DE69833160T2

DE69833160T2 - Amplifizierung und Detektion von HIV-1 und/oder HIV-2

Info

Publication number: DE69833160T2
Application number: DE69833160T
Authority: DE
Inventors: John Wesley San Diego Backus; Susan Melissa Rochester Atwood; Ann Elizabeth Rochester Casey; Eric Brice Madison Rasmussen; Thomas Joseph Penfield Cummins
Original assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1997-06-25
Filing date: 1998-06-24
Publication date: 2006-09-14
Anticipated expiration: 2018-06-25
Also published as: DE69833160D1; ES2256920T3; JP4339427B2; EP0887427B1; SI0887427T1; EP0887427A2; ATE315667T1; JPH1169987A; EP0887427A3; DK0887427T3; US6001558A

Description

1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren und Test-Kits für die Amplifikation und Detektion von humanem Immundefizienzvirus (HIV).
Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf PCR-Verfahren, welche multiple Primer-Sets verwenden, um alle Subtypen von HIV-1, einschließlich der Gruppe M und Gruppe O-Isolate, und alle Subtypen von HIV-2 zu amplifizieren.
2. Hintergrundinformation
In unserem Verständnis über das erworbene Immundefizienz-Syndrom (AIDS) und sein verursachendes Mittel, das humane Immundefizienzvirus (HIV), wurden Fortschritte gemacht. Zwei Gruppen von humanen Immundefizienzviren, HIV-1 und HIV-2, wurden identifiziert. HIV-1 und HIV-2 sind genetisch verwandt und sind aber trotzdem verschieden. Sowohl HIV-1 als auch HIV-2 zeigen erhebliche genetische Variabilität unter ihren verschiedenen Isolaten. Tatsächlich wurden 10 Subtypen von HIV-1 (Gruppe M, umfassend Subtypen A bis I, und Gruppe O, umfassend Subtyp O) identifiziert. Während die Konsensus-Sequenzen für HIV-1 und HIV-2 aus veröffentlichten Nukleotid-Sequenzen von verschiedenen HIV-1 und HIV-2-Isolaten generiert wurden, ist es unmöglich, substantielle Regionen mit absoluter Sequenz-Konservierung zwischen allen Isolaten von HIV-1 oder allen Isolaten von HIV-2 zu finden. Zusätzlich zu der genetischen Variabilität, die unter den HIV-Isolaten gefunden wurde, sind viele Nukleotid-Regionen des HIV so hoch zwischen HIV und nicht-verwandten Viren konserviert, wie sie innerhalb der HIV-1 und HIV-2-Familien sind. Zusammen genommen machen es diese Fakten extrem schwierig, Polymerase-Kettenreaktion (PCR) -Primer und Sonden zu entwerfen, welche alle Gruppe M- und Gruppe 0-Subtypen von HIV-1 und alle HIV-2-Subtypen effizient detektieren werden, ohne nicht-verwandte Viren falsch zu detektieren.
EP 0 727 497 führt zum Beispiel eine Multiplex-PCR-Methode mit Primern ein, welche exklusiv die Amplifikation der pol-Nukleinsäure von allen bekannten HIV-1-Subtypen ermöglichen. Aus diesem besagten Stand der Technik sind aber keine Primer-Kombinationen ableitbar, welche sowohl HIV-1 als auch HIV-2-Nukleinsäuren in einer Reaktion amplifizie ren. EP 0 630 973 führt eine Multiplex-PCR-Methode für einige Stämme von HIV-1 und HIV-2 ein, wobei die verwendeten Primer von verschiedenen genomischen Orten abgeleitet sind.
Eine der Herausforderungen, die denjenigen begegnet, die versuchen Amplifikations-Systeme zu entwickeln, welche alle bekannten HIV-1 und HIV-2-Subtypen detektieren, ist die Entwicklung von Oligonukleotid-Primer-Sets, welche adäquat arbeiten, wenn sie zusammen unter einem einzelnen Set von Amplifikations-Bedingungen verwendet werden (z.B. Salz-Bedingungen, Temperaturen und Amplifikations-Zeiten). Die Identifizierung von Primern und Detektions-Sonden, die in Bezug auf Primer-Primer- und Primer-Sonden-Interaktionen kompatibel sind, ist eine noch größere Herausforderung. Daher werden im Falle der Amplifikation und der Detektion von HIV-1 und/oder HIV-2 nach wie vor Schritte benötigt, welche die Wahrscheinlichkeit der Detektion von hoch divergenten Subtypen oder Isolaten unter weniger als idealen Bedingungen maximieren.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung überwindet die oben aufgeführten Probleme und stellt ein benötigtes Mittel zur Amplifikation und Detektion von hoch divergenten HIV-1 und/oder HIV-2-Isolaten zur Verfügung. Daher ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren und Test-Kits für die Detektion aller bekannten HIV-1-Subtypen und/oder HIV-2-Subtypen zur Verfügung zu stellen.
Verschiedene andere Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der detaillierten Beschreibung der Erfindung offensichtlich werden.
In einer Ausführungsform bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Amplifikation von HIV-1-Nukleinsäuren. Das Verfahren umfaßt das in Kontakt Bringen einer Probe, von der angenommen wird, daß sie HIV-1-Nukleinsäuren enthält, mit vier verschiedenen Nukleosid-Triphosphaten, einer thermostabilen DNA-Polymerase und mnindestens vier Oligonukleotiden bei Bedingungen, unter denen HIV-1-Zielnukleinsäure amplifiziert wird. Die vier Oligonukleotide werden ausgewählt aus den Sets:

(a) SEQ ID NOS.: 1, 3, 7 und 8;
(b) SEQ ID NOS.: 1, 4, 7 und 8;
(c) SEQ ID NOS.: 2, 3, 7 und 8 und
(d) SEQ ID NOS.: 2, 4, 7 und 8.

In einer anderen Ausführungsform bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Amplifikation von HIV-2, welches umfaßt: in Kontakt Bringen einer Probe mit vier verschiedenen Nukleosid-Triphosphaten, einer thermostabilen DNA-Polymerase und mindestens vier Oligonukleotiden bei Bedingungen, unter denen HIV-2-Zielnukleinsäure amplifiziert wird. Die vier Oligonukleotide werden ausgewählt aus den Sets:

(a) SEQ ID NOS.: 11, 12, 14 und 16;
(b) SEQ ID NOS.: 11, 12, 15 und 16;
(c) SEQ ID NOS.: 11, 12, 18 und 20;
(d) SEQ ID NOS.: 11, 12, 19 und 20;
(e) SEQ ID NOS.: 14, 16, 18 und 20;
(f) SEQ ID NOS.: 14, 16, 19 und 20;
(g) SEQ ID NOS.: 15, 16, 18 und 20 und
(h) SEQ ID NOS.: 15, 16, 19 und 20.

In einer weiteren Ausführungsform bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Co-Amplifikation von HIV-1 und HIV-2-Zielnukleinsäure. Eine Probe, von der angenommen wird, daß sie irgendeine HIV-Nukleinsäure enthält, wird mit vier verschiedenen Nukleosid-Triphosphaten, einer thermostabilen DNA-Polymerase, mindestens einem Primer-Paar, das ausgewählt ist aus SEQ ID NOS.: 1, 2, 3, 4, 7 und 8, und mindestens einem Primer-Paar, das ausgewählt ist aus SEQ ID NOS.: 11, 12, 14, 15, 16, 18, 19 und 20, bei Bedingungen in Kontakt gebracht, unter welchen die HIV-1- und die HIV-2- Zielnukleinsäuren amplifiziert werden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Entwicklung eines Co-Amplifikations-Systems für HIV-1 und HIV-2, welches alle Subtypen von HIV-1 und HIV-2 sensitiv und spezifisch detektieren kann, ist eine extreme Herausforderung aus verschiedenen Gründen: (1) die Diversität auf der Ebene der Nukleinsäure-Sequenz zwischen individuellen Isolaten, (2) das Erfordernis, Primer-Primer-Interaktionen zwischen mindestens acht bis zehn Primern zu minimieren, während die Nebenprodukt-Bildung die Assay-Sensitivität und auch möglicherweise die Spezifität reduzieren wird, (3) das Erfordernis, die amplifizierten Produkte spezifisch zu detektieren, was idealerweise mittels Oligonukleotid-Hybridisierung mit einer Sonde durchgeführt werden sollte, welche intern („internal") zu den Amplifikations-Primern ist, und (4) das Erfordernis sowohl die Anwesenheit von Inhibitoren in präparierten Patienten-Spezimen als auch die ineffiziente Gewinnung von Zielnukleinsäure aus der Probenpräparation zu kontrollieren. Die Anmelder haben diese Hindernisse überwunden und sind zu der vorliegenden Erfindung gelangt, in Bezug auf die Amplifikation und/oder Detektion von HIV-1 und HIV-2-Nukleinsäuren.
In der vorliegenden Erfindung wurden Primer-Sets für HIV-1 und HIV-2 entwickelt, welche miteinander kompatibel sind und daher kombiniert werden können, um einen komplexen Co-Amplifikations-Assay zu bilden, welcher alle sequenzierten Isolate von HIV-1 und HIV-2 detektieren kann. Mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung sind die Fachleute in der Lage, sensitiv und spezifisch sowohl HIV-1 als auch HIV-2-Zielnukleinsäuren mit einem hohen Niveau des Vertrauens zu amplifizieren und zu detektieren. Diese Amplifikation und diese Detektion können auf eine Multiplex-Weise und bei Anwesenheit einer internen positiven Kontrolle (IPC) durchgeführt werden, welche falsch negative Ergebnisse aufgrund von Problemen bei der Proben-Präparation, der Amplifikation und/oder der Detektion signalisiert.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Amplifikation von HIV-1 und/oder HIV-2-Nukleinsäuren. Oligonukleotid-Primer-Sets wurden identifiziert, welche, wenn sie in verschiedenen Kombinationen verwendet werden, sensitiv und spezifisch Zielnukleinsäuren von allen bekannten Isolaten von HIV-1 und/oder HIV-2 amplifizieren. Um HIV-1-Zielnukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung zu amplifizieren, werden Primer-Sets aus den folgenden Oligonukleotiden ausgewählt:
HIV-1
LTR Region-Primer:
POL Region-Primer:

TCGGGTTTATTACAGGGACAGCAGAGA (SEQ ID NO. 7)
CTTGTATTACTACTGCCCCTTCACCTTTCCA (SEQ ID NO. 8)

In den Verfahren der vorliegenden Erfindung wird HIV-1-Zielnukleinsäure amplifiziert durch in Kontakt Bringen einer biologischen Probe, von der angenommen wird, daß sie HIV-Nukleinsäuren enthält, mit einem Primer-Set, welches mindestens vier Oligonukleotide umfaßt. Primer-Sets, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen ein, sind aber nicht limitiert auf

Die vier Oligonukleotide dieser Primer-Sets können allein oder in Kombination mit anderen HIV-1 oder HIV-2-Primern verwendet werden. Zum Beispiel könnte Oligonukleotid SEQ ID NO. 2 in Zusammenhang mit den Primer-Sets (a) oder (b) oben verwendet werden. Bevorzugte Primer-Sets sind:

(a) SEQ ID NOS.: 1, 2, 3, 7 und 8;
(b) SEQ ID NOS.: 1, 2, 4, 7 und 8;
(c) SEQ ID NOS.: 2, 3, 4, 7 und 8;
(d) SEQ ID NOS.: 1, 3, 4, 7 und 8 und
(e) SEQ ID NOS.: 1, 2, 3, 4, 7 und 8.

Weiter bevorzugt wird das Primer-Set, welches Oligonukleotide enthält, welche mit den SEQ ID NOS.: 2, 3, 4, 7 und 8 korrespondieren. Jedes dieser Primer-Sets kann verwendet werden, um Nukleinsäure von allen bekannten HIV-Subtypen, einschließlich Gruppe M und Gruppe O, zu amplifizieren.
Zusätzlich zu dem Primer-Set (den Primer-Sets) kann die biologische Probe auch mit PCR-Reagenzien, wie z.B. vier verschiedenen Nukleosid-Triphosphaten und einer thermostabilen DNA-Polymerase bei Bedingungen in Kontakt gebracht werden, unter denen jede HIV-1-Nukleinsäure, die in der Probe anwesend ist, amplifiziert wird.
Um HIV-2-Zielnukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung zu amplifizieren, werden Primer-Sets aus den folgenden Oligonukleotiden ausgewählt:
HIV-2
ENV Region-Primer:

CCGGGATAGTGCAGCAACAGCAACA (SEQ ID NO. 11)
CCCAGACGGTCAGTCGCAACA (SEQ ID NO. 12)

LTR Region-Primer:

GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA (SEQ ID NO. 14)
GAGCCCTGGGAGGTTCTCTCCA (SEQ ID NO. 15)
GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA (SEQ ID NO. 16)

POL Region-Primer:

TAGACACAGGGGCTGACGACTCAATAGT (SEQ ID NO. 18)
CACAGGGGCTGACGACTCAATAGTAGCA (SEQ ID NO. 19)
GCCAAAAATGTTGATTGGGGTATCTCCTGTCATTA (SEQ ID NO. 20)

In den Verfahren der vorliegenden Erfindung wird HIV-2-Zielnukleinsäure amplifiziert durch in Kontakt Bringen einer biologischen Probe, von der angenommen wird, daß sie HIV-2-Nukleinsäure enthält, mit einem Primer-Set, welches mindestens vier Olignonukleotide umfaßt. Primer-Sets, welche zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen ein, sind aber nicht limitiert auf

(a) SEQ ID NOS.: 11, 12, 14 und 16;
(b) SEQ ID NOS.: 11, 12, 15, und 16;
(c) SEQ ID NOS.: 11, 12, 18 und 20;
(d) SEQ ID NOS.: 11, 12, 19 und 20;
(e) SEQ ID NOS.: 14, 16, 18 und 20;
(f) SEQ ID NOS.: 14, 16, 19 und 20;
(g) SEQ ID NOS.: 15, 16, 18 und 20;
(h) SEQ ID NOS.: 15, 16, 19 und 20.

Bevorzugt wird das Primer-Set, welches Oligonukleotide enthält, die mit den SEQ ID NOS.: 11, 12, 14 und 16 korrespondieren. Jedes dieser Primer-Sets kann verwendet werden, um die Nukleinsäure von allen bekannten HIV-2-Subtypen zu amplifizieren.
Zusätzlich zu dem Primer-Set (den Primer-Sets) kann die biologische Probe auch mit PCR-Reagenzien, wie z.B. vier verschiedenen Nukleosid-Triposphaten und thermostabiler DNA-Polymerase bei Bedingungen in Kontakt gebracht werden, unter denen jede HIV-2-Zielnukleinsäure, die in der Probe vorhanden ist, amplifiziert wird.
Um sowohl HIV-1 als auch HIV-2 zu amplifizieren, wird eine biologische Probe mit einem HIV-1-Primer-Set der vorliegenden Erfindung zusammen mit einem HIV-2-Primer-Set der vorliegenden Erfindung in Kontakt gebracht. Bevorzugterweise wird die biologische Probe mit Oligonukleotiden in Kontakt gebracht, die mit den SEQ ID NOS.: 2, 3, 4, 7, 8, 11, 12, 14 und 16 korrespondieren. Die Verwendung eines solchen Sets von Primern kann die Ziel nukleinsäure von allen bekannten HIV-1 und/oder HIV-2-Subtypen, die in der Probe anwesend sind, amplifizieren.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung verwenden in einigen Fällen mehr als zwei Primer, um die Zielnukleinsäure-Sequenzen zu amplifizieren, welche eine übliche Sonden-Region überlappen, wie z.B. ein Primer-Set, einschließlich SEQ ID NOS.: 2, 3 und 4. Dies maximiert die Stamm-Sensitivität und die Robustheit des Amplifikations-Systems. Dieses neue Merkmal erhöht die Stamm-Sensitivität des Assay-Systems und erlaubt die Kombination von Primern, welche separate Vorteile aufweisen, wie z.B. höhere Amplifikations-Effizienz und höhere Sequenzhomologie unter Isolaten, was in der Tat die Sensitivität und die Robustheit des Amplifikationssystems erhöht.
Wenn das HIV-1 und/oder HIV-2-Ziel unter der Verwendung des Primer-Sets (der Primer-Sets) der vorliegenden Erfindung amplifiziert ist, kann die Anwesenheit oder die Abwesenheit des amplifizierten HIV-Ziels unter der Verwendung bekannter Detektionsverfahren detektiert werden. Zum Beispiel kann die amplifizierte Zielnukleinsäure unter der Verwendung einer oder mehrerer Oligonukleotid-Sonden detektiert werden, die für die amplifizierte HIV-1 oder HIV-2-Zielnukleinsäure spezifisch sind. Die Fachleute können leicht Oligonukleotid-Sonden identifizieren, welche geeignet sein würden, um die amplifizierte HIV-1 und/oder HIV-2-Zielnukleinsäure in Abhängigkeit von den verwendeten Primer-Sets zu detektieren. Oligonukleotid-Sonden, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen ein, sind aber nicht limitiert auf, die folgenden Oligonukleotide:
HIV-1
LTR Region-Sonden:

CAACAGACGGGCACACACTACT (SEQ ID NO. 5)
GAACAGATGGGCACACAGTGCT (SEQ ID NO. 6)

POL Region-Sonden:

AGCTTTGCTGGTCCTTTCCAAAGTGGG (SEQ ID NO. 9)
AGTTGTGCCGGTCCTTTCCAAATTGGG (SEQ ID NO. 10)

HIV-2
POL Region-Sonden:

CCAAAAATAGTAGGGGGAATAGGGGGATTC (SEQ ID NO. 21)
CACCCCAAAAATAGTAGGTGGGATAGGAGGG (SEQ ID NO. 22)

Bevorzugterweise werden die amplifizierten HIV-1 und HIV-2-Ziele unter der Verwendung von Sonden, die mit den SEQ ID NOS.: 5, 6, 9 und 10 korrespondieren, mit irgendeiner der folgenden Kombinationen: SEQ ID NOS.: 21 und 22 detektiert.
Die vorliegende Erfindung verwendet multiple überlappende Sonden, um alle bekannten Isolate zu detektieren, wenn in Regionen untersucht („probing") wird, welche einen niedrigen Grad an Sequenz-Konservierung relativ zu den Primer-Regionen aufweisen. Dies erlaubt, daß Amplifikations-Primer in Regionen entwickelt werden, welche nicht von einer hoch konservierten und hoch spezifischen Sonden-Region separiert sind, was typischerweise für eine Sequenz-spezifische Detektion des Amplifikationsproduktes erforderlich ist. In einigen Situation, z.B. mit HIV-1, sind multiple Sonden erforderlich, um alle bekannten Isolate mit hoher Sensitivität zu detektieren.
Die generellen Prinzipien und Bedingungen für die Amplifikation und die Detektion von Nukleinsäuren unter der Verwendung von PCR sind sehr gut bekannt, wobei die Details davon in zahlreichen Referenzen zur Verfügung gestellt werden, einschließlich U.S. Patent Nrn. 4,683,195 (Mullis et al.), 4,683,202 (Mullis, et al.) und 4,965,188 (Mullis, et al.), welche alle hiermit durch Referenz eingefügt werden. Daher sollte angesichts der Lehren im Stand der Technik und der spezifischen hierin zur Verfügung gestellten Lehren ein Fachmann auf dem Gebiet keine Schwierigkeiten beim Gebrauch der vorliegenden Erfindung haben, um alle bekannten Subtypen von HIV-1 und HIV-2 zu detektieren.
Der Begriff „biologische Probe" schließt ein, ist aber nicht limitiert auf, zelluläres oder virales Material, Haar, Körperflüssigkeiten oder zelluläres Material, enthaltend Nukleinsäuren, welche detektiert werden können.
Der Begriff „Oligonukleotide" bezieht sich auf ein Molekül, welches eines oder mehrere Deoxyribonukleotide oder Ribonukleotide umfaßt, wie z.B. Primer, Sonden und Nukleinsäure-Fragmente, die detektiert werden sollen.
Der Begriff „Primer" bezieht sich auf ein Oligonukleotid, welches entweder natürlich vorkommt oder synthetisch hergestellt wird und welches in der Lage ist, als ein Ausgangspunkt der Synthese zu agieren, wenn es unter Bedingungen gebracht wird, unter welchen die Synthese eines Primer-Extensions-Produktes komplementär zu einem Nukleinsäure-Strang (das ist die Matrize) induziert wird, wobei solche Bedingungen die Anwesenheit von anderen PCR-Reagenzien und geeignete Temperatur und pH-Wert einschließen.
Der Primer ist bevorzugterweise einzelsträngig für maximale Effizienz bei der Amplifikation, kann aber eine Doppelstrang-Region enthalten, wenn gewünscht. Er muß lang genug sein, um die Synthese von Extensions-Produkten bei der Anwesenheit der DNA-Polymerase zu „primen". Die genaue Größe jedes Primers wird in Abhängigkeit der Verwendung, die in Erwägung gezogen ist, der Konzentration und der Sequenz des Primers, der Komplexität der abgezielten Sequenz, der Reaktionstemperatur und der Quelle des Primers variieren. Im allgemeinen werden die Primer, die in dieser Erfindung verwendet werden, von 12 bis 60 Nukleotide aufweisen und bevorzugterweise werden sie von 16 bis 40 Nukleotide aufweisen. Weiter bevorzugt weist jeder Primer von 18 bis 35 Nukleotide auf.
Primer, die hierin nützlich sind, können unter der Verwendung bekannter Techniken und Ausrüstung präpariert werden, einschließlich zum Beispiel eines ABI DNA-Synthesizers (erhältlich von Applied Biosystems) oder eines Biosearch 8600 Series oder 8800 Series Synthesizers (erhältlich von Milligen-Biosearch, Inc.). Verfahren zur Verwendung dieser Ausrüstung sind bekannt und z.B. in U.S. Patent Nr. 4,965,188 (Gelfand, et al.), die hierin durch Referenz eingefügt wird, beschrieben. Natürlich vorkommende Primer, die aus biologischen Quellen isoliert werden, können auch nützlich sein (z.B. Restriktions-Endonuklease-Verdaue). Ein Set von mindestens zwei Primern wird im allgemeinen für jede Zielnukleinsäure verwendet. Daher kann eine Vielzahl von Sets an Primern simultan verwendet werden, um eine Vielzahl von Zielnukleinsäuren zu amplifizieren.
Wie hierin verwendet, ist eine „Sonde" ein Oligonukleotid, welches substantiell komplementär zu einer Nukleinsäure-Sequenz der Zielnukleinsäure ist und welche für die Detektion oder den Einfang der amplifizierten Zielnukleinsäure verwendet wird.
In der vorliegenden Erfindung werden Sequenz-spezifische Primer und Sonden zur Verfügung gestellt. Es wird für die Fachleute offensichtlich sein, daß zusätzliche Sequenzspezifische Primer und Sonden z.B. durch die Addition von Nukleotiden entweder an den 5' oder 3'-Enden präpariert werden können, wobei die Nukleotide komplementär oder nichtkomplementär zu der Zielsequenz sind. Solche Zusammensetzungen sind im Umfang dieser Erfindung.
Die Primer und/oder die Sonden, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können optional markiert werden. Unter der Verwendung bekannter Verfahren des Standes der Technik können die Primer und/oder Sonden mit einem spezifischen Bindungs-Liganden (z.B. Biotin), einem Enzym (z.B. Glucoseoxidase, Peroxidasen, Urikase und alkalische Phosphatase), Radioisotopen, Elektronen-dichten Reagenzien, Chromogenen, Fluorogenen, phosphoreszierenden Resten oder Ferritin markiert werden. Bevorzugterweise ist die Markierung ein spezifischer Bindungs-Ligand. Weiter bevorzugt ist die Markierung Biotin oder ein Derivat davon, Streptavidin oder ein Derivat davon oder ein Hapten.
Ein „PCR-Reagenz" bezieht sich auf irgendeines der Reagenzien, die als essentiell für die PCR angesehen werden, nämlich ein Set an Primern für jede Zielnukleinsäure, eine DNA-Polymerase, einen DNA-Poylmerase-Cofaktor und ein oder mehrere Deoxyribonucleosid-5'-triphosphate (dNTP's). Andere optionale Reagenzien und Materialien, die in der PCR verwendet werden, sind unten beschrieben. Diese Reagenzien können individuell, als ein Teil eines Test-Kits oder in Reagenz-Kammern von Test-Vorrichtungen zur Verfügung gestellt werden.
Eine DNA-Polymerase ist ein Enzym, welche Deoxynucleosid-Monophosphat-Moleküle an das 3'-Hydroxyl-Ende des Primers in einem Komplex von Primer und Matrize addieren wird, aber diese Addition findet in einer Matrizen-abhängigen Weise statt. Im allgemeinen schreitet die Synthese der Extensions-Produkte in der 5' zu 3'-Richtung des neu synthetisierten Stranges fort, bis die Synthese terminiert wird. Nützliche DNA-Polymerasen schließen z.B. E. coli DNA-Polymerase I, T4 DNA-Polymerase, Klenow-Polymerase, reverse Transkriptase und andere, die im Stand der Technik bekannt sind, ein. Bevorzugterweise ist die DNA-Polymerase thermostabil, was bedeutet, daß sie gegenüber Hitze stabil ist und bevorzugt bei höheren Temperaturen aktiv ist, insbesondere den hohen Temperaturen, die für spezifisches „Priming" und die Extension von DNA-Strängen verwendet werden. Weiter bevorzugt sind thermostabile DNA-Polymerasen nicht substantiell inaktiv bei den hohen Temperaturen, die bei den Polymerase-Kettenreaktionen verwendet werden, wie hierin beschrieben. Solche Temperaturen werden in Abhängigkeit von einer Reihe von Reaktionsbedingungen variieren, einschließlich pH-Wert, Nukleotid-Zusammensetzung, Länge der Primer, Salzkonzentration und anderen Bedingungen, die im Stand der Technik bekannt sind.
Eine Zahl von thermostabilen DNA-Polymerasen sind im Stand der Technik berichtet worden, einschließlich denjenigen, die im Detail im U.S. Patent Nrn. 4,965,188 (Gelfand et al.) und 4,889,818 (Gelfand et al.), welche beide hierin durch Referenz eingefügt werden, aufgeführt sind. Insbesondere nützliche Polymerasen sind diejenigen, die von zahlreichen bakteriellen Thermus-Spezies erhalten werden, wie z.B. Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermus filiformis und Thermus flavus. Andere nützliche thermostabile Polymerasen werden von zahlreichen mikrobiellen Quellen erhalten, einschließlich Thermococcus literalis, Pyrococcus furiosus, Thermotoga sp. und denjenigen, die in WO-A-89/06691 (veröffentlicht am 27. Juli 1989) beschrieben werden. Einige nützliche thermostabile Polymerasen sind kommerziell erhältlich, wie z.B. AmpliTaq^®, Tth und UlTma^® von Perkin Elmer, Pfu von Stratagene und Vent und Deep-Vent von New England Biolabs. Eine Reihe von Techniken sind auch für die Isolierung natürlich kommender Polymerasen aus Organismen und für die Produktion gentechnisch manipulierter Enzyme unter der Verwendung rekombinanter Techniken bekannt.
Ein DNA-Polymerase-Cofaktor bezieht sich auf eine Nicht-Protein-Verbindung, von welcher das Enzym in Bezug auf seine Aktivität abhängig ist. Daher ist das Enzym ohne die Anwesenheit des Cofaktors katalytisch inaktiv. Eine Reihe von Materialien sind bekannte Cofaktoren, einschließlich, aber nicht limitiert auf, Mangan- und Magnesium-Salze, wie z.B. Chloride, Sulfate, Acetate und Salze von Fettsäuren. Magnesium-Chloride und Sulfate werden bevorzugt.
Für die PCR werden außerdem zwei oder mehrere Deoxyribonukleosid-5'-triphosphate benötigt, wie z.B. zwei oder mehrere dATP, dCTP, dGTP, dTTP und dUTP. Analoga, wie z.B. dITP und 7-Deaza-dGTP, sind ebenso nützlich. Bevorzugterweise werden die vier üblichen Triphosphate (dATP, dCTP, dGTP und dTTP) zusammen verwendet.
Die PCR-Reagenzien, die hierin beschrieben werden, werden in der PCR in geeigneten Konzentrationen zur Verfügung gestellt und verwendet, um die Amplifikation der Zielnukleinsäure zur Verfügung zu stellen. Die minimalen Mengen an Primern, DNA-Polymerase, Cofaktoren und Deoxyribonucleosid-5'-triphosphaten, welche für die Amplifikation benötigt werden, und geeignete Bereiche von jedem sind im Stand der Technik bekannt. Die minimale Menge der DNA-Polymerase ist im allgemeinen mindestens ungefähr 0,5 Einheiten/100 μl Lösung, wobei von ungefähr 2 bis ungefähr 25 Einheiten/100 μl Lösung bevorzugt werden und wovon von ungefähr 7 bis ungefähr 20 Einheiten/100 μl Lösung weiter bevorzugt werden. Andere Mengen sind nützlich für gegebene Amplifikations-Systeme. Eine „Einheit" ist hierin definiert als die Menge an Enzym-Aktivität, die benötigt wird, um 10 nmol der Gesamt-Nukleotide (dNTP's) in eine erweiternde Nukleinsäure-Kette in 30 Minuten bei 74°C einzufügen. Die minimale Menge jedes Primers, der bei der Amplifikation verwendet wird, ist mindestens ungefähr 0,075 μM, wobei von ungefähr 0,1 bis ungefähr 2 μM bevorzugt werden, aber andere Mengen sind im Stand der Technik bekannt. Der Cofaktor ist im allgemeinen in einer Menge von ungefähr 2 bis ungefähr 15 mM anwesend. Die Menge jedes dNTP ist im allgemeinen von ungefähr 0,25 bis ungefähr 3,5 mM.
Die PCR-Reagenzien können individuell oder in zahlreichen Kombinationen oder alle in einer gepufferten Lösung, die einen pH-Wert im Bereich von ungefähr pH 7 bis ungefährpH 9 aufweist, unter der Verwendung irgendeines geeigneten Puffers, wovon viele im Stand der Technik bekannt sind, bereit gestellt werden.
Andere Reagenzien, die in der PCR verwendet werden können, schließen z.B. Antikörper, die spezifisch für die thermostabile DNA-Polymerase sind, ein. Antikörper können verwendet werden, um die Polymerase vor der Amplifikation zu inhibieren. Antikörper, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, sind spezifisch für die thermostabile DNA-Polymerase, inhibieren die enzymatische Aktivität der DNA-Polymerase bei Temperaturen unterhalb von ungefähr 50°C und werden bei höheren Temperaturen deaktiviert. Nützliche Antikörper schließen monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper und Antikörper-Fragmente ein. Bevorzugterweise ist der Antikörper monoklonal. Die Antikörper, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können unter der Verwendung von Methoden präpariert werden, wie z.B. denjenigen, die in Harlow et al. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1988), beschrieben werden.
Repräsentative monoklonale Antikörper werden in U.S. Patent Nr. 5,338,671 (Scalice et al.), dessen Inhalte hierin durch Referenz eingefügt werden, beschrieben. Zwei solcher monoklonaler Antikörper werden leicht durch einen Fachmann unter der Verwendung konventioneller Prozeduren und Ausgangsmaterialien erhalten, einschließlich entweder aus Hybridoma-Zellinien HB 11126 oder 11127, hinterlegt bei der American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD). Der monoklonale Antikörper ist in einer Menge von ungefähr 5:1 bis ungefähr 500:1 molares Verhältnis zu der DNA-Polymerase anwesend.
Die amplifizierten Nukleinsäuren können auf eine Reihe von bekannten Wegen detektiert werden, wie z.B. denjenigen, die in U.S. Patent Nr. 4,965,188 (Gelfand et al.) beschrieben werden. Zum Beispiel können die amplifizierten Nukleinsäuren unter der Verwendung von Southern Blotting, Dot Blot-Techniken oder nicht-isotopischer Oligonukleotid-Einfang-Detektion mit einer markierten Sonde detektiert werden. Alternativ dazu kam die Amplifikation unter der Verwendung von Primern durchgeführt werden, welche auf geeignete Weise markiert sind, und die amplifizierten Primer-Extensions-Produkte können unter der Verwendung von Verfahren und Ausrüstung für die Detektion der Markierung detektiert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die amplifizierte Zielnukleinsäure unter der Verwendung einer Oligonukleotid-Sonde detektiert, welche für die Detektion markiert ist und direkt oder indirekt mit dem amplifizierten Ziel hybridisiert werden kann. Die Sonde kann löslich sein oder an einen festen Träger angehängt sein. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist einer oder mehrere der Primer, die für die Amplifikation der Zielnukleinsäure verwendet wird/werden, markiert, z.B. mit einem spezifischen Bindungs-Rest. Das resultierende Primer-Extensions-Produkt, in welches der markierte Primer eingefügt wurde, kann mit einer Sonde eingefangen werden. Die Detektion des amplifizierten Zieles, das an die Sonde hybridisiert ist, kann durch die Detektion der Anwesenheit der markierten Sonde oder des markierten amplifizierten Zieles erreicht werden, und zwar unter der Verwendung geeig neter Detektions-Ausrüstung und Verfahren, welche im Stand der Technik bekannt sind. Bestimmte Markierungen können ohne die Verwendung von Detektions-Ausrüstung mit dem Auge sichtbar sein.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform ist einer oder mehrere der Primer, die für die Amplifikation der Zielnukleinsäure verwendet wird/werden, mit Biotin markiert und die biotinylierten amplifizierten Zielnukleinsäuren werden mit Sonden hybridisiert, die an einen festen Träger angehängt sind. Die gebundenen Ziele werden dann detektiert, indem sie mit einem Streptavidin-Peroxidase-Konjugat bei Anwesenheit eines Oxidationsmittels, wie z.B. Wasserstoffperoxid, und einer geeigneten Farbstoff-Bildungs-Zusammensetzung in Kontakt gebracht werden. Zum Beispiel schließen geeignete Farbstoff-bereitstellende Reagenzien Tetramethylbenzidin und Derivate davon und Leuco-Farbstoffe, wie z.B. Triarylimidazol-Leuco-Farbstoffe, wie beschrieben in U.S. Patent Nr. 4,089,747 (Bruschi), ein.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „ungefähr", wenn er in Bezug auf die Zeit verwendet wird, auf +/– 10% dieses Zeitlimits. Wenn der Begriff „ungefähr" in Bezug auf Temperaturen verwendet wird, bezieht er sich auf +/– 5°C.
Die folgenden Beispiele werden zur Illustration bestimmter Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellt und sollen nicht als Einschränkung der Erfindung verstanden werden.
Beispiele
Materialien und Methoden:
Rekombinante DNA-Polymerase von Thermus aquaticus wurde unter der Verwendung bekannter Prozeduren präpariert, wie z.B. der in EP-A-0 482 714 beschriebenen, und hatte eine Aktivität von ungefähr 250.000 Einheiten/mg Protein.
Die Primer und Sonden, die in den folgenden Beispielen verwendet werden, wurden präpariert unter der Verwendung bekannter Ausgangsmaterialien und Prozeduren unter der Verwendung eines Applied Biosystems Model 380B, 3-Säulen-DNA-Synthesizers unter der Verwendung von Standard-Phosphoramidit-Chemie und dem ABI 1 μM Maßstab, schnell-Zyklus-Protokoll („ABI 1 μmolar scale, fast cycle protocol"). Nukleosid-3-Phosphoramidite und Nukleosid-derivatisierte, kontrollierte Poren-Glas-Träger wurden von Applied Biosystems erhalten. Die Primer hatten die oben identifizierten Sequenzen. Sie wurden am 5'-Ende mit zwei Aminotetraethylenglycol-Abstandsgruppen funktionalisiert, gemäß U.S. Patent 4,962,029, gefolgt von einem einzelnen kommerziell erhältlichen DuPont Biotin- Phosphoramidit. Die Sonden wurden am 3'-Ende mit zwei Tetraethylenglycol-Abstandsgruppen funktionalisiert, gefolgt von einer einzelnen Aminodiol-Verbindungsgruppe, gemäß U.S. Patent Nr. 4,914,210. Alle Reinigungen wurden unter der Verwendung einer Nukleinsäure-Reinigungssäule durchgeführt. Deoxyribonucleotide (dNTP's) wurden von Sigma Chemical Co. erhalten.
In einigen Experimenten wurden Phosphorthioat-Primer verwendet. Phosphorothioat-Primer, welche Phosphorothioat-Verbindungen in den letzten und vorletzten Positionen relativ zu der 3'-Hydroxylgruppe aufweisen, wurden durch H-Phosphat-Chemie gemäß der Methode nach U.S. Patent Nr. 5,003,087 präpariert, ebenso beschrieben im technischen Bulletin, welches Katalog Nr. 40-4036-xx, Glen Research, Sterling, Virginia, beilag.
Eine Streptavidin-Peroxidase-Konjugat-Lösung wurde verwendet, welche ein kommerziell erhältliches (Sigma Chemical Co.) Konjugat aus Streptavidin und Meerrettich-Peroxidase, Casein (0,5%) und Merthiolat (0,5%) in einer Phosphat-gepufferten Saline-Lösung (24 mM Natriumphosphat und 75 mM Natriumchlorid) umfaßt. 10 mM 4'-Hydroxyacetanilid wurde als ein Konjugat-Stabilisator addiert.
Das interne positive Kontroll (IPC)-Ziel wurde wie folgt präpariert. Die IPC-Sequenz wurde als ein einzelsträngiges synthetisches Target durch Phosphoramidit-Oligonukleotid-Synthese generiert. Es wurde dann mit Oligonukleotid-Primern, die 5'-Restriktionsstellen enthalten, amplifiziert und direktional in den pBluescript II KS(–) Plasmid-Vektor kloniert. Kulturen im großen Maßstab von Plasmid-enthaltendem E. coli wurden unter Ampicillin-Selektion gewachsen, wie zuvor beschrieben (Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Harbour Press 1989). Plasmid-DNA wurde nachfolgend an Qiagen-Säulen unter der Verwendung der geeigneten Reagenzien des Lieferanten und unter Befolgung des Verfahrens des Lieferanten gereinigt. Das resultierende gereinigte Plasmid wurde in TE-Puffer (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0) resuspendiert und die Konzentration wurde spektrophotometrisch bestimmt (Sambrook et al., 1989). Das Plasmid wurde nachfolgend mit dem Restriktionsenzym ScaI verdaut, um das Plasmid zu linearisieren, während eine intakte Zielsequenz aufrecht erhalten wird. Serielle Verdünnungen von allen Zielen wurden in TE-Puffer mit 10 mg/ml Ultraschall-behandelter Kalb-Thymus-DNA (Sigma) durchgeführt.
Die Leuco-Farbstoff-Dispersion enthielt Agarose (0,5%), 4,5-bis-(4-Dimethylaminophenyl)-2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-imidazol-Leucofarbstoff (250 μM), Diethylentriaminpentaessigsäure (100 μM), 3'-Chlor-4'-hydroxyacetanilid (5 mM), Polyvenylpyrrolidon (112 mM) und Natriumphosphat, monobasisch, 1-Hydrat (10 mM) und Wasserstoffperoxyd (H₂O₂) (8,82 mM).
Die Wasch-Lösung (pH 7,4) enthielt Natriumchlorid (373 mM), (Ethylendinitri-lo)tetraessigsäure-Dinatriumsalz (2,5 mM), Decylnatriumsulfat (38 mM) und Ethylcerithiosalicylsäure, Natriumsalz (25 μM) in Natriumphosphat, monobasisch 1-Hydrat-Puffer (25 mM).
Die Polymerase-Kettenreaktions-Mischung (75 μl) enthielt Tris(Hydroxymethyl)aminomethan-Puffer (10–18 mM, pH 8), EDTA (0–0,75 mM), Kaliumchlorid (50 mM), Magnesiumchlorid (4 mM), dATP, dCTP, dGTP und dTTP (jeweils 0,3 mM), die angegebenen Primer (jeweils 0,4 μM, wenn nicht anderweitig angegeben), Typ IV Gelatine (100 mg/ml), Taq-Polymerase (16 Einheiten/100 μl) und Glycerol (9,5%). Ein 50-facher molarer Überschuß (über die Polymerase) von TP1-12.2 und ein fünffacher Überschuß von TP4-9.2 wurden verwendet.
Um Einfang-Reagenzien zu bilden, wurden die Sonden kovalent an polymerische Partikel (1 μm durchschnittlicher Durchmesser) angehängt, präpariert unter der Verwendung konventioneller Emulsions-Polymerisations-Techniken, aus Poly[styrol-co-3-(p-vinylbenzylthio)propionsäure] (95:5 bis 98:2 Gewichts-Verhältnis, 1 μm durchschnittlicher Durchmesser). Eine Suspension der Partikel in Wasser wurde mit 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure-Puffer (0,1 M, pH 6) gewaschen und suspendiert auf ungefähr 10% Feststoffe. Eine Probe (3,3 ml) der gewaschenen Partikel, verdünnt auf 3,33% Feststoffe in dem Puffer (0,1 M) wurde gemischt mit 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (2,1 ml von 84 mg/ml Wasser) und der Sonde (983 μl von 44,44 OD/ml nanoreines Wasser). Die resultierende Suspension wurde auf 50°C in einem Wasserbad für ungefähr 2 Stunden mit intermitterendem Mischen erhitzt und zentrifugiert. Die Partikel wurden dann dreimal mit Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Puffer (0,01 M, pH 8), enthaltend (Ethylendinitrilo)tetraessigsäuredinatriumsalz (0,0001 M) gewaschen und darin auf 4% Feststoffe resuspendiert.
Nach der Verdünnung auf 0,25% Feststoffe mit Puffer wurden die Einfang-Reagenzien (1–2 μl) auf definierte Regionen der mikroporösen Membran (LOPRODYNE^TM Polamid-Membran, 1,2 μm durchschnittliche Porengröße von Pall Corp.) in den Test-Wells von SURECELL^TM wegwerfbaren Test-Vorrichtungen (erhältlich von Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc.), welche im Detail in U.S.-A-4948,561 (Hinckley et al.) beschrieben werden, aufgetragen und getrocknet.
Andere Reagenzien und Materialien wurden entweder von kommerziellen Quellen erhalten oder unter der Verwendung von leicht erhältlichen Ausgangsmaterialien und üblichen Prozeduren präpariert.
Experimente:
Primer-Selektion:
Die Anmelder begannen die Entwicklung ihres PCR-Amplifikations-Systems für HIV-1 und HIV-2 durch die Identifikation hoch konservierter Sequenz-Regionen von HIV-1. Primer wurden für konservierte Regionen entwickelt, unter der Verwendung der folgenden Kriterien: (1) Produkt-Längen konnten nicht 200 Nukleotide überschreiten, weil kleinere Produkte mit höherer Effizienz amplifizieren und weniger sensitiv gegenüber Reduktionen der effektiven Polymerase-Konzentration, Anlagerungs-/Extensions-Zeit oder durchschnittlicher Größe von präpariertem Probenmaterial sind, (2) Primer-Sets müssen eine funktionelle Sonden-Region zwischen sich aufweisen für die spezifische Detektion des amplifizierten Produktes, (3) Fehlanpassungen („miss matches") nahe des 3'-Endes des Primers würden weit weniger bevorzugt werden als Fehlanpassungen nahe des 5'-Endes und (4) die Primer müßten etablierte Kriterien für Primer-Entwicklung in Bezug auf die 3'-End-Stabilität, die Länge, den GC-Gehalt und Interaktionen mit anderen potentiellen Primern und Sonden bestehen müssen.
Am Anfang wurden die folgenden 11 Primer für die Testung selektiert:
Viele dieser Primer sind identisch zu einem oder zwei der anderen Primer, außer für die Sequenzen am 5'-Ende des Primers, am 3'-Ende des Primers oder an beiden. SEQ ID NOS. 1 und 23 repräsentieren eine Vorwärts-Primer-Region der LTR-Region des HIV-1-Genoms, während SEQ ID NOS. 24 und 2 eine andere LTR-Vorwärts-Primer-Region repräsentieren. SEQ ID NOS. 25, 3 und 26 repräsentieren eine LTR-Rückwärts-Primer-Region, während SEQ ID NO. 4 eine zweite Region repräsentiert. SEQ ID NO. 7 war der alleinige Vorwärts-Primer, welcher für die POL-Region des HIV-Genoms entwickelt wurde, während SEQ ID NOS. 27 und 8 die Rückwärts-Primer sind, welche in der Lage sein sollten, SEQ ID NO. 7 zu komplementieren.
Diese Primer wurden getestet durch Amplifikation von entweder 0 oder 15 Kopien von HIV-1-Ziel pro 75 ml Reaktion mittels PCR für 40 Zyklen an dem PE9600 Thermocycler, gefolgt durch Detektion mittels Gel-Elektrophorese. HIV-1-Ziel-DNA wurde wie folgt präpariert, 8E5-Zellen (Folks T.M., et al. J. Exp. Med. 164:280, 1986), welche eine einzelne Kopie eines Polymerase-defizienten HIV-Genoms enthalten, welche in das Wirts-Chromosom eingefügt ist, wurden in 90% RPMI-Medium mit 10% fötalem bovinem Serum propagiert. DNA wurde aus 2,5 × 10⁹ Zellen/l Liter Kultur mittels typischem SDS, Proteinase-K-Verdau gefolgt von Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanol-Präzipitation präpariert. Der resultierende Extrakt wurde über Cesiumchlorid in Banden aufgelöst, dialysiert, extrahiert, mit Ethanol präzipitiert und in 10 mM Tris/l mM EDTA (pH 8,0) resuspendiert für die Analyse. Der DNA-Gehalt wurde durch die Messung der optischen Dichte bei A₂₆₀ berechnet. Alle Reaktionen wurden, wie oben beschrieben, ausgeführt, außer das 3 mg Kalb-Thymus-DNA pro 75 μl Reaktion addiert wurden. Zweifache Reaktionen würden für jede der 16 möglichen LTR-Kombinationen und der zwei möglichen POL-Kombinationen durchgeführt. Die Gel-Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Die Kontroll-Reaktionen, die kein HIV-1-Ziel enthielten, demonstrierten eine sichtbare Nebenprodukt-Bande für die Kombination SEQ ID NOS. 23/4 mit einer Anlagerungs-/Extensions-Temperatur von 68°C, was diese Kombination zu einem weniger bevorzugten Primer-Set macht. Abgesehen von diesem Nebenprodukt wurden im wesentlichen keine sichtbaren Nebenprodukte bei einer der Anlagerungs-/Extensions-Temperaturen beobachtet.
Die ausgewählten Primer wurden weiterhin in Bezug auf die Intensität der Gel-Bande bei beiden Anlagerungs-/Extensions-Temperaturen verglichen. Es gab geringe Unterschiede in der Intensität der Gel-Bande zwischen den Kombinationen, die SEQ ID NOS. 1 oder 23 enthalten, SEQ ID NOS. 24 und 2 arbeiteten äquivalent zueinander, wenn sie mit verschiedenen Rückwärts-Primern kombiniert wurden. Von den drei überlappenden Rückwärts-Primern übertrafen SEQ ID NOS. 3 und 26 SEQ ID NO. 25, insbesondere bei den Anlagerungs/Extensions-Temperaturen von 70°C. Alle die Kombinationen, welche SEQ ID NO. 4 einschlossen, amplifizierten gut bei beiden Anlagerungs-/Extensions-Temperaturen. SEQ ID NO. 27 arbeitete sehr schwach im Vergleich zu SEQ ID NO. 8 (beide in Kombination mit SEQ ID NO. 1); daher wurden keine weiteren Testungen mit SEQ ID NO. 27 durchgeführt. Tabelle 1 – Screening von potentiellen HIV-1-Primer-Sets

Intensität der Gelbande: ++ > + > W+ > W > W- > (–)

Das nächste Experiment war eine Co-Amplifikations-Reaktion des Primer-Sets SEQ ID NOS. 7/8 individuell mit allen möglichen LTR-Primer-Sets. Diese Co-Amplifikation wurde bei Anwesenheit einer internen positiven Kontrolle (IPC) durchgeführt. Die Amplifikation wurde durchgeführt unter der Verwendung eines Johnson & Johnson Clinical Diagnostics' PCR-Analysators, eines automatisierten PCR-Prozessors, beschrieben in U.S. Patent Nr. 5,089,233. Das HIV-Ziel wurde während 40 Zyklen unter der Verwendung von drei verschiedenen thermalen Profilen amplifiziert:

(1) 95°C Denaturierung für 15 Sekunden und 68°C Anlagerung/Extension für 30 Sekunden;
(2) 95°C Denaturierung für 15 Sekunden und 66°C Anlagerung/Extension für 30 Sekunden und
(3) 96°C Denaturierung für 5 Sekunden und 68°C Anlagerung/Extension für 40 Sekunden.

Das amplifizierte Produkt wurde detektiert, wie oben beschrieben.
Das Profil 1 wurde als die Bedingung des Standes der Technik angesehen, das zweite Profil wurde verwendet, um zu bestimmen; welche Primer-Kombinationen anfällig für die Bildung von Nebenprodukt waren und das dritte Profil war ein Versuch, die Amplifikation robuster zu machen (durch Erhöhen der Anlagerungs-/Extensionszeit) ohne Erhöhung der gesamten Zyklus-Zeit. Alle Reaktionen wurden mit 10 Kopien von jeweils HIV- und IPC-Zielen pro 75 μl Reaktion durchgeführt.
Die Amplifikation war robuster mit dem dritten Amplifikations-Profil, insbesondere mit Primer-Sets, welche längere (> 150 Nukleotide) Produkte generieren. Die Resultate demonstrieren auch, daß SEQ ID NOS. 23, 24 und 4 alle eine Neigung haben, Nebenprodukte zu bilden. Daher wurden SEQ ID NOS. 23 und 24 fallen gelassen. Weitere Experimente wurden mit SEQ ID NOS. 1, 2 und 3 durchgeführt.
Als nächstes wurde die absolute Sensitivität von zwei HIV-1-Co-Amplifikations-Systemen (SEQ ID NOS. 1/3 oder 2/3 co-amplifiziert mit SEQ ID NOS. 7/8) getestet. Die Reaktionen wurden für 40 oder 45 Zyklen (96°C 5 Sekunden; 68°C 40 Sekunden entweder plus oder minus dem IPC-Ziel und Primern.) durchgeführt. Die Level des HIV-Ziels von 10; 5; 2,5; 1; 0,5 und 0 wurden zweifach für alle getesteten Bedingungen durchgeführt.
Während das System, welches SEQ ID NOS. 2/3 enthielt, weniger Nebenprodukte während der Amplifikation (insbesondere bei 45 Zyklen) bildete, erschienen beide Systeme in der Lage, konsistent so wenig wie 2,5 Kopien des HIV-1-Targets zu detektieren. Bei Anwesenheit von IPC amplifizierten die SEQ ID NOS. 1/3 Co-Amplifikationssysteme eines oder beide der HIV-Produkte in zwei von vier Replikaten bei einer Kopie und eines von vier Replikaten bei 0,5 Kopien. Unter den selben Bedingungen amplifizierten die SEQ ID NOS. 2/3 Co-Amplifikations-Systeme eines oder beide der HIV-Produkte in drei von vier Replikaten bei einer Kopie und vier von vier Replikaten bei 0,5 Kopien. Alle Kontroll-Reaktionen, die keine Zielsequenzen enthielten und in diesem Experiment durchgeführt wurden, waren visuell negativ.
HIV-2-Primer wurden für die Testing selektiert, in dem denselben Kriterien, die für HIV-1 aufgeführt wurden, gefolgt wurde. Ein zusätzliches Kriterium, welches bei der Entwicklung der HIV-2-Primer beachtet wurde, war die Minimierung von potentiellen Interaktionen mit Kandidaten-Primern für sowohl HIV-1 als auch HIV-2. Das anfängliche Set von HIV-2-Primern, die getestet wurden, ist unten aufgelistet:
Um HIV-2-DNA herzustellen, wurden 10E8-Zellen, die mit HIV-2 Stamm-Hut78 NIH-Z infiziert waren, mit SDS und Proteinase K behandelt, gefolgt von Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanol-Präzipitation, das resultierende Extrakt wurde in 10 mM Tris/l mM EDTA pH 8,0 resuspendiert, für die Analyse.
Individuelle HIV-2-Primer wurden auf die Fähigkeit, Nebenprodukte mit HIV-1-Primern SEQ ID NOS. 1, 2, 3, 26, 4, 7 und 8 durchsucht, bei zwei separaten Amplifikations-Profilen:

(1) 40 Zyklen mit einer Anlagerungs-/Extensions-Temperatur von 68°C und
(2) 5 Zyklen mit einer Anlagerungs-/Extensions-Temperatur von 62°C, gefolgt von 35 Zyklen mit einer Anlagerungs-/Extensions-Temperatur von 68°C.

Das zweite Profil wurde für die Testung ausgewählt um zu bestimmen, welche Primer-Sets die Bildung von Nebenprodukten unter Bedingungen minimieren könnten, welche die Effekte von Ziel-Fehlanpassungen minimieren. Jeder Primer, welcher starke Nebenprodukte mit SEQ ID NOS. 7 und 8 unter der Verwendung von Bedingung 1 bildete, wurde sofort verworfen, weil diese Primer für den Co-Amplifikations-Assay minimal erforderlich sind. Die einzigen zwei Primer, welche aufgrund dieses Kriteriums verworfen wurden, waren SEQ ID NOS. 30 und 31. Der Rest der Primer wurde basierend auf einer Vielfalt von Kriterien eingegrenzt. SEQ ID NOS. 20 wurde über SEQ ID NO. 34 aufgrund eines viel geringeren Levels an Nebenprodukten ausgewählt, welche durch SEQ ID NO. 20 mit HIV-Primern gebildet werden. SEQ ID NOS. 11 und 12 wurden über SEQ ID NOS. 28 und 29 ausgewählt, weil die ersteren weniger Nebenprodukte produzierten und außerdem die etablierten Kriterien besser erfüllten. SEQ ID NOS. 32 und 33 wurden aufgrund relativ schwacher Amplifikation mit entweder SEQ ID NOS. 20 oder 34 unter Amplifikations-Bedingung 2 fallen gelassen. Die verbleibenden HIV-2-Primer-Sets (SEQ ID NOS. 11/12, 14/16, 15/16, 18/20 und 19/20) am plifizierten alle extrem gut und ergaben sehr sichtbare Gelbanden bei 10 Kopien des HIV-2-Targets pro Reaktion in einem System, welches die folgenden Primer enthält: SEQ ID NOS. 2, 3, 7 und 8 (jeweils 0,4 μm), IPC-F1 (0,2 μm) und IPC-R1 (0,2 μm). Es gab sehr wenig Bildung von Nebenprodukt bei allen diesen Amplifikations-Systemen, wenn Amplifikations-Bedingung 1 von oben verwendet wurde. Es gab signifikante Bildung an Nebenprodukt, wenn Amplifikations-Bedingung 2 verwendet wird, aber die spezifischen Produkte sind immer noch sehr sichtbar auf einem Gel.
Sondenselektion:
Beim Umgang mit hoch divergenten Genomen, wie z.B. HIV-1 und HIV-2, ist es oftmals schwierig, drei Regionen zu identifizieren, die konserviert genug sind, um die Amplifikation jeder Region mit zwei Primern und die Detektion jeder Region mit einer einzelnen Oligonukleotid-Sonde zu erlauben. In Systemen, in welchen die Produkt-Länge minimiert werden muß, ist dieses Problem bis zu einem Punkt erschwert, der die Aufgabe unmöglich macht, wenn nicht die Stringenz der Sondierung („probing") bis zu einem Punkt reduziert wird, bei welchem die Spezifität der Sonde beeinträchtigt werden kann. Um dieses Problem zu vermeiden, haben die Anmelder ein System entwickelt, in welchem multiple Sonden verwendet werden, um die Detektion aller bekannten Sequenz-Varianten ohne Beeinträchtigung der Assay-Spezifität zu erlauben.
Um das Produkt, das von SEQ ID NOS. 2 und 3 gebildet wird, zu sondieren, muß eine Sonde in eine Region, die nur 34 Nukleotide lang ist, passen. Die am meisten konservierte Sequenz in dieser Region ist die Sequenz der Sonde SEQ ID NO. 5.

Sonde: CAACAGACGGGCACACACTACT (SEQ ID NO. 5)

Diese Sequenz ist bei der Mehrheit der HIV-1-Isolate hoch konserviert, mit einer oder weniger Nukleotid-Differenz zwischen der Sonde und dieser Region der Sequenz in den Isolaten; jedoch gibt es mehrere divergente Sequenzen, welche zwei bis fünf Mutationen in dieser Region aufweisen. Um die Fähigkeit zu maximieren, Sequenzen in der Zukunft zu detektieren, welche weiter von diesen Sequenzen divergiert sind, wurde eine zusätzliche Sonde entwickelt, SEQ ID NO. 6.

Sonde: GAACAGATGGGCACACACTGCT (SEQ ID NO. 6)

Im Fall von HIV-1-POL wurden beide Sonden, die verwendet wurden, modifiziert, um die höchste Zahl und Schwierigkeit ("severity") der begegneten Mutationen zu minimieren und um die Stärke der Bindungen, die sich bilden, zu maximieren. Indem dies durchgeführt wurde, sind beide entwickelten Sonden nicht identisch zu irgendeiner der bekannten Isolat-Sequenzen. Durch die Verwendung von zwei Sonden wurde die maximale Anzahl von angetroffenen Mutationen mit irgendeinem der bekannten Isolate von fünf auf drei reduziert. Zusätzlich sind die meisten der verbleibenden Mutationen nahe eines der Enden der Sonde positioniert, wobei ihr Effekt auf die Hybridisierung reduziert wird. Die Sequenzen der HIV-1-POL-Sonden sind unten gezeigt:

Die oben genannte beschriebene Situation ist ähnlich für die Sequenzen, die in dem HIV-2-POL-System selektiert werden, in welchem zwei Sonden verwendet wurden. Jedoch ist diese Situation etwas verschieden, weil die Regionen, die zu den zwei Sonden komplementär sind, überlappen, aber nicht identisch in der Position sind. Das ist so aufgrund des Faktes, daß die Sequenz divergent genug ist zwischen den zwei Subtypen von HIV-2, so daß man die Position der Sonde modifizieren muß, um die benötigte thermische Stabilität jeder Sonde zu erreichen. Mit diesen zwei Sonden haben alle bekannten HIV-2-Sequenzen nicht mehr als 2 Nukleotide Differenz relativ zu deren Subtyp-spezifischer HIV-2-Sonde. Die zwei HIV-2-POL-Sonden-Sequenzen sind unten gezeigt.

Das Co-Amplifikations-System, das oben beschrieben wurde, wurde für HIV-1 und HIV-2-Proben getestet. Die verwendeten Detektions-Sonden für die colorimetrische Detektion waren wie folgt:
HIV-1 LTR-Produkte:

CAACAGACGGGCACACACTACT (SEQ ID NO. 5)
GAACAGATGGGCACACACTGCT (SEQ ID NO. 6)

HIV-1 POL-Produkte:

5'-AGCTTTGCTGGTCCTTTCCAAAGTGGG (SEQ ID NO. 9)
5'-AGTTGTGCCGGTCCTTTCCAAATTGGG (SEQ ID NO. 10)

HIV-2 POL-Produkte:

sCCAAAAATAGTAGGGGGAATAGGGGGATTC (SEQ ID NO. 21)
CACCCCAAAAATAGTAGGTGGGATAGGAGGG (SEQ ID NO. 22)

HIV-2 LTR-Produkte:

CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC (SEQ ID NO. 17)

HIV-2 ENV-Produkte:

TGGACGTGGTCAAGAGACAACAAGAA (SEQ ID NO. 13)

Fünf Kultur-ampflifizierte HIV-1-Isolate wurden getestet, einschließlich prototypische Gruppe M und Gruppe O-Isolate. Alle Co-Amplifikations-Systeme, die getestet wurden, schlossen das Primer-Set SEQ ID NOS. 7/8 und ein internes positive Kontrolle-Primer-Set sowie eines von vier HIV-1 LTR-Primer-Sets ein: SEQ ID NOS. 1/3, 1/4, 2/3 und 2/4. Alle HIV-1-spezifischen Primer-Sets detektierten alle getesteten Isolate. Serielle Verdünnung der Ziel-DNAs demonstrierten, daß die Primer-Sets SEQ ID NOS. 2/3 und 2/4 die am meisten sensitiven LTR-Primer-Sets waren. Das Primer-Set SEQ ID NO. 2/4 erschien am meisten sensitiv für die hoch divergenten Gruppe O-Isolate.
Zwei verschiedene Kultur-amplifizierte HIV-2-Isolate wurden ebenso getestet, um die Leistung der verschiedenen HIV-2-Primer-Sets zu untersuchen. Alle Reaktionen schlossen die Primer-Sets SEQ ID NOS. 11/12 und IPC-F1/R1 und eines der vier LTR- oder POL-spezifischen HIV-2-Primer-Sets ein: SEQ ID NOS. 18/20, 19/20, 14/16 und 15/16. Alle Primer-Sets führten zur Amplifikation von beiden Zielen bei den höheren getesteten Zielniveaus. HIV-2-Zielverdünnung schlug vor, daß die LTR-Primer-Sets die am meisten sensitiven sind.
Die Stamm-Sensitivität von verschiedenen Co-Amplifikations-Systemen wurde weiter durch die Testung von 15 Kultur-amplifizierten HIV-1-Gruppe O-Isolaten, 17 gefrorenen Patienten-Zell-Pellets von HIV-1-infizierten afrikanischen Patienten (welche ein höheres Niveau an Sequenz-Heterogenität enthalten sollten) und 12 Kultur-amplifizierten HIV-2-Isolaten untersucht. Alle 15 Gruppe O-Isolate wurden detektiert mit dem Primer-Set SEQ ID NO. 7/8 und durch die LTR-Primer-Sets SEQ ID NOS. 1/4, 2/3 und 2/4, jedoch wurden drei der Isolate durch das Primer-Set SEQ ID NO. 1/3 vergaßt. In dem Fall des LTR-Systems waren mehrere der Gruppe O-Isolate mit nur einer der zwei LTR-Sonden positiv, und zwar mit der Sonde, welche am meisten homolog zu den Isolaten von Gruppe O und U und zu dem Schimpan sen-Virus HIV-1-CP2gab ist. Diese Resultate demonstrieren die Verbesserung, die durch die Verwendung von zwei Detektions-Sonden für ein einzelnes Ziel beobachtet wird. Im Fall der oben beschriebenen Zell-Pellets afrikanischer Patienten testeten alle drei HIV-1-Systeme (SEQ ID NOS. 2/3, 2/4 und 7/8) positiv; jedoch erschien das System SEQ ID NO. 2/3 das am meisten sensitive System in diesem Experiment, während das Set SEQ ID NO. 7/8 als das am wenigsten sensitive erschien, welches nur eins von zwei Replikaten bei dem höchsten Niveau von getesteter Ziel-DNA detektierte.
Eines der 12 Kultur-amplifizierten HIV-2-Isolate testete für alle getesteten Primer-Sets negativ. Diese Probe war auch negativ mit dem Kontroll-Primer-Set, welches im Labor verwendet wird, was vorschlägt, daß keine HIV-2-DNA in der Probe anwesend gewesen sein könnte (es ist bekannt, daß sich einige HIV-2-Isolate nicht gut kultivieren lassen). Die anderen 11 Isolate waren mit dem ENV-Primer-Set und beiden LTR-Primer-Sets positiv. Im Gegensatz dazu versäumten die Sets SEQ ID NOS. 18/20 und 19/20 zwei von elf und eines von elf Isolaten.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren aus dem humanen Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1), umfassend in Kontakt bringen einer Probe, von der angenommen wird, daß sie HIV-1-Nukleinsäure enthält, mit vier verschiedenen Nukleosidtriphosphaten, einer thermostabilen DNA-Polymerase und mindestens vier Oligonukleotiden bei Bedingungen, unter denen die HIV-1-Nukleinsäure amplifiziert wird, wobei vier Oligonukleotide der mindestens vier Oligonukleotide ausgewählt sind aus den Sets: (a) SEQ ID NOS.: 1, 3, 7 und 8; (b) SEQ ID NOS.: 1, 4, 7 und 8; (c) SEQ ID NOS.: 2, 3, 7 und 8 und (d) SEQ ID NOS.: 2, 4, 7 und 8.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei fünf Oligonukleotide der mindestens vier Olinukleotide ausgewählt sind aus den Sets: (a) SEQ ID NOS.: 1, 2, 3, 7 und 8; (b) SEQ ID NOS.: 1, 2, 4, 7 und 8; (c) SEQ ID NOS.: 2, 3, 4, 7 und 8; (d) SEQ ID NOS.: 1, 3, 4, 7 und 8 und (e) SEQ ID NOS.: 1, 2, 3, 4, 7 und 8;
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die fünf Oligonukleotide SEQ ID NOS.: 2, 3, 4, 7 und 8 sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei sechs Oligonukleotide der mindestens vier Oligonukleotide SEQ ID NOS.: 1, 2, 3, 4, 7 und 8 sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die thermostabile DNA-Polymerase ausgewählt ist aus den Sets: Thermus aquaticus Polymerase, Thermus thermophilus Polymerase und Thermococcus litoralis Polymerase.
Verfahren zur Ampflizierung und Nachweis von HIV-1-Nukleinsäure, umfassend: (i) In Kontakt bringen einer Probe, von der angenommen wird, daß sie HIV-1-Nukleinsäure enthält, mit vier verschiedenen Nukleosidtriphosphaten, einer thermostabilen DNA-Polymerase und mindestens vier Oligonukleotiden, bei Bedingungen, unter denen die HIV-1-Nukleinsäure amplifiziert wird, wobei vier Oligonukleotide der mindestens vier Oligonukleotide ausgewählt sind aus den Sets: (a) SEQ ID NOS.: 1, 3, 7 und 8; (b) SEQ ID NOS.: 1, 4, 7 und 8; (c) SEQ ID NOS.: 2, 3, 7 und 8 und (d) SEQ ID NOS.: 2, 4, 7 und 8. (ii) Denaturieren der amplifizierten HIV-1-Nukleinsäure, um Einzelstrang-Nukleinsäuren zu bilden und (iii) Nachweisen der Anwesenheit der amplifizierten HIV-1-Nukleinsäure.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Nachweis unter der Verwendung von mindestens 2 Oligonukleotid-Sonden, die ausgewählt sind aus den Sets: (a) SEQ ID NOS.: 5 und 9; (b) SEQ ID NOS.: 5 und 10; (c) SEQ ID NOS.: 6 und 9 und (d) SEQ ID NOS.: 6 und 10, erreicht wird.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Detektion unter der Verwendung von vier Oligonukleotid-Sonden, die SEQ ID NOS. 5, 6, 9 und 10 entsprechen, erreicht wird.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Nachweis unter der Verwendung einer Sonde, die markiert oder fähig ist, von einem Enzym markiert zu werden, erreicht wird.
Diagnostischer Kit, der für die Amplifizierung von HIV-1-Nukleinsäure nützlich ist, wobei der Kit umfaßt: (i) Oligonukleotide, die den SEQ ID NOS. 1, 2, 3, 4, 7 und 8 entsprechen, und (ii) eine thermostabile DNA-Polymmerase.
Diagnostischer Kit nach Anspruch 10, der weiterhin Oligonukleotide umfaßt, die den SEQ ID NOS. 5, 6, 9 und 10 entsprechen.
Verfahren zum Amplifizieren von Nukleinsäuren des humanen Immundefizienzvirus Typ 2 (HIV-2), umfassend in Kontakt bringen einer Probe, von der angenommen wird, daß sie HIV-2-Nukleinsäure enthält, mit vier verschiedenen Nukleosidtriphosphaten, einer thermostabilen DNA-Polymerase und mindestens vier Oligonukleotiden, bei Bedingungen, unter denen die HIV-2-Nukleinsäure amplifiziert wird, wobei vier Oligonukleotide der mindestens vier Oligonukleotide ausgewählt sind aus den Sets: (a) SEQ ID NOS.: 11, 12, 14 und 16; (b) SEQ ID NOS.: 11, 12, 15 und 16; (c) SEQ ID NOS.: 11, 12, 18 und 20; (d) SEQ ID NOS.: 11, 12, 19 und 20; (e) SEQ ID NOS.: 14, 16, 18 und 20; (f) SEQ ID NOS.: 14, 16, 19 und 20; (g) SEQ ID NOS.: 15, 16, 18 und 20 und (h) SEQ ID NOS.: 15, 16, 19 und 20.
Zusammensetzung, umfassend eines oder mehrere der folgenden Paare von Oligonukleotiden: (a) SEQ ID NOS.: 5 und 6; (b) SEQ ID NOS.: 9 und 10 und (c) SEQ ID NOS.: 21 und 22.
Verfahren zum Co-Amplifizieren von HIV-1- und HIV-2-Nukleinsäure, umfassend in Kontakt bringen einer Probe, von der angenommen wird, daß sie HIV-1- oder HIV-2-Nukleinsäure enthält, mit vier verschiedenen Nukleosidtriphosphaten, einer thermostabilen DNA-Polymerase, SEQ ID NO. 7 und 8, mindestens einem Primerpaar, das aus SEQ ID NOS. 1, 2, 3 und 4 ausgewählt ist, und mindestens einem Primerpaar, das aus SEQ ID NOS. 11, 12, 14, 15, 16, 18, 19 und 20 ausgewählt ist, bei Bedingungen, unter denen die HIV-1- oder HIV-2-Nukleinsäure amplifiziert wird.