DE69808609T2

DE69808609T2 - Antagonistische anti-avb3 integrin antikörper

Info

Publication number: DE69808609T2
Application number: DE69808609T
Authority: DE
Inventors: P. Carron; M. Meyer; Allen Nickols
Original assignee: GD Searle LLC
Current assignee: GD Searle LLC
Priority date: 1997-04-11
Filing date: 1998-04-09
Publication date: 2003-06-12
Anticipated expiration: 2018-04-10
Also published as: US6171588B1; EP0973550A1; AU6954398A; DE69808609D1; CA2284726A1; EP0973550B1; ES2187954T3; ATE225670T1; PT973550E; WO1998046264A1; JP2001521520A; DK0973550T3

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Antikörper, die sich eignen als αvβ&sub3; Integrin Antagonisten und als solche brauchbar sind in pharmazeutischen Zusammensetzungen und in Methoden zur Behandlung von Zuständen, die durch αvβ&sub3; vermittelt werden durch Inhibierung oder Antagonisierung von αvβ&sub3; Integrinen.

Hintergrund der Erfindung

Integrine sind eine Gruppe von Zelloberflächen-Glycoproteinen, die Zelladhesion vermitteln und somit Mediatoren von Zelladhesion-Zwischenreaktionen sind, die auftreten in verschiedenen biologischen Prozessen. Integrine sind Heterodimere, zusammengesetzt aus nicht kovalent gebundenen α- und β-Polypeptiduntereinheiten. Im Laufe der Zeit sind mindestens elf unterschiedliche α-Untereinheiten und mindestens sechs unterschiedliche β-Untereinheiten identifiziert worden. Die verschiedenen α-Untereinheiten können sich vereinigen mit verschiedenen β- Untereinheiten unter Bildung von bestimmten Integrinen.
Die Integrine, die identifiziert wurden als αvβ&sub3; (auch bekannt als der Vitronectin-Rezeptor) sind identifiziert worden als ein Integrin, das eine Rolle spielt bei verschiedenen Zuständen oder Krankheitsstadien, einschließlich Tumormetastase, Wachstum von festem Tumor (Neoplasie), Osteoporose, Paget's Krankheit, bösartiger humoraler Hypercalcemie, Angiogenese, einschließlich Tumor-Angiogenese, Retinopathie, Arthritis, einschließlich rheumatoider Arthritis, Periodontaler Erkrankung, Psoriasis und Zellmigration der glatten Muskulatur (z. B. Restenose). Außerdem wurde gefunden, dass solche Integrin inhibierenden Mittel brauchbar sein würden als antivirale Mittel, antifungale und antimicrobielle Mittel. Somit würden Antikörper, die selektiv αvβ&sub3; inhibieren oder antagonisieren nützlich sein zur Behandlung solcher Zustände.
Es ist gezeigt worden, dass αvβ&sub3; Integrin sich an eine Anzahl von Arg-Gly-Asp (RGD) enthaltenden Matrix Macromolekülen bindet, wie Fibrinogen (Beet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 80 (1983) 2417), Fibronectin (Ginsber et al., J. Clin. Invest., Band 71 (1983) 619-624) und von Willebrand factor (Ruggeri et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 79 (1982) 6038). Verbindungen, die die RGD Sequenz enthalten, ahmen extrazellulare Matrixliganden nach, so wie das Binden an Zelloberflächen-Rezeptoren. Jedoch ist außerdem bekannt, dass RGD Peptide im allgemeinen nicht selektiv für RGD abhängige Integrine sind. Beispielsweise binden sich die meisten RGD Peptide, die sich an αvβ&sub3; binden auch an αvβ&sub5;, αvβ&sub1; und αIIbβIIIa. Antagonismus von Blutplättchen αIIbβIIIa (auch bekannt als Fibrinogenrezeptor) ist dafür bekannt, dass er Blutplättchenaggregation bei Menschen blockiert. Um die Nebenwirkungen des Blutens zu verhindern bei der Behandlung von Zuständen von Erkrankungsstadien, die mit dem Integrin αvβ&sub3; verbunden sind, würde es günstig sein, selektive Antagonisten von αvβ&sub3; zu entwickeln im Gegensatz ZU αIIbβIIIa. Antikörper, die selektiv für αvβ&sub3; sind bieten einen solchen Vorteil.
WO93/20229 charakterisiert die komplex-spezifischen anti-αvβ&sub3; Integrin monoklonalen Antikörper (MoAbs) 9G2.1.3 und 10C4.1.3, die produziert werden durch die hinterlegten Zelllinien ATCC HB1030 und ATCC HB1029 und lehrt eine Anzahl von relevanten therapeutischen und diagnostischen Anwendungen solcher MoAbs.
WO89/05155 beschreibt, dass monoklonale Antikörper wie LM609 gerichtet sind gegen den RGDgerichteten Adhesionsrezeptor von Endothelialzellen. Die Druckschrift offenbart außerdem ein diagnostisches Kit-System zur Ermittlung der Gegenwart von ECr in einer Körperprobe und eine in vivo Methode für eine solche Ermittlung.
WO95/25543 offenbart Methoden zur Inhibierung von Angiogenese in einem Gewebe durch αvβ&sub3; Antagonisten wie der monoklonale Antikörper LM609 (ATCCHB 9537).

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung umfaßt murine monoklonale Antikörper, die produziert werden durch Hybridomas, die gewonnen werden aus Mäusen, die immunisiert wurden mit Humanintegrin αvβ&sub3; oder Zellen, die αvβ&sub3; exprimieren, die die funktionelle Aktivität von αvβ&sub3; blockieren. Insbesondere umfaßt die vorliegende Erfindung murine monoklonale Antikörper P113-7D6, P112-4C1, P113- 12A6, P112-11D2, P112-10D4 und P113-1F3, die komplex-spezifisch sind für αvβ&sub3; im Sinne, dass sie immun-reagieren mit einem Integrin αvβ&sub3; Komplex und nicht individuell reagieren mit irgendeinem der Integrin αv- oder β&sub3;-Untereinheiten. Außerdem binden sich die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper nicht wesentlich an αIIbβIIIa, αvβ&sub1;, αvβ&sub5; oder andere RGD erkennende Integrine. Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper können außerdem verwendet werden zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von αvβ&sub3; Integrin vermittelten Erkrankungen oder Zuständen, die als ein αvβ&sub3; Integrin Antagonist oder Inhibitor wirken.
Die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung können außerdem verwendet werden bei Methoden zur Lieferung von entweder cytotoxischen oder cytostatischen Verbindungen, Nucleinsäuren und Deoxynucleinsäuren oder Radioisotopen an Zellen, die αvβ&sub3; Integrin aufweisen. Beispielsweise können die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung (oder ein Fab, Fab', F(ab')2 und F(v) Fragmente davon, die ein Paratop für αvβ&sub3; Integrin enthalten) konjugiert werden an cytotoxische oder cytostatische Verbindungen, Nucleinsäuren oder Radioisotopen und dann kontaktiert werden mit Gewebe oder Zellen in vivo oder in vitro.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die Akte dieses Patentes enthält eine Farbfotographie. Kopien dieses Patentes mit der Farbfotographie werden durch das Patent- und Markenamt auf Anfrage und Bezahlung der notwendigen Gebühr zur Verfügung gestellt.
Fig. 1 zeigt, dass gereinigte anti-αvβ&sub3; monoklonale Antikörper P113-7D6, P112-4C1, P113-12A6, P112-11D2, P112-10D4, P113-1F3, LM609 (erhalten von Chemicon) ¹²&sup5;I-markiertes αvβ&sub3; bindet (Zeichnung A) jedoch nicht ¹²&sup5;I-markiertes αIIbβIIIa (Zeichnung B). Der Kontroll-monoklonale Antikörper M399 bindet weder ¹²&sup5;I-markiertes αvβ&sub3; noch αIIbβIIIa. M399 ist ein irrelevanter isotoper, gepaarter Kontrollantikörper, produziert durch Monsanto Company. LM609 Antikörper wurde geliefert von Chemicon (Tamecula, CA).
Fig. 2 zeigt, dass monoklonale Antikörper (50 ug/ml) P113-7D6, P112-4C1, P113-12A6, P112- 11D2, P112-10D4, P113-1F3, LM609 die Mn-induzierte Bindung von M21 (eine Melanomzelllinie) inhibiert, jedoch ein Kontroll-monoklonaler Antikörper M399 dies nicht tut.
Fig. 3 zeigt, dass die monoklonalen Antikörper (50 ug/ml) P112-4C1, P113-12A6, P112-11D2, jedoch nicht der Kontroll-monoklonale Antikörper M399 M21 Zell- (eine Humanmelanomzelllinie) Migration gegenüber Fibrinogen (Fg) inhibiert. Diese Figur zeigt Migration zu Fg alleine und Fg in Gegenwart eines Antikörpers.
Fig. 4 zeigt, dass monoklonale Antikörper (50 ug/ml) P113-7D6, P112-4C1, P113-12A6, P112- 11D2, P112-10D4, P113-1F3 und LM609 293/B3, jedoch nicht 293/B5 oder 293/B1 Zelladhesion an Vitronectin inhibieren.
Fig. 5 zeigt, dass monoklonale Antikörper P113-7D6, P112-4C1, P113-12A6, P112-11D2, P112- 10D4, P113-1F3, 23C6 und LM609 293/B3 Zelladhesion an Vitronectin inhibieren. M399 ist ein Kontroll-monoklonaler Antikörper. 23C6 Antikörper wurde geliefert von PharMingen (San Diego, CA).
Fig. 6 zeigt, dass monoklonale Antikörper (50 ug/ml) P113-7D6, P112-4C1, P113-12A6, P112- 11D2, P112-10D4, P113-1F3 Kaninchen Osteoclastadhesion an Osteopontin inhibieren. M399 ist ein Kontroll-monoklonaler Antikörper.
Fig. 7 zeigt, dass monoklonale Antikörper P113-7D6, P112-4C1, P113-12A6, P112-11D2, P112- 10D4, LM609, 23C6 die Proliferation von humanen dermalmicrovaskulär Endothelialzellen, die auf Osteopontin platiert sind, inhibieren. Der Kontroll-monoklonale Antikörper M399 hat keine inhibierende Wirkung.
Fig. 8 zeigt Immunolokalisierung von αvβ&sub3; in humanem Plazentagewebe und humanem Coloncarcinomgewebe mit monoklonalem anti-αvβ&sub3; P112-4C1. Zeichnungen A und B sind Mikrophotographien eines Schnitts von humaner Plazenta, die eingefroren worden war, von der ein Schnitt angefertigt worden war und die eingefärbt worden war zur Entdeckung des αvβ&sub3; Integrins. Abbildung A zeigt, dass beim Einfärben des Plazentagewebes unter Verwendung einer irrelevanten Isotopen-gepaarten Antikörperkontrolle die Entdeckung der Gegenwart von αvβ&sub3; mißlang. Abbildung B zeigt, dass beim Einfärben des Plazentagewebes unter Verwendung des monoklonalen anti-αvβ&sub3; P112-4C1 Antikörpers Trophoplasten (Pfeile) und Syncytiotrophoplasten (Pfeilspitzen) entdeckt werden, die positiv gefärbt sind bei der Gegenwart von αvβ&sub3; Integrin. Abbildungen C und D sind Mikrophotographien von Teilen eines Schnitts von Formalin-fixierten, in Paraffin eingebetteten Humancoloncarcinom, das behandelt wurde, von dem Schnitte angefertigt wurden und das gefärbt wurde zur Entdeckung von αvβ&sub3; Integrin. Abbildung C zeigt, dass beim Färben des Humancoloncarcinomgewebes unter Verwendung einer irrelevanten Isotopen-gepaarten Antikörperkontrolle die Entdeckung der Gegenwart von αvβ&sub3; mißlang. Abbildung D zeigt, dass der monoklonale anti-αvβ&sub3; P112-4C1 Antikörper die positive Färbung in neoplastischen Enterocyten (Pfeil), endothelialen Zellen (Pfeilspitze) und Fibroblassten (offene Pfeilspitze) in humanem Coloncarcinomgewebe entdeckt.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Metastasen

Man glaubt, dass Integrine verbunden sind, u. a., mit Tumormetastasen. Studien haben gezeigt (Humphries, et al., J. Clin. Invest., Band 81 (1988) 782), dass RGD-artige Verbindungen experimentelle Metastasen stören können, worin Tumorzellen direkt in das Blut injiziert wurden.
Tumorzellinvasion erfolgt durch einen Drei-Stufen-Prozess:
1) Tumorzellenanlagerung an extrazellulärer Matrix;
2) proteolytische Auflösung der Matrix und
3) Bewegung der Zellen durch die aufgelöste Barriere.
Dieser Prozess kann wiederholte Male erfolgen und kann in Metastasen resultieren an Stellen, die vom Originaltumor entfernt sind.
Seftor et al. (Proc Natl. Acad. Sci. LISA, Band 89 (1992) 1557) haben gezeigt, dass das αvβ&sub3; Integrin eine biologische Funktion bei der Melanomzellinvasion aufweist. Montgomery et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 91 (1994) 8856) haben demonstriert, dass das auf Humanmelanomzellen exprimierte Integrin αvβ&sub3; das Überlebenssignal fördert, wobei die Zellen vor Apoptose geschützt werden. Demgemäß würde die Mediation des metastatischen Weges der Tumorzelle durch Störung des αvβ&sub3; Integrin-Zelladhesion-Rezeptors, um Tumormetastase zu verhindern, günstig sein.
Brooks et al. (Cell, Band 79 (1994) 1157) haben demonstriert, dass Antagonisten von αvβ&sub3; einen therapeutischen Weg liefern zur Behandlung von Neoplasie (Inhibierung des festen Tumorwachstums), da systemische Verabreichung von αvβ&sub3; Antagonisten dramatische Regression von verschiedenen histologisch unterschiedlichen Humantumoren verursachen.
Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper können außerdem verwendet werden, um ein Medikament herzustellen zur Behandlung von αvβ&sub3; Integrin vermittelten Erkrankungen, wie Tumormetastase durch Verabreichung an einen Säuger, der eine Behandlung benötigt einer wirksamen Menge eines αvβ&sub3; Integrinantikörpers, der als ein αvβ&sub3; Integrin-Antagonist oder -Inhibitor wirkt.

Tumorwachstum/Angiogenese

Der Adhesionsrezeptor Integrin αvβ&sub3; wurde identifiziert als ein Marker von angiogenen Blutgefäßen in Hühnchen und Menschen und spielt eine kritische Rolle bei der Angiogenese oder Neovaskularisation (Brooks et al., J-Clin-Invest, Band 96 (1995) 1815). Angiogenese ist gekennzeichnet durch Invasion, Migration und Proliferation der glatten Muskulatur und Endothelialzellen, Antagonisten von αvβ&sub3; inhibieren diesen Prozess durch selektive Förderung von Apoptose von Zellen in Neovaskulatur. Das Wachstum von neuen Blutgefäßen oder Angiogenese ist außerdem dafür verantwortlich für pathologische Zustände wie diabetische Retinopathie (Adonis et al., Amer. J. Opththal., Band 118 (1994) 445), rheumatoider Arthritis (Peacock et al., J. Exp. Med., Band 175, (1992) 1135) und Osteoarthritis (Ondrick et al., Clin.-Podiatr.-Med.-Surg., Band 9, (1992) 185). Somit würden αvβ&sub3; Antagonisten geeignete therapeutische Zielscheiben sein für die Behandlung solcher Zustände, die mit Neovaskularisation zusammenhängen (Brooks et al., Science, Band 264 (1994) 569). Da Angiogenese normalerweise in weiblichen Reproduktivorganen erfolgt, würden Antagonisten von αvβ&sub3; zur Kontrolle der Fruchtbarkeit geeignet sein.

Osteoporose

Es ist berichtet worden, dass der Zelloberflächenrezeptor αvβ&sub3; das Hauptintegrin auf Osteoclasten ist, die verantwortlich sind für die Anlagerung an Knochen. Oteoclasten verursachen Knochenresorption und wenn solche Knochen resorbierende Wirksamkeit, die Knochen bildende Wirksamkeit übersteigt, resultiert dies in Osteoporose (ein Knochenverlust), was zu einer erhöhten Anzahl an Knochenbrüchen, Inkapazitation und erhöhten Sterblichkeit führt. Antagonisten von αvβ&sub3; erwiesen sich als potente Inhibitoren von osteoclastischer Wirksamkeit sowohl in vitro (Sato et al., J. Cell. Biol., Band 111 (1990) 1713) und in vivo (Fisher et al., Endocrinology, Band 132 (1993) 1411. Antagonismus von αvβ&sub3; führt zu verminderter Knochenresorption und stellt somit ein normales Gleichgewicht von Knochenbildung und resorbierender Aktivität her. Es würde somit günstig sein, Antagonisten von Osteoclast αvβ&sub3; zu liefern, die wirksame Inhibitoren von Knochenresorption sind und somit bei der Behandlung oder Verhinderung von Osteoporose geeignet sind.

Restenose

Die Rolle des αvβ&sub3; Integrins in der Zellmigration der glatten Muskulatur macht es außerdem zu einer therapeutischen Zielscheibe für die Verhinderung oder Inhibierung von neointimaler Hyperplasie, die ein führender Grund von Restenose ist, nach vaskulären Prozeduren (Choi et al., J. Vasc. Surg. Band 19(1) (1994) 125). Verhinderung oder Inhibierung von neointimaler Hyperplasie durch pharmazeutische Mittel, um Restenose zu verhindern oder zu inhibieren würde günstig sein.

Virale Infektion

White (Current Biology, Band 3(9) (1993) 596) hat berichtet, dass Adenovirus αvβ&sub3; verwendet zum Eindringen in Wirtszellen. Das Integrin scheint erforderlich zu sein zur Endocytose der Virusteilchen und kann erforderlich sein für die Penetration des viralen Genoms in die Wirtszelle. Somit würden Antikörper, die αvβ&sub3; inhibieren Anwendung finden als antivirale Mittel.

Anti-Integrin Antikörper

Eine Anzahl an anti-Integrin Antikörper sind bekannt. Doerr et al. (J. B. C., Band 271 (1996) 2443) berichtete, dass ein blockierender Antikörper gegenüber αvβ&sub5; Integrin in vitro die Migration von MCF- 7 humanen Brustkrebszellen inhibiert als Antwort auf die Stimulierung von IGF-1. Gui et al. (British J. Surgery, Band 82 (1995) 1192) berichten, dass Antikörper gegen αvβ&sub5; und β&sub1; und β&sub5; inhibieren in vitro Chemoinvasion durch Humanbrustkrebscarcinomzelllinien Hs578T und MDA-MB-231. Lehman et al. (Cancer Research, Band 54 (1994) 2102) zeigt, dass ein monoklonaler Antikörper (69-6-5) mit verschiedenen αv Integrinen reagiert, einschließlich αvβ&sub3; und Säulencarcinomzelladhesion inhibiert bei einer Anzahl von Substraten, einschließlich Vitronectin. Brooks et al. (Science, Band 264 (1994) 569) zeigen, dass Blockade von Integrinaktivität mit einem anti-αvβ&sub3; monoklonalen Antikörper Tumorinduzierte Angiogenese von Hühnchen chorioallantoischen Membranen inhibiert durch Human M21-L Melanomfragmente. Chuntharapai et al. (Exp. Cell. Res., Band 205 (1993) 345) beschreibt monoklonale Antikörper 9G2.1.3 und 10C4.1.3, die den αvβ&sub3; Komplex erkennen, wobei man von letzterem monoklonalen Antikörper sagt, dass er schwach bindet oder überhaupt nicht bindet an Gewebe, die αvβ&sub3; exprimieren, mit der Ausnahme von Osteoclasten und es wurde nahegelegt, dass er für in vivo Therapie von Knochenerkrankungen geeignet sei. Dem ersteren monoklonalen Antikörper wurde nahegelegt, dass er ein Potentiell als ein therapeutisches Mittel bei einigen Krebserkrankungen aufweist.
Ginsberg et al., U. S. Patent Nr. 5,306,620 offenbart Antikörper, die mit Integrin reagieren, so dass die Bindungsaffinität von Integrin für Liganden erhöht ist. Als solche sollen diese monoklonalen Antikörper geeignet sein zur Verhinderung von Metastasen durch Immobilisierung von Melanomtumoren. Brown, U. S. Patent Nr. 5,057,604 offenbart die Verwendung von monoklonalen Antikörpern gegen αvβ&sub3; Integrine, die RGD-vermittelte Phagocytoseerhöhung inhibieren durch Binden an einen Rezeptor, der RGD Sequenz enthaltende Proteine erkennt. Plow et al., U. S. Patent Nr. 5,149,780 offenbart ein Proteinhomolog zum RGD Epitop von Integrin β-Untereinheiten und einen monoklonalen Antikörper, der Integrin-Ligandenbindung inhibiert durch Bindung an die β&sub3;- Untereinheit. Diese Wirkung soll brauchbar sein bei Therapien für Adhesions initiierte Humanantworten wie Koagulation und einige entzündliche Antworten.
Als ein Ergebnis der vorliegenden Erfindung können monoklonale Antikörper verwendet werden in einer Methode zum Blockieren von αvβ&sub3;-vermittelten Ereignissen wie Zelladhesion, Osteoclastvermittelte Knochenresorption, Restenose, Ocularneovascularisation und Wachstum von Hämangiomas als auch neoplastische Zellen oder Tumorwachstum und Dissemination. Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper können außerdem verwendet werden für Antikörper vermitteltes Zielen und Bereitstellung von therapeutischen Mitteln zum Zerreißen oder Töten von αvβ&sub3; tragenden Neoplasmen und Tumor bedingten vasculären Betten. Außerdem können die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper verwendet werden für die Sichtbarmachung oder bildlichen Darstellung von αvβ&sub3; tragenden Neoplasmen oder Tumor bedingten vasculären Betten, beispielsweise durch NMR oder Immunscintigraphie.
Außerdem können diese monoklonalen Antikörper αvβ&sub3; in Lösungen und gefrorenen Gewebeschnitten und auf Zelloberflächen entdecken und somit können diese monoklonalen Antikörper verwendet werden für die Entdeckung und Kennzeichnung von αvβ&sub3; tragenden Tumor- und Endothelialzellen in humanen Bösartigkeiten. Demgemäß können die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung verwendet werden zur immunchemischen und immunhistochemischen Identifizierung von Tumorvasculatur. Da das Integrin αvβ&sub3; minimal exprimiert ist auf ruhenden oder normalen Blutgefäßen, jedoch wesentlich verstärkt reguliert ist auf vasculären Zellen innerhalb humaner Tumoren (Brooks et al., Cell, Band 79 (1994) 1157; Brooks et al., Science, Band 264 (1994) 569; Brooks, et al., J-Clin-Inest, Band 96 (1995) 1815) kann αvβ&sub3; als Marker erachtet werden von Humantumor verbundenen Blutgefäßen und Tumorwachstum (Brooks, et al., J-clin-Invest, Band 96 (1995) 1815). Folglich können Antikörper, die αvβ&sub3; erkennen, verwendet werden als immundiagnostisches Mittel, um Tumor bedingte Blutgefäße oder vasculäre Betten zu identifizieren unter Anwendung konventioneller immunhistochemischer Techniken. Außerdem, da das Integrin αvβ&sub3; ein Marker für Tumor verbundene Blutgefäße ist und jüngere Erkenntnisse anzeigen, dass Blutgefäßdichte ein prognostischer Indikator von Krebs und Krankheitsstatus ist (Weidner, Semin- Diagn-Pathol, Band 10 (1993) 302), können Antikörper, die αvβ&sub3; erkennen verwendet werden als eine Komponente einer diagnostischen Vorrichtung oder Technik, um Tumor-bedingte Blutgefäßüberschuß oder -dichte zu messen und Krankheitsprognose zu definierten. Insbesondere werden histologische Schnitte von frisch gefrorenen oder Formalin-fixierten in Paraffin eingebettete Tumorgewebe immun gefärbt mit αvβ&sub3; Antikörper, vorzugsweise unter Verwendung des αvβ&sub3; Antikörpers bei einer Konzentration von 0,1-50 ug/ml unter Anwendung von in der Technik bekannten Verfahren. αvβ&sub3; Antikörper, gebunden an vasculäre Endothelialzellen im Gewebe können sichtbar gemacht werden unter Anwendung eines zweiten Mittels, gewöhnlich einem zweiten Antikörper, der die Lokalisierung der αvβ&sub3; Antikörperbindung innerhalb des Gewebeschnitts gestattet. Vorzugsweise reagiert der zweite Antikörper mit oder bindet sich an den αvβ&sub3; Antikörper und weist ein gebundes Reportermolekül auf, beispielsweise einen anti-Maus Antikörper mit einem gebunden Enzym oder fluoreszierenden Marker. Die Anzahl und der Bereich von immun-gefärbten Blutgefäßen im Gewebe kann dann gezählt werden durch mikroskopische Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, um Tumorblutgefäßdichte oder Vermehrung anzuzeigen.
Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper können außerdem verwendet werden bei Methoden zur Lieferung von entweder cytotoxischen oder cytostatischen Verbindungen, Nuclein- und Deoxynucleinsäuren oder Radioisotopen an Zellen, die αvβ&sub3; integrin aufweisen. Beispielsweise können die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper (oder ein Fab, Fab', F(ab')2 und F(v) Fragmente davon, enthaltend ein Paratop für αvβ&sub3; Integrin) konjugiert werden mit den cytotoxischen oder cytostatischen Verbindungen, Nucleinsäuren oder Radioisotopen und dann kontaktiert werden mit Gewebe oder Zellen in vivo oder in vitro.

Antikörper und Antikörperzusammensetzungen

Der Ausdruck "Antikörper" betrifft Immunglobulinmoleküle und immunologisch aktive Teile von Immunglobulinmolekülen, d. h. Moleküle, die eine Antikörper-Bindungsstelle oder ein Paratop enthalten. Beispiele für Antikörpermoleküle sind intake Immunglobulinmoleküle, im wesentlichen intakte Immunglobulinmoleküle und diejenigen Teile eines Immunglobulinmoleküls, die das Paratop enthalten, einschließlich solche in der Technik bekannte Teile wie Fab, Fab', F(ab')2 und F(v).
Der Ausdruck "Antikörper-Bindungsstelle" betrifft den strukturellen Teil eines Antikörpermoleküls, der zusammengesetzt ist aus einer schwer- und leichtkettigen variablen und hypervariablen Region, die spezifisch Antigen bindet (oder damit immun-reagiert). Der Ausdruck "immun-reagieren" betrifft die Bindung zwischen einem Molekül, das eine antigene Determinante enthält und einem Molekül, das eine Antikörper-Bindungsstelle enthält wie ein ganzes Antikörpermolekül oder ein Teil davon. Der Ausdruck "antigene Determinante" betrifft den tatsächlichen strukturellen Teil des Antigens, das immunologisch an eine Antikörperbindungsstelle gebunden ist. Der Ausdruck ist außerdem austauschbar zu verwenden mit "Epitop".
Im vorliegenden betrifft der Ausdruck "spezifisch binden" eine nicht zufällige Bindungsreaktion zwischen zwei Molekülen, beispielsweise zwischen einem Antikörpermolekül, das immun-reagiert mit einem Antigen oder zwischen einem Zelloberflächenintegrinrezeptor und einem Ligandenmolekül. Beispiele eines spezifisch gebundenen Rezeptor-Ligandenkomplexes ist das zwischen Blutplättchen αIIbβIIIa und Fibrinogen an der Blutplättchenoberfläche.
Der Ligand, an den ein Integrin spezifisch gebunden ist wird als ein spezifischer Ligand bezeichnet und muss zwangsläufig im Zusammenhang mit einem bestimmten Integrin genannt werden. Spezifische Liganden zum Binden an Integrine sind wohl gekennzeichnet für viele Integrine. Beispielsweise ist Fibrinogen ein spezifischer Ligand für den Blutplättchenrezeptor (αIIbβIIIa); Vitronectin, von Willebrand Factor und Fibrinogen sind spezifische Liganden für den Vitronectinrezeptor (VnR); Fibronektin ist ein spezifischer Ligand für den VLA-5 Rezeptor; Laminin ist ein spezifischer Ligand für den VLA-6 Rezeptor und Kollagen ist ein spezifischer Ligandrezeptor für den VLA-2 Rezeptor. Wie in Fig. 1 angegeben wurde (Abbildung B) binden die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper kein αIIbβIIIa.
Eine monoklonale Antikörperzusammensetzung ist typischerweise zusammengesetzt aus Antikörpern, die durch Klone einer einzigen Zeile produziert wurden, genannt ein Hybridoma, das abscheidet (produziert) eine Art von Antikörpermolekül. Historischerweise werden die Hybridomazellen gebildet durch Fusionierung einer Antikörper produzierenden Zelle und einem Myelom oder einer anderen sich selbst fortsetzenden Zelllinie. Solche Antikörper wurden zuerst beschrieben durch Köhler und Milstein, Nature, Band 256 (1975) 495-497, wobei diese Beschreibung durch Bezugnahme hier eingeschlossen ist, obgleich zahlreiche wohl bekannte Variationen seitdem beschrieben worden sind zur Produzierung von Hybridomazellen.
Die Herstellung von monoklonalen Antikörpern umfaßt im allgemeinen die Immunisierung eines Säugers mit einem Inoculum, das das Integrin enthält, gegen das der Antikörper immun-reagieren soll, wobei in den Antikörper des Säugers Moleküle induziert werden, die die hier beschriebene immunspezifität aufweisen. Die Antikörper produzierenden Zellen werden dann isoliert, geklont und gescreent auf die Gegenwart von interessierenden Antikörpermolekülen.
Die Integrin inhibierenden monoklonalen Antikörper dieser Erfindung können hergestellt werden durch die Methode umfassend die Stufen:
(a) Immunisieren eines Tieres mit einem Inoculum, das ein Integrin enthält. Das Integrin kann präsentiert werden in einer Vielzahl von Formen wie hier beschrieben, einschließlich gereinigtem Integrin, teilweise isoliertem Integrin in Form von Zellmembranen, die den Zelloberflächen- Integrinrezeptor an die Membranen gebunden haben und ganze Zellen, die das Integrin mit der Zellmembran verbunden haben.
Die Immunisierung erfolgt typischerweise durch Verabreichung des Inoculums an einen immunologisch kompetenten Säuger in einer immunologisch wirksamen Menge, d. h. eine Menge, die ausreicht, um eine Immunantwort zu erzeugen. Vorzugsweise ist der Säuger ein Nagetier wie ein Kaninchen, Ratte oder Maus. Der Säuger wird dann solange gehalten, wie ausreicht für den Säuger, um Zellen zu produzieren, die Antikörpermoleküle abscheiden, die mit dem Rezeptor immun-reagieren.
Der Ausdruck "Inoculum" wird um vorliegenden verwendet, um eine Zusammensetzung zu beschreiben, die ein Integrin in einer der vorstehend beschriebenen Formen enthält als ein Wirkstoff, der für die Herstellung von Integrin inhibierenden Antikörpern verwendet wird.
Das Inoculum enthält eine wirksame immunogene Menge an αvβ&sub3; Integrin. Die wirksame Menge an Integrin je Dosierungseinheit, die ausreicht eine Immunantwort auf das immunisierende Integrin zu induzieren, hängt u. a. von der Spezies des inoculierten Tieres ab, dem Körpergewicht des Tieres und dem ausgewählten Inoculierungsplan, wie in der Technik wohl bekannt ist. Inocula enthalten typischerweise Proteinkonzentrationen von etwa 10 Mikrogramm bis etwa 500 Milligramm je Inoculierung (Dosis), vorzugsweise etwa 50 Mikrogramm bis etwa 50 Milligramm je Dosis.
Der Ausdruck "Dosierungseinheit", wie er auf das Inocula zutrifft, betrifft physikalisch getrennte Einheiten, die sich als Dosierungseinheiten eignen für Tiere, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge des Materials enthält, das berechnet ist, um den gewünschten immunogenen Effekt im Zusammenhang mit dem erforderlichen Verdünnungsmittel zu produzieren, d. h. Träger oder Vehikel. Die Spezifizierungen für die neuen Dosierungseinheiten eines Inoculums dieser Erfindung werden diktiert durch und sind direkt abhängig von (a) den einzigartigen Charakteristiken des Wirkstoffs und der bestimmten zu erzielenden immunologischen Wirkung und (b) den innewohnenden technischen Begrenzungen der Compoundierung solcher Wirkstoffe zur immunologischen Anwendung bei Tieren, wie hier im einzelnen beschrieben wurde, wobei dies Merkmale der vorliegenden Erfindung sind.
Inocula werden typischerweise hergestellt aus dem Immunogen, beispielsweise einem isolierten Integrin durch Dispergieren des Immunogens in einem physiologisch tolerierbaren Verdünnungsmittel wie Wasser, Kochsalzlösung oder Phosphat gepufferte Kochsalzlösung unter Bildung einer wässrigen Zusammensetzung.
Inocula können außerdem ein Adjuvanz enthalten als Teil des Verdünnungsmittels. Adjuvanzien wie Freunds Complete Adjuvant (FCA), Freund's Incomplete Adjuvant (FIA) und Alum sind in der Technik wohl bekannte Materialien und sind im Handel aus verschiedenen Quellen erhältlich.
In einer bevorzugten Immunisierung wurden Mäuse dreimal immunisiert über einen Zeitraum von mehreren Wochen mit 1 · 10&sup6; Babyharnsternieren (BHK) Zellen, die gentechnisch verändert wurden, um αvβ&sub3; zu produzieren. BHK Zellen wurden transfiziert unter Verwendung von LipofectAMINE® gemäß den Empfehlungen des Herstellers (Gibco BRL, Gaithersgurg, MD) mit human av oder β&sub3; cDNA in den Expressionsvektor pcDNA3 des Säugers (Invitrogen Corporation), was Neomycinresistenz verleiht (Southern, P. J. und Berg, P., J. Mol. Appl. Gen. Band 1 (1982) 327). Expression von human αvβ&sub3; durch tranfizierte BHK Zellen wurde bestätigt durch Fließcytometrie unter Verwendung von αvβ&sub3; spezifischen mAb LM609 (Chemicon, Temecula, CA; Proc. Natl. Acad, Sci. USA, Band 84 (1987) 6471. Mäuse wurden immunisiert mit αvβ&sub3; exprimierenden BHK Zellen, die emulgiert waren im FCA zum Zeitpunkt der ersten Immunisierung; alle anderen Immunisierungen benutzten Antigen vermischt mit FIA oder Phosphat gepufferter Kochsalzlösung. Etwa vier Tage vor der Gewinnung von Splenocyten von mit Zellen immunisierten Mäusen wurden die Mäuse immunisiert mit αvβ&sub3;, das von human plazentalen Extrakten gereinigt wurde.
(b) Eine Suspension von Antikörper produzierenden Zellen, die von den immunisierten Säugern entfernt worden war, wurde dann hergestellt. Dies erfolgt typischerweise durch Entfernung der Milz des Säugers und mechanische Trennung der einzelnen Milzzellen in einem physiologisch tolerierbaren Medium unter Anwendung von in der Technik wohl bekannten Methoden.
(c) Die suspendierten Antikörper produzierenden Zellen werden behandelt mit einem Transformierungsmittel, das in der Lage ist eine transformierte ("immortalisierte") Zelllinie zu produzieren. Transformierungsmittel und deren Verwendung, um immortalisierte Zell (transformiert) Linien zu erzeugen sind in der Technik wohl bekannt und umfassen DNA Viren, wie Epstein Bar Virus (EBV), Simian Virus 40 (SV40), Polyoma Virus und dergleichen, RNA Viren, wie Moloney Murine Leukämie Virus (Mo-MuLV), Rous Sarcoma Virus und dergleichen, Myelomzellen, wie P3X63-Ag8.653, Sp2/0-Ag14 und dergleichen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform resultiert die Behandlung mit dem Transformierungsmittel in der Produktion eines Hybridomas mit Hilfe von Fusionierung der suspendierten Milzzellen mit Mausmyelomazellen von einer geeigneten Zelllinie durch die Verwendung eines geeigneten Fusionspromotors. Ein bevorzugtes Verhältnis ist etwa 2 Milzzellen je Myelomzelle in einer Suspension, enthaltend etwa 10&sup8; Splenocyten. Ein bevorzugter Fusionspromoter ist Polyethylenglycol mit einem Durchschnittsmolekulargewicht von etwa 1000 bis etwa 4000 (im Handel erhältlich als PEG 1300-1600, ATCC); jedoch können andere in der Technik bekannte Fusionspromotoren verwendet werden.
Die verwendete Zelllinie sollte vorzugsweise vom sogenannten "Arzneimittel resistenten" Typ sein, so dass nicht fusionierte Myelomazellen in einem selektiven Medium nicht überleben, während Hybriden überleben werden. Eine übliche Klasse sind 8-Azaguanin resistente Zelllinien, die keine Enzymhypoxanthin-Guaninphosphoribosyltransferase aufweisen und somit nicht getragen werden durch HAT (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) Medium. Es wird außerdem generell bevorzugt, dass die verwendete Myelomazelllinie vom sogenannten "nicht ausscheidenden" Typ ist, der nicht selbst irgendwelche Antikörper produziert. In gewissen Fällen jedoch können ausscheidende Myelomalinien bevorzugt sein.
(d) Die transformierten Zellen werden dann geklont, vorzugsweise zur Monoklonalität. Das Klonen erfolgt vorzugsweise in einem Gewebekulturmedium, das nicht transformierte Zellen nicht stützt (trägt). Wenn die transformierten Zellen Hybridomas sind, erfolgt dies typischerweise durch Verdünnen und Kultivieren in getrennten Behältern des Gemischs aus nicht fusionierten Milzzellen, nicht fusionierten Myelomazellen und fusionierten Zellen (Hybridomas) in einem selektiven Medium, das die nicht fusionierten Myelomazellen nicht stützt (nicht transformierte Zellen). Diese Zellen werden kultiviert in diesem Medium solange, bis die nicht fusionierten Zellen absterben können (etwa eine Woche). Die Verdünnung kann eine begrenzte Verdünnung sein, worin das Volumen des Verdünnungsmittels statistisch berechnet wird, um eine gewisse Anzahl an Zellen zu isolieren (z. B. 1-4) in jedem getrennten Behälter (z. B. jedes Näpfchen einer Mikrotiterplatte). Wahlweise kann die Verdünnung erfolgen in Weichagar, so dass eine einzige Zellsuspension erzeugt wird und dann platiert wird in halbfestem Agar (Goding, J. W., J. Immuol. Methods., Band 39 (1980) 285). Das Medium ist eines (z. B. HAT Medium), das die Arzneimittel resistente (z. B. 8-Azaguanin resistent), nicht fusionierte Myelomazelllinie niclnt stützen wird.
(e) Dieses Gewebekulturmedium der geklonten Hybridomas wird dann untersucht, um die Gegenwart von ausgeschiedenen Antikörpermolekülen zu entdecken, die die hier beschriebenen immun-reaktiven Eigenschaften besitzen unter Anwendung von wohl bekannten immunologischen Screening-Techniken zusammen mit den hier beschriebenen Versuchen, um Integrin inhibierende Antikörper zu identifizieren.
Wie durch die verschiedenen Screening-Protokolle in nachstehendem Beispiel 1 gezeigt wird, werden verschiedene getrennte Versuche typischerweise durchgeführt, um Integrin inhibierende Antikörper zu identifizieren, um einen erfindungsgemäßen Antikörper zu identifizieren. Zuerst wird die Kultur ausgewertet für Antikörper, die mit αvβ&sub3; immun-reaktiv sind. Hybridomas in Zellkulturen, die die αvβ&sub3; reaktiven Antikörper enthalten werden dann geklont durch Verdünnen und einzelne Klone werden nochmals gescreent, um klonale Zelllinien zu identifizieren, die αvβ&sub3; reaktive Antikörper produzieren.
Repräsentative und bevorzugte Methoden zur Herstellung von Integrin inhibierenden monoklonalen Antikörperzusammensetzungen werden in nachstehendem Beispiel 1 beschrieben.
(f) Gewünschte klonale Zeillinien werden dann ausgewählt. Um eine wesentlich größere Konzentration von monoklonalem Antikörper zu produzieren, kann das gewünschte Hybridoma durch Injektion in Mäuse transferiert werden, vorzugsweise syngeneische oder semisyngeneische Mäuse. Das Hybridoma wird die Bilidung von Antikörper produzierenden Tumoren verursachen nach einer geeigneten Inkubationszeit, die in einer höheren Konzentration des gewünschten Antikörpers (etwa 5-20 mg/ml) im Blutstrom und peritonealem Exudat (Ascites) der Wirtsmaus resultiert.
Eine monoklonale Antikörperzusammensetzung kann angereichert werden an gewünschten Antikörpermolekülen durch zusätzliche Isolierungsmethoden wie Immunaffinitie-Chromotographie unter Verwendung von an Festphasen immunisierten Immunisierungsmitteln wie hier beschrieben oder durch Verwendung von beispielsweise DEAE Sephadex, um die IgG Fraktion, falls gewünscht, zu erhalten.
Media und Tiere, die sich zur Herstellung dieser Zusammensetzungen eignen sind beide in der Technik wohl bekannt und im Handel erhältlich und umfassen synthetische Kulturmedien, Inzuchtmäuse und dergleichen. Ein Beispiel für ein synthetisches Medium ist Dulbecco's minimal essential Medium (DME/FIZ, 1 : 1) ergänzt durch 4,5 g/l Glukose, 20 mM Glutamin und 20% fötales Kalbsserum. Ein Beispiel für einen Inzuchtmäusestamm ist der Balb/c.
Eine monoklonale Antikörperzusammensetzung kann außerdem produziert werden durch in der Technik bekannte Methoden der Produzierung von Antikörpern durch rekombinante DNA Methoden. Diese Methoden umfassen Isolierung, Manipulierung und Exprimierung von Nucleinsäure, die für alle oder einen Teil einer Immunglobulin variablen Region codiert, einschließlich sowohl des Teils der variablen Region umfaßt durch die variable Region von Immunglobulin-Leichtketten und der Portion der variablen Region, umfaßt durch die variable Region von Immunglobulin-Schwerketten. Methoden zur Isolierung, Manipulierung und Exprimierung der variablen Region zum Codieren von Nucleinsäure in procaryotischen und eucaryotischen Wirten werden beschrieben in Ronsinson et al., PCT Veröffentlichung Nr. WO 98/0099; Winter et al., Europäische Patent Veröffentlichung Nr. 0239400; Reading, U. S. Patent Nr. 4,714,681; Cabilly et al., Europäische Patent Veröffentlichung Nr. 0125023; Sorge et al., Mol. Cell Biol., Band 4 (1984) 1730-1737; Beher et al., Science, Band 240 (1988) 1041-1043; Skerra et al., Science, Band 240 (1988) 1030-1041 und Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A. Band 86 (1989) 3833-3837. Typischerweise codiert die Nucleinsäure für die gesamte oder einen Teil einer Immunglobulin variablen Region, die ein vorgewähltes Antigen bindet (Ligand). Quellen für eine solche Nucleinsäure sind in der Technik wohl bekannt und können beispielsweise erhalten werden aus einem Hybridoma, das einen monoklonalen Antikörper produziert, der das vorgewählte Antigen bindet oder das vorgewählte Antigen kann verwendet werden, um eine Expressionsbibliothek zu screenen, die für eine Vielzahl von Immunglobulin variablen Regionen codiert, und somit die Nucleinsäure isoliert.
Siehe beispielsweise die Methode zur Isolierung von monoklonalen Antikörpern aus einem immunologischen Repertoire wie beschrieben durch Sastry et al., (Proc. Natl. Acad. Sci., Band 86 (1989) 5728-5732) und Huse et al., (Science, Sand 246 (1989) 1275-1281).
Isolierte Nucleinsäuren, die für die Murinimmunoglobulingene codieren können gentechnisch verändert werden, um αvβ&sub3; Antikörperbindungsregionen herzustellen, die in human Ig Rückgrate aufgepfropft sind unter Anwendung des als Antikörperhumanisierung bekannten Verfahrens (Richmann et al., Nature, Band 332 (1988) 323). Ferner können Nucleinsäuren, die für die Murinimmunglobulingene von αvβ&sub3; Antikörper codieren gentechnisch verändert werden, um rekombinante bifunktionelle Antikörper, Einzelketten Fv (scFv) oder bispezifische scFv Fusionsproteine zu produzieren, die in einem einzigen Gen oder Genprodukt ein Toxin, immunstimulatorisches Molekül oder Zielgruppe kombinieren mit der αvβ&sub3; Bindungsdomäne (Reisfeld, et al., Curr Top Microbiol Immunol, Band 213 (1996) 27; Rybak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 89 (1992) 3165; Siegall et al., J. Immunol., Band 152 (1994) 2377; Naramura, et al., Immunol. Lett., Band 39 (1993) 91). Ferner kann Nucleinsäure, die für die murinen Immunglobulingene von αvβ&sub3; Antikörper codiert oder die Nucleinsäure, die für den humanisierten aufgepfropften Gegenpart codiert gentechnisch verändert werden, um die Antigen-Bindungsaffinität zu erhöhen, unter Anwendung von dem Fachmann bekannten Techniken (Rehinnecker et al., J. Immunol., Band 157 (1996) 2989; Barbas et al., TBTECH, Band 14 (1996) 230; Hoogenboom, Trends Biotechnol. Band 15(2) (1997) 62). Rekombinante αvβ&sub3; Antikörper, Antikörperfragmente oder Fusionsproteine, die von demselben stammen, können exprimiert werden in E coli, transgenen Pflanzen oder Tieren (Huse et al., Science, Band 246 (1989) 1275; Hiatt et al., Nature, Band 342 (1989) 76; Morcol et al., Ann. N. Y. Acad, Sci,, Band 721 (1994) 218; Ebert et al., Biotechnology-N-Y, Band 9 (1991) 835.
Die anti-αvβ&sub3; monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung können hergestellt werden durch rekombinante DNA Methoden wie diejenige beschrieben in U. S. Patent 4,816,567. DNA, die die monoklonalen Antikörper der Erfindung codiert kann leicht isoliert werden und getrennt werden unter Verwendung üblicher Verfahren (z. B. durch Anwendung von Oligonucleotiduntersuchungen, die in der Lage sind, sich spezifisch an Gene zu binden, die die schweren und leichten Ketten von Murin- Antikörper encodieren können). Die erfindungsgemäßen Hybridomazellen dienen als bevorzugte Quelle solcher DNA. Wenn sie einmal isoliert ist kann die DNA eingeführt werden in einen Expressionsvektor und dann transfiziert werden in Wirtszellen wie Simian COS Zellen, Zellen von chinesischen Hamsterovarien (CHO) oder Myelomazellen, die nicht sonst irgendwie Immunglobulin produzieren, um die Synthese von monoklonalem Antikörpern in den rekombinanten Wirtszellen zu erhalten.
Die DNA kann außerdem modifiziert sein beispielsweise durch Verwendung der codierenden Sequenz konstanter Domänen für humane schwere und leichte Ketten anstelle der homologen Murinsequenzen (siehe Morrison ea al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855, U. S. 4,816,567 und U. S. 5,693,761. Rekombinante DNA Technologie ist angewandt worden, um Immunglobulinmoleküle zu produzieren, die Humangerüstregionen aufweisen, kombiniert mit komplementären determinierenden Regionen (CDR's) von einem Spendermaus- oder -rattenimmunglobulin. Diese neuen Proteine werden "umgestaltete" oder "humanisierte" Immunglobuline genannt und das Verfahren, durch das das Spenderimmunglobulin umgewandelt wurde in ein humanartiges Immunglobulin durch Kombinieren seiner CDR's mit einem Humangerüst wird "Humanisierung" genannt. Humanisierte Antikörper sind wichtig, weil sie sich an das gleiche Antigen binden wie die originalen Antikörper, aber weniger immunogen sind, wenn sie in einen menschlichen Wirt injiziert werden.
Die durch die vorstehende Methode hergestellten monoklonalen Antikörperzusammensetzungen können verwendet werden beispielsweise in diagnostischen und therapeutischen Modalitäten, worin spezifische Bindung oder Inhibierung von Integrin gewünscht wird, wie im nachstehenden beschrieben.
(g) IgG isoliert von Ascitesflüssigkeiten von Mäusen, die inoculiert worden waren mit den Zeillinien, die αvβ&sub3; reaktive Antikörper produzieren, wurden dann weiter bewertet als Inhibitoren von αvβ&sub3; in Versuchen wie Inhibierung von Mn-induzierter Bindung von M21 Zellen an Fibrinogen (Fig. 2); Inhibierung von M21 Zellmigration (Fig. 3); Inhibierung von 293/β&sub3;, 293/β&sub5; oder 293/β&sub1; Zellen an Vitronectin (Fig. 4 und 5) und Inhibierung von Kaninchen Osteoclastadhesion an Osteopontin (Fig. 6).

Hybridomas

Hybridomas der vorliegenden Erfindung sind solche, die dahingehend gekennzeichnet sind, dass sie die Kapazität haben eine Integrin inhibierende monoklonale Antikörperzusammensetzung dieser Erfindung zu produzieren.
Ein bevorzugtes Hybridoma der vorliegenden Erfindung wird dahingehend gekennzeichnet, dass es Integrin inhibierende Antikörpermoleküle produziert, die mit einem Integrin immun-reagieren. Der Antikörper ist außerdem "komplex-spezifisch" in dem Sinne, dass er immun-reagiert mit einem Integrin αvβ&sub3; Komplex und nicht reagiert mit einem der einzelnen Integrin αv- oder β&sub3;-Untereinheiten. Mit anderen Worten, der Antikörper erkennt αv im Kontext mit β&sub3;, während zur gleichen Zeit er β&sub3; im Kontext mit αv reagiert, wie in Fig. 5 gezeigt.
Repräsentative bevorzugte Hybridomas werden hergestellt und beschrieben in nachstehendem Beispiel 1. Insbesondere bevorzugt sind die Hybridoma-Zelllinien bezeichnet als P113-7D6, P112- 4C1, P113-12A6, P112-11D2, P112-10D4 und P113-1F3.
Hybridoma-Zelllinien P113-7D6, P112-4C1, P113-12A6, P112-11D2, P112-10D4 und P113-1F3 sind hinterlegt worden gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrages bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Me. 20852, U. S. A am 5. November 1996 und es wurden ihnen die Hinterlegungsnummern HB-12224, HB-12225, HB-12226, HB-12227, HB-12228 und HB-12229 zugeteilt.
Diese Hybridomas wurden für die für die Hinterlegung geforderte Dauer hinterlegt und sind der Öffentlichkeit zugänglich ab Erteilung eines Patentes unter Bedingungen, die sicherstellen, dass der Zugang zu dem Hybridoma während der Laufzeit der Patentanmeldung demjenigen gestattet ist, der zu einem solchen Zugang berechtigt ist und dass alle Beschränkungen der Zugänglichkeit der Öffentlichkeit zu dem hinterlegten Hybridoma unwiderruflich bei Erteilung eines Patentes aufgehoben werden. Die hinterlegten Hybridomas werden durch die ATCC aufbewahrt und alle Aufbewahrungsgebühren sind für die Zeit des Patentes oder 30 Jahre vom Hinterlegungsdatum, je nachdem, was länger ist, bezahlt worden und in jedem Fall mindestens fünf Jahre nach dem letzten Datum des letzten Antrags auf Zugänglichkeit.
Methoden zur Herstellung von Hybridomas, die Antikörpermoleküle produzieren (ausscheiden), welche eine gewünschte Immunspezifität besitzen, d. h. die Fähigkeit besitzen, mit einem bestimmten Antigen, einem identifizierbaren Epitop auf einem bestimmten Antigen immun zu reagieren sind in der Technik wohl bekannt und werden im nachhinein weiter beschrieben. Besonders anwendbar ist die Hybridoma-Technologie, beschrieben durch Niman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 80 (1983) 4949-4953 und durch Galfre et al., Meth. Enzymol., Band 73 (1981) 3-46.

Therapeutische Methoden und Zusammensetzungen

Therapeutische Präparate und Zusammensetzungen sind vorgesehen zur Inhibierung von Integrinen. Diese Präparate eignen sich zum inhibieren von Zellanlagerung und Migration, die durch Integrine vermittelt wird und finden Anwendung in einer großen Vielzahl von Zelltypen, Geweben und Systemen, wo Anlagerung von Zellen gewünscht wird.
So sieht die Erfindung generell eine Methode vor zur Inhibierung eines Integrins, das einen spezifischen Liganden bindet, umfassend die Kontaktierung des Integrins mit einer Lösung, enthaltend eine inhibierende Menge eines Integrin inhibierenden Antikörpers wie hier beschrieben, der immunspezifisch für das Integrin ist beispielsweise αvβ&sub3; Integrin.
Typischerweise wird die Methode durchgeführt an Zellen, die das Integrin auf der Oberfläche der Zelle exprimieren, so dass das Kontaktieren durch Vermischen der Zellen erfolgt in einer Lösung mit den Integrin inhibierenden Antikörpern unter Bildung eines Gemischs. Das Gemisch ist vorzugsweise physiologisch verträglich mit der Lebensfähigkeit der Zellen, vorzugsweise steril und bevorzugtererweise verträglich im Gemisch mit Blut, um die Zugabe des Gemischs zum Blut zu erleichtern.
Eine inhibierende Menge von Integrin inhibierendem Antikörper ist eine Menge, die ausreicht, um das gewünschte Ergebnis zu erzeugen, nämlich das Integrin zu einem Grad zu inhibieren, der ausreicht, um die Adhesion der Zellen zu reduzieren, die das Integrin exprimieren und hängt typischerweise von der Menge des zu kontaktierenden Integrins ab.
In bevorzugten Ausführungsformen, gleichgültig ob die Methode in vitro praktiziert wird oder ob die Präparate hergestellt werden zur Verwendung in vivo eine inhibierende Menge ist eine Menge, die ausreicht, um mindestens ein Mohr Äquivalent des Integrin inhibierenden Antikörpers per Molar Äquivalent des Integrins zu inhibieren. Diese Menge wird als stoichiometrische Menge des Integrin inhibierenden Antikörpers bezeichnet. Obgleich die Antikörperaffinität für die Immunreaktion typischerweise ausreicht für einen Integrin inhibierenden Antikörper, um stoichiometrisch in verdünnten Lösungen immun zu reagieren, wird es vorgezogen, dass eine inhibierende Menge im Bereich von etwa 100 Nanomolar (nM) bis 1 Millimolar (mM), vorzugsweise im Bereich von 1 bis 100 Mikromolar (uM) und bevorzugtererweise etwa 1 bis 10 uM liegt.
Wenn eine Integrin inhibierende Methode praktiziert wird in vitro werden eine flüssige Probe, enthaltend das Integrin und vorzugsweise eine physiologische Flüssigkeit, enthaltend Zellen, die Zelloberflächenintegrin exprimieren vermischt mit einer inhibierenden Menge eines Integrin inhibierenden Antikörpers dieser Erfindung, unter Bildung eines Komplexes. Der Komplex wird unter biologischen Bedingungen gehalten, die verträglich sind mit der Bildung eines Immunreaktionsproduktes und außerdem verträglich, falls erforderlich, mit der Zelllebensfähigkeit für eine Zeit, die für den Integrin inhibierenden Antikörper ausreicht, um mit dem Integrin immun zu reagieren und wenn er immun-reagiert hat, das Integrin zu inhibieren.
Wenn das Integrin inhibierende Medikament hergestellt wird zur Verwendung in vivo wird eine inhibierende Menge einer Antikörperzusammensetzung, enthaltend ein physiologisch tolerierbares Verdünnungsmittel und Integrin inhibierende Antikörpermoleküle wie hier beschrieben, intravenös verabreicht an einen Säuger, z. B. einen Menschen und der Säuger wird so lange gehalten, bis die Antikörpermoleküle immun-reagieren mit irgendeinem vorliegenden Integrin und ein inhibierendes Immunreaktionsprodukt bilden. Andere Verabreichungswege sind vorgesehen, einschließlich intraperitoneal, intramuskulär, intrathecal und subcutan.
In bevorzugten Ausführungsformen wird eine therapeutische Zusammensetzung hergestellt zur Verwendung in einer Integrin inhibierenden Methode und umfaßt Integrin inhibierende Antikörpermoleküle, die mit dem Integrinkomplex immun-reagieren, d. h. mit beiden α- und β- Untereinheiten des Heterodimers des Integrins immun-reagieren, jedoch nicht mit nur einem oder anderen der Untereinheiten. Beispiele für Zusammensetzungen umfassen einen oder mehrere der monoklonalen Antikörper, die ausgeschieden werden durch die Hybridomas P113-7D6, P112-4C1, P113-12A6, P112-11D2, P112-10D4 oder P113-1F3.
Die Integrin inhibierenden Antikörper können kombiniert werden mit anderen pharmazeutischen Zusammensetzungen und/oder Exzipienzien. Beispielsweise kann ein Medikament hergestellt werden, worin ein αvβ&sub3; Antikörper gemeinsam verabreicht werden kann oder zugesetzt werden kann zu etablierten chemotherapeutischen Mitteln gegen Krebs oder biotherapeutischen Diäten. Normale physiologische Kochsalzlösung ist ein bevorzugtes Exzipient oder Vehikel zur Verabreichung von Antikörper. Dies kann enthalten, ist jedoch nicht darauf beschränkt, die Kombination oder gleichzeitige Verabreichung von αvβ&sub3; Antikörpern mit cytotoxischen Arzneimitteln, Kombinationen von cytotoxischen Arzneimitteln oder mit immun stimulierenden Arzneimitteln wie Interleukinen oder deren Derivate oder mit hämotopoietischen Faktoren und deren Derivate. Beispielsweise kann αvβ&sub3; Antikörper gleichzeitig verabreicht werden oder zugesetzt werden zu therapeutischen Diäten zur Verwendung von IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-15, TNF, α, β, γ Interferonen und M-CSF oder Kombinationen dieser Mittei oder deren Derivate in biologischer Therapie von Krebs. Außerdem kann αvβ&sub3; Antikörper gemeinsam verabreicht werden oder zugesetzt werden zu therapeutischen Diäten zur Verwendung von G-CSF, M-CSF, IL-3 und Erythropoietin oder Kombinationen dieser Mittel oder deren Derivate bei biologischer Therapie von Krebs.
Die anti-αvβ&sub3; monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung oder Fragmente davon, die ein Paratop enthalten (z. B. Fab, Fab', F(ab')2 und F(v) Fragmente) können außerdem kombiniert werden mit cytotoxischen oder cytostatischen Arzneimitteln, Proteintoxinen, Nucleinsäuren oder Radioisotopen durch in der Technik bekannte Methoden. In Abhängigkeit von der Dosis und der Art des Antikörperkonjugats ist es möglich, Tumorzellen zu töten und Tumorgröße zu reduzieren oder Inhibierung von Zellwachstum und somit Inhibierung von Tumorwachstum zu erzielen.
Viele monoklonalen Antikörperkonjugate von Radioisotopen, Proteintoxinen, cytotoxischen und cytostatischen Arzneimitteln sind hergestellt worden und in Modellsystemen getestet worden. Radio markierte monoklonale Antikörperkonjugate erwiesen sich als wirksame bildlich darzustellende Mittel in der Klinik und zeigen versprechende therapeutische Ergebnisse als Medikamente zur Behandlung von Lymphomas und Leukämias in Menschen. Proteintoxin monoklonale Antikörperkonjugate sind außerdem getestet worden in humanen klinischen Versuchen auf Zustände, wie Lymphomas. An Antikörper konjugierte cytotoxische und cytostatische Arzneimittel sind ebenfalls erforscht worden in klinischen Versuchen.
Beispiele für Verfahren zur Bindung von cytotoxischen und cytostatischen Arzneimitteln als auch Proteintoxinen und Peptiden an Antikörper sind im CRC Handbook beschrieben: Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking, Chapter 11, 267 (CRC Press Inc., Boca Raton FL, 1993), als auch beispielsweise U. S. Patent Nr. 5,591,829.
Die Aminoseitenketten von Lysinen, die aminoterminalen Gruppen in Polypeptiden, die Carboxylgruppen von Asparagin- und Glutaminsäuren, die Thiolgruppe von Cysteinen und die Kohlenwasserstoffgruppe von Antikörpern, Toxinen und anderen Arzneimitteln sind verwendet worden, um Arzneimittelkonjugate herzustellen. Das CRC Handbook: Chemistry of Protein Conjugation und Crosslinking beschreibt u. a. verschiedene heterobifunktionelle Reagenzien zum Binden von verschiedenen Substanzen an Antikörper. Solche Reagenzien umfassen m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS) und N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP). Disulfid erzeugende Reagenzien wie 3-(2-Dipyridyldithio)propionat können verwendet werden, um Pyridyldisulfidgruppen zu erzeuelen in Proteinen im Zusammenhang mit wasserlöslichen Carbodiimiden wie Ethyl-3-(3-dimethylaminopropylcarbodiimid. Konjugation durch Thioetherbindungen können erzeugt werden unter Verwendung von Iodacetylverbindungen wie N-Hydroxysuccinimidyliodacetat oder N-Succinimidyl(4-iodacetyl)aminobenzoat, während Konjugation außerdem erfolgen kann unter Verwendung von Säure labilen und photospaltbaren Quervernetzern wie 4-(todacetylamino)-3,4,5,6-tetrahydrophthalsäureanhydrid und 1-[4-Nitro-3-(1-chlorcarbonyloxyethyl)phenyl]methyl-S-acetylthiosäureester. Die Kupplung kann außerdem erfolgen durch Kohlenwasserstoffreste oder Linker wie Dextrane als auch mit Polyaminosäuren wie Poly-L- glutamat.
Verschiedene Proteintoxine, Pflanzentoxine, Peptide und cytotoxische und cytostatische Verbindungen zur Konjugation an Antikörper umfassen: Ricin, Abrin, Modeccin, Gelonin, antivirales Kermesbeerenprotein (PAP), α-Arnanitin, Ribosom inhibierendes Protein (RIP), Gersten RIP, Weizen RIP, Mais RIP, Flachs RIP, bakterielle Toxine einschließlich Diphtherietoxin, Fragmente von Diphtherietoxin, Pseudomonasexotoxin, Shigatoxin und chemische Toxine einschließlich Senfgas, Taxol, Doxurubicin, Daunomycin, Methotrexat, Cisplatin, Bleomycin, Vinblastin, Mitomycin C, Idarubicin, Morpholinodoxorubicin, Melphalan, Cytosinarabinosid, 5-Fluorouracil und Neocarzinostatin.
Beispielsweise könnte SPDP verwendet werden, um freie Aminogruppen von Antikörpern oder Fragmenten davon, enthaltend pin Paratop (wie Fab, Fab', F(ab')2 und F(v) Fragmente) zu binden an eine Vielzahl von Pflanzentoxinen, einschließlich Ricin, Abrin, Modeccin, Gelonin, antivirales Kermesbeerenprotein (PAP), α-Amanitin, Ribosom inhibierendes Protein (RIP), Gersten RIP, Weizen RIP, Mais RIP, Flachs RIP, bakterielle Toxine einschließlich Diphterietoxin, Fragmente von Diphtherietoxin, Pseudomonasexotoxin, Shigatoxin und chemische Toxine einschließlich Methotrexat, Senfgas, Doxorubicin und Daunomycin.
Ein Durchschnittsfachmann kann leicht Antikörperkonjugate der folgenden Verbindungen herstellen unter Verwendung von Antikörper der vorliegenden Erfindung: Mitomycin C, Doxorubicin und Daunomycin (Suzuki et al., Chem. Pharm. Bull., Band 29 (1981) 844; Idarubicin (Pietersz et al., Cancer Res., Band 48 (1988) 926; Doxorubicin (Trail et al., Cancer Res., Band 52 (1992) 5693; Trail et al., Science, Band 261 (1993) 212; Aboud-Pirak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 86 (1989) 3778; Morpholinodoxorubicin (Mueller et al., Bioconjugate Chem., Band 1, (1990) 325; Dillman et al., Cancer Res., Band 48 (1988) 6097; Daunomycin (Hurwitz et al., Cancer Res. Band 35 (1975) 1175; Page et al., Proc. Arn. Assoc. Cancer Res., Band 22 (1981) 211; Page et al., «Drug targeting with monoclonal antibodies, in Protides of the Biolodical Fluids, Peeters, H., Ed., Band 29, Pergammon Press, Oxford, (19814 933; Tsukada et al., J. Natl. Cancer Inst., Band 73 (1984) 721; Suzuki et al., Chem. Pharm. Bull., Band 29 (1981) 844; Hurwitz, et al., Eur. J. Cancer, Band 14 (1978) 1213; Hurwitz et al., J. Appl. Biochem., Band 2, (1980) 25; Lavie et al., Cancer Immunol. Immunother., Band 33 (1991) 223; Dillman et al., Cancer Res., Band 48 (1988) 6097, Vinblastin (Apelegren et al., Cancer Res. Band 50 (1990) 3540; Starling et al., Cancer Res., Band 51 (1991) 2965; Johnson et al., Cancer Immunol. Immunother., Band 27 (1988) 241; Melphalan (Smyth et al., Cancer Res., Band 47 (1987) 62; Cytosinarabinosid and 5-Fluoruracil (Hurwitz et al., J. Med. Chem., Band 28 (1985) 137; Bleomycin (Manabe et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., Band 115 (1983) 1009; Neocarzinostatin (Kimura et al., Cancer Immunol. Immunother., Band 7, (1980) 235; Cisplatin (McIntosh et al., J. Pharm. Sci., Band 86 (12) (1997) 1478; Methotrexat (Kulkarni et al., Cancer Res., Band 41 (1981)2700.
Kürzlich haben verschiedene Typen von Oligodeoxynucleotiden ("ODNs") eine breite Aufstellung von Aktivitäten demonstriert gegen bestimmte intrazelluläre Zielscheiben wie Oncogene, normale Wirtsgene und virale Zielscheiben Uhlmann et al., Chem. Rev., Band 90 (1990) 543; Crooke, Biotechnology, Band 10 (1992) 882.
Chemisch modifizierte Nuclease resistente Analoge von ODNs haben gezeigt, dass sie Aktivität bei relativ hohen Konzentrationen enthalten (größer als 1 uM), während nicht modifiziertes Phosphordiester ODNs Aktivitäten aufweisen bei typischerweise größer als 10 uM. Komplexierung von ODNs zu anti-αvβ&sub3; Integrin Antikörpern bietet einen Weg, um die Abgabe von ODNs an Zielscheibenstellen zu erleichtern wie Säuger (z. B. Human) Zellen exprimierendes αvβ&sub3; Integrin. Solche Zusammensetzungen können hergestellt werden durch Binden von Polyoeotidseouenzen, die ODNs binden wie das Nucleocapsid 7 von HIV-1 oder von Nucleocapsid stammende Peptide, beispielsweise:
oder
an den Antikörper. Geeignete Nucleocapsid 7 Peptide als auch geeignete Oligonucleotide (einschließlich anti-Sinn Oligonucleotide wie 5'-GTGCCGGGGTCTTCGGGC-3' für c-myb spezifische mRNA) wurden identifiziert in Bachmann et al., J. Mol. Med., Band 76 (1998) 126.
Die Nucleocapsid 7 Peptide können hergestellt werden durch in der Technik bekannte Methoden und gebunden werden an erfindungsgemäße Antikörper wie beschrieben in CRC Handbook: Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking, Kapitel 11 (CRC Press Inc., Boca Raton FL) für Binden von Proteinen und Peptiden an Antikörper.
Anstelle von Oligonucleotiden kann es wünschenswert sein, einsträngige anti-Sinn DNA eines Gens zu verwenden wie das HIV- oder Herpes Symplex Virus Thymidinkinase (TK) Gen, was beschrieben wird in Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 78 (1981) 1441 und in U. S. Patent Nr. 5,631,236.
Die Abgabe von anti-Sinn DNA in einem solchen Fall kann günstig sein bei der Behandlung von viraler Infektion, insbesondere gegen HfV. Wahlweise kann es vorteilhaft sein, vollständige doppelsträngige DNA zu liefern, die für ein Gen codiert anstelle des Oligonucleotids. Beispielsweise kann das TK Gen an Zellen geliefert werden als Teil einer Gentherapie zur Behandlung von festen Tumoren, die αvβ&sub3; Integrin tragen. In einem solchen Falle ist es angezeigt, dass anschließend ein Vorarzneimittel hergestellt wird, das durch TK aktiviert wurde, wie Ganciclovir zur Behandlung des Individuums, um das Vorarzneimittel zu aktivieren.
Kürzlich erwiesen sich Antikörper-Radionuclid-Zusammensetzungen erfolgreich in diagnostischen und therapeutischen Anwendungen bei Säugern und insbesondere bei Menschen. Im allgemeinen umfassen konjugierte Antikörper-Radionuclidzusammensetzungen die chemische Umsetzung eines Chelatbildnes, der das Radionuclid an den Antikörper binden kann. Zahlreiche Chelatbildner sind für diesen Zweck in der Technik bekannt und weisen im allgemeinen Stickstoff- und Schwefeldonoratome auf, wie Dithiodiaminocarbonsäuren und Dithioamidocarbonsäuren (bekannt als N&sub2;S&sub2; Chelatbildner) und Thiotriaza Chelat bildende Verbindungen (bekannt als N&sub3;S Chelatbildner). Geeignete Radioisotopen und Chelatbildner zusammen mit Methoden zum Binden derselben an Antikörper werden offenbart in U. S. Patent Nr. 5,130,118.
Wahlweise können Radiohalogen markierte Verbindungen hergestellt werden und mit Antikörper umgesetzt werden wie beschrieben in U. S. Patenten Nr. 5,679,318 und 5,252,748.
Beispiele für Verfahren und Verbindungen zur Herstellung von radiomarkierten monoklonalen Antikörperkonjugaten für Radionuclide wie ¹&sup8;&sup6;Re, ¹&sup8;&sup8;Re, ¹&sup5;³Sm, &sup9;&sup0;Y, ¹&sup0;&sup5;Rh, ¹³¹I werden offenbart in U. S. Patent Nr. 5,679,318. Auf ähnliche Weise werden Beispiele für Verfahren und Chelatbildner zur Herstellung von radiomarkierten monoklonalen Antikörperkonjugaten für Radionuclide von Kupfer, wie beispielsweise &sup6;&sup4;Cu, &sup6;&sup7;Cu; Technetium, z. B. 99mTc; Rhenium, z. B. ¹&sup8;&sup6;Re und ¹&sup8;&sup8;Re; Blei, beispielsweise ²&sup0;³Pb und ²¹²Pb; Palladium, beispielsweise ¹&sup0;³Pd, ¹&sup0;&sup9;Pd; Wismut, beispielsweise ²¹²Bi und Gold beispielsweise ¹&sup9;&sup8;Au beschrieben in U. S. Patent Nr. 5,681,927.
Ein Durchschnittsfachmann wird erkennen, dass andere Isotopen von Iod ebenfalls verwendet werden können, beispielsweise ¹²&sup5;I und andere Isotopen, z. B. ²&sup4;¹Am, ¹&sup9;²Ir und ¹¹¹In, siehe beispielsweise U. S. 5,130,118.
Verfahren zur Erzeugung von freien Sulfhydrylgruppen auf Antikörpern oder Antikörperfragmenten sind ebenfalls bekannt, siehe z. B. U. S. Patent Nr. 4,659,839.
Da einige Radionuclide eine relativ kurze Halbwertszeit besitzen, kann es wünschenswert sein, mit Chelatbildnern konjugierte Antikörper herzustellen und dann kurz vor der Verwendung den mit Chelatbildner konjugierten Antikörper mit dem in Frage kommenden Radionuclid umzusetzen.
Folgende Beispiele sollen als Erläuterung gewisser bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung dienen.

BEISPIELE

Erzeugung von Monoklonalem Antikörper

Beispiel 1: Produktion von P112-4C1-A2-C7-A3.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Hybridomazelllinie offenbart, P112-4C1-A2-C7-A3, hergestellt durch Hybridzelllinie P112-4C1-A2-C7-A3 erzeugt von einer Maus, die mit Human-αvβ&sub3; immunisiert wurde. Eine Probe dieser Zelllinie ist hinterlegt bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA mit der Hinterlegungsnummer HB- 12225. Dieser Antikörper wurde wie folgt produziert.
Sechs Wochen alte weibliche Balb/c Mäuse wurden intraperitoneal immunisiert (i. p.) mit 1 · 10&sup6; BHK Zellen, transfiziert mit αvβ&sub3; (BHK/αvβ&sub3;) in Freund's Complete Adjuvant (FCA). Drei Wochen später wurde den Mäusen eine Zusatz i. p. Immunisierung verabreicht unter Verwendung von 1 · 10&sup6; BHK/αvβ&sub3; Zellen in Freunds Incomplete Adjuvant (FIA). Zwei Wochen später wurde den Mäusen ein zweiter i. p. Zusatz von 1 · 10&sup6; BHK/αvβ&sub3; Zellen in FIA verabreicht. Nach weiteren 3 Wochen wurden 5 ug gereinigtes αvβ&sub3; in Kochsalzlösung intravenös verabreicht und i. p. Fusionen erfolgten 3 Tage später.
Die immunisierten Mäuse wurden durch CO&sub2; Überdosierung getötet und eine Splenektomie erfolgte sofort. Die Milzzellen der Mäuse wurden fusioniert mit Myeloma P3X63 Ag8.653 (ATCC) unter Verwendung von Polyethylenglycol, MG 1300-1600 (ATCC). Die Zellen wurden verdünnt auf 1 · 10&sup6; Zellen/ml in HAT Selektionsmedium, platiert in 48 Näpfchen Kulturgefäßen bei 0,5 ml/Näpfchen und gezüchtet unter selektiven Bedingungen (HAT Medium), die es nur den Zellen erlaubten zu proliferieren, die aus der Fusion eines Splenocyten mit einer Myelomazelle stammten. Fünfhundertundsiebzig Näpfchen wurden mit Zellen platiert und 225 zeigten Hybridomawachstum. Konditionierte Medien von Näpfchen mit Hybridomawachstum wurden gescreent auf ihre Gegenwart von Antikörpern die ¹²&sup5;I-markiertes αvβ&sub3; oder ¹²&sup5;I-markiertes αIIbβIIIa binden unter Anwendung des nachstehend beschriebenen Einfangversuchs. Zehn Näpfchen, eines davon war Näpfchen C1 in Platte 4 und hatte somit die Bezeichnung P112-4C1, enthielt Zellen, die einen Antikörper produzierten, der an αvβ&sub3; gebunden war, jedoch nicht an αIIbβIIIa. Zellen in Näpfchen 4C1 wurden geklont in Weichagar, um Kolonien von Zellen zu erhalten, die von einer einzigen Zelle stammten, die einen Antikörper produzierte, welche ¹²&sup5;I-markiertes αvβ&sub3; von der Lösung absorbiert. Kolonien wurden aus dem Weichagar herausgepickt, in geeignetem Zellkulturmedium gezüchtet und dann nochmals in dem alt Einfachversuch gescreent. Eine von Näpfchen A2 stammende αvβ&sub3; Bindungskolonie wurde identifiziert und bezeichnet als P112-4C1-A2. Dieses Verfahren wurde zwei weitere Male wiederholt, um zu der vom Endklonen stammenden Zelllinie zu kommen, bezeichnet als P112-4C1-A2-C7-A3. Der von dieser Zelllinie produzierte monoklonale Antikörper ist ein IgG1, K.
IgG wurde gereinigt aus Mausaszites, erzeugt mit der P112-4C1-A2-C7-A3 Zelllinie durch Protein G oder Protein A Chromatographie, wie nachstehend beschrieben und der gereinigte P112-4C1-A2- C7-A3 monoklonale Antikörper (mAb) getested in verschiedenen Versuchen, um die Eigenschaften des P112-4C1-A2-C7-A3 als ein Inhibitor von αvβ&sub3; weiter zu charakterisieren. Repräsentative Beispiele der Ergebnisse dieser Art von Tests werden in den Fig. 1-7 gezeigt.

Reinigung des monoklonalen Antikörpers

Aszitesflüssigkeit wurde getrennt produziert von jeweils einem der sechs Hybridomas, die αvβ&sub3; komplex-spezifische Antikörper ausscheiden und dem Kontroll M399 Hybridoma. Die Aszitesflüssigkeit wurde geklärt, um das Lipid zu entfernen und gereinigt an einer HiTrap® Protein G Säule gemäß den Empfehlungen des Herstellers (Pharmacia Biotech) oder einer Protein A Säule (Pharmacia) unter Verwendung des BioRad® Protein A MAPS 11 Puffersystems. Die eluierten Fraktionen wurden extensiv dialysiert gegen PBS und geprüft auf Reinheit durch SDS-PAGE. Die gereinigten Antikörper waren mehr als 90% rein, wie bestimmt durch Coomassie blue® Färbung und comigratiert mit einem IgG1 K, MOPC-21 (Sigma). Die gereinigten Antikörper wurden dann untersucht in dem αvβ&sub3; Einfangversuch, um zu bestimmen, ob sie die Fähigkeit αvβ&sub3; zu binden beibehalten haben. Alle sechs Antikörper von Fusionen P112 und P113 banden sich an ¹²&sup5;I- markiertes αvβ&sub3; in einer Dosis abhängigen Weise, während der Kontroll IgG1 K Antikörper M399 dies nicht hat. Siehe Fig. 1.

Immunolokalisierung von αvβ&sub3; in Humanplazentagewebe und Humancoloncarcinomgewebe

Abschnitte von gefrorener Humanplazenta wurden behandelt mit 3% H&sub2;O&sub2; fünf Minuten lang, um die endogene Peroxidaseaktivität zu blockieren, gewaschen mit PBS un dann inkubiert mit 5% BSA in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS) und behandelt für immunhistochemische Entdeckung von αvβ&sub3;.
Formalin fixiertes Humancoloncarcinomgewebe wurde erhalten von der Northwestern School of Medicin, Department of Pathology und behandelt unter Verwendung eines automatischen Gewebeprozessors. Proben wurden eingebettet in Tissueprep® Paraffin und zu 4 Micron dicke Gewebeabschnitte zerschnitten unter Verwendung eines Reichert-Jung Microtoms und getrocknet auf üblichen Glasscheiben bei 59ºC 30 Minuten lang. Danach wurden die Abschnitte vom Paraffin befreit mit Xylol und rehydratisiert durch reinen Alkohol bis destilliertem Wasser. Die rehydratisierten Abschnitte wurden behandelt mit 3% H&sub2;O&sub2; 20 Minuten lang, gewaschen mit PBS, inkubiert in PBS, enthaltend 2% Trockenmagermilch (Lösung A) 20 Minuten lang und behandelt für immunhistochemische Entdeckung von αvβ&sub3;.
Abschnitte von Humanplazenta und Humancoloncarcinoma wurden inkubiert mit anti-αvβ&sub3; monoklonalen Antikörper (P112-4C1), verdünnt in Lösung A zu einer Konzentration von 18 ug/ml oder mit einem handelsüblichen Isotopen-gepaarten irrelevanten oder Kontrollimmunglobulin (Zymed) verdünnt auf 18 ug/ml in Lösung A. Nach einer einstündigen Inkubation wurden die Abschnitte gewaschen mit PBS und dann 40 Minuten lang inkubiert mit biotinyliertem Pferde anti- Maus IgG (Vector Laboratories), verdünnt 1 : 100 in PBS, enthaltend normales Pferdeserum und dann gewaschen mit PBS. Gebundener Antikörper wurde entdeckt unter Verwendung einer chromogenen Avidin-Biotin Konjugatmethode (Elite ABC und Vector DAB Kit; Vector Laboratories) gemäß den empfohlenen Verfahren des Herstellers. Die Abschnitte wurden gespült in Leitungswasser und gegengefärbt in Lerners #3 Hämatoxylin 20 Sekunden lang, gespült in Leitungswasser, in 0,05% sauren Alkohol 3 Sekunden lang getan, gespült in Leitungswasser 1 Minute lang, inkubiert in blau färbendem Hämatoxylinreagenz 30 Sekunden lang und dann in Leitungswasser 1 Minute lang. Schließlich wurden die Abschnitte dehydratisiert in Ethanol, gereinigt mit Xylol und mit einem Deckglas versehen.
Bilder der Abschnitte von Humanplazenta und Humancoloncarcinoma wurden eingefangen unter Verwendung eines Nikon Microphot-FXA Mikroskops und einer Sony DKC-5000 Digitalkamera. Abschnitte wurden gescannt, um die ausgewählten Interessensgebiete zu lokalisieren, wonach die Bilder eingefangen wurden durch Digitalkamera und heruntergeladen wurden in ein Photo Design Programm (Adobe Photoshop 4,0, Adobe Image Systems Inc.). Maßstabsstriche wurden zugefügt, um die Vergrößerung anzuzeigen und die Bilder wurden kombiniert und kommentiert.
αvβ&sub3; und αIIbβIIIa Einfangversuch
96 Näpfchenplatten (Dynatech, Chantilly, VA) wurden beschichtet mit 0,5 ug/Näpfchen Ziegen anti- Maus IgG Fc-spezifischem monoklonalen Antikörper (Sigma, St. Louis, MO) in Borat gepufferter Kochsalzlösung, pH 8,2 über Nacht bei 4ºC. Versuchsplatten wurden geleert und 200 ul/Näpfchen 1% BSA in PBS und 0,05% Tween®-20 wurde zugesetzt, um nicht umgesetzte Stellen in den Näpfchen zu blockieren. Nach zweistündiger Inkubation bei 37ºC wurden die Platten dreimal gewaschen mit Kochsalzlösung und 0,05% Tween®-20 (15). Proben (Mausseren, Hybridomaüberstand oder gereinigter monoklonaler Antikörper) wurde zugesetzt (50 ul/Näpfchen) und 90 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Die Platten wurden dreimal gewaschen in TS und etwa 100.000 cpm/Näpfchen ¹²&sup5;I-markiertes αvβ&sub3; oder ¹²&sup5;I-markiertes αIIbβIIIa in Tris gepufferter Kochsalzlösung, enthaltend 1 mM Ca&spplus;&spplus;, Mg&spplus;&spplus; und Mn&spplus;&spplus;, pH 7,4 und 1% BSA & 50 mM Octylglucoside wurden zugesetzt und 2 Stunden lang bei 37ºC inkubiert. Die Platten wurden dann dreimal gewaschen mit TS und die Näpfchen wurden gezählt in einem Gammazähler.

Osteopontin Reinigung

Humanosteopontin cDNA in voller Länge wurde exprimiert in E. coli als ein 6xHis-Fusionsprotein unter Verwendung des QIAexpress® pQE Expressionssystems wie vom Hersteller beschrieben (Qiagen®, Chatsworth CA). Osteopontin wurde gereinigt durch Ni-NTA Affinitätschromatographie gemäß den Empfehlungen des Herstellers (Qiagen) und dann weiter gereinigt durch MonoQ® (Pharmacia, Piscataway, NJ) Chromatographie. Osteopontin wurde als über 95% rein bewertet durch SDS Gelelektrophorese.

Reinigung des Vitronectin Rezeptors (αvβ&sub3;)

Humanvitronectinrezeptor (αvβ&sub3;) und der Humanblutplättchenrezeptor (αIIbβIIIa) wurde gereinigt von Humanplazenta wie vorstehend beschrieben (Pytela, R., Pierschbacher, M. D., Argraves, S., Suzuki, S., und Rouslahti, E., Methods in Enzymology, Band 144 (1987) 475; Yatohgo, T., Izumi, M., Kashiwagi, H., und Hayashi, M., Cell structure and Function, Band 13 (1988) 281). ¹²&sup5;I-markiertes αvβ&sub3; und ¹²&sup5;I-markies αIIbβIIIa wurden erzeugt durch Iodierung der unmarkierten Vorläufer unter Verwendung von Iodogen® gemäß den Empfehlungen des Herstellers.

M21 Migrationsversuch

M21 Melanomazelllinien wurden erhalten von J. W. Smith (Burnham Institute, La Jolla) und in RPMI 1640 gehalten, ergänzt durch 10% FBS, pen-strep (200 U/ml) und L-glut (2 mM). Fibrinogen und Vitronectin wurden gereinigt von Humanplasma wie vorstehend beschrieben (Yatohgo et al., Cell Struct. Fung., Band 13 (1988) 281; Fuller et al., Methods in Enzymology Band 163 (1988) 44474.
Extrazelluläre Matrixproteine (z. B. Fibrinogen) wurden auf den Boden von Costar Transwellmembran geschichtet bei einer Konzentration von 5 ug/ml. Nach zweistündiger Beschichtungszeit bei 37ºC wurde der Migrationsversuch eingeleitet durch Zugabe von 2 · 10&sup5; Zellen zur oberen Kammer des Reservoirs. Migrationsversuche erfolgten in HBSS, 50 mM HEPES, 1 mg/ml BSA, 0,5 mM Ca²&spplus;, 0,5 mM Mg²&spplus; und 0,2 mM Mn²&spplus;. Die Zellen durften 18 Stunden lang oder 20 Stunden lang bei 37ºC migrieren. Das obere Reservoir wurde vorsichtig abgetupft mit einem Applikator, der eine Wattespitze aufwies, um Zellen von der oberen Filteroberfläche zu entfernen. Der Filter wurde entfernt und Zellen auf der unteren Oberfläche wurden mit Diff-Quik® (Baxter) gefärbt. Zellen, die drei bis fünf zufällige mikroskopische Hochleistungsfelder in Anspruch nahmen, wurden gezählt und bewertet. Für Inhibierungsstudien wurden die Inhibitoren inkubiert mit den Zellen 30 Minuten lang bei 37ºC vor der Zugabe zu dem Transwell.

M21 Zelladhesionsversuch

Fibrinogen wurde auf 10 ug/ml verdünnt in Beschichtungspuffer (20 mM Tns HCl, 150 mM NaCl, pH 7,4) und je Näpfchen (100 ul) von Immulon®2 96 Näpfchenplatten (Dynatech) zugesetzt und über Nacht bei 4ºC inkubiert. Die Platten wurden gewaschen (50 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, pH 7,4) und dann verfügbare Proteinbindungsstellen blockiert durch Zugabe von Adhesionspuffer (1 X Hanks Balanced Salzlösung ohne Ca²&spplus; und Mg²&spplus; (Sigma), plus 50 mM Hepes, pH 7,4), enthaltend 1% BSA.
M21 Zellen wurden gewaschen mit HBSS (Ca²&spplus; und Mg²&spplus; frei), inkubiert in Zelldissoziationslösung (Sigma) 5 Minuten lang bei 37ºC und dann gewaschen durch Zentrifugierung/Resuspension in Adhesionspuffer, enthaltend 200 uM Mn²&spplus;.
Zellen und verschiedene Konzentrationen von mAb wurden kombiniert und Adhesionspuffer, enthaltend 200 uM Mn²&spplus; den Platten zugesetzt und 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Die Platten wurden vorsichtig gewaschen mit 50 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, pH 7,4 und 100 ul Zelllysis/Subtratpuffer (50 mM Na Acetat pH 5,0, enthaltend 0,5% TritonX-100® und 0,3 mg/ml p- Nitrophenylphosphat (Sigma)) wurde jedem Näpfchen zugesetzt und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert; 50 ul 1 N NaOH wurde zugesetzt, um Farbe zu entwickeln und die Plattenabsorbanz wurde bei 412 nm gemessen. Die Anzahl an Zellen, die pro Näpfchen gebunden waren, wurde bestimmt durch Bezugnahme auf eine Standardkurve, die mit bekannten Anzahlen an Zellen entwickelt worden war.

293 Zellbindungsversuch

Humanvitronectin wurde gereinigt von frisch gefrorenem Plasma wie früher beschrieben (Yatohgo, T, Izumi, M., Kashiwagi, H., und Hayashi, M., Cell structure and Function, Band 13 (1988) 281). 293 Zellen wurden transfiziert mit β3 und β5 Integrin Subeinheiten wie nachstehend beschrieben.
96 Näpfchenplatten (Immunlon®2, Dynatech, Chantilly, VA) wurden beschichtet mit Vitronectin, 50 ul/Näpfchen in TS (0 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,4 (TS), über Nacht bei 4ºC. Nicht umgesetzte Stellen wurden blockiert mit 1% BSA in TS, 200 ul/Näpfchen 2 Stunden lang bei 37ºC. Antikörper wurden verdünnt in Hanks gepufferter Salzlösung (Ca&spplus;Mg&spplus; frei) (HBSS) & 20 mM Hepes & 0,1% BSA & 200 uM MnCl. 293 Zellen, die transfiziert worden waren mit β&sub3; (293/β&sub3;), 293 Zellen, die transfiziert worden waren mit β&sub5; (293/β&sub5;) und nicht transfizierte 293 Zellen (293/β&sub1;) wurden von den Kolben entfernt mit Zelldissoziationspuffer (Sigma, St. Louis, MO) und dreimal gewaschen mit HBSS. Die Zellen wurden gezählt und verdünnt auf 2 · 10&sup6; Zellen/ml in HBSS & 20 mM Hepes & 0,1% BSA & 200 uM MnCl. Gleiche Volumen an Zellen wurden vermischt mit verdünnten Antikörpern und 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. 100 ul/Näpfchen des Zell/Antikörpergemischs wurde dann den Vitronectin beschichteten Platten zugesetzt und die Platten wurden 30-Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Die Platten wurden gewaschen dreimal mit HBSS, um nicht gebundene Zellen zu entfernen und 100 ul HBSS & 200 uM MnCl wurden je Näpfchen zugesetzt. Das MTT Kit (Promega) wurde verwendet, um die Anzahl an lebensfähigen gebundenen Zellen zu ermitteln.

Fließcytometriemethoden

2 · 10&sup5; bis 5 · 10&sup5; Zellen wurden inkubiert mit 1 ug primären Antikörper in FACS Puffer (1% BSA/PBS + 0,1% NaN&sub3;) bei 4ºC 30-60 Minuten lang, gewaschen, dann 30-45 Minuten bei 4ºC inkubiert mit einem FITC-konjugiertem Ziegen anti-Maus F(ab')² sekundären Antikörper (Zymed Laboratories, Inc., San Francisco, CA). Zellen wurden gewaschen und nochmals suspendiert in Puffer mit Propidiumiodid (PI), dann analysiert durch Fließcytometrie (FACScan®; Becton Dickinson Immunocytometry Systems; San Jose, CA). Lebensfähige Zellen wurden ausgeschieden auf der Basis von PI Exklusion.
Tabelle 1 zeigt die Bindung von αnti-Integrin monoklonalen Antikörpern an 293/Wildtyp (wt), 293/β&sub3; und 293/β&sub5; Zellen unter Anwendung von Immunfluoreszenz- und Fließcytometrie. Die anti-αvβ&sub3; Antikörper P113-7D6, P112-4C1, P113-12A6, P112-11D2, P112-10D4, P113-1F3 und LM609 binden sich an 293 Zellen, die transfiziert worden waren mit der Human-β&sub3; cDNA (293/β&sub3; Zellen), jedoch nicht an die Wildtyp 293 Zellen (293/wt) oder 293 Zellen, die transfiziert worden waren mit Human-β&sub5; cDNA (293/β&sub5;). Der komplex-spezifische Antikörper P1F6 (αvβ&sub5;; Chemicon) bindet sich nur an 293/β&sub5; Zellen und P4C10 (β&sub1;; GIBCO) bindet sich an alle drei Zelllinien, was übereinstimmt mit den früheren Berichten, die zeigten, dass Wildtyp 293 Zellen αvβ&sub1; exprimieren, jedoch nicht αvβ&sub3; (Bodary und McLean, J. Biol. Chem. Band 264 (1990) 5938). Tabelle 1
Tabelle 1 zeigt αvβ&sub3; Antikörperbindung an 293/wt, 293/β&sub3; und 293/β&sub5; Zellen durch Immunfluoreszenz und Fließcytometrie. Die Zellfärbungsfluoreszenz-Intensität von spezifischen Antikörpern wird angegeben relativ zum Kontrollantikörper M399: (-) < 2-fach; (+/-) 2 bis 5-fach; (+) 5 bis 10-fach; (++) 10 bis 50-fach. Die Zelllinien werden bezeichnet als Wildtyp 293 (293/wt), 293 Zellen transfiziert mit Human-β3 (293/β&sub3;) und 293 Zellen transfiziert mit human β5 (293/β&sub5;).

Gentechnische Veränderung von 293 Zellen

293 Zellen exprimieren natürlicherweise αvβ&sub1;, α&sub2;β&sub1; und α&sub5;β&sub1; und α&sub6;β&sub1; mit geringem oder nicht feststellbarem αvβ&sub3; (Bodary & McLean, J. Biol. Chem., Band 265 (1990) 5938). Die Zellen wurden transfiziert unter Verwendung von LipofectAMINE® gemäß den Empfehlungen des Herstellers (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) mit β&sub3; oder β&sub5; cDNA in den Säuger Expressionsvektor pcDNA3 (Invitrogen Corporation), der Neomycinresistenz aufweist (Southern, P. J. und Berg, P., J. Mol. Appl. Gen. Band 1 (1982) 327).
Individuelle Klone wurden erzeugt durch begrenzte Verdünnung und expandiert in Gegenwart eines Antibiotikums. Hochexpressionsspiegel von αvβ&sub3; oder αvβ&sub5; wurden bestätigt durch Fließcytometrie unter Verwendung des αvβ&sub3; komplex-spezifischen mAb LM609 (Chemicon, Temecula, CA; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 84 (1987) 6471 und dem αvβ&sub5; komplex-spezifischen Antikörper P1F6 (GIBCO).

Osteoclast Adhesionsversuch

Kaninchen Osteoclasten wurden erhalten von den Knochen der Vorder- und Hinterläufe von 5 Tage alten Kaninchen. Haut und Muskeln wurden von den Knochen entfernt und die Knochen wurden pulverisiert in α MEM enthaltend 20 mM Hepes pH 7,0 und 1% BSA. Gewebeklumpen und freigesetzte Zellen wurden nochmal suspendiert in α MEM, enthaltend 20 mM Hepes pH 7,0 und 1 % BSA, Zellklumpen durften sich absetzen bei Schwerkrafteinheit und der Osteoclast enthaltende Überstand wurde entfernt und verdünnt in α MEM & 20 mM Hepes & 1% BSA.
Humanosteopontin (PN) wurde auf rekombinante Weise hergestellt wie früher beschrieben. 96 Näpfchenplatten (Immulon®-2, Dynatech, Chantilly, VA) wurden beschichtet mit 5 ug/ml OPN in 20 mM Tris, 150 mM NaCl&sub2;, pH 7,4 (TS) über Nacht bei 4ºC. Nicht umgesetzte Stellen wurden blockiert mit 1% BSA in TS, 200 ul/Näpfchen) 2 Stunden lang bei 37ºC. Die Platten wurden dreimal gewaschen mit TS Puffer und 100 ul/Näpfchen Antikörpern, verdünnt in α MEM & 20 mM Hepes & 1% BSA wurden zugesetzt. Verdünnte Osteoclasten, 100 ul/Näpfchen wurden den Platten zugesetzt und die Platten wurden 60 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Platten wurden dreimal gewaschen mit α MEM & 1% BSA und 100 ul/Näpfchen NPP/Tartrat Lysispuffer (50 mM Natriumacetat, 0,5% Triton X-10®, 0,25 mg/ml p-Nitrophenylphosphat und 6,7 mM Tartrat) wurden zugesetzt und 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert. Schließlich wurde 0,1 N NaOH (50 ul/Näpfchen) zugesetzt und die Absorbanz bei 405 nM wurde bestimmt. Die Anzahl an je Näpfchen gebundene Zellen wurden bestimmt durch Bezugnahme auf eine Standardkurve, die mit bekannten Anzahlen an Zellen entwickelt worden war.

Endothelialer Zellproliferationsversuch

Humane dermale mikrovasculäre Endothelialzellen wurden geliefert von Clonetics (San Diego, CA) und für die Versuche der Passagen 3-10 verwendet. Die Zellen wurden gezüchtet in Gelatine beschichteten (1 mg/ml) Kolben und gehalten in MCDB 131 (Gibco), 5% FBS (Hyclon) 100 ul/ml Mitogen (Biomedical Technologies), 100 ul/ml Schweininnereienheparin (Sigma), 2 mM L-Glutamin und 100 U/ml Penicillin/100 ug/ml Streptomycin (Gibco) bei 37ºC, 5% Co&sub2;.
Für die Proliferationsversuche wurden 10 ng/ml Human-bFGF (R&D Systems) verwendet anstelle von Mitogen und die Endkonzetration des Heparins wurde reduziert auf 80 ug/ml. Die Zellen wurden von den Kolben geerntet durch Trypsinisierung und platiert bei 4-6 · 10³ Zellen/Näpfchen (100 ul/Näpfchen) auf 96 Näpfchen Mikrotiterplatten, die zuvor beschichtet worden waren mit Osteopontin (10 ug/ml in Hanks Balanced Salzlösung; 100 ul/Näpfchen). Die Zellen wurden 2 Stunden lang bei 37ºC inkubiert, um die Zellanlagerung zu gestatten und dann wurden monoklonale Antikörper (in verschiedenen Konzentrationen) direkt den Näpfchen zugesetzt. Die Platten wurden in den Inkubator zurückgetan und etwa 4 Tage gezüchtet (etwa 80% Konfluenz), wobei sie jeden zweiten Tag gefüttert wurden. Am letzten Tag wurde den Zellen frisches Medium zugeführt (das keine Antikörper enthielt) und die Proliferation wurde überwacht durch Zugabe des REDOX Indikators Alamar Blue® (Biosource International) in einer Menge gleich 10% des Kulturvolumens. Die Platten wurden weitere 4-5 Stunden inkubiert und die Fluoreszenz bei 545/575 nm (Exzitation/Emission) wurde gemessen unter Verwendung eines PANDEX Fluoreszenz Konzentrations Analysators. Die Enddaten wurden ausgedrückt als Prozent der Inhibierung (wobei mit Antikörper behandelte Zellen mit unbehandelten Zellen verglichen wurden).

Claims

1. Ein komplex spezifischer anti-αvβ&sub3;-Integrin monoklonaler Antikörper, enthaltend einen monoklonalen Antikörper ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus P113-7D6, P112-4C1, P113- 12A6, P112-11D2, P112-10D4 oder P113-1F3, erhältlich vom Hybridoma hinterlegt unter der Hinterlegungsnummer ATCC HB 12224, HB 12225, HB 12226, HB 12227, HB 12228 bzw. 12 229.

2. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, geeignet zur Verwendung in Menschen, enthaltend den monoklonalen Antikörper des Anspruchs 1.

3. Ein monoklonaler Antikörper, der monoklonaler Antikörper P113-7D6 ist, erhältlich vom Hybrodoma hinterlegt unter der Hinterlegungsnummer ATCC HB 12 224.

4. Ein monoklonaler Antikörper, der monoklonaler Antikörper P112-4C1 ist, erhältlich vom Hybrodoma hinterlegt unter der Hinterlegungsnummer ATCC HB 12 225.

5. Ein monoklonaler Antikörper, der monoklonaler Antikörper P113-12A6 ist, erhältlich vom Hybrodoma hinterlegt unter der Hinterlegungsnummer ATCC HB 12 226.

6. Ein monoklonaler Antikörper, der monoklonaler Antikörper P112-11D2 ist, erhältlich vom Hybrodoma hinterlegt unter der Hinterlegungsnummer ATCC HB 12 227.

7. Ein monoklonaler Antikörper, der monoklonaler Antikörper P112-10D4 ist, erhältlich vom Hybrodoma hinterlegt unter der Hinterlegungsnummer ATCC HB 12 228.

8. Ein monoklonaler Antikörper, der monoklonaler Antikörper P113-1F3 ist, erhältlich vom Hybrodoma hinterlegt unter der Hinterlegungsnummer ATCC HB 12 229.

9. Eine Verwendung eines Antikörpers des Anspruchs 1 zur Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von Zuständen, die durch αvβ&sub3;-Integrin vermittelt werden in einem Säuger, der eine solche Behandlung benötigt, umfassend die Verabreichung einer wirksamen αvβ&sub3;-Integrin inhibierende Menge des Antikörpers.

10. Die Verwendung gemäß Anspruch 9, worin der Zustand Osteoporose ist.

11. Die Verwendung gemäß Anspruch 9, worin der Zustand bösartige humorale Hypercalcemie ist.

12. Die Verwendung gemäß Anspruch 9, worin der Zustand durch Zellmigration der glatten Muskulatur vermittelt wird.

13. Die Verwendung des Anspruchs 12, worin der Zustand Atherosclerose ist.

14. Die Verwendung gemäß Anspruch 9, worin der Zustand Restenose ist.

15. Die Verwendung gemäß Anspruch 9, worin der Zustand ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus ocularer Neovascularisierung, macularer Degeneration und diabetischer Retinopathie.

16. Die Verwendung gemäß Anspruch 9, worin der Zustand Psoriasis ist.

17. Die Verwendung gemäß Anspruch 9, worin der Zustand rheumatoide Arthritis ist.

18. Ein immundiagnostisches diagnostisches Kit, enthaltend einen monoklonalen Antikörper ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus P113-7D6, P112-4C1, P113-12A6, P112-11D2, P112- 10D4 und P113-1F3, erhältlich von den Hybridomas hinterlegt unter der Hinterlegungsnummer ATTC HB 12 224, HB 12 226, HB 12 225, HB 12 227, HB 12 228 bzw. HB 12 229.

19. Eine Methode zur Bestimmung der Gegenwart eines Zustandes, der vermittelt wird durch αvβ&sub3;-Integrin in einem Säuger, umfassend die Stufen von Umsetzung eines αvβ&sub3; komplex spezifischen Antikörpers des Anspruchs 1 mit einer Gewebeprobe vom Säuger, Auswaschen des komplex spezifischen Antikörpers, der nicht an die Gewebeprobe gebunden ist, Umsetzung eines zweiten Antikörpers, der irgendeinen der in Anspruch 18 aufgelisteten monoklonalen Antikörper erkennt mit der Gewebeprobe, wobei der zweite Antikörper ein Reporter-Molekül aufweist, das daran gebunden ist; Auswaschen des zweiten Antikörpers, der nicht an die Gewebeprobe gebunden ist und Entdecken der Gegenwart von Reporter-Molekülen in der Probe.

20. Die Methode des Anspruchs 19, worin die Gegenwart von αvβ&sub3; tragenden Neoplasmen oder Tumor bedingtem vasculären Bett durch NMR oder Immunscintigraphie entdeckt wird.

21. Eine Methode gemäß Anspruch 9, worin der Zustand Osteoarthritis ist.

22. Eine Verwendung eines monoklonalen Antikörpers des Anspruchs 1 zur Lieferung "in vitro" einer cytotoxischen oder cytostatischen Verbindung an Zellen, die ein αvβ&sub3;-Integrin aufweisen oder zur Herstellung eines Medikamentes zur Lieferung einer cytotoxischen oder cytostatischen Verbindung an Zellen, die ein αvβ&sub3;-Integrin aufweisen, worin die Lieferung das Kontaktieren der Zellen umfasst mit dem monoklonalen Antikörper oder Fragment davon, enthaltend das Paratop, worin der Antikörper oder Fragment davon konjugiert ist mit der cytotoxischen oder cytostatischen Verbindung.

23. Die Verwendung des Anspruchs 22, worin αvβ&sub3;-Integrin tragende Zellen getötet werden.

24. Die Verwendung des Anspruchs 22, worin das Wachstum von αvβ&sub3;-Integrin tragenden Zellen inhibiert wird.

25. Die Verwendung des Anspruchs 22, worin der monoklonale Antikörper oder Fragment davon konjugiert ist an ein cytotoxisches oder cytostatisches Mittel, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Doxorubicin, Daunomycin, Methotrexat, Cisplatin, Bleomycin, Vinblastin, Mitomycin C, Idarubicin, Morpholinodoxorubicin, Melphalan, Cytosin Arabisnosid, 5-Fluorouracil und Neocarzinostatin.

26. Eine Verwendung eines monoklonalen Antikörpers des Anspruchs 1 zur Lieferung "in vitro" von Nucleinsäure an Zellen, die ein αvβ&sub3;-Integrin aufweisen oder zur Herstellung eines Medikamentes zur Lieferung von Nucleinsäure an Zellen, die ein αvβ&sub3;-Integrin aufweisen, worin die Lieferung das Kontaktieren der Zellen mit dem monoklonalen Antikörper oder Fragment davon umfasst, enthaltend das Paratop, worin der Antikörper oder Fragment davon konjugiert ist mit einer Nukleinsäure.

27. Die Verwendung des Anspruchs 26, worin die Nucleinsäure ein Antisinn Oligonucleotid ist, wobei das Oligonucleotid gegebenenfalls modifiziert ist Nuclease restistent zu sein.

28. Die Verwendung des Anspruchs 26, worin das Oligonucleotid 5'- GTGCCGGGGTCTTCGGGC-3' ist.

29. Eine Verwendung eines monoklonalen Antikörpers des Anspruchs 1 zur Lieferung "in vitro" eines Gens an Zellen, die ein αvβ&sub3;-Integrin aufweisen oder zur Herstellung eines Medikamentes zur Lieferung eines Gens an Zellen, die ein αvβ&sub3;-Integrin aufweisen, worin die Lieferung das Kontaktieren der Zellen mit dem monoklonalen Antikörper oder Fragment davon umfasst, enthaltend das Paratop, worin der Antikörper oder das Fragment davon konjugiert ist an das cDNA des Gens.

30. Die Verwendung von Anspruch 29, worin die cDNA encodiert für das HIV-1 Thymidinkinase- Gen.

31. Eine Verwendung eines monoklonalen Antikörpers des Anspruchs 1 zur Lieferung "in vitro" eines radioisotops an Zellen, die ein αvβ&sub3;-Integrin aufweisen oder zur Herstellung eines Medikamentes zur Lieferung eines Radioisotops an Zellen, die ein αvβ&sub3;-Integrin aufweisen, worin die Lieferung umfasst Kontaktieren der Zellen mit dem monoklonalen Antikörper oder Fragment davon, enthaltend das Paratop, worin der Antikörper oder Fragment davon konjugiert ist an das Radioisotop.

32. Die Verwendung des Anspruchs 31, worin das Radioisotop ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus &sup6;&sup4;Cu, &sup6;&sup7;Cu, &sup9;&sup0;Y, 99mTc, ¹&sup0;³Pd, ¹&sup0;&sup5;Rh, ¹&sup0;&sup9;Pd, ¹¹¹In, ¹²&sup5;I, ¹³¹I, ¹&sup5;³Sm, ¹&sup8;&sup6;Re, ¹&sup8;&sup8;Re, ¹&sup9;²Ir, ¹&sup9;&sup8;Au, ²&sup0;³Pb, ²¹²Pb, ²¹²Bi und ²&sup4;¹Am.

33. Eine Verwendung eines monoklonalen Antikörpers des Anspruchs 1 zur Lieferung "in vitro" eines bakteriellen Toxins an Zellen, die ein αvβ&sub3;-Integrin aufweisen oder zur Herstellung eines Medikamentes zur Lieferung eines bakteriellen Toxins an Zellen, die ein αvβ&sub3;-Integrin aufweisen, worin die Lieferung umfaßt Kontaktieren der Zellen mit dem monoklonalen Antikörper oder Fragment davon, enthaltend das Paratop, worin der Antikörper oder das Fragment davon konjugiert ist an das bakterielle Toxin.

34. Die Verwendung des Anspruchs 33, worin das bakterielle Toxin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Pseudomonas Exotoxin, Diphtherietoxin und Shigatoxin.

35. Eine Verwendung eines monoklonalen Antikörpers des Anspruchs 1 zur Lieferung "in vitro" eines Pflanzentoxins an Zellen, die ein αvβ&sub3;-Integrin aufweisen oder zur Herstellung eines Medikamentes zur Lieferung eines Pflanzentoxins an Zellen, die ein αvβ&sub3;-Integrin aufweisen, worin die Lieferung umfasst Kontaktierung der Zellen mit dem monoklonalen Antikörper oder Fragment davon, enthaltend das Paratop, worin der Antikörper oder das Fragment davon konjugiert ist an das Pflanzentoxin.

36. Die Verwendung des Anspruchs 35, worin das Pflanzentoxin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ricin, Abrin, Modeccin, Gelonin, antivirales Kermesbeerenprotein (PAP), α-Amanitin, Ribosom inhibierendes Protein (RIP), Gerste RIP, Weizen RIP, Mais RIP und Flachs RIP.

37. Die Hybridoma Zelle, die in der Lage ist, monoklonalen Antikörper P113-7D6 herzustellen, hinterlegt unter der Hinterlegungsnummer ATCC HB 12 224.

38. Die Hybridoma Zelle, die in der Lage ist, monoklonalen Antikörper P112-4C1 herzustellen, hinterlegt unter der Hinterlegungsnummer ATCC HB 12 225.

39. Die Hybridoma Zelle, die in der Lage ist, monoklonalen Antikörper P113-12A6 herzustellen, hinterlegt unter der Hinterlegungsnummer ATCC HB 12 226.

40. Die Hybridoma Zelle, die in der Lage ist, monoklonalen Antikörper P112-11D2 herzustellen, hinterlegt unter der Hinterlegungsnummer ATCC HB 12 227.

41. Die Hybridoma Zelle, die in der Lage ist, monoklonalen Antikörper P112-10D4 herzustellen, hinterlegt unter der Hinterlegungsnummer ATCC HB 12 228.

42. Die Hybridoma Zelle, die in der Lage ist, monoklonalen Antikörper P113-1F3 herzustellen, hinterlegt unter der Hinterlegungsnummer ATCC HB 12 229.