DE69839273T2

DE69839273T2 - Krebsimmuntherapie mit semi-allogenen zellen

Info

Publication number: DE69839273T2
Application number: DE69839273T
Authority: DE
Inventors: Edward P. Chicago Cohen
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1997-01-31
Filing date: 1998-01-30
Publication date: 2009-03-05
Anticipated expiration: 2018-01-31
Also published as: US20080305131A1; CA2278678A1; US6187307B1; DE69839273D1; EP1012240A2; WO1998033527A2; US7402306B1; ATE389712T1; EP1012240B1; WO1998033527A3; US7670611B2; JP2001522226A

Description

Hintergrund der Erfindung
Erfindungsgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbesserte Antigen präsentierende semi-allogene immunogene Zellen, die so wirken, dass sie eine Immunantwort stimulieren und induzieren, wenn sie einem Individuum verabreicht werden. Insbesondere betrifft sie Zellen, welche sowohl allogene und syngene MHC-Derminanten exprimieren und welche ebenfalls mindestens ein Antigen exprimieren, das durch T-Lymphozyten erkannt wird. Die Erfindung ist ebenfalls auf Verfahren zur Induzierung einer Immunantwort und Verfahren zur Behandlung von Tumoren durch die Verabreichung der Antigen präsentierenden semi-allogenen immunogenen Zellen an ein Individuum gerichtet.
Stand der Technik
T-Lymphozyten erkennen einen außerordentlich breiten Bereich an relativ kleinen Peptiden, die von größeren Makromolekülen stammen, im Kontext membranassoziierter Strukturen, die durch den Klasse I Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) dargestellt werden.
Die meisten progressiv wachsenden neoplastischen Zellen bilden potentielle immunogene Tumor-assoziierte Antigene (TAAs). TAAs sind in einer Vielzahl von Tumoren identifiziert worden, einschließlich Melanomen, Brustadenokarzinom, Prostataadenokarzinom, Ösophaguskrebs, Lymphom und vielen anderen. Siehe den Übersichtsartikel von Shawler et al. Advance in Pharmacology 40: 309–337, Academic Press (1997). Wie andere Epitope werden TAAs auf Tumorzellen durch T-Lymphozyten im Kontext mit MHC-spezifizierten Determinanten erkannt. Traversari et al. (1992) J. Exp. Med. 176: 1453–1457; van der Bruggen et al. (1991) Science 254: 1643–164. Jedoch provozieren diese Tumorzellen keine Antitumorimmunantworten, die in der Lage sind, das Wachstum maligner Zellen zu kontrollieren. Boon et al. (1992) Cancer Surveys 13: 23–37; Boon, T. (1993) Int. J. Cancer 54: 177–180; Boon, T. (1992) Advances Cancer Res. 58: 177–209.
In den vergangenen Jahren hat sich die Aufmerksamkeit auf die Verwendung von Cytokinen in einem Versuch gerichtet, die Immunantwort gegen Tumor-assoziierte Antigene zu verstärken. Cytokine, wie beispielsweise Interleukin 2 (IL-2) oder Interferon (IFN-γ) sind verwendet worden, um neoplastische Erkrankungen zu behandeln, jedoch mit marginaler therapeutischer Wirksamkeit. Vieweg et al. (1995) Cancer Investigation 132(2): 193–201. Cytokine weisen keine direkten toxischen Wirkungen auf Krebszellen auf; ihre Antitumoraktivität wird durch die Modulierung der Immunantwort des Wirts gegen die Neoplasie vermittelt. Beispielsweise induziert Interferon-γ die Expression von MHC-Klasse I Determinanten und verstärkt die Sensivität von Tumorzellen gegenüber cytotoxischer T-Zellen-vermittelter Lyse. Lichtor et al. (1995) J. Neurosura 83: 1038–1044. IL-2 wird für das Wachstum cytotoxischer T-Lymphozyten benötigt und verstärkt Natürliche Killer (NK) und Lymphokin-aktivierte Killerzellen (LAK). Die beschränkte Wirkung der systemischen Verabreichung von IL-2 in der Krebsimmuntherapie wurde teilweise durch die kurze Halbwertszeit von IL-2 und die schwere Toxizität aufgrund der notwendigen hohen Dosierungen erklärt. Vieweg et al. (1995).
Lymphokin-aktivierte Killerzellen (LAK) sind ebenfalls als Ansatz verwendet worden, eine zelluläre Immunantwort auszulösen. LAK-Zellen sind MHC-unbeschränkte lymphoide Zellen, die frische Tumorzellen töten, jedoch keine normalen Zellen. Tumor-infiltrierende Lmyphozyten (TIL) sind vorherrschend MHC-beschränkte T-Zellen, die sich als 50- bis 100-mal stärker als LAK-Zellen in Mausmodellen herausstellten. Die Verwendung von LAK oder TIL entweder alleine oder mit IL-2 hat einige Antitumorwirkungen gezeigt. In einem kombinierten Ansatz bleibt jedoch die IL-2-Toxizität ein Problem. Vieweg et al. (1995).
Kürzlich hat die Immuntherapie neoplastischer Erkrankungen die Einschleusung von Genen für Cytokine in autologe maligne Zellen eingeschlossen, die dann in immunkompetente Empfänger eingeschleust werden. Die Einschleusung und Expression des Gens für IL-2 oder IFN-γ in eine Tumorzelle, für gewöhnlich durch eine retrovirale Transduktion, führt zur Erkennung der Zellen durch das Immunsystem, eine Abnahme der metastatischen Eigenschaften der Zellen und der Erzeugung von Immunantworten, die in der Lage sind, die Abstoßung sowohl der Cytokin-sezernierenden und der ursprünglicherweise nicht Cytokin-sezernierenden Tumorzellen zu verursachen. Wie bei anderen therapeutischen Strategien ist eine Eliminierung der gesamten neoplastischen Zellpopulation häufig unvollständig, und das Tumorwachstum kehrt zurück. Cohen et al. (1994) Seminars in Cancer Biology 5: 419–428.
In ähnlichen Studien führte die Einschleusung von Genen, die definierte, aber allogene (für den Empfänger fremde) MHC-Klasse I Determinanten in Maustumorzellen festlegen, zu einem Verlust der Tumorigenizität der Zellen in immunkompetenten Empfängern. Ähnlich wie Tumorzellen, die bezüglich der Cytokinsezernierung modifiziert worden sind, weisen Mäuse, die die Tumorzellen, die sowohl syngene und allogene Antigene exprimieren, eine Immunität gegenüber nicht modifizierten Neoplasien auf, die nur syngene Determinanten exprimieren. Das Überleben der Tumor-tragenden Mäuse, welche mit den modifizierten Zellen immunisiert worden, ist signifikant länger als das der nicht-immunisierten Mäuse, obwohl in den meisten Fällen das Tumorwachstum wieder einsetzt, und die Tiere schließlich der Erkrankung erliegen. Itaya et al. (1987) Cancer Res. 47: 3136–3140; Hui et al. (1989) J. Imunol. 143: 3835–43; Ostrand-Rosenberg (1991) Int. J. Cancer [Suppl] 6: 61–8.
Die Modifizierung von Tumorzellen zum Zwecke der Immuntherapie benötigt die Etablierung von einer Zelllinie aus den malignen Zellen eines Patienten. Die Etablierung einer derartigen Zelllinie kann nicht immer erreicht werden, wie beispielsweise gezeigt wurde von Oettgen et al., Immunol. Allergy, Clin. North. Am. 10: 607–637 (1990). Zusätzlich können maligne Zellen, die aus einem Patienten isoliert worden sind, welche in der Lage sind, in vitro zu wachsen, nicht die gesamte Neoplasie des Patienten widerspiegeln. Das bedeutet, dass Tumor-assoziierte Antigene, die auf nur einer kleinen Population an Zellen vorhanden sind, nicht in Zellen enthalten sein müssen, welche in der Lage sind, in vitro zu wachsen. Außerdem führt in den seltenen Fällen, in denen eine maligne Langzeit-Zelllinie etabiliert werden kann, eine Transduktion der Zelllinien und die Transduktion der Zelllinien und die post-Transduktionsselektion zu einem selektiven Verlust der Tumor-assozierten Antigene, die durch die malignen Parental-Zellen in vivo exprimiert werden.
Kürzlich durchgeführte Studien im Bereich der Krebsimmuntherapien haben die Verwendung allogener Zellen eingeschlossen, wie beispielsweise Mausfibroblasten, die genetisch so verändert worden sind, dass sie (Antikörper-definierte) Malanom-assoziierte Antigene (MAAs) exprimierten und IL-2 sezernieren. Mäuse mit etabliertem Melanom, die mit den modifizierten Fibroblasten immunisiert wurden, entwickeln eine starke zelluläre Antimelanom-Immunantwort, die hauptsächlich von CD8⁺-T-Zellen, Makrophagen und natürliche Killer/Lymphokin-aktivierte Killer (NK/LAK)-Zellen vermittelt wird. Immunisierte Mäuse überleben signifikant länger als sowohl nicht-immunisierte Mäuse und Mäuse, die mit bestrahlten Melanomzellen immunisiert worden sind. Kim et al. (1992) Int. J. Cancer 51: 283–289.
Zwei einander nicht ausschließende Mechanismen sind vorgeschlagen worden, um die verbesserte Reaktion gegen autologe Tumore in Mäusen zu erklären, die mit allogenen Zellen immunisiert wurden, welche so modifiziert worden sind, dass sie IL-2 sezernieren und MAAs exprimieren: (i) große Anzahlen an CTLs mit Spezifität gegen Tumor-assoziierte Antigene, welche durch die Neoplasmie exprimiert werden, werden in der Mikroumgebung der Allograft-Erkennung und Abstoßung erzeugt (die immunogenen Eigenschaften der Tumorzellen, die mit Genen transfiziert werden, welche allogene Determinanten festlegen, wirkt unterstützend, Hui et al. (1989) J. Immunol. 143: 3835–3843; Ostrand-Rosenberg et al. (1991) J. Cancer 6: [Suppl.]: 61–680); und (ii) allogene MHC-Klasse I Determinanten präsentieren Tumor-assoziierte T-Zellepitope direkt in CTL-Vorläuferzellen. Die starke lokale Umgebung mit IL-2, welches von gentechnisch modifizierten Zellen sezerniert wird, verstärkt die Erzeugung großer Anzahlen an CTLs mit Antitumorspezifität weiter.
WO 98/11202 offenbart semi-allogene Zellhybride als präventive und therapeutische Vakzine für Krebs und AIDS.
Toffaletti et al. (The Journal of Immunology, 1983, Bd. 130, Nr. 6, Seite 2980–2986) offenbart die Steigerung syngener Tumor-spezifischer Immunität durch semi-allogene Zellhybride.
Payelle et al. (International Journal of Cancer, 27, 783–788 (1981) offenbart den adaptiven Transfer der Immunität, welche durch semi-allogene Hybridzellen gegen ein murines Fibrosarkom induziert wurde.
Weisong et al. (Cancer Immuno. Immunother (1998) 45: 217–224) offenbart, dass die Co-Expression immunogener Determinanten durch das gleiche zelluläre Immunogen für die optimale immunotherapeutische Nützlichkeit in Mäusen mit Melanomen benötigt wird.
Vieweg et al. (Cancer Investigation, 13(2), 193–201 (1995)) offenbart Ansichten zur Verwendung Cytokin-sezernierender Tumorzellpräparate für die Krebsbehandlung.
Obwohl das Überleben tumortragender Mäuse, die mit IL-2 sezernierenden, TAA exprimierenden Allogenzellen behandelt wurden, signifikant (P < 0,001) länger ist, als das unbehandelter Mäuse, wird in den meisten Fällen die Tumorzellpopulation unvollständig ausgetilgt, und die Mäuse sterben schließlich an einem progressiven malignen Melanom. Kim et al. (1994) Cancer Immunol. Immunother. 38: 185–193. Der Status der Gentherapie wird allgemein beleuchtet von Roth und Cristiano, J. National Cancer Institute 89(1): 21–39 (1997), jedoch müssen signifikante Hindernisse in der Krebsimmuntherapie noch überwunden werden.
Demgemäß gibt es einen Bedarf für effizientere zelluläre immunogene Zellen, welche stärkere und länger anhaltende T-Zell-vermittelte Immunantworten gegen Krebszellen im Körper auslösen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf Antigen repräsentierende semi-allogene immunogene Zellen, die genetisch selektiert wurden, welche mindestens eine Klasse I MHC- oder Klasse II MHC-Determinante exprimieren, die für den Empfänger syngen ist, mindestens eine Klasse I oder Klasse II MHC-Determinante, die allogen für den Empfänger ist, und mindestens ein Antigen, das durch T-Zellen erkannt wird, wobei die Antigen präsentierende Zelle mit den DNA transformiert ist, welche für mindestens ein Antigen codiert, das durch T-Zellen erkannt wird, und diese exprimiert, und wobei die semi-allogene Zelle keine Hybridzelle ist, die gegenüber einem dominanten Marker resistent ist.
Nach einem Aspekt der Erfindung umfassen die Antigen präsentierenden semi-allgenen immunogenen Zellen eine Antigen präsentierende Zelle, welche mindestens eine Klasse I und Klasse II MHC-Determinante exprimiert, wobei mindestens eine Klasse I MHC- oder Klasse II MHC-Determinante syngen für den Empfänger ist und wobei mindestens eine der Klasse I oder Klasse II MHC-Determinanten, die von der Antigen präsentierenden Zelle exprimiert wird, allogen mit dem Empfänger ist, und wobei die Antigen präsentierende Zelle mit Nukleinsäuremolekülen transformiert ist und diese exprimiert, welche für mindestens ein Antigen codieren, das durch T-Zellen erkannt wird, und wobei diese semi-allogene Zelle keine Hybridzelle ist, die gegenüber einem dominanten selektierbaren Marker resistent ist.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform umfassen die Nukleinsäuremoleküle, die für mindestens ein Antigen codieren, das durch T-Zellen erkannt wird, eine bekannte codierende Sequenz eines Antigens, das durch T-Zellen erkannt wird. Die codierenden Sequenzen, die erfindungsgemäß in Erwägung gezogen werden, schließen codierende Sequenzen eines infektiösen Agens ein, wie beispielsweise eines Bakteriums, eines Virus oder eines Parasiten, wie auch codierende Sequenzen für Tumor-assoziierte Antigene (TAAs).
Die bevorzugten codierenden Sequenzen der vorliegenden Erfindung sind solche, die für Tumor-assistierte Antigene codieren (TAAs). Eine Vielzahl bekannter TAA codierender Sequenzen kann für diese Zwecke verwendet werden, welche Gene der MAGE-Familie, BAGE, Tyrosinase, CEA, CO17-1A, MART-1, gp100, MUC-1, TAG-72, CA 125, Decappeptide 810, P1A, mutierte Proto-Onkogene, wie beispielsweise p21^ras, P210-Gen und HER-2/neu; mutierte Tumorsuppressorgene, wie beispielsweise p53, einschließen, aber nicht darauf beschränkt sind; und (4) Tumor-assozierte virale Antigene, wie HPV16 E7. Diese Gene sind in der Literatur, z. B. Shawler et al. (1997) umfassend beschrieben worden.
In einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform umfasst das Nukleinsäuremolekül, was für mindestens ein Antigen codiert, das durch T-Zellen erkannt wird, genomische DNA oder RNA, welche aus einem infektiösen Agens, wie beispielsweise einem Bakterium, Virus oder Parasiten, isoliert worden ist, oder aus Tumorzellen. Erfindungsgemäß können die Tumorzellen, die für die Isolierung von DNA oder RNA verwendet werden, Zellen einer Tumorzelllinie und auch Zellen einer Neoplasie oder eines Tumors eines Empfängers einschließen. Viele Tumorzelllinien sind für diesen Zweck verfügbar, wie beispielsweise Maus B16-Melanomzellen, Maus E0771-Mammaadenokarzinomzellen und menschliche Tumorzelllinien. Vorzugsweise werden die Tumorzellen, aus denen die DNA oder RNA isoliert wird, aus einer festen oder diffusen Neoplasie (d. h. einem soliden oder hämatologischen Tumor) eines Empfängers gewonnen. Die Neoplasien schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Melanom, Lymphom, Plasmozytom, Sarkom, Gliom, Thymom, Leukämien, Brustkrebs, Prostatakrebs, Kolonkrebs, Ösophaguskrebs, Hirnkrebs, Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Zervixkarzinom, Hepatom und andere Neoplasien, die im Fachgebiet bekannt sind, wie beispielsweise solche, die von Shawler et al. (1997) beschrieben worden sind.
Nach einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt umfassen die Antigen präsentierenden semi-allogenen immunogenen Zellen eine semi-allogene Hybridzelle, die durch die Fusion einer Antigen präsentierenden Zelle mit einer Tumorzelle gebildet wird, wobei die Hybridzelle mindestens eine Klasse I MHC- oder Klasse II MHC-Determinante exprimiert, die syngen mit einem Empfänger ist, und mindestens eine Klasse I oder Klasse II MHC-Determinante, die allogen mit dem Empfänger ist, und wobei die Hybridzelle ebenfalls mindestens ein Antigen exprimiert, das durch T-Zellen erkannt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Antigen, das durch semi-allogenen Hybridzellen exprimiert wird, das von T-Zellen erkannt wird, ein Tumor-assoziiertes Antigen, wobei die semi-allogene Zelle eine Hybridzelle ist, die gegenüber einem dominanten selektierbaren Marker resistent ist.
Erfindungsgemäß können alle oben beschriebenen Tumorzellen in einer derartigen Zellfusion benutzt werden, einschließlich Zellen einer Tumorzelllinie, und Zellen aus einem Tumor eines Empfängers. Vorzugsweise werden die Tumorzellen aus einer soliden oder diffusen Neoplasie gewonnen (d. h. einem soliden oder hämatologischen Tumor) eines Empfängers. Die Neoplasien schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Melanom, Lymphom, Plasmozytom, Sarkom, Gliom, Thymom, Leukämien, Brustkrebs, Prostatakrebs, Kolonkarzinom, Ösophaguskrebs, Hirnkrebs, Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Zervixkarzinom, Hepatom und andere Neoplasien, die im Fachgebiet bekannt sind, wie beispielsweise die, die von Shawler et al. (1997) beschrieben worden sind.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung werden die Antigen präsentierenden semi-allogenen immunogenen Zellen auch mit einer Nukleinsäuresequenz transformiert und exprimieren eine, die für mindestens ein Cytokin codiert.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung richtet sich auf therapeutische Zusammensetzungen, die genannten Antigen präsentierenden semi-allogenen immunogenen Zellen umfassen.
Einen weiteren Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur Induzierung einer immunologischen Antwort bereit, welche das Verabreichen einer immunologisch wirksamen Menge der genannten Antigen präsentierenden semi-allogenen immunogenen Zellen an ein Tier, das einer derartigen Reaktion bedarf, umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt auch die Verwendung der genannten Antigen präsentierenden semi-allogenen immunogenen Zellen zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention oder Behandlung eines Tumors in einem Tier bereit.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Diese und andere Merkmale, Aspekte und Vorteile der Zusammensetzungen und Methoden der vorliegenden Erfindung werden besser unter Betrachtung der folgenden Beschreibung, der angehängten Ansprüche und der beigefügten Zeichnungen klar. So wie es hier verwendet wird, kennzeichnet das Symbol "/", dass die relevanten Zellen mit genomischer DNA transfiziert sind, während das Symbol "x" zeigt, dass die relevanten Zellen fusioniert sind und zu Hybridzellen führen. Beispielsweise stellt "LM-IL-2K^b/B16" LM-IL-2K^b-Zellen dar, die mit genomischer DNA von B16-Zellen transfiziert sind; "LM(TK-) × B16" stellt Hybridzellen dar, die durch Fusionieren von LM(TK-)-Zellen und B16-Zellen gebildet wurden.
1 stellt graphisch eine Immunfluoreszenzfärbung von LM-IL-2-Zellen mit Antikörpern für H-2K^b-Determinanten dar, die mit pBR327H-2K^b transduziert worden sind. Die dünne Linie zeigt an, dass die Zellen mit IgG_2a-Isotypserum inkubiert wurden. Die dicke Linie zeigt an, dass die Zellen mit anti-H-2K^b-, anti-H-2K^k- oder anti-H-2D^b-mAbs inkubiert worden sind.
2 stellt graphisch das Tumorwachstum in C57BL/6J-Mäusen dar, denen eine Mischung aus B16-Melanomzellen und einer der folgenden injiziert wurde: Medium (gefüllte Quadrate), LMZipNeo-Zellen (offene Diamanten), LM-IL-2 (offene Kreise), LM-IL-2/B16-Zellen (gefüllte Dreiecke); LM-IL-2K^b/B16-Zellen (gefüllte Kreise).
3 stellt graphisch das Überleben von C57BL/6J-Mäusen dar, denen ein Gemisch aus B16-Melanomzellen und einem der folgenden injiziert wurde: Medium (gefüllte Quadrate), LMZipNeo-Zellen (offene Quadrate), LM-IL-2 (offene Dreiecke), LM-IL-2/B16-Zellen (offene Kreise); LM-IL-2K^b/B16-Zellen (gefüllte Dreiecke).
4 stellt graphisch die Dauer bis zum ersten Auftreten eines Tumors in Mäusen dar, die nach der vorigen Injektion von B16-Zellen und LM-IL-2K^b/B16-Zellen überlebten, denen ein zweites Mal B16-Zellen alleine injiziert wurden. Offene Kreise stellen naive Mäuse mit einer mittleren Überlebensdauer (M. S. T.) von 34,4 ± 2,2 Tagen dar. Gefüllte Kreise stellen Mäuse dar, die 120 Tage überleben und eine mittlere Überlebensdauer von 53,0 ± 7,1 Tagen haben.
5 stellt graphisch das Überleben von C57BL/6J-Mäusen mit Melanomen dar, welche mit LM-IL-2K^b/B16-Zellen behandelt wurden. Gefüllte Kreise stellen Mäuse dar, denen B16-Zellen alleine injiziert wurden. Offene Kreise stellen Mäuse dar, denen B16-Zellen 20 Tage vor den LM-IL-2K^b/B16-Zellen injiziert wurden. Offene Dreiecke stellen Mäuse dar, denen B16-Zellen 10 Tage vor dem LM-IL-2K^b/B16-Zellen injiziert wurden. Offene Kreise stellen Mäuse dar, denen B16-Zellen 5 Tage vor den LM-IL-2K^b/B16-Zellen injiziert wurden. Gefüllte Dreiecke stellen Mäuse dar, denen eine Mischung aus B16-Zellen und LM-IL-2K^b/B16-Zellen injiziert wurden.
6 stellt graphisch die Cytotoxizität gegenüber B16-Zellen in C57BL/6J-Mäusen dar, denen zerstörte oder intakte LM-IL-2K^b/B16-Zellen injiziert wurden.
7 stellt graphisch das Überleben von C57BL/6J-Mäusen dar, denen eine Mischung aus B16-Zellen und Nicht-Cytokin-sezernierenden Zellen injiziert wurde. Gefüllte Kreise stellen Mäuse dar, denen B16-Zellen injiziert wurden; gefüllte Quadrate stellen Mäuse dar, denen B16-Zellen und LM-K^b-Zellen injiziert wurden; gefüllte Dreiecke stellen Mäuse dar, denen B16-Zellen und LM-K^b/B16-Zellen injiziert wurden.
8 stellt die Immunfluoreszenzfärbung von B16 × LM-Hybridzellen dar. A Zellen, die mit anti-MAA-Antikörpern inkubiert wurden. B Zellen, die mit anti-H-2K^b mAb inkubiert wurden. C Zellen, die mit anti-H-2K^b mAb inkubiert wurden. Schwarze Bereiche Zellen, die mit spezifischen Antikörpern inkubiert wurden; weiße Bereiche Zellen, die mit IgG2a-Isotypen-Serum inkubiert wurden.
9 stellt die Immunfluoreszenzfärbe von B16 × LM-Hybridzellen mit B7.1 mAb in einem Durchfluss-Cytofluorographen dar. Die feinen Linien stellen Zellen dar, die mit dem IgG2a-Isotypenserum inkubiert wurden. Die dicken Linien stellen Zellen dar, die mit anti-B7.1 mAb inkubiert wurden.
10 stellt das Überleben von C57BL/6J-Mäusen dar, denen eine Mischung aus B16-Zellen und B16 × LM-Hybridzellen injiziert wurden. Mittlere Überlebensdauer: (1) injiziert mit lebensfähigen B16-Zellen alleine, 29,3 ± 4,1 Tage (gefüllte Quadrate); (2) injiziert mit lebensfähigen B16-Zellen und bestrahlten B16-Zellen, 36,8 ± 5,3 Tage (Kreuz); (3) injiziert mit lebensfähigen B16-Zellen und LM(TK-)-Zellen, 35,4 ± 1,7 Tage (offene Kreise); (4) injiziert mit lebensfähigen B16-Zellen, bestrahlten B16-Zellen und LM(TK-)-Zellen, 36,8 ± 5,3 Tage (offene Quadrate); und (5) injiziert mit lebensfähigen B16-Zellen und B16 × LM-Hybridzellen, 52,6 ± 11,0 Tage (gefüllte Kreise). Überlebensdauer der mit lebensfähigen B16-Zellen und mit B16 × LM-Hybridzellen injizierten Mäuse gegenüber dem Überleben von Mäusen in irgendeiner anderen Gruppen, P < 0,005.
11 stellt die mittlere Überlebensdauer von C57Bl/6J-Mäusen dar, denen eine Mischung aus B16 × LM-Hybridzellen und B16 Melanomen, GL 261-Gliom, c1498-Lymphom oder EL-4- Thymomzellen infiziert wurden. Das Überleben der Mäuse, denen lebensfähige B16-Zellen und B16 × LM-Hybridzellen injiziert wurden, bezogen auf das Überleben der Mäuse in jeder der anderen Gruppen, P < 0,05. Gestreifte Balken: Mäuse, denen B16-Melanomzellen, Gl 261-Gliom-, c1498 Lymphom- oder EL-4-Thymomzellen alleine injiziert wurden; gefüllte Balken: Mäuse, denen eine Mischung aus B16 × LM-Hybridzellen und einer von B16 Melanom-, Gl 261 Gliom-, c1498 Lymphom- und EL-4-Thymomzellen injiziert wurden.
12 stellt die cytotoxischen Reaktionen (Prozent der spezifischen Cytolyse) gegen B16-Melanom-, c1498-Lymphom-, EL-4-Thymom- und Gl 261-Gliomzellen in Mäusen dar, die mit B16 × LM-Hybridzellen immunisiert wurden. P < 0,001 für die spezifische Cytolyse von B16-Zellen in Gegenwart von Milzzellen aus Mäusen, denen die Hybridzellen injiziert wurden, gegenüber der spezifischen Cytolyse von c1498-, EL-4- oder Gl 261-Gliomzellen. Gefüllte Balken: Milzzellen von Mäusen, denen B16 × LM-Hybridzellen injiziert wurden; gestreifte Balken: Milzzellen von naiven C57BL/6-Mäusen.
13 stellt die Wirkung von CD8+, CD4+ oder Asiolo-GM1 mAb oder Milzzell-vermittelten cytotoxischen Reaktionen gegenüber B16-Zellen in C57BL/6-Mäusen, die mit B16 × LM-Hybridzellen immunisiert wurden, dar.
14 stellt das Tumorwachstum in C57BL/6J-Mäusen dar, denen eine Mischung aus EO771-Brustkrebszellen und LM-IL-2K^b/EO771-Zellen injiziert wurden. Das mittlere Tumorvolumen stammte aus zweidimensionalen Messungen, welche mit einem Nummernmessschieber gewonnen wurden. P < 0,01. Beim ersten Auftreten des Tumors in der Gruppe der Mäuse, denen EO771-Zellen und LM-IL-2K^b/EO771-Zellen injiziert wurden, und bei jeder der anderen Gruppen.
15 stellt das Überleben von C57BL/6J-Mäusen dar, denen eine Mischung aus EO771-Brustkarzinomzellen und LM-IL-2K^b/EO771-Zellen injiziert wurden. Mittlere Überlebensdauern: Mäusen, denen lebensfähige EO711-Zellen alleine injiziert wurden, 34,5 ± 5,8 Tage (gefüllte Quadrate); Mäuse, denen lebensfähige EO771-Zellen und LM-Zellen injiziert wurden, 41 ± 14 Tage (gefüllte Dreiecke); Mäusen, denen lebensfähige EO771-Zellen und LM-IL-2K^b-Zellen injiziert wurden, 44 ± 9 Tage (offene Kreise); Mäuse, denen lebensfähige EO771-Zellen und LM-IL-2K^b/B16-Zellen injiziert wurden, 46 ± 11 Tage (gefüllte Kreise); von den sieben Mäusen, denen lebensfähige EO771-Zellen und LM-IL-2K^b/EO771-Zellen injiziert wurden < 110 Tage (gefüllte Quadrate); und MST für die verbleibenden Mäuse, die an einem progressiven Tumorwachstum starben, = 54 ± 9. P als Differenz des Überlebens von Mäusen, denen lebensfähiger EO771-Zellen und LM-IL-2K^b/EO771-Zellen injiziert wurden, bezogen auf das Überleben von Mäusen in jeder der anderen Gruppe < 0,001.
16 stellt das Überleben von C57BL/6J-Mäusen dar, die eine vorhergehende Injektion von EO771-Zellen und LM-IL-2K^b/EO771-Zellen überlebten, denen EO771-Zellen alleine injiziert wurden, wobei die gefüllten Kreise überlebende Mäuse darstellen, denen EO771-Zellen injiziert wurden und die offenen Quadrate naive Mäuse darstellen, die in EO771-Zellen injiziert wurden.
17 stellt das Tumorwachstum in C3H/HeJ-Mäusen dar, die in einer Mischung von SB-1-Brustkrebszellen und LM-IL-2K^b/SB-1-Zellen injiziert wurden. P < 0,01 beim ersten Auftreten eines Tumors in der Gruppe der Mäuse, die in SP1-zellen injiziert wurden und LM-IL-2K^b/SB-1-Zellen und in irgendeiner der anderen Gruppen.
18 stellt das Überleben von C3H/HeJ-Mäusen dar, die in eine Mischung aus SB-1-Brustkarzinomzellen und LM-IL-2K^b/SB-1-Zellen injiziert wurden. Mittlere Überlebensdauer: Mäuse, denen SB-1-Zellen alleine injiziert wurden, 29 ± 7 Tage (gefüllte Quadrate); Mäuse, denen SB-1- Zellen und LM-IL-2-Zellen injiziert wurden, 38 ± 8 Tage (gefüllte Dreiecke); Mäuse, denen SB-1-Zellen und LM-IL-2K^b-Zellen injiziert wurden, 34 ± 7 Tage (offene Kreise); Mäuse, denen SB-1-Zellen und LM-IL-2/SB-1-Zellen injiziert wurden, 36 ± 5 Tage (offene Dreiecke); Mäuse, denen SB-1-Zellen und LM-IL-2K^b/EO771-Zellen injiziert wurden, 51 ± 18 Tage (offene Quadrate); Mäuse, denen SB-1-Zellen und LM-IL-2K^b/SB-1-Zellen injiziert wurden, 76 ± 26 Tage (gefüllte Kreise). Das Überleben der Mäuse, denen SB-1-Zellen und LM-IL-2K^b/SB-1-Zellen injiziert wurden, bezogen auf das Überleben von Mäusen, die in jeder der anderen Gruppen waren p < 0,01.
19 stellt die immunhistochemische Färbung von Brustkrebs in Mäusen dar, denen SB-1-Zellen und LM-IL-2K^b/SB-1-Zellen injiziert wurden. Zellen, die mit CD8+ mAbs, innerhalb des Epitheliums des Tumors färben sind durch
angezeigt. + zeigt Stromazellen, die die Epitheldukte auskleiden. Horizontaler Balken = 11,0 μm.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf Antigen präsentierende semi-allogene immunogene Zellen, die genetisch ausgewählt wurden, und welche sowohl allogene (dem Empfänger fremde) und syngene (dem Empfänger gleiche) MHC-Determinanten exprimieren und die ebenfalls mindestens ein anderes Antigen exprimieren, das durch T-Lymphozyten des Empfängers erkannt wird und die allogenen und syngenen MHC-Determinanten zusammenbringt. Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf die Verwendung der genannten semi-allogenen immunogenen Zellen zur Herstellung von Medikamenten.
Erfindungsgemäß ist überraschend gefunden worden, dass die kombinierte Expression sowohl syngener und allogener MHC-Determinanten zusammen mit der Expression von Antigenen, die durch T-Zellen bekannt werden, eine immunologische Reaktion von noch größerem Ausmaß stimuliert als immunogene Zellen, die entweder syngene oder allogene MHC-Determinanten alleine exprimieren. Beispielsweise ermöglichen die kombinierte Expression sowohl syngener als auch allogener MHC Klasse I Determinanten zusammen mit der Expression von Tumor-assoziierten Antigenen (TAAs) in Fibroblastenzellen stark erhöhte, Langzeit-Antitumor-zelluläre Immunreaktionen in Mäusen, die mit den semi-allogenen Fibroblastenzellen immunisiert wurden. In einigen Fällen stoßen die Tiere die Tumorzellen ab und überleben endlos. Die Antigen präsentierenden semi-allogenen immunogenen Zellen der vorliegenden Erfindung umfassen eine Zelle, die genetisch ausgewählt ist, welche MHC-Determinanten exprimiert, die semi-allogen für den Empfänger sind und ebenfalls mindestens ein Antigen exprimieren, das durch T-Zellen erkannt wird.
Der Begriff "eine Zelle" oder "Zellen" bezieht sich, so wie es hier verwendet wird, auf einzelne Zellen wie auch Zellpopulationen.
Der Begriff "genetisch ausgewählt", so wie es hier verwendet wird, kennzeichnet Zellen, z. B. Antigen präsentierende Zellen, die durch genetische Ansätze ausgewählt wurden, um sicherzustellen, dass sie derartige MHC-Determinanten exprimieren, die semi-allogen sind und ebenfalls mindestens ein Antigen exprimieren, das durch T-Zellen erkannt wird. Die genetischen Ansätze, die verwendet werden, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, HLA-Typisierung, Transformation oder Transfektionstechniken zur Einschleusung von Nukleinsäuremolekülen in die Antigen präsentierenden Zellen und Zellfusionstechniken. Diese Techniken sind im Fachgebiet gut bekannt und werden in der Offenbarung, die folgt, weiter beschrieben.
Fachleute auf dem Gebiet können die vorliegende Erfindung für die genannten semi-allogenen immunogenen Zellen, die genetisch für die Immuntherapie ausgewählt wurden, einschätzen. Antigen präsentierende Zellen exprimieren für gewöhnlich mindestens eine MHC-Determinante. Jedoch können Antigen präsentierende Zellen, die für gewöhnlich verwendbar sind, MHC-Determinanten exprimieren, die semi-allogen sind, d. h. diese Zellen können nur allogene MHC-Determinanten exprimieren, oder nur syngene Determinanten. Solche Antigen präsentierenden Zellen können mit Nucleinsäuremolekülen transformiert werden, die mindestens eine Klasse I oder Klasse II MHC-Determinante codieren (entweder syngen oder allogen), so dass transformierte Antigen präsentierende Zellen ausgewählt werden, die sowohl syngene als auch allogene Determinanten exprimieren. Unter anderen Umständen sind eine Anzahl an Donor-Antigen präsentierenden Zellen in einer Bank oder einem Krankenhaus verfügbar, die sowohl syngene als auch allogene MHC-Determinanten exprimieren oder nicht. Erfindungsgemäß werden geeignete Donorzellen für die Immuntherapie ausgewählt, die sowohl allogene als auch syngene MHC-Determinanten exprimieren, beispielsweise durch HLA-Typisierung einer Vielzahl von Donorzellen und dem Empfänger. Unter anderen Umständen können Antigen präsentierende Zellen, die verfügbar sind, nicht mindestens ein Antigen exprimieren, das durch T-Zellen des Empfängers erkannt wird. Erfindungsgemäß können solche Antigen präsentierenden Zellen dann durch DNA transformiert werden, welche mindestens ein Antigen codiert, das durch T-Zellen des Empfängers erkannt wird. Antigen präsentierende Zellen können ebenfalls genetisch modifiziert werden, z. B. durch ein Zellfusionsverfahren, so dass die erhaltenen Hybridzellen mindestens eine syngene MHC-Determinante exprimieren, mindestens eine allogene Determinante und mindestens ein Antigen, das von T-Zellen erkannt wird.
Erfindungsgemäß exprimieren die Antigen präsentierenden Zellen, auf die hier Bezug genommen wird, mindestens ein Klasse I oder Klasse II MHC-Determinante und können solche Zellen umfassen, die als professionelle oder konstitutive Antigen präsentierende Zellen, wie beispielsweise Makrophagen, dendritische Zellen und B-Zellen bekannt sind. Andere professionelle Antigen präsentierende Zellen schließen Monozyten, Makrophagen, Kupfferzellen der Marginalzone, Mikroglia, Langerhans'sche Zellen, interdigitierende dendritische Zellen, follikuläre dendritische Zellen und T-Zellen ein. Fakultative Antigen präsentierende Zellen können ebenfalls in den immunogenen Zellen der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Beispiele fakultativ Antigen präsentierender Zellen schließen Astrozyten, follikuläre Zellen, Endothelium und Fibroblasten ein. So wie es hier verwendet wird, umfassen "Antigen präsentierende Zellen" sowohl professionelle (konstitutive) und fakultative Arten an Antigen präsentierenden Zellen.
Es ist klar, dass, so wie es hier verwendet wird, der Begriff "Fibroblast" auch solche Zellarten einschließt, die sich in Fibroblasten entwickeln, wie beispielsweise mesenchymale Stammzellen, Young et al. (1995) Dev. Dynamics 202: 137–144.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die fakultative Antigen präsentierende Zelle ein Fibroblast. Menschliche Fibroblastenzelllinien, etabliert aus normalen Fibroblastenzellen wie auch maligne Fibroblastenzellen, die aus Individuen entnommen werden, können von der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852-1776 bezogen werden. Menschliche Fibroblasten können ebenfalls aus Vorhäuten von Kindern nach der Beschneidung gewonnen werden. Massenweise Lieferungen von Vorhäuten von Kindern sind in Kinderabteilungen von Krankenhäusern verfügbar. Makrophagenzelllinien und B-Zelllinien sind durch die ATCC verfügbar. Andere Antigen präsentierende Zellen, einschließlich Fibroblasten, können aus Gewebeproben, die von menschlichen Individuen gewonnen werden, isoliert werden.
Die immunogenen Zellen der vorliegenden Erfindung exprimieren MHC-Determinanten, die semi-allogen zum Empfänger sind.
"Semi-allogene MHC-Determinanten" bezieht sich mindestens eine Klasse I oder Klasse II MHC-Determinante, die durch die genannten immunogenen Zellen exprimiert wird, welche syngen zum Empfänger ist, und mindestens eine Klasse I oder Klasse II MHC-Determinante ist allogen mit dem Empfänger. "Syngen" bezieht sich auf ein MHC-Allel, das für eine HLA-Spezifität codiert, die mindestens mit einem der Klasse I oder Klasse II MHC-Allele des Empfängers übereinstimmt und damit immunologisch kompatibel ist. "Allogen" bezieht sich auf mindestens eines der Klasse I oder Klasse II MHC-Allele, das für eine HLA-Spezifität codiert, die mit mindestens einem der Klasse I oder Klasse MHC-Allele des Empfängers nicht übereinstimmt und immunologisch nicht kompatibel ist.
Wie in der Literatur beschrieben ist, wird der menschliche MHC-Locus, als HLA bezeichnet, auf Chromosom 6 gefunden und enthält mindestens 50 nah verwandte Gene. Es gibt drei klassische MHC Klasse I Gene, HLA-A, -B und -C, jedes davon codiert eine α-Kette eines MHC-Klasse I Moleküls. Die menschlichen MHC-Klasse II Gene sind in mindestens drei Unterregionen arrangiert, HLA-DP, -DQ und -DR, von denen jede mindestens ein α-Gen und ein β-Gen enthält, Roitt et al., Immunology, 2. Auflage, Gower Medical Publishing, New York, 1989.
Es gibt eine große Anzahl an Genen in dem MHC-Locus und einen großen Grad an Polymorphismen innerhalb jedes MHC-Gens. So hat eine normale menschliche Population eine sehr große Anzahl verschiedener Genotypen. Tabelle I (übernommen von Roitt et al.) listet die verschiedenen Antigen-Spezifitäten auf, die in jeder HLA-Subregion nachgewiesen werden. Ein Haplotyp ist ein Satz an MHC-Genen, die auf einem Chromosom 6 verbunden sind. Da ein Individuum ein maternales und ein paternales Chromosom 6 erbt, stammt ein HLA-Haplotyp von jedem Elternteil.
In Mäusen wird der MHC-Locus (als H-2 bezeichnet) auf Chromosom 17 gefunden. Es gibt drei übergreifende MHC-Klasse I Gene, H-2K, H-2D und H-2L. Es gibt auch drei Haupt-MHC Klasse II Gene, H-2A, H-2E und H-2M.
Die vorliegende Erfindung beschreibt, wie man Antigen präsentierende Zellen genetisch modifiziert, so dass diese Zellen MHC-Determinanten exprimieren, die semi-allogen mit dem Empfänger sind. Unter den Umständen, dass die Antigen präsentierende Zelle, die verwendet wird, nur allogene Determinanten exprimiert, kann ein Nukleinsäuremolekül, wenn es für mindestens eine syngene Determinante codiert, in die Antigen präsentierende Zelle durch gut bekannte Transfektions- oder Transformationsverfahren eingeschleust werden, wie beispielsweise durch die die beschrieben wurden durch Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
Die Durchführungsbeispiele beschreiben ein Verfahren zur Einschleusung eines Gens für eine syngene Maus MHC-Klasse I Determinante, H-2K^b, in Mausfibroblastenzellen, die allogene MHC-Determinanten des k-Haplotyps exprimieren, d. h. H-2^k. (Hochstellen wird verwendet, um den Haplotyp anzuzeigen.) wenn es in einer Immuntherapie in Form eines Tiers benutzt wird, beispielsweise in der menschlichen Immuntherapie, muss der Schritt des Einschleusens eines Gens einer menschlichen syngenen MHC-Determinante in eine Antigen präsentierende Zelle nicht immer notwendig sein. Donor-Antigen präsentierende Zellen können verfügbar sein, die mindestens eine Klasse I oder Klasse II MHC-Determinante haben, welche mit einer der MHC-Determinanten eines Empfängers übereinstimmt. Derartige Antigen präsentierende Zellen können nach der HLA-Typisierung des Empfängers und einer Anzahl möglicher Donor-Antigen präsentierender Zellen selektiert werden.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird eine HLA-Typisierung an einem Individuum durchgeführt, welcher der Empfänger der genannten semi-allogenen immunogenen Zellen sein soll, um den HLA-Typ des Individuums zu bestimmen. Verfahren zur HLA-Typisierung sind Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt, werden routinegemäß in Krankenhäusern und klinischen Laboratorien durchgeführt und sind allgemein beschrieben in Roitt et al. (1989).
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung kann eine Bank oder Bibliothek zusammengefügt werden, welche verschiedene menschliche Antigen präsentierende Zelllinien umfasst, die kontinuierlich in Kultur gehalten werden. Jede Antigen präsentierende Zelllinie wird ebenfalls HLA-typisiert und durch irgendeine Anzahl an Datenaufbewahrungsmethoden gespeichert, wie beispielsweise einem log-Buch, Computerdatenbanken etc. Nach der HLA-Typisierung eines Empfängerindividuums, wird eine Antigen präsentierende Zelllinie aus der Bibliothek oder einer anderen Quelle ausgewählt, so dass mindestens ein Allel, das für HLA-Spezifizitäten codiert, die von der Antigen präsentierenden Zelle exprimiert werden und mit dem Empfänger nicht übereinstimmen. So kann z. B. in Bezug auf MHC-Klasse I Determinanten ein Empfänger eine A-Subbereichsspezifität von A1-A2 haben und Antigen präsentierende Zellen empfangen, die eine A-Subbereichspezifität von A28-A2 haben. Die Determinanten, die das Produkt des A2-Allels in den Antigen präsentierenden Zellen sind, stimmen mit dem Determinanten überein, die von dem A2-Allel der Zellen des Empfängers codiert werden (syngen). Zusätzlich sollte mindestens ein Allel, das für HLA-Spezifitäten codiert, zwischen den Antigen präsentierenden Zellen und dem Empfänger auch nicht übereinstimmen (allogen). Auf diese Weise werden sowohl syngene als auch allogene Determinanten auf der Oberfläche der Antigen präsentierenden Zelle vorhanden sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine geeignete Antigen präsentierende Zelle ausgewählt, wobei die allogenen Determinanten vorzugsweise von der Antigen präsentierenden Zelle exprimiert werden. In dieser Ausführungsform stimmen die meisten Allele, die für die verschiedenen A-Spezifitäten codieren, nicht mit der Antigen präsentierenden Zelle und dem Empfänger überein. Der Satz "die meisten Allele stimmen an den Bereichen HLA-Spezifitäten nicht überein", und ähnliche, betreffen nicht-übereinstimmende Allele zwischen Donor-Antigen präsentierenden Zellen und dem Empfängerindividuum im Bereich von ungefähr 50% bis weniger als 100%. Gleichermaßen bezieht sich, so wie es hier verwendet wird, der Satz "allogene Determinanten werden vorzugsweise von der Antigen präsentierenden Zelle exprimiert", und ähnliche, auf das Vorhandensein allogener MHC-Klasse I und Klasse II Determinanten im Bereich von ungefähr 50% bis weniger als 100%.
Die erfindungsgemäßen semi-allogenen immunogenen Zellen können ebenfalls genetisch durch die Fusionierung einer Antigen präsentierenden Zelle mit einer Tumorzelle ausgewählt werden, so dass die erhaltene Hybridzelle sowohl syngene als auch allogene MHC-Determinanten exprimiert. Nach einem solchen Verfahren wird eine Antigen präsentierende Zelle mit einer Tumorzelle über ein Zellfusionsverfahren fusioniert.
Erfindungsgemäß können Antigen präsentierende Zellen, die in den angehängten Ansprüchen beschrieben sind, für eine derartige Zellfusion verwendet werden. Antigen präsentierende Zellen, die in der Zellfusion verwendet werden, können ausschließlich allogene MHC-Determinanten exprimieren, oder sie können vornehmlich allogene MHC-Determinanten exprimieren. Der Begriff "exprimieren ausschließlich allogene MHC-Determinanten" bezieht sich darauf, dass die MHC-Determinanten von Donorzellen mit den MHC-Determinanten des Empfängers vollständig nicht übereinstimmen. Der Betriff "exprimieren vornehmlich allogene Determinanten" bezieht sich auf das Vorhandensein von allogenen MHC-Klasse I oder Klasse II Determinanten im Bereich von ungefähr 50% bis weniger als 100%.
Bevorzugter sind die Antigen präsentierenden Zellen, die für die Fusion verwendet werden, Derivate oder mutierte Antigen präsentierende Zellen, die die Selektion der erhaltenen Hybridzellen erleichtern können. Beispielsweise benötigen Derivate oder mutierte Antigen präsentierende Zellen als derartige Zellen besondere Nährstoffergänzungen oder haben bestimmte Medikamentenresistenzen. Viele derartige Derivate oder mutierte Antigen präsentierende Zellen sind beschrieben und im Fachgebiet verfügbar. Beispielsweise sind LM(TK-)Zellen, die von der ATCC erhältlich sind, mutierte Fibroblasten-LM-Zellen, denen die Thymidinkinase fehlt. LM(TK-)Zellen sterben im Wachstumsmedium, das HAT enthält (Hypoxanthin-Aminopterin und Thymidin). Fachleute auf dem Gebiet erkennen viele konventionelle Verfahren zum Erhalten derartiger Derivate oder mutierte Antigen präsentierende Zellen. Beispielsweise können, wie in den Arbeitsbeispielen beschrieben ist, LM(TK-)Zellen im Wachstumsmedium kultiviert werden, welches über einen Zeitraum Ouabain enthält, so dass Ouabain-resistente Zellen in der Zellpopulation angereichert werden.
Tumorzellen, die für die Fusion verwendet werden, exprimieren exklusiv oder vorherrschend syngene MHC-Determinanten. Der Begriff "exprimieren exklusiv syngene Determinanten" bezieht sich darauf, dass die MHC-Determinanten, die von den Donorzellen exprimiert werden, gleich sind (übereinstimmen) wie MHC-Determinanten, die von dem Empfänger exprimiert werden. Der Begriff "exprimiert vorherrschend syngene Determinanten" bezieht sich auf das Vorhandensein von syngenen MHC-Klasse I oder Klasse II Determinanten im Bereich von ungefähr 50% bis weniger als 100%. Solche Tumorzellen schließen Zellen einer Tumorzelllinie oder bevorzugter von neoplastischen Zellen des Empfängers ein. Zahlreiche Tumorzelllinien sind für Fachleute auf dem Gebiet erhältlich, wie beispielsweise B16-Melanomzellen, EO771-Mammaadenokarzinomzellen, EL4-Thymomzellen und menschlichen Melanomzelllinien, von denen alle aus der American Type Culture Collection in Rockville, MD (ATCC) erhalten werden können. In einer bevorzugten Ausführungsform stammen die Tumorzellen für die Fusion von einem Tier, z. B. einem Säuger, welcher von dem zu behandelnden Tumor betroffen ist. Derartige Tumoren können solide oder hämatologische Tumoren sein, welche Melanom, Lymphom, Plasmozytom, Sarkom, Gliom, Thymom, Leukämien, Brustkrebs, Prostatakrebs, Kolonkarzinom, Ösophaguskrebs, Hirnkrebs, Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Zervixkarzinom und Hepatome einschließen, sind aber nicht darauf beschränkt. Tumorzellen können aus einem Individuum über klinische Routineverfahren gewonnen werden.
Verfahren zur Zellfusion, die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung benutzt werden können, sind in der Literatur ausgiebig beschrieben und schließen Polyethylenglykol (oder PEG)-vermittelte, Calciumphosphat-vermittelte, Lipofectin-vermittelte und Elektroporations-vermittelte Zellfusionen ein.
Semi-allogene Hybridzellen, die aus einer Zellfusionprozedur hervorgehen, können durch gut bekannte Verfahren selektiert werden, einschließlich Selektion, die auf einer Medikamentenresistenz oder besonderen Nährstoffanforderungen beruhen, wie oben beschrieben wurde. Zum Beispiel sind Ouabain-resistente LM(TK-)-Zellen gegenüber Ouabain resistent, aber gegenüber HAT empfindlich. B16-Zellen sind gegenüber HAT resistent, aber gegenüber Ouabain empfindlich. Wenn LM(TK-)-Zellen mit B16-Zellen fusioniert werden, sind die erhaltenen Hybridzellen sowohl resistent gegen HAT als auch Ouabain. Solche Hybridzellen können dann durch Wachstumsmedium selektiert werden, das sowohl Ouabain als HAT enthält. Ein weiteres Beispiel für die Verfahren zur Auswahl von Hybridzellen, ist das Fluoreszenz-aktivierte Zellsorting (FACS) ein gut bekanntes Verfahren für Fachleute auf dem Gebiet. Siehe z. B. Coligan et al. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons Inc. (1194). In diesem Verfahren werden einige Oberflächenmoleküle durch spezifische Antikörper erkannt, die fluoreszenzgefärbt sind. Zellen, die diese Oberflächenmoleküle exprimieren, können dann mit Hilfe eines fluoreszenzaktivierten Zellsorters eingesammelt werden. Demgemäß können Hybridzellen als solche Zellen ausgewählt werden, die Oberflächenmoleküle beider Parentalzellen exprimieren (d. h. konventionelle Antigen präsentierende Zellen und Tumorzellen), werden als Hybridzellen am Ende eines Zellfusionsverfahrens ausgewählt. Viele Oberflächenmoleküle können untersucht werden, z. B. B7.1, ICAM, MHC-Moleküle oder Tumor-assoziierte Antigen, gegen die spezifisch Antikörper verfügbar sind. Derartige Hybridzellen werden hinsichtlich ihrer Oberflächen-MHC-Determinanten untersucht, um sicherzustellen, dass sowohl syngene Determinanten und allogene Determinanten auf der Zelloberfläche vorhanden sind. Fachleute auf dem Gebiet können eine Anzahl gut bekannter Verfahren für diese Untersuchung verwenden; z. B. Immunfluoreszenzfärbung, gefolgt von cytometrischen Messungen. Siehe Coligan et al., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons Inc. (1994).
Des Weiteren exprimieren die genetisch ausgewählten immunogenen Zellen erfindungsgemäß zusätzlich zu den semi-allogenen MHC-Determinanten mindestens ein Antigen, das durch T-Zellen erkannt wird.
In einem Aspekt der Erfindung sind die Antigen präsentierenden Zellen genetisch mit Nukleinsäuremolekülen transformiert, welche für mindestens ein Antigen codieren, das durch T-Zellen erkannt wird.
In einer Ausführungsform nach diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung codieren die Nukleinsäuremoleküle mindestens ein Antigen, das durch T-Zellen erkannt wird, und es sind bekannte RNA- oder DNA-Sequenzen, die für mindestens ein Antigen codieren, das durch T-Zellen erkannt wird.
Codierende Sequenzen, die zur Durchführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können irgendeine aus einer Unzahl an bekannten Sequenzen oder Fragmenten bekannter Sequenzen umfassen, welche Antigene codieren, die von T-Zellen erkannt werden. "Fragment" bedeutet ein Segment der DNA mit ausreichender Länge, um ein antigenes Peptid von mindestens ungefähr 8 Aminosäuren zu codieren.
Die vorliegende Erfindung zieht codierende Sequenzen für eine Vielzahl von Tumor-assoziierten Antigenen in Erwägung, welche einschließen, aber nicht begrenzt sind auf (1) Gene, die für TAAs codieren, die durch die zellulären Immunantworten erkannt werden (vermittelt hauptsächlich durch cytotoxische T-Zellen) und/oder durch humorale Immunreaktionen (hauptsächlich vermittelt durch T-Helferzellen), wie beispielsweise Mitglieder der MAGE-Genfamilie, BAGE, Tyrosinase, CEA, CO17-1A, MART-1, gp100, MUC-1, TAG-72, CA 125, Decapeptid 810, P1A; (2) mutierte Protoonkogene, wie beispielsweise p21^ras, P210-Gen (ein Produkt eines Rearrangements von bcr/abl) und HER-2/neu; (3) mutierte Tumorsuppressorgene, wie beispielsweise p53; (4) Tumor-assozierte virale Antigene, wie beispielsweise HPV E7. Gene für derartige TAAs sind umfassend in dem Fachgebiet beschrieben, z. B. von Shawler et al. (1197). Einige Tumor-assoziierte Antigen werden in bestimmten Arten von Tumoren exprimiert, andere sind mit einer Vielzahl an Tumorarten assoziiert. Erfindungsgemäß kann der Fachmann besondere codierende Sequenzen gemäß der Art des Tumors, der behandelt werden soll, auswählen.
Codierende Sequenzen für Antigene eines infektiösen Agens werden ebenfalls im Rahmen der vorliegenden Erfindung in Erwägung gezogen. Die semi-allogenen Immunzellen der vorliegenden Erfindung sind besonders nützlich gegenüber Viren, von denen viele mutieren und ihre äußere Umhüllung ändern, wodurch die Neutralisierung durch Antikörper eingeschränkt wird. Zusätzlich sind die genannten semi-allogenen immunogenen Zellen ebenfalls nützlich gegen Pathogene, die leicht in die Wirtszellen eindringen und sich vor zirkulierenden Zellen des Immunsystems verstecken. Beispiele solcher intrazellulären Parasiten, gegen die semi-allogene immunogene Zellen der vorliegenden Erfindung nützlich sind, schließen Borrelia, Chlamydia, Plasmodium, Legionella pneumophila, Leishmania, das für Chagas' verantwortliche Trypanosom und ähnliche ein.
Erfindungsgemäß wird eine codierende Sequenz eines Antigens in einem Vektor platziert, der sich innerhalb einer Zelle replizieren kann. Die codierende Sequenz wird operativ mit einem Promotor verbunden, der in Zellen eines Tiers, wie beispielsweise eines Säugers, funktionstüchtig ist und innerhalb des Vektors enthalten ist. Der rekombinante Vektor, der den Promotor und die codierende Sequenz umfasst, wird dann in die Antigen präsentierende Zelle eingeschleust. Die Einschleusung von DNA in Antigen präsentierende Zellen kann durch zahlreiche gut bekannte Verfahren erreicht werden, wie beispielsweise durch Transfektion oder virale und retrovirale Vektoren, die DNA umfassen, Transduktion in der Zelle der modifizierten Viruspartikel, und physikalische/chemische Techniken, wie beispielsweise Calciumphosphattransfektion, Komplexbildung mit Polykation oder Lipiden, Elektroporation, Partikelbombardierung und Mikroinjektion in Nuklei.
Vorzugsweise sind ein selektierbarer Marker und eine Terminationssequenz in dem rekombinanten Vektor eingeschlossen. Polyadenylierungssignale können ebenfalls in den Expressionsvektor eingeschlossen werden. Plasmid und virale Vektoren, die für die Durchführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, sind im Fachgebiet gut bekannt, und beschrieben in Sambrook et al., A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. (1989). Promotoren, 3'-Terminationssequenzen, Polyadenylierungssignale und selektierbare Markergene, die in menschlichen Zellen funktionstüchtig sind, sind ebenfalls auf dem Gebiet gut bekannt und werden in Sambrook et al. (1989) diskutiert.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung sind die Nukleinsäuremoleküle, die für mindestens ein Antigen codieren, welches durch T-Zellen erkannt wird, DNA oder RNA, welche aus einem infektiösen Agens isoliert wurde, wie beispielsweise einem Bakterium oder Virus, oder aus Tumorzellen. Solche DNA oder RNA wird isoliert und mechanisch geschert (oder mit einem oder mehreren geeigneten Restriktionsenzymen von Fall von DNA geschnitten), um hochmolekulargewichtige Fragmente zu erzeugen. Die hochmolekulargewichtigen Fragmente werden dann in die genannten Antigen präsentierenden Zellen eingeschleust. Viruspartikel können ebenfalls direkt in die Antigen präsentierenden Zellen mittels Transduktion eingeschleust werden.
In einer bevorzugteren Ausführungsform wird genomische DNA für den Transfer in die Antigen präsentierenden Zellen aus Tumorzellen isoliert, entweder aus einer Tumorzelllinie, wie oben beschrieben wurde, oder bevorzugter aus den kleinen primären oder metastasierenden Neoplasien eines Tiers.
Tumorzellen, die einem Individuum entnommen wurden, können direkt zur Isolierung von DNA ohne weitere Kultivierung in vitro verwendet werden. Die Population transfizierter Zellen, die wegen ihrer allgemeinen, nicht spezifischen, immun-verstärkenden Eigenschaften selektiert werden, exprimieren den Bereich an Tumor-assoziierten Antigenen, welcher den Tumor eines Tiers charakterisiert, einschließlich Antigenen, die nur auf einem kleinen Anteil der malignen Zellen vorhanden sein können.
In diesem erfindungsgemäßen Aspekt werden neoplastische Zellen entweder aus diffusen Neoplasien oder aus einem Teil eines Tumors eines Tiers während eines chirurgischen Eingriffs, durch Nadelaspiration oder durch andere gut bekannte Verfahren gewonnen. Beispiele für neoplastische Erkrankungen, die der Praktizierung der vorliegenden Erfindung zugänglich sind, schließen solide Tumoren und hämatologische Tumoren ein, z. B. Melanom, Lymphom, Plasmocytom, Sarkom, Gliom, Thymom, Leukämien, Brustkrebs, Prostatakrebs, Kolonkarzinom, Ösophaguskrebs, Hirnkrebs, Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Zervixkarzinom und Heptatom. Genomische DNA wird dann aus der Zelle oder Tumorprobe unter Verwendung in dem Fachgebiet bekannter Methoden isoliert und gereinigt, einschließlich derer, die in Sambrook et al., 1989, L Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. ausgeführt sind. Neoplastische Zellen und Tumorproben können ebenfalls in Kultur unter Verwendung von im Fachgebiet gut bekannten Methoden gezüchtet werden, um die Menge an DNA zu erhöhen, die für die Isolierung verfügbar ist.
Isolierte, gereinigte genomische DNA, die aus einem Tumor oder einer Zellkultur isoliert wurde, wird dann vorzugsweise mechanisch geschert oder mit einem geeigneten Restriktionsenzym geschnitten, um hochmolekular-gewichtige DNA-Fragmente von ungefähr 20 bis 25 Kb hervorzubringen. In einer am meisten bevorzugten Methode wird die DNA unter Verwendung einer 23 oder 25 Gauge-Nadel geschert.
Genomische DNA kann in die Antigen präsentierenden Zellen durch irgendeine aus einer Anzahl an Verfahren, die im Fachgebiet bekannt sind, eingeschleust werden, wie beispielsweise durch Calciumphosphat-Copräzipitation, Elektroporation, kationische Liposom-vermittelte Transfektion oder durch irgendeine einer Anzahl anderer gut bekannter Methoden zum Einschleusen von DNA in Zellen. Erfindungsgemäß wird genomische DNA zusammen mit einem selektierbaren Marker, wie beispielsweise einem Gen, das Resistenz gegenüber Hygromycin, Neomycin oder anderen Antibiotika verleiht, eingeschleust. Verfahren, wie diese, sind im Fachgebiet als Cotransfektion oder Cotransformation gut bekannt. Siehe Sambrook et al. Diese Markergene sind für gewöhnlich im Plasmid enthalten. Plasmide, wie diese, sind gut bekannt und für Fachleute verfügbar. In dem Cotransformationsverfahren der vorliegenden Erfindung ist die Menge des Plasmids vorzugsweise geringer als die Menge der genomischen DNA, um die Selektion von Transformanten zu erleichtern. Vorzugsweise beträgt das Verhältnis von Plasmid gegenüber genomischer ungefähr 1:3 bis ungefähr 1:20, mehr bevorzugt ist das Verhältnis ungefähr 1:10. Nach der Transformation werden Transformanten (d. h. Zellen, die die genomische DNA und das Marker erhalten haben) als die Zellen ausgewählt, die im Selektionsmedium wachsen, z. B. im Medium, das Antibiotika enthält.
In einem anderen Aspekt der Erfindung in Bezug auf die genannten semi-allogenen immunogenen Zellen, die mindestens ein Antigen exprimieren, das durch T-Zellen erkannt wird, werden Antigen präsentierende Zellen genetisch modifiziert, um mindestens ein Antigen, das durch T-Zellen erkannt wird, über das oben beschriebene Zellfusionsverfahren zu exprimieren. Demgemäß werden Antigen präsentierende Zellen mit Tumorzellen fusioniert. Die Hybridzellen, die aus dem Fusionsprozess hervorgehen, exprimieren mindestens ein durch T-Zellen erkennbares Antigen, welches von den parentalen Tumorzellen exprimiert wird, vorzugsweise ein Tumor-assoziiertes Antigen. Die Expression mindestens eines Antigens auf den Hybridzellen kann durch eine Vielzahl an gut bekannten Verfahren bestätigt werden, wie beispielsweise durch Immunfluoreszenzfärbung und cytometrische Messungen, wie oben beschrieben wurde. In dieser Form sind die Transformation oder Transfektion von Nukleinsäuremolekülen, die für Tumor-assoziierte Antigene codieren, nicht notwendig.
Wie oben beschrieben wurde, werden Antigen präsentierende Zellen, die MHC-Determinanten exprimieren, die semi-allogen mit einem Empfänger sind und die auch mindestens ein Antigen exprimieren, das durch T-Zellen erkannt wird, über beispielsweise Transformation/Transfektion, HLA-Typisierung oder Zellfusion genetisch ausgewählt.
Nach einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung stellen die Antigen präsentierenden Zellen, die in der vorliegenden Erfindung benutzt werden, co-stimulatorische Moleküle her, die an der T-Zellaktivierung beteiligt sind, wie beispielsweise B7 und ICAM. Beispielsweise sind menschliche Fibroblasten dafür bekannt, dass die co-stimulatorischen Moleküle, wie beispielsweise B7-1 und ICAM herstellen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung benötigen die genannten semi-allogenen immunogenen Zellen keine Transformation und/oder Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für mindestens ein Cytokin codiert. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die semi-allogenen immunogenen Zellen so entworfen werden, dass sie eine codierende Sequenz mindestens eines Cytokins exprimieren. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die codierende Sequenz in Antigen präsentierende Zellen vor der Einschleusung von hochmolekular-gewichtiger DNA oder eines Expressionsvektors mit einer codierenden Sequenz für einem besonderes Antigen oder ein Zellfusionsverfahren eingeschleust. Die Einschleusung in die Antigen präsentierenden Zellen mit mehreren codierenden Sequenzen verschiedener Cytokine wird ebenfalls durch die vorliegende Erfindung in Erwägung gezogen. Beispiele für Cytokine, die für die Umsetzung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, schließen Interleukin-1, Interleukin-2, Interleukin-3, Interleukin-4, Interleukin-5, Interleukin-6, Interleukin-7, Interleukin-8, Interleukin-9, Interleukin-10, Interleukin-11, Interleukin-12, Interferon-α, Interferon-γ, Tumornekrosefaktor, Granulocytenmakrophagenkolonien-stimulierenden Faktor und Granulocytenkolonien-stimulierenden Faktor ein.
Die codierende Sequenz für eines oder mehrere Cytokine kann in die semi-allogenen Antigen präsentierenden Zellen über einen Expressionsvektor, wie beispielsweise ein Plasmid oder einen viralen Vektor eingeschleust werden. Unter Verwendung von Vektorkonstruktionsmethoden, die im Fachgebiet gut bekannt sind, wird die codierende Sequenz mindestens eines Cytokins operativ mit einem Promotor verbunden, der in menschlichen Zellen funktionstüchtig ist, und ist unter dessen Kontrolle. Beispielsweise kann ein auf einem Plasmid basierender Vektor, der den SV40-Promotor umfasst, verwendet werden. Virale Vektoren, die aus dem Moloney Murine Leukemia (MoMLV)-Virus, Adenovirus, Herpes-Virus, Pockenvirus und Adeno-assozierten Virus (AAV) hergestellt werden, sind für die Expression von Cytokingenen in den semi-allogenen Antigen präsentierenden Zellen der vorliegenden Erfindung nützlich. Solche Vektoren sind im Fachgebiet gut bekannt und durch die ATCC erhältlich. In einer Ausführungsform der Erfindung ist der Vektor pZipNeoSVIL2, welcher ein Gen für menschliches IL-2 und das neo^r-Gen, beide unter Kontrolle des Moloney Maus Leukämie-Virus "long terminal repeat" hat.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine therapeutische Zusammensetzung bereit, die die Antigen präsentierende semi-allogenen immunogenen Zellen und einen therapeutisch annehmbaren Träger umfasst. So wie es hier verwendet wird, schließt ein therapeutisch annehmbarer Träger jedes und alle Lösungsmittel ein, einschließlich Wasser, Dispersionsmedien, Kulturen aus Zellenmedien, isotonische Mittel und ähnliche, die nicht-toxisch für den Wirt sind. Vorzugsweise ist dies eine wässrige isotonisch gepufferte Lösung mit einem pH-Wert von ungefähr 7,0. Die Verwendung solcher Medien und Mittel in therapeutischen Zusammensetzungen ist im Fachgebiet gut bekannt. Außer insofern als irgendein konventionelles Medium oder Mittel nicht mit den semi-allogenen immunogenen Zellen der vorliegenden Erfindung kompatibel ist, ist die Verwendung derartiger konventioneller Medien oder Mittel in therapeutischen Zusammensetzungen in Erwägung zu ziehen. Zusätzliche wirksame Inhaltsstoffe können ebenfalls in die Zusammensetzungen eingeschlossen sein.
Die therapeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können einem Tier, das deren bedarf, verabreicht werden. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Induzierung einer Immunreaktion in einem Tier bereit, das einer solchen Reaktion bedarf, welches das Verabreichen einer immunologisch wirksamen Menge der genannten semi-allogenen immunogenen Zellen umfasst. Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zur Verhinderung oder Behandlung eines Tumors in einem Tier bereit, welches das Verabreichen einer Antitumor-wirksamen Menge der genannten semi-allogen immunogenen Zellen umfasst.
Der Begriff "Tier", der hier benutzt wird, schließt alle Säuger ein, einschließlich des Menschen. Vorzugsweise ist das Tier der vorliegenden Erfindung ein Mensch.
Die Tumoren, die erfindungsgemäß in Erwägung gezogen werden, gegen die die Immunantwort induziert wird, oder welche zu verhindern oder zu behandeln sind, können ein Melanom, Lymphom, Plasmocytom, Sakrom, Gliom, Thymom, Leukämien, Brustkrebs, Prostatakrebs, Kolonkarzinom, Ösophaguskrebs, Hirnkrebs, Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Zervixkarzinom, Hepatom und andere Neoplasien, die im Fachgebiet bekannt sind, wie solche, die in Shawler et al. (1997) beschrieben wurden, einschließen, sind aber nicht darauf beschränkt.
Die Immunantwort, die in dem Tier durch Verabreichung der genannten semi-allogenen Immunogene induziert wird, kann zelluläre Immunantworten einschließen, die hauptsächlich durch cytotoxische T-Zellen vermittelt werden, welche in der Lage sind, Tumorzellen abzutöten, und auch humorale Immunantworten, die primär durch Helfer-T-Zellen vermittelt werden, welche in der Lage sind, B-Zellen zu aktivieren, die dadurch zur Antikörperproduktion befähigt sind. Eine Vielzahl an Techniken kann für die Analyse der Art von Immunreaktionen verwendet werden, die durch die genannten immunogenen Zellen induziert werden, die alle im Fachgebiet gut beschrieben sind, z. B. Coligan et al., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons Inc. (1994).
Die Bezeichnung "Verhinderung eines Tumors", die hier verwendet wird, bedeutet das Auftreten des Tumors wird verhindert oder das Entstehen des Tumors wird signifikant verzögert. Der Begriff "Behandeln eines Tumors", der hier verwendet wird, bedeutet, dass das Tumorwachstum signifikant inhibiert wird, was beispielsweise durch das Tumorvolumen widergespiegelt wird. Das Tumorvolumen kann durch zahlreiche bekannte Verfahren bestimmt werden, z. B. durch das Erhalten zweidimensionaler Messungen mit einem Zahlenmessschieber.
Wenn "eine immunologisch wirksame Menge", "eine Antitumor-wirksame Menge" oder "eine Tumor-inhibierende wirksame Menge" angegeben ist, kann die präzise Menge der semi-allogenen immunogenen Zellen, die zu verabreichen ist, von einem Arzt unter Inbetrachtziehen der individuellen Unterschiede im Alter, Gewicht, der Tumorgröße, dem Ausmaß der Infektion oder Metastasierung, und dem Zustand des Patienten bestimmt werden. Es kann allgemein gesagt werden, dass eine therapeutische Zusammensetzung, die die genannten semi-allogenen immunogenen Zellen umfasst, vorzugsweise in einer Menge von mindestens ungefähr 1 × 10³ bis ungefähr 5 × 10⁹ Zellen pro Dosis verabreicht werden sollte.
Die Verabreichung der genannten therapeutischen Zusammensetzungen kann in irgendeiner geeigneten Weise durchgeführt werden, einschließlich durch Aerosolinhalierung, Injektion, Ingestion, Transfusion, Implantation oder Transplantation. Vorzugsweise werden die semi-allogenen Immunogene der vorliegenden Erfindung einem Patienten subkutan (s. c.), intraperitoneal (i. p.), intra-arterial (i. a.) oder intravenös (i. v.) durch Injektion verabreicht. Der therapeutisch annehmbare Träger sollte durch Techniken die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt, sterilisiert sein.
Die Lehren der Veröffentlichungen, die in der vorliegenden Beschreibung zitiert sind, werden hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen.
Die Erfindung wird weiter durch die folgenden spezifischen Beispiele dargestellt, welche nicht beabsichtigen, den Bereich der Erfindung in irgendeiner Weise einzuschränken.
Beispiel 1
Experimentelle Materialien
Experimentelle Tiere
Sechs bis acht Wochen alte spezifische pathogen-freie C57BL/6J-Mäuse (H-2^b) und C3H/HeJ-Mäuse (H-2^k) wurden vom Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) bezogen. Sie wurden in Tierhaltungsräumen der Universität von Illinois in Chicago gemäß den NIH Richtlinien zur Versorgung und Verwendung von Labortieren gehalten. Den Mäusen wurde Purina Maus Futter und Wasser ad libitum zum Futter gegeben. Sie waren 8 bis 12 Wochen alt, wenn sie in den Experimenten verwendet wurden.
Zelllinien
Tumorzellen, die in den Beispielen verwendet wurden, wurden wie folgt gewonnen und aufbewahrt. B16-Zellen, eine hoch maligne Melanomzelllinie, die aus einer spontanen Neoplasie stammt, die in einer C57BL/6-Maus auftrat, wurden von I. Fidler (M. D. Anderson Cancer Center, Houston, TX) erhalten. Die Zellen wurden durch serielle Passagierung in histokompatiblen C57BL/6J-Mäusen oder bei 37°C in einer befeuchteten 7%igen CO₂/Luftatmosphäre in Wachstumsmedium gehalten. C1498-Zellen, eine spontan auftretende Lymphomzelllinie mit C57BL/6-Mausursprung, wurde von der American Type Culture Collection (Rockville, MD) erhalten. El-4-Thymomzellen und Gl 261-Gliomzellen wurden ebenfalls von der American Type Culture Collection (Rockville, MD) erhalten. C1498-Zellen, El-4-Thymomzellen und Gl 261-Gliomzellen wurden bei 37°C in einer angefeuchteten 7%igen CO₂/Luftatmosphäre in Wachstumsmedium gehalten. EO771-Zellen, eine Mammaadenokarzinomzelllinie, die aus einer C57BL/6-Maus stammt, wurden aus der Tumor Repository der Division of Cancer Treatment, Diagnosis and Centers of the National Cancer Institute (Frederick, MD) erhalten. EO771-Zellen wurden durch serielle Passagierungen in C57BL/6J-Mäusen gehalten. SB-1-Zellen wurden aus einer spontanen Brustneoplasie genommen, die in der C3H/HeJ-Maus auftrat, die in den Tierställen der Universität von Illinois in Chicago gehalten wurden.
Die Antigen präsentierenden Zellen, die in den Beispielen verwendet wurden, wurden wie folgt erhalten und aufbewahrt. LM-Zellen, eine Fibroblastenzelllinie, die aus einer C3H/HeJ-Maus (H-2^k) stammt, wurden von der American Type Culture Collection (Rockville, MD) erhalten. LM-Zellen wurden bei 37°C in einer angefeuchteten 7%igen CO₂/Luftatmosphäre in Wachstumsmedium gehalten. LM(TK-)-Zellen, eine Thymidinkinase-defiziente Fibroblastenzelllinie von C3H/He-Maus (H-2^k)-Ursprung, wurden von der American Culture Collection (Rockville, MD) erhalten. LM(TK-)-Zellen wurden bei 37°C in einer angefeuchteten 7%igen CO₂/Luftmischung in Wachstumsmedium gehalten. Da LM(TK-)-Zellen das Enzym Thymidinkinase fehlt, starben sie innerhalb von 14 Tagen in Wachstumsmedium, das 100 μM Hypoxanthin, 0,4 μM Aminopterin und 16 μM Thymidin (HAT) enthält.
WR19M.1-Zellen, eine Mausmonocyten/Makrophagen-Zelllinie wurde von der American Type Culture Collection (Rockville, MD) erhalten und wurde bei 37°C in einer angefeuchteten 7%igen CO₂/Luftatmosphäre in Wachstumsmedium gehalten.
Antiseren
Ein Antiserum, das mit B16-Melanomzellen reagiert, wurde in C57BL/6J-Mäusen erzeugt, denen intraperitoneal (i. p.) abgetötete (drei Runden aus Einfrieren und Auftauen) B16-Zellen, die in Freunds vollständigem Adjuvans (Spex Industries, Inc., Metuchen, N. J.) suspendiert waren, injiziert wurden. Das Antiserum reagierte mit B16-Zellen, aber nicht mit einer Vielzahl an Organen und Geweben aus der C57BL/6J-Maus, oder mit einer Reihe verschiedener neoplastischer Zelllinien (11). H-2K^b (Klon AF6-88.5 von BALG/c-Ursprung, IgG2a) und H-2K^k (Klon 25-9-3 von C3H-Ursprung, IgM) monoklonale Antikörper (mAbs) stammten von Pharmigen (San Diego, CA). Fluoresceinisothiocyanat(FITC)-konjugierte Ziege-Antimaus-IgG stammten von Sigma (St. Louis, MO). Anti-L3T4 (CD4) mAbs stammten von Pharmingen (San Diego, CA); Lyt-2.2 (CD8) (Hybridom 3.155) mAbs stammten von M. Mokyr (University of Illinois, Chicago, IL) und anti-Asialo GM1 mAbs stammten von Wako Chemical Co. (Dallas, TX). FITC-markierte B7.1 mAbs stammten von Pharmingen.
Beispiel 2
Modifizierung von LM-Zellen zur Sekretion von IL-2
LM-Zellen (H-2^k), eine Fibroblastenzelllinie von C3H(HeJ)-Mausursprung wurden bezüglich der IL-2-Sekretion durch Transduktion des Replikations-defekten retroviralen Vektors, pZipNeoSVIL-2, unter Verwendung von zuvor beschriebenen Techniken in Sugden et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 410–413 modifiziert. Der Vektor pZipNeoSVIL-2 wurde von M. K. L. Collins, Institute of Cancer Research, London, England bezogen. Der Vektor, welcher in GP+env AM12-Zellen verpackt war (von A. Bank, Columbia University, New York, NY) enthält ein Gen für menschliches IL-2 und ein neo^r-Gen, beide unter Kontrolle des Moloney Leukämie Virus "long terminal repeat". Zur Verwendung als Kontrolle wurden LM-Zellen mit dem retroviralen Vektor pZipNeoSV(X) (von M. K. L. Collins) transduziert, welcher ebenfalls in GP+env AM12-Zellen verpackt war (LM-ZipNeo-Zellen). pZipNeoSV(X) war spezifisch für neo^r-Gen, aber es fehlte ihm das Gen für IL-2.
Virus-haltige Überstände von GP+env AM12-Zellen, die mit pZipNeoSVIL-2 oder pZipNeoSV(X) transfiziert wurden, wurden zu LM-Zellen gegeben, gefolgt von einer Inkubation bei 37°C über Nacht in Wachstumsmedium, zu dem Polybren (Sigma; 5 μg/ml, Endkonzentration) zugegeben worden war). Das Wachstumsmedium bestand aus Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium (DMEM), das durch 10% fötales Rinderserum (FBS) und Antibiotika ergänzt wurde. Die Zellen wurden 14 Tage in Wachstumsmedium gehalten, welches 400 μg/ml des Neomycinanalogons, G418, enthält. Das Wachstumsmedium bestand aus Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium (DMEM), das mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt war. 100% der nicht transduzierten LM-Zellen starben im Medium, das mit G418 ergänzt war, innerhalb dieses Zeitraums. Nach der Selektion wurden die überlebenden Kolonien zusammengegeben und hinsichtlich der IL-2-Sekretion untersucht.
Die IL-2-Sekretion wurde durch die Fähigkeit der Zellkulturüberstände nachgewiesen, das Wachstum von CTLL-2-Zellen, einer IL-2-abhängigen Zelllinie (von A. Finneagan, Rush Medical College, Chicago, IL), Bakker et al. (1994) J. Exp. Med. 179: 1005–1009 zu bewahren. Verschiedene Verdünnungen der filtrierten Kulturüberstände (0,2 μm Nitrocellulose; Gelman, Ann Arbor, MI) wurden in 96- Zellplatten (Falcon) überführt, welche 5 × 10³ CTLL-2-Zellen in einem Endvolumen von 200 μl als das Wachstummedium pro Well enthielten. Nach Inkubation für 16 Stunden wurden 0,5 μCi ³H-Thymidin (Amersham, Arlington Heights, IL) in jedes Well für zusätzliche 6 Stunden gegeben. Es wurde durch Zugeben verschiedener Mengen an rekombinantem menschlichen IL-2 (Gibco BRL, Grand Island, NY) zu einer gleichen Anzahl von CTLL-2-Zellen einer Standardkurve erzeugt. Danach wurden die Zellen auf Glasfaserfiltern eingesammelt (Whittaker M. A. Products, Walkerville, MD), indem ein "PhD multiple harvester" (Microbiological Associates, Bethesda, MD) verwendet wurde, und sie wurden mit Ethanol (95%) gewaschen. Die Radioaktivität in der nicht-löslichen Fraktion wurde in einem Flüssigszintillationsspektrometer (Parkard Instrument Co., Downers Grove, IL) gemessen. Eine Einheit an IL-2 ergab unter diesen Bedingungen eine halbmaximale Proliferation von CTLL-2-Zellen. Jeder dritte Transfer, die transduzierten Zellen (LM-IL-2- und LM-ZipNeo-Zellen) wurden in Wachstumsmedium passagiert, das 400 μg/ml G418 enthält.
Die Ergebnisse (Tabelle II) zeigen, dass 1 × 10⁶ retroviral transduzierte LM-Zellen ungefähr 100 Einheiten IL-2 in 48 Stunden bilden (LM-IL-2-Zellen). Die Kulturüberstände der nicht transduzierten LM-Zellen oder LM-Zellen, die mit dem IL-2-negativen Vektor pZipNeoSV(X), (LM-ZipNeo-Zellen) transduziert waren (LM-ZipNeo-Zellen) stimulierten die Proliferation von CTLL-2-Zellen nicht. Äquivalente Mengen an IL-2 wurden in den Kulturüberständen von LM-IL-2, aber nicht bei LMZipNeo-Zellen, für mehr als 6 Monate kontinuierlicher Kultur nachgewiesen.
Beispiel 3
Modifizierung von LM-IL-2-Zellen bezüglich der Expression von H-2K^b
pBR327H-2K^b (Biogen Research Corp., Cambridge, MA), ein Plasmid, das MHC-H-2K^b-Determinanten codiert, wurde verwendet, um LM-Zellen zu modifizieren (LM-IL-2K^b-Zellen). Zehn μg pBR327H-2K^b und 1 μg pBabePuro (M. K. L. Collins), ein Plasmid, das eine Resistenz gegen Puromycin verleiht, wurden mit Lipofectin (Gibco BRL) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemischt, und dann zu 1 × 10⁶ LM-IL-2-Zellen in 10 ml Dulbecco's modifiziertem Eagle's-Medium (DMEM) ohne fötales Kälberserum (FBS) gegeben. Das Plasmid pBabePuro, Vile et al. (1993) Cancer Res. 53: 962–967 wurde eingeschlossen, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass Zellen, die hinsichtlich einer Resistenz in Puromycin umgewandelt wurden, pBR327H-2K^b aufgenommen hatten. (Das Verhältnis von pBR327H-2K^b zu pBabePuro, welches zu den Zellen gegeben wurde, betrug 10:1). Zur Verwendung als Kontrolle wurde die gleiche Anzahl an LM-IL-2-Zellen mit 1 μg pBabePuro alleine transfiziert. Die Zellen wurden für 18 Stunden bei 37°C in einer CO₂/Luftatmosphäre inkubiert, mit DMEM gewaschen, gefolgt von einer Zugabe von Wachstumsmedium. Nach einer Inkubation für 48 Stunden wurden die Zellkulturen geteilt und in Wachstumsmedium, das mit 3,0 μg/ml Puromycin (Sigma) ergänzt war, ausplattiert, gefolgt von einer Inkubation bei 37°C für sieben zusätzliche Tage. Die überlebenden Kolonien wurden zusammengegeben und durch Färben mit spezifischen Fluorescein-konjugierten Antikörpern auf die Expression von H-2K^b-Determinanten getestet. 100% der nicht-transfizierten LM-IL-2-Zellen, welche in Wachstumsmedium, das Puromycin enthält, gehalten wurden, starben während der 7-tägigen Inkubationszeit. LM-IL-2-Zellen, die mit dem Plasmid (pBR327H-2K^b-Zellen) transduziert waren, oder nicht transduzierte LM-IL-2-Zellen wurden in 100 mm²-Gewebekultur-Petrischalen mit EDTA (0,1 mM) dissoziiert und dann für 1 Stunde bei 4°C mit FITC-konjugiertem anti-H-2K^b, anti-H-2K^k oder anti-H-2D^b mAbs inkubiert. Als Kontrolle wurden Aliquots der Zellsuspensionen in gleicher Weise behandelt, außer dass FITC-konjugierte IgG_2a-Isotypenseren, die mAbs substituierten. Nach drei Waschschritten mit PBS (pH 7,4) wurden mindestens 1 × 10⁴ Zellen jeder Art hinsichtlich der Fluzoreszenzfärbung in einem Durchflusscytofluorograph analysiert.
Beispiel 4
Immunfluoreszenzfärbung und cytofluorometrische Messungen
Quantitative Immunfluoreszenzmessungen wurden verwendet, um die Expression von H-2K^b-Determinanten durch LM-IL-2-Zellen nachzuweisen, die mit pBR327H-2K^b (LM-IL-2K^b-Zellen) transfiziert waren. Die Messungen wurden mit einem Epic V-Flow Cytofluorograph (Coulter Electronics, Hialeah, FL) durchgeführt, welcher mit einem Multiparameter-Datensammel- und -Wiedergabesystem (MDADS) ausgerüstet ist. Für die Analyse wurde eine Einzelzellsuspension aus Monolayerkulturen mit 0,1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in Phosphat-gepufferter Salzlösung (pH 7,4) (PBS) hergestellt. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen, das 0,2% Natriumazid und 0,5% FBS enthält. Danach wurden Fluoresceinisothiocyanat(FITC)-konjugierte H-2K^b-monoklonale Antikörper (mAbs) (Klon AF6-88.5; Pharmingen, San Diego, CA) zu den Zellen gegeben, gefolgt von einer Inkubation bei 4°C für 1 Stunde. Die Zellen wurden dann mit PBS, das 0,5% FBS und 0,2% Natriumazid enthält, gewaschen. Einparametrische Fluoreszenzhistogramme wurden durch Analyse von mindestens 1 × 10⁴ Zellen erzeugt. Die Hintergrundfärbung wurde durch die Substituierung von Zellen bestimmt, welche mit FITC-konjugiertem Ziege-Antimaus-Isotyp IgG_2a alleine für Zellen, die mit den spezifischen Antikörpern gefärbt waren, bestimmt. Die 15% der Zellen, die mit der höchsten Intensität gefärbt waren, wurden in Kunststoffzellkulturplatten (Falcon) abgesondert, welche DMEM enthalten, das mit 50 FBS ergänzt ist. Direkt danach wurden die Zellen bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert und in Wachstumsmedium in Kunststoffzellkulturplatten inkubiert, gefolgt von einer Inkubation von 37°C in einer angefeuchteten 7% CO₂/Luft-Atmosphäre. Als Kontrollen wurden Aliquots der Zellsuspension, welche mit FITC-markierten IgG_2a-Isotypenserum oder mit FITC-markierten mAbs für H-2K^k- oder H-2D^b-Determinanten inkubiert wurden, ebenfalls analysiert. Die Ergebnisse (1) zeigen an, dass die transfizierten Zellen (LM-IL-2K^b-Zellen) positiv mit den H-2K^b, aber nicht den IgG₂₀-Isotypenserum oder H-2D^b mAbs gefärbt wurden. Als zusätzliche Kontrolle wurden die Zellen in gleicher Weise hinsichtlich der Expression von H-2K^k-Determinanten analysiert. Wie angezeigt ist (1), wurden LM-IL-2-Zellen von C3H/He-Mausursprung mit H-2K^k mAbs ebenfalls gefärbt. Die Intensität der Immunfluoreszenzfärbung von Lm-IL-2K^b-Zellen bezüglich der H-2K^b-Determinanten war gleich der von Milzzellen nativer C57BL/6J-Mäuse. Die Expression von H-2K^b-Determinanten war eine stabile Eigenschaft der Zellen. Zellen, die mit pBR327h-2K^b transfiziert wurden, waren mit gleicher Intensität gefärbt, mit H-2K^b mAbs nach drei Monaten kontinuierlicher Kultur.
Beispiel 5
Transfektion von LM-IL-2K^b-Zellen mit genomischer DNA aus B16-Melanomzellen
Hochmolekular-gewichtige DNA, die aus B16-Zellen isoliert wurde, wurde für die Transfektion von LM-IL-2K^b-Zellen verwendet, indem das Verfahren verwendet wurde, das von Wigler et al. (1978) Cell 14: 725–731 beschrieben worden ist, und das von Kim et al. (1992) Int. J. Cancer 51: 283–289 modifiziert wurde. Die DNA wurde zunächst durch Durchleiten durch eine Größe 25 Gauge-Nadel geschert. Die molekulare Größe der DNA zu diesem Zeitpunkt war größer als 23 kb, wie durch Elektrophorese in 0,6%igen Agarosegelen bestimmt wurde. Danach wurden 100 μg der gescherten DNA mit 100 μg pHyg (von L. Lau, Universität von Illinois, Chicago, IL) gemischt, ein Plasmid, welches das E. coli-Enzym Hygromycin B-Phosphotransferase (Sugden et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 410–413) codiert, welches eine Resistenz gegen Hygromycin B verleiht. Das Verhältnis der DNA von B16-Zellen zu pHyg betrug 10:1, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass Zellen, die die Plasmid-DNA aufgenommen haben, ebenfalls die DNA aus den Melanomzellen aufgenommen haben. Die gescherte DNA und pHyg wurden dann mit Lipofectin gemäß den Anweisungen des Herstellers gemischt. Das DNA/Lipofectin-Gemisch wurde zu einer Population aus 1 × 10⁷ LM-IL-2K^b-Zellen gegeben, die 24 Stunden vorher in zehn 100 mm-Kunststoffzellkulturplatten aufteilt worden waren. Direkt nach der Zugabe der DNA/Lipofectin-Mischung zu den Zellen wurde das Wachstumsmedium durch DMEM ersetzt. In einigen Fällen wurde DNA von B16-Zellen weggelassen und 1 μg an pHyg wurde mit Lipofectin gemischt und zu einer gleichen Zahl von LM-IL-2K^b-Zellen gegeben. In beiden Fällen wurden die Zellen für 14 Tage in Wachstumsmedium gehalten, welches 500 μg/ml Hygromycin B (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) enthält. 100% nicht-transfizierter LM-IL-2K^b-Zellen, die in dem Hygromycin-Wachstumsmedium bewahrt wurden, starben innerhalb dieses Zeitraums. Die überlebenden Kolonien (jeweils mehr als 2 × 10⁴) der Hygromycin-resistenten LM-IL-2K^b-Zellen, die mit pHyg und DNA von Melanomzellen transfiziert waren (LM-IL-2K^b/B16) oder mit pHyg alleine (LM-Il-2K^b), wurden zusammengegeben und verwendet, um eine Immunogenantwort in Mäusen zu induzieren. In einigen Fällen wurden die Zellen durch Homogenisierung und Beschallung vor der Injektion in Mäuse aufgebrochen. Die Menge an IL-2, die von LM-IL-2K^b/B16-Zellen gebildet wird, war gleich der, die von LM-IL-2- oder LM-IL-2K^b-Zellen gebildet wird, wie durch die Fähigkeit des Zellkulturüberstandes bestimmt wurde, das Wachstum von CTLL-2-Zellen zu bewahren (Tabelle II).
Beispiel 6
Überleben von C57BL/6J-Mäusen, denen B16-Melanomzellen und LM-IL-2K^b-Zellen injiziert wurden, die mit genomischer DNA von B16-Zellen transfiziert waren
B16-Melanom ist eine hochmaligne Neoplasie der C57BL/6-Mäuse. Die Tiere weisen keine scheinbare Resistenz gegen das Wachstum der Melanomzellen auf. 100 Mäuse, denen subkutan (s. c.) 5 × 10³ B16-Zellen injiziert wurden, starben an dem progressiven Tumorwachstum in ungefähr 38 Tagen.
Als erstes Mittel zur Bestimmung der immuntherapeutischen Eigenschaften von LM-IL-2K^b/B16-Zellen 8LM-IL-2K^b-Zellen, die mit genomischer DNA von B16-Zellen transfiziert waren) gegenüber dem Wachstum des Melanoms, wurden C57BL/6J-Mäuse subkutan mit einer Mischung aus B16-Zellen und LM-IL-2K^b/B16-Zellen injiziert, gefolgt von zwei anschließenden Injektionen in wöchentlichen Intervallen mit LM-IL-2K^b/B16-Zellen alleine.
Das Tumorwachstum wurde in C57Bl/6J-Mäusen, denen eine Mischung aus B16-Zellen und LM-IL-2K^b/B16-Zellen injiziert wurden, überwacht (2). C57BL/6J-Mäuse (5 pro Gruppe) wurden subkutan mit einer Mischung aus 5 × 10³ B16-Zellen und 2 × 10H6 LM-IL-2K^b/B16-Zellen injiziert. Zum gleichen Zeitpunkt erhielten die Mäuse eine zweite Injektion i. p. nur aus 2 × 10⁶ LM-IL-2K^b/B16-Zellen. Als Kontrollen wurden Mäusen nach dem gleichen Protokoll äquivalente Anzahlen der B16-Zellen und LM-IL-2-Zellen injiziert, oder B16-Zellen und LM-IL-2/B16-Zellen. Den Mäusen wurden subkutan und i. p. zweimal mehr in wöchentlichen Intervallen gleiche Anzahlen an Zellen wie in den anfänglichen Injektionen verabreicht, aber ohne die zusätzlichen B16-Zellen. Das Tumorvolumen wurde durch zweidimensionale Messungen, welche mit einem Zahlenmessschieber durchgeführt wurden, abgeleitet. Die Ergebnisse zeigen, dass keine der Mäuse, denen das Gemisch aus B16- und LM-IL-2K^b/B16-Zellen injiziert wurde, Tumoren entwickelt, während alle Mäuse in verschiedenen Kontrollgruppen innerhalb von 15 bis 60 Tagen Tumore entwickelten (2).
In einem ähnlichen Experiment wurde die Überlebensdauer von C57BL/6J-Mäusen, denen verschiedene Kombinationen aus Zellgemischen injiziert wurden, gemessen (3). C57BL/6J-Mäusen (5 pro Gruppe) wurde subkutan eine Mischung aus 5 × 10³ B16-Zellen und 2 × 10⁶ LM-IL-2K^b/B16-Zellen injiziert. Zum gleichen Zeitpunkt erhielten die Mäuse eine zweite Injektion i. p., die nur aus 2 × 10H6 LM-IL-2K^b/B16-Zellen besteht. Als Kontrollen wurden andere naive (nicht behandelte) C57BL/6J-Mäuse nach dem gleichen Protokoll mit einer gleichen Anzahl an B16-Zellen und LM-ZipNeo-Zellen, mit B16-Zellen und LM-IL-2-Zellen, mit B16-Zellen und LM-IL-2/B16-Zellen oder nur mit B16-Zellen injiziert. Den Mäusen jeder Behandlungsgruppe wurde zweimal mehr in wöchentlichen Intervallen, mit der gleichen Anzahl an LM-IL-2K^b/B16-, LM-ZipNeo-Zellen, LM-IL-2- oder LM-IL-2/B16-Zellen, ohne zusätzliche B16-Zellen injiziert. Die mittleren Überlebensdauern betrugen 38,4 + 2,8 Tage für Mäuse, denen nur lebensfähige B16-Zellen injiziert wurden; 39,4 + 7,1 Tage bei Mäusen, denen lebensfähige B16-Zellen und LM-Zip-Neo-Zellen injiziert wurden, 47,7 + 9,6 Tage bei Mäusen, denen lebensfähige B16-Zellen und LM-IL-2-Zellen injiziert wurden; 62,2 + 12,2 Tage bei Mäusen, denen lebensfähige B16-Zellen und LM-IL-2/B16-Zellen injiziert wurden; und >120 Tage bei Mäusen, denen lebensfähige B16-Zellen und LM-IL-2K^b/B16-Zellen injiziert wurden. Mäusen, denen eine Mischung aus B16-Zellen und nicht-IL-2-sezernierenden LM-ZipNeo-Zellen injiziert wurden, oder nur B16-Zellen entwickelten progressiv wachsende Neoplasien und starben in ungefähr 40 Tagen. Andere naive C57BL/6J-Mäuse wurden mit einer Mischung aus B16-Zellen und LM-IL-2-Zellen injiziert. Der Unterschied der Überlebensdauer der Mäuse, denen nur B16-Zellen, und denen die Mischung aus B16-Zellen und LM-IL-2-Zellen injiziert wurden, war nicht signifikant (P > 0,1).
Um die Beteiligung von H-2K^b-Determinanten an den immunogenen Eigenschaften der Zellen zu bestimmen, wurde das Überleben der Mäuse, denen B16-Zellen und LM-IL-2/B16-Zellen (LM-IL-2-Zellen, die mit DNA aus B16-Zellen transfiziert wurden) mit dem Überleben von Mäusen verglichen, denen B16-Zellen und LM-IL-2K^b/B16-Zellen injiziert wurden. Der Student'sche t-Test wurde verwendet, um die statistischen Differenzen zwischen dem Überleben und den cytotoxischen Aktivitäten in Mäusen in verschiedenen experimentellen und Kontrollgruppen festzustellen. Ein p-Wert von weniger als 0,05 wurde als signifikant angesehen. Wie durch die Daten gezeigt wird (3), war die Überlebensrate von Mäusen, denen eine Mischung aus B16-Zellen und LM-IL-2/B16-Zellen injiziert wurden, signifikant geringer als die Überlebensrate von Mäusen, denen die Mischung aus B16-Zellen und LM-IL-2K^b/B16-Zellen injiziert wurden (p < 0,001).
Mäusen, denen eine Mischung aus B16-Zellen und LM-IL-2K^b/B16-Zellen injiziert wurde, überlebten signifikant länger als Mäuse in verschiedenen Kontrollgruppen. Die Tiere wiesen eine Langzeitresistenz gegenüber dem Wachstum des Melanoms auf. Diese Ergebnisse zeigen, dass der größte immuntherapeutische Nutzen in der Gruppe der Mäuse vorhanden war, die mit immunogenen Zellen behandelt wurden, die sowohl syngene als auch allogene MHC-Determinanten exprimierten, welche mit der genomischen DNA des Tumors transformiert worden waren und welche ebenfalls transformiert wurden, um IL-2 zu sezernieren.
Die immunogenen Langzeit-Eigenschaften von LM-IL-2K^b/B16-Zellen wurden durch Injizieren von Mäusen untersucht, die die anfängliche Behandlung mit einer zweiten Injektion aus B16-Zellen überlebten (4). Die zweite Injektion fand 150 Tage nach der ersten Injektion des Gemischs der B16-Zellen und der LM-IL-2K^b/B16-Zellen statt. Als Kontrolle wurde naiven C57BL/6J-Mäuse s. c. eine gleiche Anzahl an B16-Zellen injiziert. Es gab fünf Mäuse in jeder Gruppe. Wie die Daten in 4 illustrieren, wurde das ersten Auftreten des Melanoms bei Mäusen, die zuvor mit LM-IL-2K^b/B16-Zellen behandelt wurden, signifikant (P < 0,001) verzögert. Die mittlere Überlebensdauer (M. S. T.) der nicht behandelten Mäuse betrug 34,4 + 2,2 Tage. M. S. T. der behandelten Mäuse betrug 53,0 + 7,1 Tage (p < 0,1).
Beispiel 7
Behandlung von Mäusen mit vorher existierenden Melanomen mit LM-IL-2K^b/B16-Zellen
Um zu bestimmen, ob LM-IL-2K^b/B16-Zellen eine ähnliche therapeutische Wirkung auf Mäuse mit etablierten Melanomen haben, wurden C57BL/6J-Mäusen subkutan 5 × 10³ B16-Zellen injiziert, gefolgt von einer Injektion s. c. und einer Injektion i. p. aus 2 × 10⁶ LM-IL-2K^b/B16-Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten in jeder Injektionsstelle. Eine gleiche Anzahl an LM-IL-2K^b/B16-Zellen wurde s. c. und i. p. zweimal mehr in wöchentlichen Intervallen injiziert. Als Kontrollen wurden anderen naiven C57BL/6J-Mäusen subkutan Gemische aus 5 × 10³ B16-Zellen und 2 × 10⁶ LM-IL-2K^b/B16-Zellen injiziert und i. p. 2 × 10⁶ LM-IL-2K^b/B16-Zellen, oder s. c. eine gleiche Anzahl nur aus B16-Zellen. Es gab 5 Mäuse pro Gruppe. Die mittleren Überlebensdauern waren wie folgt: Mäuse, denen nur B16-Zellen injiziert wurden, 31,8 + 6,1 Tage; Mäusen, denen eine Mischung aus B16-Zellen und LM-IL-2K^b/B16-Zellen injiziert wurden, 52,8 + 9,9 Tage; Mäusen, denen LM-IL-2K^b/B16-Zellen 5 Tage nach der Injektion von B16-Zellen injiziert wurden; 44,2 + 5,8 Tage; Mäusen, denen LM-IL-2K^b/B16-Zellen 10 Tage nach der Injektion von B16-Zellen injiziert wurden, 39,3 + 3,6 Tage; Mäusen, denen LM-IL-2K^b/B16-Zellen 20 Tage nach der Injektion von B16-Zellen injiziert wurden, 34,4 + 4,0 Tage. P für das überleben der Mäuse, denen die Mischung aus B16-Zellen und LM-IL-2K^b/B16-Zellen injiziert wurden gegenüber Mäusen, denen B16-Zellen 5 Tage vor LM-IL-2K^b/B16-Zellen injiziert wurden, war weniger als 0,005; bei Mäusen, denen B16-Zellen 10 Tage vor der Injektion von LM-IL-2K^b/B16-Zellen injiziert wurden, war p weniger als 0,04; bei Mäusen, denen B16-Zellen 120 Tage vor Injektion von LM-IL-2K^b/B16-Zellen injiziert wurden, war p weniger als 0,1.
Wie gezeigt ist (5), überlebten Mäuse, denen B16-Zellen 5 Tage, und 10 Tage vor der ersten Injektion von LM-IL-2K^b/B16-Zellen injiziert wurden, signifikant länger als Mäuse, denen nur B16-Zellen injiziert wurden (p < 0,003 bzw. < 0,04). Mäusen, denen B16-Zellen 20 Tage vor der ersten Injektion von LM-IL-2K^b/B16-Zellen injiziert wurden, schafften es nicht, signifikant länger zu überleben als Mäuse, denen nur B16-Zellen injiziert wurden (M. S. T. = 34,4 ± 4 bzw. 31,8 ± 6 Tage; p = 0,1).
Beispiel 8
Cytotoxische Reaktion gegen Melanome in C57BL/6J-Mäusen, die mit zerstörten LM-IL-2K^b/B16-Zellen immunisiert wurden
Die oben beschriebenen Experimente wurden in Mäusen durchgeführt, die mit lebensfähigen LM-IL-2K^b/B16-Zellen immunisiert wurden. Die Milzzell-vermittelte Cytotoxizitätsexperimente in Mäusen, die mit homogenisierten/beschallten (zerstörten) LM-IL-2K^b/B16-Zellen immunisiert wurden, wurden durchgeführt, um zu bestimmen, ob Immunisierung mit zerstörten Zellen zu gleichen cytotoxischen Reaktionen gegen Melanome führen würde. In dem Experiment wurden 4 × 10⁶ LM-IL-2K^b/B16-Zellen in 400 μl Wachstumsmedium suspendiert und in einem Takmar Tissue Mixer (Cincinnati, OH) für 1 Minute bei 4°C homogenisiert, gefolgt von der Beschallung für 1 Minute bei 4°C in einem Sonifier Cell Disrupter (VWR Scientific, Philadelphia, PA). Danach wurde C57BL/6J-Mäusen intraperitoneal (i. p.) und subkutan 2 × 10⁶ lebensfähige oder eine gleiche Anzahl (5 × 10⁶) zerstörter LM-IL-2K^b/B16-Zellen in jede Injektionsstelle injiziert. Die Mäuse erhielten zwei anschließende Injektionen der zerstörten oder lebensfähigen Zellen in wöchentlichen Intervallen. Andere naive C57BL/6J-Mäuse wurden gemäß dem gleichen Protokoll mit lebensfähigen LM-IL-2K^b- oder LM-IL-2-Zellen injiziert. Eine Woche nach der letzten Injektion wurden die Mäuse getötet und ein Standard ⁵¹Cr-Freisetzungsassay gegen B16-Zellen wurde durchgeführt.
Ein Pool aus mononukleären Zellen aus den Milzen von drei Mäusen in jeder Gruppe wurde gesammelt. Eine Milzzellsuspension wurde durch das Durchdrücken der Milz durch eine Anzahl aus 40 Gauge-Edelstahlsieben in ungefähr 5 ml eiskaltem Wachstumsmedium hergestellt. Die Zellen wurden in konische 15 ml Zentrifugenröhrchen (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) überführt und große Zellklumpen und Zelltrümmer wurden 1 Minute absetzen gelassen. Anschließend wurden Zellen, die Überstand blieben, eingesammelt, auf einen Histopaque 1077-Gradienten (Sigma) geschichtet und dann für 30 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert (400 × g). Die Lebensfähigkeit der mononukleären Zellen, die zu diesem Zeitpunkt aus den Gradienten gesammelt wurden, war größer als 90%, wie durch einen Trypanblau-Farbstoff-Ausschlusstest bestimmt wurde (0,4%). Aliquots der Zellsuspensionen wurden in Wachsmedium bei 37°C für 5 Tage mit Mitomycin-C-behandelten (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) (50 μg/ml for 45 Minuten bei 37°C) Zellen des gleichen Typs coinkubiert, welche dann verwendet wurden, um die Mäuse zu immunisieren. Das Verhältnis der Milzzellen zu Mitomycin-C-behandelten Zellen betrug 30.1. Das Inkubationsmedium bestand aus RPMI-1640-Medium, das mit 100 U/ml menschlichem IL-2, 10% FBS, 5 × 10^–2 mmol/l 2-β-Mercaptoethanol, 15 mmol/l HEPES, 0,5 mmol/l Natriumpyruvat und Penicillin/Streptomacin (Gibco) ergänzt war. Zum Ende der 5-tägigen Inkubation wurde die Population, die es nicht schaffte, an die Kunststoffzellkulturflaschen zu adhärieren, eingesammelt und als Quelle für Effektorzellen für die Bestimmungen der Cytotoxizität verwendet.
Für den ⁵¹Cr-Freisetzungstest wurden 5 × 10⁶ Zielzellen mit ⁵¹Cr während einer einstündigen Inkubation bei 37°C in Wachstumsmedium markiert, das 100 μCi ⁵¹Cr (Amersham, Arlington Heights, IL) enthält. Nach drei Waschschritten mit DMEM wurden 1 × 10⁴ der ⁵¹Cr-markierten Zellen für 4 Stunden bei 37°C mit der nicht an Kunststoff-adhärierten Population der Milzzellen aus den immunisierten Mäusen, in verschiedenen Effektor:Ziel (E:T)-Verhältnissen inkubiert. Anschließend wurde die prozentuale spezifische Cytolyse berechnet als:

Spontane Freisetzung im Bereich von 10 bis 15% der maximalen ⁵¹Cr-Freisetzung

Der Student'sche t-Test wurde verwendet, um die statistischen Unterschiede zwischen der Überlebensdauer und den cytotoxischen Eigenschaften in Mäusen in verschiedenen experimentellen und Kontrollgruppen zu bestimmen. Ein p-Wert von weniger als 0,05 wurde als signifikant angesehen.
Wie gezeigt ist (6), waren cytotoxische Reaktionen in der Gruppe aus Mäusen vorhanden, denen die lebensfähigen, aber nicht die homogenisierten/beschallten Zellen injiziert wurden. Milzzellen aus Mäusen, denen die lebensfähigen LM-IL-2K^b- oder LM-IL-2-Zellen injiziert wurden, wie auch Zellen aus naiven Mäusen, wiesen keine Cytotoxizität gegen B16-Zellen auf.
Beispiel 9
Bestimmung der Klassen von Effektorzellen, die in der Anti-Melanom-Cytotoxizität in Mäusen aktiviert sind, welche mit semi-allogenen transfektierten Zellen immunisiert sind.
Die Wirkung von anti-Lyt-2.2-monoklonalen Antikörpern (mAbs) (gerichtet gegen Lyt-2.2⁺-Zellen (CD8⁺ T) oder anti-Asialo G_m1 mAbs (gerichteten gegen NK/LAK-Zellen) auf die Milzzell-vermittelten Cytotoxizitätsreaktionen wurde verwendet, um die vorherrschenden Zelltypen zu identifizieren, die in der Anti-Melanomcytotoxizität in Mäusen aktiviert sind, welche mit den oben beschriebenen semi-allogenen transfizierten Zellen immunisiert wurden.
C57BL/6J-Mäusen wurden eine der folgenden genetisch modifizierten Zelltypen injiziert: LM-ZipNeo, LM-IL-2, LM-IL-2/B16, LM-IL-2K^b und LM-IL-2K^b/B16. Als Kontrolle wurde einer Mausgruppe Wachstumsmedium injiziert. Die Mäuse erhielten 2 × 10⁶ Zellen s. c. und 2 × 10⁶ Zellen i. p. Zwei zusätzliche Injektionen in wöchentlichen Intervallen gemäß dem gleichen Protokoll wurden den Mäusen ebenfalls verabreicht. 7 Tage nach der letzten Injektion wurde ein Pool aus mononukleären Zellen aus den Milzen von 3 Mäusen jeder Gruppe für 5 Tage mit Mitomycin C-behandelten (50 μg/ml; 30 min) Zellen des gleichen Typs wie zuerst injiziert inkubiert. Nach der 5-tätigen Inkubationsdauer wurde die Nicht-Kunststoff-adhärierenden Zellen bei 4°C für 1 Stunde mit überschüssigen Mengen an mAbs [anti-Lyt-2.2⁺ (CD8⁺):Hybridom 3.155 (Sarmiento et al. (1985) J. Immunol. 125: 2665–2672) oder anti-Asialo G_M1 (Kasai et al. (1980) Eur. J. Immunol. 10: 175–180 (Wako Chemical Co., Dallas, TX)] inkubiert, bevor der ⁵¹Cr-Freisetzungstest durchgeführt wurde. Die Antikörper wurden so titriert, dass die Konzentrationen, die verwendet wurden, 5 Mal der Menge entsprachen, die benötigt wird, um die Bindung der spezifischen Zelltypen naiver C57BL/6-Mäuse zu sättigen, wie durch cytofluorometrische Analysen seriell verdünnter Antikörper bestimmt wurde. Zum Ende der Inkubation wurden ⁵¹Cr-markierte B16-Zellen oder ⁵¹Cr-markierte c1498-Zellen hinzugegeben, und die gemischten Zellkulturen wurden für vier zusätzliche Stunden inkubiert, worauf die spezifische Freisetzung des Isotops (% Cytolyse) bestimmt wurde. c1498-Zellen sind eine unabhängig entstandene Neoplasie der C57BL/6-Mäuse. Tabelle III gibt die Ergebnisse des ⁵¹Cr-Freisetzungstests wieder. Die Werte stellen den Mittelwert ± SD aus Dreifachbestimmungen dar. Wie in Tabelle III gezeigt wird, waren Milzzellen aus Mäusen, die mit LM-IL-2K^b/B16-Zellen immunisiert wurden, cytotoxische B16-Zellen, aber nicht c1498-Zellen.
Wie ebenfalls in Tabelle III gezeigt ist, wurde die Immunreaktion hauptsächlich durch CD8⁺-CTLs vermittelt. NK/LAK-Zellen schienen nicht an der anti-Melanom-Cytotoxizitätsreaktion beteiligt zu sein.
Beispiel 10
Überleben der C57BL/6J-Mäuse, denen eine Mischung aus B16-Melanomzellen und Nicht-Cytokin-sezernierenden LMK^b/B16-Zellen injiziert wurden
LM-Mausfibroblasten (H2^k), die kein IL-2 sezernieren, wurden so modifiziert, dass sie H-2K^b-Determinanten (LMK^b) durch Transduktion mit einem Plasmid (pBR327H-2K^b, Biogen Research Corp., Cambridge, Massachusetts) gemeinsam mit einem Plasmid (pBabePuro), welches eine Resistenz gegenüber Puromycin verleiht, exprimiert. Die Anzahl an Puromycin-resistenten Zellen wurde in vitro erhöht, und dann wurde die Expression von H-2K^b-Determinanten auf diesen Zellen durch Immunfluoreszenzfärbung, im Wesentlichen wie in Beispiel 4 beschrieben, getestet.
Nach der Überprüfung, dass die H-2K^b-Determinanten exprimiert werden, wurden die LMK^b-Zellen mit genomischer DNA aus B16-Melanomzellen, mit einem Plasmid (pHyg) co-transfiziert, das eine Resistenz gegenüber Hygromycin verleiht. Kolonien der Hygromycin-resistenten transfizierten Zellen (LMK^b/B16) (mehr als 5 × 10⁴) wurden gepoolt, und dann wurde die Zellzahl in vitro erhöht. Die Zellen wurden ohne weitere Modifizierung in dem Experiment verwendet.
Die immuntherapeutischen Eigenschaften der genetisch modifizierten Zellen wurden in C57BL/6J-Mäusen (H-2^b) getestet. Mäusen, welche zwischen 8 und 12 Wochen alt waren, als das Experiment begann, wurde subkutan (s. c.) eine Mischung aus 5 × 10³ B16 Melanomzellen und 2 × 10⁶ LMK^b/B16-Zellen injiziert. Zum gleichen Zeitpunkt erhielten die Mäuse eine zweite intraperitoneale (i. p.) Injektion nur aus 2 × 10H6 LMK^b/B16. Die Mäuse erhielten zwei anschließende s. c. und i. p. Injektionen in wöchentlichen Intervallen, bestehend aus äquivalenten Anzahlen an LMK^b/B16-Zellen, ohne zusätzliche B16-Zellen.
Als Kontrollen erhielten die Mäuse eine s. c. Injektion nur aus 5 × 10³ B16-Zellen oder eine s. c. Injektion einer Mischung aus 5 × 10³ B16-Zellen und LM-Zellen, die modifiziert wurden, um H-2K^b-Determinanten alleine (LMK^b-Zellen) zu exprimieren, und eine zweite i. p. Injektion nur aus 2 × 10⁶ LMK^b-Zellen. Die Mäuse in der Gruppe, die mit LMK^b-Zellen behandelt wurden, erhielten zwei aufeinander folgende s. c. und i. p. Injektionen in wöchentlichen Intervallen, bestehend aus äquivalenten Anzahlen aus LMK^b-Zellen, ohne zusätzliche B16-Zellen.
In jeder Gruppe gab es 8 Mäuse. P < 0,001 für Unterschiede in der Überlebensdauer von Mäusen, denen B16-Melanomzellen und LMK^b/B16-Zellen injiziert wurden und Mäusen, denen nur B16-Zellen injiziert wurden, oder Mäusen, denen B16-Zellen und LMK^b-Zellen injiziert wurden.
Wie in 7 angegeben ist, überlebten Mäuse, denen eine Mischung aus B16-Zellen und LMK^b/B16-Zellen injiziert wurden, signifikant länger als Mäuse, denen entweder nur B16-Zellen und Mäuse, denen eine Mischung aus B16-Zellen und LMK^b-Zellen injiziert wurden. Dieses Ergebnis zeigt auch, dass eine Nicht-Cytokin-sezernierende Antigen präsentierende Zelle, die mit genomischer Tumor-DNA transfiziert ist, immunogene Antitumorwirkungen bereitstellt.
Beispiel 11
Bildung von Hybridzellen aus B16-Melanom × LM-Fibroblasten
B16-Melanom × LM-Fibroblastenhybridzellen wurden wie folgt hergestellt. Ouabain-resistente LM(TK-)-Zellen, eine Thymidinkinase-defiziente Variante, wurde zuerst durch Inkubieren von ungefähr 10⁷ Zellen für 3 Wochen in Wachstumsmedium, das 1 mM Ouabain enthält, gewonnen. Das Medium wurde in häufigen Intervallen gewechselt, nicht weniger als jeden dritten Tag, um tote, nicht adhärierende Zellen zu entfernen. Zum Ende der Inkubation wurden Kolonien von LM(TK-)-Zellen (ungefähr 5 × 10²), die in dem Ouabain-haltigen Wachstumsmedium proliferierten, gewonnen und gepoolt. Die Zellen wurden in Wachstumsmedium gehalten, welches 1 mM Ouabain enthält, bis sie für Experimente verwendet wurden. Für die Fusion wurden 5 × 10⁶ Ouabain-resistente LM(TK-)-Zellen mit einer gleichen Anzahl aus B16-Zellen mit einer in vitro-Kultur gemischt und dann bei 37°C in Wachstumsmedium inkubiert, das PEG-1000 enthält, um die Fusion zu erleichtern. 24 Stunden später wurde das Medium durch Wachstumsmedium ersetzt, das sowohl HAT als auch (1 mM) Ouabain enthält. LM(TK-)-Zellen waren aufgrund ihres Fehlens der Thymidinkinase nicht in der Lage, in HAT-haltigem Medium zu wachsen, während nicht-fusionierte B16-Zellen in der Lage waren, in diesem Medium zu wachsen. LM(TK-)-Zellen wurden als Ouabain-resistent ausgewählt, während B16-Zellen als Ouabain- sensitiv ausgewählt wurden. Auf diese Weise komplementierten die Hybridzellen, welche aus der Fusion der LM(TK-)- und der B16-Zellen hervorgingen, die Eigenschaften beider Typen an Elternzellen und proliferieren ein Selektionsmedium, das sowohl HAT als auch Ouabain enthält.
Nach der Fusion wurden B16 × LM-Hybridzellen untersucht, um sicherzustellen, dass sie MHC-Klasse I, Determinanten beider Arten der Parentalzellen, H-2^b-Determinanten aus den Parental-B16-Zellen und H-2^k-Determinanten der Parental-LM(TK-)-Zellen exprimierten. Ungefähr 1 × 10³-Kolonien von Zellen, die in HAT/Ouabain-Medium proliferierten, wurden gepoolt und mittels quantitativer Immunfluoreszenzfärbung, indem im Wesentlichen das gleiche Protokoll, das in Beispiel 4 beschrieben ist, befolgt wurde, getestet. Wie gezeigt ist (8), wurden sowohl die Hybridzellen und die B16-Zellen mit anti-H-2K^b mAbs gefärbt. LM-Zellen wurden mit anti-H-2K^b mAbs nicht gefärbt. Unter gleichen Bedingungen färbten die Hybridzellen und LM-Zellen mit anti-H-2K^k mAbs. B16-Zellen wurden mit anti-H-2K^k mAbs nicht gefärbt. Die Immunfluoreszenzfärbungsintensität der entsprechenden Zelltypen war ungefähr die gleiche. Die Ergebnisse stimmen mit der Co-Expression der Hybridzellen beider Arten an MHC-Klasse I Determinanten der Parentalzellen überein.
Ein ähnlicher Ansatz wurde verwendet, um die Bildung aus (Antikörper-definierten) MAAs durch die Hybride und Parentalzellen nachzuweisen. Ein Antiserum, das in C57BL/6J-Mäusen erzeugt wurde, denen (durch drei Runden aus Einfrieren und Auftauen) abgetötete B16-Zellen injiziert wurden, wurde für diesen Zweck verwendet (11). Wie gezeigt ist (8), färbten sowohl die B16-Zellen als auch die Hybridzellen sich mit den Melanomantikörpern. LM-Zellen wurden mit den Aliquots des Melanomantiserums nicht gefärbt. Wie bei den MHC-Klasse I Determinanten war die Intensität der Immunfluoreszenzfärbung der B16-zellen und der Hybridzellen mit dem Melanomantiserum ungefähr gleich. Nach 6 Monaten kontinuierlicher Kultivierung war die Färbung der Hybridzellen mit dem B16-Antiserum und den anti-H-2K^b und den anti-H-2K^k mAbs äquivalent mit der, die gefunden wurde als die Zellen zuerst untersucht wurden.
Zusätzlich zum Testen der Expression von MAAs und MHC-Klasse I Determinanten wurden die Hybridzellen durch Immunfloureszenzfärbung auf die Expression von B7.1, B7.2 und ICAM-1, co-stimulatorischen und Adhäsionsmolekülen untersucht, die an der Aktivierung von cytotoxischen T-Lymphozyten beteiligt sind. Das Verfahren zur Immunfärbung war im Wesentlichen das gleiche, das in Beispiel 4 beschrieben wurde. Wie gezeigt ist (9), wurden sowohl die Hybridzellen als auch die LM-Zellen mit anti-B7.1 mAbs positiv gefärbt (mittlere Fluoreszenzintensitäten (MFI) von 23,2 und 19,2 über den Zellen, die mit FITC-konjugierten Maus-IgG_2a alleine inkubiert wurden, welche als Hintergrund genommen wurde). LM-Zellen und Hybridzellen wurden für B7.2 oder ICAM-1 nicht positiv gefärbt (Daten nicht dargestellt). B16-Zellen wurden mit B7.1, B7.2 oder ICAM-1 unter diesen Bedingungen nicht gefärbt (maximale MFI von 4,6 über dem Hintergrund). WR19M.1-Zellen, eine Maus-Monozyten/Makrophagen-Zelllinie wurde als Positivkontrolle eingeschlossen. Wie die Hybridzellen und LM-Zellen wurden die Zellen positiv mit anti-B7.1 mAbs gefärbt (MFI von 23.2 über dem Hintergrund).
Beispiel 12
Behandlung mit B16 × LM-Hybridzellen verlängerte die Überlebensdauer von C57BL/6J-Mäusen mit Melanom
C57BL/6J-Mäuse wiesen keine auffällige Resistenz gegen eine maligne Proliferation der B16-Melanomzellen auf. Nur 5 × 10³ lebensfähige Zellen, die subkutan (s. c.) injiziert wurden, führten zum Tod durch ein progressives Tumorwachstum in 100% der Tiere in weniger als 35 Tagen. Die Wirkung der Immunisierung mit B16 × LM-Hybridzellen auf die Überlebensdauer der C57BL/6J-Mäuse mit B16-Melanom wurde durch Injizieren naiver Mäuse s. c. mit einer Mischung aus 5 × 10³ lebensfähigen B16-Zellen und 1 × 10⁷-Hybridzellen bestimmt. Die Mäuse erhielten eine einzelne s. c.-Injektion aus 1 × 10⁷ Hybridzellen alleine zwei Wochen später. Als Kontrolle erhielten die Mäuse s. c. Injektionen einer äquivalenten Anzahl lebensfähiger B16-Zellen, welche bestrahlt wurden (5000 Rad aus einer ⁶⁰Co-Quelle), B16-Zellen und LM(TK-)-Zellen. Die Überlebensdauer der Mäuse in jeder Gruppe (6 pro Gruppe) wurde mit der Überlebensdauer von Mäusen verglichen, denen s. c. nur 5 × 10³ lebensfähige B16-Zellen injiziert wurden. Wie gezeigt ist (10), überlebten Mäuse, denen die Mischung aus B16-Zellen und die Hybridzellen injiziert wurden signifikant länger (P < 0,005) als Mäuse, denen die Mischung aus B16-Zellen, bestrahlte B16-Zellen und LM(TK-)-Zellen injiziert wurden. Die verlängerte Lebensdauer der Mäuse, denen die Hybridzellen injiziert wurden, bezogen auf die Überlebensdauer der Mäuse, denen die Mischung aus B16-Zellen, bestrahlten B16-Zellen und LM(TK-)-Zellen injiziert wurden, wies darauf hin, dass die Co-Expression sowohl der H-2K^b- und K^k-Determinanten durch den gleichen Zelltyp benötigt wurde, um ein optimales immuntherapeutisches Ergebnis zu erhalten.
Als zusätzliche Kontrollen wurden andere naive C57BL/6J-Mäuse gemäß dem gleichen Protokoll mit einer Mischung aus B16-Zellen und LM-Zellen mit einer Mischung aus B16-Zellen und bestrahlten B16-Zellen oder mit einer gleichen Anzahl an B16-Zellen alleine injiziert. Wie gezeigt ist (10), war die Überlebensdauer der Mäuse in diesen Gruppen signifikant geringer als die der Mäuse in der Gruppe, die mit den Hybridzellen behandelt wurde. Die Daten weisen darauf hin, dass die immunogenen Eigenschaften schwacher MAAs verstärkt werden, wenn sie durch Zellen exprimiert werden, die sowohl syngene als auch allogene Determinanten bildeten. Dieses in vivo-Ergebnis wurde bestätigt durch die Untersuchung der Milzzell-vermittelten Cytotoxizität in vivo. Die Cytotoxizität der Milzzellen, welche aus C57BL/6J-Mäusen gewonnen wurde, die mit einer Mischung aus (Röntgen-bestrahlten) B16-Zellen und LM(TK-)-Zellen immunisiert wurden, oder Mäusen, die mit Hybridzellen immunisiert wurden, wurde untersucht. Die in vitro-Ergebnisse stimmten mit den in vivo-Ergebnissen überein.
Um zu untersuchen, ob die Hybridzellen das Potential des Wachstums in C57BL/6J-Mäusen behielten, wurde naiven Mäusen s. c. 10⁷ lebensfähige Hybidzellen in jeder der drei wöchentlichen Injektionen injiziert. Die Mäuse wiesen keine offensichtlichen Krankheitseffekte auf. Es bildeten sich keine Tumoren und die Mäuse lebten unendlich (mehr als 6 Monate).
Beispiel 13
B16 × LM-Hybridzellen-induzierte Immunität und Spezifität für Melanome
Um zu bestimmen, ob Mäuse, denen die Hybridzellen injiziert wurden, eine Immunität gegen andere Arten von Neoplasien entwickelten, die in C57BL/6-Mäusen entstanden, wurde die Überlebensdauer von naiven C57BL/6J-Mäusen, denen eine Mischung aus Hybridzellen und B16-Zellen injiziert wurden, mit der Überlebensdauer von Mäusen verglichen, denen eine Mischung der Hybridzellen und Gl 261 Gliom, c1498 Lyphom-Zellen und EL4-Thymomzellen injiziert wurden. Die Tiere (fünf pro Gruppe) erhielten 5 × 10³ der jeweiligen Tumorzellen und 1 × 10⁷ Hybridzellen in der ersten Injektion, und 1 × 10⁷ Hybridzellen allein in wöchentlichen Intervallen bei zwei anschließenden Gelegenheiten.
Wie gezeigt ist (11), überlebten Mäuse, denen die Mischung aus B16-Zellen und Hybridzellen injiziert wurde, signifikant länger (p < 0,005) als Mäuse in jeder der anderen Gruppen. Mit Ausnahme der Mäuse, denen die B16-Zellen und die Hybridzellen injiziert wurden, überlebten Mäuse in den Kontrollgruppen nicht länger als Mäuse, denen äquivalente Anzahl der jeweiligen Tumorzelllinien alleine injiziert wurden. Die Ergebnisse stimmten mit der Expression der Melanom-spezifischen Tumor-assoziierten Antigene (TAAs) in hoch immunogener Form durch Die Melanom × Fibroblasten-Hybridzellen überein.
Die Milzzell-vermittelten cytotoxischen Reaktionen in Mäusen, denen die Hybridzellen injiziert wurden, wurde durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Spezifizität der Antimelanom-Immunreaktion, die in vivo gefunden wurden, durch die Ergebnisse der Studien, die in vitro durchgeführt wurden, widergespiegelt wurde. Naiven C57BL/6J-Mäusen (2 pro Gruppe) wurden s. c. dreimal in wöchentlichen Intervallen 1 × 10⁷ lebensfähige Hybridzellen injiziert. Eine Milzzellsuspension, welche 3 Wochen nach der Injektion hergestellt wurde, wurde auf ihre Reaktivität gegenüber ⁵¹Cr-markierten B16-Zellen, und zum Vergleich gegen ⁵¹Cr-markierte c1498, EL-4 oder Gl 261-Zellen getestet. Die Ergebnisse (12) zeigen, dass die Reaktivität gegen die Melanomzellen signifikant (p < 0,0005) höher ist als die Reaktionen gegen irgendeine andere der anderen Arten an Maustumoren, die getestet wurden. Die Reaktivität gegen c1498, EL-4 oder Gl 261 in Mäusen, die mit den Hybridzellen immunisiert wurden, sind nicht größer als die der naiven Mäuse.
Beispiel 14
CD8⁺ (Lyt 2.2)-Zellen sind die vorherrschenden Antimelanomeffektorzellarten in Mäusen, die mit B16 × LM-Hybridzellen immunisiert wurden
Die Wirkung von mAbs gegen CD8⁺ (Lyt 2.2), CD4⁺ (L3T4) oder Asialo GM1-Determinanten auf Effektorzellen, die die anti-B16-Melanom-Reaktion vermitteln, wurde verwendet, um die Zelltypen zu bestimmen, die bei der Antimelanomimmunität in Mäusen aktiviert waren, welche mit den Hybridzellen immunisiert wurden. Naiven C57BL/6J-Mäusen (2 pro Gruppe) wurden 1 × 10⁷ Hybridzellen s. c. über drei wöchentlichen Injektionen injiziert. Eine Woche nach der letzten Injektion wurden die Mäuse getötet und eine Milzzellsuspension wurde hergestellt. Die Zellen wurden in Wachstumsmedium für 5 Tage zusätzlich mit Mitomycin C-behandelten (50 μg/ml; 30 min; 37°C) Hybridzellen (Verhältnis der Hybridzellen:Milzzellen = 30:1) inkubiert. Zum Ende der Inkubation wurden die Milzzellen mit überschüssigen Mengen an CD4⁺, CD8⁺ und/oder Asialo GM1 mAbs für 1 Stunde bei 4°C inkubiert, bevor ein Standard-⁵¹Cr-Freisetzungstest gegen B16-Zellen durchgeführt wurde, behandelt. Das Verfahren entspricht dem, das in Beispiel 9 beschrieben wurde.
Wie gezeigt wird (13), reduzierte die Behandlung der Zellen mit anti-CD8⁺ mAbs oder mit einer Mischung aus CD8⁺ und Asialo GM1 mAbs die spezifische Freisetzung des Isotops gegenüber dem "Hintergrund" (die Antimelanomaktivität, die in eine Population aus Milzzellen naiver C57BL/6J-Mäuse vorhanden ist) (p < 0,005). Geringere inhibitorische Wirkungen wurden in Zellpopulationen beobachtet, die mit CD4⁺ oder Asialo GM1 mAbs alleine behandelt wurden. Diese Ergebnisse zeigen, dass CD8⁺-Zellen die vorherrschende Art der Antimelanom-Effektorzellen in Mäusen ist, welche mit den B16 × LM-Hybridzellen immunisiert wurden.
Beispiel 15
Überleben der C57BL/6J-Mäuse, denen eine Mischung aus EO771-Brustkarzinomzellen und LM-IL-2K^b-Zellen injiziert wurden, die mit DNA aus EO771-Zellen transfiziert wurden (LM-IL-2K^b/EO771)
EO771 ist eine Brustkrebszelllinie, die aus einer Brustneoplasie entstammt, die in einer C57BL/6-Maus entstanden ist. Die Zellen werden durch seriellen Transfer in syngenen Mäusen oder unter Standzellkulturbedingungen gehalten. C57BL/6J-Mäuse sind stark empfindlich gegenüber EO771-Zellen. 100% der Mäuse, denen 1 × 10³ EO771-Zellen injiziert wurden, entwickelten progressiv wachsende Neoplasien.
Die potentiellen immuntherapeutischen Eigenschaften von LM-IL-2K^b/EO771-Zellen gegen das Wachstum von EO771-Zellen wurden in naiven syngenen C57BL/6J-Mäusen (14) bestimmt. In dem Experiment wurden C57BL/6J-Mäuse (7 pro Gruppe) in die Fettpolster der Brust mit einer Mischung aus 5 × 10³ EO771-Zellen und 2 × 10⁶ LM-IL-2K^b/EO771-Zellen in einem Gesamtvolumen von 200 μl injiziert. Zum gleichen Zeitpunkt erhielten die Mäuse ebenfalls ein i. p.-Injektion nur aus 2 × 10⁶ LM-IL-2K^b/EO771-Zellen, gefolgt von zwei aufeinander folgenden Injektionen in wöchentlichen Intervallen, bestehend aus 2 × 10⁶ LM-IL-2K^b/EO771-Zellen i. p. und 2 × 10⁶ LM-IL-2K^b/EO771-Zellen in die gleiche Brust wie zuvor injiziert, ohne zusätzliche EO771-Zellen. Als Kontrolle wurden naive C57BL/6J-Mäuse mit einer gleichen Anzahl an EO771-Zellen in Wachstumsmedium alleine injiziert, gefolgt von zwei anschließenden Injektionen in wöchentlichen Intervallen aus Wachstumsmedium i. p. und Wachstumsmedium in die gleiche Brust wie zuvor injiziert. Als zusätzliche Kontrollen wurden naiven C57BL/6J-Mäusen gemäß dem gleichen Protokoll eine Mischung aus EO771-Zellen und LM-Zellen injiziert, wobei die EO771-Zellen und die Nicht-Tumor-DNA-transfizierten LM-IL-2K^b-Zellen, oder mit EO771-Zellen und LM-IL-2K^b-Zellen, die mit DNA aus B16-Zellen transfiziert waren (LM-IL-2K^b/B16). B16 ist eine Melanomzelllinie von C57BL/6J-Ursprung.
Die Ergebnisse (14) zeigen, dass das erste Auftreten des Tumors in der Gruppe der Mäuse, denen die Mischung aus EO771-Zellen und LM-IL-2K^b/EO77-Zellen injiziert wurden, bezogen auf das bei Mäusen in irgendeiner der anderen Gruppen verzögert war. Drei Mäuse in der Gruppe, die EO771-Zellen und LM-IL-2K^b/EO771-Zellen erhielten, entwickelten keine Tumore. In den Fällen, in denen Brustneoplasien auftraten, war die Tumorwachstumsrate (zweidimensionale Messungen) in jeder Gruppe die gleiche. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine spezifische Teilimmunität gegen EO771-Zellen in Mäusen entwickelt wurde, die mit LM-IL-2K^b/EO771-Zellen immunisiert wurden.
Die Entwicklung der Teilimmunität in C57BL/6J-Mäusen, die mit LM-IL-2K^b/EO771-Zellen behandelt wurden, wurde durch den Befund unterstrichen, dass Mäuse in der Behandlungsgruppe signifikant (P < 0,01) länger überlebten als Mäuse in irgendeiner der zahlreichen Kontrollgruppen, einschließlich der Mäuse, die mit der Mischung aus EO771-Zellen und LM-IL-2K^b/EO771-Zellen injiziert wurden (15). In einigen Fällen schienen Mäuse, denen die Mischung aus EO771-Zellen und LM-IL-2K^b/EO771-Zellen injiziert wurde, die Brustkrebszellen abgestoßen zu haben, und sie überlebten unendlich (mehr als 110 Tage). Zusätzlich bildeten sich Tumore in Mäusen, denen nur semi-allogene LM-IL-2K^b/EO771-Zellen injiziert wurden oder in Peritonealhöhlen von Mäusen, denen in die Brust die Mischung aus EO771-Zellen und LM-IL-2K^b/EO771-Zellen injiziert wurde, nicht.
Um zu bestimmen, ob die überlebenden Mäuse in der Gruppe, denen EO771-Zellen injiziert wurden und LM-IL-2K^b/EO771-Zellen, gegenüber einer zweiten Injektion an EO771-Zellen resistent waren, wurde den Tieren in das Fettpolster der Brust nur 5 × 10³ EO771-Zellen 100 Tage nach der ersten Injektion injiziert. Die MST (33 ± 6 Tage) der überlebenden Mäuse war signifikant (P < 0,02) höher als bei naiven Mäusen, denen eine gleiche Anzahl nur aus EO771-Zellen injiziert wurde (20 ± 6 Tage) (16).
Beispiel 16
Überlebensdauer von C3H/HeJ-Mäusen, denen eine Mischung aus Zellen eines spontanen Adenokarzinoms der Brust (SB-1) und LM-IL-2K^b-Zellen, die mit DNA aus der gleichen Neoplasie transfiziert waren (LM-IL-2K^b/SB-1), injiziert wurden
Die Ergebnisse der vorhergehenden Experimente (Beispiel 15) wiesen darauf hin, dass spezifische Teilimmunität gegen EO771-Zellen, eine Brustkrebszelllinie in C57BL/6J-Mäusen erzeugt wurde, die mit semi-allogenen, IL-2-sezernierenden Mausfibroblasten immunisiert wurde, welche mit DNA von EO771-Zellen transfiziert waren. Da die immunogenen Eigenschaften einer Brustkrebszelllinie von denen einer spontanen Brustneoplasie verschieden sein kann, wurde das gleiche Protokoll befolgt, um zu bestimmen, ob eine gleiche Reaktion in C3H/HeJ-Mäusen beobachtet werden könnte, die mit semi-allogenen, IL-2-sezernierenden Mausfibroblasten immunisiert wurden, welche mit DNA transfiziert wurden, welche direkt aus einem Brustadenokarzinom entnommen wurde, welche in einer C3H/He-Maus (SB-1-Zellen) entstanden ist. Unbehandelte C3H/HeJ-Mäuse wiesen keine scheinbare Resistenz gegenüber dem Wachstum der SB-1-Brustkarzinomzellen auf. 100% der Mäuse, denen 1 × 10⁴ SB-1-Zellen in das Brustfettpolster injiziert wurden, starben an dem progressiven Tumorwachstum innerhalb von ungefähr 30 Tagen. Die potentiellen immuntherapeutischen Eigenschaften der LM-IL-2K^b/SB-1-Zellen wurden durch Injizieren von einer Mischung aus 1 × 10⁶ SB-1-Zellen und 2 × 10⁶ LM-IL-2K^b/SB-1-Zellen und in das Fettpolster der Brust und i. p. von 2 × 10⁶ LM-IL-2K^b/SB-1-Zellen alleine in C3H/HeJ-Mäusen bestimmt. Die Mäuse erhielten zwei anschließende Injektionen i. p. und zwei anschließende Injektionen in die gleiche Brust wie zuerst mit der gleichen Anzahl aus LM-IL-2K^b/SB-1-Zellen alleine injiziert, wie zuvor beschrieben wurde. Der Zeitraum bis zum ersten Auftreten eines Tumors, die Rate des Tumorwachstums und die Überlebensdauer der Mäuse, denen die Mischung aus SB-1-Zellen und LM-IL-2K^b/SB-1-Zellen injiziert wurde, wurde mit dem Zeitraum verglichen bis zum ersten Auftreten und der Überlebensdauer der Mäuse, denen nur die SB-1-Zellen injiziert wurden. Es gab fünf Mäuse pro Gruppe. Die Ergebnisse (17) wiesen darauf hin, dass das erste Auftreten eines tastbaren Tumors in den Brüsten der Mäuse, denen die Mischung aus LM-IL-2K^b/SB-1-Zellen und SB-1-Zellen injiziert wurden, verzögert war, bezogen auf das erste Auftreten des Tumors in Mäusen, in denen die SB-1-Zellen und Wachstumsmedium injiziert wurden. Sobald die Brustneoplasien zuerst auftraten, wurde die Tumorwachstumsrate (zweidimensionale Messungen) in den behandelten und nicht-behandelten Gruppen ungefähr das gleiche. In Übereinstimmung mit dem verspäteten Auftreten des Tumors in der behandelten Gruppe, überlebten die Mäuse, denen die Mischung aus SB-1-Zellen und LM-IL-2K^b/SB-1-Zellen injiziert wurde, signifikant (P < 0,006) länger als Mäuse, denen nur die SB-1-Zellen injiziert wurden (18). In keinem Fall wurden Tumore an den Immunisierungsstellen, bei denen nur LM-IL-2K^b/SB-1-Zellen injiziert wurden, nachgewiesen.
Als zusätzliche Kontrollen wurde naiven C3H/HeJ-Mäusen gemäß dem gleichen Protokoll eine Mischung aus SB-1-Zellen und nicht-transfizierten LM-IL-2-Zellen, SB-1-Zellen und nicht-transfizierten semi-allogenen LM-IL-2K^b-Zellen, oder SB-1-Zellen und syngene LM-IL-2-Zellen, die mit DNA von SB-1-Zellen transfiziert war (LM-IL-2/SB-1), injiziert. Wie gezeigt (17 und 18) war mit Ausnahme der zwei Mäuse in der Gruppe (5 pro Gruppe), die mit der Mischung aus SB-1-Zellen und LM-IL-2K^b/EO771-Zellen injiziert wurden, das erste Auftreten des Tumors, die Tumorwachstumsrate und die Überlebensdauer der Mäuse in jeder Gruppe ungefähr gleich wie bei Mäusen, denen nur SB-1-Zellen injiziert wurden. Der größte immuntherapeutische Nutzen war in der Gruppe der Mäuse, denen die Mischung aus SB-1-Zellen und LM-IL-2K^b-Zellen injiziert wurden, welche mit genomischer DNA von SB-1-Zellen transfiziert waren.
Als zusätzliche Kontrolle, um die Wirkung von Immunisierungen mit LM-IL-2K^b/EO771-Zellen auf das Wachstum von SB-1-Zellen zu bestimmen, dem unabhängig entstandenen Brustkrebs, wurde naiven C3H/HeJ-Mäusen eine Mischung aus SB-1-Zellen und LM-IL-2K^b/EO771-Zellen injiziert. Wie gezeigt wird (18), starben sie in signifikant (P < 0,01) kürzeren Intervallen als Mäuse mit SB-1-Zellen und LM-IL-2K^b-Zellen, die mit DNA von SB-1-Zellen transfiziert war, obwohl Mäuse, denen die Mischung aus SB-1-Zellen und LM-IL-2K^b/EO771-Zellen länger überlebten als Mäuse, denen nur SB-1-Zellen injiziert wurden.
Beispiel 17
Milzzellen-vermittelte Immunreaktionen gegen EO771-Zellen wurden in C57BL/6J-Mäusen hervorgerufen, welche mit LM-IL-2K^b/EO771-Zellen immunisiert wurden
Wie in Beispiel 15 beschrieben wurde, überlebten C57BL/6J-Mäuse, denen eine Mischung aus EO771-Zellen und LM-IL-2K^b/EO771-Zellen injiziert wurden, signifikant länger als Mäuse in zahlreichen Kontrollgruppen, einschließlich der Mäuse, die mit einer Mischung aus EO771-Zellen und LM-IL-2K^b-Zellen injiziert wurden, welche mit DNA aus B16-Melanomzellen transfiziert waren. Die Ergebnisse zeigen an, dass eine spezifische Teilimmunität gegen EO771-Zellen in Mäusen erzeugt wurde, die mit semi-allogenen, Cytokin-sezernierenden Zellen immunisiert wurden, welche mit DNA aus EO771-Zellen transfiziert war.
Ein Standard-⁵¹Cr-Freisetzungstest wurde verwendet, um die Antitumorimmunantwort in Mäusen zu charakterisieren, denen die Mischung aus EO771-Zellen und LM-IL-2K^b/EO771-Zellen injiziert wurde. In dem Experiment wurde C57BL/6J-Mäusen in das Fettpolster der Brust eine Mischung aus 5 × 10³ EO771-Zellen und 2 × 10⁶ LM-IL-2K^b/EO771-Zellen injiziert. Zum gleichen Zeitpunkt erhielten die Mäuse ebenfalls eine Injektion i. p. der gleichen Anzahl nur aus LM-IL-2K^b/EO771-Zellen, gefolgt von zwei anschließenden Injektionen in wöchentlichen Intervallen aus gleichen Anzahlen an LM-IL-2K^b/EO771-Zellen i. p. und LM-IL-2K^b/EO771-Zellen in die gleiche Brust, wie zuvor injiziert wurde, ohne zusätzliche EO771-Zellen. Die Mäuse wurden 1 Woche nach der letzten Injektion der LM-IL-2K^b/EO771-Zellen geopfert. Ein Pool aus mononukleären Zellen aus den Milzen von 3 Mäusen in jeder Gruppe wurde eingesammelt. Eine Milzzellsuspension wurde für 5 zusätzliche Tage mit (Mitomycin C-behandelten; 50 μg/ml; 30 min bei 37°C) LM-IL-2K^b/EO771-Zellen co-inkubiert, worauf eine Cytotoxizitätsbestimmung gegen ⁵¹Cr-markierte EO771-Zellen durchgeführt wurde. Als Kontrollen wurde das gleiche Protokoll befolgt, außer dass Milzzellen von Mäusen, denen EO771-Zellen und LM-Zellen, EO771-Zellen und LM-IL-2K^b-Zellen oder EO771-Zellen und LM-IL-2K^b/B16-Zellen injiziert wurden, durch Milzzellen von Mäusen substituiert wurden, denen EO771-Zellen und LM-IL-2K^b/EO771-Zellen injiziert wurden. Als zusätzliche Kontrolle wurden Milzzellen von Mäusen, denen nur EO771-Zellen injiziert wurden, gewonnen.
Die Ergebnisse (Tabelle IV) zeigen, dass die cytotoxischen Reaktionen (spezifische ⁵¹Cr-Freisetzung) gegen EO771-Zellen in Mäusen, denen die Mischung aus EO771-Zellen und LM-IL-2^b/EO771-Zellen injiziert wurde, signifikant (P < 0,01) höher war als die in irgendeiner der anderen Gruppen. Diese Reaktion gegen EO771-Zellen in Mäusen, denen die Mischung aus EO771-Zellen und LM-IL-2K^b-Zellen injiziert wurde, welche mit DNA von B16-Melanomzellen transfiziert war, war nicht signifikant verschieden vom Hintergrund (spezifische ⁵¹Cr-Freisetzung aus EO771-Zellen, welche mit Milzzellen co-inkubiert wurden, die aus Mäusen stammte, denen nur EO771-Zellen injiziert wurden). Immunisierungen mit Nicht-DNA-transfizierten LM-IL-2K^b-Zellen erzeugten keine zellvermittelten Reaktionen gegen EO771-Brustkarzinomzellen in C57BL/6J-Mäusen.
Als zusätzliche Kontrolle, um zu bestimmen, ob cytotoxische Reaktionen gegen LM-Zellen in den Milzzellsuspensionen vorhanden waren, die nicht mit EO771-Zellen reagierten, wurden Aliquots der Zellsuspensionen von C57BL/6J-Mäusen, denen verschiedene Zellgemische injiziert wurden, auf cytotoxische Reaktionen gegen LM-Zellen getestet. Wie gezeigt ist (Tabelle IV), war die spezifische prozentuale Lyse 50% höher bei Zellen aus jeder Gruppe, einschließlich der Zellen der Mäuse, die mit LM-IL-2K^b/B16-Zellen immunisiert wurden, welche keine cytotoxischen Reaktionen gegen EO771-Zellen hervorriefen.
Beispiel 18
CD8⁺-Zellen infiltrierte Brusttumore, welche sich in Mäusen entwickelten, denen SB-1- und LM-IL-2K^b/SB-1-Zellen injiziert wurden und in Mäusen, denen EO771-Zellen und LM-IL-2k^b/EO771-Zellen injiziert wurden
Wie in Beispiel 16 beschrieben wurde, überlebten C3H/HeJ-Mäuse, denen eine Mischung aus SB-1-Zellen und LM-IL-2K^b/SB-1-Mäuse injiziert wurde, signifikant länger als Mäuse in verschiedenen Kontrollgruppen.
Immunhistochemische Färbungen wurden verwendet, um das zelluläre Infiltrat in Brusttumoren zu charakterisieren, welches sich in Mäusen entwickelte, denen die Mischung aus SB-1-Zellen und LM-IL-2K^b/SB-1-Zellen injiziert wurde. Primäre Antikörper für Maus CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Cd11b oder NK (Ly-49c) Zellen wurden in der Analyse verwendet. In diesen Experimenten wurde C3H/HeJ-Mäusen (3 Mäuse pro Gruppe) in das Fettpolster der Brust eine Mischung aus 1 × 10⁶ SB-1-Zellen und 2 × 10⁶ LM-IL-2K^b/SB-1-Zellen injiziert und i. p. 1 × 10⁶ LM-IL-2K^b/SB-1-Zellen alleine. Die Mäuse erhielten anschließende i. p.-Injektionen und zwei anschließende Injektionen in die gleiche Brust, in die als erstes injiziert wurde, mit gleichen Anzahl aus LM-IL-2KTb/SB-1-Zellen alleine, wie zuvor beschrieben wurde. Eine Woche nach der letzten Injektion wurden die Mäuse geopfert und die Brustneoplasien wurden schnell in flüssigem Stickstoff eingefroren.
Ein repräsentativer Gewebeblock wurde ausgewählt und 5 μm-Gefrierschnitte wurden hergestellt, welche auf saubere Glasobjektträger gegeben wurden und mit Aceton fixiert wurden. Anschließend wurden die Schnitte 2 × mit 0,1 M PBS gewaschen, in 3% H₂O₂ 10 Minuten platziert und dann 3 × mit 0,1 M PBS gewaschen. Eine 1:5-Verdünnung aus Ziegenserum (Gibco BRL) in PBS (Blockierpuffer) wurde zu den Objektträgern zugegeben (um die nicht-spezifische Bindung von Primärantikörper zu reduzieren), gefolgt von einer Inkubation bei 37°C für 15 Minuten. Nach der Inkubation wurden die Objektträger mit Anti-Maus CD4 (L3T4), Anti-Maus CD8a (Ly-2), Anti-Maus CD11b (integrin a_m Mac-1a) Kette oder Anti-Maus Nk (Ly-49c) Antikörpern (alle von Pharmingen, San Diego, CA) überflutet. Diese Antikörper sind so titriert worden, dass die Verdünnung, die verwendet wurde, die minimale Hintergrundfärbung hat, welche typischerweise eine 1:50-Verdünnung mit Blockierungspuffer war. Anschließend wurden die Objektträger zweimal mit PBS gewaschen, gefolgt von der Zugabe von Avidin-Biotin-Komplex und Diaminobenzidin, gemäß den Anweisungen des Herstellers (Vector, Burlington, CA). Die Schnitte wurden 2 × mit PBS gewaschen und mit Eosin gegengefärbt. Nach einem letzten Waschen mit Xylol wurden Deckgläschen über den gefärbten Schnitten platziert und mit Permount überschichtet. Die Verteilung der Zellen, die durch die mAbs gefärbt wurden, wurde unabhängig durch vier Untersucher ermittelt und quantitativ eingeteilt.
Wie gezeigt ist (19 und Tabelle V), infiltrierten große Anzahlen an Zellen, die mit CD8-Antikörpern reagierten, die Epitheldrüsen der Brusttumore in Mäusen, denen die Mischung aus SB-1 und LM-IL-2K^b/SB-1-Zellen injiziert wurden. Geringere Anzahlen an CD8⁺-Zellen waren in Tumoren bei Mäusen vorhanden, denen nur SB-1-Zellen injiziert wurden. Es gab keine auffälligen Unterschiede zwischen den Anzahlen der CD4+, CD11b+ oder NK-Zellen in den Brustneoplasien der behandelten und unbehandelten Gruppen (Tabelle V).

Das gleiche Protokoll wurde dann befolgt, um zelluläre Infiltrate in den Epitheldrüsen der Tumore zu charakterisieren, die sich in C57BL/J6-Mäusen bildeten, die in eine Mischung aus EO771-Zellen und LM-IL-2K^b/EO771-Zellen injiziert wurden. Ähnliche CD8+ T-Zellen-Infiltrate waren in Brusttumoren vorhanden, die sich in C57BL/6J-Mäusen entwickelten, denen eine Mischung aus EO771-Zellen und LM-IL-2K^b/EO771-Zellen injiziert wurde. Kleinere Anzahlen an CD8+ Zellen waren in Tumoren vorhanden, die sich in Mäusen entwickelten, denen nur die EO771-Zellen injiziert wurden. Tabelle I Derzeit anerkannte HLA-Spezifitäten, die in jeder HLA-Subregion nachgewiesen werden (Roitt et al.)

DR		DQ	DP	B		C	A
DR1	Dw1	DQw1	DPw1	Bw4	Bw47	Cw1	A1
DR2	Dw2	DQw2	DPw2	B5	Bw48	Cw2	A2
DR3	Dw3	DQw3	DPw3	Bw6	B49	Cw3	A3
DR4	Dw4		DPw4	B7	Bw50	Cw4	A9
DR5			DPw5	B8	B51	Cw5	A10
DRw6			DPw6	B12	Bw52	Cw6	A11
DR7	Dw7			B13	Bw53	Cw7	Aw19
DRw8	Dw8			B14	Bw54	Cw8	A23
DRw9				B15	Bw55		A24
DRw10				B16	Bw56		A25
DRw11	Dw5			B17	Bw57		A26
DRw12				B18	Bw58		A28
DRw13	Dw6			B21	Bw59		A29
DRw14	Dw9			Bw22	Bw60		A30
DRw52				B27	Bw61		A31
DRw53				B35	Bw62		A32
				B37	Bw63		Aw33
				B38	Bw64		Aw34
				B39	Bw65		Aw36
				B40	Bw67		Aw43
				Bw41	Bw70		Aw66
				Bw42	Bw71		Aw68
				B44	Bw72		Aw69
				B45	Bw73
				B46

Tabelle II Interleukin 2-Sekretion durch genetisch modifizierte Fibroblasten

Impfstoff	IL-2^a
Zelltyp	(Einheiten/10⁶-Zellen/48 h)
LM-ZipNeo	0
LM-IL-2	96
LM-IL-2/B16	98
LM-IL-2K^b	91
LM-IL-2K^b/B16	86

Tabelle III Cytotoxität von B16 durch Milzzellen von Mäusen, die mit semi-allogenen Fibroblasten geimpft wurden, die mit genomischer DNA von B16 transfiziert waren

Impfstoffzelltyp	Ziel	Blockierende AB	spezifische Freisetzung
Medium	B16	keine	0,0
	B16	α CD8⁺	0,0
	B16	α Asialo-GM1	0,0
	c1498	kein	0,0
LM-ZipNeo	B16	keine	4,9 ± 1,5
	B16	α CD8⁺	3,6 ± 1,8
	B16	α Asialo-GM1	1,2 ± 0,95
	c1498	keine	2,2 ± 0,62
LM-IL-2	B16	keine	0,0
	B16	α CD8⁺	0,0
	B16	α Asialo-GM1	0,0
	c1498	keine	0,0
LM-IL-2/B16*	B16	keine	2,0 ± 0,3
	B16	α CD8⁺	3,3 ± 0,35
	B16	α Asialo-GM1	1,4 ± 1,4
	B16	keine	3,1 ± 2,1
LM-IL-2K^b	B16	keine	6,3 ± 2,1
	B16	α CD8⁺	2,0 ± 1,7
	B16	α Asialo-GM1	3,3 ± 0,75
	c1498	keine	4,8 ± 2,4
LM-IL-2K^b/B16**	B16	keine	19,1 ± 0,36
	B16	α CD8⁺	9,3 ± 2,0
	B16	α Asialo-GM1	17,6 ± 2,7
	c1498	keine	3,8 ± 1,6

Tabelle IV Cytotoxische Reaktionen gegen EO771-Brustkarzinomzellen in C57BL/6J-Mäusen, denen eine Mischung aus EO771-Zellen und LM-IL-2K^b/EO771-Zellen injiziert wurde

injiziert mit EO771-Zellen	Ziel	% spezifisch
⁵¹Cr-Freisetzung und LM-IL-2K^b/EO771-Zellen	EO771	25,0 ± 7
LM-Zellen	EO771	9,0 ± 4
LM-IL-2K^b-Zellen	EO771	3,1 ± 2,0
LM-IL-2K^b/B16-Zellen	EO771	7,0 ± 4,0
Medium	EO771	3,3 ± 1,0
EO771-Zellen und LM-IL-2K^b/EO771-Zellen	LM	59 ± 12
LM-Zellen	LM	64 ± 15
LM-IL-2K^b-Zellen	LM	53 ± 3
LM-IL-2K^b/B16-Zellen	LM	57 ± 10
Medium	LM	1,8 ± 12

Legende zur Tabelle IV: C57BL/6J-Mäusen wurde in das Fettpolster der Brust eine Mischung aus 5 × 10³ EO771-Zellen und 2 × 10⁶ LM-IL-2K^b/EO771-Zellen oder gleiche Anzahlen an EO771-Zellen und LM-Zellen, EO771-Zellen und LM-IL-2K^b-Zellen, mit EO771-Zellen und LM-IL-2K^b/B16-Zellen oder mit EO771-Zellen in Wachstumsmedium injiziert. Die Mäuse erhielten zwei anschließende Injektionen i. p. in die Brust, bestehend aus gleichen Anzahlen von LM-Zellen, LM-IL-2K^b-Zellen oder LM-IL-2K^b/B16-Zellen ohne zusätzliche EO771-Zellen. Eine Woche nach der letzten Injektion wurden die Mäuse getötet und gepoolte Milzzellsuspensionen aus Mäusen in jeder Gruppe wurden mit Mitomycin C-behandelten (50 μg/ml für 30 min bei 37°C) Stimulatorzellen des gleichen Typs gemischt, welcher für die Immunisierung der Mäuse verwendet wurde, gefolgt von einer Inkubation unter Standardzellkulturbedingungen bei 37°C für 5 Tage. Am Ende der Inkubation wurde ein ⁵¹Cr-Freisetzungstest durchgeführt, indem ⁵¹Cr-markierte EO771-Zellen oder ⁵¹Cr-markierte LM-Zellen als "Ziele" der Reaktion verwendet wurden. Das Verhältnis der Milzzellen zu Zielzellen betrug 100:1.

^b

	infiltrierende Zellen
	CD4	CD8	CD11b	NK
injiziert mit SB-1- und LM-IL-2K^b/SB-1-Zellen	1,1 ± 0,9	9,9 ± 3,4	6,5 ± 3,0	0,4 ± 0,5
injiziert mit SB-1-Zellen allein	2,0 ± 1,6	0,9 ± 1,4	8,0 ± 2,0	< 0,1 ± 0,1

Legende: C3H/HeJ-Mäuse wurde in das Fettpolster der Brust mit einer Mischung aus 1 × 10⁶ SB-1-Zellen und 2 × 10⁶-LM-IL-2K^b/SB-1-Zellen in einem Gesamtvolumen von 200 μl injiziert. Zur gleichen Zeit erhielten die Mäuse eine Injektion i. p. aus 2 × 10⁶ LM-IL-2K⁶/SB-1-Zellen in 200 μl, gefolgt von zwei anschließenden Injektionen in wöchentlichen Intervallen, bestehend aus 2 × 10⁶ LM-IL-2K^b/SB-1-Zellen i. p. und 2 × 10⁶ LM-IL-2K^b/SB-1-Zellen in das Fettpolster der gleichen Brust, in die zuerst injiziert wurde. Als Kontrollen wurden andere naive C3H/He-Mäuse nach dem gleichen Protokoll mit gleichen Anzahlen nur aus SB-1-Zellen in die Brust ohne anschließende Injektion injiziert. Eine Woche nach der letzten Injektion wurden histologische Schnitte für die immunhistochemische Färbung mit CD4, CD8, CD11b oder NK mAbs hergestellt. Die Daten stellen eine Untersuchung der Zellzahlen in fünf hoch aufgelösten Gesichtsfeldern pro jeweils acht Objektträgern durch drei unabhängige Beobachter dar.
P < 0,001 für Unterschiede in der Anzahl der CD8+ Zellen in Tumoren der Mäuse, denen SB-1-Zellen und LM-IL-2K^b/SB-1-Zellen und Mäusen, denen SB-1-Zellen alleine injiziert wurden.
P für die Unterschiede in den Anzahlen der CD4+, CD11b oder NK-Zellen in Tumoren der Mäuse, denen SB-1-Zellen und LM-IL-2K^b/SB-1-Zellen und Mäusen, denen nur SB-1-Zellen injiziert wurden, nicht signifikant.

Claims

Antigen präsentierende semi-allogene immunogene Zelle, die mindestens eine Klasse I MHC- oder Klasse II MHC-Determinante exprimiert, die syngen mit dem Empfänger ist, und mindestens eine Klasse I oder Klasse II MHC-Determinante, die allogen mit dem Empfänger ist, und wobei die Antigen präsentierende Zelle mit DNA, die für mindestens ein Antigen codiert, welches durch T-Zellen erkannt wird, transformiert ist und exprimiert, und wobei diese semi-allogene Zelle nicht ein Hybridzelle ist, die resistent gegenüber einem dominant selektierbaren Marker ist.
Semi-allogene immunogene Zelle nach Anspruch 1, welche mit DNA transformiert ist und diese exprimiert, die für mindestens ein Antigen codiert, das durch T-Zellen erkannt wird, wobei diese DNA aus einer Neoplasie oder einem Tumor des Empfängers isoliert ist.
Semi-allogene immunogene Zelle nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 2, wobei diese Antigen präsentierende Zelle ferner mit einer codierenden Sequenz für mindestens ein Cytokin transformiert ist und diese exprimiert.
Semi-allogene immunogene Zelle nach Anspruch 3, wobei das Cytokin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Interleukin-1, Interleukin-2, Interleukin-3, Interleukin-4, Interleukin-5, Interleukin-6, Interleukin-7, Interleukin-8, Interleukin-9, Interleukin-10, Interleukin-11, Interleukin-12, Interferon-α, Interferon-γ, Tumornekrosefaktor, Granulozyten-Makrophagen-Kolonien stimulierendem Faktor und Granulozyten-Kolonien stimulierendem Faktor.
Semi-allogene immunogene Zelle nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Antigen präsentierende Zelle aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Fibroblasten, einem Makrophagen, einer B-Zelle und einer dendritischen Zelle besteht.
Semi-allogene immunogene Zelle nach Anspruch 2 bis 5, wobei die Neoplasie aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Melanom, Lymphom, Plasmozytom, Sarkom, Gliom, Thymom, Leukämie, Brustkrebs, Prostatakrebs, Darmkrebs, Ösophaguskrebs, Hirnkrebs, Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Gebährmutterkrebs und Hepatom besteht.
Semi-allogene immunogene Zelle nach Anspruch 2, wobei die DNA, die aus einer Neoplasie oder einem Tumor isoliert ist, codierende Sequenzen für Tumor assoziierte Antigene umfaßt.
Semi-allogene immunogene Zelle nach Anspruch 2, wobei die DNA, die aus neoplastischen Zellen isoliert ist, codierende Sequenzen für Tumor assoziierte Antigene umfaßt, die mit einem Tumor assoziiert sind, wobei dieser Tumor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Melanom, Lymphom, Plasmozytom, Sarkom, Gliom, Thymom, Leukämie, Brustkrebs, Prostatakrebs, Darmkrebs, Ösophaguskrebs, Hirnkrebs, Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Gebährmutterkrebs und Hepatom.
Therapeutische Zusammensetzung umfassend eine semi-allogene immunogene Zelle nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8 vermischt mit einem therapeutisch annehmbaren Träger.
Verwendung einer semi-allogenen immunogenen Zelle gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines Medikaments zur Induzierung einer immunologischen Reaktion in einem Tier, das einer derartigen Reaktion bedarf.
Verwendung einer semi-allogenen immunogenen Zelle gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung oder Behandlung eines Tumors in einem Tier, das dessen bedarf.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei der Tumor ein fester Tumor oder hämatologischer Tumor ist.