DE69827998T2

DE69827998T2 - kurze PNA Oligonukleotide in Triplexkomplexen

Info

Publication number: DE69827998T2
Application number: DE69827998T
Authority: DE
Inventors: Michael Dr. Naesby
Original assignee: PNA Diagnostics ApS Denmark
Current assignee: PNA Diagnostics ApS Denmark
Priority date: 1997-08-22
Filing date: 1998-08-19
Publication date: 2005-10-06
Anticipated expiration: 2018-08-20
Also published as: JPH11127876A; EP0897991A3; EP0897991B1; DE69827998D1; DK0897991T3; JP4235283B2; EP0897991A2; US6979536B1

Description

Gebiet der Erfindung
Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist ein Verfahren zur Bestimmung einer Nukleinsäure durch Bildung eines dreisträngigen Komplexes zwischen der zu bestimmenden Nukleinsäure und zwei oder mehr Sondenmolekülen, der so gebildete dreisträngige Bindungskomplex und die Verwendung von kleinen Triplex-bildenden Nukleinsäure-bindenden Molekülen als Sonden.
Hintergrund der Erfindung
Der Nachweis und die Quantifizierung von Nukleinsäuremolekülen bildet ein grundlegendes Element in mehreren diagnostischen Techniken. Ein wesentliches Merkmal solcher Techniken ist das Vermögen einer Sonde (einer Nukleinsäure oder eines Analogons hiervon), spezifisch an eine komplementäre Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren. Damit eine Hybridisierung stattfindet, müssen einige Standardbedingungen z. B. bezüglich Salzkonzentration und Temperatur erfüllt sein, aber der hauptsächliche determinierende Faktor ist die Zahl an vollständig passenden Nukleobasen in dem Hybrid von zwei hybridisierenden Strängen. In Hybriden von relativ kurzer Länge, z. B. 6-10 Basenpaaren, wird eine einzige Basenpaar-Fehlpaarung zu einer dramatischen Verringerung der thermischen Stabilität führen, wohingegen die relative Verringerung der Stabilität, verursacht durch eine einzige Basenpaar-Fehlpaarung (oder eine Deletion/Insertion), mit zunehmender Länge des Hybrids zunehmend geringer wird.
Für diagnostische Zwecke ist es oft wünschenswert, eine Sequenz von Nukleobasen zu identifizieren, welche nur in einem besonderen Gen oder Organismus vorhanden ist, aber in jedweder Hintergrund-Nukleinsäure abwesend ist, welche in der Probe vorkommen kann. Damit eine besondere Sequenz von Nukleobasen in einer typischen Probe, wie z. B. dem menschlichen Genom, statistisch einmalig ist, muss die Länge der Sequenz in der Größenordnung von mindestens 18-20 Basen liegen, was andererseits ihre Fähigkeit erhöhen wird, Fehlpaarungen bzw. Mismatches ohne dramatischen Verlust der thermischen Stabilität anzunehmen.
Während die Erkennung von Nukleinsäuren im allgemeinen durch die Anwendung von Duplex- oder Triplex-Bildung möglich ist, werden heutezutage für diagnostische Zwecke vorwiegend Duplex-bildende Sonden, welche an einzelsträngige Analyt-Nukleinsäure über Watson-Crick(WC)-Basenpaarung binden, verwendet. Obgleich von Triplex-Strukturen, welche sowohl WC- als auch Hoogsteen-Bindung (H) beteiligen, gezeigt worden ist, thermisch im Vergleich zu Doppelsträngen sehr stabil zu sein, schienen zwei im Konflikt stehende Eigenschaften ihrer Nutzung für diagnostische Zwecke ein Hindernis entgegenzustellen: Weil normalerweise ein ununterbrochener Strang von Purinbasen in einer Triplex-bildenden Zielsequenz erforderlich ist, ist die Chance, gattungs- oder spezies-spezifische Ziele innerhalb einer besonderen NA-Sequenz zu finden, ziemlich gering, da eine solche Sequenz eine bestimmte Länge aufweisen müsste, um spezifisch zu sein. Selbst wenn längere und somit statistisch einmalige Purinsequenzen vorhanden wären, würden die hybridisierenden Eigenschaften von jedweden komplementären Triplex-bildenden Sonden (hohes Bindungsvermögen pro Basenpaar) diese dazu veranlassen, unspezifisch auch an alle Teilsequenzen bis herunter zu 6 oder 7 Basen in Länge zu binden, wodurch sie ihre Spezifität verlieren.
In der WO 92/20702 wird offenbart, dass bestimmte Peptid-Nukleinsäuren in den Strang von doppelsträngiger DNA eindringen und DNA mit hoher Affinität binden können. In der WO 92/20703 wird die Herstellung und Verwendung von Peptid-Nukleinsäuren (PNA) als diagnostische Sonden offenbart. In der WO 95/01370 wird offenbart, dass zwei Moleküle einer identischen Homopyrimidin-Sequenz stabile Triplexstrukturen bilden können, enthaltend zwei Moleküle der PNA und ein Molekül einzelsträngige DNA oder RNA. Diese Strukturen werden sowohl für therapeutische als auch diagnostische Verwendung offenbart. Hyrup, B., und Nielsen, P.E. (1996), Bioorganic and Medicinal Chemistry, 4: 5, fassen die Eigenschaften und die potentiellen Anwendungen von PNA zusammen.
In der WO 96/02558 werden Moleküle offenbart, welche zwei Segmente von identischer Sequenz aber antiparalleler Orientierung, verknüpft durch eine Verbrückungseinheit, enthalten. Von solchen Molekülen wird offenbart, eine kleine aber signifikante Erhöhung in der Tm aufzuweisen, verglichen mit dem aus unabhängigen PNAs, welche jeweils die Sequenz von einem der Segmente aufweisen, gebildeten Komplex. Dies wird der hohen lokalen Konzentration der kovalent verknüpften PNA-Stränge zugeschrieben. Die offenbarten Segmente haben im allgemeinen eine Län ge von 6 oder mehr Basen. Die verknüpften Peptid-Nukleinsäuren dieser Offenbarung leiden unter dem Hauptproblem, dass für eine ausreichend große Sequenzspezifität der Bindung die Notwendigkeit nach einem relativ großen Pyrimidin-Abschnitt besteht, entsprechend einem komplementären Purin-Abschnitt in der Analyt-Nukleinsäure, was zu sehr hohen Spiegeln an unspezifischer Bindung führen würde.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, sequenzspezifische Komplexe vorzusehen, enthaltend drei unabhängige Stränge, gebunden durch Tripelhelix-Bildung, wobei einer der Stränge ein kurzes Triplex-bildendes Sondenmolekül ist.
Zusammenfassung der Erfindung
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung einer Nukleinsäure A, umfassend die Bildung eines dreisträngigen Bindungskomplexes zwischen der Nukleinsäure A, einem ersten Nukleinsäure-A-bindenden Molekül B und mindestens einem weiteren die Nukleinsäure-A-bindenden Molekül C mit einer zur Sequenz von B verschiedenen Basensequenz und das Bestimmen der Gegenwart oder Menge des Bindungskomplexes als Maß für die Gegenwart oder Menge der Nukleinsäure, wobei der dreisträngige Komplex unter Bedingungen gebildet wird, bei denen der dreisträngige Komplex zwischen A, B und dem einen oder mehreren unterschiedlichen Molekülen C thermisch stabiler ist als ein dreisträngiger Komplex, gebildet aus zwei Molekülen von B oder zwei identischen Molekülen von C, mit einem Molekül von A.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Feststellung, daß das Ziel erreicht werden kann durch Stabilisieren eines kurzen Hoogsteen(H)-bindenden Oligomeren durch ein längeres Watson-Crick-bindendes Oligomer. Dies umgeht die Anforderung nach einem langen Homopurin-Abschnitt in einer spezifischen Zielsequenz und macht es gleichzeitig möglich, dass hohe Unterscheidungsvermögen kurzer Hoogsteen-bindender Sonden ohne Verlust der Spezifität auszunutzen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein dreisträngiger Bindungskomplex zwischen einer Nukleinsäure A, einem ersten die Nukleinsäure-bindenden Molekül B und mindestens einem weiteren die Nukleinsäure-bindenden Molekül C mit einer zu B verschiedenen Basensequenz, dadurch gekennzeichnet, dass er thermisch stabiler ist als ein dreisträngiger Komplex, gebildet aus zwei Molekülen B oder zwei identischen Molekülen von C, mit einem Molekül von A.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines Nukleinsäure-bindenden Moleküls mit einer Länge von 4 bis 10, vorzugsweise 5 bis 8 Basen als Sonde zur spezifischen Bestimmung einer Nukleinsäure.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die gesteuerte Bindung eines kurzen Triplex-bildenden Oligomeren (B) unter Bedingungen, bei denen es nicht von selbst stabile Hybride mit einer Nukleinsäure (A) bilden wird, durch die gesteuerte Bindung von einem oder mehreren duplex-bildenden Oligomer(en) mit gemischter Sequenz (C).
Weitere Gegenstände der Erfindung werden in den Nebenansprüchen offenbart.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1 zeigt die theoretisch möglichen dreisträngigen Komplexe, gebildet in einer Mischung, enthaltend die Analyt-Nukleinsäure A, eine kürzere Sonde B und eine längere Sonde C. Bei passenden Hybridisierungsbedingungen wird die Bildung des Komplexes 1a gegenüber der Bildung von Komplex 1b für eine spezifische Analyt-Nukleinsäure A begünstigt.
In der 2 wird gezeigt, dass bei einem Komplex 2b, der eine Sonde C mit einem Mismatch außerhalb der tripelhelikalen Bindungsregion einschließt, die Komplexbildung nicht begünstigt wird, verglichen mit dem Komplex 2a, der die vollständig passende Sonde C einschließt.
3 zeigt diesselbe Anordnung wie 2, ist jedoch dadurch gekennzeichnet, dass anstatt einer einzelnen längeren Sonde C zwei kleinere Sonden C1 und C2 verwendet werden.
Die 4 zeigt, dass in einer Anordnung von 3 die zwei Sonden C1 und C2 aneinandergrenzend innerhalb der tripelhelikalen Bindungsregion gebunden werden müssen, damit eine stabile Triplexbildung stattfindet.
Die 5 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, wobei die Nukleinsäure während der Amplifikation markiert wird und die korrekten Amp licons durch die Verwendung einer unterschiedlich markierten Sonde B bestimmt werden.
Die 6a, 6b, 7a, 7b und 8 zeigen die Ergebnisse von Experimenten, durchgeführt in den Beispielen 1 bis 3.
Die 9 zeigt einen ersten Modus zur Destabilisierung von AB₂.
Die 10A zeigt den Fall, worin die zu bestimmende Nukleinsäure (A) vollständig sowohl zu Sonde C2 als auch Sonde D passt, aber die Sonde C2 die höhere Affinität für die zu bestimmende Nukleinsäure besitzt. In diesem Fall kann die tripelhelikale Struktur gebildet werden, weil C1 und C2 nach der Bindung lediglich durch einen Nick getrennt werden. In der 10B wird der Fall gezeigt, worin die Zielnukleinsäure (A) einen Mismatch in Bezug auf C2 aber nicht auf die Kompetitor-Sonde D aufweist. Diese Situation begünstigt die Bindung von D an das Ziel, was zu einer Lücke zwischen D und C1 führt, welche die Bildung der Tripelhelix verhindern wird. So kann die nicht zu bestimmende Nukleinsäure von der zu bestimmenden Nukleinsäure unterschieden werden.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die zu bestimmende Nukleinsäure A versteht sich in der vorliegenden Erfindung als eine Analyt-Nukleinsäure oder eine hiervon abgeleitete Nukleinsäure. Analyt-Nukleinsäuren schließen Nukleinsäuren von jedwedem Ursprung, zum Beispiel Nukleinsäuren pflanzlichen, tierischen, menschlichen, viralen, bakteriellen oder nicht-natürlichen Ursprungs ein. Sie können in Lösung, Suspension, aber auch fixiert an feste Träger oder enthalten in zellhaltigen Medien, Zellschmiers, fixierten Zellen, Geweben oder fixierten Organismen vorhanden sein. Hieraus abgeleitete Nukleinsäuren sind Nukleinsäuren, hergestellt aus Analyt-Nukleinsäuren oder Teilen davon, zum Beispiel als Kopien der obenstehend erwähnten Nukleinsäuren oder Teilen davon. Diese Kopien schließen von dieser Original-Analyt-Nukleinsäure durch Amplifiaktion erzeugte Nukleinsäuren ein, einschließlich jeglicher Replikations- oder/und Transkriptions-/reverser Transkriptions-Reaktionen, beispielsweise der Polymerasekettenreaktion.
Proben, welche die zu bestimmende Nukleinsäure enthalten, werden oft vorbehandelt, um den Analyt für die Hybridisierung zugänglich zu machen. Eine solche Vor behandlung kann Zell-Lyse und Denaturieren von doppelsträngigen Nukleinsäuren durch Ändern des pH zur alkalischen Region, Wiederholen von extremen Temperaturänderungen (Gefrieren/Auftauen), Ändern der physiologischen Sondenbedingungen (osmotischer Druck), Verwendung von Detergenzien, chaotropen Salzen oder Enzymen (z. B. Proteasen, Lipase) einschließen. Diese Schritte können entweder allein oder in Kombination angewandt werden, um die Nukleinsäuren in einer zugänglichen Form freizusetzen. In manchen Fällen kann es vorteilhaft sein, die Nukleinsäuren von anderen Komponenten der Probe, wie Proteinen, Zellen, Zellfragmenten, aber auch Nukleinsäuren, deren Nachweis nicht beabsichtigt ist, abzutrennen. Darüber hinaus kann es vorteilhaft sein, die Analyt-Nukleinsäure zu denaturieren, um sie einzelsträngig und frei von Sekundärstrukturen zu machen.
Ein Nukleinsäure-bindendes Molekül gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Molekül, das die Sequenz von Nukleobasen auf Nukleinsäure A durch Wasserstoffbrückenbindung erkennt, wie allgemein von der natürlichen Erkennung von Nukleobasen in doppelsträngigen Nukleinsäuren bekannt, wie zwischen den Basen A und T oder U und zwischen den Basen C und G. Die Erkennung kann zum Beispiel zwischen natürlichen vorkommenden Nukleobasen aber auch zwischen natürlichen Basen und nicht-natürlichen Basen und zwischen nicht-natürlichen Basen und nicht-natürlichen Basen stattfinden. Nicht-natürliche Basen sind zum Beispiel Basen, wie dargelegt in der WO 96/02558, speziell heterocyclische Iso-Pyrimidin-Basen. Diese wasserstoffbrückenbildenden Einheiten sind in aufeinanderfolgender Weise an das Grundgerüst angehängt, so dass eine Bindung stattfinden kann. Geeignete Grundgerüste sind das natürlich vorkommende Phosphat-Zucker-Grundgerüst (wie in Nukleinsäuren, DNA und RNA) und jegliche nicht-natürlich vorkommenden Grundgerüste (wie in Peptid-Nukleinsäuren (PNA)).
Vorzugsweise besitzen die Nukleinsäure-bindenden Moleküle ein polymeres Grundgerüst, das von dem natürlichen Zucker-Phosphat-Grundgerüst verschieden ist. Beispiele solcher Sondenmoleküle sind jetzt im Fach gut bekannt. Diese Sonden können auf monomeren Untereinheiten basieren, welche auf repetitive Weise verknüpft sind. Es wird bevorzugt, dass das Sondenmolekül monomere Untereinheiten enthält, welche durch Peptidbindungen an andere monomere Untereinheiten verknüpft sind. Die Peptidbindung versteht sich als die Bindung, welche ein primäres oder sekundäres Amin und einen Carbonsäurerest verbindet. Andere Typen von Bindungen innerhalb der Monomere oder das Verbinden von einem oder mehreren Monomeren in dem Grundgerüst sind möglich, beispielsweise Ether- oder Aminobindungen. Bei spiele solcher Sondenmoleküle werden in der WO 92/20702, einschließlich Sondenmolekülen mit an Aza-Stickstoffatome gebundenen Liganden, WO 94/25477 und WO 96/20212 beschrieben. Sondenmoleküle mit gemischten verschiedenen Bindungen zwischen den Monomeren werden in der EP-A-0 672 677 beschrieben. Der Begriff Sondenmolekül beinhaltet ferner Moleküle, welche den obenstehenden Abschnitt des nicht-natürlichen Grundgerüsts und einen zusätzlichen Abschnitt des natürlichen Zucker-Phosphat-Grundgerüsts aufweisen. Solche Chimären können eine etwas niedrigere Affinität gegenüber komplementären Nukleinsäuren besitzen, sind aber nichtsdestoweniger in der vorliegenden Erfindung verwendbar.
Der Begriff Grundgerüst soll in der vorliegenden Erfindung die polymere Einheit bedeuten, an welche an verschiedenen Anheftungspunkten heterocyclische Baseneinheiten in aufeinanderfolgender Weise gebunden werden, worin die Abstände zwischen den für die Anheftung einer Baseneinheit auf dem Grundgerüst verwendeten Atomen voneinander durch einen Abschnitt von 4 bis 8, vorzugsweise 6 Atomen getrennt sind, am stärksten bevorzugt einschließlich der Peptidgruppe (CONH).
Bevorzugte Sondenmoleküle sind Verbindungen der allgemeinen Formel I
Formel I worin
n eine ganze Zahl von mindestens 3 ist,
x eine ganze Zahl von 2 bis n – 1 ist,
jedes von L¹-Lⁿ ein Ligand ist, unabhängig gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, Hydroxy, (C₁-C₄)-Alkanoyl, natürlich vorkommenden Nukleobasen, nicht-natürlich vorkommenden Nukleobasen, aromatischen Einheiten, DNA-Interkalatoren, Nukleobasen-bindenden Gruppen, heterocyclischen Einheiten, Reporterliganden und chelatbildenden Einheiten, worin mindestens eines von L¹-Lⁿ, vorzugsweise mindestens eines von L²-L^n-1 ein Nicht-Nukleobasen-Elektronenakzeptor oder eine Donoreinheit ist und mindestens 2 von L¹-Lⁿ eine Nukleobasen-bindende Gruppe oder eine natürlich oder nicht-natürlich vorkommende Nukleobase sind,
jedes von C¹-Cⁿ (CR⁶R⁷)_y (vorzugsweise CR⁶R⁷, CHR⁶CHR⁷ oder CR⁶R⁷CH₂) ist, worin R⁶ Wasserstoff ist und R⁷ gewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus den Seitenketten von natürlich vorkommenden alpha-Aminosäuren, oder R⁶ und R⁷ unabhängig gewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, (C₁-C₆)-Alkyl, Aryl, Aralkyl, Heteroaryl, Hydroxy, (C₁-C₆)-Alkoxy, (C₁-C₆)-Alkylthio, NR³R⁴ und SR⁵, worin R³ und R⁴ wie nachstehend definiert sind, und R⁵ Wasserstoff, (C₁-C₆)-Alkyl, Hydroxy, (C₁-C₆)-Alkoxy oder (C₁-C₆)-Alkylthio-substiuiertes (C₁-C₆)-Alkyl ist, oder R⁶ und R⁷ zusammengenommen ein alicyclisches oder heterocyclisches System vervollständigen; oder C¹-Cⁿ für CO, CS, CNR³ steht;
jedes von D¹-Dⁿ (CR⁶R⁷)_z (vorzugsweise CR⁶R⁷, CHR⁶CHR⁷ oder CH₂CR⁶R⁷) ist, worin R⁶ und R⁷ wie obenstehend definiert sind,
jedes von y und z Null ist oder eine ganze Zahl von 1 bis 10, wobei die Summe y + z mindestens 2, vorzugsweise grösser als 2, aber nicht grösser als 10 ist,
jedes von G¹-G^n-1 -NR³CO-, -NR³CS-, -NR³SO- oder -NR³SO^2–, in beliebiger Orientierung, ist, wobei R³ wie nachstehend definiert ist;
jedes von A¹-Aⁿ und B¹-Bⁿ so gewählt werden, dass:

(a) A¹-Aⁿ eine Gruppe der Formel (II/A), (II,B), (II/C) oder (II/D) ist, und B¹-Bⁿ N oder R³N⁺ ist, oder
(b) A¹-Aⁿ eine Gruppe der Formel (II/D) ist, und B¹-Bⁿ für CH steht;

³

₂

₃

₂

⁴

¹

²

₁

₄

₁

₄

₁

₄

₁

₄

₁

₄

³

⁴

₁

₄

₁

₄

₁

₆

₁

₆

₂

₃

₂

₃

Bevorzugte Sonden enthalten mindestens eine Monomeruntereinheit der Formel III
Formel III worin für A, B, C, D, G, L die obenstehenden Definitionen für A^X, B^X, C^X, D^X, G^X und L^X zutreffen.
Alkoxy- und Alkylthiogruppen enthalten vorzugsweise von 1 bis 4 Kohlenstoffatome.
Ein Beispiel für eine kondensierte aromatische Einheit ist Naphthol. Eine heterocyclische Einheit ist beispielsweise Pyridin. Reportergruppen sind Einheiten, welche nachgewiesen werden können, wie fluoreszierende Verbindungen, beispielsweise Fluorescein, oder Gruppen bzw. Einheiten, welche von einer anderen molekularen Einheit erkannt werden können, wie Haptene, welche von einem gegen dieses Hapten herangezogenen Antikörper erkannt werden können.
In den obenstehenden Strukturen, worin Q oder I ein Oligonukleotid oder Oligonukleosid ist, können solche Strukturen als chimäre Strukturen zwischen PNA-Verbindungen und dem Oligonukleotid oder Oligonukleosid betrachtet werden.
Bei den Linkern A¹-Aⁿ für die Bindung von Akzeptoreinheiten wird im Allgemeinen eine Länge zwischen 1 bis 10 Atomen bevorzugt, am stärksten bevorzugt 2 bis 6 Atomen, für Donor-Einheiten eine Länge von 1 bis 10, am stärksten bevorzugt 2 bis 8 Atomen.
Stärker bevorzugt sind Verbindungen der Untergruppen Ia-Ib, basierend auf der allgemeinen Formel I, worin

(Ia): B¹-Bⁿ ist N und A¹-Aⁿ ist -CO-(CH₂)₆-
(Ib): B¹-Bⁿ ist N und A¹-Aⁿ ist -CO-NR³-(CH₂)₂-
(Ic): B¹-Bⁿ ist CH und A¹-Aⁿ ist -NR³-CO-(CH₂)₂-

Bevorzugte PNA-enthaltende Verbindungen, nützlich zur Bewirkung einer Bindung an RNA, ssDNA und dsDNA und zur Bildung von triplexierenden Strukturen sind Verbindungen der Formel IIa, IIb und IIc:
worin:
jedes L unabhängig gewählt wird aus den Definitionen von L¹-Lⁿ in Formel I,
jedes R⁷ unabhängig gewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff und den Seitenketten von natürlich vorkommender alpha-Aminosäure,
n eine ganze Zahl größer als 1 ist,
jedes k, l und m unabhängig Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist,
jedes p für Null oder 1 steht, und
R^h und Rⁱ so beschaffen sind, wie definiert für R', R'' und R'''.
Markierungen sind im allgemeinen als Einheiten bekannt, welche selbst immobilisierbar oder nachweisbar sind oder durch Kopplung an zusätzliche Einheiten immobilisiert/nachgewiesen werden können. Beispiele von Markierungen sind fluoreszierende Einheiten (z. B. Fluorescein oder Rhodamin), Enzyme (z. B. Peroxidase oder Phosphatase), immunologisch aktive Substanzen, wie Haptene (z. B. Digoxigenin), oder proteinbindende Anker (z. B. Biotin), etc.
Die am stärksten bevorzugten Nukleinsäure-bindenden Verbindungen umfassen mindestens eine monomere Untereinheit der allgemeinen Formel V:
(V) worin
L ein Ligand ist, wie obenstehend definiert für L¹-Lⁿ,
k, l und m unabhängig voneinander Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 5 sind,
p Null oder 1 ist, und
R⁷ gewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff und den Seitenketten von natürlich vorkommenden alpha-Aminosäuren.
Diese Verbindungen können analog zu der Synthese hergestellt werden, beschrieben in WO 92/20702, WO 94/25477, WO 96/20212, EP-0 672 677 und EP-0 700 928. Ein bevorzugter Weg zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel I ist die schrittweise chemische Synthese gemäß WO 92/20702, beinhaltend als Monomer eine Verbindung der allgemeinen Formel VIa-VIc
worin die Definitionen von A, B, C und D gewählt sind aus den Definitionen von A¹-Aⁿ, B¹-Bⁿ, C¹-Cⁿ bzw. D¹-Dⁿ in der Formel I, jeweils unter der Bedingung, daß jegliche Aminogruppen darin durch Amino-Schutzgruppen geschützt sein können; E für COOH, CSOH, SOOH, SO₂OH oder ein aktiviertes Derivat hiervon steht; F für NHR³ oder NPgaR³ steht, worin R³ wie obenstehend definiert ist und Pga eine Amino-Schutzgruppe ist, und L wie obenstehend definiert oder ein geschütztes Derivat hiervon ist.
Bevorzugte Monomere sind Aminosäuren mit der Formel (VII)
VII worin X eine Carbonsäure-Schutzgruppe oder Wasserstoff ist, R⁷ unabhängig gewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff und den Seitenketten von natürlich vorkommenden alpha-Aminosäuren oder Amino-geschützten und/oder säureterminal-aktivierten Derivaten hiervon.
Die Sequenzen von B und C werden vorzugsweise so gewählt, daß mindestens eine von ihnen für die Analyt-Nukleinsäure selektiv ist. Vorzugsweise ist B nicht-selektiv und C ist selektiv, woraus folgt, daß die von B gebundene Sequenz kürzer als die von C gebundene Sequenz ist.
Ferner ist der Komplex ABC vorzugsweise stabiler als die Doppelhelix von A und ihrem Komplement A' (wie zum Beispiel in natürlicher dsDNA), wenn ein solches Komplement in der Probe vorhanden ist.
Die molekulare Struktur von Nukleinsäure-bindenden Molekülen B und C (neben den Sequenzanforderungen) kann im Allgemeinen entweder die gleiche oder verschieden sein. Allerdings wird es stark bevorzugt, daß mindestens eines der Moleküle B und C eine Nukleinsäure-bindende Verbindung ist, welche ein nicht-natürlich vorkommendes Grundgerüst umfaßt. Am meisten bevorzugt sind beide Moleküle B und C Nukleinsäure-bindende Verbindungen mit einem nicht-natürlichen Grundgerüst. Im Folgenden wird auf die Moleküle B und C als Sonden Bezug genommen. Die allgemeine Anforderung für die Bildung eines Komplexes gemäß der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß die Moleküle A, B und C zur Bildung einer tripelhelikalen Struktur innerhalb einer Region in der Lage sind, welche im Folgenden als die tripel- bzw. dreisträngige Region bezeichnet wird. Es wird deshalb gemäß der Erfindung bevorzugt, daß die Sonden, welche innerhalb dieser Region binden, keine Zucker-Phosphat-Grundgerüsteinheiten enthalten.
Ein Kernpunkt der vorliegenden Erfindung ist die Bildung eines Komplexes, enthaltend mindestens den Nukleinsäurestrang A, ein Bindungsmolekül B und mindestens ein weiteres Nukleinsäure-Bindungs-Molekül C mit einer von der Sequenz von B verschiedenen Basensequenz. Diese mindestens drei Moleküle werden unter solchen Bedingungen inkubiert, daß ein dreisträngiger Komplex gebildet wird, der alle diese Moleküle enthält. Jegliche anderen Komplexe, welche die Nukleinsäure A und das Molekül B enthalten, sollten nicht zu einem nachweisbaren oder störenden Ausmaß gebildet werden. Dies kann auf mehreren Wegen erreicht werden, von denen einige mit der Konstruktion von Molekül C zusammenhängen.
In einer ersten Ausführungsform enthält der tripelsträngige Komplex die Nukleinsäure A, ein Molekül von B und ein Molekül von C in der tripelsträngigen Region. In einer bevorzugten Ausführungsform besitzt die tripelsträngige Region von ABC eine Länge von mehr als 3, aber weniger als 11, vorzugsweise mehr als 4, aber weniger als 9 Basen. Das Molekül B sollte deshalb eine Länge besitzen, welche diese Region abdeckt. Allerdings können an B andere Einheiten angeheftet sein, welche nicht mit seiner Fähigkeit in Konflikt stehen, an der tripelsträngigen Struktur teilzunehmen. Solche Einheiten können Markierungen oder weitere Erkennungs-Einheiten, wie Nukleinsäure-bindende Moleküle, welche nicht an der tripelsträngigen Struktur teilhaben, beispielsweise verwendet als spezifisch erkennbare Sequenzen zur Bindung einer sekundären Sonde, einschließen. Vorzugsweise enthält der Teil von B, welcher an der Tripelhelixbildung teilnimmt, keinerlei Nicht-Pyrimidin-Basen.
In praktischer Hinsicht enthält das Molekül C eine Region Cy, welche an der Tripelstrangbildung durch Bindung auf eine WC-Weise an die Nukleinsäure A teilnimmt. Darüber hinaus besitzt das Molekül C an einem oder beiden Enden von Sequenz Cy ein oder mehrere weitere Segment(e), welche Nukleinsäure A binden, vorzugsweise durch Doppelhelix-Bildung mit der Nukleinsäure A. Am stärksten bevorzugt besitzen diese Segmente eine Länge von 1 bis 20, weiter bevorzugt von 2 bis 8 und am stärksten bevorzugt von 2 bis 4 Basen. Diese Segmente werden im Folgenden als Cx und Cz bezeichnet. In dem Fall, daß C ein Segment Cx und ein Segment Cz aufweist, können diese Segmente entweder von gleicher oder unterschiedlicher Länge sein. Die Bindungsregion von Molekül C schließt in dieser Ausführungsform deshalb eine Triplex-bildende Region und eine oder zwei Duplex-bildende Regionen ein. Die Länge von Molekül C sollte ausgewählt werden, wie es allgemein vom Fachmann auf dem Gebiet anerkannt wird. Dies bedeutet, daß die Länge von Molekül C so sein sollte, daß es selektiv ist. Dies hängt natürlich von dem Vorkommen von Nukleinsäuren in der Probe und ihrer Sequenzähnlichkeit zur Nukleinsäure A ab. In speziellen Fällen muß die Länge von C nicht mehr als 6-9 Basen betragen, aber im allgemeinen sollte die Bindungssequenz von C, für eine ausreichende Unterscheidung ähnlicher Sequenzen, im Bereich von 10 bis 40 basenpaarenden Einheiten liegen. Die bevorzugte gesamte Nukleinsäure-A-Bindungs-Länge von Molekül C beläuft sich auf mindestens 12 Basen, weil das Molekül C in der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet wird, um die Baseninformation zu enthalten, um zwischen Nukleinsäure A und nicht zu bestimmenden Nukleinsäuren zu unterscheiden.
Diese Ausführungsform der Erfindung wird in der 1 beispielhaft veranschaulicht. Abhängig von den Hybridisierungsbedingungen wird ein kurzes PNA-Oligo (B) an den Analyt (A) über Hoogsteen-Basenpaarung nur binden, wenn es durch ein anderes längeres PNA-Oligo (C) stabilisiert wird, welches an den Analyt (A) durch Watson-Crick-Basenpaarung bindet (siehe 1a). Unter ähnlichen Hybridisierungsbedingungen sind zwei Moleküle des kurzen PNA-Oligos (B) nicht in der Lage, stabile Triplexstrukturen mit dem Analyt (A) (siehe 1b) zu bilden, und ebensowenig bildet B allein einen stabilen Duplex mit A.
Die Selektivität von C für A kann innerhalb jedwedes Segmentes von C lokalisiert sein. Gemäß der vorliegenden Erfindung und hinsichtlich der Tatsache, daß nur sehr wenige Nukleinsäuren auf der Grundlage von kurzen Purin-Abschnitten unterschieden werden können, kann das Molekül C jedoch entworfen werden, um für die zu bestimmende Nukleinsäuresequenz in mindestens einem der Segmente Cx und Cz spezifisch zu sein. Um Selektivität zu erzielen, erstrecken sich diese Segmente von dem Purin-Abschnitt für die Bindung von Molekül B, so daß das Segment Cx oder Cz den Sequenzunterschied zwischen Nukleinsäure A und der nicht zu bestimmenden Nukleinsäure einschließt (wodurch ein Mismatch zu der nicht zu bestimmenden Nukleinsäure erzeugt wird).
Diese Ausführungsform wird in der 2 beispielhaft veranschaulicht. Eine zwischen dem Analyt (A), einem kurzen Hoogsteen-bindenden PNA-Oligo (B) und einem Watson-Crick-bindenden PNA-Oligo (siehe 2a) gebildete Triplexstruktur wird destabilisiert, wenn ein Mismatch eingeführt wird, auch außerhalb der von (B) abgegrenzten Triplex-Region, und die Triplexstruktur (siehe 2b) wird nicht gebildet.
In einer zweiten Ausführungsform können Fehlpaarungen zwischen Molekül C und jeglichen nicht zu bestimmenden Nukleinsäuren innerhalb der anderen Segmente, einschließlich Segment Cy, lokalisiert sein. Dies wird die Bildung des tripelsträngigen Komplexes von C mit der nicht zu bestimmenden Nukleinsäure und dem Molekül B zusätzlich destabilisieren.
In einer zweiten Hauptform der Erfindung enthält die tripelsträngige Region ein zusätzliches Molekül C, so daß der tripelsträngige Komplex die Analyt-Nukleinsäure A, ein Molekül B und zwei getrennte Moleküle C (im Folgenden bezeichnet als C1 und C2) enthalten wird. Jedes dieser Moleküle C kann eine Länge von 5 bis 40 Basen besitzen. Um diesen Komplex zu erzeugen, umfassen die Moleküle C jeweils ein Segment Cy (Cy1 bzw. Cy2), welche gemeinsam zur Bildung einer tripelsträngigen Struktur mit der Bindungsregion der Analyt-Nukleinsäure (A) und einem Molekül B in der Lage sind. Die Sequenz von jedem der Segmente (Cy) wird so gewählt, daß eine exklusive Bindung an die Analyt-Nukleinsäure ausgeführt wird. Exklusiv in diesem Zusammenhang bedeutet, daß die Bindungsregion der Segmente Cy1 und Cy2 auf A nicht überlappen. Vorzugsweise sind diese Bindungsregionen aneinander angrenzend, so daß bei Bindung C1 und C2 eine sehr kleine Lücke, vorzugsweise von 2 bis 1 Nukleotiden, am stärksten bevorzugt einen Nick (kein Nukleotid) zwischen den Enden der Segmente Cy1 und Cy2 bilden. C1 und C2 können unabhängig Segmente Cx oder Cz enthalten, ausgelegt für die doppelsträngige Bindung von Sonden C1 und C2 an die Analyt-Nukleinsäure. Diese Segmente Cx und Cz werden vorzugsweise an Segmente Cy1 und Cy2 an den Enden dieser Segmente, welche voneinander abgewandt sind, gebunden. C1 und C2 enthalten vorzugsweise keine Segmente an den Enden von Cy1 und Cy2, welche zueinander weisen.
Eine Zeichnung, welche diese Ausführungsform zeigt, ist in der 3 enthalten. Abhängig von den Hybridisierungsbedingungen kann ein kurzes PNA-Oligo (B) an den Analyt (A) über Hoogsteen-Basenpaarung binden, bei Stabilisierung durch zwei aneinandergrenzend gebundene PNA-Oligos (C1 und C2), welche an den Analyt (A) durch Watson-Crick-Basenpaarung binden (siehe 3a). Wenn ein Mismatch in C1 oder C2 eingeführt wird, auch außerhalb der von B abgegrenzten Triplexregion, wird die gesamte Triplexstruktur (siehe 3b) destabilisiert werden und wird nicht gebildet werden. In der Ausführungsform unter Verwendung von zwei Molekülen, C1 und C2, wird die Spezifität des Verfahrens wesentlich erhöht. Aufgrund der Tatsache, daß die Bildung des kompletten tripelsträngigen Komplexes ein unterscheidender Faktor zwischen Analyt- und Nicht-Analyt-Nukleinsäuren ist, ist die vorliegende Erfindung ebenfalls in hohem Maße geeignet für die Bestimmung von Analyt-Nukleinsäuren, welche sich von nicht zu bestimmenden Nukleinsäuren durch Deletionen oder Insertionen unterscheiden. Eine derartige Anordnung wird in der 4 gezeigt. Wenn zwei PNA-Oligos (C1 und C2), hybridisierend durch Watson-Crick-Basenpaarung, aneinandergrenzend auf dem Analyt (A) gebunden werden, können sie zusammenwirken, um die Bindung eines kurzen PNA-Oligos (B), welches über Hoogsteen-Basenpaarung an (A) hybridisiert, zu fördern, und eine Triplexstruktur wird gebildet werden (siehe 4a). Wenn eine oder mehrere Basen in (A) zwischen den Zielstellen der zwei Watson-Crick-bindenden PNA-Oligos eingeführt werden (siehe 4b), werden sie nicht in der Lage sein, das kurze PNA-Oligo (B) zu stabilisieren, welches daher nicht an den Analyten (A) binden wird.
In Ausführungsformen, worin zwei unabhängige Sonden C1 und C2 verwendet werden, gibt es keine strikte Anforderung, daß die Dreifachstrang-bindende Region von B kleiner als die Moleküle C ist. Anstelle dessen ist die Anforderung, daß die Dreifachstrang-bindende Region von B kleiner ist als die Gesamtlänge der Bindungsregion der Moleküle C1 und C2. Die tripelsträngigen Bindungsregionen von jedem der Moleküle C1 und C2 sind im allgemeinen kleiner als die Dreifachstrang-bindende Region von B.
In einer weiteren Ausführungsform, welche sehr nützlich zur Unterscheidung zwischen Nukleinsäuren mit sehr ähnlicher Basensequenz ist, beispielsweise zwischen Allelen, bakteriellen Arten, Unterarten oder sogar spezifischen Stämmen, wird zusätzlich zu den Sonden B und C eine weitere Sonde D verwendet. Die Sonde D wird eine Kompetitor-Sonde sein, welche fähig zur Bindung an Nukleinsäure A anstatt einer der Sonden C ist, und welche sich von der Sonde C hinsichtlich Länge und/oder Bindungsposition und/oder Sequenz und/oder Modifikationen von Nukleobasen unterscheiden wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform, welche schematisch in 10 gezeigt ist, wird eine Reaktionsmischung vorgesehen, enthaltend die Zielnukleinsäure A, Sondenmolekül B, zwei Sondenmoleküle C1 und C2 sowie ein Kompetitor-Sondenmolekül D. In diesem Fall ist die Kompetitorsonde vorzugsweise die unterscheidende Sonde (d.h. der Unterschied in der Sequenz der zu bestimmenden Nukleinsäure und der nicht zu bestimmenden Nukleinsäure wird in der Bindungsregion von Sonde D gefunden). Die Kompetitorsonde besitzt eine Sequenz, vollständig komplementär zu einem Teil des Ziels A, aber ihr fehlen ein oder mehrere distale Nukleotide, was zu einer Lücke zwischen D und C1 führt. Wenn die Sonde C2 eine Sequenz besitzt, vollständig komplementär zu der zu bestimmenden Nukleinsäure (A), dann wird eher C2 als der Kompetitor (D) an A hybridisieren und eine Triplexbildung gestatten. Wenn die Sonde C2 einen Mismatch bezüglich des Ziels A besitzt, dann wird der Kompetitor (unter Voraussetzung der passenden Zusammensetzung und Konzentration) anstelle von C2 an A hybridisieren, und es wird eine Lücke gebildet werden, welche eine Triplexbildung nicht zuläßt.
Im Falle der spezifischen Bestimmung eines Ziels A, welches Sequenzen aus Mycobacterium interjectum entspricht, wird ein Kompetitormolekül D, komplementär zu einem Teil dieser Zielsequenz, zusammen mit den Sonden B und C1 und C2 zu der Probe zugesetzt. Bei Verwendung eines Moleküls C2, vollständig komplementär zu M. interjectum und mit höherer Affinität als D, würde dieses Molekül (zusammen mit C1) eine Triplexbildung zulassen, welche B einschließt. Bei Verwendung anderer C2-Moleküle, welche nicht vollständig passen, würden diese Moleküle von dem Kompetitor D auskompetiert werden, und eine Lücke würde gebildet werden, die eine Triplexbildung nicht zulässt. Auf diese Weise würde eine falsche Triplexbildung als Folge einer Kreuzhybridisierung von fehlgepaarten C2-Sonden vermieden werden. Somit sieht die Verwendung derartiger Kompetitorsonden eine viel bessere Möglichkeit vor, zwischen nah verwandten Nukleinsäuren zu unterscheiden.
Eine Dreifachstrang-Bindungsregion in jeder der Nukleinsäuren oder der erwähnten Nukleinsäure-bindenden Moleküle ist als eine Region dieser Nukleinsäure oder dieses Moleküls definiert, entweder basenpaarend mit zwei anderen Strängen von Nukleinsäuren oder Molekülen, oder basenpaarend mit Basen, welche selbst mit zwei Strängen von Nukleinsäuren oder Molekülen basenpaaren. Eine Doppelhelix-bildende Region ist als eine Region oder Sequenz eines Moleküls definiert, basenpaarend mit Basen nur eines Strangs von einer/m anderen Nukleinsäure oder Molekül (z. B. Segmente Cx und Cz, welche aneinander angrenzend an die tripelsträngige Region der Analyt-Nukleinsäure A binden). In diesem Fall findet vorzugsweise Watson-Crick-Basenpaarung statt, während bei der Dreifachstrang-Bindung sowohl Watson-Crick-Basenpaarung als auch Hoogsteen-Basenpaarung stattfinden. Diese Doppelhelix-bildende Region kann so klein wie 1 Basenpaar sein, kann aber so lang wie 100 Basenpaare sein.
Es ist ein Kernpunkt der vorliegenden Erfindung, daß die Moleküle B und C nicht miteinander verknüpft sind. Dies ist wichtig, damit eines der Moleküle nicht das andere der Moleküle durch örtliche Erhöhung der Konzentration dieses anderen Moleküls auf künstliche Weise in den tripelhelikalen Komplex hineinzwingen wird. Ein Hintergrund der vorliegenden Erfindung ist die Tatsache, daß die bloße Bindung eines oder zweier Moleküle C die Bindung eines Moleküls B in einer tripelhelikalen Weise ermöglicht. Die Bildung des tripelsträngigen Komplexes zwischen A, B und C wird jedoch nur stattfinden, wenn sie thermostabiler als ein tripelsträngiger Komplex ist, gebildet aus zwei Molekülen von B oder zwei identischen Molekülen von C mit einem Molekül von A.
Es gibt mindestens drei bevorzugte Wege zum Erzielen einer höheren Thermostabilität des korrekten tripelsträngigen Komplexes (gebildet aus A, B und C, nun bezeich net als ABC). Der Einschluß von Molekül C in Begünstigung eines zweiten Moleküls von B in die tripelsträngige Region kann leicht erreicht werden aufgrund der Tatsache, daß die Nukleinsäure-A-bindende Region von Molekül C länger ist als die Nukleinsäure-A-bindende Region von B. Somit kann die Länge von C (und in manchen Situationen auch von B) variiert werden, um eine optimale ABC-Triplexbildung zu erhalten.
In einer anderen Ausführungsform ist das Molekül B und/oder C an mindestens einer Position chemisch modifiziert worden, was die Tripelhelixbildung von zwei Molekülen B mit einem Molekül A (siehe 9) und von zwei identischen Molekülen C mit einem Molekül A destabilisiert. Solche Modifikationen sind beispielsweise chemische Gruppen, zum Beispiel geladene Gruppen, wie Carboxy- oder Aminogruppen, oder organische chemische Gruppen, wie Acylgruppen oder Benzoylgruppen, gebunden an jegliches Atom der Moleküle B und/oder C. Eine bevorzugte Anordnung dieser Gruppen ist, wenn die Sequenz der Sonden so gewählt wird, daß bei Bindung an die Analyt-Nukleinsäure die chemischen Gruppen von zwei identischen Molekülen (B oder C) in enge Nachbarschaft gebracht werden, was eine Destabilisierung des gesamten tripelhelikalen Komplexes verursacht. Die Größe und Beschaffenheit solcher chemischen Gruppen kann verwendet werden, um eine Feineinstellung der Bindungscharakteristika vorzunehmen, und sollte auf eine Weise gewählt werden, daß die Bildung des korrekten tripelsträngigen Komplexes (einschließlich A, B und C) nicht beeinflußt wird. In einer dritten Art der Erfindung besitzt die Tripelbindungsregion eine asymmetrische Basensequenz, so daß in einer bevorzugten Bindungsart, die tripelsträngige Bindungsregion in AB₂ und AC₂ sehr klein sein würde. Der bevorzugte Bindungsmodus in tripelsträngigen Komplexen hängt natürlich von der chemischen Struktur der gewählten Moleküle ab. Für Peptid-Nukleinsäuren ist der bevorzugte tripelsträngige Bindungsmodus beispielsweise zueinander antiparallel, was bedeutet, daß die Aminoenden der zwei Moleküle in entgegengesetzte Richtungen weisen, wobei eines zum 3'-Ende der Analyt-Nukleinsäure weist, und das andere zum 5'-Ende der Analyt-Nukleinsäure weist. Deshalb wird es bevorzugt, eine asymmetrische Bindungsregion (eine asymmetrische Basensequenz) der Analyt-Nukleinsäure A zu wählen, und C und B mit entgegengesetzten Richtungen so zu synthetisieren, daß sie in einer antiparallelen Weise bezüglich einander binden werden.
Im Hinblick auf Peptid-Nukleinsäure-Oligos ist auch Triplexbildung mit Nukleinsäure für zwei Moleküle möglich, welche in die gleiche Richtung weisen. Obwohl diese Komplexe weniger stabil sind, als wenn zwei PNA-Moleküle in entgegengesetzten Richtungen gebunden werden, besteht eine Möglichkeit, daß zwei Moleküle von B oder zwei identische Moleküle von C einen Triplex mit der Analyt-Nukleinsäure A bilden werden und somit die Bildung des korrekten Komplexes ABC stören. Die Destabilisierung von sowohl AB₂ als auch AC₂ ist obenstehend beschrieben worden. Darüber hinaus kann die Bildung von AC₂ durch Ausführen der Bindungsreaktion unter alkalischen Bedingungen verhindert werden, während modifizierte Basen wie z. B. Pseudoisocytosin in Molekül B aber nicht in C eingeschlossen sind. Unter alkalischen Bedingungen ist Cytosin nicht protoniert und kann nicht an Hoogsteen-Bindung teilnehmen, wohingegen Pseudoisocytosin unabhängig vom pH-Wert der Reaktionslösung ist. Pseudoisocytosin und andere modifizierte Basen werden in der WO 96/02558 beschrieben.
Die Probe, welche die zu bestimmende Nukleinsäure (A) enthält, wird mit den Sondenmolekülen B und C versetzt, um den Komplex ABC zwischen diesen Sondenmolekülen und der zu bestimmenden Nukleinsäure zu erzeugen. Dieser Komplex wird über Basen-vermittelte Wasserstoffbrückenbindung gebildet. Die Bindung der Sondenmoleküle an die Nukleinsäure wird gemäß dem Fachmann auf dem Gebiet bekannten Bedingungen für die Tripelhelixbildung erfolgen. Solche Bedingungen sind für Peptid-Nukleinsäuren gut beschrieben, zum Beispiel in der WO 95/01370 und in Wittung, P. et al., (1997) Biochemistry 36 (26): 7973-7979, worauf in dieser Hinsicht Bezug genommen wird. Weil in vielen Fällen die Menge an Nukleinsäuren in der Probe nicht bekannt oder offensichtlich ist, könnte es bevorzugt werden, so zu wählen, daß die Menge jedes Sondenmoleküls die höchste erwartete Menge an Nukleinsäure A in der Probe übersteigt. Damit jedoch ein niedriger Spiegel an Hintergrundsignal beibehalten wird, kann es ratsam sein, eine solche Menge an Sondenmolekülen zu wählen, die in der zu erwartenden Größenordnung der Nukleinsäure liegt.
Wie beschrieben in der WO 95/15971, gibt es mehrere Möglichkeiten, um das Vorhandensein einer beliebigen Nukleinsäure zu bestimmen. In der vorliegenden Erfindung wird es bevorzugt, dass mindestens ein Sondenmolekül markiert ist. Am stärksten bevorzugt ist bei Molekül B eine Markierung angeheftet. Weiter bevorzugt besitzt entweder die Nukleinsäure A oder die Moleküle) C eine immobilisierbare Markierung oder ist immobilisiert worden. Das geltende Prinzip ist, daß innerhalb des Komplexes, enthaltend die zu bestimmende Nukleinsäure und die Sondenmoleküle, mindestens eine Reportereinheit und/oder mindestens eine immobilisierbare Einheit vorkommt.
Ein Beispiel einer spezifischen Ausführungsform eines Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird in der 5 gezeigt. Die Analyt-Nukleinsäure (langer Strang) wird mit einem Paar von Primern kontaktiert, von denen einer immobilisierbar markiert ist, beispielsweise durch Aufweisen einer Biotineinheit am 5'-Phosphatende. Nach Amplifizierung durch PCR sind die Stränge, bei denen der biotinylierte Primer eingebaut wurde, immobilisierbar markiert worden. Diese Stränge werden als Analyt-Nukleinsäuren A im Nachweis gemäß des Verfahrens der Erfindung verwendet werden. Der Probe werden dann zwei Sondenmoleküle C zugegeben, welche so entworfen sind, daß sie aneinander angrenzend mittels Watson-Crick-Basenpaarung an den markierten Strang binden können. Ferner werden der Probe Sondenmoleküle B zugeführt, welche von kürzerer Länge als die gesamte Bindungssequenz der Moleküle C sind und in der Lage zu Hoogsteen-Basenpaarung sind, unter Bildung einer tripelsträngigen Region, wie obenstehend dargelegt. Dieses Molekül B enthält eine nachweisbare Markierung. Der Pfeil auf der linken Seite von 5 gibt den Fall an, in welchem das in der PCR hergestellte Amplicon tatsächlich die zu bestimmende Nukleinsäure ist. Dann können die Sondenmoleküle B und C den korrekten tripelsträngigen Komplex bilden. Dieser Komplex kann nach Immobilisieren auf einem mit Streptavidin beschichteten festen Träger, Entfernen jedweder überschüssigen Sondenmoleküle und Markierung durch Waschen, und danach Detektion des Vorhandenseins oder der Menge an nachweisbarer Markierung auf dem festen Träger bestimmt werden. Das Nachweisverfahren wird natürlich von der verwendeten Markierung abhängen, z. B. wird im Falle von elektrochemolumineszent markierten Sonden die Elektrochemolumineszenz erzeugt und nachgewiesen werden. Jedwede nicht nachzuweisenden Nukleinsäuren oder Amplicons (nicht enthaltend die korrekte Doppelhelix-Bindungsregion für aneinander grenzendes Binden der Moleküle C) werden nicht nachgewiesen werden, wie dem rechten Pfeil folgendend in der 5 gezeigt. Dies zeigt, daß sogar im unwahrscheinlichen Fall, daß beide Sondenmoleküle C1 und C2 zufällig an Nukleinsäure A binden können, dies nicht nachgewiesen wird, wenn sie nicht exakt nebeneinander gebunden werden. In diesem Falle kann das Sondenmolekül B nicht an einem thermostabilen Komplex ABC1C2 teilnehmen, und deswegen wird der Analyt A nicht nachweisbar markiert werden und, sogar bei Immobilisierung auf der festen Phase, nicht einer Bestimmung unterzogen werden.
Wir haben gezeigt, daß durch Erhöhen der Länge des Watson-Crick-bindenden Moleküls (C) die Gesamtstabilität einer beabsichtigten Triplexstruktur ABC erhöht werden kann. Die Sonden B und C enthalten beide eine Sequenz von Basen, komplementär zu der kurzen Tripelhelixregion (beispielsweise einen Homopurin-Trakt), wel che als das Ziel für die Triplexbildung fungiert. Deswegen können zwei Moleküle von Sonde B oder zwei identische Moleküle von C theoretisch kompetierende Triplexstrukturen innerhalb der Zielsequenz bilden, aber durch Verwendung von modifizierten Basen und/oder einem Grundgerüst und durch Regulieren der Hybridisierungsbedingungen kann die Bildung der korrekten Triplexstruktur ABC gewährleistet werden.
Wir haben auch gezeigt, daß zwei aneinandergrenzend gebundene Watson-Crick-paarende Oligos (C), welche jeweils einen Teil der Triplexregion abdecken, die Hoogsteen-Bindung ausreichend stabilisieren können, damit eine Triplexbildung unter Einschluß des kleinen Oligos B stattfindet. Einmal gebunden, wird dieses Oligo dem Triplex zusätzliche Stabilität verleihen, aber ob ein jeweiliges Hoogsteen-Oligo gebunden bleiben wird oder nicht, hängt hauptsächlich von der Abgangs-Rate der Watson-Crick-Oligo(s) ab. Somit zeigen unsere Ergebnisse, daß eine Triplexbildung durch Watson-Crick-Bindung initiiert wird, welche der limitierende Schritt ist, und daß auch das Aufschmelzen durch die Dissoziation der Watson-Crick-Basenpaarung initiiert wird, was selbstverständlich zur unverzüglichen Dissoziation der Hoogsteen-Bindung führt.
Diese Beobachtungen besitzen eine Reihe von Implikationen: Zum Ersten ist die Anzahl von Basen an der Erkennungsstelle, welche tatsächlich an der Bindung und Stabilisierung der Triplexstruktur teilnehmen, nicht auf diejenigen innerhalb der Triplexregion selbst beschränkt, was z. B. eine Mismatch-Unterscheidung auch in benachbarten Positionen zuläßt. Zweitens wird der Bereich, innerhalb dessen die thermische Stabilität der Triplexstruktur moduliert werden kann, verbreitert, zusammen mit der Auswahl von Parametern, welche angewandt werden können, um die thermische Stabilität unter verschiedenen Assay-Bedingungen zu steuern. Drittens kann die kooperative Bindung von zwei Watson-Crick-paarenden Sonden C an zwei halbe Zielstellen ausgenutzt werden, um die Herbeiführbarkeit von Triplexstrukturen zur Unterscheidung von Mismatches weiter zu verbessern. Viertens kann die Bildung der beabsichtigten Triplexstruktur als Bestätigung herangezogen werden, daß zwei Watson-Crick-paarende Sonden C tatsächlich direkt nebeneinander auf dem Ziel-Nukleinsäurestrang gebunden worden sind. Schließlich wird die Triplexbildung unter Beteiligung einer kurzen markierten Hoogsteen-bindenden Sonde als eine doppelte Bestätigung wirken, daß die korrekte Zielsequenz identifiziert worden ist, da der zweite Schritt der Triplexbildung (Hoogsteen-Bindung) in kritischer Weise vom ersten Schritt (Watson-Crick-Bindung) abhängig ist. In einem derartigen Schema wird die markierte Sonde nicht an irgendeine Nukleinsäure binden, außer wenn die erste Sonde(n) (C) korrekt an ihre Zielsequenz hybridisiert hat.
Die Feststellung, daß ein Triplex durch Erhöhen der Länge lediglich des Watson-Crick-Strangs stabilisiert werden kann, ist neu und unerwartet. Hybridisierungsbedingungen können überwacht werden, um zu gestatten, daß eine kurze Sonde nur dann mittels Hoogsteen-Bindung bindet, wenn sie durch eine längere Watson-Crick-Bindungssonde stabilisiert wird.
Die Option des Einschließens einer gemischten Sequenz, angrenzend an das Triplex-Motiv, in der kompletten Zielstelle für die Bildung der Triplexstruktur vermittelt zusätzliche Wege zur Modulierung der Gesamtstabilität dadurch, daß die Triplexbildung von Basensequenzen außerhalb der eigentlichen, durch den Hoogsteen-Strang abgegrenzten, Triplexregion abhängig gemacht wird.
Durch Verwendung von kooperativ gebundenen Watson-Crick-Sonden (geteilte Sonden) zur Stabilisierung des Hoogsteen-Strangs, können Nukleobasen, welche sogar weiter weg von der Triplexregion selbst lokalisiert sind, die Gesamtstabilität der Triplexstruktur beeinflussen. Gleichzeitig steigert die Verwendung von kooperativ gebundenen Watson-Crick-Oligos die Spezifität des Gesamtkomplexes. Dies beruht darauf, daß die Unterscheidungsleistung von zwei geteilten Watson-Crick-Sonden, z. B. gegenüber Einzelbasenmutationen, höher ist als jene von einer Einzelsonde ähnlicher Länge, weil die geteilten Sonden weniger Degeneration in der Zielregion für die Hybridisierung tolerieren werden.
Die Tatsache, daß die kurze Triplex-bildende PNA eine Stabilisierung durch Watson-Crick-bindende PNA benötigt, kann benutzt werden, um zu bestätigen, daß zwei geteilte Sonden tatsächlich aneinander angrenzend auf dem Zielmolekül hybridisiert sind, weil sie dem Triplex nicht ausreichend Stabilisierung geben werden, wenn Lücken zwischen ihnen gefunden oder eingeführt werden.
Die vorliegende Erfindung sieht die Möglichkeit vor, universelle Sonden B zu verwenden. Weil B relativ kurz ist, da C selektiv ist, kann hierfür eine solche Sequenz gewählt werden, welche für Bestimmungen unterschiedlicher Analyten verwendet werden kann, wodurch weniger Sonden-Synthese für verschiedene Assays notwendig ist. Darüber hinaus kann dasselbe markierte Oligo verwendet werden, um gleichzeitig unterschiedliche Zielnukleinsäuren nachzuweisen.
Die folgenden Beispiele beschreiben die Erfindung weiter:
Beispiele
Allgemein:
PNA-Oligos und Monomere wurden gemäß WO 96/02558 und wie beschrieben für eine automatisierte Synthese (Koch, T. et al., (1997) J. Peptide Res. 49: 80-88) auf einem ABI 433-Synthesizer synthetisiert. Alle DNA-Oligonukleotide sind einzelsträngig und linear.
NH₂ bezeichnet das CONH₂-Ende einer PNA (Ende, welches während der chemischen Synthese an die feste Phase angeknüpft wurde), N bezeichnet das Aminoende der PNA.
Beispiel 1
Bildung eines Komplexes aus einer zu bestimmenden Nukleinsäure und den Molekülen B und C
Unter Voraussetzung der passenden Bedingungen für die Hybridisierung wird ein kurzes PNA-Oligo (B) an den Analyt (A) nur über Hoogsteen-Basenpaarung binden, wenn es durch ein anderes, längeres PNA-Oligo stabilisiert wird, welches durch Watson-Crick-Basenpaarung an den Analyt (A) bindet (abgebildet in 1a). Unter ähnlichen Hybridisierungsbedingungen ist das kurze PNA-Oligo (B) allein nicht in der Lage, stabile Triplexstrukturen mit dem Analyt (A) zu bilden (abgebildet in 1b). Dies ist experimentell gezeigt worden, und die Ergebnisse sind in der 6 präsentiert.
Als Moleküle wurden verwendet:
A: DNA 12-mer:5'-TCCAGAAGATAC-3' (SEQ. ID. Nr. 1)
B: PNA 6-mer: H-TCTTCT-NH₂
C: PNA 12-mer: H-GTATCTTCTGGA-NH₂
Die Bedingungen für die Triplexbildung sind wie folgend: Ein pmol radioaktiv markiertes DNA-Oligo (A) wurde mit den PNA-Oligos (Mengen gemäß der nachstehenden Tabelle) in einem Gesamtvolumen von 8 μl Puffer (100 mM NaCl; 0,1 mM EDTA; 10 mM NaH₂PO₄, pH 5) gemischt. Die Reaktion wurde 2 Minuten lang bei 95°C hitzedenaturiert und 2 Stunden lang inkubiert. Die Produkte wurden durch 10%ige Polyacrylamidgelelektrophorese, gefolgt von Autoradiographie, analysiert.
Die Ziffern 1) bis 9) beziehen sich auf Spuren in dem Autoradiogramm, welches in 6 gezeigt wird:
6a) Spuren:

1) A (1 pmol)
2) A (1 pmol) + B (1 pmol)
3) A (1 pmol) + B (2 pmol)
4) A (1 pmol) + B (4 pmol)
5) A (1 pmol) + B (10 pmol)
6) A (1 pmol) + B (2 pmol) + C (1 pmol)
7) A (1 pmol) + B (2 pmol) + C (2 pmol)
8) A (1 pmol) + B (2 pmol) + C (4 pmol)
9) A (1 pmol) + B (2 pmol) + C (10 pmol)

6b) Spuren:

1) A (1 pmol)
2) A (1 pmol) + C (1 pmol)
3) A (1 pmol) + C (2 pmol)
4) A (1 pmol) + C (4 pmol)
5) A (1 pmol) + C (10 pmol)
6) A (1 pmol) + C (2 pmol) + B (1 pmol)
7) A (1 pmol) + C (2 pmol) + B (2 pmol)
8) A (1 pmol) + C (2 pmol) + B (4 pmol)
9) A (1 pmol) + C (2 pmol) + B (10 pmol)

Das Gel zeigt, daß die Inkubation von steigenden Mengen an B mit 1 pmol A nicht zu irgendwelchen nachweisbaren Hybriden führt, und nur das DNA-Oligo (A) im Gel gesehen wird (6a, Spur 1-5). Wenn die Menge von A und B konstant gehalten wird und mit steigenden Mengen an C vermischt wird, wird ein Triplexprodukt zwischen A, B und C gebildet (6a, Spur 6 und 7), und nach Zugabe von zusätzlichen Mengen an C wird ein zusätzliches Triplexprodukt zwischen A und zwei Molekülen C gebildet (6a, Spur 8 und 9). Eine blassere Bande kann in den Spuren 6-9 beobachtet werden, welche die Bildung von kleinen Mengen eines Duplex zwischen A und C anzeigt. In 6b wird das DNA-Oligo allein am Boden des Gels gesehen, aber nach Zugabe von steigenden Mengen an C kann sowohl Duplex- als auch Triplex-Bildung gesehen werden, von welchen die Triplexstruktur das bevorzugte Produkt ist (Spuren 2-5). Das Konstanthalten der Menge von A und C und das Zusetzen steigender Mengen von B führt zur Bildung des Triplex, welcher A, B und C beinhaltet, wohingegen der Triplex zwischen A und zwei Molekülen C vollständig auskompetiert wird. Diese Ergebnisse zeigen, daß unter diesen Hybridisierungsbedingungen das kurze PNA-Oligo (B) nicht in der Lage ist, stabile Produkte mit A zu bilden, aber wenn es zusammen mit sowohl A als auch C vorhanden ist, wird es an der Bildung eines ABC-Triplex teilnehmen, wobei auch die Bildung eines AC₂-Triplex auskompetiert wird.
Beispiel 2
Unterscheidung zwischen Nukleinsäuren mit einem einzigen Basen-Unterschied durch Bildung eines Tripelhelix-Komplexes unter Verwendung von zwei Molekülen C1 und C2 sowie einer Sonde B.
Dieses Experiment richtet sich auf einen bevorzugten Modus der Erfindung unter Verwendung von zwei geteilten Sonden. Die Ergebnisse sind als das Autoradiogramm in 7 präsentiert. Die folgenden Verbindungen werden im Experiment verwendet (an der Tripelhelixbildung beteiligte Sequenzen sind unterstrichen, symmetrischer Fall):
A1: DNA 16-mer:5'-CGTCCAGAAGATACCG-3' (zu bestimmende Nukleinsäure) (SEQ. ID. NR. 2)
A2: DNA 16-mer:5'-CGTGCAGAAGATACCG-3' (nicht zu bestimmende Nukleinsäure) (SEQ. ID. NR. 3)
B: PNA 6-mer: H-TCTTCT-NH₂
C1: PNA 8-mer: H-CGGTATCT-NH₂
C2: PNA 8-mer: H-TCTGGACG-NH₂
Die experimentellen Bedingungen sind die folgenden: Ein pmol radioaktiv markiertes DNA-Oligo (A1 oder A2) wurde mit den PNA-Oligos (Mengen gemäß der nachstehenden Tabelle) in einem Gesamtvolumen von 8 μl Puffer (100 mM NaCl; 0,1 mM EDTA; 10 mM NaH₂PO₄, pH 5) vermischt. Die Reaktion wurde 2 Minuten lang bei 95°C hitzedenaturiert und 2 Stunden lang inkubiert. Die Produkte wurden durch 10%ige Polyacrylamidgelelektrophorese, gefolgt von Autoradiographie, analysiert.
Die Ziffern 1) bis 10) beziehen sich auf Spuren in dem Autoradiogramm, welches in der 7 gezeigt wird:
7a) Spuren:

1) A1 (1 pmol)
2) A1 (1 pmol) + B (2 pmol)
3) A1 (1 pmol) + C1 (2 pmol)
4) A1 (1 pmol) + C2 (2 pmol)
5) A1 (1 pmol) + B (2 pmol) + C1 (2 pmol)
6) A1 (1 pmol) + B (2 pmol) + C2 (2 pmol)
7) A1 (1 pmol) + B (2 pmol) + C1/C2 (1/1 pmol)
8) A1 (1 pmol) + B (2 pmol) + C1/C2 (2/2 pmol)
9) A1 (1 pmol) + B (2 pmol) + C1/C2 (4/4 pmol)
10) A1 (1 pmol) + B (2 pmol) + C1/C2 (10/10 pmol)

7b) Spuren:

1) A2 (1 pmol)
2) A2 (1 pmol) + B (2 pmol)
3) A2 (1 pmol) + C1 (2 pmol)
4) A2 (1 pmol) + C2 (2 pmol)
5) A2 (1 pmol) + B (2 pmol) + C1 (2 pmol)
6) A2 (1 pmol) + B (2 pmol) + C2 (2 pmol)
7) A2 (1 pmol) + B (2 pmol) + C1/C2 (1/1 pmol)
8) A2 (1 pmol) + B (2 pmol) + C1/C2 (2/2 pmol)
9) A2 (1 pmol) + B (2 pmol) + C1/C2 (4/4 pmol)
10) A2 (1 pmol) + B (2 pmol) + C1/C2 (10/10 pmol)

Wie in der 7a ersehen werden kann, ist weder B, C1 noch C2 in der Lage, stabile Hybride mit dem Analyt A1 allein zu bilden (Spuren 2-6), und nur wenn alle Komponenten A, B, C1 und C2 vorhanden sind, wird eine stabile Triplexstruktur gebildet werden (Spuren 7-10). Wenn ein Mismatch zwischen dem Analyten (A2) und einer der WC-bindenden Sonden (C2) eingeführt wird, wird die Triplexbildung stark inhibiert (7b, Spuren 7-10).
Beispiel 3
Unterscheidung zwischen Nukleinsäuren, welche sich um eine einzelne Baseninsertion unterscheiden
In dieser Bestimmung wurden zwei geteilte Sonden verwendet, wie in Beispiel 2. Die zu bestimmende Nukleinsäure unterscheidet sich von einer nicht zu bestimmenden Nukleinsäure um eine einzige Baseninsertion in der letztgenannten. Die Sonden C1 und C2 werden so ausgewählt, daß sie mit einer Lücke von einer Base zwischen ihnen an die nicht zu bestimmende Nukleinsäure binden werden, aber nur mit einem Nick in dem Komplex, wenn sie an die zu bestimmende Nukleinsäure gebunden haben (Sequenzen, welche an der Tripelhelixbildung beteiligt sind, sind unterstrichen, asymmetrischer Fall):
Die verwendeten Moleküle sind:
A1: DNA 40-mer (zu bestimmende Nukleinsäure):
5'-GCTTGTAGTCCTGCTTGAGAGAACGTGCGGGCGATTTGCC-3' (SEQ.ID.NR. 4)
A2: DNA 40-mer (nicht zu bestimmende Nukleinsäure):
5'-GCTTGTAGTCCTGCTTGAGATGAACGTGCGGGCGATTTGC-3' (SEQ.ID.NR. 5)
B: PNA 6-mer: H-TCTCTT-NH₂
C1: PNA 15-mer: H-ATCGCCCGCACGTTC-NH₂
C2: PNA 15-mer: H-TCTCAAGCAGGACTA-NH₂
Die experimentellen Bedingungen sind die folgenden: Ein pmol radioaktiv markiertes DNA-Oligo (A1 oder A2) wurde mit den PNA-Oligos (Mengen gemäß der nachstehenden Tabelle) in einem Gesamtvolumen von 8 μl Puffer (100 mM NaCl; 0,1 mM EDTA; 10 mM NaH₂PO₄, pH 5) gemischt. Die Reaktion wurde 2 Minuten lang bei 95°C hitzedenaturiert und 2 Stunden lang inkubiert. Die Produkte wurden durch 10%ige Polyacrylamidgelelektrophorese, gefolgt von Autoradiographie, analysiert.
Die Ziffern 1) bis 12) beziehen sich auf Spuren in dem Autoradiogramm, welches in der 8 gezeigt wird:
8) Spuren:

1) A1 (1 pmol)
2) A1 (1 pmol) + C1 (10 pmol)
3) A1 (1 pmol) + C2 (10 pmol)
4) A1 (1 pmol) + C1/C2 (10/10 pmol)
5) A1 (1 pmol) + B (10 pmol) + C1/C2 (10/10 pmol)
6) A1 (1 pmol) + B (10 pmol)
7) A2 (1 pmol)
8) A2 (1 pmol) + C1 (10 pmol)
9) A2 (1 pmol) + C2 (10 pmol)
10) A2 (1 pmol) + C1/C2 (10/10 pmol)
11) A2 (1 pmol) + B (10 pmol) + C1/C2 (10/10 pmol)
12) A2 (1 pmol) + B (10 pmol)

Jede der PNA-Sonden C1 und C2 ist in der Lage, einen Duplex mit dem Analyt (A1 oder A2) entweder allein (Spuren 2-3, 8-9) oder gemeinsam (Spuren 4 und 10) zu bilden. Wenn die zwei Duplex-bildenden PNA-Oligos C1 und C2 aneinander angrenzend gebunden werden, ist ein kurzes Triplex-bildendes PNA-Oligo B in der Lage, über Hoogsteen-Basenpaarung zu binden, um eine Triplexstruktur zu bilden (Spur 5). Wenn C1 und C2 durch so wenig wie eine Nukleobase getrennt sind, wird das Triplex-bildende Oligo B nicht binden (Spur 11) und nur der Komplex zwischen dem Analyt und C1/C2 wird beobachtet.
Beispiel 4
Unterscheidung unter Verwendung einer Kompetitor-Sonde D
Dieses Experiment ist ein Beispiel der verbesserten Nachweisspezifität unter Verwendung von zwei Molekülen C1 und C2, eines markierten Moleküls B, fähig zur Triplexbildung durch Hoogsteen-Bindung, und eines Moleküls D, fähig zum Hybridisieren an das Ziel A (abgebildet in 10). Die Ergebnisse des Experiments werden in der 11 präsentiert. Es wurden die folgenden Verbindungen verwendet:
A: DNA 22-mer: 5'-CTTGTGGTGGAAAGCTTTTGCG-3' (SEQ.ID.Nr. 6)
A1: DNA 22-mer: 5'-CCTGTGGTGGAAAGCTTTTGCG-3' (SEQ.ID.Nr. 7)
A2: DNA 22-mer: 5'-TGTGTGGTGGAAAGCTTTTGCG-3' (SEQ.ID.Nr. 8)
A3: DNA 22-mer: 5'-CTTTTGGTGGAAAGCTTTTGCG-3' (SEQ.ID.Nr. 9)
B: PNA 6-mer: Kemptid -JJTTTJ-gly-NH₂ (J steht für Pseudoisocytosin)
C1: PNA 11-mer: H-CGCAAAAGCTT-NH₂
C2-1: PNA 11-mer: H-TCCACCACAGG-NH₂
C2-2: PNA 11-mer: H-TCCACCACACA-NH₂
C2-3 : PNA 11-mer: H-TCCACCAAAAG-NH₂
D: PNA 10-mer: H-CCACCACAAG-NH₂
Das PNA B wurde über das Kemptid-Motiv radioaktiv markiert (Koch, T. et al., Tetrahedron Lett. (1995) 36: 6933-36), und 1 pmol wurde mit 1 pmol Ziel (A, A1, A2 oder A3) und verschiedenen Mengen an PNA-Sonden C und D in einem Gesamtvolumen von 10 μl Puffer (100 mM NaCl; 0,1 mM EDTA; 10 mM NaH₂PO₄, pH 5,0) vermischt. Die Mischung wurde 2 Minuten lang bei 95°C hitzedenaturiert, bevor 10 Minuten lang bei RT hybridisiert wurde. 2 μl Auftragspuffer wurden zugegeben, und die Hälfte der Reaktion (Spuren 1 und 2) oder ein Drittel der Reaktion (Spuren 3-8) wur den auf einer 5%igen Polyacrylamidgelelektrophorese laufen gelassen und durch Autoradiographie visualisiert.
Drei verschiedene Kombinationen von PNA-Nachweissonden (11a, b und c) wurden hinsichtlich ihres Vermögens getestet, an ihr entsprechendes Ziel-DNA-Oligo (A1, A2 bzw. A3) zu binden, und hinsichtlich Kreuzhybridisierung an ein verwandtes Kontroll-DNA-Oligo (A), enthaltend verschiedene Einzelbasensubstitutionen bezüglich der Ziel-DNA-Oligos. Die Hybridisierung wurde entweder mit oder ohne eine steigende Menge einer Kompetitor-PNA (D) geassayt, komplementär zum Kontroll-Oligo-A, aber eine Nukleobase kürzer als die Nachweissonden (C2-1, C2-2 und C2-3). Die Sonde C1, welche die andere Hälfte der DNA-Zielregion abdeckt, war allen Zielen gemeinsam und wurde somit in allen Assays eingesetzt.
Die Reaktionen, entsprechend den Spuren 1-8 auf 11a, waren:
Die Reaktionen, entsprechend den Spuren 1-8 auf 11b, waren:
Die Reaktionen, entsprechend den Spuren 1-8 auf 11c, waren:
In Abwesenheit von PNA-Kompetitor-Molekül D ist die Kombination der PNA-Sondenmoleküle C1, C2 und B in der Lage, zu binden und eine Triplex-Struktur zu bilden, sowohl mit dem Kontroll-Ziel, das einen einzelnen Mismatch (Spur 1) aufweist, als auch mit dem vollständig komplementären Ziel (Spur 2). Der Einschluß von 10 pmol Kompetitor (Spur 3) bringt noch eine gewisse Kreuzhybridisierung mit einem Satz von Nachweissonden (11c) hervor, aber sämtliche Kreuzhybridisierung an das Kontrollziel könnte durch Zugeben einer höheren Menge an PNA-Kompetitor D zu den Reaktionen verhindert werden (Spuren 5, 7 und 8). Mit den komplementären Zielen wird selbst in Gegenwart von Kompetitor noch eine Triplexbildung beobachtet (Spuren 4, 6 und 8).
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Verfahren zum Bestimmen einer Nukleinsäure A, umfassend das Bilden eines dreistängigen Bindungskomplex zwischen der Nukleinsäure A, einem ersten die Nukleinsäure A bindenden Molekül B und mindestens einem weiteren die Nukleinsäure A bindenden Molekül C mit einer zur Sequenz von Molekül B verschiedenen Basensequenz, und das Bestimmen der Gegenwart oder der Menge des Bindungskomplexes als Maß für die Gegenwart oder Menge der Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass der dreistängige Komplex unter Bedingungen gebildet wird, bei denen der dreistängige Komplex zwischen A, B und dem einen oder mehreren Molekülen C thermisch stabiler ist als ein dreistängiger Komplex, gebildet aus zwei Molekülen von B, oder zwei identischen Molekülen von C, mit einem Molekül von A.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der dreistängige Komplex eine tripelhelikale Bindungsregion enthält, zu der jedes von A, B und C mit mindestens 1, aber weniger als 11, vorzugsweise mehr als 1 aber weniger als 8 Basen beiträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Komplex nur ein Molekül C, welches in der dreisträngigen Region bindet, enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekül B eine Basensequenz von mehr als 3 aber weniger als 11, vorzugsweise mehr als 4 aber weniger als 8 Basen besitzt, welche an der Bindung in der tripelhelikalen Bindungsregion teilnehmen.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die tripelhelikale Bindungssequenz von B eine kleinere Länge aufweist als die Sequenz, welche von Molekül C gebunden wird.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Molekül C eine Länge von mindestens 6 Basen aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das der gebildete Komplex zwei verschiedene Moleküle C enthält, welche in der dreisträngigen Region binden.
Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das die Moleküle C in aneinandergrenzender Weise an A binden.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Molekül B und/oder C chemisch modifiziert worden sind, wodurch eine Tripelhelix-Bildung von zwei Molekülen B oder zwei identischen Molekülen C, mit einem Molekül A destabilisiert wird.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindungsregion von B eine asymmetrische Basensequenz besitzt.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindungsregion von B eine symmetrische Basensequenz besitzt.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Molekül B über Hoogsteen-Basenpaarung an Nukleinsäure gebunden wird, und Molekül C über Watson-Crick-Basenpaarung gebunden wird.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Molekül B und/oder C markiert ist, und die Gegenwart der Markierungen) im Bindungskomplex für die Bestimmung der Nukleinsäure verwendet wird.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eines oder alle der Moleküle B und C ein Nukleinsäure-Analogon ist.
Verfahren gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsäure-Analogon PNA ist.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Basen in der Region von B, bindend an A, aus Pyrimidinen bestehen.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure von anderen Nukleinsäuren unterschieden wird, was nicht durch einen Unterschied in der Basensequenz bestimmt ist, die innerhalb der Region der Bindung von Molekül B an die Nukleinsäure liegt.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure von anderen Nukleinsäuren unterschieden wird, was nicht durch einen Unterschied in der Basensequenz bestimmt ist, die innerhalb der Region der Bindung von Molekül C an die Nukleinsäure, aber nicht innerhalb der Region der Bindung von Molekül B an die Nukleinsäure liegt.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Molekül C die Region der Bindung von Molekül B an die Nukleinsäure vollständig überspannt.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens 2 Moleküle C verwendet werden, wobei jedes von ihnen an einen exklusiven Teil der Nukleinsäure innerhalb der Region der Bindung von Molekül B bindet.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionsmischung zur Bildung des dreistängigen Bindungskomplexes ferner ein Kompetitorsonden-Molekül D enthält, welches mit mindestens einem Molekül C um die Bindung an A konkurrieren kann, welches aber nicht in der Lage ist, an dem dreistängigen Komplex teilzunehmen.
Dreistängiger Bindungskomplex zwischen einer Nukleinsäure A, einem ersten Nukleinsäure-bindenden Molekül B und mindestens einem weiteren Nukleinsäure-bindenden Molekül C mit einer anderen Basensequenz als B, welcher thermisch stabiler ist als ein dreistängiger Komplex, gebildet aus zwei Molekülen von B, oder zwei identischen Molekülen von C, mit einem Molekül von A, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekül B eine kleinere Länge aufweist als die Gesamt-Bindungsregion des/der Moleküle) C, und Molekül B eine Basensequenz von mehr als 3, aber weniger als 11 Basen besitzt, und die Sequenz von B asymmetrisch ist.
Komplex gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass Molekül B eine kleinere Länge aufweist als die Gesamt-Bindungsregion des/der Moleküle) C, und Molekül B eine Basensequenz von mehr als 3, aber weniger als 11 Basen besitzt, und die Sequenz von B symmetrisch ist.
Verfahren zum Bilden eines dreistängigen Bindungskomplex gemäß den Ansprüchen 22–23, umfassend das Mischen der Nukleinsäure A, eines ersten Nukleinsäure-bindenden Moleküls B und mindestens eines weiteren Nukleinsäure-bindenden Moleküls C.