DE69829001T2

DE69829001T2 - Humanisierte monoklonale antikörper mit hoher affinität gegen tag-72

Info

Publication number: DE69829001T2
Application number: DE69829001T
Authority: DE
Inventors: William Henry Kerr Anderson; Philip R. West Wratting Tempest; Frank J. Carr; William J. Carnoustie Harris; Kathryn Armour
Original assignee: Dow Chemical Co
Current assignee: THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, US
Priority date: 1998-02-25
Filing date: 1998-02-25
Publication date: 2006-03-23
Anticipated expiration: 2018-02-26
Also published as: NO20004250L; JP4080692B2; CA2321932A1; EP1056860A1; WO1999043816A1; NO20004250D0; AU6439398A; ATE288960T1; DE69829001D1; IL138021A0; EP1056860B1; AU758358B2; JP2002504371A

Description

BEREICH DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft humanisierte monoklonale Antikörper und Fragmente oder Derivate davon, welche spezifisch tumorassoziiertes Glycoprotein TAG-72 binden, ein humanes Pankarzinomantigen, das durch verschiedene humane Tumorzellen exprimiert wird. Im Spezielleren betrifft die vorliegende Erfindung humanisierte monoklonale Antikörper und Fragmente oder Derivate davon, die von dem monoklonalen Maus-Antikörper CC49 oder anderen Maus-Antikörpern abgeleitet sind, welche spezifisch TAG-72 binden. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zum Produzieren derartiger humanisierter monoklonaler Antikörper, die spezifisch für TAG-72 sind, pharmazeutische und diagnostische Zusammensetzungen, die solche humanisierten monoklonalen Antikörper enthalten und Verfahren zur Verwendung davon für die Behandlung oder Diagnose von Krebs.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Identifizierung von Antigenen, die von Tumorzellen exprimiert werden, und die Herstellung von monoklonalen Antikörpern, welche spezifisch derartige Antigene binden, ist in der Technik allgemein bekannt. Monoklonale Antitumor-Antikörper zeigen eine potenzielle Anwendung sowohl als therapeutische als auch diagnostische Mittel. Derartige monoklonale Antikörper besitzen potenzielle Anwendung als diagnostische Mittel da sie spezifisch Tumorantigene binden und dadurch das Vorliegen von Tumorzellen oder Tumorantigen in einem Analyten nachweisen können. Zum Beispiel ist die Verwendung von monoklonalen Antikörpern, welche Tumorantigene binden, für in vitro- und in vivo-Darstellung von Tumorzellen oder Tumoren unter Verwendung einer markierten Form eines solchen monoklonalen Antikörpers in der Technik üblich.
Darüber hinaus haben monoklonale Antikörper, welche Tumorantigene binden, allgemein bekannte Anwendung als therapeutische Mittel. Die Verwendung von monoklonalen Antikörpern an sich als therapeutische Mittel oder als Konjugate, worin der monoklonale Antikörper direkt oder indirekt an eine Effektorgruppe gebunden ist, d.h. an ein Arzneimittel, Cytokin, Cytotoxin usw., ist allgemein bekannt.
Im Prinzip, wenn der monoklonale Antikörper an eine Effektorgruppe gebunden ist, wirkt der monoklonale Antikörper als eine Targetinggruppe, d.h. er richtet die gewünschte Effektorgruppe (welche typischerweise therapeutische Aktivität besitzt) gegen ein gewünschtes Ziel, z.B. einen Tumor, welcher das Antigen exprimiert, das durch den monoklonalen Antikörper gebunden wird. Im Gegensatz hierzu, wenn der monoklonale Antikörper an sich als ein therapeutisches Mittel wirkt, wirkt der Antikörper sowohl als eine Targetinggruppe – d.h. er wird spezifisch an eine Zelle binden, welche das Antigen exprimiert – als auch als ein Effektor, welcher therapeutische Aktivität, typischerweise Tumorzelllyse, vermittelt. Derartige Effektorfunktionen – einschließlich z.B. antikörperabhängige zelluläre Cytotoxizität (ADCC (Antibody-dependent cellular cytotoxicity)) und komplementabhängige Cytotoxizität (CDC (Complement dependent cytotoxicity)), unter anderen – werden durch den Teil des Antikörpermoleküls bewirkt, welcher in der Literatur im Allgemeinen als der Fc-Anteil bezeichnet wird. Ein spezifisches Tumorantigen gegen welches verschiedene monoklonale Antikörper entwickelt worden sind, ist tumorassoziiertes Glycoprotein TAG-72. TAG-72 wird exprimiert auf der Oberfläche verschiedener humaner Tumorzellen, wie etwa der LS174T-Tumorzelllinie (American Type Tissue Collection (ATCC) Nr. CL188, eine Variante der Zelllinie LS180 (ATCC Nr. CL187)), eine Colonadenokarzinomlinie. Verschiedene Forschungsgruppen berichteten von der Produktion monoklonaler Antikörper für TAG-72. Siehe z.B. Muraro et al., Cancer Res., 48:4588–4596 (1988); Johnson et al., Cancer Res., 46:850–857 (1986); Molinolo et al., Cancer Res., 50:1291–1298 (1990); Thor et al., Cancer Res., 46:3118–3127 (1986); EP 394277 von Schlom et al. (zugeteilt dem National Cancer Institute); und U.S. Patent 5,512,443 von Jeffrey Schlom et al., Specific antibodies to TAG-72, welche öffentlich erhältlich sind, umfassend CC49 (ATCC Nr. HB 9459), CC83 (ATCC Nr. HB 9453), CC46 (ATCC Nr. HB9458), CC92 (ATCC Nr. HB 9454), CC30 (ATCC Nr. HB 9457), CC11 (ATCC Nr. 9455) und CC15 (ATCC Nr. HB 9460).
Ein Beispiel davon, CC49, ist ein monoklonaler Maus-Antikörper des IgG₁-Isotyps. Dieser monoklonale Antikörper ist eine zweite Generation monoklonaler Antikörper, hergestellt durch Immunisieren von Mäusen mit TAG-72, gereinigt unter Verwendung des Antikörpers erster Generation, B72.3. Colcher et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:3199–3203 (1981). CC49 bindet spezifisch TAG-72 und besitzt eine höhere Antigenbindungsaffinität als B72.3. Muraro et al., Cancer Res., 48:4588–4596 (1988). Von diesem monoklonalen Antikörper ist berichtet worden, dass er auf humane Colonkarzinomxenografte wirkungsvoll ausgerichtet ist und das Wachstum solcher Xenografte mit guter Wirksamkeit verringert. Molinolo et al., Cancer Res., 50:1291–1298 (1996); Colcher et al., J. Natl. Cancer Inst., 82:1191–1197 (1990). Ebenfalls ist berichtet worden, dass radioaktiv markiertes CC49 ausgezeichnete Tumorlokalisierung in mehreren laufenden klinischen Versuchen zeigt.
Jedoch wenngleich Maus-Antikörper Anwendbarkeit als therapeutische Mittel bei Menschen aufweisen, sind sie in mehrerlei Hinsicht nachteilhaft. Im Besonderen können Maus-Antikörper aufgrund der Tatsache, dass sie ihren Ursprung in einer fremden Spezies haben, immunogen bei Menschen sein. Dies kann zu einer neutralisierenden Antikörperreaktion (humane Anti-Maus-Antikörper (HAMA)-Reaktion) führen, was besonders problematisch ist wenn es gewünscht ist, dass die Antikörper wiederholt verabreicht werden, z.B. bei der Behandlung eines chronischen oder wiederauftretenden Kranheitszustands. Da sie konstante Dömanen aus Maus enthalten, kann es auch sein, dass sie keine humanen Effektorfunktionen zeigen.
In einem Versuch zum Eliminieren oder Verringern derartiger Probleme sind chimäre Antikörper offenbart worden. Chimäre Antikörper enthalten Teile von zwei verschiedenen Antikörpern, typischerweise von zwei verschiedenen Spezies. Im Allgemeinen enthalten solche Antikörper humane konstante Regionen und variable Regionen anderer Spezies, typischerweise variable Regionen aus Maus. Zum Beispiel wurde von einigen chimären Maus/Human-Antikörpern berichtet, welche Bindungscharakteristika des elterlichen Maus-Antikörpers und Effektorfunktionen, welche mit den humanen konstanten Regionen verbunden sind, zeigen. Siehe z.B.: U.S. Patent 4,816,567 von Cabilly et al.; U.S. Patent 4,978,745 von Shoemaker et al.; U.S. Patent 4,975,369 von Beavers et al.; und U.S. Patent 4,816,397 von Boss et al. Im Allgemeinen werden diese chimären Antikörper aufgebaut durch Herstellen einer genomischen Genbibliothek von DNA, die extrahiert ist aus bereits bestehenden Maushybridomen. Nishimura et al., Cancer Res., 47:999 (1987). Die Bibliothek wird dann auf Gene der variablen Region von sowohl schweren als auch leichten Ketten gescreent, die die richtigen Antikörperfragmentumlagerungsmuster zeigen. Alternativ werden cDNA-Bibliotheken hergestellt aus RNA, die aus den Hybridomen extrahiert und gescreent ist oder die variablen Regionen werden erhalten durch Polymerasekettenreaktion. Die klonierten Gene für die variable Region werden dann in einen Expressionsvektor ligiert, der klonierte Kassetten des Gens für die geeignete konstante Region humaner schwerer oder leichter Kette enthält. Die chimären Gene werden dann in einer gewählten Zelllinie, üblicherweise einer Mausmyelomlinie, exprimiert. Derartige chimäre Antikörper sind bei der Humantherapie verwendet worden.
Darüber hinaus ist von der Produktion chimärer Maus-Human-Antikörper berichtet worden, die von CC49 und CC83 stammen, welche spezifisch TAG-72 binden. Siehe in dieser Hinsicht z.B. EPO 0,365,997 von Mezes et al. (The Dow Chemical Company). Ein solcher chimärer CC49-Antikörper ist derjenige, der durch die Zelllinie produziert wird, die als ATTC Nr. HB 9884 (Budapest) hinterlegt ist.
Ebenfalls berichten Morrison et al. von der Herstellung mehrerer Antitumor chimärer monoklonaler Antikörper in Important Advances in Oncology, Recombinant Chimeric Monoclonal Antibodies, S. 3–18 (S.A. Rosenberg, Hrsg., 1990) (J.B. Lippincott, Philadelphia, PA). Ergebnisse klinischer Versuche mit chimären cMAb-17-1A in Patienten mit metastatischen Colorektalkarzinomen zeigen nun, dass dieser Antikörper eine 6-fach längere Kreislaufzeit und wesentlich verringerte Immunogenität im Vergleich zu dem monoklonalen Maus-Antikörper aufweist, aus welchem er erhalten wurde. LoBuglio et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:4220–4224 (1989); Meredith et al., J. Nucl. Med., 32:1162–1168 (1991).
Während jedoch solche chimäre monoklonale Antikörper typischerweise geringere Immunogenität zeigen, sind sie immer noch potenziell immunogen in Menschen, da sie variable Sequenzen aus Maus enthalten, welche Antikörperreaktionen bzw. Antikörperantworten auslösen können. Daher besteht die Möglichkeit, dass diese chimären Antikörper eine anti-idiotypische Reaktion auslösen können wenn sie Patienten verabreicht werden. Saleh et al., Cancer Immunol. Immunother., 32:185–190 (1990).
Wenn z.B. cB72.3(γ4) Patienten mit Colorektalkarzinomen verabreicht wurde, lösten 62 % solcher Patienten eine humane Anti-Maus-Antikörper (HAMA)-Reaktion aus, was eine Anti-V-Region-Reaktion bzw. -Antwort umfasste. Dies ist nachteilhaft, da eine HAMA-Antwort wiederholte Antitumor-Antikörperverabreichung potenziell uneffektiv machen würde, aufgrund einer erhöhten Antikörperclearance aus dem Serum (Saleh et al., Cancer Immunol. Immunother., 32:180–190 (1990)) und ebenfalls aufgrund potenzieller allergischer Reaktionen (LoBuglio et al., Hybridoma, 5:5117–5123 (1986).
Eine Vielzahl genetischer Varianten potenzieller klinischer Anwendbarkeit ist von MAb CC49 entwickelt worden. Diese umfassen cCC49, ein C_H2-Domänedefizientes cCC49 (Slavin-Chiorini et al., Int. J. Cancer, 53:97–103 (1993)) und ein Einzelketten-Fv (sFv) (Milenic et al., Cancer Res. 51:6365–6371 (1991); Sawyer et al., Protein Eng., 7:1401–1406 (1994)). Diese Moleküle können relativ verringerte HAMA-Antworten in Patienten auslösen, da sie schnellere Plasma- und Gesamtkörper-Clearance-Raten in Mäusen und Rhesusaffen im Vergleich zu intaktem IgG gezeigt haben. Slavin-Chiorini et al., (1993) (id); Milenic et al. (1991) (id). Zusätzlich wurde von neuen Einzelkettenimmunoglobulin (SCIg)-Molekülen berichtet, welche von cCC49 abgeleitet sind, und durch Einzelgenkonstrukte kodiert sind. Ein solches Molekül, SCIgΔC_H1 besteht aus CC49 sFv, gebunden an die humane γ1-Fc-Region (Shu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7915–7999 (1993)), während das andere SCIg-IL-2 ein humanes Interleukin-2 (IL-2)-Molekül trägt, genetisch gebunden an das Carboxylende der Fc-Region von SCIgΔC_H1 (Kashmiri et al., Proc. XVI Intl. Cancer Cong. 1:183–187 (1994)). Beide SCIgs sind vergleichbar mit cCC49 beim Antigenbinden und der cytolytischen Antikörperaktivität gegen Zellen. Die biologische Aktivität des IL-2 ist ebenfalls beibehalten in SCIg-IL-2.
Bei einem Versuch zur Vermeidung der Immunogenitätsprobleme von chimären und Maus-Antikörpern ist ebenfalls die Produktion von "humanisierten" Antikörpern bekannt. Idealerweise führt "Humanisierung" zu einem Antikörper, der in Menschen nicht immunogen ist, mit im Wesentlicher vollständiger Retention der Antigenbindungseigenschaften des anfänglichen Moleküls. Um alle Antigenbindungseigenschaften des anfänglichen Antikörpers beizubehalten, muss die Struktur seiner kombinierenden Stelle sorgfältig in der "humanisierten" Version reproduziert werden. Dies kann potenziell erreicht werden durch Transplantieren der Kombinierungsstelle des nichthumanen Antikörpers auf ein humanes Gerüst, entweder (a) durch Propfen nur der nichthumanen CDRs auf humanes Gerüst und konstante Regionen mit oder ohne Retention kritischer Gerüstreste bzw. Gerüstgruppen (Jones et al., Nature, 321:522 (1986); Verhoeyen et al., Science, 239: 1539 (1988)); oder (b) durch Transplantieren der vollständigen nichthumanen variablen Domänen (zum Beibehalten von Ligandenbindungseigenschaften) aber ebenfalls indem sie einem "Umhüllen" ("cloaking") unterzogen werden mit einer human-ähnlichen Oberfläche durch vernünftiges Ersetzen von exponierten Resten (zum Verringern der Antigenizität) (Padlan, Molec. Immunol., 28:489 (1991)).
Im Wesentlichen umfasst Humanisierung durch CDR-Pfropfen das Transplantieren von nur den CDRs auf humanes Fragment und konstante Regionen. Theoretisch sollte dies im Wesentlichen Immunogenität eliminieren (ausgenommen wenn allotypische oder idiotypische Unterschiede bestehen). Jones et al., Nature, 321:522–525 (1986); Verhoeyen et al., Science, 239:1534–1536 (1988); Riechmann et al., Nature, 332:323–327 (1988). Während eine solche Technik in einigen Fällen wirkungsvoll ist, ergibt CDR-Pfropfen manchmal nicht das gewünschte Ergebnis. Es wurde eher berichtet, dass einige Gerüst-Reste des anfänglichen Antikörpers ebenfalls beibehalten werden müssen, um Antigenbindungsaktivität zu beizubehalten. Riechmann et al., Nature, 332:323–327 (1988); Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10023–10029; Tempest et al., Biol. Technology, 9:266–271 (1991); Co et al., Nature, 351:501–502 (1991)).
Wie diskutiert, muss zum Erhalten der Antigenbindungseigenschaften des anfänglichen Antikörpers die Struktur seiner Kombinierungsstelle sorgfältig in dem humanisierten Molekül reproduziert werden. Röntgenstrahlkristallographieuntersuchungen zeigten, dass die Antikörperkombinierungsstelle primär aus CDR-Resten gebildet wird, wenngleich es sich erwies, dass einige benachbarte Gerüstreste in die Antigenbindung involviert sind. Amit et al., Science, 233:747–753 (1986); Colman et al., Nature, 326:358–363 (1987); Sheriff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:8075–8079 (1987); Padlan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:5938–5942 (1989); Fischmann et al., J. Biol. Chem., 266:12915–12920 (1991); Tulip et al., J. Molec. Biol., 227:122–148 (1992). Es ist ebenfalls gefunden worden, dass die Strukturen der CDR-Schleifen wesentlich beeinflusst wird durch umgebenden Gerüststrukturen. Chothia et al., J. Molec. Biol., 196:901–917 (1987); Chothia et al., Nature, 342:877–883 (1989); Tramomonteno et al., J. Molec. Biol. 215:175–182 (1990).
Kleine aber wesentliche Unterschiede in der relativen Anordnung der variablen Domänen der leichten Kette (V_L) und variablen Domänen der schweren Kette (V_H) können festgestellt werden (Colman et al., Nature, 326:358–363 (1987)) und diese Unterschiede sind angeblich auf Variationen in den Resten zurückzuführen die beim Interdomänenkontakt umfasst sind (Padlan et al., Molec. Immunol., 31:169–217 (1994)).
Darüber hinaus zeigten Strukturuntersuchungen der Wirkung der Mutation auf innere Reste, worin Veränderungen des Seitenkettenvolumens umfasst sind, dass die resultierenden lokalen Deformationen akkomodiert werden durch Verschiebungen in Seitenkettenpositionen, die auf entfernte Teile in dem Molekülinneren propagiert werden. Dies legt nahe, dass Humanisierung der inneren Reste in den variablen Domänen und in der Grenzfläche zwischen diesen Domänen oder mindestens des inneren Volumens ebenfalls erhalten werden sollten; ein Humanisierungsprotokoll, worin ein innerer Rest ersetzt wird durch eine oder verschiedene physikalische Eigenschaften (wie etwa Größe, Ladung oder Hydrophobizität etc.) könnte zu einer wesentlichen Modifikation der Struktur der Antigenkombinierungsstelle führen.
Ein Verfahren zum Identifizieren der Gerüstreste, die beibehalten werden sollen, ist durch Computermodellierung. Alternativ können kritische Gerüstreste potenziell identifiziert werden durch Vergleichen bekannter Antikörperkombinierungsstellenstrukturen (Padlan, Molec. Immun., 31(3):169–217 (1994)).
Die Reste, welche potenziell Antigenbindung beeinflussen, fallen in verschiedene Gruppen. Die erste Gruppe umfasst Reste, die benachbart zu der Kombinierungsstellenoberfläche sind und welche daher in direkten Kontakt mit Antigenen kommen könnten. Sie umfassen die Amino-terminalen Reste und diejenigen, die den CDRs benachbart sind. Die zweite Gruppe umfasst Reste, die die Struktur oder relative Anordnung der CDRs ändern könnten, entweder durch Inkontaktbringen der CDRs oder der entgegengesetzten Ketten. Die dritte Gruppe umfasst Aminosäuren mit verdeckten Seitenketten, die die strukturelle Integrität der variablen Domänen beeinflussen könnten. Die Reste in diesen Gruppen werden üblicherweise in den gleichen Positionen (ibid) entsprechend dem übernommenen Nummerierungssystem gefunden. Siehe Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH Pub. Nr. 91-3242 (5. Ausgabe, 1991) (U.S. Dept. Health & Human Services, Bethesda, MD) und Genbank.
Während jedoch humanisierte Antikörper wünschenswert sind aufgrund ihrer potenziell geringen Immunogenität in Menschen, ist ihre Herstellung unvorhersagbar. Zum Beispiel kann Sequenzmodifizierung von Antikörpern zu wesentlichem oder sogar vollständigem Verlust von Antigenbindungsaffinität oder Verlust der Bindungsspezifität führen. Alternativ können "humanisierte Antikörper" weiterhin Immunogenität in Menschen zeigen, unabhängig von Sequenzmodifikation.
Daher besteht weiterhin ein wesentlicher Bedarf in der Technik für neue humanisierte Antikörper für gewünschte Antigene. Im Spezielleren besteht ein Bedarf in der Technik für humanisierte Antikörper, die spezifisch für TAG-72 sind, aufgrund ihres Potenzials als immunotherapeutische und immunodiagnostische Mittel.
Zusätzlich zu der früheren Diskussion im Stand der Technik offenbaren S. KASHMIRI ET AL.: "Generation, characterisation, and in vivo studies of humanized anticarcinoma antibody CC49". "HYBRIDOMA", Band 14, Nummer 5, Oktober 1995, Seiten 461–473, einen humanisierten CC49-Antikörper, erhalten durch Pfropfen der hypervariablen MAb CC49-Regionen auf die variablen leichten und variablen schweren Gerüste (Frameworks) der humanen MAbs LEN bzw. 21/28' CL, unter Beibehalten dieser Mausgerüstreste, die erforderlich sein können für die Integrität des Antigens, das mit der Stellenstruktur kombiniert.
Y. SHA ET AL.: "A heavy-chain grafted antibody that recognizes the tumorassociated TAG72 antigen". CANCER BIOTHERAPY, Band 9, Nummer 4, 1994, Seiten 341–349, offenbart einen humanisierten Anti-TAG-72-Antikörper, erhalten durch Transplantation von CDRs von der Maus-V_H des Maus-ccM4-Antikörpers, welcher das TAG-72-Antigen in FRs des humanen Myelomproteins new M erkennt.
WO9611013 offenbart die Verwendung einer humanisierten CDR-gepfropften Version von NN-14.
GEGENSTÄNDE DER ERFINDUNG
Letztendlich ist es ein Gegenstand der Erfindung, humanisierte Antikörper bereitzustellen, welche spezifisch für humanes TAG-72 sind.
Im Spezielleren ist ein Gegenstand der Erfindung die Bereitstellung humanisierter Antikörper, die von Maus-Antikörpern für TAG-72 abgeleitet sind, und im Besonderen CC49, ein spezifischer Maus-Antikörper, welcher an TAG-72 bindet.
Es ist ebenfalls ein Gegenstand der Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen bereitzustellen, die humanisierte Antikörper enthalten, welche spezifisch für TAG-72 sind. Es ist ein noch speziellerer Gegenstand der Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen bereitzustellen, die humanisierte Antikörper enthalten, die von CC49 abgleitet sind, einem Maus-Antikörper, welcher spezifisch an TAG-72 bindet.
Ein weiterer spezifischer Gegenstand der Erfindung ist das Vorsehen der Verwendung von humanisierten Antikörpern für TAG-72 bei der Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs, welcher TAG-72 exprimiert, im Besonderen humaner Darmkrebs.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung von Immundiagnostikzusammensetzungen zum Nachweis von Krebszellen, welche einen humanisierten Antikörper enthalten, welcher spezifisch TAG-72 bindet, und vorzugsweise von CC49 abgeleitet ist, wobei der Antikörper in markierter oder unmarkierter Form ist. Es ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein in vitro-Verfahren zur Immunodiagnose von Krebs bereitzustellen, unter Verwendung von Zusammensetzungen, welche einen humanisierten Antikörper enthalten, welcher spezifisch TAG-72 bindet, welcher in markierter oder unmarkierter Form ist.
Es ist noch weiterer Gegenstand der Erfindung Nukleinsäuresequenzen bereitzustellen, welche für humanisierte Antikörper für TAG-72 oder Fragmente davon codieren. Ein speziellerer Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung von Nukleinsäuresequenzen, welche für humanisierte Antikörper codieren, die abgeleitet sind von CC49, einem Maus-Antikörper, welcher spezifisch an TAG-72 bindet. Es ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung Vektoren bereitzustellen, aus welchen humanisierte Antikörper für TAG-72 exprimiert werden können, im Besonderen humanisierte Antikörper, die von CC49 abgeleitet sind, einem Maus-Antikörper, welcher spezifisch an TAG-72 bindet.
In einer ersten Hinsicht der Erfindung wird ein humanisierter Antikörper oder ein humanisiertes Antikörperfragment davon bereitgestellt, welches spezifisch TAG-72 bindet, dadurch gekennzeichnet, dass der humanisierte Antikörper aufweist: humanisierte variable schwere Kette-Regionen bzw. humansierte variable Regionen der schweren Kette mit der Aminosäuresequenz von 1 oder 3 oder mit der Aminosäuresequenz der humanisierten variablen schwere Kette-Region des humanisierten CC49-Antikörpers, exprimiert durch ATCC CRL 12209; und humanisierte variable leichte Kette-Regionen bzw. humanisierte Regionen der variablen leichten Kette mit der Aminosäuresequenz von 2 oder 4 oder mit der Aminosäuresequenz der humanisierten variablen leichte Kette-Region des humanisierten CC49-Antikörpers, exprimiert durch ATCC CRL 12209.
In einer zweiten Hinsicht der Erfindung wird eine Nukleinsäuresequenz bereitgestellt, die dadurch gekennzeichnet ist, dass der obige humane Antikörper oder das humanisierte Antikörperfragment von der Nukleinsäuresequenz exprimiert werden kann.
In einer dritten Hinsicht der Erfindung wird ein Vektor bereitgestellt, der dadurch gekennzeichnet ist, dass der obige humanisierte Antikörper oder das humanisierte Antikörperfragment von dem Vektor exprimiert werden können.
In einer vierten Hinsicht der Erfindung wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, die geeignet ist für die Behandlung oder in vivo- oder in vitro-Nachweis von Krebs, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine therapeutisch wirksame bzw. eine diagnostisch wirksame Menge des obigen humanisierten Antikörpers oder humanisierten Antikörperfragments umfasst.
In einer fünften Hinsicht der Erfindung wird eine therapeutische Zusammensetzung bereitgestellt, umfassend den obigen humanisierten Antikörper oder das humanisierte Antikörperfragment, direkt oder indirekt assoziiert oder gebunden an einen Effektorrest mit therapeutischer Aktivität, wobei der Effektorrest ein Radionuklid, ein therapeutisches Enzym, ein Antikrebswirkstoff, ein Cytokin, ein Cytoxin oder ein Antiproliferationsmittel ist.
In einer sechsten Hinsicht der Erfindung wird eine Zusammensetzung für den Nachweis von Krebs bereitgestellt, umfassend den obigen humanisierten Antikörper oder das humanisierte Antikörperfragment, direkt oder indirekt assoziiert mit oder gebunden an eine nachweisbare Markierung.
In einer siebten Hinsicht der Erfindung wird ein Verfahren des in vitro-Immunnachweises von TAG-72-exprimierenden Krebszellen bereitgestellt, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren durchgeführt wird durch Inkontaktbringen der Krebszellen mit einer Zusammensetzung gemäß dem sechsten Aspekt der Erfindung.
In einer achten Hinsicht der Erfindung wird eine kommerzielle Verpackungseinheit bereitgestellt, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Zusammensetzung gemäß des sechsten Aspekts der Erfindung als aktiven Bestandteil zusammen mit Anleitungen zur Verwendung zum Behandeln oder Nachweisen von Krebs enthält, worin die Zusammensetzung vor der Anwendung rekonstitutiert wird.
Die Verwendung des obigen humanisierten Antikörpers oder humanisierten Antikörperfragments bei der Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Krebs.
1 zeigt ein Alignement von Aminosäuresequenzen von Maus-CC49 V_H, den NEWM-Gerüstregionen, die durch das FR-Ausgangsmaterial codiert werden, und die humanisierte auf NEWM-basierende V_H (HuVH), welche in Beispiel 1 offenbart ist. Die CDRs sind in den Umrahmungen. Reste aus Maus, die in den FRs erhalten sind, sind durch Pfeilsymbole (↑) gekennzeichnet. Maus-FR-Reste, die in alternativen Versionen von HuVH erhalten sind, sind durch Buchstabensymbole (Λ), (S) und (K) gekennzeichnet.
2 zeigt ein Alignement von Aminosäuresequenzen von Maus-CC49 V_K, in REI-Gerüstregionen, die durch das FR-Ausgangsmaterial codiert werden und der humanisierten auf REI basierenden V_K, welche offenbart ist in Beispiel 1. CDRs sind in den Umrahmungen.
3 zeigt ein Alignement von der variablen schweren Kette von CC49, dem HuCC49, das in Beispiel 1 offenbart ist und NEWM.
4 zeigt ein Alignement von der variablen leichten Kette von CC49, das HuCC49, das in Beispiel 1 offenbart ist, und REI.
5 enthält Schemata der Vektoren, die verwendet werden, um die humanisierte V_H und V_K zu exprimieren, die in 3 und 4 gezeigt sind.
6 ist ein ELISA, der die Bindung von CC49-Antikörpern HuVHA/MuVK und HuVHA/HuVK an TAG-72 zeigt.
7 ist ein ELISA, der die Bindung von CC49-Antikörpern MuVH/MuVK und HuVH/HuVK an TAG-72 zeigt.
8 ist ein ELISA, der die Bindung von CC49-Antikörpern MuVH/MuVK und HuVH/HuVK an TAG-72 zeigt.
9 ist ein ELISA, der die Bindung von CC49-Antikörpern MuVH/MuVK und HuVHA/HuVK an TAG-72 zeigt.
10 ist ein ELISA, der die Bindung von CC49-Antikörpern HuVH/HuVK und HuVHK/HuVK an TAG-72 zeigt.
11 ist ein ELISA, der die Bindung von CC49-Antikörpern HuVHS/HuVK und HuVH/HuVK an TAG-72 zeigt.
12 ist eine Scatchard-Analyse von humanisierten (HuVH/HuVK) und chimären (MuVH/MuVK) monoklonalen CC49- Antikörpern.
13 zeigt die Einzelstrang-DNA-Sequenz des Templats, das verwendet wird, um die anfänglichen humanisierten auf NEWM basierenden VHs, HuVH und HuVHA, zu produzieren.
14 zeigt die Doppelstrang-DNA-Sequenz des Templats, das verwendet wird, um die alternativen humanisierten VHs, HuVHS und HuVHK, zu produzieren.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Vor der Beschreibung der Erfindung werden Definitionen bestimmter Ausdrücke, die in dieser Offenbarung verwendet werden, unten angegeben:
Antikörper – Dies betrifft Einzelketten-, Doppelketten- und Mehrkettenproteine und Glykoproteine, die zu der Klasse polyklonaler, monoklonaler, chimärer und Hetero-Immunglobuline (monoklonale Antikörper sind bevorzugt) gehören, er umfasst auch synthetische und genetisch entwickelte Varianten dieser Immunglobuline. "Antikörperfragment" umfasst Fab-, Fab'-, F(ab')₂- und Fv-Fragmente, als auch jeden Teil eines Antikörpers mit Spezifität gegenüber einem gewünschten Zielepitop oder Zielepitopen.
Humanisierter Antikörper – Dies wird einen Antikörper betreffen, der von einem nichthumanen Antikörper abgeleitet ist, typischerweise von Maus, der die Antigenbindungseigenschaften des parenteralen Antikörpers beibehält oder im Wesentlichen beibehält, jedoch weniger immunogen in Menschen ist. Dies kann durch verschiedene Methoden erreicht werden, einschließlich (a) Pfropfen von nur den nichthumanen CDRs auf humane Gerüst- und konstante Regionen, mit oder ohne Retention von kritischen Gerüstresten, oder (b) Transplantieren der gesamten nichthumanen variablen Domänen, wobei sie jedoch mit einem humanartigen Abschnitt durch Ersetzen von Oberflächenresten verborgen werden. Solche Verfahren, die geeignet sind zum Durchführen der vorliegenden Erfindung umfassen diejenigen, die offenbart sind in Jones et al., Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851–6855 (1984); Morrison und Oi, Adv. Immunol., 44:65–92 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534–1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28:489–498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3):169–217 (1994).
Komplementaritätsbestimmende Region oder CDR – Der Ausdruck CDR bedeutet, so wie er hier verwendet wird, Aminosäuresequenzen, welche zusammen die Bindungsaffinität und Spezifität der natürlichen Fv-Region einer nativen Immunglobulinbindunsstelle, wie von Kabat et al. (1991) angegeben, definieren.
Gerüstregion – Der Ausdruck FR bedeutet, so wie er hier verwendet wird, Aminosäuresequenzen, die zwischen CDRs angeordnet sind. Diese Teile des Antikörpers dienen dazu, die CDRs in einer geeigneten Orientierung für Antigenbindung zu halten. In den Antikörpern und Antikörperfragmenten der vorliegenden Erfindung können die Gerüstregionen für die variable leichte Kette- Region ausgewählt sein aus der Gruppe, bestehend aus humanen leichten lambda-Kette-FRs und humanen kappa-Untergruppen I, II und III leichte Kette-FRs, unabhängig davon ob die Aminosäuresequenzen dieser FRs in ihrer vollen humanen nativen Form bleiben oder anstelle dessen Modifikationen ihrer Aminosäuresequenzen enthalten, welche erforderlich sind, um Bindungsaffinität und/oder Bindungsspezifität beizubehalten oder zu erhöhen.
Konstante Region – Der Teil des Antikörpermoleküls, welcher Effektorfunktionen verleiht. In der vorliegenden Erfindung werden konstante Regionen aus Maus substituiert durch konstante humane Regionen. Die konstanten Regionen der betroffenen chimären oder humanisierten Antikörper sind von humanen Immunglobulinen abgeleitet. Die konstante schwere Kette-Region kann ausgewählt sein aus einem der fünf Isotypen: Alpha, Delta, Epsilon, Gamma oder mü. Weiterhin sind schwere Ketten von verschiedenen Unterklassen (wie etwa die IgG-Unterklassen von schweren Ketten) verantwortlich für verschiedene Effektorfunktionen und daher können durch Wählen der gewünschten konstanten schwere Kette-Region bzw. konstanten Region der schweren Kette chimäre Antikörper mit gewünschten Effektorfunktionen produziert werden.
Bevorzugte konstante Regionen sind Gamma 1 (IgG1), Gamma 3 (IgG3) und Gamma 4 (IgG4). Bevorzugter ist eine konstante Region des Gamma 1 (IgG1)-Isotyps. Die konstante leichte Kette-Region kann den kappa- oder Lambda-Typ aufweisen, vorzugsweise den kappa-Typ.
Chimärer Antikörper – Dies ist ein Antikörper, der Sequenzen enthält, die von zwei verschiedenen Antikörpern abgeleitet sind, welche typischerweise von verschiedenen Spezies sind. Am typischsten umfassen chimäre Antikörper humane und Maus-Antikörperfragmente, im Allgemeinen konstante humane und variable Regionen aus Maus.
Säuger – Tiere, die ihre Jungen mit Milch ernähren, die durch Milchdrüsen sezerniert wird, vorzugsweise warmblütige Säugetiere, am bevorzugtesten Menschen.
Immunogenität – Ein Maß der Fähigkeit eines zielgerichteten Proteins oder einer therapeutischen Gruppe zum Auslösen einer Immunantwort (humoral oder zellulär) bei Verabreichung an einen Patienten. Die vorliegende Erfindung ist verbunden mit der Immunogenität der betreffenden humanisierten Antikörper oder Fragmente davon.
Humanisierter Antikörper mit verringerter Immunogenität – Dies betrifft einen humanisierten Antikörper, der verringerte Immunogenität relativ zu dem parenteralen Antikörper zeigt.
Humanisierter Antikörper der im Wesentlichen die Bindungseigenschaften des parenteralen Antikörpers beibehält – Dies betrifft einen humanisierten Antikörper, welcher die Fähigkeit zum spezifischen Binden des Antigens beibehält, das durch den parenteralen Antikörper erkannt wird, welcher verwendet wird, um solche humanisierten Antikörper zu produzieren. Vorzugsweise wird der humanisierte Antikörper die gleiche oder im Wesentlichen die gleiche Antigenbindungsaffinität und Avidität wie der parenterale bzw. elterliche Antikörper, z.B. CC49, zeigen. Vorzugsweise wird die Affinität des Antikörpers mindestens etwa 10 % derjenigen des prenteralen Antikörpers sein. Bevorzugter wird die Affinität mindestens etwa 25 % sein, d.h. mindestens das zweifache weniger als die Affinität des parenteralen Antikörpers. Am bevorzugtesten wird die Affinität mindestens etwa 50 % des parenteralen Antikörpers sein. Verfahren zum Untersuchen der Antigenbindungsaffinität sind in der Technik allgemein bekannt und umfassen Halbmaximumbindungsassays, Kompetitionassays und Scatchard-Analysen. Geeignete Antigenbindungsassays sind in dieser Anmeldung beschrieben.
In ihrer weitesten Ausführungsform ist die vorliegende Erfindung auf humanisierte Antikörper gerichtet, welche spezifisch TAG-72, ein Pankarzinomantigen, das durch verschiedene humane Krebse exprimiert wird, binden, im Speziellen humane Darmkarzinome. Vorzugsweise werden solche Antikörper aus Antikörpern erhalten werden, die gute Bindungsaffinität für TAG-72 aufweisen, z.B.: B72.3 (Thor et al., Cancer Res., 46:3118–3127 (1986); Johnson et al., Cancer Res., 46:850–857 (1986)), hinterlegt als ATCC Nr. HB 8108; CC49 (ATCC Nr. HB 9459); CC83 (ATCC Ni. HB 9453); CC46 (ATCC Nr. HB 9452); CC92 (ATCC Nr. HB 9454); CC30 (ATCC Nr. HB 9457); CC11 (ATCC Nr. 9455); und CC15 (ATCC Nr. HB 9460) oder chimärisierte Formen davon (siehe z.B. EPO 0,365,997 von Mezes et al., The Dow Chemical Company).
Am bevorzugtesten werden solche humanisierten Antikörper von CC49 abgeleitet sein, von welchem berichtet worden ist, dass er auf Humankolonkarzinomxenografte wirksam gerichtet ist und ebenfalls das Wachstum des Xenografts mit guter Wirksamkeit verringert. Molinolo et al., Cancer Res., 50:1291–1298 (1990); Colcher et al., J. Natl. Cancer Inst., 82:1191–1197 (1990).
Wie oben diskutiert, liefern humanisierte Antikörper potenzielle Vorteile gegenüber Maus- und auch chimären Antikörpern, z.B. verringerte Immunogenität im Menschen. Dies ist vorteilhaft, da dies das Auslösen einer HAMA-Antwort verringern und potenziell eliminieren sollte, wenn solche humanisierten Antikörper in vivo verabreicht werden, z.B. zur Behandlung von Krebs oder zur Diagnose von Krebs, z.B. zur Tumordarstellung.
Jedoch, wie oben angegeben, kann Humanisierung in einigen Fällen umgekehrt die Antigenbindung beeinflussen. Vorzugsweise werden die humanisierten Antikörper der vorliegenden Erfindung, welche spezifisch TAG-72 binden, eine Bindungsaffinität für TAG-72 von mindestens etwa 10 % und bevorzugter mindestens etwa 25 % und am bevorzugtesten mindestens etwa 50 % derjenigen der TAG-72-Antigenbindungsaffinität des parenteralen Maus-Antikörpers aufweisen, z.B. B72.3, CC49, CC46, CC30, CC11, CC15, CC83 oder eines anderen parenteralen Antikörpers. Am bevorzugtesten werden die humanisierten Antikörper der vorliegenden Erfindung eine Bindungsaffinität für TAG-72 von mindestens etwa 10 %, bevorzugter mindestens etwa 25 % und am bevorzugtesten mindestens etwa 50 % derjenigen der TAG-72-Antigenbindungsaffinität von entweder CC49- oder einem chimären CC49-Antikörper aufweisen.
Vorzugsweise werden die humanisierten Antikörper der vorliegenden Erfindung dasselbe Epitop binden wie CC49. Solche Antikörper können basierend auf ihrer Fähigkeit zum Konkurrieren mit CC49 zur Bindung an TAG-72 oder TAG-72-exprimierende Krebszellen identifiziert werden.
Im Allgemeinen werden die betreffenden humanisierten Antikörper produziert durch Erhalten von Nukleinsäuresequenzen, die für die variablen schweren und variablen leichten Sequenzen eines Antikörpers codieren, welcher TAG-72 bindet, vorzugsweise CC49, Identifizieren der CDRs in den variablen schweren und variablen leichten Sequenzen und Pfropfen derartiger CDR-Nukleinsäuresequenzen auf humane Gerüstnukleinsäuresequenzen.
Vorzugsweise wird das ausgewählte humane Gerüst ein solches sein, von dem erwartet wird, dass es geeignet ist zur in vivo-Verabreichung, d.h. keine Immunogenität zeigt. Dies kann z.B. bestimmt werden durch vorhergehende Versuche unter in vivo-Verwendung derartiger Antikörper und durch Studien von Aminosäuresequenzähnlichkeiten. In dem letzteren Ansatz werden die Aminosäuresequenzen der Grundgerüstregionen des zu humanisierenden Antikörpers, z.B. CC49, mit denjenigen bekannter humaner Gerüstregionen verglichen werden und es werden humane Gerüstregionen, die für CDR-Pfropfen verwendet werden, ausgewählt werden, welche eine Größe und Sequenz umfassen, die am ähnlichsten derjenigen des parenteralen Antikörpers ist, z.B. ein Maus-Antikörper, welcher TAG-72 bindet. Zahlreiche humane Gerüstregionen sind isoliert worden und ihre Sequenzen in der Literatur beschrieben. Siehe z.B. Kabat et al. (id). Dies verstärkt die Wahrscheinlichkeit, dass der resultierende CDR-gepfropfte "humanisierte" Antikörper, welcher die CDRs des parenteralen (z.B. Maus) Antikörpers gepfropft auf die ausgewählten humanen Gerüstregionen enthält, wesentlich die Antigenbindungsstruktur und so die Bindungsaffinität des parenteralen Antikörpers beibehalten wird. Als ein Ergebnis solcher Untersuchungen sind die FRs von REI- und NEWM-Antikörpern so identifiziert worden, dass sie Aminosäuresequenzen aufweisen, welche es wahrscheinlich den CDRs von CC49 erlauben, ein wesentliches Ausmaß Antigenbindungsaffinität beizubehalten. Wie angegeben, werden die ausgewählten humanen Gerüstregionen vorzugsweise diejenigen sein, von welchen erwartet wird, dass sie geeignet zur in vivo-Verabreichung, d.h. nicht immunogen sind. Basierend auf ihren Aminosäuresequenzen wird von humanen REI- und NEWM-Gerüstregionen erwartet, dass sie im Wesentlichen nicht immunogen sind.
Verfahren zum Klonieren von Nukleinsäuresequenzen, die für Immunglobuline codieren, sind in der Technik allgemein bekannt. Solche Verfahren werden im Allgemeinen die Amplifikation der Immunglobulinsequenzen umfassen, welche zu klonieren sind, unter Verwendung geeigneter Primer durch Polymerasekettenreaktion (PCR). Primer, die geeignet sind zum Amplifizieren von Immunglobulinnukleinsäuresequenzen und im Besonderen variablen schweren und variablen leichten Sequenzen aus Maus sind in der Literatur beschrieben worden. Nachdem solche Immunglobulinsequenzen kloniert worden sind, werden sie durch in der Technik allgemein bekannte Verfahren sequenziert werden. Dies wird durchgeführt, um die variablen schweren und variablen leichten Sequenzen und im Spezielleren die Anteile davon, welche die CDRs und FRs bilden, zu bestimmen. Dies kann durch allgemein bekannte Verfahren durchgeführt werden.
Wenn die CDRs und FRs der klonierten Antikörpersequenzen, welche zu humanisieren sind, identifiziert worden sind, werden dann die Aminosäuresequenzen, die für CDRs codieren, identifiziert (deduziert basierend auf den Nukleinsäuresequenzen und dem genetischen Code und durch Vergleich der früheren Antikörpersequenzen) und die entsprechenden Nukleinsäuresequenzen werden auf ausgewählte humane FRs gepfropft. Dies kann durchgeführt werden durch die Verwendung geeigneter Primer und Linker.
Verfahren zum Auswählen geeigneter Primer und Linker zum Bereitstellen für Ligierung von gewünschten Nukleinsäuresequenzen sind innerhalb des Fachwissens und umfassen diejenigen, die in U.S. Patent Nr. 4,816,397 von Boss et al. und U.S. Patent Nr. 5,225,539 von Winter et al. offenbart sind.
Nachdem die CDRs auf humane FRS gepfropft sind, werden dann die resultierenden "humanisierten" variablen schweren und variablen leichten Sequenzen exprimiert werden, um ein humanisiertes Fv oder einen humanisierten Antikörper zu produzieren, welcher TAG-72 bindet. Typischerweise werden die humanisierten variablen schweren und variablen leichten Sequenzen exprimiert werden als ein Fusionsprotein mit humanen konstante Domäne-Sequenzen bzw. Sequenzen der humanen konstanten Domäne, sodass ein intakter Antikörper, welcher TAG-72 bindet, erhalten wird. Jedoch ist dies nicht notwendig, da die variablen schweren und leichten Sequenzen auch in der Abwesenheit von konstanten Sequenzen exprimiert werden können, um ein humanisiertes Fv zu bilden, welches TAG-72 bindet. Jedoch ist die Fusion von humanen konstanten Sequenzen an eine oder mehrere humanisierte variable Regionen potenziell wünschenswert, da der resultierende Antikörper, welcher TAG-72 bindet, dann humane Effektorfunktionen besitzen wird, wie etwa komplementabhängige Cytotoxizität (CDC) und Antikörper-abhängige zelluläre Cytotoxizitäts (ADCC)-Aktivität. Eine solche Aktivität ist gefunden worden in chimären Antikörpern, einschließlich CC49. Die humanisierten Anti-TAG-72-Antikörper der vorliegenden Erfindung können auch solche Effektorfunktionsaktivität unterstützen, mit dem zusätzlichen Vorteil eines stark verminderten Risikos einer HAMA-Antwort.
Verfahren zum Synthetisieren von DNAs, die für ein Protein bekannter Sequenz codieren, sind in der Technik allgemein bekannt. Unter Verwendung solcher Verfahren werden DNA-Sequenzen, die für die betreffenden humanisierten V_L- und V_H-Sequenzen codieren, synthetisiert und dann in Vektorsystemen exprimiert, die geeignet zur Expression rekombinanter Antikörper sind. Dies kann in jedem Vektorsystem bewirkt werden, welches dafür sorgt, dass die betreffenden humanisierten V_L- und V_H-Sequenzen als ein Fusionsprotein mit humanen konstante Domäne-Sequenzen exprimiert werden und assoziieren, um funktionelle (antigenbindende) Antikörper zu produzieren. Expressionsvektoren und Wirtszellen, die zur Expression rekombinanter Antikörper und humanisierter Antikörper im Besonderen geeignet sind, sind in der Technik allgemein bekannt.
Die folgenden Literaturstellen sind Beispiele von Verfahren und Vektoren, die geeignet sind zur Expression rekombinanter Immunglobuline, die verwendet werden können beim Durchführen der vorliegenden Erfindung. Weidle et al., Gene, 51:21–29 (1987); Dorai et al., J. Immunol., 13(12):4232–4241 (1987); De Waele et al., Eur. J. Biochem., 176:287–295 (1988); Colcher et al., Cancer Res., 49:1738–1745 (1989); Wood et al., J. Immunol., 145(a):3011–3016 (1990); Bulens et al., Eur. J. Biochem., 195:235–242 (1991); Beggington et al., Biol. Technology, 10:169 (1992); King et al., Biochem. J., 281:317–323 (1992); Page et al., Biol. Technology, 9:64 (1991); King et al., Biochem. J., 290:723–729 (1993); Chaudary et al., Nature, 339:394–397 (1989); Jones et al., Nature, 321:522–525 (1986); Morrison and Oi, Adv. Immunol. 44:65–92 (1988); Benhar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:12051–12055 (1994); Singer et al., J. Immunol., 150:2844–2857 (1993); Cooto et al., Hybridoma, 13(3):215–219 (1994); Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029–10033 (1989); Caron et al., Cancer Res., 32:6761–6767 (1992); Cotoma et al., J. Immunol. Meth., 152:89–109 (1992). Darüber hinaus sind Vektoren, die zur Expression rekombinanter Antikörper geeignet sind, kommerziell erhältlich. Der Vektor kann z.B. ein bloßes Nukleinsäuresegment, ein trägerassoziiertes Nukleinsäuresegment, ein Nukleoprotein, ein Plasmid, ein Virus, ein Viroid oder ein transposables Element sein.
Wirtszellen, von welchen bekannt ist, dass sie in der Lage sind zum Exprimieren funktioneller Immunglobuline, umfassend z.B. Säugerzellen, wie etwa Goldhamsterovar (CHO)-Zellen; COS-Zellen; Myelomzellen, wie etwa NSO- und SP2/0-Zellen; Bakterien, wie etwa Escherichia coli; Hefezellen, wie etwa Saccharomyces cerevisiae; und andere Wirtszellen. Unter diesen werden CHO-Zellen von vielen Forschern verwendet, unter Voraussetzung ihrer Fähigkeit zum wirkungsvollen Exprimieren und Sezernieren von Immunglobulinen. NSO-Zellen sind einer der bevorzugten Typen von Wirtszellen, die geeignet in der vorliegenden Erfindung sind.
Im Wesentlichen wird rekombinante Expression humanisierter Antikörper durch eines von zwei allgemeinen Verfahren bewirkt. In dem ersten Verfahren werden die Wirtszellen mit einem einzelnen Vektor transfiziert, welcher für die Expression von sowohl schweren als auch leichten variablen Sequenzen, optional fusioniert an ausgewählte konstante Regionen, sorgt. In dem zweiten Verfahren werden Wirtszellen mit zwei Vektoren transfiziert, wobei jeder von diesen für eine verschiedene variable Kette codiert (d.h. eine variable schwere Kette oder eine variable leichte Kette; jeder für eine variable Kette codierende Vektor kann optional für die Expression der variablen Kette, die an eine ausgewählte konstante Region fusioniert ist, sorgen.
Humane konstante Domäne-Sequenzen sind in der Technik allgemein bekannt und sind in der Literatur beschrieben worden. Bevorzugte humane konstante Sequenzen umfassen die konstanten leichten kappa- und lambda-Sequenzen. Bevorzugte humane konstante schwere Sequenzen umfassen humane Gamma 1-, humane Gamma 2-, humane Gamma 3-, humane Gamma 4- und mutierte Versionen davon, welche für abgewandelte Wirkung oder Funktion sorgen, z.B. verstärkte in vivo-Halbwertszeit oder verringerte Fc-Rezeptorbindung.
Nach Expression wird die Antigenbindungsaffinität des resultierenden humanisierten Antikörpers durch bekannte Verfahren untersucht werden, z.B. durch Scatchard-Analyse. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Antigen-Bindungsaffinität des humanisierten Antikörpers mindestens 25 derjenigen des parenteralen Antikörpers, z.B. CC49, sein, d.h. um mindestens das zweifache weniger als diejenige von nativem oder chimärem CC49. Am bevorzugtesten wird die Affinität des humanisierten Antikörpers mindestens etwa 50 % derjenigen des parenteralen Antikörpers, z.B. CC49, sein.
In einigen Fällen können humanisierte Antikörper, die produziert werden durch Pfropfen von CDRs (von einem Antikörper, welcher TAG-72 bindet) auf ausgewählte humane Gerüstregionen humanisierte Antikörper liefern, die die gewünschte Affinität für TAG-72 aufweisen. Jedoch kann es erforderlich oder wünschenswert sein, spezifische Gruppen bzw. Reste des ausgewählten humanen Gerüsts weiter zu modifizieren, um Antigenbindung zu verstärken. Dies kann der Fall sein, da angenommen wird, dass einige Gerüstreste wesentlich für Antigenbindung sind oder zumindest Antigenbindung beeinflussen. Vorzugsweise werden diese Gerüstreste des parenteralen (z.B. Maus) Antikörpers, welche Kombinierungsstellenstrukturen erhalten oder beeinflussen, beibehalten werden. Diese Reste bzw. Gruppen können identifiziert werden durch Röntgenstrahlkristallographie des parenteralen Antikörpers oder Fab-Fragments, wobei die dreidimensionale Struktur der Antigenbindungsstelle identifiziert wird. Ebenfalls können Gerüstreste, die bei der Antigenbindung beteiligt sind, potenziell basierend auf früher beschriebenen humanisierten Maus-Antikörpersequenzen identifiziert werden. Daher kann es vorteilhaft sein, solche Gerüstreste oder andere aus dem parenteralen Mausantikörper beizubehalten, um TAG-72-Bindung zu optimieren. Vorzugsweise wird eine solche Methodologie einen "humanartigen"-Charakter dem resultierenden humanisierten Antikörper verleihen, wodurch er weniger immunogen wird, während die inneren und kontaktierenden Reste, welche Antigenbindung beeinflussen, beibehalten werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin Varianten und Äquivalente, welche im Wesentlichen homolog zu den humanisierten Antikörpern und Antikörperfragmenten sind, die hier angegeben sind. Diese können z.B. konservative Substitutionsmutationen, d.h. die Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren durch ähnliche Aminosäuren enthalten. Zum Beispiel betrifft konservative Substition die Substitution einer Aminosäure durch eine andere innerhalb der gleichen allgemeinen Klasse, z.B. einer sauren Aminosäure durch eine andere saure Aminosäure, einer basischen Aminosäure durch eine andere basische Aminosäure oder einer neutralen Aminosäure durch eine andere neutrale Aminosäure. Was unter einer konservativen Aminosäuresubstitution vorgesehen ist, ist in der Technik allgemein bekannt.
Der Ausdruck "im Wesentlichen homolog" wird verwendet im Hinblick auf die Ähnlichkeit einer betreffenden Aminosäursequenz (eines Oligo- oder Polypeptids oder Proteins) zu einer verwandten Referenzaminosäuresequenz. Dieser Ausdruck ist definiert als mindestens etwa 75 % Übereinstimmung – d.h. der Zustand identischer Aminosäurereste, die parallel angeordnet sind – zwischen den betreffenden und den Referenzsequenzen, wenn diese Sequenzen in "Orientierung" gebracht werden, d.h. wenn eine minimale Anzahl von "null" Basen in die vorliegenden und/oder Referenzsequenzen insertiert worden ist, um die Anzahl bestehender korrespondierender Basen zwischen den Sequenzen zu maximieren. "Null" Basen sind kein Teil der betreffenden und Referenzsequenzen: Ebenfalls kann die minimale Anzahl von "null" Basen, insertiert in die betreffende Sequenz, sich von der minimalen Anzahl, die in der Referenzsequenz insertiert ist, unterscheiden. In dieser Definition wird eine Referenzsequenz betrachtet als "verwandt" zu einer betreffenden Sequenz bzw. Zielsequenz, worin beide Aminosäuresequenzen Proteine oder Teile von Proteinen bilden, welche entweder αTAG-72-Antikörper oder Antikörper-Fragmente davon sind, mit einer TAG-72-Bindungsaffinität. Jedes der Proteine, das diese α-TAG-72-Antikörper oder Antikörperfragmente umfasst, kann unabhängig Antikörper oder Antikörperfragmente oder bi- oder multifunktionale Proteine sein, z.B. wie etwa Fusionsproteine, bi- und multispezifische Antikörper, Einzelkettenantikörper und dgl.
Die vorliegende Erfindung richtet sich weiterhin auf Nukleinsäuresequenzen aus welchen solche humanisierten Antikörper exprimiert werden können, als auch Expressionsvektoren, welche für die Produktion solcher humanisierter Antikörper in transformierten Wirtszellen sorgen.
In bevorzugten Ausführungsformen werden solche humanisierte Antikörper und entsprechende Nukleinsäuresequenzen von CC49 abgeleitet sein. Am bevorzugtesten werden die humanisierten schweren Ketten die Aminosäuresequenzen besitzen, die in 1 oder 3 angegeben sind und die humanisierten leichten Ketten werden die Aminosäuresequenzen besitzen, die in 2 oder 4 angegeben sind. Jedoch, wie diskutiert, sieht die Erfindung andere Modifikationen dieser humanisierten variablen schweren und leichten Sequenzen vor, z.B. Sequenzen, welche weiterhin eine oder mehrere konservative Aminosäuresubstitutionen oder Sequenzen umfassen, welche eine oder mehrere zusätzliche Mausgerüstreste beibehalten, welche Antigenbindung beeinflussen (Verstärken), welche Alternativen zu oder Supplemente für die bereits in den Figuren gezeigten sind.
Die vorliegenden humanisierten Antikörper sollten, da sie spezifisch TAG-72, ein Pankarzinomantigen, exprimieren auf vielen verschiedenen Krebszelltypen (z.B. Darmkarzinome, Brustkarzinome, Ovarkarzinome, Prostatakarzinome) binden, und da weiterhin erwartet wird, dass sie im Wesentlichen nicht immunogen in Menschen sind, geeignet sein sollten zur Verwendung als Therapeutika für die Behandlung oder Verhinderung von Krebsen, die durch TAG-72-Expression gekennzeichnet sind, und als diagnostische Mittel, z.B. zur Verwendung bei der Tumordarstellung oder in dem Radioimmunguided Surgery System (RIGS^®). Siehe Hinkle et al., Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals, 4(3):339–358 (1991). Der Fachmann in der Technik wäre in der Lage durch Routineversuch zu bestimmen, was eine wirksame nichttoxische Menge Antikörper zum Zweck der Behandlung von Krebs sein würde. Im Allgemeinen jedoch wird eine wirksame Menge im Bereich von etwa 0,05 bis 100 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag sein.
Die Antikörper der Erfindung können einem Säuger gemäß dem oben genannten Behandlungsverfahren in einer Menge verabreicht werden, die ausreichend ist, um eine solche Wirkung auszulösen, um eine therapeutische, prophylaktische oder diagnostische Wirkung zu erzielen. Derartige Antikörper der Erfindung können solchen Säugern in einer herkömmlichen Dosisform verabreicht werden, hergestellt durch Kombinieren des Antikörpers der Erfindung mit einem herkömmlichen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Vehikel, Verdünnungsmittel und/oder Arzneimittelträger bzw. Wirkstoffträger entsprechend bekannter Techniken, um eine Suspension, injizierbare Lösung oder andere Formulierung zu bilden. Es wird durch den Fachmann in der Technik erkannt werden, dass die Form und der Charakter des pharmazeutisch verträglichen Trägers oder Verdünnungsmittels durch die Menge des aktiven Bestandteils, mit welchem er zu kombinieren ist, dem Verabreichungsweg und anderen gut bekannten Variablen bestimmt wird.
Pharmazeutisch verträgliche Formulierungen können z.B. umfassen ein geeignetes Lösungsmittel, Konservierungsmittel, wie etwa Benzylalkohol, falls gewünscht, und einen Puffer. Geeignetes Lösungsmittel kann z.B. Wasser, wässrige Alkohole, Glykole und Phosphonat und Carbonatester umfassen. Derartige wässrige Lösungen enthalten nicht mehr als 50 % bezüglich des Volumens organisches Lösungsmittel. Formulierungen des Suspensionstyps können ein flüssiges Suspendierungsmedium als einen Träger umfassen, z.B. wässriges Polyvinylpyrrolidon, inerte Öle, wie etwa Pflanzenöle oder hochraffinierte Mineralöle oder wässrige Celluloseether wie etwa wässrige Carboxymethylcellulose. Ein Verdickungsmittel, wie etwa Gelatine oder ein Alginat kann ebenfalls vorliegen, ein oder mehrere natürliche oder synthetische oberflächenaktive Mittel oder Antischaummittel können verwendet werden und ein oder mehrere Suspendierungsmittel, wie etwa Sorbitol oder ein anderer Zucker, können darin verwendet werden. Derartige Formulierungen können ein oder mehrere Hilfsstoffe enthalten.
Der Verabreichungsweg des Antikörpers (oder Fragments davon) der Erfindung kann oral, parenteral, durch Inhalation oder topisch sein. Der Ausdruck parenteral umfasst, wie er hier verwendet wird, intravenöse, intramuskuläre, subkutane, rektale, vaginale oder intraperetonale Verabreichung. Die subkutanen, intravenösen und intramuskulären Formen parenteraler Verabreichung sind im Allgemeinen bevorzugt. Die täglichen parenteralen und oralen Dosisverabreichungen zum prophylaktischen oder therapeutischen Verwenden humanisierter Antikörper der Erfindung werden im Allgemeinen im Bereich von etwa 0,005 bis 100, jedoch vorzugsweise etwa 0,5 bis 10 Milligram pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag sein.
Der Antikörper der Erfindung kann auch durch Inhalation verabreicht werden. Durch "Inhalation" bedeutet intranasale und orale Inhalationsverabreichung. Geeignete Dosisformen für eine solche Verabreichung, wie etwa eine Aerosolformulierung oder ein Dosierinhalator, können durch herkömmliche Techniken hergestellt werden. Die bevorzugte Dosismenge einer Verbindung der Erfindung, die zu verwenden ist, ist im Allgemeinen im Bereich von etwa 0,1 bis 1000 Milligramm, vorzugsweise etwa 10 bis 100 Milligramm/Kilogramm Körpergewicht.
Der Antikörper der Erfindung kann auch topisch verabreicht werden. Unter topischer Verabreichung versteht sich nichtsystemische Verabreichung. Dies umfasst die Verabreichung einer humanisierten Antikörper- (oder humanisiertes Antikörperfragment) Formulierung der Erfindung extern zur Epidermis oder in die Backentasche und Instillation eines solchen Antikörpers in das Ohr, Auge oder in die Nase und wo immer er nicht wesentlich in den Blutstrom eintritt. Unter systemischer Verabreichung versteht sich orale, intravenöse, intraperetoneale, subkutane und intramuskuläre Verabreichung. Die Menge eines Antikörpers, die erforderlich ist für therapeutische, prophylaktische oder diagnostische Wirkung wird natürlich mit dem gewählten Antikörper, der Natur und Schwere des zu behandelnden Zustands und dem Lebewesen, das einer Behandlung unterzogen wird, variieren und ist letztendlich im Entscheidungsbereich des Arztes. Eine geeignete topische Dosis eines Antikörpers der Erfindung wird im Allgemeinen innerhalb des Bereichs von etwa 1 bis 100 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht täglich sein.
Formulierungen
Während es möglich ist, dass ein Antikörper oder Fragment davon alleine verabreicht wird, ist es bevorzugt, ihn bzw. es als eine pharmazeutische Formulierung zu verabreichen. Der aktive Bestandteil kann zur topischen Verabreichung von 0,001 % bis 10 % Gew./Gew., z.B. von 1 % bis 2 % bezüglich des Gewichts, der Formulierung umfassen, wenngleich er soviel wie etwa 10 % Gew./Gew. jedoch vorzugsweise nicht im Überschuss von 5 % Gew./Gew. und bevorzugter von 0,1 % bis 1 % Gew./Gew. der Formulierung umfasst. Die topischen Formulierungen der vorliegenden Erfindung umfassen einen aktiven Bestandteil zusammen mit einem oder mehreren verträglichen Trägern hierfür und optional einem oder mehreren therapeutischen Bestandteilen. Die bzw. der Träger müssen "verträglich" sein in dem Sinne, dass sie kompatibel mit anderen Bestandteilen der Formulierungen sind und nicht nachteilig für deren Empfänger sind.
Formulierungen, die geeignet sind zur topischen Verabreichung, umfassen flüssige oder halbflüssige Präparate, die geeignet sind zur Penetration durch die Haut zu der Stelle an welcher Behandlung erforderlich ist, wie etwa Einreibemittel, Lotionen, Cremes, Salben oder Pasten und Tropfen, die geeignet sind zur Verabreichung in das Auge, Ohr oder in die Nase. Tropfen gemäß der vorliegenden Erfindung können sterile wässrige oder ölige Lösungen oder Suspensionen umfassen und können hergestellt werden durch Lösen des aktiven Bestandteils in einer geeigneten wässrigen Lösung eines bakteriziden und/oder fungiziden Mittels und/oder einem anderen geeigneten Konservierungsmittel, und vorzugsweise umfassen sie ein oberflächenaktives Mittel. Die resultierende Lösung kann dann geklärt und sterilisiert werden durch Filtration und in das Behältnis mit einer aseptische Technik übergeführt werden. Beispiele bakterizider und fungizider Mittel, die geeignet sind zur Aufnahme in den Tropfen sind Phenylquecksilbernitrat oder -acetat (0,002 %), Benzalkoniumchlorid (0,01 %) und Chlorhexidinacetat (0,01 %). Geeignete Lösungsmittel für die Herstellung einer öligen Lösung umfassen Glycerol, verdünnten Alkohol und Propylenglykol.
Lotionen gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen diejenigen, die geeignet sind zur Anwendung auf Haut oder Auge. Die Augenlotion kann eine sterile wässrige Lösung umfassen, die optional ein Bakterizid enthält, und kann hergestellt werden durch Verfahren, die ähnlich denjenigen sind zur Herstellung der Tropfen. Lotionen oder Einreibemittel zur Anwendung auf die Haut können auch ein Mittel umfassen, um das Trocknen zu beschleunigen und die Haut zu kühlen, wie etwa einen Alkohol oder Aceton, und/oder ein feuchtigkeitspendendes Mittel, wie etwa Glycerol oder ein Öl, wie etwa Castoröl oder Arachisöl.
Cremes, Salben oder Pasten gemäß der vorliegenden Erfindung sind halbfeste Formulierungen des aktiven Bestandteils für externe Anwendung. Sie können hergestellt werden durch Mischen des aktiven Bestandteils in fein zerteilte oder pulverförmige Form, alleine oder in Lösung oder Suspension in einem wässrigen oder nichtwässrigen Fluid, mit der Hilfe einer geeigneten Einrichtung, auf Fett- oder Nichtfett-Basis. Die Basis kann Kohlenwasserstoffe umfassen, wie etwa hartes, weiches oder flüssiges Paraffin, Glycerol, Bienenwachs, eine Metallseife; Mucilago; ein Öl natürlichen Ursprungs, wie etwa Mandel-, Mais-, Arachis-, Castoröl oder Olivenöl; Wollfett oder seine Derivate oder eine Fettsäure, wie etwa Stearin- oder Ölsäure, zusammen mit einem Alkohol, wie etwa Propylenglykol oder Makrogelen. Die Formulierung kann jedes geeignete oberflächenaktive Mittel enthalten, wie etwa anionische, kationische oder nichtionische oberflächenaktive Mittel, wie etwa Sorbitanester oder Polyoxyethylenderivate davon. Suspendierungsmittel, wie etwa natürliche Gummis, Cellulosederivate oder anorganische Materialien wie etwa silicatische Silicas und andere Bestandteile, wie etwa Lanolin, können ebenfalls enthalten sein.
Kits gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen gefrorene oder lyophilisierte humanisierte Antikörper bzw. humanisierte Antikörperfragmente, die zu rekonstituieren sind, durch Tauen (optional gefolgt durch weitere Verdünnung) oder durch Suspension in einem (vorzugsweisen gepufferten) flüssigen Vehikel. Die Kits können ebenfalls Puffer und/oder Arzneimittelträgerlösungen (in flüssiger oder gefrorener Form) – oder Puffer- und/oder Arzneimittelträgerpulverpräparate, die mit Wasser zu rekonstituieren sind) zum Zweck des Mischens mit den humanisierten Antikörpern oder humanisierten Antikörperfragmenten enthalten, um eine Formulierung, die zur Verabreichung geeignet ist, herzustellen. Daher werden vorzugsweise die Kits, die die humanisierten Antikörper oder humanisierten Antikörperfragmente enthalten, geforen, lyphilisiert, vorverdünnt oder vorgemischt, in einer solchen Konzentration, dass die Zuführung einer vorbestimmten Menge Wärme, Wasser oder einer Lösung, die in dem Kit bereitgestellt wird, zu einer Formulierung mit ausreichender Konzentration und pH-Wert führen wird, um wirksam zu sein für in vivo- oder in vitro-Anwendung bei der Behandlung oder Diagnose von Krebs. Vorzugsweise wird ein solcher Kit auch Anleitungen umfassen zum Rekonstituieren und Verwenden der humanisierten Antikörper- oder humanisierten Antikörperfragmentzusammensetzung zum Behandeln oder Nachweisen von Krebs. Der Kit kann auch zwei oder mehrere Komponententeile für die rekonstituierte aktive Zusammensetzung umfassen. Zum Beispiel kann ein zweites Komponententeil – zusätzlich zu den humanisierten Antikörpern oder humanisierten Antikörperfragmenten – ein bifunktioneller Chelant, bifunktionelles Chelat oder ein therapeutisches Mittel, wie etwa ein Radionuklid sein, welches beim Mischen mit den humanisierten Antikörpern oder humanisierten Antikörperfragmenten ein konjugiertes System damit bildet. Die oben angegeben Puffer, Arzneimittelträger und andere Komponententeile können getrennt oder zusammen mit dem Kit verkauft werden.
Durch den Fachmann in der Technik wird erkannt werden, dass die optionale Menge und der Abstand einzelner Dosen eines humanisierten Antikörpers oder humanisierten Antikörperfragments der Erfindung durch die Natur und das Ausmaß des zu behandelnden Zustands, die Form, den Weg und die Stelle der Verabreichung und das spezielle zu behandelnde Lebewesen bestimmt wird, und dass ein solches Optimum durch herkömmliche Techniken bestimmt werden kann. Der Fachmann in der Technik wird einzuschätzen wissen, dass der optimale Behandlungsverlauf, d.h. die Anzahl von Dosen eines Antikörpers oder Fragments davon der Erfindung, die pro Tag für eine definierte Anzahl von Tagen gegeben wird, durch den Fachmann in der Technik bestimmt werden kann, unter Verwendung herkömmlicher Behandlungsverlaufsbestimmungstests.
Die vorliegenden humanisierten Antikörper können auch in Kombination mit anderen Antikrebsmitteln verabreicht werden, z.B. anderen Antikörpern oder Arzneimitteln. Ebenfalls können die vorliegenden humanisierten Antikörper oder Fragmente davon direkt oder indirekt gebunden sein an einen Effektor mit therapeutischer Aktivität. Geeignete Effektorgruppen umfassen beispielsweise Cytokine (IL-2, TNF, Interferone, Kolonie-stimulierende Faktoren, IL-1 usw.), Cytotoxine (Pseudomonas exotoxin, Ricin, Abrin, usw.), Radionuklide, wie etwa ⁹⁰Y, ¹³¹I, ^99mTc, ¹¹¹In, ¹²⁵I unter anderen, Arzneimittel, Methotrexat, Daunorubicin, Doxorubicin, usw.), Immunmodulatoren, therapeutische Enzyme (z.B. beta-Galactosidase), Anti-proliferative Mittel, usw. Die Bindung von Antikörpern an gewünschte Effektoren ist allgemein bekannt. Siehe z.B. U.S. Patent Nr. 5,435,990 von Cheng et al. Darüber hinaus sind bifunktionelle Linker zum Erleichtern einer solchen Bindung allgemein bekannt und weitgehend verfügbar. Ebenfalls sind Chelatoren (Chelaten und Chelate), die eine Bindung von Radionukliden vorsehen, allgemein bekannt und erhältlich.
Alternativ können die vorliegenden humanisierten Antikörper oder Fragmente davon, die spezifisch für TAG-72 sind, als Immundiagnostikmittel, sowohl in vivo als auch in vitro, verwendet werden. Eine besonders bevorzugte Verwendung ist zur in vivo-Darstellung von Krebszellläsionen, welche TAG-72 exprimieren. Die vorliegenden Antikörper sind bevorzugt, da sie keine wesentliche HAMA- oder allergische Antwort auslösen sollten. Daher können sie wiederholt verwendet werden, um den Krankheitszustand eines Patienten darzustellen.
Wie oben angegeben, ist eine andere bevorzugte Anwendung der vorliegenden humanisierten Antikörper oder Fragmente davon das Radioimmunoguided System^®. Diese Technik, die ebenfalls bekannt ist als das RIGS^®-System umfasst die intravenöse Verabreichung eines radioaktiv markierten monoklonalen Antikörpers oder seines Fragments vor der Operation. Nachdem man Tumoraufnahme und Blutclearance der Radioaktivität zuließ, wird der Patient in den Operationsraum geführt, wo chirurgische Untersuchung der Hilfe einer Hand- Gamma-Aktivitätsssonde, z.B. Neoprobe^® 1000, durchgeführt wird. Dies hilft dem Chirurgen die Tumormetastasen zu identifizieren und Komplikationen beim Herausschneiden zu verbessern. Das RIGS^®-System ist vorteilhaft, da es den Nachweis von Tumoren erlaubt, die ansonsten durch visuelle Untersuchung und/oder Abtasten nicht nachweisbar sind. Siehe O'Dwyer et al., Arch. Surg., 121:1391–1394 (1986). Diese Technik ist im einzelnen beschrieben in Hinkle et al., Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmacouticals, 4(3)339–358 (1991) (worin zahlreiche Literaturstellen zitiert werden, die diese Technik beschreiben). Diese Literaturstelle offenbart auch die Verwendung dieser Technik mit dem CC49 monoklonalen Antikörper selbst. Diese Technik ist besonders geeignet für Krebse des Darms, der Brust, des Pankreas und der Ovarien.
Die vorliegenden humanisierten Antikörper oder humanisierten Antikörperfragmente davon, die radioaktiv markiert sind mit Radionukliden, welche geeignet sind zur in vivo Verabreichung, z.B. Jodradionuklide, wie etwa ¹³I und ¹²⁵I; ¹¹¹In und ^99mTc sind ebenfalls geeignete radioaktive Markierungsmittel.
Die vorliegenden humanisierten Antikörper können alleine oder in Kombination mit anderen Antikörpern verwendet werden. Ebenfalls können die vorliegenden humanisierten Antikörper hergestellt werden in der Form einer diagnostisch wirksamen Zusammensetzung. Im Allgemeinen wird dies die Aufnahme diagnostisch verträglicher Träger und Exzipienten und Markierungsmittel, welche für den Nachweis sorgen, umfassen. Geeignete Markierungsmittel umfassen diagnostische Radionuklide, Enzyme, usw. Verfahren zum Verwenden von Antikörpern zur Tumordarstellung sind in der Technik allgemein bekannt.
Ohne weitere nähere Ausführung wird angenommen, dass der Fachmann in der Technik unter Verwendung der vorhergehenden Beschreibung die vorliegende Erfindung in ihrem vollsten Ausmaß verwenden kann. Die Erfindung wird weiter veranschaulicht durch eine Betrachtung der folgenden Beispiele, welche rein exemplarisch für die vorliegende Erfindung vorgesehen sind und daher nur als veranschaulichende Beispiele ausgelegt und nicht als Begrenzungen des Bereichs der vorliegenden Erfindung ausgelegt werden dürfen.
BEISPIELE
Materialien und Verfahren
DNA-Templatherstellung
Die gesamte Rekombinierungssarbeit wurde durchgeführt auf DNA-Sequenzen in Plasmid M13-Vektoren. Die Quelle der NEWM-Gerüstregionen zum Produzieren der anfänglichen humanisierten CC49 VH war ein M13-Konstrukt, das – zwischen den M14 BamHI- und HindIII-Stellen – ein DNA-Segment trägt mit der in 13 gezeigten Nukleotidsequenz. Die Quelle der REI-Gerüstregionen zum Produzieren der anfänglichen humanisierten CC49 VL war ein M13-Konstrukt, das – zwischen den M13 BamH I- und HIND III-Stellen – ein DNA-Segment trägt, das die REI-Aminosäuresequenz von 2 codiert.
Wenn Überlappungsextinktionsverfahren verwendet wurden, um Mutationen in eine gegebene DNA-Sequenz einzuführen, wurde doppelsträngige M13-DNA verwendet. Im Gegensatz hierzu, wenn Extensionsligierungsverfahren anstelle dessen verwendet wurden, wurden die Oligonukleotide so ausgestaltet, um nur an einen der beiden DNA-Stränge zu annealen. In dem letzteren Verfahren wurde die M13-DNA zuerst behandelt, um jede Thymidinbase in der DNA durch Uridin zu ersetzen, um uridinylierte DNA zu produzieren. Dies wurde durchgeführt durch Transfizieren der M13-Plasmid-DNA in kompetente Zellen, denen dUTPase und Uracilglycosylase fehlte, üblicherweise RZ1032-Zellen (wenngleich CJ236-Zellen, die erhältlich sind von Bio-Rad of Hercules, CA, ebenfalls geeignet sind), durch Kombinieren der folgenden Bestandteile.
1 μl M13-Plasmid-DNA
4 ml LB-Nährmedium
40 μl kompetente RZ1032-Zellen.
Die Kultur wurde für 5 Stunden bei 37 °C geschüttelt und die resultierende einsträngige Plasmid-DNA (ssDNA) wurde isoliert und in 50 μl Tris-EDTA-Puffer gelöst. Die DNA wurde dann mit Uracilglycosylase behandelt durch Zusammenmischen von:
1 μl uridinylierte ssDNA
1 μl 10x Glycosylasepuffer
1 U Uracilglycosylase (Gibco BRL, Gathersburg, MD)
40 μl 25 mM MgCl₂.
Dieses Gemisch wurde dann bei 37 °C für 1 Stunde inkubiert und dann wurden 6,6 μl 25 mM MgCl₂ und 9,9 μl 1 M NaOH zugegeben. Das Gemisch wurde dann weiter für 5 Minuten bei 37 °C inkubiert und 16,5 μl 0,6 M HCl wurden dann zugegeben, um das Gemisch zu neutralisieren. Die DNA wurde dann mit Ethanol präzipitiert und in Wasser gelost.
M13 Oligonukleotidprimer
Die folgenden Oligonukleotidprimer wurden durchgehend im Verfahren zum Herstellen humanisierter CC49 VHs und VLs, die unten beispielhaft dargestellt sind, verwendet.
10.5'-CTAAAACGACGGCCAGT-3';
11.5'-AACAGCTATGACCATG-3';
385.5'-GCGGGCGTCTTCGCTATTACGC-3'; und
391.5'-CTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGA-3'.
Diese Primer sind komplementär zu Regionen des Plasmids M13, welche sowohl außerhalb der (NEWM oder REI) Zielgerüstsequenzen als auch dem Abschnitt von M13 von der BamH I-Stel e bis zur Hind III-Stelle sind.
Variable Regionen aus Maus
Zum Vergleichen der Antikörperbindungscharakteristika der gemäß den unten angegebenen Beispielen produzierten Antikörper wurden Antikörper mit einer chimären schweren Kette (d.h. einer schweren Kette mit einer Maus CC49-VH-Region und einer humanen konstanten IgG1-Region) und/oder einer chimären leichten Kette (d.h. eine leichte Kette mit einer Maus-CC49-VL und einer humanen konstanten kappa-Region) exprimiert. Die Quelle dieser chimären Kette war die bei der ATCC hinterlegte Zelllinie HB9884 (Budapest), welche einen chimären CC49-Antikörper exprimiert, der beide Ketten aufweist. Die schwere Kette dieses Antikörpers wurde als „MuVH" bezeichnet und die leichte Kette davon wurde als „MuVL" bezeichnet.
Oligonukleotidphosphorylierungsprotokoll
Mutierende Oligonukleotide, die verwendet werden in Nicht-Überlappungsextensionen wurden gemäß dem unten angegebenen Verfahren phosphoryliert. In einem Endvolumen von 25 μl wurden die folgenden Bestandteile kombiniert:
10 pmol von jedem Oligonukleotid,
5 μl eines 5x Polynukleotidkinasepuffers und
5U T4-Polynukleotidkinase (Gibco BRL).
Die Phosphorylierungsreaktion wurde mit der Zugabe des Enzyms gestartet und man ließ sie für eine Stunde bei 37 °C fortschreiten.
Annealingprotokoll für Nicht-Überlappungsextensionsligierungen
Der Annealingschritt für Nicht-Überlappungsextensionsligierungen umfasste das Durchführen eines Annealings, worin alle Mutations-tragende Oligonukleotide und ein Primeroligonukleotid an ein einsträngiges DNA-Templat annealed wurden, worin alle Thymidinbasen durch Uridinbasen ersetzt worden sind. Die mutierenden Oligonukleotide wurden zuerst gemäß dem obigen Oligonukleotidphosphorylierungsprotokoll phosphoryliert. In einem Endvolumen von 20 μl wurden die folgenden Bestandteile kombiniert:
1 pmol von jedem Mutations-tragenden phosphorylierten Oligonukleotid
1 pmol eines Primeroligonukleotids
4 μl 5x Annealingpuffer
0,2 pmol ssU-DNA-Templat.
Das Gemisch wurde dann auf 90 °C für 30 sec. erhitzt, dann rasch auf 70 °C gekühlt und man ließ es letztendlich langsam auf 37 °C kühlen.
Extensions-Ligierungsprotokoll für Nicht-Überlappungsextensionsligierungen
Nach Abschluss des Annealingschritts, worin der Primer und phosphorylierte mutierende Oligonukleotide annealed wurden an das ssU-DNA-Templat, wurde Extensionsligierung wie folgt durchgeführt. In einem Endvolumen von 30 μl wurden die folgenden Bestandteile kombiniert:
20 μl annealte ssU-DNA (d.h. die Bestandteile des obigen Annealingverfahrens)
2 μl 5x Annealingpuffer
2 μl 0,1 M Dithiotreitol
0,3 μl 0,1 M ATP
1 μl 6,25 mM dNTP-Gemisch äquimolarer Mengen von dATP, dTTP, dGTP, dCTP
2,5U T7 DNA-Polymerase (USB, nun Amersham Life Sciences, Cleveland, OH)
0,5U T4 DNA-Ligase (Gibco BRL)
Wasser auf 30 μl.
Dieses Gemisch wurde dann bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert.
Standard-PCR-Protokolle
Das folgende Verfahren wurde wechselweise verwendet, sowohl zum Amplifizieren der Nicht-Überlappungsextensionsligierungs-DNA-Sequenzen als auch zum Durchführen einer Extension jeder Überlappungs-DNA-Sequenz. In einem Endvolumen von 50 μl wurden die folgenden Bestandteile kombiniert:
2 μl Templat-DNA (entweder annealte ssU-DNA oder nicht-annealte ssDNA)
5 μl 10x Vent-Puffer (NEB, d.h. New England Biolabs, Beverly, MA) oder 10 × Thermalasepuffer (IBI von New Haven, CT)
2 μl 6,25 mM dNTP-Gemisch äquimolarer Mengen von dATP, dTTP, dGTP, dCTP
25 pmol eines Oligonukleotidprimers
25 pmol von entweder einem Mutations-tragenden Oligonukleotid (für Überlappungsextension) oder eines zweiten Oligonukleotidprimers
1 U Vent-DNA-Polymerase (NEB) oder Thermalase DNA Polymerase (IBI).
Reaktionen wurden initiiert durch die Zugabe der DNA-Polymerase und dann behandelt mit etwa 15 Zyklen von: (1) 94 °C für 30 sec., (2) 50 °C für 30 sec. und (3) 30–60 Sekunden bei entweder 75 °C (für Vent-DNA-Polymerase) oder 72 °C (für Thermalase). Die Reaktionen wurden zum Abschluss gebracht durch 5 Minuten bei einer konstanten Temperatur von entweder 75 °C für Vent-DNA-Polymerase oder 72 °C für Thermalase.
PCR-Überlappungsextensionsamplifikationsprotokoll
Nachdem ein Paar PCR-Reaktionen durchgeführt wurden – eine für jedes der beiden (teilweise komplementär) überlappenden DNA-Segmente – wurden die beiden resultierenden Segmente verbunden gemäß den folgenden PCR-Verfahren. In einem Endvolumen von 50 μl wurden die folgenden Bestandteile gemischt:
1 μl von jeder Überlappungs-DNA (für die obigen Überlappungs-PCR-Extensionsreaktionen)
5 μl 10x Vent-Puffer (NEB) oder Thermalasepuffer (IBI)
2 μl 6,25 mM dNTP-Gemisch äquimolarer Mengen von dATP, dTTP, dGTP, dCTP
25 pmol von jedem Oligonukleotidprimer, der verwendet wird in den Überlappungs-PCR-Extensionen
1 U Vent-DNA-Polymerase (NEB) oder Thermalase-DNA-Polymerase (IBI).
Die Reaktionen wurden initiiert durch die Zugabe der DNA-Polymerase und dann behandelt mit etwa 15 Zyklen von: (1) 94 °C für 30 sec. (2) 50 °C für 30 sec. und (3) 30–60 Sekunden bei entweder 75 °C (für Vent-DNA-Polymerase) oder 72 °C (für Thermalase). Die Reaktionen wurden zum Abschluss gebracht mit 5 Minuten bei einer konstanten Temperatur von entweder 75 °C (für Vent-DNA-Polymerase) oder 72 °C (für Thermalase).
Transfer humanisierter CC49-DNA-Sequenzen der variablen Region von M13 auf pSV-Vektoren und nachfolgende Antikörperexpression
Humanisierte Antikörper wurden in pSV-Vektoren exprimiert, die in NSO-Zellen gezüchtet wurden. Die humanisierten variable Region-Konstrukte bzw. humanisierten Konstrukte der variablen Region, welche in dem Plasmid M13 produziert wurden, wurden mit 10U von jeweils HindIII und BamHI (beide von BRL, d.h. Gibco BRL) für 1 Stunde bei 37 °C in einem Endvolumen von 100 μl mit Tris-EDTA-Puffer verdaut. Die resultierenden DNA-Fragmente wurden dann auf einem Agarosegel mit niederem Schmelzpunkt laufengelassen, die Bande, die die humanisiertes Konstrukt-DNA enthielt, wurde herausgeschnitten und die DNA wurde gereinigt unter Verwendung einer ELUTIP ,d‘-Säule mit 20 μl Tris-EDTA-Puffer. 10 μl des gereinigten DNA-Präparats wurden dann kombiniert mit 1 μl eines Hind III- und BamH I-verdauten pSV-Präparats, 3 μl 5x Ligasepuffer und 1 U T4-DNA-Ligase (BRL), um das Konstrukt in ein pSV-Plasmid zu insertieren. Humanisierte CC49 VH-Konstrukte wurden in pSVgpt-Vektoren insertiert, die eine konstante Region der humanen schweren IgG1-Kette aufweisen; der pSVgpt-Vektor, der verwendet wird, ist der „aLYS-30", der in 5 gezeigt ist. Humanisierte CC49 VL-Konstrukte wurden in pSVhyg-Vektoren insertiert, die eine konstante Domäne der humanen leichten kappa-Kette aufweisen; der verwendete pSVhyg-Vektor ist der in „aLYs-17", der in 5 gezeigt wird. Jedes humanisierte Konstrukt der variablen Region wurde benachbart zu der jeweiligen konstanten Region insertiert, d.h., um entweder das HuVHLYS- oder das HuVLLys-Segment, dargestellt in 5, zu ersetzen.
Die resultierenden Vektoren wurden in NSO-Zellen wie folgt transfiziert. Etwa 3 μg des VH-Vektors oder etwa 6 μg des VL-Vektors, produziert durch die pSV-Insertionsverfahren, wurden dann linearisiert durch Verdau mit 10 U Pvu I (Gibco BRL). Die verdaute DNA wurde dann mit Ethanol präzipitiert und wieder aufgelöst in 50 μl Wasser. NSO-Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und in 0,5 ml Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) resuspendiert und dann in eine Gene Pulser Küvette (Bio-Rad) übergeführt. Die DNA aus sowohl einem VH- als auch einem VL-Konstrukt wurde dann vorsichtig gemischt mit den Zellen durch Pipettieren und die Küvette wurde für 5 Minuten auf Eis belassen. Als nächstes wurde die Küvette zwischen den Elektroden des Bio-Rad Gene Pulsers eingeschoben und ein Einzelpuls von 170 V bei 960 μF wurde angelegt. Die Inhalte der Küvette wurden dann in einen Kolben übergeführt, der 20 ml DMEM enthielt und man beließ die Zellen für 1 bis 2 Tage bei 37 °C. Die Zellen wurden erneut durch Zentrifugation geerntet und in 36 ml selektivem DMEM resuspendiert. 1,5 ml-Aliquote dieser Resuspension wurden in jeder Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen angeordnet und bei 37 °C für 4 Tage inkubiert, zu welcher Zeit das Medium in jeder Vertiefung durch 1,5 ml frisches selektives DMEM-Medium ersetzt wurde. Nach sechs weiteren Tagen Inkubation bei 37 °C waren überlebende Zellkolonien für das bloße Auge sichtbar und die Überstände von jeder Vertiefung wurden auf Antikörper-Produktion untersucht. Sowohl Gesamtantikörperproduktion (d.h. ohne Reinigung) als auch Produktion gereinigter Antikörper wurde untersucht. Um gereinigte Antikörper zu erhalten wurden die Überstände durch eine Protein-A-Säule geführt.
ELISA-Assayprotokolle
Antikörperkonzentrationen und Antikörperbindungscharakteristika wurden getestet unter Verwendung von Enzym-verknüpften Immunosorbensassay (ELISA)-Verfahren (Enzyme-linked immunosorbent assay), welche wie folgt angegeben werden.
Messung der IpG-Konzentration
Die Konzentration von IgG, die von transfizierten Zellen sezerniert wird, wurde unter Verwendung eines Enzym-verknüpften Immunosorbensassay (ELISA)-Verfahrens bestimmt, welches wie folgt angegeben wird.
Polyvinylchlorid (PVC)-Miktrotiterplatten (Dynatech Laboratories, Chantilly, VA, Katalog # 001-010-2101) wurde beschichtet mit Ziege-Anti-Human-IgG (10 mg/ml, GAHIG, Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL, Katalog # 2010-01), verdünnt mit Milli-Q^®-Wasser und angeordnet auf den Platten unter Verwendung von 50 ml/Vertiefung. Die Platten wurden über Nacht bei Umgebungstemperatur oder bei 37 °C für 3 Stunden luftgetrocknet. Vor der Verwendung wurde nichtspezifische Bindung blockiert durch die Zugabe von 0,2 ml/Vertiefung 1 % ( Gew./V) Rinderserumalbumin (Sigma, St. Louis, MO-Katalog # A7888) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (Sigma, Katalog # 1000-3) (PBS/BSA). Alle Inkubationen wurden in einer Feuchtekammer durchgeführt. Die Platten wurden für 1 bis 2 Stunden bei 37 °C inkubiert und die Blockierungslösung vor der Probezugabe entfernt. Zweifache Reihenverdünnungen von Proben oder einer Standard-IgG-Lösung, eingestellt auf 500 ng/ml (50 μl/Vertiefung), wurden dreifach in PBS-BSA-Lösung durchgeführt. Die Platte wurde bei 37 °C für 3 Stunden oder über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Platte wurde dreimal mit 0,025 % Tween-20 (V/V, Sigma) gewaschen, unter Verwendung einer Automatikplattenwaschvorrichtung. 50 μl/Vertiefung mit 1:1000-Verdünnung eines Ziege-Anti-human-IgG, konjugiert an Meerrettich-Peroxidase (Southern Biotechnology Associates Inc.) wurden zugegeben und bei 37 °C für 1,5 Stunden inkubiert. Die Vertiefungen wurden dreimal mit 0,025 % Tween-20 (V/V, Sigma) unter Verwendung einer Automatikplattenwaschvorrichtung gewaschen und 50 μl/Vertiefung OPD-Substratpuffer zugegeben. Die Farbe wurde für 4 Minuten entwickelt, mit 12,5 μl 12,5 % H₂SO₄ gestoppt und die Absorption bei 492 nm ausgelesen.
Die Konzentration von IgG in der Testprobe wurde abgeschätzt durch Vergleich des Mittels der optischen Dichten mit einer Standardkurve, die aus dem Standard-IgG konstruiert war.
Bestimmung relativer Affinitäten humanisierter Antikörper
Antikörperbindungscharakteristika wurden in einem ELISA getestet unter Verwendung von partiell gereinigtem TAG-72-Antigen, immobilisiert auf Polyvinylchlorid (PVC) Mikrotiterplatten (Dynatech Laboratories, Chantilly, VA, Katalog # 001-010-2101).
PVC-Platten wurden beschichtet mit 50 μl/Vertiefung TAG-72 (Dow Chemical, Charge #040191), verdünnt 1:300 in Milli-Q-Wasser. Die Platten wurden über Nacht bei Umgebungstemperatur oder bei 37 °C für 3 Stunden luftgetrocknet. Vor der Verwendung wurde nichtspezifische Bindung blockiert durch die Zugabe von 0,2 ml/Vertiefung von 1 % (Gew./V) Rinderserumalbumin (Sigma, St. Louis, MO-Katalog # A7888) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (Sigma, Katalog # 1000-3) (PBS/BSA). Platten wurden inkubiert für 1–2 Stunden bei 37 °C und die Blockierungslösung vor Probenzugabe entfernt. Alle Inkubationen wurden in einer Feuchtekammer durchgeführt. Zweifache Reihenverdünnungen (Ausgangskonzentrationsbereich von 1,0 μg/ml – 10 μg/ml) der in der PBS/BSA-Lösung zu testenden Proben wurden in dreifache Vertiefungen der TAG-beschichteten Platte (50 μl/Vertiefung) gegeben.
Die Platte wurde über Nacht bei 4 °C oder 1 bis 2 Stunden bei 37 °C inkubiert. Die Platte wurde dreimal mit 0,025 % Tween 20 V/V, Sigma) gewaschen unter Verwendung einer Automatikplattenwaschvorrichtung. 50 μl/Vertiefung 1:1000-Verdünnung eines Ziege-Anti-Human-IgG, konjugiert an Meerrettichperoxidase (Southern Biotechnology Associates Inc.) wurden zugegeben und inkubiert bei 37 °C für 1,5 Stunden. Die Vertiefungen wurden dreimal mit 0,025 % Tween 20 (V/V, Sigma) unter Verwendung einer Automatikplattenwaschvorrichtung gewaschen und 50 μl/Vertiefung OPD-Substratpuffer wurden zugegeben. Die Farbe wurde 4 Minuten entwickelt, gestoppt mit 12,5 μl 12,5 % H₂SO₄ und die Absorption bei 492 nm gelesen.
Bestimmung der Affinitätskonstanten zum Binden an TAG-72
Zweifache Verdünnungen gereinigter Hu-CC49 wurden hergestellt in PBS/BSA über einen Bereich von 1,0 μg/ml – 0,003 μg/ml und Proben (20 μl/Vertiefung) wurden dreifach aufgebracht auf TAG-beschichtetes PVC, hergestellt und blockiert wie oben beschrieben. Platten wurden über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nachfolgend auf diese Inkubation wurden Proben von der Platte auf die entsprechenden Vertiefungen auf der GAHIG-beschichteten Abfang-Platte (Trap-Plate) übergeführt. Die anfängliche TAG-Platte wurde dreimal mit 0,025 % Tween-20 (V/V, Sigma, Katalog # P1379) unter Verwendung einer Automatikplattenwaschvorrichtung gewaschen. Eine ¹²⁵I-markierte Ziege-Anti-Human-IgG-Sonde (ICN Biomedicals, Inc., Katalog # 68088) wurde auf 75.000 cpm/25 μl in PBS/BSA verdünnt und in alle Vertiefungen (25 μl/Vertiefung) gegeben. Diese TAG-Platte wurde für 1 Stunde bei 37 °C inkubiert.
Nach 1 Stunde Inkubation bei 37 °C wurde die Abfang-Platte wie oben beschrieben gewaschen und ¹²⁵I-markierte GAHIG-Sonde wurde zugegeben. Diese Platte wurde für 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. Beide Platten (TAG und GAHIG-Abfang), die Sonde enthalten, wurden dann mit einer Mikroplattenwaschvorrichtung gewaschen, um die ungebundene Sonde zu entfernen. Ein Plattenschneidegerät (D. Lee, Sunnyvale, CA, Modell HWC-4) wurde verwendet, um die Vertiefungen vom Plattenrahmen zu entfernen. Die Radioaktivität in jeder Vertiefung wurde durch einen Gamma-Zähler quantifiziert. Die resultierenden Daten wurden gemäß dem Verfahren von Scatchard analysiert (Ann. NYAcad., 51:600–672 (1946)).
Beispiel 1
Herstellung von CDR-gepfropftem (anfänglich humanisiertem) Antikörper aus Maus-CC49
Wir beschreiben in diesem Beispiel den Aufbau von humanisierten CC49-Mabs (CC49 HuVH/HuVK) unter Verwendung der V_L- und V_H-Gerüste von humanen Mabs REI bzw. NEWM. Die CDRs für Maus CC49 wurden auf humane Gerüste gemäß bekannter Verfahren, wie oben diskutiert, gepfropft. Im Speziellen wurden humane Gerüste ausgewählt aus Antikörpern, welche basierend auf früheren Studien laut Voraussage geeignet sind, d.h. welche nicht nachteilig die Antigenbindung beeinflussen sollten und keine wesentliche Immunogenität in Menschen zeigen sollten. Die ausgewählten humanen Gerüste für die variablen schweren bzw. variablen leichten Ketten waren NEWM und REI. Bei der Herstellung der anfänglichen Version des humanisierten VH, wurden ebenfalls bestimmte Mausgerüstreste beibehalten, welche basierend auf früheren Studien Retention von Antigenbindungseigenschaften erlauben könnten. Im Besonderen wurden anfänglich die Reste Y27, T30, A72, F95 und T97 der schweren Kette aus Maus beibehalten. Gleichzeitig wurde eine alternative Version des humanisierten VH produziert, welche zusätzlich den Mausgerüstrest A24 beibehielt.
Die Produktion dieses NEWM-gepfropften humanisierten CC49 VHS wurde durchgeführt gemäß den Annealing- und Extensionsligierungsprotokollen, die oben beschrieben sind, unter Verwendung eines einsträngigen M13-DNA-Templats, das zwischen den Hind III- und BamH I-Stellen davon ein DNA Segment trägt, das die in 13 gezeigte Nukleotidsequenz aufweist. In diesem Verfahren wurde Primer 11 in Verbindung mit einem Satz mutierender Oligonukleotide verwendet. Diese mutierenden Oligonukleotide wurden mit den folgenden Sequenzen ausgestaltet und synthetisiert:
1a. 5'-GCTGTCTCACCCAGTGAATTGCATGGTCAGTGAAGGTGTAGCCAGACACGGTGCAGGTCA-3';
1b. 5'-GCTGTCTCACCCAGTGAATTGCATGGTCAGTGAAGGTGTAGCCAGACGCGGTGCAGGCA-3';
2. 5'-CTGGTGTCTGCCAGCATTGTCACTCTCCCCTTGAACCTCTCATTGTATTTAAAATCATCATTTCCGGGAGAAAAATATCCAATCCACTCAAGAC-3'; und
3. 5'-GGACCCTTGGCCCCAGTAGGCCATATTCAGGGATCTTGTACAGAAATAGACCGCGGTGTC-3'
Kodons, welche in den Oligonukleotiden aufgebaut wurden, um Maus-FR-Aminosäuren beizubehalten, sind im Fettdruck gezeigt. Nach Extensionsligierung wurde amplifizierende PCR durchgeführt, unter Verwendung des Standard-PCR-Protokolls mit Vent-DNA-Polymerase. Die Verwendung von zwei Versionen von mutierendem Oligonukleotid 1 führte zu der Bildung von zwei anfänglichen humanisierten V_HS. Diese wurden als „CC49-NMVH", ebenfalls „HuVH" genannt, (für Konstrukte die Oligonukleotid 1a beinhalten und „HuVHA" (für Konstrukte, die Oligonukleotid 1b enthalten) bezeichnet.
Bei der Herstellung der anfänglichen bzw. Anfangsversion des humanisierten VL wurden keine Grundgerüstreste beibehalten, die für Maus einzigartig sind. Die Produktion des REI-gepfropften humanisierten CC49 V wurde durchgeführt gemäß den Annealing- und Extensions-Ligierungsprotokollen, die oben beschrieben sind, unter Verwendung eines ssM13-Templats, das zwischen den Hind III- und BamH I-Stellen davon ein ssU-DNA-Segment trägt, das die REIVK-Sequenz codiert, die in 2 gezeigt ist. In diesem Verfahren wurde Primer 385 in Verbindung mit einem Satz mutierender Oligonukleotide verwendet. Diese mutierenden Oligonukleotide wurden entwickelt und synthetisiert mit den folgenden Sequenzen:
21. 5'-GTTCTTCTGATTACCACTGTATAAAAGACTTTGACTGGAC-3'
22. 5'-CAGATTCCCTAGCGGATGCCCAGTAG-3';
23. 5'-TTCTACTCACGTGTGATTTGCAGCTTGGTCCCTTGGCCGAACGTGAGGGGATAGGAATAGTATTGCTGGCAGTAGTAG-3' und
24. 5'-GCTCTGGGTCATCTGGATGTCGG-3'.
Nach Extensionsligierung wurde Amplifizierungs-PCR durchgeführt unter Verwendung des oben beschriebenen Thermalase-Standard-PCR-Protokolls. Die resultierende humanisierte VL wurde als „CC49-REVK" bezeichnet und wurde ebenfalls als „HuVK" bezeichnet.
Die beiden schwere Kette-Konstrukte, HuVH und HuVHA und das leichte Kette-Konstrukt, HuVH, welche in M13-Vektoren angeordnet waren, wurden gezüchtet und exprimiert in TG1-Zellen. Die Polypeptidexpressionsprodukte dieser Konstrukte wurden sequenziert und die Aminosäuresequenzen dieser Konstrukte sind in den 1 und 2 dargestellt.
Diese DNA-Konstrukte wurden dann in pSV-Expressionsvektoren insertiert, wie oben beschrieben. Kombinationen dieser miteinander oder mit den ATCC (Budapest) HB 9884 DNA-Sequenzen, die für das chimäre MuVH oder MuVL codieren, wurden dann in NSO-Zellen insertiert. Im Speziellen wurden die folgenden vier Kombinationen von schwere und leichte Kette-Konstrukten getrennt in NSO-Zellen transfiziert, wie oben beschrieben: HuVHA und MuVK, HuVHA und HuVK, MuVH und MuVK und HuVH und HuVK. Diese Kombinationen wurden exprimiert und die resultierenden Antikörper wurden dann auf Antigenbindungscharakteristika unter Verwendung des oben angegebenen ELISA-Assays getestet. Die Ergebnisse dieser Assays sind in den 6 bis 9 gezeigt.
Die Daten in 6 zeigen, dass mit HuVHA, die HuVK-humanisierte leichte Kette ebenso funktioniert wie die MuVK-chimäre leichte Kette. Die 7 und 8 deuten an, dass der vollständig humanisierte HuVH/HuVK-Antikörper TAG-72 ungefähr um das zweifache weniger bindet als der chimäre MuVH/MuVK-Antikörper. Ebenfalls legt 9 nahe, dass die A24-Mutation keine Verstärkung der Antigenbindung produziert; eher bewirkt die A24-Mutation eine ungefähr 2-fache Verringerung der Affinität gemäß Messung durch diesen ELISA-Assay.
Weitere Entwicklung von humanisiertem CC49
Da es erscheint, dass die HuVK humanisierte leichte Kette so gut funktioniert wie die MuVK-chimäre leichte Kette, wurde weitere Arbeit darauf ausgerichtet, um alternative mutierte Versionen der HuVH humanisierten schweren Kette herzustellen. Eine erste Variante von HuVH wurde hergestellt durch Ersetzen des in Position 76 des CC49 NMVH in 1 gezeigten Lysinrests durch den Maus-FR-Rest, Serin. Dies wurde erreicht durch das Vent-DNA-Polymerase-PCR Überlappungsextensionsprotokoll, das oben beschrieben ist, unter Verwendung von zwei Primer- und Mutierungsoligonukleotidpaaren – Oligonukleotide 10 und 4 und Oligonukleotide 11 und 5. Jedes Paar wurde in Verbindung mit einem der Stränge eines dsDNA-Templats – angeordnet zwischen den Hind III und BamH I-Stellen von Plasmid M13 – und welches die Nukleotidsequenz aufweist, die in 14 gezeigt ist (der obere Strang wurde mit Paar 11 & 5 verwendet) verwendet. Mutierende Oligonukleotide 4 und 5 wurden entwickelt und synthetisiert mit den folgenden Sequenzen:
4. 5'-AGACACCAGCAGCAACCAGTTCAG-3'; und
5. 5'-GCTGAACTGGTTGCTGCTGGTGTC-3'.
Die Serinrestkodons sind im Fettdruck gezeigt. Die resultierende humanisierte CC49 V_H wurde als „HuVHS" bezeichnet.
Eine zweite Variante von HuVH wurde hergestellt durch Ersetzen des in Position 74 des CC49 NMVH in 1 gezeigten Restes durch den Maus-FR-Rest, Lysin. Dies wurde erreicht durch das oben beschriebene Vent-DNA-Polymerase PCR Überlappungsextensionsprotokoll, unter Verwendung von zwei Primer- und Mutierungsoligonukleotidpaaren – Oligonukleotide 10 und 6 und Oligonukleotide 11 und 7. Jedes Paar wurde verwendet in Verbindung mit einem der Stränge eines dsDNA-Templats – angeordnet zwischen den Hind III- und BamH I-Stellen von Plasmid M13 – und mit der Nukleotidsequenz, die in 14 gezeigt ist (der obere Strang wurde verwendet mit Paar 11 und 7). Mutierende Oligonukleotide 6 und 7 wurden entwickelt und synthetisiert mit den folgenden Sequenzen.
6. 5'-CTGGCAGACAAGAGCAAGAACCAG-3'.
7. 5'-TGGTTCTTGCTCTTGTCTGCCAGC-3'.
Die Lysinrestkodons sind in Fettdruck gezeigt. Die resultierende CC49 VH wurde als „HuVHK" bezeichnet.
Die beiden schwere Kette-Konstrukte, HUVHS und HUVHK, welche in M13 Vektoren angeordnet waren, wurden gezüchtet und exprimiert in TG1-Zellen. Die Polypeptidexpressionsprodukte dieser Konstrukte wurden sequenziert und die Aminosäuresequenzen dieser Konstrukte sind in 1 dargestellt.
Diese DNA-Konstrukte wurden dann in pSV-Expressionsvektoren insertiert, wie oben beschrieben. Kombinationen dieser mit HUVK wurden dann in NSO-Zellen insertiert. Diese Kombinationen wurden exprimiert und die resultierenden Antikörper wurden dann auf Antigenbindungscharakteristika getestet, unter Verwendung des oben angegebenen ELISA-Assays. Die Ergebnisse dieser Assays sind in den 10 und 11 gezeigt. Diese Figuren zeigen, dass weder die K74- noch S76-Mutation zu verbesserter Antigenbindung führte; tatsächlich bewirkte die S76-Mutation eine ungefähr 2-fache Verringerung der Affinität gemäß Messung durch diesen ELISA-Assay.
Beispiel 2
Messung der Affinitätskonstante für den humanisierten CC49-Antikörper, der in Beispiel 1 erhalten wird.
Die Affinitätskonstante des endgültigen humanisierten CC49-Antikörpers, CC49 HuVH/HuVK von Beispiel 1 (mit Sequenzen der variablen schweren und variablen leichten Kette, gezeigt in 3 bzw. 4) wurde gemessen entsprechend dem ELISA-Assayprotokoll, das oben angegeben ist. Der ATCC (Budapest) HB 9884 chimäre CC49 Antikörper wurde als interne Kontrolle verwendet. Dieser ELISA-Assay wurde wiederholt durchgeführt, unter Verwendung gereinigter Proben humanisierter und chimärer CC49-monoklonaler Antikörper, um die Genauigkeit der erhaltenen Werte zu konkretisieren und der inhärenten Variabilität von Assay zu Assay Rechnung zu tragen. Typische Ergebnisse aus einer solchen Analyse sind in 12 gezeigt. Ein Zusammenfassung der Ergebnisse, die während dieser Analysen erhalten wurde, ist in Tabelle 1 gezeigt.
TABELLE 1 Zusammenfassung der Affinitätskonstantenanalyse humanisierter und chimärer CC49
Diese Ergebnisse zeigen, dass der humanisierte Anti-TAG-72-Antikörper HuVH/HuVK (mit den variablen schweren und variablen leichten Sequenzen, gezeigt in den 3 bzw. 4) eine Bindungsaffinität aufweist, die sich derjenigen eines chimären CC49-Antikörpers (MuVh/MuVK) nähert. Daher wird erwartet, dass dieser humanisierte Antikörper wirkungsvoll TAG-72-exprimierende Karzinome in vivo gerichtet wird. Ebenfalls, basierend auf seiner Sequenz, sollte dieser Antikörper geringe oder keine Immunogenität in Menschen zeigen, und vorteilhafte Plasmaclearance, Metaboliteneigenschaften und wirkungsvolles Tumortargeting in Relation zu dem Maus CC49 und ebenfalls in Relation zu chimären Versionen davon aufweisen.
Eine Mausplasmacytomzelllinie, welche diesen humanisierten CC49-Antikörper produziert, wurde bei der American Type Culture Collection (12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, am 16. Oktober 1996) hinterlegt und diese Zelllinie erhielt die Hinterlegungsnummer ATCC CRL-12209. Diese Hinterlegung wurde durchgeführt gemäß dem Budapester Vertrag. Diese hinterlegte Zelllinie wird unwiderrufbar verfügbar sein, ohne Eingrenzung, nach Erteilung eines Patents auf diese Anmeldung oder eine andere Anmeldung, die Priorität dieser Anmeldung unter 35 U.S.C. § 120 beansprucht.
Basierend auf dem vorhergehenden wird angenommen, dass die in den Beispielen 1 bis 3 offenbarten humanisierten Antikörper Antigenbindungscharakteristika zeigen, d.h. TAG-72-Affinitäten, die vergleichbar sind mit parenteralem monoklonalem Antikörper nCC49 (Mausantikörper) und chimären Antikörpern, die von nCC49, z.B. cCC49, abgeleitet sind. Darüber hinaus werden, basierend auf den vorhergehenden Ergebnissen, diese Antikörper Eigenschaften besitzen, welche sie gut geeignet machen zur Verwendung als in vivo-Diagnostika oder Therapeutika, z.B. verbesserte Serumclearance, Metaboliteneigenschaften und geringe oder keine Immunogenität in Menschen.
Diese Eigenschaften sind sehr signifikant, da diese Eigenschaften die vorliegenden humanisierten Antikörper in die Lage versetzen wiederholt in großen Dosen und über eine ausgedehnte Zeitdauer verabreicht zu werden, ohne wesentliche nachteilige Wirkungen, z.B. eine HAMA-Antwort oder nichtspezifische Cytotoxizität. Dies ist wichtig für Krebsbehandlung, als auch für Krebsdiagnose, da ermöglicht wird, dass diese Antikörper über ausgedehnte Zeitdauern verwendet werden. Darüber hinaus werden die Clearanceeigenschaften der vorliegenden humanen Antikörper es diesen Antikörpern ermöglicht, wirkungsvoll gewünschte Zielstellen anzuvisieren, z.B. TAG-72-exprimierende Karzinome (aufgrund der Wirkungen von Serumclearance auf die Targetingeffizienz). Daher umfassen die humanisierten Antikörper der vorliegenden Erfindung eine wesentliche Verbesserung in Bezug auf früher offenbarte Antikörpern, die spezifisch für TAG-72 sind.
Andere Ausführungsformen der Erfindung werden für den Fachmann ersichtlich werden aus einer Betrachtung dieser Beschreibung oder der Praxis der hier offenbarten Erfindung.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Humanisierter Antikörper oder humansiertes Antikörperfragment davon, welcher bzw. welches spezifisch TAG-72 bindet, dadurch gekennzeichnet, dass der humanisierte Antikörper aufweist: humanisierte variable schwere Kette-Regionen mit der Aminosäuresequenz von 1 oder 3 oder mit der Aminosäuresequenz der humanisierten variablen schwere Kette-Region des humanisierten CC49-Antikörpers, exprimiert durch ATCC CRL 12209; und humanisierte variable leichte Kette-Regionen mit der Aminosäuresequenz von 2 oder 4 oder mit der Aminosäuresequenz der humanisierten variablen leichte Kette-Region des humanisierten CC49-Antikörpers, exprimiert durch ATCC CRL 12209.
Humanisierter Antikörper oder humanisiertes Antikörperfragment nach Anspruch 1, worin der humanisierte Antikörper identisch ist mit dem humanisierten CC49-Antikörper, exprimiert durch ATCC CRL-12209.
Humanisierter Antikörper oder humanisiertes Antikörperfragment nach Anspruch 2, worin der humanisierte Antikörper durch ATCC CRL-12209 exprimiert wird.
Humanisiertes Antikörperfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das humanisierte Antikörperfragment eine humanisierte variable schwere Kette-Sequenz der 1 oder 3 oder eine humanisierte leichte Kette-Sequenz der 2 oder 4 aufweist oder sowohl die humanisierte variable schwere Kette-Sequenz als auch die humanisierte variable leichte Kette-Sequenz aufweist.
Nukleinsäuresequenz, dadurch gekennzeichnet, dass ein humaner Antikörper oder ein humanisiertes Antikörperfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 3 exprimiert werden kann von der Nukleinsäuresequenz.
Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass ein humanisierter Antikörper oder humanisiertes Antikörperfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 3 von dem Vektor exprimiert werden kann.
Vektor nach Anspruch 6, worin der Vektor ein bloßes Nukleinsäuresegment, ein Träger-assoziiertes Nukleinsäuresegment, ein Nukleoprotein, ein Plasmid, ein Virus, ein Viroid oder ein transpositionierbares Element ist.
Zusammensetzung, die geeignet ist zur Behandlung oder zum in vivo- oder in vitro-Nachweis von Krebs, dadurch gekennzeichnet, dass sie jeweils umfasst, eine therapeutisch wirksame Menge oder diagnostisch wirksame Menge eines humanisierten Antikörpers oder humanisierten Antikörperfragments nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
Therapeutische Zusammensetzung, umfassend einen humanisierten Antikörper oder ein humanisiertes Antikörperfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 3, direkt oder indirekt assoziiert mit oder verknüpft mit einem Effektorrest mit therapeutischer Aktivität, wobei der Effektorrest ein Radionuklid, therapeutisches Enzym, Antikrebwirkstoff, Cytokin, Cytoxin oder Antiproliferationsmittel Mittel ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 9 zur Behandlung von Krebs.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, worin der Krebs ein TAG-72-exprimierender Krebs ist.
Zusammensetzung zum Nachweis von Krebs, umfassend einen humanisierten Antikörper oder ein humanisiertes Antikörperfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 3, direkt oder indirekt assoziiert mit oder gebunden an eine nachweisbare Markierung.
Zusammensetzung nach Anspruch 12, worin die nachweisbare Markierung ein Radionuklid oder ein Enzym ist.
Verfahren des in vitro-Immunachweises von TAG-72-exprimierenden Krebszellen, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren durchgeführt wird durch Inkontaktbringen der Krebszellen mit einer Zusammensetzung nach Anspruch 12 oder Anspruch 13.
Verfahren nach Anspruch 14, worin die humanisierten Antikörper oder humanisierten Antikörperfragmente der Zusammensetzung an einen festen Träger gebunden sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 12 oder Anspruch 13, worin der Krebs ein TAG-72-exprimierender Krebs ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 16, worin das Krebsnachweismittel durch in vivo-Tumordarstellung nachweisbar ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 16, worin die nachweisbare Markierung ein Radionuklid ist, worin das Krebsnachweismittel durch eine Radionuklidaktivitätssonde nachweisbar ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 18, worin das Radionuklid ¹²⁵I oder ¹³¹I ist.
Kommerzielle Verpackungseinheit, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 12, 13, 16, 17, 18 oder 19 als aktiven Bestandteil zusammen mit Anleitungen zur Verwendung davon enthält, zur Behandlung oder zum Nachweis von Krebs, worin die Zusammensetzung vor der Verwendung rekonstituiert wird.
Verwendung eines humanisierten Antikörpers oder humanisierten Antikörperfragments nach einem der Ansprüche 1 bis 3 bei der Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Krebs.