DE69909790T2

DE69909790T2 - Antitrombotische mitteln

Info

Publication number: DE69909790T2
Application number: DE69909790T
Authority: DE
Inventors: Asim Dutta-Roy
Original assignee: Provexis PLC
Current assignee: Provexis Natural Products Ltd
Priority date: 1998-04-24
Filing date: 1999-04-23
Publication date: 2004-04-22
Anticipated expiration: 2019-04-24
Also published as: EP1083912B1; JP2002512972A; PT1083912E; ES2204130T3; AU772923B2; CA2330013A1; JP4975902B2; JP2012036195A; EP1334728A2; EP1334728A3; GB9808796D0; DE69909790D1; US6958164B2; EP1083912A1; ATE245429T1; AU3835099A; WO1999055350A1; CA2330013C; US20030206983A1; DK1083912T3

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft antithrombotische Mittel und betrifft insbesondere Zusammensetzungen, die aus Fruchtextrakten hergestellt sind.
Ausgangspunkt der Erfindung
Es ist bekannt, dass ein hoher Verbrauch an Früchten und Gemüse eine wichtige Präventivmaßnahme ist, durch die das Risiko kardiovaskulärer Erkrankungen und bestimmter mit der Ernährung verbundener Krebsarten, wie beispielsweise Magen-, Darm-, Brust- und Prostatakrebs reduziert werden können. Ein Faktor, der in den Beginn und Entwicklung sowohl kardiovaskulärer Erkrankungen als auch Krebs involviert ist, ist das Auftreten abnormaler oxidativer Prozesse, die zur Erzeugung von freien Hydroxy- und Peroxy-Radikalen oder -Verbindungen führen. Teilweise wird die vorteilhafte Wirkung des Essens von Früchten und von Gemüse durch die Antioxidantien erklärt, die darin enthalten sind, und die oxidative Reaktionen hemmen. Spezielle Oxidantien, von denen bekannt ist, dass sie für die Hemmung verantwortlich sind, schließen Vitamin C, Vitamin E und Carotinoide, einschließlich Alpha- und Beta-Carotinoide, Lycopen, Lutein, Zeanthin, Crytoxanthin und Xanthophylle ein.
Es wurde ein beträchtlicher Aufwand in die Identifizierung von Nahrungsmittel-Verbindungen investiert, die von Tomaten abgleitet sind, und die eine Rolle bei der Prävention von Erkrankungen des Herzens und einigen Krebserkrankungen spielen. Solche Verbindungen werden in Abushita et al., Food Chemistry, 1997, 60(2), 207–212 offenbart, wobei ein Carotinoid-Extrakt aus Tomaten fraktioniert und die Hauptbestandteile als Lycopen, Beta-Carotin und Lutein identifiziert wurden.
Studien bezüglich Tomaten haben sich auf die Rolle der Carotinoide, insbesondere auf Lycopen, in der Antioxidantien-Abwehr gegen die Oxidation des Low-Density Lipoproteins bzw. Lipoproteins mit geringer Dichte (LDL) konzentriert. In Oshima et al., J. Agricultural and Food Chemistry, 1996, 44(8), 2306–2309 ist offenbart, dass mit Lycopen ergänztes LDL Hydroperoxide langsamer als nicht ergänztes LDL akkumuliert, wenn es von Singulett-Sauerstoff bedroht ist, wodurch sich ein Beweis ergibt, der die Theorie stützt, dass Antioxidantien ein Hydroxyl/Peroxyl-Radikal einfangendes Potential aufweisen. Es ist weiterhin in Fuhrmann et al., Nutrition Metabolism and Cardiovascular Diseases, 1997, 7(6), 433–443 offenbart, dass zu Nahrungszwecken ergänztes Lycopen das Niveau der humanen LDL-Oxidation signifikant reduzierte.
In Weisburger, Proceedings for the Society for Experimental Biology and Medicine, 1998, 218(2), 140–143 wurde berichtet, dass die optimale Absorption von Carotinoiden, die typischerweise fettlösliche Chemikalien sind, in Gegenwart einer kleinen Menge eines Diät- bzw. Nahrungsöls oder -Fettes verbessert wird. Die Forschung auf dem Gebiet der Ernährung und Gesundheit hat gezeigt, dass einfach gesättigte Öle, wie beispielsweise Olivenöl, am wünschenswertesten sind, weil solche Öle das Risiko der Arteriosklerose, der koronaren Herzkrankheit oder mit der Ernährung verbundener Krebserkrankungen nicht erhöht.
US 4 507 286 offenbart die Herstellung eines Polysaccharids aus den Säften der Wurzeln und Frucht einer Bromeliaceae-Spezies und das Polysaccharid weist durch Behandlung mit Bromelain eine anti-inflammatorische Wirksamkeit und eine die Plättchen-Aggregation hemmende Wirkung auf.
Altman et al., (Thrombosis and Haemostasis, 53(3), 312–313 (1985)) beschreiben die Isolierung einer aktiven Fraktion aus der Melone (C. Cucumis Melo), die die Plättchen-Aggregation in vitro hemmt. Jedoch verschwindet die die Plättchen-Aggregation hemmende Wirkung der Fraktion nach Behandlung mit Adenosindeaminase, einem Enzym, das in Menschen ubiquitär ist.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Anmelder haben herausgefunden, dass Extrakte aus vielen Früchten eine Fähigkeit zeigen, die Plättchen-Aggregation zu hemmen. Die bis jetzt erzielten Ergebnisse legen nahe, dass Zusammensetzungen, die Extrakte aus diesen Früchten enthalten, deswegen bei der Vorbeugung von Koronar-Erkrankungen, beispielsweise von Herzinfarkten und Schlaganfall und in der Vorbeugung weiterer thromboembolischer Ereignisse in Patienten, die unter einem Herzinfarkt, Schlaganfall oder instabiler Angina litten, von Nutzen sein kann. Zusätzlich können solche Zusammensetzungen bei der Vermeidung einer Restenosis im Anschluß an eine Angioplastie und Bypass-Verfahren verwendet werden. Darüber hinaus können Zusammensetzungen, die Fruchtextrakte umfassen, in der Behandlung der Koronar-Krankheit, die sich aus thromboembolischen Störungen, wie beispielsweise Herzinfarkt ergeben, in Verbindung mit einer thrombolytischen Therapie, von Nutzen sein.
Die bis jetzt erzielten Ergebnisse zeigen, dass die für die Anti-Plättchen-Aggregationswirksamkeit verantwortlichen Verbindungen wasserlösliche Verbindungen sind, die eine äußerst unterschiedliche Struktur gegenüber den Lipid-löslichen Verbindungen wie beispielsweise Lycopen aufweisen, die in den oben angesprochenen Papers identifiziert wurden.
Es existieren viele bekannte Anti-Plättchen-Aggregationswirkstoffe bzw. -Mittel, die in unterschiedlichen Stadien der Plättchenproduktion und Wirkung wirken. Aspirin (Acetylsalicylsäure) ist am häufigsten verwendet und untersucht worden. Dipyridamol und Ticlopidin wurden ebenfalls verwendet. Die Anti-Plättchen-Aktivität des Aspirins ist auf eine irreversible Hemmung der Plättchen-Cyclooxygenase zurückzuführen, wodurch die Synthese von Thromboxan A₂, einer Verbindung, die die Plättchen-Aggregation verursacht, gehemmt wird. Indobufen ist ein reversibler Inhibitor bzw. Hemmstoff von Plättchen-Cyclooxygenase. Einige Verbindungen sind direkt Inhibitoren der Thromboxan A₂-Synthase, beispielsweise Pirmagrel, oder dienen als Antagonisten an Thromboxan-Rezeptoren, beispielsweise Sulotroban.
Die bis jetzt erzielten Ergebnisse legen nahe, dass die wirksamen Bestandteile in Fruchtextrakten ein oder mehrere Schritte des Weges beeinflussen können, der zur Produktion von Thromboxan A₂ führen kann, stromaufwärts von demjenigen von Aspirin und den anderen Anti-Blutplättchen-Arzneistoffen, die gegenwärtig verfügbar sind. Es ist wohl bekannt, dass Nebenwirkungen bzw. unerwünschte Wirkungen übliche Begleiterscheinungen bei therapeutischen Dosen von Aspirin sind; die Hauptwirkung sind gastrointestinale Störungen wie beispielsweise Übelkeit, Dyspepsie und Schwindel. Es wird deswegen angenommen, dass die isolierte Blutplättchen-Aggregations hemmenden Verbindungen in Fruchtextrakten als eine wünschenswerte Alternative zu Aspirin und anderen Anti-Blutplättchen-Arzneistoffen in der Vorbeugung von thromboembolischen Ereignissen und Koronar-Krankheit Anwendung finden werden.
Demgemäß stellt die Erfindung in einem Aspekt die Verwendung eines Fruchtextraktes oder einer wirksamen Fraktion hiervon zur Herstellung einer Zusammensetzung zur oralen Verabreichung zur Verwendung in der Prophylaxe oder Behandlung eines Erkrankungszustandes bei einem Menschen bereit, begonnen oder charakterisiert durch eine Plättchen-Aggregation, wobei der Extrakt oder die aktive Fraktion von einer Frucht gewonnen wird, ausgewählt aus einer Frucht von Pflanzen der Familien Solanaceae, Rutaceae, Curcurbitaceae, Rosaceae, Musaceae, Anacardiaceae, Vitaceae, Arecaceae, Ericaceae und Lauraceae.
Bei einem anderen Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung eines Fruchtextraktes oder der aktiven Fraktion hiervon zur Herstellung einer Zusammensetzung zur oralen Verabreichung zur Verwendung als humaner Blutplättchen-Aggregations-Hemmstoff in einem Menschen bereit, wobei der Extrakt oder die aktive Fraktion aus einer Frucht gewonnen werden, ausgewählt aus Früchten oder Pflanzen der Familien Solanaceae, Rutaceae, Curcurbitaceae, Rosaceae, Musaceae, Anacardiaceae, Vitaceae, Arecaceae, Ericaceae und Lauraceae.
Bei einem noch weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eines wirksame Fraktion eines Fruchtextraktes zur Verwendung als humaner Blutplättchen-Aggregations-Hemmstoff in einem Menschen durch orale Verabreichung bereit, wobei die aktive Fraktion dazu in der Lage ist, durch einen Ultrafiltrationsfilter mit einem Molekulargewicht Cut-off von 1.000 hindurch zu passen, und die eine im wesentlichen hitzestabile farblose oder strohfarbene wasserlösliche Verbindung oder Verbindungen mit einem Molekulargewicht bzw. einer Molekülmasse von weniger als 1.000 enthält.
Spezielle und bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind in den hierzu beigefügten Ansprüchen dargelegt.
Es wird bevorzugt, dass die gemäß der Erfindung verwendeten Fruchtextrakte solche sind, die gegenüber Menschen nicht toxisch sind und typischerweise sind die Früchte solche, von denen üblicherweise angenommen wird, dass sie verzehrbare Früchte sind. Somit können die Früchte Samen oder Steine bzw. Kerne enthalten oder nicht, weisen jedoch ein eßbares, im wesentlichen nicht öliges Fleisch auf. Typischerweise können die Früchte eine Rinde, Schale oder Haut aufweisen, die das Fleisch umgibt, die wahlweise eßbar sein können.
Beispiele für Früchte, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können sind solche, die aus den Familien Solanaceae, Rutaceae, Curcurbitaceae, Rosaceae, Musaceae, Anacardiaceae, Bromeliaceae, Vitaceae, Arecaceae, Ericaceae und Lauraceae ausgewählt sind.
Beispiele für Solanaceae schließen die Tomate ein, beispielsweise die englische Tomaten-Varietät. Beispiele für Rutaceae schießen die Citrusspezies wie beispielsweise Citrus Paradisi (Grapefruit), Citrus Sinensis (Orange), Citrus Limon (Limone) und Citrus Aurantifolia (Limette) ein. Beispiele für Cucurbitaceen schließen Cucumis Melo (Melone), beispielsweise die Honigmelone ein. Beispiele für Anacardiaceen schließen Mangifera Indica (Mango) ein. Beispiele für Rosaceae schließen Pyrus Malus oder Pyrus Sylvestris (Äpfel), Pyrus Communis (Birne), Amygdalus Persica oder Prunus Persica Var. Nectarina (Nektarine), Prunus Armeniaca (Aprikose), Prunus Domestica (Pflaume), Prunus Avium (Kirsche), Prunus Persica (Pfirsich), Erdbeere und Brombeere ein. Beispiele für Bromeliaceen schließen Ananas Sativus (Ananas) ein. Beispiele für Lauraceen schließen Persea Gratissima oder Persea Americana (Avocado) ein. Beispiele für Vitaceen schließen Vitis Vinifera (Weintrauben) ein. Beispiele für Arecaceen schließen Phoenix Dactylifera (Datteln) ein. Beispiele für Ericaceen schließen Blaubeeren ein.
Früchte, von denen herausgefunden wurde, dass Extrakte oder aktive Formen hiervon eine die Plättchen-Aggregation hemmende Wirksamkeit aufweisen sind die Tomate, Grapefruit, Me tone, Mango, Melone, Ananas, Nektarine, Erdbeere, Pflaume, Banane, Moosbeere bzw. Preiselbeere, Weintrauben, Birne, Apfel und Avocado.
Die Extrakte der Erfindung können durch Homogenisieren des Fruchtfleischs einer vorzugsweise geschälten Frucht und darauf Entfernen von Feststoffen hieraus, beispielsweise mittels Zentrifugation hergestellt werden. Somit ist der Extrakt typischerweise ein wäßriger Extrakt, der im wesentlichen aus dem Saft der Frucht besteht, wahlweise unter Zusatz von zusätzlichem Wasser, das während des Homogenisierungsschrittes hinzugefügt wird. Solche wäßrigen Extrakte können konzentriert, angereichert oder beispielsweise durch Standardtechniken, beispielsweise Abdampfen unter reduziertem Druck kondensiert werden. Beispiele für Konzentrate sind solche, die zumindest 2-fach konzentriert sind, üblicherweise zumindest 4-fach, beispielsweise 8-fach oder zumindest 40-fach oder zumindest 100-fach oder zumindest 200-fach oder zumindest 1.000-fach konzentriert sind.
Die Extrakte können fraktioniert werden, um ein oder mehrere wirksame Fraktionen durch beispielsweise Molekulargewichtsfiltration oder durch Chromatographie auf einem geeigneten festen Träger wie beispielsweise einem Sepharosegel (für eine Größenausschluß-Chromatographie) oder durch eine Ionenaustauschersäule unter Verwendung einer HPLC auf einem in geeigneter Weise behandelten Siliziumdioxid oder Aluminiumoxid, beispielsweise ODS-beschichtetes Siliziumdioxid, oder durch Lösungsmittelextraktion, darin zu isolieren.
Experimente, die mit Tomatenextrakten durchgeführt wurden, haben gezeigt, dass der aktive Bestandteile) des Extraktes durch einen Ultrafiltrationsfilter mit einem Molekulargewicht Cut-off von 1.000 hindurch paßt, farblos oder strohfarben ist, wasserlöslich ist und keine signifikante Aktivität verliert, wenn er gekocht wird.
Tomatenextrakte und insbesondere wäßrige Extrakte von Tomaten repräsentieren einen bevorzugten Aspekt der Erfindung. Es wurde herausgefunden, dass eine wirksame bzw. aktive Fraktion des Tomatenextraktes ein Gemisch aus Nucleosiden einschließlich Cytidin enthält.
Es wurde herausgefunden, dass die wirksame Fraktion in erster Linie mit dem Saft, dem Fleisch, das die Kerne der Tomate umgibt und mit den Kernen der Tomate in Verbindung steht oder aus diesen extrahierbar ist. Somit repräsentiert die Verwendung von Zusammensetzungen, die aus einer wirksamen Fraktion hergestellt sind, die im wesentlichen aus dem Homogenat oder einem Extrakt hiervon besteht, das aus dem Fleisch einer geschälten Tomate besteht oder das im wesentlichen aus dem Saft und/oder dem Fleisch, das die Kerne umgibt und/oder aus den Kernen besteht, eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dar.
Der aktive Bestandteil des Tomatenextraktes wurde durch Massenspektroskopie (MS) und Kernmagnetresonanz (NMR)-Spektroskopie untersucht und es hat sich herausgestellt, dass dieser ein Gemisch aus Nucleosiden enthält. Die aktive Fraktion ist dadurch gekennzeichnet, dass sie:

(a) im wesentlichen hitze- bzw. wärmestabil ist;
(b) farblos oder strohfarben ist;
(c) eine wasserlösliche Verbindung ist;
(d) aus Bestandteilen besteht, die ein Molekulargewicht von weniger als 1.000 aufweisen;
(e) ein oder mehrere Nucleoside enthält, die eine Plättchen-Aggregations hemmende Wirkung aufweisen; und vorzugsweise
(f) ein Massenspektrum aufweisen, wenn sie einer MALDI-TOF Massenspektrometrie unterworfen werden, wie es in 7 hierzu beigefügt dargestellt ist; und vorzugsweise
(g) ein ¹H Kernmagnetresonanzspektrum zeigt, das im wesentlichen wie in 6 hierzu beigefügt dargestellt ist.

Pharmazeutische und nutrizeutische Zubereitungen
Die Extrakte oder aktiven Fraktionen hiervon werden zur oralen Verabreichung formuliert. Sie können als solches z. B. als Lösungen, Suspensionen, Sirupe, Tabletten, Kapseln, Pastillen und Snack-Riegel, Inserte und Pflaster zubereitet werden. Solche Zubereitungen können gemäß Verfahren hergestellt werden, die per se bekannt sind. Es wird bevorzugt, dass die Zubereitungen fettarme Materialien sind oder im wesentlichen frei von diesen sind.
Beispielsweise können die Extrakte oder aktiven Fraktionen zur oralen Verabreichung zu Sirupen oder anderen Lösungen ausgebildet werden, beispielsweise zu Gesundheitsgetränken bzw. -Drinks, in Gegenwart eines oder mehrerer Trägerstoffe, ausgewählt aus Zuckern, Vitaminen, Aromastoffen, Farbstoffen, Konservierungsmitteln und Verdickungsmitteln.
Mittel zur Einstellung der Tonizität wie beispielsweise Natriumchlorid oder Zucker können zugesetzt werden, um eine Lösung mit einer speziellen osmotischen Stärke bereitzustellen, beispielsweise eine isotonische Lösung. Ein oder mehrere Mittel zur Einstellung des pHs wie beispielsweise Puffermittel können dazu verwendet werden, den pH auf einen speziellen Wert einzustellen und ihn vorzugsweise bei diesem Wert zu halten. Beispiele für Puffermittel schließen Natriumcitrat/Citronensäure-Puffer und Phosphatpuffer ein.
Alternativ können die Extrakte oder aktiven Fraktionen hiervon getrocknet werden, beispielsweise durch Sprühtrocknen oder Gefriertrocknen und das getrocknete Produkt kann zu einer festen oder halbfesten Dosierungsform formuliert werden, beispielsweise als Tablette, Pastille, Kapsel, Pulver bzw. Puder, Granulat oder Gel.
Anstelle dessen können einfache getrocknete Extrakte ohne zusätzliche Bestandteile hergestellt werden. Alternativ können getrocknete Extrakte durch Absorbieren auf einen festen Träger hergestellt werden; beispielsweise auf einen Zucker wie beispielsweise Saccharose, Lactose, Glykose, Fructose, Mannose oder ein Zuckeralkohol wie beispielsweise Xylitol, Sorbitol oder Mannitol; oder ein Zellulosederivat. Weitere besonders nützliche Adsorbentien schließen Adsorbentien auf Stärkebasis wie beispielsweise Cerealien-Mehle beispielsweise Weizenmehl und Maismehl ein. Zur Tablettenzubereitung wird der Trockenextrakt typischerweise mit einem Verdünnungsmittel wie beispielsweise einem Zucker, beispielsweise Saccharose oder Lactose und mit Zuckeralkoholen wie beispielsweise Xylitol, Sorbitol oder Mannitol; oder mit modifizierter Zellulose oder Zellulose-Derivaten wie beispielsweise pulverförmiger Zellulose oder mikrokristalliner Zellulose oder Carboxymethylzellulose. Die Tabletten enthalten typischerweise ein oder mehrere Trägerstoffe, ausgewählt aus Granuliermitteln, Bindemitteln, Gleitmitteln und Zerfallsförderern bzw. Sprengmitteln. Beispiele für Sprengmittel schließen Stärke und Stärkederivate und andere quellbare Polymere ein, beispielsweise vernetzte polymere Sprengmittel, wie beispielsweise vernetzte Carboxymethyl zellulose, vernetztes Polyvinylpyrrolidon und Stärkeglycolate. Beispiele für Gleitmittel schließen Stearate wie beispielsweise Magnesiumstearat und Stearinsäure ein. Beispiele für Bindemittel und Granuliermittel schließen Polyvinylpyrrolidon ein. Wenn das Verdünnungsmittel natürlich nicht süß ist, kann ein Süßstoff zugesetzt werden, beispielsweise Ammoniumglycyrrhizinat oder ein künstlicher Süßstoff wie beispielsweise Aspartam oder Natriumsaccharinat.
Trockenextrakte können ebenfalls als Pulver, Granulate oder halbfeste Zubereitungen zum Einbringen in Kapseln formuliert werden. Wenn sie in Form von Pulvern verwendet werden, können die Extrakte zusammen mit einem oder mehreren der oben definierten Trägerstoffe bezüglich Tabletten formuliert werden oder können in einer unverdünnten Form präsentiert werden. Zur Präsentierung in Form von halbfesten Mitteln können die getrockneten Extrakte bzw. Trockenextrakte gelöst oder in einer viskosen Flüssigkeit oder einem halbfesten Träger wie beispielsweise Polyethylenglykol suspendiert werden oder in einem flüssigen Träger wie beispielsweise Glykol, beispielsweise Propylenglykol, oder in Glycerol oder in einem Pflanzen- oder Fischöl, beispielsweise einem Öl, ausgewählt aus Olivenöl, Sonnenblumenöl, Distelöl, Nachtkerzenöl, Sojaöl, Lebertranöl, Heringsöl etc. Solche Extrakte können in Kapseln entweder vom Hartgelatine- oder Weichgelatinetyp eingefüllt werden oder können aus Hart- oder Weichgelatine-Äquivalenten hergestellt werden, wobei Weichgelatine oder Gelatineäquivalente Kapseln für viskose Flüssigkeiten oder halbfeste Füllungen bevorzugt werden.
Trockenextrakte können ebenfalls in Pulverform zum Einbau in Snack-Riegel, beispielsweise Fruchtriegel, Nußriegel oder Cerealien-Riegel bereitgestellt werden. Zur Präsentation in Form von Snack-Riegeln können die Trockenextrakte mit einem oder mehreren Inhaltsstoffen ausgewählt aus Trockenfrüchten wie beispielsweise sonnengetrockneten Tromaten, Rosinen und Sultaninen, gemahlenen Nüssen oder Cerealien wie beispielsweise Hafer- und Weizenmehl, vermischt werden.
Trockenextrakte können in Pulverform zur Wiederherstellung als Lösung bereitgestellt werden. Als solches können sie ebenfalls lösliche Trägerstoffe wie beispielsweise Zucker, Puffermittel wie beispielsweise Citrat- und Phosphat-Puffer, Schäum- bzw. Sprudelmittel, gebildet aus Carbonaten, beispielsweise Hydrogencarbonaten wie beispielsweise Natrium- oder Ammoniumhydrogencarbonat und einer festen Säure, beispielsweise Citronensäure oder einem sauren Citrat-Salz, enthalten.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird der Trockenextrakt in Pulverform wahlweise mit einem bevorzugten Feststoff (beispielsweise pulverförmigem) Trägerstoff zum Einbau in Kapseln, beispielsweise Hartgelatinekapseln, bereitgestellt.
Eine feste oder halbfeste Dosisform der vorliegenden Erfindung kann bis zu ungefähr 1.000 mg Trockenextrakt, beispielsweise bis zu ungefähr 800 mg Trockenextrakt enthalten.
Die Extrakte können als Nahrungsergänzungsmittel oder Nahrungszusätze präsentiert werden oder können in Nahrungsmittel eingebaut werden, beispielsweise Functional Food oder Nutriceuticals.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können in Form von Einzeldosisformen bzw. Eindosisformen präsentiert werden, die eine definierte Konzentration des Extraktes oder des aktiven Anteils bzw. Fraktion hiervon enthalten. Eine solche Einzeldosisform kann so ausgewählt werden, dass eine gewünschte Ebene einer biologischen Aktivität erreicht wird.
Pharmazeutische Verwendungen
Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Prophylaxe oder Behandlung eines Zustands oder einer Störung bereit, die durch die Plättchen-Aggregation vermittelt wird, wobei das Verfahren die Verabreichung einer wirksamen und vorzugsweise nicht toxischen, die Plättchen-Aggregation hemmenden Menge einer Frucht oder eines Extraktes oder aktiven Fraktion hiervon, wie hierin vorstehend definiert, an einen Patienten (beispielsweise einen Menschen oder ein Säugetier) umfasst, das einer solchen Verabreichung bedarf.
Zur Behandlung von Erkrankungen, die durch eine Plättchen-Aggregation charakterisiert sind, hängt die Menge des Extraktes oder der aktiven Fraktion, die einem Patienten pro Tag verabreicht wird, von der Stärke des Extraktes, dem speziellen Zustand oder der Erkrankung und der Behandlung und dem Schweregrad ab und letztendlich wird dies im Ermessen des Arztes liegen.
Die verabreichte Menge ist jedoch typischerweise eine nicht toxische Menge, die zur Behandlung des fraglichen Zustands oder Leidens wirksam ist.
Die einem Patienten verabreichte Menge des Extraktes oder der aktiven Fraktion variiert typischerweise gemäß der Konzentration des aktiven Inhaltsstoffs oder Inhaltsstoffe im Extrakt. Typischerweise kann eine tägliche Dosierungsvorschrift für einen humanen Patienten, der unter einer Plättchen-Aggregation vermittelten Krankheit leidet, von 0,0001 bis 0,1, vorzugsweise 0,001 bis 0,05 Gramm pro Kilogramm Körpergewicht betragen. Wenn eine aktive Fraktion isoliert und verabreicht wird, kann die Menge an festem Material, die verabreicht wird, um eine Menge reduziert werden, die mit der erhöhten Reinheit der Fraktion übereinstimmt. Typischerweise wird die Verabreichung von zumindest 100 mg, vorzugsweise 200 mg der aktiven Fraktion pro Tag an einen menschlichen Patienten, der unter einer Plättchen-Aggregations-vermittelten Krankheit leidet, die Plättchen-Aggregation signifikant hemmen.
Die Zusammensetzungen können in Einzel- oder vielfachen Dosierungseinheiten pro Tag verabreicht werden, beispielsweise von ein bis vier Mal täglich, vorzugsweise ein oder zwei Mal täglich.
Die Extrakte der Erfindung können in einer festen, flüssigen oder halbfesten Form verabreicht werden. Beispielsweise können die Extrakte in Form von Fruchtsaft, Konzentraten der wäßrigen Extrakte oder gereinigten aktiven Fraktionen der Extrakte in fester, flüssiger oder halbfester Form verabreicht werden. Wenn sie im unkonzentrierten Zustand verabreicht werden, können sie in Form eines Saftes verabreicht werden, der aus 100% Frucht hergestellt ist. Jedoch werden die Extrakte vorzugsweise als Konzentrate und besonders bevorzugt als Konzentrate in fester Form, beispielsweise in Form von Tabletten, Hartgelatinekapseln oder Snack-Riegeln, wie hierin vorstehend definiert, verabreicht.
In einer Ausführungsform der Erfindung kann zumindest 300 ml 100% Fruchtsaft (beispielsweise 600 ml 100% Fruchtsaft) eine typische tägliche Dosierungsvorschrift für einen huma nen Patienten umfassen, der mit einer Plättchen-Aggregation verbundenen Krankheit leidet. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann zumindest 300 ml 100% Fruchtsaft in vielfachen Dosen pro Tag verabreicht werden, beispielsweise zumindest zwei Mal am Tag, vorzugsweise drei Mal täglich. Jedoch schließen die vorher erwähnten Dosierungsvorschriften den Konsum relativ großer Mengen an Flüssigkeit ein, die für den Patienten nicht akzeptabel sind. Deswegen können in einer weiteren Ausführungsform Konzentrate, die wie hierin vorstehend definiert sind, beispielsweise in vielfachen Dosen pro Tag verabreicht werden.
Die Zusammensetzungen der Erfindung weisen eine die Plättchen-Aggregation hemmende Aktivität auf. Als solches sind die Zusammensetzungen der Erfindung in der Behandlung von Zuständen und Störungen von Nutzen, zu denen die Aggregation von Blutplättchen ihren Teil beitragen, oder bei denen die Plättchen-Hyperaktivität mit einbezogen ist. Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können therapeutisch bei verschiedenen Leiden verwendet werden, bei denen die Plättchen-Hyperaktivität ein primäres oder sekundäres Merkmal ist, wie beispielsweise Herzerkrankungen und Fettleibigkeit. Beispiele für klinische Indikationen, bei denen die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung von speziellem Interesse sind, schließen die Behandlung oder Handhabung nach einem Herzinfarkt, Koronarthrombosen, Koronarartierienbypass-Transplantaten, Herzklappenersatz und peripheren und vaskulären Transplantaten ein.
Die Extrakte der Erfindung können alleine oder in Kombination mit anderen therapeutischen Mitteln verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Extrakte der Erfindung in Kombination mit einem oder mehreren von Streptokinase, Heparin, Insulin, Anti-Fettleibigkeits-Arzneistoffen und HMGCoA Reductase-Inhibitoren verabreicht.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Erfindung wird nunmehr durch die nachfolgenden Beispiele und bezüglich der begleitenden Figuren veranschaulicht, jedoch nicht eingeschränkt, bei denen:
1 in schematischer Form ein typisches Verfahren der Teilfraktionierung von Tomatenextrakten zeigt;
2 ein Gelfiltrationschromatogramm eines wäßrigen Tomatenextrakt-Ultrafiltrats ist;
3 ein Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) Ionenaustauschchromatogramm eines entsalzten gelfiltrierten wäßrigen Tomatenextraktes ist;
4 eine graphische Darstellung ist, die die Plättchen-Aggregations-Aktivität in den entsalzten Fraktionen, nämlich Fraktion 1 und Fraktion 2 darstellen, gesammelt im Anschluß an eine HPLC Ionenaustauschchromatographie;
5 ein ¹H NMR Spektrum von Cytidin ist;
6 ein ¹H NMR Spektrum der entsalzten aktiven Fraktion F2 eines wäßrigen Tomatenextrakts ist;
7 ein MALDI-TOF Massenspektrum der aktiven Fraktion F2 ist;
8 ein GC-CIMS Chromatogramm der derivatisierten Fraktion F2 ist; und
9 eine graphische Darstellung ist, die die Ergebnisse des Plättchen-Aggregationsassays darstellt, gewonnen unter Verwendung von Extrakten aus unterschiedlichen Teilen der Tomate.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
BEISPIEL 1
ADP induzierte Plättchen-Aggregationsstudie
Verfahren
Extrakte, die aus 100% Fruchtsaft oder verdünntem Fruchtsaft bestanden, wurden frisch am Tag des Assays aus den in Tabelle 1 unten dargelegten Früchten hergestellt. Um 100% Fruchtsaft herzustellen wurden die Früchte geschält und das Fruchtfleisch wurde homogenisiert. Das sich ergebende Homogenat wurde bei 3.000 × G für 10 Minuten auf einer Zentrifuge in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen geschleudert, wonach der Überstand (Saft) entfernt und der pH des Saftes mit entweder 1 M oder 0,1 M Natriumhydroxid eingestellt wurde, abhängig vom anfänglichen pH des Fruchtextraktes. Für relativ faserhaltige Früchte (Apfel, Mango, Avocado) wurde ein 20% oder 50% G/V Extrakt durch Homogenisieren von entweder 20% oder 50% Frucht mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) bei pH 7,4 hergestellt, wobei das Homogenat wie oben beschrieben bzgl. der 100% Fruchtextrakte verarbeitet wurde.
Die Wirkung der Fruchtextrakte auf die Aggregationseigenschaften menschlicher Blutplättchen wurde bei jungen Freiwilligen untersucht. Venöses Blut wurde von den Freiwilligen gesammelt, die in den letzten vierzehn Tagen vor der Spende keine wie auch immer geartete Medikation eingenommen hatten. Blut (20 ml) wurde unter Verwendung einer 19G Butterfly-Nadel gesammelt und die Koagulation wurde durch Mischen der Blutproben mit saurem Citrat (135 mM) im Verhältnis von 9 Teilen Volumen Blut zu 1 Teil Volumen ACD verhindert. Plättchen-reiches Plasma (PRP) wurde aus den Proben durch Zentrifugieren der Probe bei 200 g für 15 Minuten hergestellt.
Fruchtsaft (50 μl), dessen pH auf 7,4 eingestellt wurde, wo dies notwendig war, entweder mit 1 M oder 0,1 M Natriumhydroxid, abhängig vom anfänglichen pH des Fruchtextraktes, wurde mit dem PRP (450 μl) vermischt und bei 37°C für 15 Minuten inkubiert, wonach die Wirkung des Fruchtextraktes auf die ADP-induzierte Plättchen-Aggregation unter Zusatz von ADP in einer Endkonzentration von 10 μM überwacht wurde. Kontrollen wurden parallel unter Verwendung von 50 μl PBS, pH 7,4 anstelle des Fruchtsaftes laufen gelassen.
Die Plättchen-Aggregation in PRP wurde unter Verwendung eines Packs-4 Aggregometers (Helena Labs, USA) bei einer konstanten Rührgeschwindigkeit von 1.000 UpM bei 37°C überwacht. Die Plättchenzählungen wurden unter Verwendung eines Coulter Cell Counters durchgeführt.
Ergebnisse
Tabelle 1 zeigt die Anti-Aggregationseigenschaften verschiedener Fruchtextrakte bezüglich menschlicher Blutplättchen. Die Ergebnisse wurden als %-Hemmung der Aggregationsreaktion auf ADP für eine Anzahl von Freiwilligen (n) ausgedrückt. In der Tabelle wurden die Extrakte, die mit einem Sternchen markiert waren, für 10 Minuten gekocht und darauf bei 113.000 g für 30 Minuten zentrifugiert.
Tabelle 1
BEISPIEL 2
Teilfraktionierung eines Tomatenextraktes
Verfahren
Tomatenextrakte werden gemäß des allgemeinen in 1 dargestellten Schemas fraktioniert und die Plättchen-Aggregations-hemmende Wirkung wurde in verschiedenen Stadien gemessen. Somit wurde frischer Tomatensaft, hergestellt aus 100% Frucht, für 10 Minuten gekocht und wurde dann für 30 Minuten bei 113.000 G zentrifugiert. Die Plättchen-Aggregationshemmende Aktivität des Extraktes ist in Tabelle 1 oben dargestellt.
Im Anschluß an die Zentrifugation wurde ein Teil des überstehenden Extraktes durch Passieren durch eine Amicon YM 1 Filtrationsmembran mit einem Molekulargewichts Cut-off von 1.000 unter Stickstoffdruck bei 4°C unterworfen. Das Ultrafiltrat wurde gesammelt, genauso wie der zurückbleibende Fruchtsaft, der über dem Filter verblieb (Retentat) und das Ultrafiltrat und das Retentat wurden dann beide bezüglich ihrer Aktivitäten bei der Hemmung einer ADP- oder Collagen-induzierten Plättchen-Aggregation getestet. Die Anti-Plättchenaktivitäten des Ultrafiltrats und Retentats waren gleich, was darauf hinweist, dass der aktive Bestandteil des Extraktes aus einer Verbindung oder Verbindungen mit einem Molekulargewicht von weniger als 1.000 besteht.
Um zu bestimmen, ob die Antiplättchen-Aggregationsaktivität auf fettlösliche oder wasserlösliche Bestandteile im Tomatenultrafiltrat zurückzuführen war (Molekulargewichts Cut-off 1.000) wurde der Fettbestandteil des Ultrafiltrats mit Chloroform und Methanol gemäß des Verfahrens von Bligh und Dyer extrahiert. Somit wurden 2 ml des Ultrafiltrats mit 2,5 ml Methanol gefolgt von 1,25 ml Chloroform gemischt, um eine einzige Phase und ein Chloroform : Methanol : Wasserverhältnis von 1 : 2 : 0,8 zu erhalten. Es bildete sich kein Präzipitat. Chloroform (1,25 ml) und Wasser (1,25 ml) wuden dann zugesetzt, um das Verhältnis auf 2:2 : 1,8 zu bringen und nach sanftem Mischen ließ man das Gemisch sich in zwei Schichten absetzen. Die obere Schicht (Methanol/Wasser) wurde entfernt und das Methanol unter Stickstoff bei 55°C abgedampft. Das Volumen wurde darauf auf 2 ml nach Einstellung auf pH 7,4 eingestellt. Die Anti-Plättchen-Aggregationsaktivität dieser wäßrigen Phase wurde mit 50 μl PBS als Kontrolle verglichen.
Die Chloroformphase wurde unter Stickstoff abgedampft und in Ethanol resuspendiert (50 μl). Eine Probe (10 μl) der Ethanolphase wurde darauf auf eine Anti-Plättchen-Aggregationsaktivität gegen eine 10 μl Ethanolkontrolle getestet.
Ergebnisse
Das Ultrafiltrat (MWCO 1000) und die entfettete wäßrige Fraktion, beide bei pH 7,4, wiesen eine ähnliche Aktivität gegen ADP- und Collagen-induzierte Plättchen-Aggregation auf. Die Lipidfraktion hemmte andererseits die primäre Aggregation nicht, jedoch wurde eine Desaggregation beobachtet. Es wurde angenommen, dass dies auf unspezifische Lipideffekte auf die Plättchen zurückzuführen ist.
Als Zusammenfassung legen die Fraktionierungsexperimente nahe, dass die Plättchen-Aggregations-hemmende Aktivität mit wasserlöslichen Bestandteilen mit einem Molekulargewicht von weniger als 1.000 in Verbindung steht. Der Bestandteil (die Bestandteile) ist (sind) hitzestabil und farblos/strohfarben.
BEISPIEL 3
Isolierung und Identifizierung eines aktiven Anti-Plättchen-Aggregationsbestandteils aus einem Tomatenextrakt
Verfahren
Tomatenextrakte wurden gemäß des allgemein in 1 dargestellten Schemas fraktioniert und die Plättchen-Aggregations-hemmende Aktivität bzw. Wirksamkeit wurde in verschiedenen Stadien gemessen. Somit wurde frischer Tomatensaft, hergestellt aus 100% Frucht, 10 Minuten lang gekocht und wurde dann bei 113.000 G für 30 Minuten zentrifugiert.
Im Anschluß an die Zentrifugation wurde ein Anteil des Überstand-Extraktes einer Ultrafiltration unterworfen, indem er durch eine Amicon YM1 Filtrationsmembran mit einem Molekulargewichts Cut-off von 1.000 unter Stickstoffdruck bei 4°C passiert wurde. Das Ultrafiltrat, MWCO 1000, wurde gesammelt und eine Probe wurde bezüglich der Aktivität bei der Hemmung von ADP oder einer Collagen-induzierten Plättchen-Aggregation getestet. Das . Ultrafiltrat wurde zur weiteren Aufreinigung gefriergetrocknet.
Die gefriergetrocknete Probe wurde in 2 ml Wasser suspendiert. Die Anti-Plättchen-Aggregationsaktivität für diese wäßrige Phase wurde mit 50 μl PBS als Kontrolle verglichen. Weil nur die wäßrige Fraktion der gefriergetrockneten Probe die Plättchen-Aggregationshemmende Aktivität (siehe Beispiel 2) aufwies, wurde eine weitere Aufreinigung des aktiven Bestandteils unter Verwendung der wäßrigen Fraktion durchgeführt.
Eine weitere Fraktionierung wurde auf einer Sepharose-Säule durchgeführt, die gemäß der Molekulargröße auftrennt. Somit wurde eine Gelfiltrationssäulenchromatographie der resuspendierten gefriergetrockneten Probe unter Verwendung eines P2-Biogels durchgeführt. Eine P2 Biogelsäule wurde mit 0,01 M Essigsäue-Puffer, pH 3,3, der 0,15 M Natriumchlorid enthielt äquilibriert. Die Probe wurde auf die Säule geladen und mit 0,01 M Essigsäure-Puffer, pH 3,3, der 0,15 M Natriumchlorid enthielt, eluiert. Die Plättchen-Aggregation wurde in jeder der gesammelten Fraktionen (als Nr. 1 bis 8 bezeichnet) gesammelt, was den UV-Spektren Peaks entspricht, die auf der Chromatographiespur in 2 dargestellt sind.
Es stellte sich heraus, dass die Plättchen-Aggregations-hemmende Aktivität in jeder der gesammelten Fraktionen konzentriert war, die Peak 4 entsprach. Diese Fraktion, als Fraktion 4 bezeichnet, wurde vor der weiteren Aufreinigung gefriergetrocknet. Die gefriergetrocknete Probe wurde in Wasser resuspendiert, um eine Lösung aus 20 mg/ml zu ergeben. Ein Entsalzen der gesammelten Fraktion wurde durch Aufladen der Probe auf eine P2-Biogelsäule und Eluieren mit 0,01 M Essigsäure, pH 3,3, durchgeführt. Das Eluat wurde gefriergetrocknet und in Wasser wie vorher resuspendiert.
Eine weitere Aufreinigung wurde durch Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) Ionenaustausch-Chromatographie auf Silikagel Nucleosil erreicht. Die Probe wurde auf eine Nucleosil 5 μM-Säule mit einer Schutzsäule gepackt mit Persorb A C18 aufgebracht. Die Probe wurde auf der Säule durch Waschen der Säule mit Lösungsmittel A (10 mM Natriumacetat, eingestellt auf pH 4 mit Eisessig) konzentriert. Zur Elution wurde ein linearer Gradient von 100% Lösungsmittel A zu 100% Lösungsmittel B (10 mM Natriumacetat und 1 M Natriumchlorid, pH 4) über einen Zeitverlauf von 30 Minuten in einer Durchflußgeschwindigkeit von 1 ml/min verwendet.
Zwei Fraktionen wurden gesammelt: Fraktion 1, die dem über Peaks 1 bis 11 eluierten Material entsprach (zwischen 2,3 und 8,1 Minuten nach Probeninjektion) und Fraktion 2, die Material entsprach, das bei Peak 5 eluierte. Ein Entsalzen der gesammelten Fraktionen wurde durch Aufladen der Probe auf eine P2-Biogelsäule und durch Eluieren mit 0,01 M Essigsäure-Puffer, pH 3,3 durchgeführt. Das Eluat wurde gefriergetrocknet und in Wasser wie vorher resuspendiert. Eine ADP-induzierte Plättchen-Aggregationsaktivität, die in entsalzten Fraktionen, Fraktion 1 (F1) und Fraktion 2 (F2), gemessen wurde, ist in 4 dargestellt. Die Plättchen-Aggregations-hemmende Aktivität war in einer der Fraktionen, nämlich Fraktion 2, konzentriert, was Peak 15 (3) entspricht. Fraktion 2 wurde dann vor einer weiteren Untersuchung gefriergetrocknet. Die gefriergetrocknete Probe wurde in Wasser resuspendiert, um eine Konzentration von 20 mg/ml zu liefern und wurde für eine Strukturanalyse des aktiven Bestandteils (Bestandteile) zurückgehalten.
Die aktiven Bestandteile, die in der aktiven Fraktion vorlagen, wurden unter Verwendung einer Massenspektroskopie und Kernmagnetresonanz (MNR) wie unten beschrieben charakterisiert.
Kernmagnetische Resonanz-Spektroskopie
Ein Teil der Probe der aktiven Fraktion F2 wurde einer ¹H NMR Analyse unterworfen und das sich ergebende NMR Spektrum ist in 6 dargestellt. Das Spektrum der aktiven Fraktion wurde mit dem Spektrum einer reinen Probe der Verbindung 4-Amino-I-B-D-rtbofuranosyl-2-(1H)-pyrimidinon (Cytidin) verglichen – siehe 5, von der ersichtlich ist, dass beträchtliche Ähnlichkeiten existieren, dass jedoch die aktive Fraktion in klarer Weise kein reines Cytidin enthält. Die NMR Daten für die Probe F2 legen das Vorhandensein von Ribose nahe. Die kleineren Unterschiede in den NMR Daten legten einen unterschiedlichen pH oder ein unterschiedliches Salz nahe.
Massenspektroskopische Analyse
Die entsalzte aktive Fraktion, nämlich Fraktion 2 (F2) wurde mehreren massenspektroskopischen analytischen Techniken unterworfen. Die aus den verschiedenen Massenspektren ge wonnenen Daten legten nahe, dass die Probe F2 mehrere Nucleosid-Arten bzw. -Spezies enthält, von denen der Hauptbestandteil Cytidin ist.
Sonde EIMS
Ein Teil der Probe F2 (42480) wurde durch die Sonde EIMS unter Verwendung eines Temperaturbereichs von Umgebung bis ca. 550°C bei 50°C pro Minute überprüft. Ein VG AutoSpecE Massenspektrometer wurde verwendet, das von 950 bis 25 amu bei ca. 5 Sekunden pro Scan scannt. Die Sonde-EIMS-Daten für F2 zeigten ein potentiell diagnostisches Ion bei m/z 111, das 4-Aminopyrimidinon (Cytosin) zu entsprechen schien, gebildet durch thermische/EIinduzierte Fragmentierung eines Nucleosids, durch Vergleich mit einem NIST Bibliothek EI-Massenspektrum von Cytosin. Es existierte ebenfalls ein klarer Hinweis bzw. Beweis für das Vorhandensein von HLC, was Hydrochlorid nahelegt. Die Probe schien mit verzweigtkettigen Oligomeren von Octylphenolethoxylaten kontaminiert zu sein, was Ionen bei m/z 45, 135, 267, 311, 355, 382, 399. 426, 443, 470 und 487 ergab.
MALDI-TOF
Teile der Probe F2 (42480) und verschiedene Standards, die Cytidin einschlossen, wurden in Wasser gelöst und mit Matrix (9 : 1 5-Hydroxypicolinsäure/50 mM Ammoniumcitrat) vermischt. Ein PE Biosystems Voyager-STR Massenspektrometer wurde verwendet. Ein Matrixrohling wurde ebenfalls analysiert. Das MALDI-TOF (matrix assisted laser desorption /ionisation-time of flight)-Spektrum von Probe F2 (7) war demjenigen von Cytidin und Arabinofuranosylcytosin sehr ähnlich. Alle drei Proben zeigten klar m/z 244 (MH⁺, m/z 266 (MNa⁺), m/z 487 (2MH⁺ und m/z 509 (2MNa⁺ Ionen, was nahelegt, dass der Hauptbestandteil von F2 Cytidin oder ein Isomer von Cytidin ist. Cyclocytidin wies ein geringeres Molekulargewicht auf, wie erwartet und zeigte Ionen bei m/z 266 (MH+), m/z 451 (2MH⁺ und m/z 473 (2MNa⁺).
Derivatisierung/GC-EIMS
Teile der Probe F2 (42480) und verschiedene Standards, die Cytidin einschlossen, wurden in Wasser gelöst und mit internem Standard (Arabitol) vermischt. Die sich ergebenden Lösungen und ein Rohling wurden lyophilisiert, unter Verwendung von Essigsäureanhydrid/Pyridin acetyliert und unter Verwendung von Tri-SiI-Z trimethylsilyliert. Die sich ergebenden Produkte wurden in Hexan gelöst und Teilmengen (ca. 1 μl) durch GC-EIMS (Gaschromatographie-Elektronenionisierungsmassenspektroskopie) auf einem VG Trio-1 Tischmassenspektrometer analysiert. Die Proben wurden über einem kalten Säuleninjektor auf eine DB-5 GC Kapillarsäule injiziert. Die GC-EIMS-Daten aus der derivatisierten Probe F2 und eine derivatisierte Cytidin-Kontrollprobe legten nahe, dass der Hauptbestandteil in Probe F2 mit derivatisiertem Cytidin eng verwandt ist, jedoch zu derivatisiertem Arabinofuranosylcytosin schwach unterschiedlich war.
Derivatisierung/GC-CIMS
Teile der Probe F2 (42480) und des Cytidin-Standards wurden in Wasser gelöst und lyophilisiert. Sie wurden in derselben Weise wie oben derivatisiert und Teilmengen (ca. 1 μl) der sich ergebenden Hexanlösungen wurden durch GC-CIMS (Gaschromatographie – chemische Ionisierungsmassenspektroskopie) auf einem PE TurboMass Tischmassenspektrometer untersucht. Die Proben wurden über einem PSS-Injektor auf eine DB-SMS Kapillar-GC-Säule injiziert. Die GC-CIMS-Daten für derivatisiertes F2 und derivatisiertes Cytidin bestätigten, dass eine der Peaks in der Probe F2 Cytidin ist. Die Überprüfung der CI-Spektren zeigte ebenfalls das Vorhandensein von Ionen bei m/z 259 und 348, was mit der Ribofuranosyl-Einheit assoziert sein kann.
BEISPIEL 4
Assay der Aktivität von aus Tomaten gewonnenem Extrakt bei der Hemmung der Blutplättchen-Aggregation, die durch Agonisten induziert wurde oder nach Zusatz von Arachidonsäure
Es ist bekannt, dass im Anschluß an eine Verletzung sich die Blutplättchen an das geschädigte Gefäßendothel anlagern, wodurch es weiteren Plättchen erleichtert wird, aneinander zu kleben, zu aggregieren, und diese dadurch aktiviert werden und einen Plättchenpfropfen bilden. Die Plättchen-Aggregation wird über Faktoren vermittelt, die an der Stelle der Verletzung produziert werden und mit Rezeptoren auf der Plättchenoberfläche reagieren. Einige dieser Faktoren, beispielsweise ADP, Serotonin und Thromboxan A₂ werden selbst durch aktivierte Plättchen freigesetzt, wodurch eine positive Feedback-Schlaufe erzeugt wird.
Während des Verfahrens der Plättchen-Aggregation und Aktivierung binden Liganden, wie beispielsweise ADP oder Collagen in niederen Dosen an spezifische Rezeptoren. Dies führt zur Aktivierung von Membranphospholipasen und führt zur Freisetzung von Arachidonsäure aus den Plättchenmembran-Phospholipiden durch Aktivität des Enzyms Phospholipase A₂. Ein Teil der Arachidonsäure wird rasch durch mehrere zyklische Endoperoxidasen, deren Hauptbestandteile Cyclooxygenase und Lipoxygenase sind, zu Prostaglandinen und zuletzt zu Thromboxan A₂ über das Enzym Thromboxansynthetase metabolisiert. Thromboxan A₂ ist biologisch hoch aktiv und vermittelt einen Anstieg der intrazellulären Kalziumionen und der Plättchenkörnchen-Freisetzung, die eine weitere Plättchen-Aggregation fördert. Thromboxan A₂ ist chemisch instabil und wird zu Thromboxan B₂ abgebaut und deswegen wird die Messung der Thromboxan-Konzentrationen durch Messung von Thromboxan B₂ durchgeführt.
Die Plättchen-Aggregations-hemmende Aktivität von halb aufgereinigten Tomatenextrakten wurde durch Messen der Produktion von Thromboxan B₂, produziert von Blutplättchen in Gegenwart der Agonisten ADP oder Collagen oder wenn exogene Arachidonsäure zugesetzt wird, untersucht.
Verfahren
Halb aufgereinigte Tomatenextrakte wurden gemäß Beispielen 2 und 3 hergestellt. Somit wurden 50 μl der Gelfiltrationsfraktion, die Peak 4 (siehe 2) entsprach oder der HPLC gereinigte Fraktion 2 (siehe 3) 50 μl PBS Puffer zugesetzt und mit 450 μl Plättchenreichem Plasma für 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Im Anschluß an die Inkubation wurde der Agonist bis zur erwünschten Konzentration zugesetzt. Das Assaygemisch wurde dann zentri fugiert und die Konzentrationen an Thromboxan B₂ im Überstand wurden gemessen. Alternativ wurden die zentrifugierten Assayproben rasch zur Thromboxan B₂ Analyse zu einem späteren Zeitpunkt eingefroren.
Ergebnisse Tabelle 2
Tabelle 2 zeigt die Wirkung der Gelfiltrations-Fraktion entsprechend Peak 4 und der HPLC Fraktion F2-Fraktion auf die Thromboxan B₂ Produktion in Blutplättchen durch ADP, Collagen und Arachidonsäure. Die Ergebnisse wurden als Nanogramm/ml Thromboxan B₂ ausgedrückt, produziert in Reaktion auf ADP, Collagen oder Arachidonsäure in Gegenwart des halb aufgereinigten Tomatenextraktes.
Die Gelfiltrations-Fraktion, die Peak 4 entsprach, nämlich Fraktion 4 und die HPLC Fraktion, nämlich die Fraktion 2, wiesen eine ähnliche Wirkstärke gegen ADP induzierte Thromboxan B₂ Produktion auf. In ähnlicher Weise hemmte die Fraktion 2 eine Collagen-induzierte Thromboxan B₂ Produktion im Vergleich zur Kontrollprobe. Fraktion 2 hemmte andererseits die Thromboxan B₂ Produktion in Gegenwart von Arachidonsäure nicht.
Folgerung
Diese Experimente zeigen, dass der aktive Bestandteil (die aktiven Bestandteile) von Tomatensaftextrakt die Produktion von Thromboxan B₂, induziert durch ADP und Collagen, hemmt, jedoch nicht den Metabolismus aus Arachidonsäure zu Thromboxan B₂ stoppt. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Plättchen-Aggregations-hemmende Wirkung die Umwandlung von Arachidonsäure zu Thromboxan A₂ nicht hemmt und als solches die Aktivität des Enzyms Cyclooxygenase nicht hemmt, das diese Umwandlung katalysiert.
Folglich legen die Ergebnisse dieses Experiments nahe, dass die Aktivität der aktiven Anti-Plättchen-Aggregations-Bestandteile in Tomatenextrakten derjenigen von Aspirin verschieden sind.
BEISPIEL 5
Lokalisierung des aktiven Bestandteils in Tomaten
Vier Tomaten wurden geschält und geschnitten, um Präparationen zu gewinnen, die das folgende enthielten:

i) den Saft, der die Samen umgab; bezeichnet als T1
ii) nur Tomatenfleisch; bezeichnet als T2
iii) ganze Tomaten einschließlich der Samen; bezeichnet als T3.

Extrakte der Zubereitungen T1 bis T3 wurden wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt und die ADP induzierte Plättchen-Aggregations-Aktivität wurde jeweils gemessen.
Ergebnisse und Folgerungen
9 zeigt die Anti-Plättchen-Aggregations-Aktivität der Tomatenzubereitungen T1 bis T3 auf humane Blutplättchen. Die Zubereitungen T1 und T3 wiesen eine ähnliche Wirkstärke gegen ADP induzierte Plättchen-Aggregation auf. Darüber hinaus war die Plättchen-Aggregations-Aktivität, die in T1 und T3 gemessen wurde, im Vergleich zu T2 stark reduziert, was nahelegt, dass der aktive Anti-Plättchen-Aggregations-Bestandteil in einem größeren Umfang im Saft und den Samen der Tomate lokalisiert ist.
BEISPIEL 6
Bioverfügbarkeitsstudien
Vorläufige Studien bezüglich der Bioverfügbarkeit des aktiven Plättchen-Aggregationshemmenden Bestandteils in Tomatenextrakten wurden bei vier Freiwilligen durchgeführt. Dosierungen von 300 ml 100% Tomatensaft, hergestellt wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben, wurde jedem der vier Freiwilligen verabreicht. Die Plättchen-Aggregations-Aktivität wurde in venösen Blutproben gemessen, die den Freiwilligen unmittelbar bevor (Zeitpunkt 0) und eine Stunde nach (Zeitpunkt 1) Konsum des Saftes entnommen wurden.
Tabelle 3 zeigt die prozentuale Reduktion der ADP induzierten und Collagen induzierten Blutplättchen-Aggregations-Aktivität in Blutproben, die jedem der vier Individuen eine Stunde nach Konsum der Tomatensaftzubereitung entnommen wurden. Die Ergebnisse legen nahe, dass der Konsum von 300 ml Tomatensaft ausreichend ist, um die Blutplättchen-Aggregation ausreichend zu hemmen.
BEISPIEL 7
Untersuchung der kumulativen Wirkung des Konsums von Tomatensaft
300 ml Tomatensaft, die gemäß Beispiel 6 hergestellt wurden, wurden täglich zwei Individuen über eine zweiwöchige Zeitspanne verabreicht. Messungen der Blutplättchen-Aggregations-Aktivität zeigten, dass eine ungefähr 12% Hemmung der Blutplättchen-Aggregation im Vergleich zu Tag 0 vorlag und die Aktivität nicht beibehalten wurde, d.h. im Körper nicht akkumulierte.
Zubereitungen bzw. Formulierungen
BEISPIEL 8
Kapseln, die Fruchtextrakt enthalten
Eine Kapselformulierung wird durch Gefriertrocknen eines Fruchtextraktes hergestellt (beispielsweise ein Tomatenextrakt wie in den Beispielen 2 und/oder 3 beschrieben) und durch Einfüllen des sich ergebenden gefriergetrockenten Pulvers in eine Hartgelatinekapsel, so dass sich ein Kapselgehalt von 800 mg pro Kapsel ergibt.
BEISPIEL 9
Kapseln, die verdünnten Fruchtextrakt enthalten Einer wäßrigen Lösung der aktiven Fraktion aus Beispiel 2 oder Beispiel 3 wird ein Verdünnungsmittel zugesetzt, ausgewählt aus Saccharose, Lactose und Sorbitol. Die Lösung wird dann gefriergetrocknet, um ein Pulver zu ergeben, das in Hardgelatinekapselhüllen eingefüllt wird, so dass sich ein Kapselgehalt von 800 mg pro Kapsel (200 mg Tomatenextrakt und 600 mg Verdünnungsmittel) ergibt.
BEISPIEL 9
Kaubarer Frucht-Riegel, der getrockneten Fruchtextrakt enthält
Ein kaubarer Frucht-Riegel wird durch Kombinieren von gefriergetrocknetem Tomatenextraktpulver mit Hafermehl und Zusammenmischen mit anderen Inhaltsstoffen in einem Mixer, Komprimieren zu einer Riegelform und Backen hergestellt.
Die Erfindung wurde bezüglich spezieller Beispiele veranschaulicht, es wird jedoch leicht zu erkennen sein, dass zahlreiche Modifikationen und Veränderungen durchgeführt werden können, ohne vom Umfang der hierzu beigefügten Ansprüche abzuweichen.

Claims

Verwendung eines Fruchtextraktes oder aktiven Bestandteils hiervon für die Herstellung einer Zusammensetzung zur oralen Verabreichung zur Benutzung in der Prophylaxe oder Behandlung eines krankhaften Zustandes, der in einem Menschen begonnen hat, oder durch Thrombozytenaggregation gekennzeichnet ist, wobei der Extrakt oder der aktive Bestandteil aus einer Frucht gewonnen wird, die aus Früchten der Pflanzen der Familie Solnaceae, Rutaceae, Cucurbitaceae; Rosaceae, Musaceae, Anacardiaceae, Vitaceae, Arecceae, Ericaeae und Lauraceae ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 1 zur Hemmung der menschlichen Thrombozytenaggregation in einem Menschen, wobei der Extrakt oder der aktive Bestandteil aus Früchten gewonnen wird, die aus Früchten der Pflanzen der Familien Solnaceae, Rutaceae, Cucurbitaceae, Rosaceae, Musaceae, Anacardiaceae, Vitaceae, Arecceae, Ericaeae und Lauraceae ausgewählt wird.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Früchte ausgewählt werden aus Tomaten, Grapefruit, Melonen, Mangos, Nektarinen, Erdbeeren, Pflaumen, Bananen, Preißelbeeren, Trauben, Äpfeln und Avocado.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei die Früchte Tomaten sind.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei die Zusammensetzung einen aktiven Bestandteil von Tomaten beinhaltet, wobei der aktive Bestandteil einen im wesentlichen hitzestabilen, farblosen oder strohfarbenen wasserlöslichen Bestandteil oder Bestandteile beinhaltet, die ein Molekulargewicht von unter 1.000 aufweisen.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei die Früchte Grapefruit sind.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei die Früchte Melonen sind.
Verwendung nach irgendeinem der vorangegangenen Ansprüche, wobei der Fruchtextrakt ein wässriger Extrakt ist.
Verwendung nach irgendeinem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Zusammensetzung im wesentlichen aus dem Saft der Frucht besteht.
Verwendung nach irgendeinem der vorangegangenen Ansprüche, wobei der Fruchtextrakt aus dem Fleisch einer geschälten Frucht gewonnen wird.
Verwendung nach irgendeinem der vorangegangenen Ansprüche, wobei der Fruchtextrakt oder der aktive Bestandteil hiervon dehydriert worden ist, um einen trockenen Extrakt zu ergeben.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Zusammensetzung in Form einer festen oder halbfesten Dosierungsform besteht, die den getrockneten Extrakt beinhaltet.
Verwendung nach irgendeinem der vorangegangenen Ansprüche, wobei der Fruchtextrakt oder der aktive Bestandteil einen im wesentlichen hitzestabilen, farblosen oder strohfarbigen wasserlöslichen Bestandteil oder Bestandteile mit einem Molekulargewicht von weniger als 1.000 beinhaltet.
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 13, wobei der krankhafte Zustand aus Herzinfarkten, Schlaganfällen, kardiovaskulären Krankheiten und Krankheitszuständen, die mit Thrombozyten-Hyperaktivitäten einhergehen, ausgewählt wird.
Aktiver Bestandteil eines Fruchtextraktes zur Verwendung für die menschliche Thrombozyten-Aggregationshemmung durch orale Verabreichung, wobei der aktive Bestandteil in der Lage ist, durch einen Ultrafiltrationsfilter durchzutreten, der eine Molekulargewichtsbegrenzung von 1.000 aufweist und einen im wesentlichen hitzestabilen farblosen oder strohfarbigen wasserlöslichen Bestandteil oder Bestandteile mit einem Molekulargewicht von weniger als 1.000 beinhaltet.
Aktiver Bestandteil zur Verwendung nach Anspruch 15, wobei die Früchte Tomaten sind.
Aktiver Bestandteil zur Verwendung nach Anspruch 15 oder 16, welcher im trockenen Zustand ist.