DE69832798T2

DE69832798T2 - Regulatorische sequenzen für die in-vivo-expression einer heterologen dns-sequenz in endothelzellen und ihre verwendungen.

Info

Publication number: DE69832798T2
Application number: DE69832798T
Authority: DE
Inventors: Georg Breier; Werner Risau; Volker RÖNICKE; Andreas Kappel
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1997-06-03
Filing date: 1998-06-03
Publication date: 2006-09-14
Anticipated expiration: 2018-06-04
Also published as: ATE312935T1; WO1998055638A9; EP1007714B1; DE69832798D1; AU8435698A; EP1007714A1; US7011973B1; WO1998055638A1; JP2002511750A; US20050235367A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante DNA-Moleküle, welche die regulatorische(n) Sequenz(en) eines Introns des Gens des Vasculo-endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF)-Rezeptors 2 (Flk 1) oder eines Gens, das zu dem Flk-1-Gen homolog ist, umfassen, die in der Lage sind, einer heterologen DNA-Sequenz in Endothelzellen in vivo die Expression zu verleihen. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Vektoren, die diese rekombinanten DNA-Moleküle umfassen, sowie Wirtszellen, die mit solchen rekombinanten DNA-Molekülen oder Vektoren transformiert sind. Die vorliegende Erfindung betrifft zusätzlich Arzneimittel und diagnostische Zusammensetzungen, die solche rekombinanten DNA-Moleküle, Vektoren oder Zellen enthalten. Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung Zellen und transgene nicht-menschliche Tiere, welche die vorstehend erwähnten rekombinanten DNA-Moleküle oder Vektoren stabil in ihr Genom integriert enthalten, und ihre Verwendung für die Identifizierung von Substanzen, die in der Lage sind, die Transkription eines Gens in Endothelzellen zu unterdrücken oder zu aktivieren. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung der vorstehend beschriebenen rekombinanten DNA-Moleküle und Vektoren zur Herstellung von Arzneimitteln für die Behandlung, Verhinderung und/oder Verzögerung einer Gefäß- oder einer Tumorerkrankung in einem Individuum. Darüber hinaus können die rekombinanten DNA-Moleküle und die Vektoren der Erfindung für die Herstellung von Arzneimitteln zur Induktion einer Gefäß- oder einer Tumorerkrankung in einem nicht-menschlichen Tier verwendet werden.
Auf den Gebieten der Neurowissenschaft und der medizinischen Therapie besteht ein großer Bedarf an Testsystemen zur Untersuchung der Funktion und der Wechselwirkung von Genprodukten, deren Fehlfunktion oder Expression Gefäß- und/oder Tumorerkrankungen verursachen. Solche Systeme wären auch für die Entwicklung von Arzneistoffen gegen solche Krankheiten geeignet. Hervorstechende Beispiele für Genprodukte, die an Gefäßerkrankungen beteiligt sind, sind angiogene Wachstumsfaktoren und ihre Endothel-Rezeptoren, die eine Hauptrolle bei der Bildung des embryonalen Gefäßsystems und bei bestimmten von der Angiogenese abhängigen Krankheiten wie z. B. dem Wachstum von festen Tumoren oder der Retinopathie spielen. Der eine Kinase-Insertion-Domäne enthaltende Rezeptor/fötale Leber-Kinase-1 (KDR/Flk-1), die im Folgenden als Flk-1 und Flt-1 bezeichnet werden, sind hoch affine signalübertragende Rezeptoren für das endotheliale Mitogen, den vasculo-endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) (Connolly, J. Clin. Invest. 84 (1989), 1470–1478; Leung, Science 246 (1989), 1306–1309). Über die Wechselwirkung mit seinen Rezeptoren spielt VEGF eine kritische Rolle bei dem Wachstum und der Erhaltung der vasculären Endothelzellen und bei der Entwicklung von neuen Blutgefäßen bei physiologischen und pathologischen Zuständen (Aiello, New Engl. J. Med. 331 (1994), 1480–1487; Shweiki, Nature 359 (1992), 843–845; Beckman, J. Clin. Invest. 91 (1993), 153–159). Die Muster der embryonalen Expression des VEGF legen nahe, dass er für die Differenzierung von Endothelzellen aus Hämangioblasten und für die Entwicklung von Blutgefäßen in allen Wachstumsstadien entscheidend ist (Jakeman, Endocrinology 133 (1993), 848–859; Breier, Development 114 (1992), 521–532). Unter den vielen, potenziell angiogenen Faktoren ist VEGF der einzige mit Mustern der Expression, der Sekretion und der Aktivität, die eine spezifische angiogene Funktion bei der normalen Entwicklung nahe legen (Klagsbrun, Current Biology 3 (1993), 699–702).
Hoch-affine Rezeptoren für VEGF befinden sich nur auf Endothelzellen und die Bindung von VEGF wurde bei makro- und mikrovasculären Endothelzellen sowie in ruhenden und in sich vermehrenden Endothelzellen aufgezeigt (Jakeman, Endocrinology 133 (1993), 848–859; Jakeman, Clin. Invest. 89 (1992), 244–253). Flk-1 und Flt-1 wurden durch Affinitäts-Kreuzvernetzungs- und Kompetitions-Bindungs-Testansätze als Kandidaten für VEGF-Rezeptoren identifiziert (de Vries, Science 255 (1992), 989–991; Millauer, Cell 72 (1993), 835–846; Terman, Biochem. Biophys. Res. Commun. 187 (1992), 1579–1586). Diese beiden Rezeptor-Tyrosinkinasen enthalten sieben ähnliche extrazelluläre Immunglobulin-Domänen und eine konservierte intrazelluläre Tyrosinkinase-Domäne, die durch eine Kinase-Insertion unterbrochen ist (de Vries, Science 255 (1992) 989–991; Matthews, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 9026–9030; Terman, Oncogene 6 (1991), 1677–1683); sie werden in Endothelzellen in vivo spezifisch exprimiert (Millauer, Cell 72 (1993), 835–846); Peters, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 7533–7537; Yamaguchi, Development 118 (1993), 489–498). Eine in-situ-Hybridisierung mit einer sich entwickelnden Maus zeigte, dass Flk-1 in Endothelzellen in allen Entwicklungsstadien exprimiert wird, sowie in der Blutinsel, in der die Vorläufer der Endothelzellen zuerst erscheinen (Millauer, Cell 72 (1993), 835–846). Flk-1 ist ein Marker für Endothelzellen-Vorläufer in ihren frühesten Entwicklungsstadien (Yamaguchi, Development 118 (1993), 489–498).
Das vasculäre Endothel ist für physiologische Antwortreaktionen entscheidend, einschließlich der Thrombose und der Thrombolyse, des Lymphocyten- und Makrophagen-Homing, der Modulierung der Immunantwort und der Regulierung des vasculären Tonus. Das Endothel ist auch intensiv an der Pathogenese von Gefäßerkrankungen wie z. B. der Atherosklerose beteiligt (Ross, Nature 362 (1993), 801–809). Obwohl eine Reihe von Genen, die im Endothel exprimiert werden, charakterisiert worden sind (Collins, J. Biol. Chem. 266 (1991), 2466–2473; Iademarco, J. Biol. Chem. 267 (1992), 16323–16329; Jahroudi, Mol. Cell. Biol. 14 (1994), 999–1008; Lee, J. Biol. Chem. 265 (1990), 10446–10450), ist die Expression dieser Gene entweder nicht auf das vaskuläre Endothel begrenzt (z. B. die Gene, die den von Willebrand-Faktor, Endothelin-1 und das vaskuläre Zelladhäsions-Molekül-1 codieren), oder sie ist auf spezifische Endothelzellen-Subpopulationen beschränkt (z. B. das Gen für das Endothel-Leukocyten-Adhäsions-Molekül-1). Flk-1 (auch als VEGF-Rezeptor 2 bekannt) wird in Endothelzellen im Verlauf der embryonalen und der postnatalen Entwicklung exprimiert. Der Flk-1-Rezeptor ist der erste Endothel-Rezeptor, der in Endothelzellen-Vorläufern während der embryonalen Gefäßentwicklung exprimiert wird. Gen-Targeting-Experimente mit transgenen Mäusen haben gezeigt, dass dieser Rezeptor für die Differenzierung von Endothelzellen essentiell ist (Shalaby, Nature 376 (1995), 62–66). Des Weiteren wird in einer Vielzahl von Tumoren die Expression des Flk-1-Rezeptors in der Gefäßversorgung des Tumors erneut induziert, und es wurde gezeigt, dass die Signalübertragung über den Flk-1-Rezeptor für die Gefäßneubildung in und das Wachstum von Tumoren erforderlich ist (Millauer, Nature 367 (1994), 576–579).
Vor kurzem haben in vitro-Untersuchungen mit der stromaufwärts gelegenen Region des menschlichen Flk-1-Gens gezeigt (Patterson, J. Biol. Chem. (1995), 23111–23118), dass DNA-Fragmente, die sich in der flankierenden 5'-Region des menschlichen Flk-1-Gens befinden, die Expression eines Reportergens vermitteln.
Für die Untersuchung aller Aspekte von Genen, die an Gefäßerkrankungen wie z. B. an Atherosklerose beteiligt sind, leidet das von Patterson, vorstehend, beschriebene System jedoch unter mehreren Mängeln. Zum Beispiel wurde die Promotoraktivität der flankierenden 5'-Region, die von Patterson verwendet wurde, auch in Zelltypen beobachtet, die das Flk-1-Gen unter natürlichen Bedingungen nicht exprimieren. Des Weiteren wurde nicht gezeigt, dass das von Patterson, vorstehend, verwendete Promotor-Fragment in seinem natürlichen Hintergrund in vivo exprimiert wird. Um eine Endothel-spezifische Genexpression spezifisch zu unterdrücken oder zu verleihen und für die Entwicklung von Endothel-spezifischen Arzneistoffen benötigt man jedoch Testsysteme, die der Regulation der Expression von Flk-1 in vivo sehr ähnlich sind, da anderenfalls nicht-informative oder sogar falsch-positive Ergebnisse erhalten werden könnten.
Daher besteht das technische Problem der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung von Mitteln und Verfahren, die eine Modulierung der Genexpression spezifisch in Endothelzellen in vivo erlauben, vorzugsweise in allen Entwicklungsstadien.
Die Lösung dieses technischen Problems wird durch die Bereitstellung der Ausführungsformen erreicht, die in den Ansprüchen charakterisiert werden.
Demgemäß betrifft die Erfindung ein rekombinantes DNA-Molekül, umfassend:

(a) eine erste regulatorische Sequenz eines Introns des vasculo-endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF)-Rezeptor 2 (Flk-1)-Gens oder eines Introns eines Gens, das zum Flk-1-Gen homolog ist, welches in der Lage ist, die Expression in Endothelzellen in vivo zu verleihen, wobei die Sequenz mindestens 85% Sequenzidentität mit den Nucleotiden 10094 bis 10608 der SEQ ID NO: 1 aufweist; und
(b) eine heterologe DNA-Sequenz, die funktionell damit verknüpft ist.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde eine regulatorische Sequenz identifiziert, die die Expression einer heterologen DNA-Sequenz in im Wesentlichen allen Endothelzellen in vivo antreibt, vorzugsweise in im Wesentlichen allen Entwicklungsstadien. Diese regulatorische Sequenz ist geeignet, um die Expression einer heterologen DNA-Sequenz in den vorstehend erwähnten Zellen zu steuern. Das rekombinante DNA-Molekül der Erfindung erlaubt die Untersuchung der Funktion und der Wechselwirkung von Proteinen, die im Endothel, zum Beispiel des Menschen, exprimiert werden, und die Untersuchung einer Fehlfunktion und/oder einer nicht regulierten Expression, von denen man annimmt, dass sie die oder eine Ursache von Gefäß- und Tumorerkrankungen darstellen. Somit sind die regulatorischen Sequenzen der Erfindung insbesondere geeignet und nützlich für die Erzeugung von transgenen Zellen und von nicht-menschlichen Tieren, die als Testsysteme für die Entwicklung von Arzneistoffen zur Behandlung von Gefäß- und Tumorerkrankungen endothelialen Ursprungs dienen können.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck „eine erste regulatorische Sequenz eines Introns des Flk-1-Gens" eine Nucleotidsequenz des ersten Introns des murinen Flk-1-Gens einschließlich der regulatorischen Sequenzen, die in der Lage sind, einer heterologen DNA-Sequenz in Endothelzellen eine spezifische Expression zu verleihen, vorzugsweise in allen Entwicklungsstadien.
Der hoch affine Rezeptor des vasculo-endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF), Flk-1, ist der erste endotheliale Rezeptor, der in Angioblasten-Vorläufern exprimiert wird, und seine Funktion ist für die Differenzierung des hämangioblastischen Zellstammbaums essentiell. Gemäß der vorliegenden Erfindung wurden cis-aktive regulatorische Elemente des murinen Flk-1-Gens identifiziert, die eine Endothel-spezifische Expression eines Reportergens in transgenen Mäusen vermitteln. Sequenzen innerhalb der flankierenden 5'-Region des Flk1-Gens in Kombination mit Sequenzen, die in dem ersten Intron lokalisiert sind, steuerten spezifisch und reproduzierbar die Expression eines Transgens zu Endothelzellen der embryonalen Gefäßversorgung. Diese Sequenzen waren in der Lage, die Expression der heterologen DNA-Sequenz in Angioblasten im Verlauf der frühen Stadien der Entwicklung der Gefäßversorgung und auch in der Gefäßversorgung postnataler Mäuse zu steuern. Die im ersten Intron lokalisierten regulatorischen Sequenzen funktionierten auch als ein autonomer Endothel-spezifischer Enhancer, wenn sie mit dem heterologen Thymindinkinase-Promotor des Herpessimplex-Virus fusioniert wurden. Dieser Flk-1-Intron-Enhancer enthält mehrere potenzielle Bindestellen für Transkriptionsfaktoren der Ets- und der GATA-Familie. Die Sequenzen des Flk-1-Promotors trugen zu einer starken, vollständigen und reproduzierbaren Endothel-spezifischen Genexpression in dem Embryo bei und sind für eine Expression im Dottersack essentiell.
Um die cis-aktiven regulatorischen Sequenzen, die im Flk-1-Gen enthalten sind, zu charakterisieren, wurden rekombinante Clone des Bakteriophagen Lambda isoliert, die genomische DNA der Maus enthielten (Maus-Stamm 129/Sv) und die eine 21 Kilobasenpaare (kb) große Region des Flk-1-Gens der Maus umfassten, welches in den DNA-Insertionen der λ-Phagen 6 und 16 enthalten war, einschließlich etwa 15 kB flankierende 5'-Sequenzen, Exons 1, 2 und 3 und Introns 1 und 2 (4A). Die DNA-Sequenz einer 12,8 kb großen Region, die sich von der Position –6,65 kB (die Vorzeichen – und + beziehen sich auf die Nucleotidpositionen relativ zu der Transkriptions-Startstelle, wie in 1 gezeigt, die der Nucleotidposition 6661 der SEQ ID NO: 1 entspricht) bis zur Position +6,15 (die sich im dritten Exon befindet) erstreckt, wurde bestimmt (SEQ ID NO: 1). Es wurden Untersuchungen mit Reportergenen durchgeführt, um regulatorische cis-aktive Elemente des Flk-1-Gens zu charakterisieren. Die anfänglichen Untersuchungen konzentrierten sich auf die Rolle der flankierenden 5'-Sequenzen des Flk-1-Gens („Flk-1-Promotor") bei der Vermittlung der Endothel-spezifischen Expression in kultivierten Endothelzellen der Rinder-Aorta (BAE) (Rönicke, Circulation Research 79 (1996), 277–285). Bei diesen Untersuchungen wurde herausgefunden, dass ein Promotorfragment, das sich von –624 bis +299 erstreckte, eine hohe Expression des Luciferase-Reportergens nach einer transienten Transfektion in BAE-Zellen vermittelte. Experimente mit transgenen Mäuseembryonen, die gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, offenbarten jedoch, dass die murinen Promotor-DNA-Fragmente nicht ausreichten, um die Endothel-spezifische Expression des Reportergens in vivo zu vermitteln. Überraschenderweise wurde jedoch eine Endothel-spezifische Expression des LacZ-Reportergens in Mäuseembryonen erhalten, wenn ein Flk-1-Promotorfragment (das z. B. von –624 bis +299 Bp reichte) mit einem 2,3 kb großen Fragment des ersten Flk-1-Introns kombiniert wurde. Somit ist das erste Intron (Nucleotide 7027 bis 10642 der SEQ ID NO: 1) des Flk-1-Gens der Maus für eine Endothel-spezifische Genexpression essentiell. Insbesondere wurde von einem DNA-Fragment (vergleiche mit 12), das die Nucleotide 10094 bis 10608 der SEQ ID NO: 1 umfasste, gemäß der vorliegenden Erfindung gezeigt, dass es ausreichte, um die Expression einer heterologen DNA-Sequenz in Endothelzellen zu steuern; vergleiche mit Beispiel 8. Dies ist ein neuer Befund, weil die Sequenzen, die in den vorherigen Veröffentlichungen (Patterson, vorstehend; Rönicke, vorstehend) beschrieben wurden, im Gegensatz zu den Erwartungen und den Interpretationen des Fachgebiets nicht ausreichen, um eine Endothel-spezifische Expression in vivo zu vermitteln. Diese Ergebnisse, die gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wurden, zeigen, dass die regulatorischen Sequenzen, die in dem Intron des Flk-1-Gens lokalisiert sind und die eine Endothel-spezifische Expression vermitteln, dazu verwendet werden können, die Expression heterologer Gene in der Gefäßversorgung zu steuern.
Die genomische DNA des murinen Flk-1-Gens, die die regulatorischen Sequenzen des Introns umfasst, kann aus der Leber des Maus-Stammes 129/SV oder zum Beispiel durch die Durchmusterung einer Phagen-Genbank mit genomischer Leber-DNA im Vektor λFixII (Stratagene, La Jolla, CA), die durch im Fachgebiet bekannte, konventionelle Verfahren erzeugt wurde, erhalten werden.
Der Ausdruck „regulatorische Sequenz eines Gens, das zum Flk-1-Gen homolog ist" umfasst auch Promotorregionen und regulatorische Sequenzen eines Gens aus einer anderen Art wie zum Beispiel des Menschen und anderen Säugern, das zu dem Flk-1-Gen der Maus homolog ist und das das gleiche oder im Wesentlichen das gleiche Expressionsmuster verleihen kann. Solche regulatorischen Sequenzen sind durch ihre Fähigkeit charakterisiert, die Expression einer heterologen DNA-Sequenz spezifisch in Endothelzellen in vivo zu verleihen, vorzugsweise in allen Entwicklungsstadien. Daher können gemäß der vorliegenden Erfindung regulatorische Sequenzen aus anderen Arten, die zu den regulatorischen Sequenzen des Introns des Flk-1-Gens aus der Maus funktionell homolog sind, oder regulatorische Sequenzen von Genen verwendet werden, die ein im Wesentlichen identisches Expressionsmuster aufweisen, und zwar in dem Sinne, dass sie im Endothel exprimiert werden, vorzugsweise in allen Entwicklungsstadien.
Fachleute sind in der Lage, durch die Verwendung des bekannten Flk-1-Gens der Maus entsprechende Gene aus anderen Arten zu isolieren, zum Beispiel aus Menschen oder aus anderen Säugern. Dies kann durch die herkömmlichen, im Fachgebiet bekannten Verfahren erfolgen, wie zum Beispiel durch die Verwendung von Flk-1-Gensequenzen als Hybridisierungssonden oder durch Entwerfen von geeigneten PCR-Primern. Dann ist es möglich, die entsprechenden regulatorischen Sequenzen durch die üblichen Verfahren zu isolieren und sie auf ihr Expressionsmuster hin zu untersuchen. Für diesen Zweck ist es zum Beispiel möglich, die regulatorischen Sequenzen mit einem Reportergen zu fusionieren, wie z. B. den Genen, die die Luciferase oder das grün fluoreszierende Protein (GFP) codieren, und die Expression des Reportergens in transgenen Tieren wie zum Beispiel in Mäusen zu messen. Die Teil-Nucleotidsequenz des menschlichen Flk-1-Gens kann aus der Genbank-Zugangs-Nr. X89776; Patterson, vorstehend; Terman, Biochem. Biophys. Res. Comm. 187 (1992), 1579–1586; Genbank-Zugangs-Nr. X61656 erhalten werden. Die vorliegende Erfindung betrifft auch rekombinante DNA-Moleküle, die regulatorische Sequenzen umfassen, die mit der des Flk-1-Introns oder mit der eines Introns eines homologen Gens oder Fragmenten davon im Wesentlichen identisch sind und die in der Lage sind, eine spezifische Expression in Endothelzellen zu verleihen, vorzugsweise in allen Entwicklungsstadien in Mäusen oder in anderen Säugern.
Solche regulatorischen Sequenzen unterscheiden sich an einer oder an mehreren Positionen von den vorstehend erwähnten regulatorischen Sequenzen, besitzen aber immer noch die gleiche Spezifität, sie enthalten nämlich die gleichen oder ähnliche Sequenzmotive, die für das vorstehend beschriebene Expressionsmuster verantwortlich sind. Vorzugsweise hybridisieren solche regulatorischen Sequenzen mit einer der vorstehend beschriebenen regulatorischen Sequenzen, am stärksten bevorzugt unter stringenten Bedingungen. Besonders bevorzugt werden regulatorische Sequenzen, die mindestens 85 %, stärker bevorzugt 90–95 % und am stärksten bevorzugt 96–99 % Sequenzidentität mit einer der vorstehend erwähnten regulatorischen Sequenzen aufweisen und die gleiche Spezifität besitzen. Solche regulatorischen Sequenzen umfassen auch diejenigen, die Analoga oder Derivate darstellen, zum Beispiel aufgrund von (einer) Nucleotid-Deletion(en), -Insertion(en), -Substitution(en), -Hinzufügung(en) und/oder Rekombination(en) und/oder irgendeiner/welchen anderen Modifikation(en), die im Fachgebiet bekannt ist/sind, entweder alleine oder in Kombination, im Vergleich zu der vorstehend beschriebenen Nucleotidsequenz. Verfahren zum Einbringen solcher Modifikationen in die Nucleotidsequenz der regulatorischen Sequenzen der Erfindung sind den Fachleuten wohlbekannt und werden zum Beispiel in Sambrook (Molecular cloning; A Laboratory Manual, Zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)) beschrieben. Alle diese Fragmente, Analoga und Derivate der regulatorischen Sequenzen der Erfindung sind in den Rahmen der vorliegenden Erfindung mit eingeschlossen, solange die essentiellen, charakteristischen, regulatorischen Eigenschaften, wie sie vorstehend definiert wurden, in ihrer Art nicht beeinflusst werden. Für Fachleute ist es auch sofort ersichtlich, dass weitere regulatorische Sequenzen den regulatorischen Sequenzen der Erfindung hinzugefügt werden können. Es können zum Beispiel Promotoren, Transkriptions-Enhancer und/oder Sequenzen, die eine induzierte Expression der regulatorischen Sequenzen der Erfindung erlauben, verwendet werden. Ein geeignetes induzierbares System stellt zum Beispiel die durch Tetracyclin regulierte Genexpression dar, die z. B. durch Gossen (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 5547–5551; Trends Biotech. 12 (1994), 58–62) beschrieben wurde.
Die Expression, die durch die regulatorischen Sequenzen der Erfindung verliehen wird, braucht nicht ausschließlich auf die vorstehend beschriebene Spezifität begrenzt sein, sondern sie kann z. B. auch in Nervenzellen auftreten, einschließlich der neuralen Retina-Vorläuferzellen in allen oder in unterschiedlichen Stadien der Entwicklung sowie in blutbildenden Zellen (Yang, J. Neurosci. 16 (1996), 6089–6099).
Der Begriff „weitere regulatorische Sequenzen" bezieht sich auf Sequenzen, die die Spezifität und/oder den Expressionsspiegel beeinflussen, zum Beispiel in dem Sinne, dass sie eine zell- und/oder eine gewebsspezifische oder eine entwicklungsabhängige und/oder eine induzierbare regulierte Genexpression verleihen. Solche Regionen können stromaufwärts der Transkriptions-Initiationsstelle lokalisiert sein oder sie mit einschließen, wie z. B. ein Promotor, sie können sich aber auch stromabwärts davon befinden, wie z. B. in transkribierten, aber nicht translatierten Leader-Sequenzen.
Der Begriff „Promotor" bezieht sich auf die Nucleotidsequenzen, die für die Initiation der Transkription nötig sind, d. h. für die Bindung der RNA-Polymerase, und umfasst zum Beispiel auch die TATA-Box.
Der Begriff „in vivo" wird für die Zwecke der vorliegenden Erfindung für Zellen in einem Organismus verwendet, im Gegensatz zu Zellen, die in Kultur (in vitro) wachsen.
Der Begriff „heterolog" in Bezug auf die DNA-Sequenz, die mit dem Promotor der Erfindung funktionell verknüpft ist, bedeutet, dass diese DNA-Sequenz unter natürlichen Bedingungen nicht mit den regulatorischen Sequenzen verknüpft ist, die in dem rekombinanten DNA-Molekül der Erfindung enthalten sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die erste regulatorische Sequenz der Erfindung eine GATA-Bindestelle, eine AP-1-Bindestelle, eine SP1-Bindestelle, eine NF-κB-Bindestelle, eine STAT-Bindestelle, eine Scl/Tal-1-Bindestelle, eine Ets-Bindestelle, eine PEA3-Consensus-Sequenz oder (eine) beliebige Kombination(en) davon. Eine funktionelle Analyse der ersten 6,5 kBp der transkribierten Region des murinen Flk-1-Gens führte zu der Identifizierung eines Endothel-spezifischen positiv-regulatorischen Elements. Diese regulatorische Sequenz befindet sich in der Region zwischen der XhoI- und der BamHI-Restriktionsstelle im ersten Intron des Flk-1-Gens (vergleiche mit 4A). Sie ist in beiden Orientierungen funktionell, da der Intron-Enhancer in antiparalleler Weise in Bezug auf das Flk-1-Promotorfragment in dem Konstrukt, das als 3'-In 1 bezeichnet wurde, verwendet wurde; vergleiche mit dem nachstehenden Beispiel 2. Die Sequenzanalyse des Introns führte zur Identifizierung von zwei potenziellen GATA-Bindestellen (+1927 Bp, +3514 Bp); einer potenziellen AP-1-Bindestelle (+2210 Bp) und zwei PEA3-Consensus-Sequenzen (+3494 Bp, +3741 Bp); vergleiche mit 1. Wie in Beispiel 8 gezeigt, waren die Intron-Sequenzen, die für die Endothel-spezifische Expression ausreichten, in einem 510 Bp großen Fragment (Nucleotide 10094–10608 der SEQ ID NO: 1) enthalten. Darin konnten mehrere potenzielle Bindestellen für bekannte Transkriptionsfaktoren identifiziert werden (vergleiche mit 12), einschließlich Consensus-Bindestellen für c-ets1, PEA3 (ein Ets-ähnlicher Transkriptionsfaktor), GATA-Transkriptionsfaktoren und Scl/Tal-1. Es wurde vorgeschlagen, dass der Transkriptionsfaktor c-ets1 an der frühen Differenzierung von Endothelzellen aus ihren Vorläufern beteiligt ist (Pardanaut, Cell Adhesion and Communication 1 (1993), 151–160). Darüber hinaus wird c-ets1 in Endothelzellen im Verlauf der Bildung der Gefäßversorgung eines Tumors und bei anderen Formen der Angiogenese beim Menschen exprimiert (Wernert, Am. J. Pathol. 140 (1992), 119–127). Die Proteine der Ets-Familie können die Transkription über ein PEA3-Motiv aktivieren (Wernert, 1992). Die Transkriptionsfaktoren der GATA-Familie sind an der Transkription von Genen beteiligt, die in den blutbildenden und in den endothelialen Zellstammbäumen exprimiert werden, wie z. B. der von Willebrand-Faktor (Jahroudi, Mol. Cell. Biol. 14 (1994), 999–1008). Anders als der hämatopoietische Transkriptionsfaktor GATA-1 wird GATA-2 sowohl in dem endothelialen als auch in dem hämatopoietischen Zellstammbaum exprimiert (Elefanty, Blood 90 (1997), 1435–1447). Scl/Tal-1 wurde vor kurzem mit der Regulation der Flk-1-Expression in Zebrafischen in Verbindung gebracht (Liao, Genes Dev. 12 (1998), 621–626). Die Anwesenheit von zwei potenziellen Scl/Tal-1-Bindestellen in dem murinen Flk-1-Enhancer legt nahe, dass Scl/Tal-1 die Expression von Flk-9 in Mäusen regulieren könnte. Es wurde jedoch bisher bei Mäusen keine direkte Wirkung von Scl/Tal-1 auf die Flk-1-Expression beobachtet, obwohl Scl-Null-Mäuse vaskuläre Defekte aufweisen (Visvader, Genes Dev. 12 (1998), 473–479). Knock-out-Experimente, die mit den vorstehend beschriebenen regulatorischen Sequenzen durchgeführt werden können, werden schnell offenbaren, welche dieser z. B. in dem 510 Bp großen Fragment (Nucleotide 10094 bis 10608 der SEQ ID NO: 1) vorhandenen Elemente an der Kontrolle der regulatorischen Sequenz beteiligt sind, und die Reihenfolge dieser Elemente, die nötig ist, um eine Endothel-spezifische Genexpression zu verleihen (vermitteln). Natürlich befinden sich die regulatorischen Sequenzen, die aus solchen Untersuchungen erhalten werden, ebenfalls im Rahmen der vorliegenden Erfindung.
Die Beschreibung erwähnt, dass eine erste regulatorische Sequenz ausgewählt werden kann aus der Gruppe, bestehend aus:

(a) DNA-Sequenzen, umfassend die Nucleotidsequenz, wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt;
(b) DNA-Sequenzen, umfassend die Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 von Nucleotid 8260 bis Nucleotid 10560, von Nucleotid 8336 bis Nucleotid 10608 und/oder von Nucleotid 10094 bis Nucleotid 10608;
(c) DNA-Sequenzen, umfassend die Nucleotidsequenz des menschlichen Flk-1-Introns;
(d) DNA-Sequenzen, umfassend eine Nucleotidsequenz, die mit einer der Nucleotidsequenzen nach (a), (b) oder (c) unter stringenten Bedingungen hybridisiert;
(e) DNA-Sequenzen, umfassend eine Nucleotidsequenz, die in den Nucleotidsequenzen nach (a), (b) oder (c) konserviert ist;
(f) DNA-Sequenzen, umfassend ein Fragment, Analog oder Derivat einer Nucleotidsequenz nach einem der Punkte (a) bis (e), die in der Lage sind, eine Expression in Endothelzellen zu verleihen.

Die Beschreibung erwähnt ebenfalls, dass die regulatorischen Sequenzen die Nucleotide 8260 bis 10560, 8336 bis 10608 (umfassend das BamHI/XhoI-Fragment des ersten Introns (+1677 Bp/+3947 Bp); vergleiche mit 4 und den Beispielen 1 bis 10), die Nucleotide 8560 bis 10400 und die Nucleotide 10094 bis 10608 (umfassend das SwaI/BamHI-Fragment (+3437 Bp/3947 Bp); vergleiche mit Beispiel 8) der Nucleotidsequenz, wie sie in SEQ ID NO: 1 angeführt wird, oder eines Fragmentes davon umfassen können, die immer noch Expression in Endothelzellen verleihen, vorzugsweise in allen Entwicklungsstadien.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die heterologe DNA-Sequenz der rekombinanten DNA-Moleküle, die vorstehend beschrieben wurde, mit weiteren regulatorischen Sequenzen funktionell verknüpft. Die Expression umfasst die Transkription des Nucleinsäuremoleküls, vorzugsweise in eine translatierbare mRNA. Regulatorische Elemente, die die Expression in eukaryontischen Zellen, bevorzugt in Säugerzellen, sicherstellen, sind den Fachleuten wohlbekannt. Sie umfassen normalerweise Promotoren, die die Initiation der Transkription gewährleisten, und wahlweise polyA-Signale, welche Termination der Transkription und die Stabilisierung des Transkripts sicherstellen. Zusätzliche regulatorische Elemente können Transkriptions- sowie Translations-Enhancer umfassen. Bei solchen weiteren regulatorischen Sequenzen handelt es sich bevorzugt um einen Promotor und/oder um eine nicht translatierte 3'-Region.
Obwohl einige Endothel-spezifische Promotoren charakterisiert wurden, wie z. B. der Gene für den von Willebrand-Faktor (Jahroudi, Mol. Cell Biol. 14 (1994), 999–1008), für Endothelin-1 (Lee, J. Biol. Chem. 265 (1990), 10446–10450, für E-Selektin (Collins, J. Biol. Chem. 266 (1991), 2466–2473), für Tie-2 (Schlaeger, Development 121 (1995), 1089–1098), für VCAM (Iademarco, J. Biol. Chem. 267 (1992), 16323–16329) und für die endotheliale NO-Synthase (Zhang, J. Biol. Chem. 270 (1995), 15320–15326), sind diese Gene weder für das sich teilende Endothel spezifisch, noch für die Determination der Endothelzellen notwendig. Aufgrund der vorliegenden Erfindung können diese Promotoren nun mit den regulatorischen Sequenzen der Erfindung kombiniert werden, um eine Endothel-spezifische Genexpression heterologer DNA-Sequenzen zu vermitteln. Es können jedoch ebenso gut andere Promotoren verwendet werden. Zum Beispiel wird in Beispiel 8 gezeigt, dass die regulatorischen Sequenzen der Erfindung dem heterologen Thymidinkinase (tk)-Promotor des Herpes-Simplex-Virus eine Endothel-spezifische Expression verleihen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der vorstehend erwähnte Pomotor ein Promotor von durch Hypoxie induzierbaren Genen, von Genen, die Wachstumsfaktoren wie z. B. VEGF, PDGF oder den Fibroblasten-Wachstumsfaktor oder ihre Rezeptoren oder Enzyme der Glycolyse codieren.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst der Promotor eine DNA-Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

(a) DNA-Sequenzen, umfassend die Nucleotidsequenz, wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt, von Nucleotid 6036 bis Nucleotid 6959;
(b) DNA-Sequenzen, umfassend die Nucleotidsequenz des menschlichen Flk-1-Promotors;
(c) DNA-Sequenzen, umfassend eine Nucleotidsequenz, die mit einer Nucleotidsequenz nach (a) oder (b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert;
(d) DNA-Sequenzen, umfassend eine Nucleotidsequenz, die in den Nucleotidsequenzen nach (a) und (b) konserviert ist; und
(e) DNA-Sequenzen, umfassend ein Fragment, Analog oder Derivat einer Nucleotidsequenz nach einem der Punkte (a) bis (d).

Zumindest eine der vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen kann bevorzugt menschlichen oder murinen Ursprungs sein, obwohl andere Quellen ebenso gut verwendet werden können. Die heterologe DNA-Sequenz, die mit den regulatorischen Sequenzen funktionell verknüpft wird, befindet sich bevorzugt 5' zu der regulatorischen Sequenz der Erfindung.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform codiert die heterologe DNA-Sequenz der vorstehend beschriebenen rekombinanten DNA-Moleküle ein Peptid, ein Protein, eine Antisense-RNA, eine Sense-RNA und/oder ein Ribozym. Das rekombinante DNA-Molekül oder der Vektor der Erfindung kann alleine oder als Teil eines Vektors verwendet werden, um heterologe DNA-Sequenzen, die z. B. andere Proteine als Flk-1 codieren, in den Zellen der Blutgefäßwände, d. h. in Endothelzellen, zum Beispiel für die Gentherapie oder für die Diagnose von Gefäßerkrankungen wie z. B. Atherosklerose zu exprimieren. Das rekombinante DNA-Molekül oder der Vektor, welcher die DNA-Sequenz enthält, die ein Protein von Interesse codiert, wird in die Endothelzellen eingebracht, die darauf hin das Protein von Interesse produzieren. Zum Beispiel können die Sequenzen, die den t-PA (Pennica, Nature 301 (1982), 214), den p21-Zellzyklus-Inhibitor (El-Deiry, Cell 75 (1993), 817–823) oder die Stickstoffmonoxid-Synthase (Bredt, Nature 347 (1990), 768–770) codieren, mit den Endothelzellen-spezifischen regulatorischen Sequenzen der Erfindung funktionell verknüpft und in Endothelzellen exprimiert werden. Zum Beispiel können thrombolytische Mittel unter der Kontrolle der Endothelzellen-spezifischen regulatorischen Sequenzen der Erfindung zur Expression durch vaskuläre Endothelzellen in Blutgefäßen exprimiert werden, wie z. B. in Gefäßen, die durch abberante Blutklümpchen verstopft sind. Es können auch andere heterologe Proteine wie z. B. Proteine, die die Vermehrung der glatten Muskelzellen hemmen, wie z. B. Interferon-γ und das atriale natriuretische Polypeptid in Endothelzellen spezifisch exprimiert werden, um die Anlieferung dieser therapeutischen Peptide an eine atherosklerotische Läsion oder an einen Bereich, der das Risiko aufweist, eine atherosklerotische Läsion zu entwickeln, wie z. B. ein verletztes Blutgefäß, sicherzustellen.
Die Endothelzellen-spezifischen regulatorischen Sequenzen der Erfindung können auch bei der Gentherapie verwendet werden, um die Angiogenese zu fördern, und zwar um Erkrankungen zu behandeln, wie z. B. periphere Gefäßerkrankungen oder Koronararterien-Erkrankungen (Isner, Circulation 91 (1995), 2687–2692). Zum Beispiel können die regulatorischen Sequenzen der Erfindung mit Sequenzen funktionell verknüpft werden, die zelluläre Wachstumsfaktoren codieren, welche die Angiogenese fördern, wie z. B. dem VEGF, dem sauren Fibroblasten-Wachstumsfaktor, dem basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor und ähnlichen.
In einer besonders stark bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Protein ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus dem Vasculo-Endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), durch Hypoxie induzierbaren Faktoren (HIF), dem HIF-verwandten Faktor (HRF), dem Gewebe-Plasminogen-Aktivator, dem p21-Zellzyklus-Inhibitor, der Stickstoffmonoxid-Synthase, Interferon-γ, dem atrialen natriuretischen Polypeptid und Monocyten-chemotaktischen Proteinen.
In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Protein ein wertbarer Marker, vorzugsweise Luciferase, grün fluoreszierendes Protein oder lacZ. Diese Ausführungsform ist besonders nützlich für einfache und schnelle Durchmusterungsverfahren für Verbindungen und Stoffe, die hierin nachstehend beschrieben werden und die in der Lage sind, die Expression von Genen im Endothel zu modulieren. Zum Beispiel können Endothelzellen mit VEGF in Gegenwart oder in Abwesenheit einer Kandidaten-Verbindung kultiviert werden, um zu bestimmen, ob die Verbindung die Expression von Genen beeinflusst, die unter der Kontrolle der regulatorischen Sequenzen der Erfindung stehen, wobei dies z. B. durch die Aufzeichnung der Expression der vorstehend erwähnten Marker gemessen werden kann. Fachleuten wird auch sofort ersichtlich sein, dass andere Markergene ebenso gut verwendet werden können, wobei diese zum Beispiel einen selektierbaren Marker codieren, der eine direkte Auswahl von Verbindungen ermöglicht, die die Expression des Markers induzieren oder hemmen.
Die regulatorischen Sequenzen der Erfindung können auch bei Verfahren der Antisense-Therapie verwendet werden. Die Antisense-Therapie kann durchgeführt werden, indem einem tierischen oder einem menschlichen Patienten eine rekombinante DNA verabreicht wird, welche die Endothelzellen-spezifischen regulatorischen Sequenzen der Erfindung enthält, die funktionell mit einer DNA-Sequenz verknüpft sind, d.h. eine Antisense-Matrize, die in eine Antisense-RNA transkribiert wird. Bei der Antisense-RNA kann es sich um eine kurze (im Allgemeinen mindestens 10, bevorzugt mindestens 14 Nucleotide und bis zu 100 oder mehr Nucleotide) Nucleotidsequenz handeln, die so formuliert ist, dass sie zu einem Teil einer spezifischen mRNA-Sequenz komplementär ist. Standardverfahren, welche die Antisense-Technologie betreffen, wurden beschrieben (Melani, Cancer Res. 51 (1991), 2897–2901). Nach der Transkription der DNA-Sequenz in die Antisense-RNA bindet die Antisense-RNA an ihre Ziel-mRNA-Moleküle in der Zelle, wodurch die Translation der mRNA gehemmt und die Expression des Proteins, das durch die mRNA codiert wird, herunter reguliert wird. Zum Beispiel würde eine Antisense-Sequenz, die zu einem Teil oder zu der vollständigen Flk-1 (KDR)-mRNA komplementär ist (Terman, Oncogene 6 (1991), 1677–1683 und Terman (1992), vorstehend), die Expression von Flk-1 hemmen, was als Folge die Angiogenese hemmen würde. Eine solche Antisense-Therapie kann verwendet werden, um Krebs zu behandeln, insbesondere, um die Angiogenese am Ort eines festen Tumors zu hemmen, sowie bei anderen pathogenen Zuständen, die durch die Angiogenese verursacht oder verschlechtert werden, z. B. entzündliche Erkrankungen wie z. B. rheumatoide Arthritis und diabetische Retinopathie.
Die Expression anderer Proteine der Endothelzellen kann ebenfalls auf ähnliche Weise gehemmt werden, zum Beispiel von Endothelzellen-Proteinen wie z. B. Zellzyklus-Proteinen (wodurch die Vermehrung von Endothelzellen und damit die Angiogenese gehemmt wird); von Gerinnungsfaktoren wie z. B. des von Willebrand-Faktors und von Endothelzellen-Adhäsionsfaktoren wie z. B. ICAM-1 und VCAM-1 (Bennett, J. Immunol. 152 (1994), 3530–3540).
Somit sind in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Antisense-RNA oder das Ribozym gegen ein Gen gerichtet, das an der Vasculogenese und/oder der Angiogenese und/oder an Tumoren von Endothelzellen beteiligt ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Nucleinsäuremoleküle, die mindestens 85 % Sequenzidentität mit den Nucleotiden 10094 bis 10608 der SEQ ID NO: 1 aufweisen, wobei dieses Molekül eine Länge von mindestens 25 Nucleotiden besitzt und in der Lage ist, die Expression spezifisch in Endothelzellen in vivo zu verstärken. Solche Moleküle können, bevorzugt unter stringenten Bedingungen, mit den Nucleotidsequenzen spezifisch hybridisieren, wie vorstehend beschrieben wurde, und weisen keine oder eine nur sehr geringe Kreuzhybridisierung mit Nucleotidsequenzen auf, die keine oder im Wesentlichen unterschiedliche regulatorische Eigenschaften haben. Solche Nucleinsäuremoleküle können als Sonden und/oder zur Kontrolle der Genexpression verwendet werden. Die Nucleinsäure-Sonden-Technologie ist den Fachleuten wohlbekannt, und sie werden rasch erkennen, dass solche Sonden in der Länge variieren können. Bevorzugt werden Nucleinsäure-Sonden mit einer Länge von 17, 18, 19, 20 bis 25 und 25 bis 35 Nucleotiden. Natürlich kann es auch passend sein, Nucleinsäuren mit einer Länge von bis zu 100 und mehr Nucleotiden zu verwenden. Die Nucleinsäure-Sonden der Erfindung sind für verschiedene Anwendungen geeignet. Einerseits können sie als PCR-Primer zur Amplifikation regulatorischer Sequenzen gemäß der Erfindung verwendet werden. Eine weitere Anwendungsmöglichkeit ist die Verwendung als Hybridisierungssonden, um regulatorische Sequenzen zu identifizieren, die mit den regulatorischen Sequenzen der Erfindung hybridisieren; dies erfolgt durch homologe Durchmusterung von genomischen DNA-Genbanken. Die Nucleinsäuremoleküle gemäß dieser bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, die zu einer regulatorischen Sequenz, wie vorstehend beschrieben, komplementär sind, können auch für die Unterdrückung der Expression eines Gens verwendet werden, das solche regulatorischen Sequenzen enthält, zum Beispiel aufgrund einer Antisense- oder eine Tripel-Helix-Wirkung, oder sie können für die Konstruktion geeigneter Ribozyme verwendet werden (vergleiche z. B. mit EP-B1 0 291 533, EP-A1 0 321 201, EP-A2 0 360 257), die die (prä)-mRNA eines Gens, das eine regulatorische Sequenz der Erfindung enthält, spezifisch spalten. Die Auswahl geeigneter Zielstellen und der entsprechenden Ribozyme kann zum Beispiel, wie in Steinecke, Ribozymes, Methods in Cell Biology 50, Galbraith et al., Hrsg., Academic Press, Inc. (1995), 449–460 beschrieben, vorgenommen werden. Weiterhin sind Fachleute sich bewusst, dass es auch möglich ist, eine solche Nucleinsäuren-Sonde mit einem geeigneten Marker für spezifische Anwendungen zu markieren, wie z. B. für den Nachweis der Anwesenheit eines Nucleinsäuremoleküls der Erfindung in einer Probe, die aus einem Organismus stammt.
Bei solchen Molekülen kann es sich entweder um DNA oder um RNA oder um ein Hybrid davon handeln. Des Weiteren kann ein solches Nucleinsäuremolekül zum Beispiel Thioester-Bindungen und/oder Nucleotid-Analoga enthalten, die üblicherweise bei Oligonucleotid-Antisense-Anwendungen verwendet werden. Solche Modifikationen können zur Stabilisierung des Nucleinsäuremoleküls gegen Endo- und/oder Exonucleasen in der Zelle nützlich sein. Die Nucleinsäuremoleküle können auch durch einen geeigneten Vektor transkribiert werden, der ein chimäres Gen enthält, das die Transkription des Nucleinsäuremoleküls in der Zelle erlaubt. Die Nucleinsäuremoleküle können weiterhin Ribozym-Sequenzen enthalten, die die (prä)-mRNA, welche die regulatorischen Sequenzen der Erfindung enthält, spezifisch spalten. Des Weiteren können Oligonucleotide entworfen werden, die zu einer regulatorischen Sequenz der Erfindung komplementär sind (Tripel-Helix; vergleiche mit Lee, Nucl. Acids Res. 6 (1979), 3073; Cooney, Science 241 (1988), 456 und Dervan, Science 251 (1991), 1360), wodurch die Transkription und die Produktion des codierten Proteins verhindert wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Vektoren, insbesondere Plasmide, Cosmide, Viren und Bakteriophagen, die üblicherweise bei der Gentechnologie verwendet werden und die ein rekombinantes DNA-Molekül der Erfindung enthalten. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Vektor um einen Expressionsvektor und/oder um einen Targeting-Vektor (Ziel-Vektor). Expressionsvektoren, die von Viren wie z. B. von Retroviren, dem Vaccinia-Virus, dem adeno-assoziierten Virus, Herpes-Viren oder dem Rinder-Papillom-Virus abgeleitet wurden, können für die Anlieferung des rekombinanten DNA-Moleküls oder des Vektors der Erfindung in eine angezielte Zellpopulation verwendet werden. Es können Verfahren verwendet werden, die den Fachleuten wohlbekannt sind, um rekombinante virale Vektoren zu konstruieren; vergleiche zum Beispiel mit den Verfahren, die in Sambrook, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), N.Y. und in Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates und Wiley Interscience, N.Y. (1989) beschrieben werden. Alternativ können die rekombinanten DNA-Moleküle und die Vektoren der Erfindung in Liposomen für die Anlieferung an Zielzellen rekonstituiert werden.
Wie in Beispiel 11 gezeigt, wurde der Flk-1-Promotor durch HIF-2α, einem basischen Helix-Schleife-Helix/PAS-Domäne-Transkriptionsfaktor, der mit dem durch Hypoxie induzierbaren Faktor-1 verwandt ist, stimuliert. Von HIF-2α wurde vor kurzem gezeigt, dass er die Expression von VEGF stimuliert, was vermuten lässt, dass HIF-2α die koordinierte Expression sowohl des VEGF-Rezeptors Flk-1 als auch seines Liganden in vivo reguliert. Daher können die regulatorischen Elemente des Flk-1-Gens, die hierin beschrieben werden, zusammen mit HIF-2α für die Aufklärung der molekularen Mechanismen verwendet werden, die an der Spezifikation der Endothelzellen und der Angiogenese beteiligt sind, und sie können verwendet werden, um die Expression eines beliebigen Transgens im Endothel zu vermitteln. Daher umfasst in einer bevorzugten Ausführungsform der Vektor der Erfindung weiterhin ein Gen, das in der Lage ist, HIF-2α zu exprimieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Wirtszellen, die mit einem DNA-Molekül oder mit einem Vektor der Erfindung transformiert sind. Bei solchen Wirtszellen kann es sich um prokaryontische oder um eukaryontische Zellen handeln. Der Vektor oder das rekombinante DNA-Molekül der Erfindung, das in der Wirtszelle vorliegt, kann entweder in das Genom der Wirtszelle integriert sein oder er/es kann extrachromosomal aufrechterhalten werden. In dieser Hinsicht sollte dies auch so verstanden werden, dass das rekombinante DNA-Molekül der Erfindung für „Gen-Targeting" und/oder für den „Genaustausch" („gene replacement") verwendet werden kann, um ein mutiertes Gen wiederherzustellen oder um ein mutiertes Gen über homologe Rekombination zu erzeugen.
Bei der Wirtszelle kann es sich um eine beliebige prokaryontische oder eukaryontische Zelle handeln, wie z. B. um eine Bakterien-, Insekten-, Pilz-, Pflanzen- oder Tierzelle. Bevorzugte Pilzzellen sind zum Beispiel diejenigen der Gattung Saccharomyces, insbesondere diejenigen der Art S. cerevisiae. Geeignete Säuger-Zelllinien umfassen Saos-2-Zellen, menschliche Knochensarkom-Zellen (ATCC HTB-85), HeLa-Zellen, menschliche Epidermis-Karzinom-Zellen (ATCC CRL-7923), HepG2-Zellen, menschliche Hepatom-Zellen (ATCC HB-8065), menschliche Fibroblasten (ATCC CRL-1634), U937-Zellen, menschliche Histiocyten-Lymphom-Zellen (ATCC CRL-7939), RD-Zellen, menschliche embryonale Rhabdomyosarkom- Zellen (ATCC CCL-136), MCF7-Zellen, menschliche Brust-Adenokarzinom-Zellen (ATCC HTB-22), JEG-3-Zellen, menschliche Choriokarzinom-Zellen (ATCC HB36), A7r5-Zellen, glatte Muskelzellen der fötalen Ratten-Aorta (ATCC CRL-1444) und NIH 3T3-Maus-Fibroblasten (ATCC CRL-1658), die von der American Type Culture Collection erhältlich sind. Primärkultur-HUVEC-Zellen können von Clonetics Corp. (San Diego, CA) erhalten werden und können in EGM-Medium, das 2 % fötales Kälberserum (Clonetics) enthält, angezogen werden. Primärkulturen von menschlichen Aorta- und glatten Darm-Muskelzellen können ebenfalls von Clonetics Corp. bezogen werden. Am stärksten bevorzugt handelt es sich bei der Wirtszelle um eine Endothelzelle oder sie ist von einer solchen abgeleitet, wie z. B. BAE-Zellen. Im Hinblick auf die synergistische Wirkung einer Co-Expression eines rekombinanten DNA-Moleküls der Erfindung und HIF-2α betrifft eine weitere Ausführungsform der Erfindung die vorstehend beschriebenen Zellen, die weiterhin ein rekombinantes DNA-Molekül oder einen Vektor umfassen, der ein Gen enthält, das in der Lage ist, HIF-2α zu exprimieren.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung ein Arzneimittel, das mindestens eines der vorstehend erwähnten rekombinanten DNA-Moleküle oder Vektoren der Erfindung umfasst, entweder alleine oder in Kombination, und wahlweise einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Excipienten. Beispiele für geeignete pharmazeutische Träger sind im Fachgebiet wohlbekannt und umfassen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen wie z. B. Öl/Wasser-Emulsionen, verschiedene Arten von Befeuchtungsmitteln, sterile Lösungen usw. Zusammensetzungen, die solche Träger enthalten, können durch die wohlbekannten herkömmlichen Verfahren formuliert werden. Diese Arzneimittel können dem Individuum in einer geeigneten Dosis verabreicht werden. Die Verabreichung der geeigneten Zusammensetzungen kann auf unterschiedlichen Wegen erfolgen, wie z. B. durch eine intravenöse, intraperitoneale, subcutane, intramuskuläre, örtliche oder intradermale Verabreichung. Das Dosierungs-Protokoll wird durch den begleitenden Arzt und andere klinische Faktoren bestimmt. Wie im medizinischen Fachgebiet wohlbekannt ist, hängen die Dosierungen für einen bestimmten Patienten von vielen Faktoren ab, einschließlich der Größe des Patienten, der Körperoberfläche, dem Alter, der bestimmten Verbindung, die verabreicht werden soll, dem Geschlecht, den Zeiten und dem Weg der Verabreichung, der allgemeinen Gesundheit und anderen Arzneistoffen, die gleichzeitig verabreicht werden. Die Dosierungen werden variieren, aber eine bevorzugte Dosis für die intravenöse Verabreichung einer DNA reicht von etwa 10⁶ bis zu 10²² Kopien des DNA-Moleküls. Die Zusammensetzungen der Erfindung können lokal oder systemisch verabreicht werden. Die Verabreichung erfolgt im Allgemeinen parenteral, z. B. intravenös; die DNA kann aber auch direkt an den Zielort verabreicht werden, wie z. B. durch eine biolistische Anlieferung an eine interne oder eine externe Zielstelle oder durch einen Katheter an eine Stelle in einer Arterie.
Mit der vorliegenden Erfindung wird beabsichtigt, dass die verschiedenen rekombinanten DNA-Moleküle und Vektoren der Erfindung entweder alleine oder in einer beliebigen Kombination verabreicht werden, und zwar unter Verwendung von Standard-Vektoren und/oder Gen-Anlieferungs-Systemen und wahlweise zusammen mit einer geeigneten Verbindung wie zum Beispiel VEGF und/oder zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Excipienten. Nach der Verabreichung können die rekombinanten DNA-Moleküle stabil in das Genom des Säugers integriert werden. Andererseits können virale Vektoren verwendet werden, die für bestimmte Zellen oder Gewebe spezifisch sind, vorzugsweise für das Endothel, und die in diesen Zellen persistieren können. Geeignete pharmazeutische Träger und Excipienten sind im Fachgebiet wohlbekannt. Die Arzneimittel, die gemäß der Erfindung hergestellt werden, können für die Verhinderung oder die Behandlung oder für die Verzögerung unterschiedlicher Arten von Erkrankungen verwendet werden, die mit der Expression oder der Über-Expression eines bestimmten Gens oder von bestimmten Genen im Endothel in Zusammenhang stehen.
Des Weiteren ist es möglich, ein Arzneimittel der Erfindung, das ein rekombinantes DNA-Molekül oder einen Vektor der Erfindung umfasst, bei der Gentherapie zu verwenden. Geeignete Gen-Anlieferungs-Systeme können unter anderen Liposomen, Rezeptor-vermittelte Anlieferungs-Systeme, nackte DNA und virale Vektoren wie z. B. Herpes-Viren, Retroviren, Adenoviren und adeno- assoziierte Viren umfassen. Die Anlieferung von Nucleinsäuren an eine spezifische Stelle im Körper für die Gentherapie oder für die Antisense-Therapie kann auch unter Verwendung eines biolistischen Anlieferungs-Systems erfolgen, wie z. B. demjenigen, das durch Williams (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 2726–2729 beschrieben wurde.
Standardverfahren zur Transfektion von Zellen mit rekombinanter DNA sind den Fachleuten auf dem Gebiet der Molekularbiologie wohlbekannt, vergleiche z. B. mit WO 94/29469. Die Gentherapie und die Antisense-Therapie zur Verhinderung oder zur Verminderung der Entwicklung einer Atherosklerose oder zur Hemmung der Angiogenese können durch eine direkte Verabreichung des rekombinanten DNA-Moleküls oder des Vektors der Erfindung an einen Patienten durchgeführt werden oder durch die Transfektion von Endothelzellen mit dem rekombinanten DNA-Molekül oder dem Vektor der Erfindung ex vivo und Infusion der transfizierten Zellen in den Patienten. Darüber hinaus ist die Forschung, die sich mit dem Gentransfer in Zellen der Keimbahn beschäftigt, eines der am schnellsten wachsenden Gebiete der Reproduktionsbiologie. Die Gentherapie, die auf der Einbringung therapeutischer Gene in die Zellen durch ex vivo- oder durch in vivo-Techniken basiert, ist eine der wichtigsten Anwendungen des Gentransfers. Geeignete Vektoren und Verfahren für die in vitro- oder die in vivo-Gentherapie sind in der Literatur beschrieben und den Fachleuten bekannt; vergleiche z. B. mit WO 94/29469, WO 97/00957 oder mit Schaper (Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635–640) und den darin zitierten Referenzen. Die DNA-Moleküle und die Vektoren, die in den Arzneimitteln der Erfindung enthalten sind, können für eine direkte Einbringung oder für eine Einbringung über Liposomen oder über virale Vektoren (z. B. adenovirale, retrovirale), die das rekombinante DNA-Molekül enthalten, in die Zelle entworfen werden. Vorzugsweise handelt es sich bei der Zelle um eine Zelle der Keimbahn, eine embryonale Zelle oder um eine Eizelle, oder sie wurde von diesen abgeleitet. Die Arzneimittel der Erfindung können für die Behandlung aller Arten von Krankheiten verwendet werden, von denen bislang nicht bekannt war, dass sie mit der Expression und/oder der Über-Expression von Genen im Endothel in Beziehung stehen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch diagnostische Zusammensetzungen oder Kits, die mindestens eines der vorstehend erwähnten rekombinanten DNA-Moleküle, Vektoren, Zellen und/oder Nucleinsäuremoleküle sowie im Falle von diagnostischen Zusammensetzungen wahlweise geeignete Mittel zum Nachweis umfassen.
Diese diagnostischen Zusammensetzungen können für Verfahren zum Nachweis und zur Isolierung regulatorischer Sequenzen verwendet werden, die zu den regulatorischen Sequenzen der Erfindung im Flk-1-Intron funktionell äquivalent sind. Die Kits der Erfindung können weiterhin Verbindungen wie z. B. weitere Plasmide, Antibiotika und Ähnliches für die Durchmusterung transgener Tiere und/oder tierischer Zellen enthalten, die für die gentechnische Veränderung nicht-menschlicher Tiere, vorzugsweise von Säugern und am stärksten bevorzugt von Mäusen, nützlich sind.
Es sollte so verstanden werden, dass die eingebrachten rekombinanten DNA-Moleküle und Vektoren der Erfindung die heterologe DNA-Sequenz nach der Einbringung in die Zelle exprimieren und vorzugsweise in diesem Zustand während der Lebenspanne der Zelle verbleiben. Zum Beispiel können Zelllinien hergestellt werden, die die heterologe DNA unter der Kontrolle der regulatorischen Sequenz der Erfindung stabil exprimieren. Statt der Verwendung von Expressionsvektoren, die virale Replikationsursprünge enthalten, können die Wirtszellen mit dem rekombinanten DNA-Molekül oder dem Vektor der Erfindung und einem selektierbaren Marker, der sich entweder auf dem gleichen oder auf einem getrennten Vektor befindet, transformiert werden. Nach dem Einbringen der fremden DNA kann den veränderten Zellen erlaubt werden, für 1–2 Tage in einem angereicherten Medium zu wachsen, und dann werden sie auf ein Selektionsmedium umgesetzt. Der selektierbare Marker in dem rekombinanten Plasmid verleiht eine Resistenz gegen die Selektion und erlaubt den Zellen, das Plasmid stabil in ihre Chromosomen zu integrieren und zu wachsen, um Wachstumsherde zu bilden, die dann wiederum cloniert und zu Zelllinien erweitert werden können. Dieses Verfahren kann vorteilhaft verwendet werden, um Zelllinien herzustellen, die die heterologe DNA-Sequenz unter der Kontrolle der regulatorischen Sequenz der Erfindung exprimieren und die auf eine durch VEGF und/oder durch Hypoxie vermittelte Signalübertragung reagieren. Solche veränderten Zelllinien sind besonders bei der Durchmusterung von Verbindungen nützlich, die in der Lage sind, die Flk-1-Genexpression zu modulieren.
Es kann eine Reihe an Selektionssystemen verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt da auf, der Gene für die Thymidinkinase des Herpes-Simplex-Virus (Wigler, Cell 11 (1977), 223), die Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (Szybalska, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48 (1962), 2026) und die Adenin-Phosphoribosyltransferase (Lowy, Cell 22 (1980), 817); diese Gene können in tk^–- beziehungsweise in hgprt^–- bzw. in aprt^–-Zellen verwendet werden. Es kann auch die Antimetaboliten-Resistenz als Grundlage für die Selektion auf das dhfr-Gen, welches Resistenz gegenüber Methotrexat verleiht (Wigler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 3567; O'Hare, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 1527), sowie das gpt-Gen, das Resistenz gegenüber Mycophenolsäure verleiht (Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 2072, das neo-Gen, das Resistenz gegenüber dem Aminoglycosid G-418 verleiht (Colberre-Garapin, J. Mol. Biol. 150 (1981), 1), und das hygro-Gen, das Resistenz gegenüber Hygromycin verleiht (Santerre, Gene 30 (1984), 147), verwendet werden. Es sind weitere selektierbare Gene beschrieben worden, namentlich trpB, das den Zellen erlaubt, Indol anstelle von Tryptophan zu nutzen, hisD, das den Zellen erlaubt, Histinol anstelle von Histidin zu nutzen (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047), und ODC (Ornithin-Decarboxylase), die Resistenz gegen den Ornithin-Decarboxylase-Inhibitor 2-(Difluormethyl)-DL-Ornithin, DFMO, verleiht (McConlogue, 1987, in: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Hrsg,). Andererseits können Fachleute auch die regulatorischen Sequenzen der Erfindung verwenden, um ein endogenes Gen auszuschalten („knock out"), das identische oder ähnliche regulatorische Sequenzen umfasst, zum Beispiel durch Gen-Targeting, Cosuppressions-, Tripel-Helix-, Antisense- oder Ribozym-Technologie.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren für die Herstellung eines transgenen Tieres, vorzugsweise einer Maus, umfassend das Einbringen eines rekombinanten DNA-Moleküls oder eines Vektors der Erfindung in eine Keimzelle, eine embryonale Zelle oder in ein Ei oder in eine Zelle, die davon abgeleitet wurde. Bei dem nicht-menschlichen Tier, das bei diesem Verfahren der Erfindung verwendet werden soll, kann es sich um den Wildtyp handeln, d. h. um ein gesundes Tier, oder es kann eine Erkrankung oder eine Störung aufweisen, vorzugsweise eine Erkrankung oder eine Störung, die von der Gefäßneubildung abhängig ist, wie z. B. feste Tumore, Retinopathie, Arthritis, Psoriasis. Bei dieser Krankheit oder Störung kann es sich um eine angeborene Insuffizienz handeln oder um eine, die sich natürlich entwickelt hat oder die durch eine gentechnische Veränderung wie zum Beispiel durch die Expression einer DNA-Sequenz, die ein Protein codiert, das an der Nervenentwicklung und/oder an den vorstehend beschriebenen Erkrankungen beteiligt ist, vorzugsweise unter der Kontrolle der regulatorischen Sequenzen der Erfindung, verursacht wurde.
Die Erfindung betrifft auch transgene nicht-menschliche Tiere, die ein rekombinantes DNA-Molekül oder einen Vektor der Erfindung enthalten oder die durch das vorstehend beschriebene Verfahren erhalten wurden, wobei das rekombinante DNA-Molekül vorzugsweise in das Genom des nicht-menschlichen Tieres stabil integriert ist, bevorzugt in der Weise, dass die Anwesenheit des rekombinanten DNA-Moleküls oder des Vektors zur Transkription und/oder zur Expression der heterologen DNA-Sequenz durch die regulatorische Sequenz der Erfindung führt. Weitere nicht-menschliche Tiere, die gemäß den Ausführungsformen der Erfindung, wie vorstehend beschrieben, verwendet werden können, sind den Fachleuten wohlbekannt und umfassen Ratten, Hamster, Hunde, Affen, Kaninchen und Schweine.
Mit den regulatorischen Sequenzen der Erfindung ist es nun möglich, die Regulation der Flk-1-Genexpresssion im Verlauf der Agiogenese in vivo zu untersuchen. Da es darüber hinaus so scheint, dass der VEGF und das VEGF-Rezeptor-Gen unterschiedliche Funktionen in unterschiedlichen Entwicklungsstadien besitzen, ist es nun möglich, Domänen dieser Proteine zu bestimmen, die für ihre biologische Aktivität und/oder für die Regulation ihrer Aktivität wichtig sind. Darüber hinaus ist es nun möglich, Mutationen in vivo zu untersuchen, die unterschiedliche funktionelle oder regulatorische Aspekte des VEGF oder seines Rezeptors oder eines Vektors der Erfindung beeinflussen.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Identifizierung eines chemischen und/oder eines biologischen Stoffes, der in der Lage ist, die Transkription eines Gens in Endothelzellen zu unterdrücken oder zu aktivieren und/oder zu verstärken, umfassend:

(a) Inkontaktbringen einer Zelle der Erfindung oder des transgenen nicht-menschlichen Tieres der Erfindung, welche beide in der Lage sind, die heterologe DNA-Sequenz zu exprimieren, mit einer Vielzahl von Verbindungen; und
(b) Bestimmen derjenigen Verbindungen, welche die Expression der heterologen DNA-Sequenz unterdrücken oder aktivieren und/oder verstärken.

Diese Vielzahl an Verbindungen kann zum Beispiel in Proben enthalten sein, wie z. B. in Zellextrakten aus z. B. Pflanzen, Tieren oder Mikroorganismen. Weiterhin können die Verbindungen im Fachgebiet bekannt sein, aber bislang nicht dafür bekannt sein, dass sie in der Lage sind, die Transkription eines Gens in Endothelzellen zu unterdrücken oder zu aktivieren und/oder zu verstärken. Die Vielzahl an Verbindungen kann z. B. dem Kulturmedium zugegeben werden, oder sie kann den Tieren injiziert werden.
Der Ausdruck „Vielzahl von Verbindungen" bei einem Verfahren der Erfindung soll als eine Vielzahl von Stoffen verstanden werden, die entweder identisch sind oder nicht. Wenn eine Probe, die eine Vielzahl von Verbindungen enthält, bei dem Verfahren der Erfindung identifiziert wird, dann ist es entweder möglich, die Verbindung aus der Originalprobe zu isolieren, die als die Verbindung enthaltend identifiziert wurde, welche in der Lage ist, die Transkription eines Gens in Endothelzellen zu unterdrücken oder zu aktivieren und/oder zu verstärken, oder man kann die Originalprobe weiter unterteilen, zum Beispiel, wenn sie aus einer Vielzahl von unterschiedlichen Verbindungen besteht, damit die Anzahl der unterschiedlichen Stoffe pro Probe vermindert wird, und das Verfahren mit den Unterteilungen der Originalprobe wiederholen. In Abhängigkeit von der Komplexität der Proben kann dies mehrmals erfolgen, vorzugsweise bis die gemäß dem Verfahren der Erfindung identifizierte Probe nur noch eine begrenzte Zahl an Stoffen oder nur noch einen Stoff umfasst. Die Probe umfasst bevorzugt Stoffe mit ähnlichen chemischen und/oder physikalischen Eigenschaften, am stärksten bevorzugt wird, wenn die Stoffe identisch sind.
Die Bestimmung, ob eine Verbindung in der Lage ist, die Transkription eines Gens in Endothelzellen zu unterdrücken oder zu aktivieren und/oder zu verstärken, kann zum Beispiel in Mäusen durchgeführt werden, und zwar durch die Überwachung der Expression eines Reportergens oder durch die Überwachung des Verhaltens der transgenen nicht-menschlichen Tiere der Erfindung, die mit den Verbindungen in Kontakt gebracht worden sind, im Vergleich zum dem von Wildtyp-Tieren oder im Vergleich zu einem transgenen nicht-menschlichen Tier, das mit einer Verbindung in Kontakt gebracht wurde, von der bekannt ist, das sie entweder in der Lage ist oder nicht in der Lage ist, die Transkription eines Gens in Endothelzellen des transgenen nicht-menschlichen Tieres der Erfindung zu unterdrücken oder zu aktivieren und/oder zu verstärken. Des Weiteren können Fachleute das physische Verhalten oder zum Beispiel die Bewegungen der vorstehend beschriebenen Tiere überwachen. Solche Verfahren sind im Fachgebiet wohlbekannt. Diese Regulatoren der Flk-1-Genexpression können bei Verfahren wie z. B. der Wundheilung verwendet werden; im Gegensatz dazu können Antagonisten der Expression bei der Behandlung von Tumoren verwendet werden, die für das Wachstum von der Bildung der Gefäßversorgung abhängig sind. Somit stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen bereit, die die Expression des VEGF-Rezeptor (z. B. Flk-1 oder Flt1)-Gens modulieren. Verbindungen, von denen herausgefunden wird, dass sie die Expression eines VEGF-Rezeptorgens herunter regulieren, können bei Verfahren zur Hemmung der Angiogenese verwendet werden, während Verbindungen, von denen herausgefunden wird, dass sie die Expression von Flk-1 oder Flt1 verstärken, bei Verfahren verwendet werden können, die die Angiogenese fördern, zum Beispiel, um die Wundheilung (z. B. die Heilung von gebrochenen Knochen, Verbrennungen, diabetischen Geschwüren und Verletzungs- oder Operationswunden) zu fördern oder um periphere Gefäßerkrankungen, Atherosklerose, Hirngefäßerkrankungen, hypoxische Gewebeschäden (z. B. Retinopathie, hypoxische Schäden am Herzgewebe), diabetische Krankheitszustände wie z. B. chronische Hautläsionen oder Koronargefäßerkrankungen zu behandeln. Diese Verbindungen können auch verwendet werden, um Patienten zu behandeln, die vorübergehende ischämische Attacken, eine Gefäßverpflanzungsoperation, eine Ballon-Angioplastie, Frostbeulen, Gangrän oder eine schwache Durchblutung haben oder hatten. Verbindungen, von denen herausgefunden wurde, dass sie die gewünschte Wirkung haben (d. h. Verstärkung oder Hemmung der Expression von Flk-1), können in geeigneten Modellen des Endothelzellenwachstums und der Angiogenese, die den Fachleuten wohlbekannt sind, weiter untersucht werden. In Anbetracht des therapeutischen Wertes der Verbindungen, die gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren identifiziert wurden, betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneistoffes, das die Schritte des Verfahrens der Erfindung und die Formulierung der in Schritt (b) identifizierten Verbindung in einer pharmazeutisch verträglichen Form umfasst.
Die unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung identifizierten therapeutischen Verbindungen können einem Patienten durch ein beliebiges geeignetes Verfahren für eine bestimmte Verbindung wie z. B. oral, intravenös, parenteral, transdermal, über die Schleimhaut oder durch Operation oder Implantation (z. B. wenn die Verbindung in Form einer festen oder einer halbfesten biologisch verträglichen und resorbierbaren Matrix vorliegt) an oder nahe der Stelle, an der die Wirkung der Verbindung gewünscht wird, verabreicht werden. Zum Beispiel kann eine Salbe oder ein transdermales Pflaster, die/das direkt auf die Haut aufgetragen werden kann, so dass eine ausreichende Menge der Verbindung absorbiert wird, verwendet werden, um die Gefäßbildung lokal zu steigern. Dieses Verfahren wäre sehr allgemein für Hautwunden anwendbar. Salben, welche die Verbindung enthalten, können örtlich angewendet werden, um die Bildung neuer Blutgefäße lokal zu induzieren, wodurch die Sauerstoffversorgung des Bereiches verbessert und die Wundheilung beschleunigt wird. Die therapeutischen Dosen werden durch Fachleute so bestimmt, dass sie geeignet sind.
Des Weiteren kann die Identifizierung von trans-aktiven Faktoren, die mit den regulatorischen Sequenzen der Erfindung in Wechselwirkung treten, die Grundlage für die Entwicklung neuer Therapeutika zur Modulierung von Zuständen bilden, die mit dem Wachstum von Endothelzellen assoziiert sind, wie z. B. die Angiogenese, Gefäßerkrankungen und die Wundheilung. Die Identifizierung von trans-aktiven Faktoren wird unter der Verwendung von Standardverfahren des Fachgebietes durchgeführt (vergleiche z. B. mit Sambrook, vorstehend, und Ausubel, vorstehend). Um zu bestimmen, ob ein Protein an die regulatorischen Sequenzen der Erfindung bindet, können Standard-DNA-Footprinting – und/oder native Gel-Shift-Analysen durchgeführt werden. Um den trans-aktiven Faktor zu identifizieren, der an die regulatorische Sequenz der Erfindung bindet, können die regulatorischen Sequenzen als Affinitätsreagenz bei Standard-Proteinreinigungsverfahren oder als Sonde für die Durchmusterung einer Expressions-Genbank verwendet werden. Nachdem der trans-aktive Faktor identifiziert ist, kann die Modulierung seiner Bindung an die regulatorische Sequenz im Flk-1-Gen vorgenommen werden, beginnend zum Beispiel mit der Durchmusterung auf Inhibitoren der Bindung des trans-aktiven Faktors. Die Verstärkung der Expression von Flk-1 in einem Patienten und somit die Verstärkung der Angiogenese können durch die Verabreichung des trans-aktiven Faktors oder des Gens, das ihn codiert (z. B. in einem Vektor für die Gentherapie), erreicht werden. Wenn die aktive Form des trans-aktiven Faktors ein Dimer ist, können darüber hinaus dominant-negative Mutanten des trans-aktiven Faktors hergestellt werden, um seine Aktivität zu hemmen. Des Weiteren können nach der Identifizierung des trans-aktiven Faktors weitere Komponenten des Flk-1-Signalübertragungsweges identifiziert werden. Dann kann die Modulierung der Aktivitäten dieser Komponenten in Angriff genommen werden, um weitere Arzneistoffe und Verfahren für die Modulierung des Endothelzellenwachstums und der Angiogenese zu entwickeln.
Wie im Hintergrundabschnitt der Beschreibung der vorliegenden Erfindung diskutiert wird, spielt die Wechselwirkung des VEGF mit seinem Rezeptor eine wichtige Rolle bei dem Beginn einer angiogenen Erkrankung. Transgene nicht-menschliche Tiere, die das VEGF- und/oder sein Rezeptor-Gen und/oder mutierte Versionen davon unter der Kontrolle der regulatorischen Sequenzen der Erfindung exprimieren, können nun für die Identifizierung von Stoffen verwendet werden, die zum Beispiel in der Lage sind, die Wildtyp-Wechselwirkung des mutierten VEGF und seines Rezeptors, von denen einer oder beide Mutationen tragen, wieder herzustellen. Einige genetische Veränderungen führen zu veränderten Konformationszuständen eines Proteins. Genetische Veränderungen können daher zu einer verminderten Bindungsaktivität des VEGF führen. Die Wiederherstellung der Aktivität eines mutierten VEGF-Proteins oder eine Steigerung der Aktivität anderer Proteine, die mit mutierten VEGF-Proteinen in Wechselwirkung treten, ist das eleganteste und spezifischste Mittel, um diese molekularen Defekte zu korrigieren. Darüber hinaus können einige genetische Veränderungen zu veränderten Konformationszuständen des Rezeptors führen. Dies wiederum könnte die Aktivität der Tyrosinkinase funktionell inaktivieren und sie unfähig zur Signalübertragung machen. Um die Funktion solcher mutierter Proteine wieder herzustellen, kann ein Antikörper verwendet werden, der an ein Epitop bindet und eine Konformationsänderung des Proteins induziert, wodurch die Wildtyp-Funktion wieder hergestellt wird. Daher sind die Verfahren der Erfindung auch nützlich, um z. B. Antikörper-, Fab-, Fv- oder scFv-Expressions-Genbanken zu durchmustern, in denen die DNA-Sequenz, die diese Antikörper oder Derivate davon codiert, sich unter der Kontrolle der regulatorischen Sequenz der Erfindung befindet. Für Fachleute ist natürlich offensichtlich, dass ebenfalls andere Protein- oder Peptid-Expressions-Genbanken unter der Verwendung der regulatorischen Sequenzen der Erfindung verwendet werden können.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung des rekombinanten DNA-Moleküls, des Vektors, der Zelle, der Arzneimittel, der diagnostischen Zusammensetzungen oder eines transgenen nicht-menschlichen Tiers der Erfindung für die Identifizierung eines chemischen und/oder eines biologischen Stoffes, der in der Lage ist, die Transkription, Expression und/oder die Aktivität von Genen und/oder ihrer Expressionsprodukte in Endothelzellen zu unterdrücken oder zu aktivieren und/oder zu verstärken.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird der chemische und/oder der biologische Stoff, der bei den Verfahren und Verwendungen der vorliegenden Erfindung angewendet wird, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Peptiden, Proteinen, Nucleinsäuren, Antikörpern, kleinen organischen Verbindungen, Hormonen, Neurotransmittern, Peptidomimetika und PNAs (Milner, Nature Medicine 1 (1995), 879–880; Hupp, Cell 83 (1995), 237–245; Gibbs, Cell 79 (1994), 193–198).
Die Beschreibung der vorliegenden Erfindung beschreibt weiterhin ein Verfahren zur Hemmung einer Gefäßerkrankung in einem Individuum, umfassend das Inkontaktbringen einer Arterie des Individuums mit dem rekombinanten DNA-Molekül oder dem Vektor der Erfindung, wobei das Protein die Entwicklung der Gefäßerkrankung vermindert oder verhindert, vorzugsweise vermindert dieses Protein die Vermehrung der glatten Muskelzellen.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines rekombinanten DNA-Moleküls, eines Vektors, eines Nucleinsäuremoleküls der Erfindung und/oder eines Stoffes, der durch ein Verfahren der Erfindung identifiziert wurde, für die Herstellung einer Zusammensetzung zur Steuerung und/oder zur Verhinderung der Expression von Genen spezifisch in Endothelzellen und/oder für die Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung, Verhinderung und/oder Verzögerung einer Gefäßerkrankung und/oder einer Tumorerkrankung in einem Individuum. Man nimmt an, dass die Hochregulierung und die Aktivierung des Flk-1-Rezeptors in den den Tumor umgebenden Endothelzellen an der Neubildung von Gefäßen in verschiedenen menschlichen oder experimentellen Tumoren beteiligt ist (Plate, 1994; Ferrara, Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 5 (1996), 35–44). Diese Hypothese wird durch Experimente gestützt, in denen die Hemmung der durch Flk-1 vermittelten Signalübertragung die Tumor-Angiogenese und das Tumorwachstum stark hemmt (Millauer, Nature 367 (1994), 576–579; Millauer, Cancer Res. 56 (1996), 1615–1620). Daher ist es durch die Verwendung von Verbindungen der vorliegenden Erfindung, die vorstehend beschrieben wurden und die in der Lage sind, die Flk-1-Genexpression zu hemmen, möglich, Tumorerkrankungen zu verbessern, die von der Expression des Flk-1-Gens abhängig sind.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines rekombinanten DNA-Moleküls, eines Vektors und/oder des Nucleinsäuremoleküls der Erfindung für die Herstellung eines Arzneimittels zur Induktion einer Gefäßerkrankung in einem nicht-menschlichen Tier oder in einem transgenen nicht-menschlichen Tier, wie vorstehend beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Verfahren und Anwendungen der Erfindung handelt es sich bei der Gefäßerkrankung um Atherosklerose und/oder um eine neuronale Störung. Weitere mögliche Verfahren und Anwendungen gemäß der vorliegenden Erfindung werden den Fachleuten offensichtlich sein und werden zum Beispiel in WO 95/13387, WO 94/11499 und in WO 97/00957 beschrieben.
Die rekombinanten DNA-Moleküle, Vektoren, Nucleinsäuremoleküle, Verbindungen, Anwendungen und Verfahren der Erfindung können für die Behandlung aller Arten von Störungen und Erkrankungen verwendet werden, von denen bislang nicht bekannt war, dass sie mit der Modulierung von Genen, die spezifisch im Endothel exprimiert werden, in Beziehung stehen oder davon abhängig sind. Die rekombinanten DNA-Moleküle, Vektoren, Nucleinsäuremoleküle, Verbindungen, Verfahren und Anwendungen der vorliegenden Erfindung können in gewünschter Weise beim Menschen angewendet werden, obwohl auch die Behandlung von Tieren durch die hierin beschriebenen Verfahren und Anwendungen mit eingeschlossen ist. Daher stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer regulatorischen Sequenz, wie vorstehend definiert, für die Verstärkung und/oder die Steuerung der Genexpression in Endothelzellen in einem beliebigen Organismus bereit.
Diese und andere Ausführungsformen werden durch die Beschreibung und die Beispiele der vorliegenden Erfindung offenbart und sind darin eingeschlossen. Weiterführende Literatur, die irgendeines der Verfahren, der Anwendungen und der Verbindungen betrifft, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können aus öffentlichen Bibliotheken zum Beispiel unter Verwendung elektronischer Geräte erhalten werden. Zum Beispiel kann die öffentliche Datenbank „Medline" verwendet werden, die über das Internet zugänglich ist, wie zum Beispiel unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. Weitere Datenbanken und Adressen wie z. B. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, http://www.infobiogen.fr/, http://www.fmi.ch/biology/research_tools.html, http://www.tigr.org/ sind den Fachleuten bekannt und können ebenfalls unter Verwendung von z. B. http://www.lycos.com erhalten werden. Eine Übersicht über Patentinformationen in der Biotechnologie und eine Übersicht relevanter Quellen für die Patentinformation, die für eine retrospektive Suche und für den derzeitigen Kenntnisstand nützlich sind, wird in Berks, TIBTECH 12 (1994), 352–364 gegeben.
Die Figuren zeigen:
1: Nucleotidsequenz des murinen Flk-1-Gens. Das ATG-Codon befindet sich an Position +299. Die drei Exons sind in Fettschrift angegeben. Motive für Transkriptionsfaktoren sind unterstrichen. VRE: vaskuläres Responseelement.
2: Karte des Reportergen-Konstrukts pGL2-B. Die Pfeile symbolisieren funktionelle Elemente. Luc: Luciferasegen, AMP: Ampicillin-Resistenzgen, f1ori: Replikationsursprung des Bakteriophagen f1.
3: Karte des Reportergen-Konstrukts pGLacZ. Die Pfeile symbolisieren funktionelle Elemente. LacZ: β-Galactosidasegen, AMP: Ampicillin-Resistenzgen, f1ori: Replikationsursprung des Bakteriophagen f1.
4: Teilstruktur und funktionelle Analyse des Maus-Flk-1-Locus. A) Restriktionsenzymkarte der Region, die die ersten drei Exons (dargestellt durch schraffierte Kästchen) umfasst. Subfragmente, die Teile des Introns 1 oder des Introns 2 enthalten, sind angezeigt. Die Abkürzungen für die Restriktionsenzyme sind: B, BamHI; Xh, XhoI; Sl, SalI. B) und C) Luciferase-Reportergen-Testansätze verschiedener Konstrukte nach einer transienten Transfektion von Rinderaorta-Endothelzellen. B) Transfektions-Testansatz der Intron-Fragmente in Kombination mit der Flk-1-Promotorregion zwischen Bp –640 bis Bp +299. Die Werte wurden mit dem 5'-In1-Fragment in Bezug auf die Aktivität des Konstrukts koordiniert. C) Die Intron-Fragmente wurden in Kombination mit einem 4,4 Kbp großen Flk-1-Promotorfragment getestet, das die Region von –4,1 kBp bis +299 Bp des Flk-1-Gens überspannt. Als Referenz für Nicht-Endothelzellen wurden NIH 3T3-Zellen verwendet. RLU, relative Lichteinheiten.
5: Analyse des Introns in transgenen Mäusen. Der Embryo (10,5 Tage) wurde über Nacht mit X-Gal angefärbt. Das Reportergen befand sich unter der Kontrolle des Intron-Enhancers (3'-In1, vergleiche mit 4A) und des Flk-1-Promotorfragments, das von den Nucleotiden –4100 bis +299 reicht. A) Seitenaufsicht. B) dorso-craniale Aufsicht.
6: Histologische Auswertung eines transgenen Embryos. Der in 5 gezeigte Embryo wurde in Paraffin eingebettet. Die Schnitte wurden mit Neutralrot angefärbt. A) Pseudo-transversaler Schnitt durch die Kopfregion. B) Vergrößerung eines Ausschnitts von A. C) Pseudo-transversaler Schnitt durch die Schwanzregion. 1: 4. Hirnventrikel, 2: Hörvesikel/Otocyte, 3: V. cardinalis anterior, 4: dritter Hirnventrikel, 5: Endhirnvesikel, 6: optisches Vesikel, 7: Ganglion trigeminale (V), 8: Chorda dorsalis.
7: Funktionelle Analyse der ersten beiden Introns des Flk-1-Gens in vivo. Der abgebildete Embryo (10,5 Tage) trägt das β-Galactosidasegen unter der Kontrolle des Flk-1-Promotors (–4,1 Kbp bis +299 Bp) und die ersten beiden 6,2 Kbp der transkribierten Region (vergleiche mit 4A). Die Färbung erfolgte, wie in 5 beschrieben.
8: In vivo-Charakterisierung des Intron-Enhancers in Kombination mit dem stärksten Promotorfragment. Alle drei Embryos tragen das β-Galactosidasegen unter der Kontrolle des Flk-1-Promotorfragments von Bp –640 bis Bp +299 und den Intron-Enhancer. Die Färbung erfolgte, wie in 5 beschrieben.
9: Detaillierte Analyse des linksseitigen Embryos aus 8. A) Linke Seitenansicht. B) Ausschnittvergrößerung von A. C) Rechte Seitenansicht.
10: Histologische Auswertung des in 9 abgebildeten Embryos. Der Embryo wurde in Paraffin eingebettet und in 10 μm dicke Scheiben zerschnitten. Die Schnitte wurden mit Neutralrot angefärbt. A) Pseudo-transversaler Schnitt durch die Kopfregion. B) Vergrößerung einer ähnlichen Schnittebene wie in A. C) Pseudo-transversaler Schnitt aus einer mehr caudal gelegenen Region. D) Pseudo-transversaler Schnitt aus der Thorax-Region. 1: 4. Hirnventrikel, 2: 3. Hirnventrikel, 3: Endhirnvesikel, 4: A. carotis interna, 5: Ganglion trigeminale (V), 6: V. cardinalis anterior, 7: Neuralrohr, 8: Ösophagus, 9: V. cardinalis posterior, 10: Aorta dorsalis, 11: Endocard des Herzvorhofs, 12: Gefäße des Myocards.
11: Reportergen-Analyse der regulatorischen Elemente des Flk-1-Gens in transgenen Mäuseembryonen. Das LacZ-Reportergen wurde mit regulatorischen Elementen fusioniert, die aus dem Maus-Flk-1-Gen stammten, und auf die Expression der β-Galactosidase in transgenen Mäuseembryonen hin untersucht. A) 10,5 Tage alter transgener Mausembryo, der lacZ unter der Kontrolle des 939 Bp großen Promotorfragments in Kombination mit dem 2,3 Kbp großen XhoI/BamHI-Fragment des ersten Introns exprimiert, das die Region von +1677 Bp bis zu +3947 Bp des Flk-1-Gens überspannt. Dieser Embryo stammte von einer Leihmutter. Die meisten, wenn nicht alle, sich entwickelnden Gefäßstrukturen zeigen eine Expression der β-Galactosidase, zum Beispiel das Endocard des Herzens, die dorsale Aorta, die intersomitischen Gefäße oder die Gefäße des sich entwickelnden Gehirns. B) 11,5 Tage alter Embryo einer transgenen Maus-Linie, die mit dem gleichen Konstrukt etabliert wurde. C) Ein 11,5 Tage alter Flk-1/lacZ-Knock-in-Embryo, in dem das lacZ-Gen am endogenen Flk-1-Locus exprimiert wird, zeigt eine sehr ähnliche Färbung. Man bemerke jedoch die Abwesenheit der Expression der β-Galactosidase in den kleinen Blutgefäßen des Dottersacks. D–F) Paraffin-Schnitte des durch die β-Galactosidase gefärbten Embryos aus (B) zeigen die Expression der β-Galactosidase in den paarig angeordneten dorsalen Aortae (D), einem Venengefäß, das mit dem Herz verbunden ist (E), und Kapillaren, die in das Neuralrohr eindringen (F). G) Expression der β-Galactosidase in einem transgenen Embryo, der den tk-Promotor in Kombination mit dem 2,3 Kbp großen XhoI/BamHI-Fragment des ersten Introns von Flk-1 enthält. H) Expression der β-Galactosidase in einem transgenen Embryo, der ein Konstrukt mit Flk-1-Promotorsequenzen (–640 Bp/+299 Bp) in Kombination mit dem 510 Bp großen SwaI/BamHI-Fragment des ersten Introns enthält, das die Region von +3437 Bp bis zu +3947 Bp des Flk-1-Gens überspannt. Die Balken in D) bis F) entsprechen 100 μm.
12: Nucleotidsequenz des Flk-1-Intron-Enhancers und mögliche Bindestellen für Transkriptionsfaktoren. Sequenzen, die mit bekannten Bindestellen von Transkriptionsfaktoren übereinstimmen, sind unterstrichen. Diese Sequenz wurde in der GeneBank-Datenbank hinterlegt (Hinterlegungs-Nummer AF061804).
13: Analyse der Expression des Transgens im Verlauf der frühen Entwicklung und in gerade geborenen Mäusen. Die transgene Maus-Linie 2603 exprimiert l unter der Kontrolle des Flk-1-Promotors (–640 Bp/+299 Bp) in Kombination mit dem 2,3 Kbp großen Flk-1-Intron-Enhancer. A) Frontalansicht auf ein Gesamtpräparat eines mit β-Galactosidase gefärbten 7,8 Tage alten Embryos. Der Pfeil zeigt die Expression des Transgens in dem extraembyonalen Mesoderm an. B) und C) Paraffin-Schnitte des in A gezeigten Embryos zeigen die Expression des Transgens in Endothelzellen der Allantois (B) und des Dottersackes (C) an. D–H, LacZ-Färbung der Milz (D), der Niere (E), der Lunge (F), der Leber (G) und des Thymus (H) in einer postnatalen, 5 Tage alten, transgenen Maus. EM: extraembryonales Mesoderm. Balken: 25 um (C), 100 μM (B, D, E, F, G, H).
14: Die 5'-UTR ist für die Expression des Flk-1-Gens in der Gefäßversorgung des Dottersacks erforderlich. Transgene Mäuseembryonen, die den Flk-1-Promotor und ein 5'-UTR (–640 Bp/+299 Bp)/Enhancer (+1677 Bp/+3947 Bp)-Reportergen-Konstrukt enthalten, zeigen eine vollständige vasculäre Expression in der Gefäßversorgung des Dottersackes (A und B). Im Gegensatz dazu zeigt der Dottersack von Flk-1/lacZ-Knock-in-Embryonen, denen ein Teil der 5'-UTR fehlt, eine Expression nur in den großen Sammelgefäßen, die mit dem Embryo in Verbindung stehen, aber nicht in den kleineren Gefäßen (C). Balken: 500 μM.
15: HIF-2α stimuliert die Flk-1-Genexpression. A293-Zellen wurden mit einem Reportergen-Konstrukt, das Flk-1-Promotorsequenzen von Bp –640 bis zu Bp +299 enthielt, und mit Expressionsvektoren, die die murinen HIF-1α- beziehungsweise HIF-2α-cDNAs codierten, cotransfiziert. Die relativen Promotoraktivitäten wurden, wie in Material und Methoden beschrieben, bestimmt. Die Promotoraktivität der Kontroll-Transfektion wurde willkürlich auf 1 festgesetzt.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1: Clonierung und Konstruktion von Flk-1-Intron/Reportergen-Vektoren
DNA-Clone, die die 5'-Region des Flk-1-Gens der Maus enthielten, wurden aus einer Genbank isoliert, die aus 129/SvJ-Mäusen im Vektor λDash II (Stratagene) (Rönicke, vorstehend) oder in λFIX II hergestellt worden war, oder sie wurden aus der P1-Genbank (Genome Systems, St. Louis) erhalten. Eine 21 Kb große Region des Maus-Flk-1-Gens, die in den DNA-Insertionen der beiden λ-Phagen 6 und 16 enthalten war und die etwa 15 Kb flankierender 5'-Sequenzen, die Exons 1, 2 und 3 und die Introns 1 und 2 umfasste, wurde durch Kartierung mit Restriktionsenzymen und Southern-Blot-Analyse charakterisiert. Kleinere DNA-Fragmente der Phagenclone wurden in die DNA des Vektors pBluescript (Stratagene) cloniert und für die weitere Charakterisierung verwendet. Die Sequenzierung wurde unter der Verwendung eines automatischen Sequenziergeräts (373A, Applied Biosystems) durchgeführt. Die Nucleotidsequenz des Flk-1-Intron-Enhancers wurde in der Genbank-Datenbank hinterlegt (Hinterlegungs-Nummer AF061804). Die Suche nach potenziellen Bindestellen für Transkriptionsfaktoren wurde mit der MatInspector-Software (Quandt, (1995) Nucl. Acids Res. 23, 4878–4884) durchgeführt.
Die DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 1) einer 12,8 Kb großen Region, die etwa die Position –6,660 Kb (relativ zur der Transkriptions-Startstelle) bis etwa die Position +6,135 Kb (die sich im dritten Exon befindet) überspannte, wurde bestimmt (1). 4A zeigt eine schematische Darstellung der ersten 6,5 Kbp der transkribierten Region des murinen Flk-1-Gens. Die Exons I, II und III sind als schraffierte Kästchen hervorgehoben. Das erste Intron, das eine Länge von 3,6 Kbp besitzt, wird in zwei Regionen (5'-In1 und 3'-In1) unterteilt. Die Region In-2 enthält das vollständige zweite Intron, das zweite Exon, das 3'-Ende des ersten Introns und einen Teil des dritten Exons. Diese Unterteilung in verschiedene Intron-Fragmente wurde bei den folgenden Analysen beibehalten. Die verwendeten Reportergen-Konstrukte wurden von dem Ausgangs-Vektor pGL2 (Promega) abgeleitet, der ein Luciferasegen ohne Promotor enthält. Die Luciferase-Reportergen-Konstrukte wurden für die Transfektion von Zellen in vitro erzeugt. Für die Verwendung in transgenen Mäusen in vivo wurden Plasmide verwendet, in denen das Luciferase-Reportergen durch das lacZ-Reportergen ersetzt worden war.
Um (Luciferase) Reportergen-Konstrukte zu erzeugen, wurden Flk-1-Promotorfragmente über PCR amplifiziert und in die pGL2-Vektor-DNA (Promega) 5' zu dem Luciferasegen cloniert, wie in Rönicke, vorstehend, beschrieben wurde; vergleiche auch mit 2. Die verwendeten stromaufwärts gelegenen Primer waren kurz gesagt:
–1900:

5'-GGG GTA CCG AAT TCT AAA TGG GGC GAT TAC C-3' (SEQ ID NO 2);

–640:

5'-GTG GTA CCC AAA CAC TCA ACA CCA CTG-3'(SEQ ID NO: 3);

–624:

5'-TCG GTA CCG ACC CAG CCA GGA AGT TC-3' (SEQ ID NO: 4); der stromabwärts gelegene Primer war:

+299:

5'-TTG CTA AGC TTC CTG CAC CTC GCG CTG GG-3' (SEQ ID NO: 5).

Um das Konstrukt zu erzeugen, das von –4100 bis +299 reichte, wurde ein HindIII-EcoRI-Fragment des rekombinanten Lambda-Phagen 6 aus der P1-Genbank (Genome Systems, St. Louis) in das Plasmid inseriert, das das von –1900 bis +299 reichende Fragment enthielt. Vektoren, die zusätzlich zu den Promotorsequenzen Flk-1-Intronsequenzen enthielten, wurden wie folgt erzeugt: spezifische Intron-Sequenzen wurden durch PCR aus der clonierten genomischen Flk-1-DNA amplifiziert und stromabwärts des Reportergens inseriert. Die für die Amplifikation verwendeten Primer waren:
5'-In1down:

5'-AGG GAT CCA CTC TTT AGT AGT AAG GCG-3' (Nucleotide 7036-7057 der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 6);

5'-In1up:

5'-ACC TCG AGA CTT GGA TGG CAC-3' (Nucleotide 8324-8342 der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7);

3'-In1down:

5'-GGG CTA TAA TTG GTG CCA TCC-3' (Nucleotide 8312-8332 der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8);

3'-In1up:

5'-GGA TGG AGA AAA TCG CCA GGC-3' (Nucleotide 10637-10658 der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9);

IN2A:

5'-GTG TGC ATT GTT TAT GGA AGG G-3' (Nucleotide 10571-10593 der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 10);

IN2B:

5'-CAT AGA CAT AAA CAG TGG AGG C-3' (Nucleotide 12849-12871, die Teil der cDNA-Sequenz sind, die durch Millauer (1993), vorstehend veröffentlicht wurde, SEQ ID NO: 11). Für die anschließenden Experimente wurde der in 3 dargestellte Vektor verwendet. Er stellt eine Modifikation des Ausgangs-Vektors pGL2 dar, in dem die entsprechenden Flk-1-Promotorfragmente in die KpnI- und die HindIII-Restriktionsstelle des Polylinkers inseriert sind (2). Darüber hinaus wurde das Luciferase-Reportergen durch das β-Galactosidasegen ausgetauscht (Schlaeger, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), 3058–3063). Zur Analyse des Introns wurden die Intron-Fragmente in die angezeigte BamHI- und die SalI-Restriktionsstelle cloniert. Die DNA-Manipulationen, die PCR-Amplifikation und die DNA-Sequenzierung wurden gemäß den herkömmlichen im Fachgebiet bekannten Verfahren durchgeführt, wie sie z. B. in Sambrook, vorstehend, und in: PCR Technology, Griffin und Griffin, Hrsg., RC Press, London (1994) beschrieben werden.

Beispiel 2: Funktionelle Analyse des Introns des Flk-1-Gens in vitro
4 zeigt das Ergebnis transienter Transfektionen in BAECs. Die entsprechenden Intron-Fragmente wurden mit einem Flk-1-Promotorfragment kombiniert, das die Nucleotide –640 bis +299 umfasste. Die Aktivität des Promotors wurde in Bezug auf die Promotoraktivität des Konstrukts standardisiert, das das 5'-In1-Fragment enthielt.
Die Gewebekultur und die transienten Transfektionen wurden wie folgt durchgeführt:
Alle Zellen wurden in DMEM+, das mit 10 % FCS (Sigma) ergänzt worden war, wie in Schaeger, 1997, beschrieben kultiviert, bEnd5-Zellen wurden durch Transformation mit dem Polyoma-Mittel-T-Onkogen erzeugt, wie vorher beschrieben wurde (Montesano, Cell 62 (1990), 435–445). Rinder-Aorta-Endothelzellen (BAECs) wurden, wie beschrieben, hergestellt (Schwartz, In Vitro 14 (1978), 966–980). NIH-3T3-, C2C12- und L-Zellen wurden von der ATCC bezogen. Die transienten Transfektionen wurden unter Verwendung des CaPO₄-Präzipitationsverfahrens gemäß Chen und Okayama (Mol. Cell Biol. 7 (1987), 2745–2752) durchgeführt, wahlweise mit den Modifikationen, die beschrieben wurden (Rönicke, 1996). Die Transfektionseffizienz wurden durch Cotransfektion mit einem β-Galactosidase-Reporter-Vektor überwacht.
Jedes Konstrukt wurde mindestens sechsmal in drei unabhängigen Experimenten transfiziert. Die Zellen wurden bis zu einer Konfluenz von 70 % in 6 cm-Schalen vor der Transfektion angezogen. Die Zellen wurden 16 Stunden nach der Zugabe des CaPO₄-Präzipitats gewaschen und weitere 48 Stunden inkubiert. Bei jedem Experiment wurden 6 μg Luciferase- und 1 μg pCMV5- (Rönicke, vorstehend) lacZ-Reportergen-Konstrukt verwendet. Die Zellen wurden 15 Minuten in 1 × Reporter-Lyse-Puffer (Promega) auf einem Testreagenzglas-Rotationsgerät lysiert. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand in ein frisches Reagenzgefäß überführt und bei –80°C aufbewahrt oder sofort für einen Luciferase- und einen lacZ-Testansatz eingesetzt. Reportergen-Testansätze auf die β-Galactosidase-Aktivität wurden gemäß Eustice (Biotechniques 11 (1991), 739–740) durchgeführt. Chlorphenolrot-β-D-galactopyranosid (CPRG) wurde als Substrat verwendet und die Umwandlung wurde bei 575 nm in einem ELISA-Lesegerät (Biometra) gemessen. Die Extrakte wurden verdünnt, um OD_575nm-Werte zwischen 0,2 und 0,8 zu erhalten. Diese Werte wurden verwendet, um die Transfektionseffizienz zu standardisieren, nachdem der Wert für den Hintergrund abgezogen worden war, der von einem Zellextrakt einer Transfektion ohne lacZ-Reporter-Plasmid, aber mit einem Luciferase-Reporter-Plasmid bestimmt worden war. Die Luciferase-Reportergen-Testansätze wurden mit den gleichen Extrakten durchgeführt, dies erfolgte, wie durch den Hersteller (Promega) beschrieben. Die Luciferase-Aktivität wurde mit einem Luminometer (LB96P, Berthold) gemessen und als Prozent der Aktivität des pGL2-Promotor-Plasmids (Promega) berechnet.
Tabelle I: Funktionelle Analyse des Introns des Flk-1-Gens. Die obere Zeile gibt das entsprechende Intron-Fragment an, das in Kombination mit dem Flk-1-Promotor (–640 Bp/+299 Bp) analysiert wurde.
4C zeigt die Ergebnisse eines anderen Transfektions-Testansatzes der Intron-Fragmente. Er wurde, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt, mit der Ausnahme, dass ein Flk-1-Promotorfragment verwendet wurde, welches die Region zwischen den Nucleotiden –4100 und +299 umfasste. Es wurde auch ein Fragment analysiert, das das vollständige erste Intron, das zweite Exon, das zweite Intron und einen Teil des dritten Exons enthielt, wie in 4A gezeigt.
Tabelle II: Funktionelle Analyse von Introns des Flk-1-Gens. Die obere Zeile gibt das entsprechende Intron-Fragment an, das in Kombination mit dem Flk-1-Promotor (–4100 Bp/+299 Bp) analysiert wurde.
Die Analyse dieses Experiments offenbarte, dass das Konstrukt mit der 3'-Region des ersten Introns in BAECs eine Aktivität aufwies, die das Doppelte desjenigen betrug, das die 5'-Region des ersten Introns enthielt. Es zeigte auch eine 85% höhere Aktivität als das Konstrukt mit dem zweiten Intron (p = 0,0153). Das 4,5 kBp längere Konstrukt In1+2, das auch die 3'-Region des ersten Introns enthielt, zeigte ebenfalls eine Aktivität, die in den BAECs deutlich höher war als in den 3T3-Zellen.
Die funktionelle Analyse der ersten 6,5 Kbp der transkribierten Region des murinen Flk-1-Gens führte zu der Identifizierung eines Endothel-spezifischen positiv-regulatorischen Elements. Diese regulatorische Sequenz befindet sich in der Region zwischen der XhoI- und der BamHI-Restriktionsstelle in dem ersten Intron des Flk-1-Gens (vergl. mit 4A). Sie ist in beiden Orientierungen funktionell, da das Intron in einer antiparallelen Weise in Bezug auf das Flk-1-Promotorfragment in dem Konstrukt, das als 3'-In1 bezeichnet wurde, verwendet wurde. Bei dem Konstrukt In1+2 wurde jedoch die ursprüngliche Orientierung beibehalten. Die Sequenzanalyse des Intron-Enhancers führte zu der Identifizierung von zwei potenziellen GATA-Bindestellen an den Positionen +1927 Bp und +3514 Bp; (Evans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 5976–5980; Orkin, Blood 80 (1992), 575–581), einer potenziellen AP-1-Bindestelle an der Position +2210 Bp; (Lee, Cell 49 (1987), 741–752) und zwei PEA3-Consensus-Sequenzen an den Positionen +3494 Bp und +3741 Bp; (Martin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 5839–5843).
Beispiel 3: Funktionelle Charakterisierung des Flk-1-Promotors in vivo.
Bislang waren die Analysen des murinen Flk-1-Promotors auf in vitro-Systeme beschränkt (Rönicke, vorstehend; Patterson, vorstehend). Die Untersuchung der Promotoraktivität in vitro ist ein wichtiges Hilfsmittel bei der Charakterisierung eines Promotors, da sie verwendet werden kann, um eine große Zahl an Promotorkonstrukten auf ihre Aktivität in einer kurzen Zeit zu untersuchen. Dies ist jedoch immer eine künstliche Situation, weil nicht alle Faktoren, die in vivo von Bedeutung sind, in vitro rekonstituiert werden können. Obwohl die in vitro-Untersuchung eines Promotors wichtige Informationen über die Mechanismen der Genregulation liefert, ist es nur die in vivo-Charakterisierung, die den endgültigen Beweis für die Bedeutung der identifizierten Elemente lieferen kann. Ein ausgezeichnetes Testsystem für die Promotoranalyse in vivo sind transgene Mäuse. In diesem Modell wurde das entsprechende Promotorfragment vor ein Reportergen cloniert, zusammen mit diesem Reportergen isoliert und befruchteten Maus-Oocyten injiziert. In vielen Fällen führt die erfolgreiche Integration des Promotor-Reporter-Konstrukts in das Mausgenom zu transgenen Mäusen, die das Konstrukt in jeder Zelle enthalten. Dieses Testsystem erlaubt neben der Analyse der Promotoraktivität im Verlaufe der Embryonalentwicklung und in dem adulten Tier auch eine gewebsspezifische Charakterisierung der Promotoraktivität.
Für die Untersuchung des Flk-1-Promotors in transgenen Mäusen wurde das bakterielle β-Galactosidase-Reportergen gewählt, da das Genprodukt durch eine Farbreaktion leicht nachweisbar ist und aufgrund seiner begrenzten Löslichkeit am Ort der Herstellung verbleibt. Auf diese Weise ist es möglich, Zellen zu identifizieren, in denen das entsprechende Flk-1-Promotorfragment, da nur hier eine Expression der β-Galactosidase stattfand.
Bei der Herstellung der transgenen Mäuse wurde darauf geachtet, dass keine Regionen, die aus dem Vektor stammten, zusammen mit dem Promotor injiziert wurden. Zuerst wurden die Flk-1-Promotorfragmente untersucht, die die Regionen zwischen den Nucleotiden –640 und +299, –1900 und +299 sowie –4100 und +299 umfassten. Die Konstrukte basierten auf dem Plasmid pGL2-B, das in 2 beschrieben wird, mit der Ausnahme, dass das Luciferase-Reportergen durch das β-Galactosidase-Gen ersetzt wurde. Alle Fragmente zur Injektion, die in den Beispielen verwendet wurden, wurden durch Restriktionsverdau mit den Enzymen KpnI und SalI erhalten. Die transgenen Mäuse wurden, wie beschrieben, erzeugt (Hogan, Manipulating the Mouse Embryo (1994), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Die befruchteten Oocyten wurden aus superovulierten C57BL/6 × C3H/He-F1-Mäusen isoliert, mikroinjiziert und in scheinschwangere Weibchen des gleichen Hybrid-Maus-Stammes reimplantiert. Die Mäuse wurden am Tag 10,5 oder 11,5 der Schwangerschaft geopfert, und die Embryonen wurden durch LacZ-Färbung des Gesamtpräparats auf die Expression des Transgens hin untersucht. Die Embryonen, die untersucht werden sollten, wurden am Tag 10 nach der Reimplantation der injizierten Oocyten isoliert. Die Analyse der transgenen Embryonen offenbarte, dass, obwohl eine Promotoraktivität nachgewiesen werden konnte, keines der Konstrukte in der Lage war, dem Reportergen im Endothel eine reproduzierbare Expression zu verleihen.
Beispiel 4: Funktionelle Charakterisierung des Flk-1-Introns in vivo.
Nach der Analyse der Flk-1-Promotorregion von –4,1 Kbp bis zu +299 Bp wurde das Intron, das in vitro identifiziert worden war, auf seine Funktion in vivo hin untersucht. Zu diesem Zweck wurde ein Konstrukt ähnlich demjenigen, das in 3 gezeigt wird, verwendet, wobei das Konstrukt ein Flk-1-Promotorfragment, welches von dem Nucleotid –4100 bis zu dem Basenpaar +299 reichte, und den Intron-Enhancer (3'-In1, vergl. 4A) enthielt. Die Anfärbung und die Fixierung der Embryonen wurde wie folgt durchgeführt: Der Mittag der Plug-Beobachtung wurde als E0,5 gezählt. Die Embryonen wurden präpariert und in eiskaltes PBS überführt und 15 bis 120 Minuten in eiskaltem 2 %-igem (Gew./Vol.) Paraformaldehyd, 2 mM MgCl₂, 2 mM EGTA, 0,1 M Pipes-Puffer, pH 6,9, fixiert. Die Embryonen wurden dreimal jeweils 5 Minuten mit PBS gespült. Die Expression von LacZ wurde durch Inkubation der Embryonen bei 30°C über Nacht in 0,1 % X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid), 5 mM Kaliumferricyanid, 5 mM Kaliumferrocyanid, 1 bis 2 mM Magnesiumchlorid, 0,002 bis 0,02 % NP-40, 0,01 % oder 0,25 mM Natriumdesoxycholat, PBS, pH 7,0 nachgewiesen. Nach der Färbung wurden die Embryonen mit PBS abgespült und bei 4°C über Nacht in 2 % Paraformaldehyd, 0,1% Glutaraldehyd, PBS, pH 7,0 nachfixiert. Zur Fotographie des Gesamtpräparats wurden die nachfixierten Embryonen in PBS gespült und in jeweils 3 Minuten (wahlweise 30 %) 50 % Glycerin und dann in 70 % Glycerin äquilibriert. 5 zeigt einen Embryo (Embryonen-Tag 10,5), der nach der Injektion des Fragments isoliert worden war. In 5A kann eine Farbreaktion in den Gefäßen des sich entwickelnden Gehirns deutlich erkannt werden. Auch die Oberflächen-Gefäße in der Körpermitte (dorsal) und eine Färbung der Leber-Anlage kann beobachtet werden. 5B zeigt die dorsale, caudate Region des gleichen Embryos. Sie beweist, dass die Gefäße in beiden Hälften des Kopfes angefärbt waren.
Für die genaue Lokalisierung der gefärbten Zellen wurde der Embryo in Paraffin eingebettet, in Scheiben von 10 μM Dicke geschnitten und mit Neutralrot gegengefärbt. Die Anfertigung der Schnitte mit einem Cryostaten und die LacZ-Färbung von Organen der postnatalen Mäuse wurde, wie beschrieben, durchgeführt (Schlaeger, 1997).
Die Ergebnisse der histologischen Analyse werden in 6 gezeigt. Sie zeigt pseudotransversale Schnitte des Embryos. In Schnitt 6A kann eine Anfärbung der inneren Auskleidung der V. cardinalis anterior (3) und anderer Oberflächen-Gefäße beobachtet werden. 6B stellt eine starke Vergrößerung eines Ausschnitts von 6A mit einer Anfärbung der Endothelzellen innerhalb der V. cardinalis anterior dar. 6C zeigt eine mehr caudal liegende Region. Wiederum ist die Anfärbung der V. cardinalis anterior und der Oberflächen-Gefäße mit weitem Lumen und dünnen Wänden sowie der Gefäßstrukturen im Neuralrohr deutlich sichtbar. Es kann auch eine Färbung der Chorda dorsalis (9) beobachtet werden. In keinem der Fälle konnte jedoch eine Färbung der arteriellen Gefäße beobachtet werden.
Die anschließende Injektion des gleichen Fragments führte zu insgesamt acht weiteren transgenen Embryonen, die ein identisches Expressionsmuster zeigten, obwohl in zwei Fällen von schwächerer Natur. Somit zeigte der Intron-Enhancer eine Wirkung in vivo, die noch deutlicher ausfiel als in vitro. In Kombination mit einem Promotorfragment, das für sich selbst ein sehr variables Expressionsmuster aufwies, sichert er ein reproduzierbares Expressionsmuster mit klarer Spezifität für das Endothel, das jedoch einen wesentlichen Teil des endogenen Flk-1-Expressionsmusters abdeckt.
Beispiel 5: Funktionelle Analyse der Introns I und II des murinen Flk-1-Gens in vivo.
Da der Intron-Enhancer in Kombination mit einem Flk-1-Promotorfragment eine Endothel-spezifische Funktion in transgenen Mäusen zeigte, die einen wesentlichen Teil des endogenen Expressionsmusters abdeckt, wurde die weitere Suche nach in vivo relevanten, Gen-regulatorischen Elementen auf andere Intron-Regionen ausgedehnt. Für diesen Zweck wurde das Konstrukt verwendet, das die Promotorregion zwischen den Nucleotiden –4100 bis +299 und die ersten 6,5 Kbp der transkribierten Region (In1+2, vergl. mit 4) enthielt. 7 zeigt einen Embryo am Embryonen-Tag 10,5, der nach der Injektion dieses Fragments erhalten wurde. Wiederum war eine Färbung der Gefäße in dem sich entwickelnden Gehirn sowie in den Oberflächen-Gefäßen der Leber-Anlage sichtbar. Die folgenden Injektionen lieferten vier weitere transgene Embryonen, die das gleiche Muster aufwiesen. Eine Kombination der verwendeten Promotorregion mit nur dem 5'-Ende des ersten Introns (5'-In1; vergl. mit 4A) führte jedoch zu keinem Endothel-spezifischen Expressionsmuster.
Beispiel 6: Kombination des Intron-Enhancers mit dem Flk-1-Promotorfragment, das in vitro am stärksten aktiv war.
Um zu untersuchen, ob die unterdrückenden Elemente des murinen Flk-1-Promotors zwischen den Nucleotiden –4100 und –640 ebenfalls in Kombination mit dem Intron-Enhancer funktionell sind, wurde ein kürzeres Konstrukt ohne diese hemmenden Regionen für die weitere Analyse verwendet. Es enthielt den Intron-Enhancer (3'-In1) und die 5'-Region von dem Basenpaar-640 bis zu dem Nucleotid +299. Diese 5'-Region wies in vitro die höchste Aktivität auf. 8 zeigt drei transgene Embryonen (Embryonen-Tag 10,5), die nach der Injektion des Fragments erhalten wurden. Alle drei weisen eine deutlichere Anfärbung der Gefäßstrukturen als die bislang analysierten Embryonen auf. Während der Embryo auf der rechten Seite eine schwache Färbung zeigt, weist der linksseitige Embryo eine sehr starke Expression in praktisch allen Gefäßen auf. Der Embryo in der Mitte besitzt eine mittlere Stellung hinsichtlich der Vollständigkeit seines Expressionsmusters, d. h. ihm fehlt die Expression im Herzen, obwohl er ansonsten dem Embryo auf der linken Seite im Hinblick auf die Anfärbung der anderen Strukturen stark ähnelt. In 9A wird der linksseitige Embryo aus 8 stärker im Detail gezeigt. Die starke Färbung des Herzens in der Region des Atriums und des Ventrikels ist besonders deutlich sichtbar. Des Weiteren sind die Gefäße des sich entwickelnden Gehirns, die Gefäße zwischen den Somiten, die Aorta dorsalis sowie der feine kapillare Plexus an der Körperoberfläche gefärbt. 9B zeigt eine Ausschnittvergrößerung von 9A. Hier ist die Färbung der Gefäße in der Kopfregion sowie die Expression in dem kapillaren Plexus der Oberfläche sichtbar. In 9C wird der gleiche Embryo von der anderen Seite gezeigt. Neben den Strukturen, die für 9A beschrieben werden, kann auch eine Färbung der Chorda dorsalis beobachtet werden.
Der in 9 gezeigte Embryo wurde in Paraffin eingebettet und in Scheiben geschnitten. Die mit Neutralrot gefärbten Schnitte werden in 10. gezeigt. 10A zeigt einen pseudo-transversalen Schnitt durch die Kopfregion. Besonders deutlich hervortretend ist die Verzweigung der A. carotis interna (4) neben der Färbung der anderen Gefäßstrukturen. 10B stellt eine Vergrößerung eines ähnlichen Schnitts dar; auch hier ist die Verzweigung der A. carotis interna besonders bemerkenswert. 10C zeigt einen mehr caudal gelegenen Schnitt, der hinsichtlich seiner Position in etwa dem in 6A gezeigten Schnitt entspricht. Hier ist jedoch neben der Färbung der V. cardinalis anterior (6) eine Expression in der Verzweigung der A. carotis interna (4) und in anderen Gefäßstrukturen sichtbar.
10D stellt eine noch weiter caudal gelegene Region dar. Es kann eine Färbung des venösen Endothels (V. cardinalis posterior, 9) und in den arteriellen Strukturen (Aorta dorsalis) beobachtet werden. Des Weiteren zeigen das Endocard des Atriums sowie die Gefäße in den Trabekeln der Herzventrikel eine Expression.
Insgesamt wurden sieben transgene Embryonen nach der Injektion dieses Fragments (–640 Bp/+299 Bp/3'-In1) analysiert. Bis auf einen, der keine Färbung zeigte, wiesen alle Embryonen eine Expression der β-Galactosidase in den Endothel-Strukturen auf. Die Färbung war regelmäßig stärker ausgeprägt als bei der Kombination mit den negativ-regulierenden Elementen zwischen den Nucleotiden –4100 und –640. Somit zeigten die in vitro identifizierten Regionen eine Funktion in vivo. Die Deletion dieser negativ-regulierenden Elemente lieferte ein Konstrukt, das zu einer reproduzierbaren Expression im venösen und arteriellen Endothel führte.
Beispiel 7: Endothel-spezifische Expression, die durch regulatorische Sequenzen von Flk-1 in vivo vermittelt wird
Wenn das Flk-1-Promotorfragment mit der stärksten in vitro-Aktivität (–640 Bp/+299 Bp; Rönicke, vorstehend) in Kombination mit dem 2,3 Kbp großen XhoI/BamHI-Fragment des ersten Introns, das eine Endothel-spezifische Aktivität in vitro zeigte (3'-In1; +1677 Bp/+3947 Bp; vergleiche mit Beispiel 6), untersucht wurde, wurde eine reproduzierbare vasculäre Expression von lacZ in transgenen E10,5-Mäuse-Embryonen, die von Leihmüttern stammten, beobachtet (Tabelle III). Bei diesen Embryonen wurde das lacZ-Reportergen in den sich entwickelnden Gefäßstrukturen exprimiert, wie z. B. in den Kapillaren der Kopfregion, den intersomitischen Gefäßen, der dorsalen Aorta und in der Herzanlage (11A). Schnitte dieser Embryonen bestätigten, dass das β-Galactosidase-Protein auf das vasculäre Endothel beschränkt war. Diese in vivo-Analyse zeigte, dass die Intron-Sequenzen in Kombination mit dem Flk-1-Promotor ein Endothel-spezifisches Expressionsmuster verleihen, das dem Expressionsmuster des endogenen Flk-1-Gens (Millauer, 1993) sehr ähnlich ist. Darüber hinaus konnte das Intron-Fragment auch die Endothelzellen-spezifische Expression von lacZ steuern, wenn es in einer umgekehrten Orientierung in dem Reporterkonstrukt (Konstrukt –640 Bp/+299 Bp//+3947 Bp/+1677 Bp; vergleiche mit Tabelle III) verwendet wurde.
Tabelle III. Zusammenfassung der in vivo-Aktivitäten unterschiedlicher Flk-1-Konstrukte
Es wurden Embryonen erzeugt, die für die vorstehend angeführten Konstrukte transgen waren, und die Anfärbung mit LacZ und die Bestimmung des Genotyps wurde zu E10,5 oder E11,5 wie in Beispiel 4 beschrieben, durchgeführt. Die Konstrukte werden durch die Position des Promotors oder des Intron-Fragments in Bp relativ zu der Transkriptions-Initiationsstelle des endogenen Flk-1-Gens definiert. TG, Anzahl transgener Embryonen; ES, Zahl an Embryonen, die eine Endothel-spezifische Färbung zeigten; ET, Zahl an Embryonen, die eine ektopische Färbung zeigten; NO, Zahl an Embryonen, die keine Färbung zeigten.
Es wurden transgene Mauslinien, mit diesem Reportergen-Konstrukt (–640 Bp/+299 Bp//+1677 Bp/+3947 Bp) erzeugt, das die regulatorischen Sequenzen von Flk-1 enthielt. Eine dieser Linien (2603) zeigte eine vollständige vasculäre Expression des Reportergens an E11,5 und wurde weiter analysiert (11B). Schnitte der mit β-Galactosidase gefärbten transgenen E11,5-Embryonen offenbarten, dass die Expression des Reportergens auf das Endothel der Blutgefäße beschränkt war, z. B. im Endothel der dorsalen Aorta (11D), in den venösen Gefäßen (11E) und in dem perineuralen vasculären Plexus und den wachsenden Kapillaren, die in das Neuralrohr eindrangen (11F). Um zu bestimmen, ob die Expression des Transgens in dieser Mauslinie das vollständige Expressionsmuster des endogenen Flk-1-Gens reproduzierte, wurde das lacZ-Färbemuster dieser Embryonen mit dem von heterozygoten mutierten Flk-1-Mäuseembryonen verglichen, die das lacZ-Gen am endogenen F/k-1-Locus exprimierten (Shalaby, Nature 376 (1995), 62–66). Bei diesen Knock-in-Mäusen wurde das LacZ-Gen in den endogenen Flk-1-Locus über homologe Rekombination inseriert, und daher erwartet man von ihm, dass es das Expressionsmuster des endogenen Flk-1-Gens reproduziert (Shalaby, 1995). Das lacZ-Färbemuster der transgenen Embryonen und der Knock-in-Embryonen an E11,5 unterschied sich nicht (11B, C). Aus diesen Daten wird gefolgert, dass die –640 Bp/+299 Bp-Promotorregion des Flk-1-Gens und das 2,3 Kbp große XhoI/BamHI-Fragment des ersten Introns regulatorische Elemente enthalten, die für die Endothel-spezifische Genexpression in sich entwickelnden Mäuseembryonen ausreichend sind.
Beispiel 8: Das erste Intron des Flk-1-Gens enthält einen autonomen Endothel-spezifischen Enhancer
Um die Rolle des 2,3 Kbp großen XhoI/BamHI-Fragments des ersten Flk-1-Introns bei der Endothel-spezifischen Genexpression zu untersuchen, wurde weiterhin untersucht, ob die Intron-Sequenzen dem heterologen Thymidinkinase (tk)-Promotor des Herpes-Simplex-Virus eine Endothel-spezifische Expression verleihen können. Dieser Promotor besitzt keine intrinsische Spezifität für Endothelzellen (Schlaeger, 1997). Es wurde ein lacZ-Reportergen-Konstrukt erzeugt, das den tk-Promotor in Kombination mit dem 2,3 Kbp großen BamHI/XhoI-Fragment des ersten Introns (+1677 Bp/+3947 Bp) enthielt. Die tk-Promotor-Sequenzen wurden aus dem Plasmid ptkSDKlacZ (Schlaeger, 1997) unter Verwendung der Oligonucleotide
tk5':

5'-CCGGTACCCAAACCCCGCCCAGCGTCTTG-3'; SEQ ID NO: 16 und

tk3':

5'-CCGACAAGCTTGGTCGCTCGGTGTTCGAGG-3; SEQ ID NO: 17 amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit KpnI und HindIII verdaut.

Aus dem β-Galactosidase-Reporterkonstrukt, das in Beispiel 2 (2) beschrieben wurde, wurden die Flk-1-Promotorsequenzen durch Verdau mit KpnI und HindIII herausgeschnitten und entfernt. Dann wurde der tk-Promotor in die KpnI- und die HindIII-Restriktionsstellen des Vektors subcloniert. Transgene Mausembryonen, die mit diesem Konstrukt erzeugt wurden, zeigten eine vasculäre Expression des Reportergens (11G). Die in diesen Embryonen beobachtete β-Galactosidase-Färbung war schwächer als in Embryonen, die lacZ unter der Kontrolle des –640 Bp/+299 Bp-Flk-1-Promotors in Kombination mit dem Intron-Fragment exprimierten (11A, B). Auch die Häufigkeit transgener Mausembryonen, die dieses Transgen exprimierten, war deutlich vermindert, wenn sie mit den Konstrukten verglichen wurde, die durch den –640 Bp/+299 Bp-Flk-1-Promotor in Kombination mit dem Intron-Fragment gesteuert wurden (Tabelle III). Dies deutet an, dass dem tk-Promotor positiv wirkende Elemente fehlen, die innerhalb des Flk-1-Promotors vorhanden sind. Diese Ergebnisse zeigen jedoch, dass das Flk-1-Intron-Fragment alleine, im Gegensatz zu dem Flk-1-Promotor, die Expression eines Reportergens im Endothel in reproduzierbarer Weise gezielt steuern kann. Zusammen genommen zeigen sowohl die Ergebnisse der in vitro- als auch der in vivo-Experimente in dieser Untersuchung, dass Sequenzen, die im ersten Intron des Maus-Flk-1-Gens lokalisiert sind, als ein autonomer Endothel-spezifischer Enhancer wirken.
Um die minimalen Intron-Sequenzen, die für eine Endothel-spezifische Expression erforderlich sind, weiter zu charakterisieren, untersuchten wir, ob kürzere Intron-Fragmente in Kombination mit der 939 Bp großen Promotorregion des Flk-1-Gens (–640 Bp/+299 Bp) ebenfalls aktiv sind. Durch diese Deletionsanalyse wurde der Intron-Enhancer in einem 510 Bp großen SwaI/BamHI-Fragment (+3437 Bp/+3947 Bp) lokalisiert, das sich unmittelbar stromaufwärts des zweiten Exons befindet. Dieses Fragment reichte aus, um die Endothel-spezifische lacZ-Expression in transgenen Mäuseembryonen zu stimulieren (11H, Tabelle III). Die DNA-Sequenz dieses Fragments (12) enthält potenzielle Bindestellen für GATA- und Ets-Transkriptionsfaktoren und für Scl/Tal-1, von denen allen angenommen wird, dass sie eine Rolle bei der Angiogenese spielen (Übersichtsartikel von Risau, Nature 386 (1997), 671–674). Ob diese Consensus-Sequenzen funktionelle Bindestellen für Transkriptionsfaktoren darstellen, muss noch bestimmt werden.
Beispiel 9: Regulatorische Sequenzen von Flk-1 steuern gezielt die Endothel-spezifische Expression eines Transgens im Laufe der Entwicklung
Um zu untersuchen, ob die regulatorischen Sequenzen des Flk-1-Promotors und des identifizierten Enhancers das endogene Flk-1-Expressionsmuster über den ganzen Verlauf der Entwicklung reproduzieren können, wurde das lacZ-Expressionsmuster der transgenen Maus-Linie 2603 (11B) in verschiedenen Stadien der Embryonalentwicklung und an den postnatalen Tagen 5 (P5) und 120 (P120) weiter analysiert. In dieser Maus-Linie wird die Transkription von lacZ durch eine Kombination des –640 Bp/+299 Bp-Flk-1-Promotors und des 2,3 Kbp großen BamHI/XhoI-Intron-Enhancer-Fragments gesteuert. Das früheste Stadium, während dessen die Expression des Transgens durch LacZ-Anfärbung des Gesamtpräparats nachweisbar war, war in E7,8-Embryonen (13A). Dies ist das früheste Stadium, das untersucht wurde. Die Analyse der Schnitte dieser Embryonen bestätigte, dass das Transgen in den Angioblasten der Allantois und des Dottersackes exprimiert wurde (13B, C). Darüber hinaus war die Expression des Transgens auf das vasculäre Endothel bei allen untersuchten Stadien der Embryonalentwicklung beschränkt. Um zu bestimmen, ob die Expression des Transgens nach der Geburt weiterhin besteht, führten wir eine lacZ-Färbung von Cryostat-Schnitten aus mehreren unterschiedlichen Organen von transgenen P5- und P120-Mäusen durch. Eine starke LacZ-Färbung wurde in den Gefäßen der Milz, der Niere, des Thymus, der Leber und der Lunge von P5-Tieren nachgewiesen (13D–H). Die lacZ-Expression war jedoch in den meisten Gefäßanlagen von P120-Tieren herunter reguliert, wie dies auch für das endogene Flk-1 der Fall ist (Millauer, 1993; Kremer, Cancer Res. 57 (1997), 3852–3859). Zusammengefaßt stützen diese Ergebnisse die Schlussfolgerung, dass die identifizierten regulatorischen Sequenzen von Flk-1 (der 939 Bp große Promotor in Kombination mit dem Intron-Enhancer) ausreichen, um die meisten, wenn nicht alle, Eigenschaften der endogenen Flk-1-Expression zu reproduzieren.
Beispiel 10: Die 5'-UTR des Flk-1-Gens ist für die Expression von Flk-1 in der Gefäßversorgung des Dottersackes erforderlich
sIn Flk-1/lacZ-Knock-in-Embryonen steht das lacZ-Gen unter der Kontrolle aller endogenen regulatorischen Elemente mit Ausnahme der Region von Bp +137 bis Bp +299 in der 5'-UTR und etwa den ersten 600 Bp des ersten Introns (Shalaby, 1995). Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde gezeigt, dass die Intron-Sequenzen, die in dem Knock-in-Konstrukt deletiert waren, das durch Shalaby (1995) erzeugt worden war, nicht erforderlich sind, um die starke und vollständige Endothel-spezifische Expression des Reportergens zu erzeugen, die durch die regulatorischen Sequenzen von Flk-1 vermittelt werden, die in dieser Studie beschrieben werden (11B und Tabelle III). Da jedoch die komplette 5'-UTR von Flk-1 in dem Reportergen-Konstrukt vorhanden ist, das die vollständigste Gefäß-spezifische lacZ-Expression steuert (–640 Bp/+299 Bp//+1677 Bp/+3947 Bp; 11B und Tabelle III), erlaubt es die Folgen einer teilweisen Deletion der 5'-UTR auf die Expression von Flk-1 in vivo zu untersuchen. Die genomische DNA wurde aus nicht angefärbten Embryonen oder Dottersäcken hergestellt. Die Bestimmung des Genotyps erfolgte durch PCR-Analyse unter Verwendung der Primerpaare –258fw/LacRev oder LacZP1/LacZP2. Die Primer für die PCR-Analyse waren:
–258fw:

5'-ATGGTACCCAGGTTGCTGGGGGCAG-3' (SEQ ID NO: 12);

LacRev:

5'-TGGTGCCGGAAACCAGGCAAA-3' (SEQ ID NO: 13);

LacZP1:

5'-ATCCTCTGCATGGTCAGGTC-3' (SEQ ID NO: 14);

LacZP2:

5'-CGTGGCCTGATTCATTCC-3' (SEQ ID NO: 15).

Die vollständige Anfärbung der Gefäße der Flk-1/lacZ-Knock-in-Embryonen zum Zeitpunkt E11,5 zeigt an, dass die 5'-UTR für die vasculäre Expression in dem eigentlichen Embryo nicht essentiell ist. Das Färbemuster des Dottersackes der Flk-9/lacZ-Knock-in-Embryonen und der transgenen Mäuse aus dieser Studie, die Konstrukte trugen, welche die vollständige 5'-UTR enthielten, war jedoch deutlich unterschiedlich (14A–C). Die einheitliche vasculäre lacZ-Expression in den transgenen Dottersäcken aus dieser Studie (14A, B) war in den kleinen Gefäßen der Dottersäcke der Knock-in-Embryonen nicht vorhanden (14C), in denen nur die großen Dottersack-Gefäße angefärbt waren. Darüber hinaus wurde heraus gefunden, dass der Austausch des vollständigen Flk-1-Promotors einschließlich der 5'-UTR durch den tk-Promotor in dem vorliegenden transgenen Konstrukt (Tabelle III) zu einem ähnlichen lacZ-Expressionsmuster in den Dottersäcken führte, wie dasjenige, das für die Dottersäcke der Flk-1/lacZ-Knock-in-Embryonen beschrieben wurde. Daher könnte die 5'-UTR an der Spezifizierung der Expression von Flk-1 in einer Untergruppe von Endothelzellen beteiligt sein.
Beispiel 11: Die Rolle von HIF-2α bei der Regulation von Flk-1
Der Flk-1-Promotor (–640 Bp/+299 Bp) verleiht dem Glühwürmchen-Luciferase-Reportergen in transfizierten Endothelzellen der Rinderaorta eine Endothel-spezifische Expression (Rönicke, 1996) und stellt eine starke Transkription des Reportergens in vivo bereit; vergleiche mit den Beispielen 6 und 10. Dies legt nahe, dass Transkriptionsfaktoren, die spezifisch in Endothelzellen exprimiert werden, den Flk-1-Promotor in einer Zelltyp-spezifischen Weise aktivieren.
Der basische Helix-Schleife-Helix-Transkriptionsfaktor mit PAS-Domäne HIF-2α (auch als HLF, HRF oder EPAS1 bekannt) wird in Endothelzellen im Verlauf der Embryonalentwicklung der Maus exprimiert (Ema, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 4273–4278, 1997; Flamme, Mech. Dev. 63 (1997), 51–60; Tian, Genes Dev. 11 (1997), 72–82) und stellt somit einen Kandidaten für die Regulation der Expression von Flk-1 dar. Von HIF-2α wurde vor Kurzem gezeigt, dass er sowohl die Expression von VEGF (Ema, 1997) als auch von Tie2 (Tian, 1997) stimulieren kann. Um zu bestimmen, ob HIF-2α an der Regulation der Flk-1-Genexpression beteiligt ist, wurden A293-Zellen mit einem Luciferase-Reportergen-Konstrukt, das Flk-1-Promotorsequenzen (–640 Bp bis +299 Bp) enthielt, und einem eukaryontischen Expressionsvektor, der die Maus-HIF-2α-cDNA enthielt, cotransfiziert. Die Maus-HIF-2α- und HIF-1α-cDNAs wurden aus einer cDNA-Genbank von Endothelzellen aus Maus-Hirnkapillaren (Schnürch, Development 119 (1993), 957–968) mit einem 300 Bp großen BamHI/NcoI-Fragments erhalten, das die 5'-UTR von HIF-1α überspannte. Positive Phagen wurden erneut durchmustert und die Insertionen wurden durch PCR unter Verwendung der folgenden Oligonucleotide amplifiziert:
HIF Start:

5'-GGGAATTCACCATG AGTTCTGAACGTCGAAAAG-3'; SEQ ID NO: 18 und

HIF Flag Stop:

5'- AAGCGGCCGCTCATTTATCGTCATCGTCCTTGTAATCGTTAACTTGATCCAAAG CTCTG-3'; SEQ ID NO: 19

Das PCR-Produkt wurde mit EcoRI und NotI verdaut und in die EcoRI- und die NotI-Restriktionsstelle des Expressionsvektors pcDNA3 subcloniert. Die murine HIF-2α-cDNA wurde, wie beschrieben, erhalten (Flamme, 1997). Die Phagen-Insertion wurde durch PCR unter Verwendung der folgenden Oligonucleotide amplifiziert:
HRF Start:

5'-GGGAATTCACCACAATGACAGCTGACAAGGAG-3'; SEQ ID NO: 20 und

HRF Rev:

5'- AAGCGGCCGCTCATTTATCGTCATCGTCCTTGTAATCGTTGGTGGCCTGGTCCA GAGCTCTGAG-3'; SEQ ID NO: 21 und das PCR-Produkt wurde mit EcoRI/NotI verdaut und in die EcoRI- und die NotI-Restriktionsstelle von pcDNA3 subcloniert. In den reversen Oligonucleotid-Primer wurde eine Sequenz, die das FLAG-Epitop codierte, mit eingebaut. Das HIF-2α- und das HIF-1α-Expressionsplasmid wurden durch Insertion der mit FLAG markierten cDNAs in die EcoRI- und die NotI-Stelle von pcDNA3 (Invitrogen) konstruiert. Für Cotransfektions-Testansätze wurden A293-Zellen im Verhältnis 1 : 2 in 35 mm-Schalen aufgeteilt und 18 Stunden später mit 4 μg DNA (2 μg durch den Flk-1-Promotor angetriebenes Luciferase-Plasmid, 1 μg durch den CMV-Promotor angetriebenes β-Galactosidase-Expressions-Plasmid und 1 μg des HIF-2α- oder des HIF-1α-Expressions-Plasmids oder mit pBluescript SKII und pcDNA3 als Kontrolle) unter Verwendung eines Transfektions-Kits (MBS, Stratagene) transfiziert. Nach 20 Stunden wurden Messungen der Reportergen-Aktivität unter Verwendung des Dual Light-Kits (Tropix, Bedford, MA) durchgeführt. Die Luciferase-Aktivität jedes Extrakts wurde auf die entsprechende Aktivität der β-Galactosidase hin normiert. Die endogenen Hintergrundspiegel beider Enzymaktivitäten wurden unter Verwendung von Extrakten aus Schein-transfizierten Zellen gemessen und subtrahiert. Die normalisierte Luciferase-Aktivität der Kontroll-Transfektion wurde willkürlich auf 1 festgesetzt. Jeder Wert entspricht dem Mittelwert aus mindestens sechs Experimenten.

Im Vergleich zu den Zellen, die mit dem Luciferase-Reporter-Konstrukt alleine transfiziert worden waren, steigerte die Cotransfektion mit dem HIF-2α-Konstrukt die Aktivität des Reportergens etwa 15-fach (15). Im Gegensatz dazu stimulierte HIF-1α, ein naher Verwandter von HIF-2, der die durch Hypoxie induzierte Transkription des VEGF-Gens stimuliert, das Reporterkonstrukt nicht (15). Diese Ergebnisse legen nahe, dass HIF-2α die Expression des Flk-1-Gens reguliert.
Zusammenfassung
Der Flk-1-Rezeptor der Maus ist für die Differenzierung des hämangioblastischen Zellstammbaums und im Verlauf der embryonalen Gefäßentwicklung essentiell (Risau, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 11 (1995), 73–91; Shalaby, 1995; Risau, 1997). Darüber hinaus spielt Flk-1 eine zentrale Rolle bei der Regulation der Gefäßneubildung bei einer Vielzahl von Tumoren (Plate, Brain Pathol. 4 (1994), 207–218; Ferrara, 1996). Um die Grundlage für seine Expression im Endothel aufzuklären, wurden die regulatorischen Sequenzen des murinen Flk-1-Gens, die eine Endothel-spezifische Expression eines Reportergens in transgenen Mäuseembryonen verleihen, isoliert und charakterisiert. Die Expression des Transgens, die durch diese Sequenzen gesteuert wurde, war stark, spezifisch und hochgradig reproduzierbar. Am Wichtigsten ist, dass gezeigt wurde, dass die isolierten Sequenzen in den frühen Stadien der Gefäßentwicklung aktiv waren und dass sie somit einen Hinweis für die Identifizierung der molekularen Mechanismen darstellen, die an der Hämangioblasten-Differenzierung und der Gefäßbildung beteiligt sind. Darüber hinaus bleibt die Expression des Transgens bis kurz nach der Geburt bestehen und wird in adulten Tieren herunterreguliert, wie es für das endogene Flk-1-Gen beschrieben wurde (Millauer, 1993; Kremer, 1997).
Die Endothel-spezifische Expression in fast allen transgenen Mäuseembryonen, die untersucht wurden, wurde durch ein 939 Bp großes Fragment der Promotorregion in Kombination mit einem Fragment aus dem ersten Intron vermittelt. Flankierende 5'-Fragmente bis zu –5,5 kBp reichten alleine nicht aus, um eine reproduzierbare Endothel-spezifische Expression des Transgens zu vermitteln. Die reproduzierbare Endothel-spezifische Expression war daher von Sequenzen im ersten Intron abhängig. Diese Sequenzen aktivierten auch den heterologen tk-Promotor in Endothelzellen in vivo spezifisch und waren in einer von der Orientierung unabhängigen Weise aktiv. Somit erfüllen sie die Kriterien für einen autonomen gewebsspezifischen Enhancer.
Wie in Beispiel 8 gezeigt, waren die Intron-Sequenzen, die für die Endothel-spezifische Expression ausreichten, in einem 510 Bp großen Fragment enthalten. In diesem konnten mehrere potenzielle Bindestellen für bekannte Transkriptionsfaktoren identifiziert werden (vergleiche mit 12), einschließlich Consensus-Bindestellen für c-ets1, PEA3 (einen Ets-ähnlichen Transkriptionsfaktor), GATA-Transkriptionsfaktoren und Scl/Tal-1. Es wurde vorgeschlagen, dass der c-ets1-Transkriptionsfaktor an der frühen Differenzierung von Endothelzellen aus ihren Vorläufern beteiligt ist (Pardanaut, Cell Adhesion and Communication 1 (1993), 151– 160). Darüber hinaus wird c-ets1 in Endothelzellen im Verlauf der Gefäßneubildung von Tumoren und bei anderen Formen der Angiogenese im Menschen exprimiert (Wernert, Am. J. Pathol. 140 (1992), 119–127). Proteine der Ets-Familie können die Transkription über ein PEA3-Motiv aktivieren (Wernert, 1992). Die Transkriptionsfaktoren der GATA-Familie sind an der Transkription von Genen beteiligt, die in dem hämatopoietischen und dem Endothel-Zellstammbaum exprimiert werden, wie z. B. der von Willebrand-Faktor (Jahroudi, Mol. Cell. Biol. 14 (1994), 999–1008). Anders als bei dem hämatopoietischen Transkriptionsfaktor GATA-1 wird GATA-2 sowohl in dem Endothel- als auch in dem hämatopoietischen Zellstammbaum exprimiert (Elefanty, Blood 90 (1997) 1435–1447). Scl/Tal-1 wurde vor kurzem mit der Regulation der Expression von Flk-1 in Zebrafischen in Verbindung gebracht (Liao, Genes Dev. 12 (1998), 621–626). Die Anwesenheit von zwei potenziellen Scl/Tal-1-Bindestellen in dem murinen Flk-1-Intron-Enhancer legt nahe, dass Scl/Tal-1 die Expression von Flk-1 in Mäusen regulieren könnte. Bisher wurde jedoch keine direkte Wirkung von Scl/Tal-1 auf die Flk-1-Expression in Mäusen beobachtet, obwohl Scl-Null-Mäuse vasculäre Defekte aufweisen (Visvader, Genes Dev. 12 (1998), 473–479).
Kürzlich wurde über Analysen der regulatorischen Elemente anderer Endothel-spezifischer Gene wie z. B. des von Willebrand-Faktors (Aird, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995), 4567–4571), c-ets-1 (Jorcyk, Cell. Mol. Biol. (Noisy-legrand) 43 (1997), 211–225) oder der Endothel-Rezeptoren Tie1 (Korhonen, Blood 86 (1995), 1828–1835) und Tie2 (Schlaeger, Development 121 (1995) 1089–1098); Schaeger, 1997) berichtet. Das einheitlichste Expressionsmuster, über das berichtet wurde, wurde durch die regulatorischen Elemente des Tie2-Gens verliehen. Im Gegensatz zu Flk-1 wird jedoch die Expression von Tie2 und von Reportergenen, die durch die regulatorischen Sequenzen von Tie2 gesteuert werden, in adulten Tieren nicht herunter reguliert. Wie bei dem Flk-1-Gen sind die ersten Introns des Tie2-Gens und des Ets-1-Gens an der Endothel-spezifischen Expression beteiligt. Ähnlich wie bei dem Intron-Enhancer von Flk-1 enthält das erste Intron des Tie2-Gens ebenfalls einen autonomen Endothel-spezifischen Enhancer. Ein Hauptunterschied in der strukturellen Organisation der regulatorischen Elemente zwischen dem Flk-1-Gen und dem Tie2-Gen besteht jedoch darin, dass der Tie2-Promotor von sich selbst aus in bestimmten embryonalen Blutgefäßen aktiv ist (Schlaeger, 1995). Zumindest während der untersuchten Entwicklungsstadien (d. h. E10,5 und E11,5) wurde eine autonome Funktion des Flk-1-Promotors nicht beobachtet. Der im Intron vorhandene 303 Bp große Kern-Enhancer von Tie2 enthält ebenfalls potenzielle Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren der Ets- und der GATA-Familie (Schlaeger, 1997), und in den Promotoren von Tie1, Tie2 und Flt-1 sind c-ets1- oder PEA3-Bindestellen vorhanden (Korhonen, 1995; Schlaeger, 1995; Wakiya, J. Biol. Chem. 271 (1996), 30823–30828).
Die Analyse der Flk-1/lacZ-Knock-in-Mäuseembryonen, die das lacZ-Gen an dem endogenen Flk-1-Locus exprimieren, hat vor kurzem gezeigt, dass das lacZ-Reportergen im Verlauf der Entwicklung der intra-embryonalen Gefäßversorgung und im Dottersack von E7,5-Embryonen ubiquitär exprimiert wird (Shalaby, 1995). Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde jedoch herausgefunden, dass ein Fragment der 5'-UTR, das in dem Knock-in-Konstrukt deletiert ist, für die Expression des Reportergens in der Gefäßversorgung des Dottersackes während der späteren Stadien der embryonalen Entwicklung erforderlich ist. Auf Grundlage von transienten Transfektions-Analysen mit Endothelzellen der Rinderaorta wurde gezeigt, dass die 5'-UTR von Flk-1 ein positiv wirkendes, Endothelzellen-spezifisches Element zwischen den Nucleotiden +136 und +299 enthält (Rönicke, 1996). Eine vollständige vasculäre Färbung des Flk-1/lacZ-Knock-in-Embryos zum Zeitpunkt E11,5 zeigte, dass die 5'-UTR für die intraembryonale vasculäre Expression in diesem Entwicklungsstadium nicht essentiell ist.
Die Beteiligung von HIF-2α an der Regulation der Expression von Flk-1 unterstreicht weiterhin die Rolle der basischen Helix-Schleife-Helix/PAS-Domäne-Transkriptionsfaktoren bei der Regulation der Komponenten des VEGF-Signalübertragungssystems und der Gefäßentwicklung. Von der Hochregulierung von VEGF als Antwortreaktion auf Hypoxie nimmt man allgemein an, dass sie durch HIF-1 vermittelt wird. Darüber hinaus weisen Mäuseembryonen, denen die funktionellen Gene für HIF-1α oder ARNT fehlen, Defekte bei der Gefäßentwicklung auf, vermutlich aufgrund verminderter VEGF-Spiegel (Maltepe, Nature 386 (1997), 403–407; Iyer, Genes Dev. 12 (1998), 149–162). Diese Beobachtung deutet an, dass die physiologische Bedeutung dieser Transkriptionsfaktoren nicht auf die Anpassung an die Hypoxie beschränkt ist, sondern sich auch auf die Regulation der normalen Gefäßentwicklung erstreckt. HIF-2α wird in verschiedenen Geweben exprimiert, einschließlich in dem sich entwickelnden Endothel einiger Organe wie z. B. dem Gehirn (Flamme, 1997). Es erscheint daher wahrscheinlich, dass HIF-2α an der Regulation der Expression von Flk-1 in Blutgefäßen beteiligt ist, die HIF-2α und Flk-1 zusammen exprimieren. Interessanterweise wird HIF-2α auch in Geweben exprimiert, die den Rezeptorliganden von Flk-1, VEGF, exprimieren, und es wurde gezeigt, dass er die Expression von VEGF stimuliert (Ema, 1997). Zusammen genommen stützen diese Beobachtungen die Hypothese, dass HIF-2α sowohl ein intrinischer als auch ein extrinsischer Regulator des Wachstums und der Funktion von Blutgefäßen darstellt (Flamme, 1997), und zwar indem er sowohl die Expression des Rezeptors als auch des Liganden stimuliert. Die Expression von VEGF und Flk-1 zeigt ein bemerkenswertes, koordiniertes, zeitliches Muster sowohl bei der Entwicklung als auch bei Tumoren. So werden zum Beispiel VEGF und Flk-1 im sich entwickelnden Maushirn transient exprimiert und im adulten Tier weitgehend herunter reguliert, aber in Hirntumoren wieder aktiviert (Plate, 1994). In Hämangioblastomen des Gehirns, die stark mit Gefäßen versorgte Tumore darstellen, sind sowohl die VEGF- als auch die Flk-1-Expression stark hochreguliert, und dies korreliert mit der Hochregulierung der Expression von HIF-2α in den Stromazellen dieses Tumortyps. Ob HIF-2α zu der bemerkenswert koordinierten Expression von VEGF und Flk-1 in anderen Tumortypen mit beiträgt, muss noch erforscht werden, da zum Beispiel in Glioblastomen – einem anderen Hirntumor – die Hochregulierung von VEGF aufgrund von Hypoxie erfolgt und HIF-2α durch Hypoxie induzierbar ist. Anders als bei der Expression von VEGF und Flt-1 wird die Expression von Flk-1 durch Hypoxie nicht direkt stimuliert (Gerber, J. Biol. Chem. 272 (1997), 23659–23; Kremer, 1997). Somit scheint die primäre Funktion von HIF-2 bei der Regulation der Expression von Flk-1 nicht mit einer Antwortreaktion auf Hypoxie in Zusammenhang zu stehen.
Unter den endothelialen RTK, die bislang identifiziert wurden, ist Flk-1 der einzige Rezeptor, dessen Funktion für die Determinierung der Endothel-Zellstammbaums erforderlich ist. Daher stellt das Flk-1-Gen den idealen Kandidaten für das Studium der regulatorischen Transkriptionsmechanismen dar, die im Verlauf des Erscheinens des Endothel-Zellstammbaums aktiv sind. Die Beobachtung, dass die isolierten regulatorischen Elemente des Flk-1-Gens in einem frühen Stadium der Gefäßentwicklung aktiv sind, ist für dieses Ziel von großer Bedeutung. Die Kenntnis der regulatorischen Sequenzen des Flk-1-Gens besitzt auch eine hohe potenzielle Bedeutung für die Therapie bestimmter Krankheiten. Es wurde gezeigt, dass der Flk-1-Rezeptor ein Schlüsselregulator der Angiogenese bei verschiedenen Krankheiten einschließlich Krebs darstellt (Plate, 1994). Daher erscheint das Studium der regulatorischen Elemente, die an der Hochregulierung der Flk-1-Expression im Tumor-Endothel beteiligt sind, besonders relevant für die Untersuchung der Mechanismen der Tumor-Angiogenese. Weitere Studien werden enthüllen, ob die gleichen regulatorischen Elemente des Flk-1-Gens, die eine Endothel-spezifische Expression in Mäuseembryonen verleihen, auch in der Gefäßversorgung eines Tumors aktiv sind. Die regulatorischen Elemente des Flk-1-Gens, die in der Tumor-Gefäßversorgung aktiv sind, können Informationen über die Signalübertragungswege liefern, die bei einer anti-angiogenen Tumortherapie gezielt angesteuert werden können. Letztendlich werden die regulatorischen Elemente des Flk-1-Gens für die gezielt gesteuerte Expression von Genen in der Gefäßversorgung nützlich sein. Eine attraktive Möglichkeit ist die Expression von Suizid-Genen (Ozaki, Hum. Gene Ther. 7 (1996), 1483–1490) unter der Kontrolle dieser Elemente. Die Verwendung der regulatorischen Elemente des Flk-1-Gens in Kombination mit z. B. dem Cre/IoxP-System könnte ein wirksames Hilfsmittel für die spezifische Inaktivierung von Genen in der sich entwickelnden Gefäßversorgung oder im Tumor-Endothel sein.
Die vorliegende Erfindung wird in ihrem Rahmen nicht durch die beschriebenen spezifischen Ausführungsformen eingeschränkt, die als einzelne Erläuterungen individueller Aspekte der Erfindung gedacht sind, und alle DNA-Moleküle oder Vektoren, die funktionell äquivalent sind, fallen in den Rahmen dieser Erfindung. Tatsächlich werden verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu den hierin gezeigten und beschriebenen den Fachleuten aus der vorstehenden Beschreibung und den begleitenden Abbildungen ersichtlich sein. Es ist beabsichtigt, dass diese Modifikationen in den Rahmen der anhängigen Ansprüche fallen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Rekombinantes DNA-Molekül umfassend: (a) mindestens eine erste regulatorische Sequenz eines Introns des vasculo-endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF)-Rezeptor 2 (Flk 1)-Gens oder eines Introns eines Gens, das homolog ist zum Flk 1-Gen, welches in der Lage ist, die Expression spezifisch in Endothelzellen in vivo zu verstärken, wobei die Sequenz zu mindestens 85% identisch ist mit den Nucleotiden 10094-10608 von SEQ ID NO: 1; und (b) eine heterologe DNA-Sequenz, die funktionell damit verknüpft ist.
Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei die erste regulatorische Sequenz eine GATA-Bindestelle, eine AP-1-Bindestelle, eine SP1-Bindestelle, eine NFκB-Bindestelle, eine STAT-Bindestelle, eine Scl/Tal-1-Bindestelle, eine Ets-1-Bindestelle, eine PEA3-Consensussequenz oder jegliche Kombination(en) davon umfasst.
Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1 oder 2, wobei die heterologe DNA-Sequenz mit weiteren regulatorischen Sequenzen funktionell verknüpft ist.
Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 3, wobei die weitere regulatorische Sequenz ein Promotor ist.
Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 3 oder 4, wobei die weitere regulatorische Sequenz eine 3'-nicht-translatierte Region ist.
Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 4 oder 5, wobei der Promotor ein Promotor von durch Hypoxie induzierbaren Genen, Genen, die Wachstumsfaktoren oder ihre Rezeptoren oder glykolytische Enzyme codieren, ist.
Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 6, wobei der Wachstumsfaktor VEGF, PDGF oder Fibroblasten-Wachstumsfaktor ist.
Rekombinantes DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 4 bis 7, wobei der Promotor eine DNA-Sequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (a) DNA-Sequenzen, umfassend die Nucleotidsequenz wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt, von Nucleotid 6036 bis Nucleotid 6959; (b) DNA-Sequenzen, umfassend die Nucleotidsequenz des menschlichen Flk-1/KDR Promotors; (c) DNA-Sequenzen, umfassend eine Nucleotidsequenz, die mit einer Nucleotidsequenz nach (a) oder (b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert; (d) DNA-Sequenzen, umfassend eine Nucleotidsequenz, die in den Nucleotidsequenzen nach (a) und (b) konserviert ist; und (e) DNA-Sequenzen, umfassend ein Fragment einer Nucleotidsequenz nach einem der Punkte (a) bis (d).
Rekombinantes DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei mindestens eine der DNA-Sequenzen menschlichen oder murinen Ursprungs ist.
Rekombinantes DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die heterologe DNA-Sequenz, die mit den regulatorischen Sequenzen funktionell verknüpft ist, 5' zur ersten regulatorischen Sequenz gelegen ist.
Rekombinantes DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die heterologe DNA-Sequenz ein Peptid, Protein, Antisense-RNA, Sense-RNA und/oder ein Ribozym codiert.
Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 11, wobei das Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus vasculo-endothelialem Wachstumsfaktor (VEGF), Hypoxie-induzierbaren Faktoren 7 (HIF), HIF-verwandtem Factor (HRF), Gewebe-Plasminogen-Aktivator, p21-Zellzyklus-Inhibitor, Stickstoffmonoxid-Synthase, Interferon-γ, atrialem natriuretischem Polypeptid und Monozyten-chemotaktischen Proteinen.
Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 11, wobei das Protein ein wertbarer Marker, vorzugsweise Luciferase, grün fluoreszierendes Protein oder lacZ ist.
Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 11, wobei die Antisense-RNA oder das Ribozym gegen ein Gen gerichtet sind, das in Vasculogenese und/oder Angiogenese und/oder Tumore endothelialen Ursprungs involviert ist.
Nucleinsäuremolekül, das mindestens 85% Sequenzidentität mit Nucleotiden 10094 bis 10608 von SEQ ID NO: 1 hat, wobei das Molekül eine Länge von mindestens 25 Nucleotiden hat und in der Lage ist, die Expression spezifisch in Endothelzellen in vivo zu verstärken.
Vektor, umfassend ein rekombinantes DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 15.
Vektor nach Anspruch 16, welcher ein Expressionsvektor und/oder ein Zielvektor ist.
Vektor nach Anspruch 16 oder 17, weiter umfassend ein Gen, das in der Lage ist, HIF-2α zu exprimieren.
Zelle, transformiert mit einem DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 15 oder dem Vektor nach einem der Ansprüche 16 bis 18.
Zelle nach Anspruch 19, die eine prokaryontische oder eukaryontische Zelle ist.
Zelle nach Anspruch 19 oder 20, die eine Endothelzelle ist.
Zelle nach einem der Ansprüche 19 bis 21, weiter umfassend ein rekombinantes DNA-Molekül oder einen Vektor, der ein Gen enthält, das in der Lage ist, HIF-2α zu exprimieren.
Arzneimittel, umfassend ein rekombinantes DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 14, den Vektor nach einem der Ansprüche 16 bis 18 und/oder das Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 15 und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Diagnosezusammensetzung, umfassend ein rekombinantes DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 14, den Vektor nach einem der Ansprüche 16 bis 18, die Zelle nach einem der Ansprüche 19 bis 22 und/oder das Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 15, und gegebenenfalls geeignete Mittel zum Nachweis.
Verfahren zur Herstellung eines transgenen nicht-menschlichen Tieres, umfassend das Einbringen eines rekombinanten DNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 15 oder einen Vektor nach einem der Ansprüche 16 bis 18 in eine Keimzelle, eine embryonale Zelle oder eine Eizelle oder eine davon abgeleitete Zelle.
Transgenes nicht-menschliches Tier, umfassend stabil in sein Genom integriert ein rekombinantes DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 15 und/oder den Vektor nach einem der Ansprüche 16 bis 18 oder erhalten gemäß dem Verfahren nach Anspruch 25.
Verfahren nach Anspruch 25 oder das transgene nicht-menschliche Tier nach Anspruch 26, wobei das Tier eine Maus ist.
Verfahren zur Identifizierung eines chemischen und/oder biologischen Stoffes, der in der Lage ist, die Transkription eines Gens in Endothelzellen zu unterdrücken, umfassend: (a) Inkontaktbringen einer Zelle nach einem der Ansprüche 19 bis 22 oder des transgenen nicht-menschlichen Tieres nach Anspruch 26 oder 27, welche beide in der Lage sind, die heterologe DNA-Sequenz zu exprimieren, mit einer Vielzahl von Verbindungen; und (b) Bestimmen derjenigen Verbindungen, welche die Expression der heterologen DNA-Sequenz unterdrücken.
Verfahren zur Identifizierung eines chemischen und/oder biologischen Stoffes, der in der Lage ist, die Transkription eines Gens in Endothelzellen zu aktivieren und/oder zu verstärken, umfassend: (a) Inkontaktbringen einer Zelle nach einem der Ansprüche 19 bis 22 oder des transgenen nicht-menschlichen Tieres nach Anspruch 25 oder 27, welche beide in der Lage sind, die heterologe DNA-Sequenz zu exprimieren, mit einer Vielzahl von Verbindungen; und (b) Bestimmen derjenigen Verbindungen, die in der Lage sind, die Expression der heterologen DNA-Sequenz zu aktivieren und/oder zu verstärken.
Verwendung eines rekombinanten DNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 15, des Vektors nach einem der Ansprüche 16 bis 18, der Zelle nach einem der Ansprüche 19 bis 22, des Arzneimittels nach Anspruch 23, der Diagnosezusammensetzung nach Anspruch 24 und/oder des transgenen nicht-menschlichen Tieres nach Anspruch 26 oder 27 für die Identifizierung eines chemischen und/oder biologischen Stoffes, der in der Lage ist, die Transkription, Expression und/oder Aktivität von Genen und/oder ihrer Expressionsprodukte in Endothelzellen zu unterdrücken oder aktivieren und/oder zu verstärken.
Verfahren nach Anspruch 28 oder 29 oder die Verwendung nach Anspruch 30, wobei der chemische und/oder biologische Stoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Peptiden, Proteinen, Nucleinsäuren, Antikörpern, kleinen organischen Verbindungen, Hormonen, Neurotransmittern, Peptidomimetika und PNAs.
Verwendung eines rekombinanten DNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 14, des Vektors nach einem der Ansprüche 16 bis 18, des Nucleinsäuremoleküls nach Anspruch 15 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung, Prävention und/oder Verzögerung einer Gefäßkrankheit und/oder von Tumorerkrankungen in einem Individuum.
Verwendung eines rekombinanten DNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 14, des Vektors nach einem der Ansprüche 16 bis 18 und/oder des Nucleinsäuremoleküls nach Anspruch 15 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Induzierung einer Gefäßkrankheit in einem nicht-menschlichen Tier oder in dem transgenen nicht-menschlichen Tier nach Anspruch 26 oder 27.
Verwendung nach Anspruch 32 oder 33, wobei die Gefäßkrankheit Atherosclerose und/oder eine neuronale Störung ist.
Verwendung einer regulatorischen Sequenz wie in Anspruch 1 oder 2 definiert zur Verstärkung und/oder Lenkung der Genexpression in Endothelzellen in vitro oder ex vivo.