DE69731977T2

DE69731977T2 - Spezifische antikörper für dendritische zellen

Info

Publication number: DE69731977T2
Application number: DE69731977T
Authority: DE
Inventors: Nigel Derek HART
Original assignee: Canterbury Health Ltd
Current assignee: THE CORPORATION OF THE TRUSTEES OF THE ORDER OF TH
Priority date: 1996-10-09
Filing date: 1997-10-09
Publication date: 2005-12-08
Anticipated expiration: 2017-10-10
Also published as: AU744637B2; EP0956304B1; ATE284900T1; EP0956304A4; US6479247B1; WO1998015579A1; DE69731977D1; JP2001502670A; US20020155510A1; EP0956304A1; JP2008148707A; AU4639397A

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich allgemein auf immunologische Reagentien (Antikörper), die an aktivierte dendritische Zellen binden können, auf Zelllinien, die solche Antikörper exprimieren, und auf ein Verfahren zum Identifizieren und Reinigen von dendritischen Zellen aus Blut unter Verwendung solcher Antikörper.
Hintergrund der Erfindung
Dendritische Zellen (DC) bilden eine gesonderte Gruppe von potenten antigenpräsentierenden Zellen (APC), die aus dem Knochenmark stammen und als Spurenpopulationen im Kreislauf sowie sowohl innerhalb von lymphoiden als auch von nichtlymphoiden Geweben zu finden sind^1–3. Obwohl ihre Wichtigkeit als effektivste hämatopoetische Zellen, die an der Einleitung von primären Immunantworten beteiligt sind, gut nachgewiesen wurde^4–7, wurde kein humaner DC-spezifischer Klonmarker identifiziert, und die meisten Merkmale ihrer Ontogenese und Verwandtschaft zu anderen Leukocyten bleiben unklar.
Phänotypisch sind humane DC charakterisiert^1–7,7–11 durch eine hohe Dichte von Klasse-II-MHC-Antigenen, die Anwesenheit eines breiten Spektrums von Adhäsionsmolekülen und das Fehlen oder die geringe Expression einer Reihe von klonspezifischen Zelloberflächenantigenen (CD3, CD14, CD16, CD19, CD57). Mehrere Aktivierungsantigene einschließlich IRAC¹², HB15¹³, 4F2⁸, IL-2R^7,8 und B7/BB-1^7,14 wurden ebenfalls an humanen DC beschrieben, insbesondere nach Aktivierung, obwohl nicht gezeigt wurde, dass die Anti-IRAC- und Anti-HB15-Reagentien aus frischem Blut isolierte DC anfärben. Trotz dieser phänotypischen Charakterisierung bleibt die Identifizierung und daher Reinigung von DC schwie rig, da der größte Teil dieser Antigene auch von anderen ruhenden und aktivierten Zelltypen exprimiert wird. Viele der funktionellen und phänotypischen Merkmale von DC findet man auch sowohl bei Hodgkin-Zellen (HC) als auch bei Zelllinien, die von der Hodgkin-Krankheit (HD) abstammen, und es gibt zunehmende Beweise, die die Hypothese stützen, dass HC in manchen Fällen eine maligne Form von DC darstellen^15–17.
Immunologische Reagentien zur Verwendung in einem Verfahren zum Identifizieren und Reinigen von DC haben daher einen offensichtlichen Nutzen. Solche Reagentien müssen für DC spezifische Epitope oder Antigene erkennen. Bisher wurden Antikörper gegen die frühen Aktivierungsantigene CD83^18,19 und CMRF-44²⁰ erzeugt. Es besteht jedoch weiterhin ein Bedürfnis nach der Verfügbarkeit von Antikörpern, die an andere Epitope an DC als CD83 und CMRF-44 binden können.
Es ist daher ein Ziel dieser Erfindung, immunologische Reagentien bereitzustellen, die ein oder mehrere Epitope eines neuen Aktivierungsantigens, das man auf DC findet, erkennen oder der Öffentlichkeit wenigstens eine nützliche Wahlmöglichkeit zur Verfügung stellen.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Man kann sagen, dass die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt Antikörper oder bindende Fragmente davon bereitstellt, die spezifisch an ein Epitop binden, das sich auf der Oberfläche von dendritischen Zellen befindet, die spezifisch von dem Antikörper, der von der Hybridomzelllinie CMRF-56, dem die ATCC-Zugriffsnummer HB 12202 gegeben wurde, sezerniert wird, erkannt werden.
Zweckmäßigerweise ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper, vorzugsweise der monoklonale Antikörper CMRF-56 (mAb CMRF-56).
In noch einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung die Hybridomzelllinie CMRF-56 bereit.
In noch einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung den mAb CMRF-56 bereit, der von der Hybridomzelllinie CMRF-56 sezerniert wird und spezifisch an ein Epitop auf aktivierten humanen DC bindet, aber nicht an die Aktivierungsantigene CMRF-44 und CD83 bindet.
In noch einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren von aktivierten DC in einer Probe, die solche Zellen enthält, bereit, wobei das Verfahren den Schritt des In-Kontakt-Bringens der Probe mit einem Antikörper oder einem Antikörper-Bindungsfragment, wie sie oben definiert sind, umfasst.
In noch einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Reinigen und/oder Konzentrieren von DC aus einer Probe, die solche Zellen enthält, bereit, wobei das Verfahren den Schritt des In-Kontakt-Bringens der Probe mit einem Antikörper oder einem Antikörper-Bindungsfragment, wie sie oben definiert sind, umfasst.
In der bevorzugten Ausführungsform dieser Verfahren sind die zu identifizierenden oder zu reinigenden Zellen aktivierte humane DC, und der Antikörper ist mAb CMRF-56.
In noch einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein DC-Reinigungssystem zur Verwendung beim Reinigen oder Konzentrieren von DC aus einer Probe, die solche Zellen enthält, bereit, wobei das System einen Antikörper oder ein Antikörper-Bindungsfragment, wie sie oben definiert sind, umfasst.
Zweckmäßigerweise ist das Reinigungssystem dazu bestimmt, aktivierte humane DC zu reinigen, und bei dem Antikörper handelt es sich um gegebenenfalls markierten mAb CMRF-56.
In noch einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung einen Assaykit bereit, der den mAb CMRF-56 zur Verwendung als diagnostischen Marker für aktivierte DC enthält.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
Während die vorliegende Erfindung vorstehend in groben Zügen definiert wurde, wird man sich darüber im Klaren sein, dass sie nicht darauf beschränkt ist, sondern auch Ausführungsformen enthält, für die die folgende Beschreibung Beispiele liefert. Außerdem wird die vorliegende Erfindung durch Bezugnahme auf die Begleitzeichnungen besser verständlich; diese sind wie folgt:
1 zeigt die Reaktivität von mAb CMRF-56 gegenüber Blut- und Mandel-Leukocyten. (A) (i) Fluoreszenzintensitätshistogramm von Granulocyten, die mit mAb CMRF-56 (ausgefüllt) oder Isotypen-Kontrolle angefärbt sind; (ii) Dot-Plots von ER-negativen PBMC, doppelt markiert mit CMRF-56, gegen CD3-, CD14-, CD16-, CD19-PE; (iii) Dot-Plot von ER-positiven PBMC, doppelt markiert mit CMRF-56, gegen CD3-PE. (B) Dot-Plots von kultivierten (16 h, 37°C) ER-negativen PBMC, doppelt markiert mit CMRF-56, CD83 oder CMRF-44 gegen CD19-PE. (C) Dot-Plots von ER-negativen Mandel-Lymphocyten, doppelt markiert mit CMRF-negativem 56, CD83 oder CMRF-56 gegen CD19-PE. In allen Fällen wurden die Schwellen, die die gezeigte positive Anfärbung abgrenzen, auf der Basis der Anfärbung mit negativer Kontrolle eingestellt. Die Daten stammen aus repräsentativen Experimenten.
2 zeigt die Reaktivität von CMRF-56 und HB15 (CD83) gegenüber humanen Zelllinien und CD83-COS-Zell-Transfektanten. (A) Daten für die humanen Zelllinien L428 und Jurkat sind als Immunofluoreszenzprofile gezeigt, die nach der Markierung entweder mit Isotypkontrollen (---), CMRF-56 oder CD83 (---) erhalten wurden und aus einem repräsentativen Experiment von sechs durchgeführten stammen. Die Intensität der CMRF-56- und HB15-Markierung (MFI) gegenüber derjenigen der negativen Kontrollen ist in der rechten Ecke jedes Histogramms der humanen Zelllinien gezeigt. (B) Daten für die COS-Zell-Transfek tanten sind als Immunofluoreszenzprofile gezeigt, die nach der Markierung entweder von Kontroll-Transfektanten (--) oder CD83-Transfektanten (---) mit CMRF-56 oder CD83 erhalten wurden. Die Daten stammen aus einem repräsentativen Experiment von drei durchgeführten.
3 charakterisiert das CMRF-56-Antigen. Bindung von CMRF-56, CD83 und eines als negative Kontrolle verwendeten mAb an Human-Ig, CD83-Ig und CD83-Histidin, durch ELISA analysiert. Die Daten sind als Histogramme gezeigt und stammen aus einem repräsentativen Experiment von drei durchgeführten.
4 zeigt die Expression von CMRF-56 an direkt isolierten DC. (A) Direkt isolierte Blut-DC wurden 0, 3,6 oder 12 h in Medium kultiviert, dann durch doppelte Markierung mit CMRF-56, CMRF-44 oder CD83 gegen DR-PE analysiert. In allen Fällen wurden die Schwellen, die die gezeigte positive Anfärbung abgrenzen, auf der Basis der Anfärbung mit negativer Kontrolle eingestellt. Die Daten stammen aus einem repräsentativen Experiment von drei durchgeführten.
5 zeigt eine Analyse der CMRF-56-Expression innerhalb von kultivierten Präparaten von ER-negativen PBMC mit geringer Dichte. (A) Dot-Plots von Präparaten, doppelt markiert mit CMRF-44, CD83 oder CMRF-56 gegen ein Gemisch von PE-konjugierten CD3-, CD14-, CD16- und CD19-mAb. (B) Dot-Plots von Präparaten, doppelt markiert mit CD83 oder CMRF-44 gegen CMRF-56-Biotin. In allen Fällen wurden die Schwellen, die die gezeigte positive Anfärbung abgrenzen, auf der Basis der Anfärbung mit negativer Kontrolle eingestellt. (C) Allogenes MLR, durchgeführt nach dem Sortieren eines Präparats geringer Dichte auf der Basis der CMRF-56-Expression. Die CMRF-56-positiven (Δ) und negativen (∇) Populationen zusammen mit unmarkierten (♢) und markierten, aber nicht sortierten Kontrollen wurden 5 Tage lang mit allogenen T-Lymphocyten kultiviert, und dann wurde der Einbau von (³H)TdR bestimmt. Die Ergebnisse sind als Mittelwert der dreifach durchgeführten Zählungen im SEM ausgedrückt. Die Daten stammen aus einem repräsentativen Experiment von drei durchgeführten.
6 zeigt die Reaktivität von CMRF-56 und CD83 gegenüber (A) isolierten LC, (B) isolierten dermalen DC und (C) in vitro erzeugten DC. LC- und dermale DC-Präparate wurden doppelt mit CMRF-56, CMRF-44 und CD83 gegen HLA-DR markiert. In vitro erzeugte DC wurden mit Anti-CD1a, CMRF-44 und CMRF-56 gegen CD14-PE doppelt markiert. In allen Fällen wurden die Schwellen, die die gezeigte positive Anfärbung abgrenzen, auf der Basis der Anfärbung mit negativer Kontrolle eingestellt. Die Prozentsätze, die auf der rechten Seite jedes Dot-Plots gezeigt sind, zeigen den Prozentanteil entweder von LC, dermalen DC oder in vitro erzeugten DC an, die das relevante Antigen exprimierten. Die Daten stammen aus repräsentativen Experimenten von dreien, die mit jedem Typ Zellpräparat durchgeführt wurden.
7 zeigt die Reaktivität von CMRF-56 und CD83 gegenüber isolierten SF-DC und Mandel-DC vor und nach einer in-vitro-Kultur. Präparate von (A) Mandel-DC und (B) SF-DC wurden vor und nach 16 h Kultur in Medium doppelt mit CMRF-56, CD83/FITC SAM gegen HLA-DR-PE markiert. In allen Fällen wurden die Schwellen, die die gezeigte positive Anfärbung abgrenzen, auf der Basis der Anfärbung mit negativer Kontrolle eingestellt. Die Daten stammen aus repräsentativen Experimenten von dreien, die mit jedem Typ DC-Präparat durchgeführt wurden.
Beschreibung der Erfindung
Wie oben angegeben, stellt die vorliegende Erfindung in einem primären Aspekt immunologische Reagentien (Antikörper) bereit, die spezifisch an aktivierte DC binden können. Die Antikörper binden an ein neues Aktivierungsantigen an DC, das CMRF-56-Antigen genannt wurde.
Man wird sich darüber im Klaren sein, dass die Antikörper, die das Aktivierungsantigen CMRF-56 binden, in Form von Antiseren, die polyklonale Antikörper enthalten, vorliegen können, oder, falls bevorzugt, können auch monoklonale Antikörper durch Verwendung von Hybridomtechnik erhalten werden. Weiterhin können Antikörper oder Bindungsfragmente auch unter Verwendung von biochemischen oder DNA-Rekombinationstechniken erzeugt werden.
Es ist höchst wünschenswert, dass die immunologischen Reagentien der Erfindung monoklonale Antikörper oder Bindungsfragmente solcher Antikörper sind. Daher wird das allgemeine Verfahren von Kohler und Milstein²¹ verwendet. Im Allgemeinen beinhaltet dieses Verfahren das Gewinnen von antikörpererzeugenden Zellen aus dem Tier und das Verschmelzen der antikörpererzeugenden Zellen mit Stämmen von Myelomzellen unter Bildung von Hybridomen. Diese Hybridome werden gezüchtet oder kultiviert, so dass sie für dendritische Zellen spezifische monoklonale Antikörper erzeugen.
Ein Beispiel für das Verfahren unter Verwendung der Myelomzelllinie NS-1 ist im Folgenden angegeben. Die Zelllinie NS-1 ist von Professor C. Milstein, MRC Laboratory of Molecular Biology, Hills Road, Cambridge CB2 2QH, United Kingdom, erhältlich.
In der Technik sind noch weitere Myelomzelllinien bekannt; dazu gehören zum Beispiel die folgenden Zelllinien: X63Ag8 653, SP2/O, FO und NSO/1. Zelllinien, die schwere oder leichte Ketten von Immunglobulinen weder synthetisieren noch sezernieren (z. B. SP2/O) werden im Allgemeinen bevorzugt gegenüber Zelllinien, die Immunglobulinketten synthetisieren, aber nicht sezernieren.
Falls gewünscht, können Antikörperfragmente durch gesteuerten Protease-Abbau ganzer Immunglobulinmoleküle hergestellt werden, wie es bei Tjissen²² beschrieben ist.
Alternativ dazu können Antikörperfragmente auch unter Verwendung von molekularbiologischen Techniken hergestellt werden, indem man aus Hybridomzellen das genetische Material, das die variablen Bereiche der schweren, leichten oder beider Ketten der monoklonalen Antikörper codiert, isoliert und in geeigneten Organismen für das Produkt von rekombinanten Antigen-Bindungsfragmenten (Fv, ScFv, Fab usw.) des monoklonalen Antikörpers²³ exprimiert.
Zur Veranschaulichung der Erfindung wird jetzt die Erzeugung und Charakterisierung eines monoklonalen Antikörpers, der als mAb CMRF-56 bezeichnet wird und an ein Epitop an einem Aktivierungsantigen CMRF-56 von humanen dendritischen Zellen binden kann, beschrieben. Aufgrund dieser Beschreibung wird sich der Fachmann auch darüber im Klaren sein, wie andere Antikörper (oder ihre Bindungsfragmente, die an das Aktivierungsantigen CMRF-56 binden, zur Verwendung bei der Extraktion von humanen DC oder DC von anderen Tieren erhalten werden können.
Verfahren
Monoklonale Antikörper und Immunmarkierung
Die monoklonalen Antikörper CMRF-15 (Erythrocyten-Sialoglycoprotein, IgM), CMRF-31 (CD14, IgG2a), CMRF-44 (IgM) und biotinyliertes CMRF-44 wurden in diesem Labor hergestellt. HB15a (CD83, IgG2b) war eine Spende von Dr. T. Tedder, Duke University, North Carolina. Der GD19-mAb FMC63 (IgG2a) und der Isotypen-Kontroll-mAb X63 (IgG1), Sal4 (IgG2b) und Sal5 (IgG2a) waren eine Spende von Prof. H. Zola (Flinders Medical Centre, Adelaide, Australien). Der CD1a-mAb NaI/34 war eine Spende von Prof. A. McMichael (Institute of Molecular Medicine, Oxford, UK). HuNK-2 (GD16, IgG2a) war eine Spende von Prof. I. McKenzie (Austin Research Institute, Melbourne, Australien). OKT3 (CD3, IgG2a), HNK-1 (CD57, IgM) und OKM1 (CD11b, IgG1) wurden aus Hybridomen erzeugt, die vom ATCC erhalten wurden. Phycoerythrin-konjugierte Antikörper gegen die Antigene CD3 (leu4, IgG1), CD14 (leuM3, IgG2b), CD16 (leu11c, IgG1), CD19 (leuM12, IgG1) und HLA-DR (L243, IgG2a) wurden von Becton Dickinson, Mountain View, CA, bezogen. Fluoresceinisothiocyanat-konjugierte Schaf-Anti-Maus-Antikörper (FITC-SAM) wurden von Silenus, Hawthorn, Australien, bezogen.
Die Markierung erfolgte auf Eis unter Verwendung von Standardtechniken. Kurz gesagt, Zellen wurden mit primärem Antikörper (30 min) inkubiert, gewaschen, dann mit FITC-SAM inkubiert, woraufhin weiteres Waschen und Analyse erfolg ten. Eine doppelte Markierung von mAb/FITC-SAM-markierten Zellen wurde nach einer weiteren Inkubation von Zellen in 10% Mausserum während fünf Minuten durchgeführt, und anschließend wurde PE-konjugierter oder biotinylierter zweiter Antikörper zugegeben. Bei biotinylierten Antikörpern schloss sich an einen weiteren Waschschritt eine Inkubation (30 min) mit Avidin-PE (Becton Dickinson) an. Die Zellen wurden auf einem FACS Vantage (Becton Dickinson) analysiert oder sortiert. Proben, die nicht sofort analysiert werden konnten, wurden in 1% Paraformaldehyd fixiert und bei 4°C gelagert.
Um die Verkappung der relevanten Antigene zu untersuchen, wurden L428-Zellen entweder mit sal4 oder mit HB15/PE-SAM markiert und dann 60 min lang bei 37°C inkubiert. Dann wurden die Zellen bei 4°C gewaschen, dann (auf Eis) entweder mit CMRF-56-FITC, L243-FITC, X63-FITC oder FITC-SAM markiert.
Erzeugung des CMRF-56-mAb
Eine balb/c-Maus wurde mit der von HD abgeleiteten Zelllinie L428 immunisiert, und die Splenocyten wurden vier Tage später mit der Myelomlinie NS-1 verschmolzen. Das CMRF-56-Hybridom wurde dreimal durch Grenzverdünnung kloniert und verwendet, um Aszitesflüssigkeit zu erzeugen. Die Isotypenbestimmung wurde unter Verwendung eines indirekten ELISA-Kits (Sigma, St. Louis, MO) durchgeführt. Gereinigtes CMRF-56 wurde unter Verwendung von Protein-A-Chromatographie hergestellt und unter Verwendung von Biotin-X-NHS (Calbiochem, La Jolla, CA) biotinyliert. Kurz gesagt, CMRF-56 in einer Konzentration von 2 mg/ml in 0,05 M NaHCO₃ (pH 8,5) wurde vor der Dialyse 30 min lang (RT) mit Biotin-X-NHS (7,5 μg/ml, Calbiochem, La Jolla, CA) inkubiert.
Zelllinien
T-Zelllinien (HSB-2, Molt 4 und Jurkat), EBV-transformierte B-Zelllinien (WT49, Mann), Burkitt-Lymphom-Linien (Raji und Daudi), pre-B (Nalm 6), Myeloerythroid- (K562) und Monocytoid-Leukämie-Zelllinien (HL60, U937, KG1, KG1a, THP-1, HEL) wurden in Medium gezüchtet (10% FCS (Irvine Scientific, Santa Anna, CA) in RPMI-1640 (Gibco, Auckland, Neuseeland), das mit 2 mM Glutamin, 0,06 g/l Penicillin und 0,1 g/l Streptomycin versetzt war). Die Hodgkin-Zelllinie L428 wurde von Dr. V. Diehl (Klinik für Innere Medizin, Köln, Deutschland) erhalten, und die Hodgkin-Zelllinien KM-H2 und HDLM-2 (gezüchtet in 20% Medium) wurden von Dr. H. G. Drexler (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Deutschland) erhalten.
Lymphocyten-, Granulocyten- und Monocytenherstellung
Blut wurde von freiwilligen Spendern erhalten, die gemäß den Ethikkomitee-Richtlinien nach Inkenntnissetzung zustimmten. Mononukleäre Zellen des peripheren Bluts (PBMC) wurden durch Zentrifugation über sterilen Ficoll/Hypaque-Gradienten (d = 1,077 g/cm³, Pharmacia, Uppsala, Schweden) hergestellt. An T-Lymphocyten angereicherte Fraktionen (ER-positiv) und Nicht-T-Fraktionen (ER-negativ) wurden durch Rosettenbildung mit Neuraminidase-behandelten Schaf-Erythrocyten aus PBMC hergestellt, wie es schon früher beschrieben wurde³⁴. Granulocyten wurden nach Dextran-Sedimentation von RBC aus peripherem Blut hergestellt, wie es schon früher beschrieben wurde³⁴. Aktivierte T-Lymphocyten wurden durch Kultur von ER-positiven PBMC (2 × 10⁶/ml) in Medium, das entweder mit 5 μg/ml PHA (Sigma) oder dem Phorbolester Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA, Sigma) in einer Menge von 25 ng/ml plus dem Calcium-Ionophor A23187 (Sigma) in einer Menge von 500 ng/ml versetzt war, hergestellt.
ER-negative PBMC wurden als angereicherte Quelle für Monocyten verwendet. Aktivierte Monocyten wurden durch Kultur von ER-negativen PBMC (2 × 10⁶/ml) in Medium, das entweder mit IFNγ (500 E/ml, eine Spende von Boehringer Ingelheim, Deutschland), bakteriellem LPS (100 ng/ml), TNFα (20 ng/ml) oder GM-CSF (500 E/ml, Novartis) versetzt war, erhalten. Die Monocytenpopulationen wurden durch doppelte Markierung mit CD14-PE überwacht.
Die Wirksamkeit der in-vitro-Aktivierung wurde bestimmt, indem man mit Hilfe von Durchflusscytometrie Änderungen in der Expression der Aktivierungsantigene CD25, CD71, HLA-DR und CMRF-44 überwachte.
Herstellung von dendritischen Zellen
Hoch angereicherte DC-Populationen wurden unter Verwendung von bewährten Laborverfahren hergestellt:

i) Ruhende DC wurden durch direkte Immunabreicherung hergestellt^33,34. Kurz gesagt, ER-negative PBMC wurden mit einem Gemisch von CD3-, CD11b-, CD14-, CD16- und CD19-mAb markiert. Nach Inkubation mit magnetischen Mikrokugeln MACS (Miltenyi Biotec, Deutschland) wurden markierte Zellen durch magnetische Immunabreicherung entfernt, und die mAb-negativen Zellen wurden dann mit FITC-SAM markiert und weiter durch FACS-Sortierung gereinigt. In mehreren Experimenten wurden dann ruhende DC vor der Analyse in Medium (2 × 10⁶/ml) kultiviert (37°C, 5% CO₂).
ii) Kultivierte Blut-DC geringer Dichte wurden aus kultivierten (16 h, 37°C, 5% CO₂) ER-negativen PBMC hergestellt³⁶. Dann wurde die Fraktion mit geringer Dichte durch Zentrifugation über einen Nycodenz-Gradienten (Nycomed Pharma, Norwegen) isoliert³⁶ und entweder direkt als DC-angereicherte (10–30%) Fraktion verwendet oder durch Immunabreicherung weiter gereinigt, wie es oben beschrieben ist.
iii) LC und dermale DC wurden aus Haut (mit Zustimmung erhalten) isoliert³³, die durch Abbau über Nacht (4°C) mit Dispase (0,25% in PBS, Boehringer Mannheim) in Epidermis-Schichten und Dermis aufgetrennt wurde. Suspensionen von Epidermiszellen (EC) wurden durch Disaggregation des Gewebes durch einen Zelldissoziationsbecher (Größe 40 mesh, Sigma) in Gegenwart von 0,25% Trypsin (Sigma) hergestellt. Frische LC wurden in diesem Stadium durch einen Lymphoprep-Gradienten angereichert (2–15%), wie es beschrieben ist³⁷. Suspensionen von Dermiszellen wurden aus dermalen Schichten durch Inkubati on (1 h, 37°C) mit Collagenase D (Boehringer Mannheim, 1 mg/ml) und DNase I in Medium erhalten. Eine Einzelzellsuspension wurde durch Filtrieren durch ein Nylonsieb (80 μm) erhalten, und nach Zentrifugation über einen Lymphoprep-Gradienten (d = 1,077 g/cm³, 10 min, 500 × g) wurde die Fraktion mit geringer Dichte als angereicherte (30–50%) dermale DC-Population verwendet.
iv) DC aus Synovialflüssigkeit (SFDC) wurde so isoliert, wie es schon früher beschrieben wurde³⁸. Unter Zustimmung nach Inkenntnissetzung wurde SF durch Routine-Kniegelenkabsaugungen aus Patienten mit chronischer Arthritis in EDTA-Blutröhrchen aufgefangen. ER-negative Zelten wurden mit einem Gemisch von mAb gegen CD3, CD14, CD15, CD16 und CD19 markiert und unter Verwendung von immunmagnetischen MACS-Kügelchen abgereichert, wie es oben für die Herstellung von Blut-DC beschrieben ist. Restliche markierte Zellen wurden unter Verwendung eines FACS weiter abgereichert. Die restlichen unmarkierten MHC-Klasse-II-positiven Zellen bildeten die SFDC-Population.
v) Mandel-DC wurden unter Zustimmung nach Inkenntnissetzung bei Routine-Tonsillektomien aus Mandeln präpariert. Sie wurden sofort verarbeitet, und eine Einzelzellensuspension wurde hergestellt, indem man das Gewebe fein zerkleinerte und das Material durch ein Drahtgewebesieb passierte. Mononukleäre Zellen wurden über einen F/H-Dichtegradienten isoliert, und Mandel-DC wurden so isoliert, wie es oben für SFDC beschrieben ist.
vi) In vitro abgeleitete DC wurden aus der adhärenten Fraktion von PBMC erzeugt, die nach 2 h Kultur (37°C) in Falcon-6-Napf-Platten (BD) erhalten wurde. Adhärente Zellen wurden fünf Tage lang in Medium kultiviert, das mit GM-CSF (800 E/ml) und IL-4 (500 E/ml) versetzt war, woraufhin TNFα bis zu einer Endkonzentration von 20 ng/ml hinzugefügt wurde, und vor der Analyse wurden die Zellen weitere zwei Tage lang kultiviert.

Immunhistologie
Cryostat-en-face-Schnitte (7 μm) von Mandeln und Lymphknoten (erhalten mit geeigneter ethischer Erlaubnis, zugelassen vom Ethikkomitee von Canterbury Health) wurden über Nacht trocknen gelassen, dann 10 min lang in eiskaltem Aceton fixiert und 30 min lang an der Luft getrocknet. Die Schnitte wurden mit 10% Ziegenserum inkubiert, bevor sie mit primärem monoklonalem Antikörper (mAb) und anschließend biotinyliertem Ziegen-Anti-Maus-Ig (DAKO) inkubiert wurden, und dann wurde Streptavidin-HRP (DAKO) hinzugefügt. Zwischen den 30-minütigen Inkubationen wurden die Objektträger jeweils dreimal mit TBS gewaschen. Die enzymatische Aktivität wurde mit 3,3'-Diaminobenzidin-Lösung sichtbar gemacht. Nach einem abschließenden Waschen in PBS wurden die Objektträger gegengefärbt (Standard-H & E-Färbung) und dann montiert.
Immunfluoreszenz-Doppelmarkierung von acetonfixierten Gewebeschnitten wurde durchgeführt, wie es oben für Zellsuspensionen beschrieben ist.
Funktionelle Assays
Allogenes MLR: 10⁵ T-Lymphocyten wurden bei 37°C in 5% CO₂ in 96-Napf-Platten mit dreifach parallel angesetzten abgestuften Zahlen von sortierten APC-Teilmengen, die von einem einzigen allogenen Spender erhalten wurden, kultiviert. Die Näpfe wurden unmittelbar vor der Ernte am fünften Tag 12 Stunden lang mit 0,5 Ci [³H]-Thymidin (Amersham) gepulst. Die Zellen wurden auf Filterpapier geerntet, und der Einbau von Thymidin wurde mit einem Flüssigszintillationszähler gemessen. Die Daten werden als mittlere Zählrate (cpm) von dreifach parallel angesetzten Näpfen ± Standardabweichung ausgedrückt. In Kontrollnäpfen, die T-Zellen oder APC allein enthielten, wurde bei allen Experimenten < 500 cpm [³H]-Thymidin eingebaut.
Herstellung von CD83-Transfektanten
In Medium gezüchtete COS-7-Zellen wurden auf Nunc-Petri-Schalen bis zu ungefähr 50% Konfluenz ausgestrichen. Die Transfektion wurde durch Elektroporation (300 V, 500 μF) von Zellen (4 × 10⁶ in 400 μl Medium) mit 2 μg CD83-Plasmid (CDM8–CD83 freundlicherweise von Dr. Tedder zur Verfügung gestellt) oder Kontrollplasmid in einem Biorad-Gene-Pulser durchgeführt. Dann wurden die Zellen 72 h lang in Medium kultiviert, bevor eine Immunfluoreszenzanalyse mit dem HB15a-mAb durchgeführt wurde, um die CD83-Expression zu bestätigen.
Expression von CD83-Fusionsproteinen
CD83-Ig wurde in eukaryontischen Zellen exprimiert. Ein DNA-Fragment der extrazellulären Domäne von CD83 (einschließlich Signalpeptid) wurde durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ausgehend von einer CD83-cDNA amplifiziert, wobei man ein Primerpaar verwendete (MK001: 5'-CCCAAG CTT ATG TCG CGC GGC CTC CAG-3' (vorwärts) und MK002: 5'-GCG AAT TCA CTT ACC TGT CTC CGC TCT GTA TTT CTT-3' (rückwärts), wobei die einzigen HindIII- und EcoRI-Stellen unterstrichen sind). Das resultierende Fragment wurde mit EcoRI und HindIII abgebaut und mit EcoRI- und HindIII-abgebautem pBluescript ligiert, so dass pBS-CD83 für die DNA-Sequenzierung entstand. Nach der Bestätigung der DNA-Sequenz wurde das Fragment mit EcoRI und HindIII ausgeschnitten und mit EcoRI- und HindIII-abgebautem pIG-Vektor ligiert. Der Vektor wurde durch Elektroporation in COS-Zellen transfiziert, und CD83-Ig wurde aus dem konditionierten Medium der COS-Zellen gereinigt, wobei man Protein-A-Säulenchromatographie verwendete.
CD83-Histamin (CD83-Hist) wurde in prokaryontischen Zellen exprimiert. Ein DNA-Fragment der extrazellulären Domäne von CD83 (einschließlich Signalpeptid) wurde durch PCR ausgehend von einer CD83-cDNA amplifiziert, wobei man ein Primerpaar verwendete (MK010: 5'-GAA GAT CTA CGC CGG AGG TGA AGG TG-3' (vorwärts) und MK011: 5'-GAA GAT CTC TCC GCT CTG TAT TTC TT-3' (rückwärts), wobei die einzige BglII-Stelle unterstrichen ist). Das resultierende Fragment wurde mit BglII abgebaut und mit BglII-abgebautem pQE12 ligiert, so dass pQE-CD83 entstand. Nach der Bestätigung der DNA-Sequenz und des Leserasterstatus wurde der Vektor verwendet, um XL-1-Blue-Bakterien zu transformieren, und das CD83-Hist-Fusionsprotein wurde induziert, indem man IPTG zu der Bakterienkultur gab. Das Fusionsprotein wurde aus dem Bakterienlysat gereinigt, wobei man Ni-NTA-Harz-Säulenchromatographie verwendete.
CD83-ELISA
Die Bindung von CMRF-56 und HB15 an CD83-Konstrukte wurde durch ELISA analysiert. ELISA-Platten (Maxisorp, Nunc) wurden durch Inkubation (37°C, 1 h) mit CD83-Ig, CD83-H oder humanem Ig (hIg, salzgefällt) in einer Konzentration von 10 μg/ml beschichtet. Nach dem Blockieren (2% BSA/PBS) wurden die Näpfe entweder mit Kulturüberstand, Aszites oder in 1% BSA/PBS verdünnten gereinigten mAb inkubiert (1 h, 37°C). Nach dem Waschen (0,1% Tween 20/PBS) wurden die Platten mit GAM-HRP (DAKO, 1 : 1500) inkubiert (1 h, 37°C), und dann wurde gewaschen und die Farbe mit o-Phenylendiamin-(OPD)-Substrat entwickelt. Dann wurden die Platten auf einem MRX-Mikroplattenleser (Dynatech Laboratories) analysiert (492 nm/650 nm).
Enzym- und Hemmungsstudien
Die Enzymanfälligkeit des CMRF-56-Antigens wurde getestet, indem man die Zelllinie L428 in PBS, das entweder Pronase (50 μg/ml, Sigma) oder Neuraminidase (0,1 E/ml, Behring, Marburg, Deutschland) enthielt, inkubierte (30 min, 37°C). Vor der Analyse mittels Durchflusscytometrie wurden die Zellen gewaschen (× 3). Die enzyminduzierten Änderungen der Stärke der mAb-Bindung wurden durch Vergleich des MFI von behandelten Zellen mit dem von Zellen, die in PBS allein inkubiert wurden, bestimmt.
Die N-verknüpfte Glycosylierung von Glycoproteinen wurde durch Inkubation (12 h, 37°C) in Medium, das entweder 0 oder 10 μg/ml Tunicamycin (Sigma) enthielt, blockiert. Die Wirkung der Behandlung auf die mAb-Bindung wurde mittels Durchflusscytometrie bestimmt.
Immunfällung
Die Zellen wurden unter Verwendung von drei Verfahren markiert: (i) Zelloberflächenmarkierung mit Biotin-X-HNS (Calbiochem)^20,39, (ii) Zelloberflächen-Sialinsäure-Markierung mit Biotinhydrazid (Calbiochem)⁴⁰ oder (iii) biosynthetisch markiert mit ³⁵S (NEN, Boston, MA)²⁰. Nach der Markierung wurden die Zellen durch Inkubation (1 h auf Eis) der Zellen (4 × 10⁷) in 1 ml Lysepuffer (100 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,02% NaN₃, pH 7,8), der entweder 0,5% Triton X-100 oder 0,25% CHAPS enthielt und mit dem Enzyminhibitor Complete^TM (Boehringer) versetzt war, in Lösung gebracht. Nach der Zentrifugation (10 000 g, 10 min) wurden die in Lösung gebrachten Proteine entweder durch (i) Immunfällung unter Verwendung von Kaninchen-Anti-Maus-Immunglobulin, das kovalent an CNBr-aktivierte Sepharose 4B gekoppelt ist (RAM-Sepharose), wie es schon früher beschrieben wurde^20,39, oder durch (ii) Immunabsorption von Antigen durch mAb, der auf Maxisorp-ELISA-Platten abgefangen wurde⁴¹, analysiert. Eluiertes Protein wurde durch Gradienten-SDS-PAGE in Kombination mit Autoradiographie oder durch Western Blotting in Kombination mit Chemilumineszenz-Visualisierung analysiert.
Lipidextrakte wurden aus L428 hergestellt, wie es schon früher beschrieben wurde²⁰. Slot-Blotting von Ganzzelllysaten (hergestellt gemäß der obigen Beschreibung) oder lipidextrahiertem Material und anschließende Immunfärbung wurden so durchgeführt, wie es schon früher beschrieben wurde²⁰.
Ergebnisse
Erzeugung von CMRF-56-mAb
Hybridome wurden durch Fusion von NS-1-Myelomzellen mit Milzzellen, die von einer Maus erhalten wurden, welche mit der HD-abgeleiteten Zelllinie L428 immunisiert worden war, erzeugt. Hybridome, die mAb erzeugten, welche gegenüber L428, aber nicht gegenüber PBMC reaktiv waren, wurden identifiziert, dann auf Reaktivität gegenüber kultivierten DC geringer Dichte analysiert. Der mAb CMRF-56 (IgG₁) markierte eine Zellpopulation innerhalb dieser DC-Präparate und wurde so charakterisiert, wie es unten beschrieben ist.
CMRF-56-Reaktivität gegenüber normalen hämatopoetischen Nicht-DC-Populationen
Die Zelloberflächenexpression des CMRF-56-Antigens auf isolierten Blut- und Mandel-Leukocytenpopulationen wurde sowohl durch einfache als auch durch doppelte Markierung in Verbindung mit Durchflusscytometrie analysiert. Der CMRF-56-mAb reagierte nicht mit zirkulierenden PBMC (n = 5), Granulocyten des peripheren Bluts (n = 3, 1A), der CD3-positiven Population innerhalb von ER-negativen PBMC-Präparaten (n = 4, 1A) oder den CD16-positiven, CD14-positiven und CD19-positiven Populationen innerhalb von ER-negativen PBMC-Präparaten (n = 6, 1A).
Bei einer in-vitro-Kultur (16 h, 37°C) von ER-positiven PBMC (n = 3) während 24 und 72 h in Medium oder in Medium, das mit PHA oder PMA + CaI versetzt war (n = 3), wurde die CMRF-56-Antigen-Expression auf der CD3-positiven Population nicht induziert. Die Kultur von ER-negativen PBMC in Medium (16 h, 37°C) induzierte die Expression der CMRF-56-, CD83- und CMRF-44-Antigene auf einer Subpopulation der CD19-positiven Population, während die CD19-negative Population (einschließlich CD14-positiver Monocyten) diese Antigene nicht aufwiesen (1B). Die Kultur von ER-negativen und ER-positiven Präparaten in Gegenwart von PMA/CaI induzierte die Expression von CMRF-56 und CD83 auf den vorhandenen CD19-positiven Zellen. Bei der Kultur von ER-negativen PBMC während 24 h und 72 hin Medium, das mit zusätzlichem LPS, IFNγ, GM-CSF oder TNFα versetzt wurde, wurde die Expression von CMRF-56 auf der CD14-positiven Monocytenpopulation trotz der Induktion von Änderungen in der Expression von CMRF-44 oder MHC-Klasse-II-Antigen nicht induziert (Daten nicht gezeigt, n = 3). Eine Analyse von isolierten Mandel-Lymphocyten mittels Durchflusscytometrie bestätigte, dass CMRF-56 keine Mandel-T-Lymphocyten markierte (n = 4), aber gemeinsam mit CD83 und CMRF-44 einen Teil der Mandel-B-Lymphocyten mit mäßiger Intensität markierte (1C).
Bei allen analysierten Mandel-Lymphocytenpräparaten (n = 5) gab es einen eindeutigen Unterschied im Prozentsatz der B-Lymphocyten, die mit dem mAb markiert wurden: Das CMRF-44-Antigen wurde zu einem höheren Prozentsatz und das CD83-Antigen zu einem niedrigeren Prozentsatz von Zellen exprimiert als das CMRF-56-Antigen.
Reaktivität gegenüber Zelllinien und Transfektanten
Die Zelloberflächenexpression von CMRF-56 auf humanen Zelllinien wurde mittels Durchflusscytometrie analysiert. Das CMRF-56-Antigen wurde in nachweisbaren Mengen auf mehreren B-Zelllinien (Mann, Raji) und HD-abgeleiteten Zelllinien (L428, KM-H2, HDLM-2) exprimiert, wobei die stärkste Anfärbung an den L428- (2A) und Mann-Zelllinien festgestellt wurde. Zu den Zelllinien, die keine nachweisbaren Mengen an CMRF-56-Antigen exprimierten, gehörte die Myelo-Erythroid-K562-Linie, die T-Lymphoid-Linien HSB2 und Molt 4, die Myeloid-Monocytoid-Zelllinien NB4, THP1, 0937, KG1 und KG1a sowie die Pre-B-Lymphoid-Linie NALM6. Der CMRF-56-mAb reagierte nicht mit der CD83-positiven T-Lymphoid-Zelllinie Jurkat (2A), und wie in 2B gezeigt ist, markierte sie keine CD83-positiven COS-Zell-Transfektanten (n = 3).
Das CMRF-56-Antigen zeigte eine erhebliche Verkappung an einem Teil der L428-Zellen durch CMRF-56-mAb-FITC-SAM. Das CD83-Antigen wurde ebenfalls von HB15/PE-SAM auf 60% der angefärbten Zellen zu diskreten Flecken verkappt. Von den Zellen, die mit CMRF-56 verkappt und anschließend mit CD83 angefärbt wurden, zeigte ein Teil eine restliche, gleichmäßig verteilte CD83-Anfärbung der Membran, was eine unabhängige molekulare Membranlokalisierung der beiden Antigene anzeigt.
Biochemische Analyse
Die Empfindlichkeit von CMRF-56-Antigen gegenüber Enzymabbau oder Blockierung der N-verknüpften Glycosylierung wurde mittels Durchflusscytometrie analysiert. Eine erhöhte Bindung des CMRF-56-mAb an L428-Zellen wurde nach der Behandlung der Zellen entweder mit Neuraminidase (1,5fache Erhöhung, St.-Abw. = 0,2, n = 5) oder mit Pronase (1,4fache Erhöhung, St.-Abw. = 0,25, n = 4) beobachtet. Durch Vorinkubation mit Tunicamycin wurde die beobachtete Bindung nicht wesentlich geändert.
Eine Immunfärbung von L428-Detergens-Lysaten, die auf NC-Membranen aufgetragen wurden, bewies, dass das CMRF-56-Antigen durch das nichtionische Detergens Triton X-100 und das zwitterionische Detergens CHAPS effektiv in Lösung gebracht wurde. Zahlreiche Immunfällungsexperimente ausgehend von Lysaten, die nach Markierung mit L428-Zelloberflächenprotein (Biotin), Zelloberflächen-Sialinsäure (Biotinhydrazid) oder metabolische Markierung (³⁵S) hergestellt wurden, konnten das CMRF-56-Antigen trotz Copräzipitation von Produkten mit geeigneten Molekulargewicht mit den Anti-MHC-Klasse-II- und CD83-Reagentien nicht identifizieren (Daten nicht gezeigt). Bei einem Western-Blotting von L428 und Mann-Zelllinienlysaten wurde das CMRF-56-Antigen ebenfalls nicht identifiziert.
Durch Immunfällung von L428-Lipid- und -Nichtlipid-Extrakten, die auf Nitrocellulosemembranen aufgetragen wurden, wurde CMRF-56-Antigen in keiner der beiden Fraktionen nachgewiesen, was vermuten lässt, dass das Epitop des CMRF-56-Antigens empfindlich gegenüber organischen Lösungsmitteln ist (Daten nicht gezeigt).
Die Reaktivität von CMRF-56 gegenüber sowohl CD83-Ig als auch CD83-Hist-Konstrukten wurde durch ELISA analysiert (3). Im Gegensatz zum CD83-mAb band CMRF-56 weder an CD83-Ig (n = 3) noch an das rekombinante Material CD83-hist (n = 3).
CMRF-56-Reaktivität gegenüber isolierten DC
Die Reaktivität von CMRF-56 gegenüber isolierten DC-Populationen wurde durch indirekte Immunfluoreszenz und Durchflusscytometrie untersucht.
Direkt isolierte frische DC (5A) exprimierten keine nachweisbaren Mengen entweder des CMRF-56- oder des CD83-Antigens. Die Expression der beiden Antigene wurde jedoch an direkt isolierten DC schnell innerhalb von 6 h in-vitro-Kultur induziert. Dagegen wurde die Expression des CMRF-44-Antigens durchweg an einer Subpopulation von direkt isolierten DC nachgewiesen, und die weitere Hochregulierung des CMRF-44-Antigens ging derjenigen sowohl des CMRF-56- als auch des CD83-Antigens voraus.
Bei der Analyse der DC-angereicherten Fraktion geringer Dichte von kultivierten ER-negativen PBMC wurde stets eine Subpopulation von CMRF-56-positiven Zellen identifiziert (10–30%, n = 20), die mit den durch CD83 und CMRF-44 nachgewiesenen DC-Populationen identisch war (4A). Durch doppelte Markierung (4B) wurde bestätigt, dass die CMRF-56-Reaktivität mit den lin-negativen, CMRF-44-positiven und CD83-positiven DC-Populationen assoziiert war. Eine FACS-Sortierung von ER-negativen PBMC geringer Dichte auf der Basis der CMRF-56-Expression bewies eindeutig, dass eine starke allostimulatorische Aktivität mit der CMRF-56-positiven Population verbunden war und dass die CMRF-56-negative Population nur schwach stimulatorisch war (n = 3, 4C). Die Bindung des mAb beeinflusste die allostimulatorische Aktivität der DC nicht.
Die durchflusscytometrische Analyse von isolierten LC (n = 3) bewies, dass ungefähr 40% dieser Zellen die CMRF-56- und CMRF-44-Antigene in hoher Dichte exprimieren, wobei CD83 nur schwach auf einem erheblich geringeren Prozentanteil der Zellen exprimiert wird (6A). Dermale DC (n = 3) sind zwar stark CMRF-44- und CMRF-56-positiv, zeigten jedoch nur eine schwache Anfärbung einer Subpopulation von Zellen mit CD83 (6B).
Direkt isolierten SFDC fehlt zwar das CD83-Antigen, doch sie enthielten eine Subpopulation von CMRF-56-positiven Zellen (n = 5, 7A). Nach einer in-vitro-Kultur dieser SFDC-Präparate wurde eine weitere Hochregulierung sowohl des CMRF-56- als auch des CD83-Antigens beobachtet.
Mandel-DC, die durch direkte Immunabreicherung hergestellt wurden, waren gemeinsam mit frisch isolierten Blut-DC CD83- und CMRF-56-negativ, exprimierten jedoch nach einer Zeit der in-vitro-Kultur beide Antigene in hoher Dichte (n = 5, 7B).
In vitro erzeugte Mo-DC-Populationen wurden ebenfalls untersucht (n = 3). Nach der Kultur von Monocyten in Gegenwart von GM-CSF, IL-4 und TNFα waren die resultierenden Mo-DC stark CMRF-56-positiv. Der Prozentanteil der CMRF-56-positiven Zellen war erheblich geringer als der Prozentanteil der CD1a-positiven Zellen (6C).
Immunhistologische Analyse der CMRF-56-Expression
Bei einer immunhistologischen Anfärbung von Lymphknoten- und Mandelschnitten wurde eine schwache CMRF-56-Antigen-Expression auf den Lymphocyten des Keimzentrums und eine starke Expression auf verstreuten interfollikulären Zellen (Zellen der T-Zone) nachgewiesen. Die doppelte Immunofluoreszenzmarkierung von Mandelschnitten bewies, dass die CMRF-56-positiven interfollikulären Zellen kein CD19 und CD20 aufweisen, aber CD86 exprimierten. Eine doppelte Markierung mit CMRF-56 und CD83 bewies, dass das CMRF-56-Antigen innerhalb der interfollikulären Bereiche auf einer geringeren Zahl von Zellen exprimiert wurde als CD83 und dass eine Subpopulation der CMRF-56-positiven Population kein CD83 exprimierte.
Diskussion
Bei der Charakterisierung des mAb CMRF-56 wurde festgestellt, dass er ein vorher undefiniertes antigenes Epitop mit einer Expression, die auf humane DC- Populationen beschränkt ist, erkennt. Zirkulierende Blutleukocyten exprimierten das CMRF-56-Antigen nicht, und nach entweder Kultur allein oder in-vitro-Aktivierung wurde die Expression des CMRF-56-Antigens nur innerhalb der (DC-angereicherten) Fraktion geringer Dichte von kultivierten PBMC und an einer Subpopulation von CD19-positiven Lymphocyten nachgewiesen. Durch Immunmarkierung und FACS-Sortierung der Fraktion geringer Dichte von kultivierten PBMC wurde bestätigt, dass CMRF-56 die DC-Population innerhalb dieser Präparate anfärbte. Das Ergebnis, dass zirkulierende Blut-DC CMRF-56-negativ sind, das Antigen aber innerhalb von 6 h Kultur in hoher Dichte exprimieren, bestätigte, dass CMRF-56 einen frühen Differenzierungs-/Aktivierungsmarker auf DC erkennt. Das CMRF-56-Antigen wurde auch auf anderen DC-Populationen einschließlich isolierter LC und dermaler DC exprimiert. Eine schnelle Hochregulierung des CMRF-56-Antigens auf DC aus Mandeln und Synovialflüssigkeit erfolgte nach einer kurzen Zeit der in-vitro-Kultur. Das CMRF-56-Antigen kann aufgrund seines Fehlens bei CMRF-44-positiven Zellen, z. B. in-vitro-kultivierten und IFNγ-aktivierten Monocyten sowie frisch isolierten Blut-DC, eindeutig von CMRF-44 unterschieden werden. Ebenso unterscheiden sich diese beiden Antigene eindeutig durch das Fehlen einer CMRF-56-Reaktivität gegenüber CD83-Transfektanten, rekombinanten CD83-Proteinen und der CD83-positiven Zelllinie Jurkat.
Die zur Zeit einzigen verfügbaren selektiven DC-Oberflächenmarker sind CMRF-44^31,20 und CD83^18,19, die auch frühe Aktivierungsmarker auf DC erkennen. Das CMRF-44-Antigen, aber nicht die CD83- und CMRF-56-Antigene, werden auf einer Subpopulation von zirkulierenden DC exprimiert³¹. Obwohl alle drei Marker auf DC in Kultur schnell hochreguliert werden, geht, wie in dieser Studie gezeigt wurde, die Hochregulierung von CMRF-44 auf isolierten Blut-DC derjenigen der CMRF-56- und CD83-Antigene eindeutig voraus. Die Analyse von isolierten dermalen DC, LC, Synovialflüssigkeit-DC und Mandel-DC lässt vermuten, dass die Expression des CMRF-56-Antigens der CD83-Expression dieser Populationen vorausgeht.
Es scheint also, dass diese drei verschiedenen DC-Differenzierungs/Aktivierungs-Antigene in der Reihenfolge CMRF-44-Antigen, CMRF-56-Antigen und dann CD83-Antigen hochreguliert werden. Diese Interpretation kann jedoch durch die Tatsache beeinflusst sein, dass die Expression der CMRF-44- und CMRF-56-Antigene auf isolierten DC während einer kurzen Zeit der in-vitro-Kultur die ganze Zeit aufrechterhalten wird, während die Markierung mit Oberflächen-CD83-Antigen bei einigen Experimenten nach 24 h abnimmt. Diese Herunterregulierung der Expression des CD83-Antigens kann auf die Spaltung des Oberflächenproteins und die Freisetzung von löslichem VD83 zurückzuführen sein, von der berichtet wurde, dass sie bei aktivierten B-Lymphocyten stattfindet³⁶.
CMRF-56 und CD83 unterschieden sich erheblich in Bezug auf ihre Reaktivität gegenüber IDC in Mandelschnitten. Durch doppelte Markierung wurde nachgewiesen, dass das CMRF-56-Antigen in der interfollikulären Zone auf einer beträchtlich geringeren Zahl von Zellen exprimiert wurde als CD83 und dass Populationen sowohl von CMRF-56-positiven/CD83-positiven, CMRF-56-negativen/CD83-positiven als auch CMRF-56-positiven/CD83-negativen Zellen vorhanden waren. Frühere Studien haben gezeigt, dass CD83 innerhalb des Mandelgewebes von einer Teilmenge von IDC exprimiert wird. Die Expression des CMRF-56-Antigens auf einer CD19-negativen, CD20-negativen, HLA-DR-positiven Population innerhalb der interfollikulären Zone, die eine Population von CD83-negativen Zellen beinhaltet, liefert weitere Beweise dafür, dass die CMRF-56- und CD83-Antigene in verschiedenen Stadien der DC-Differenzierung/Aktivierung exprimiert werden. Das Fehlen des CMRF-56-Antigens auf einer Subpopulation von CD83-positiven IDC steht jedoch im Gegensatz zu den Ergebnissen, die unter Verwendung von isolierten Mandel-DC-Populationen erhalten wurden. Daher wurden keine CD83-positiven, CMRF-56-negativen DC-Populationen in einem der Präparate nachgewiesen, die entweder vor oder nach der in-vitro-Kultur analysiert wurden. Dies kann im Falle der isolierten Mandel-DC die Schwierigkeit bei der Isolierung all der Zellpopulationen aus dem Gewebe widerspiegeln, insbesondere ohne die isolierten Zellen einem in-vitro-Enzymabbau auszusetzen. Interessanterweise exprimierte der größte Teil der B-Zellen des Keimzentrums zwar CMRF-56- und CD83-Antigene geringer Dichte, wenn sie in situ analysiert wurden, doch exprimierte nur eine Subpopulation von isolierten Mandel-B-Zellen diese Antigene, was vermuten lässt, dass die Freisetzung von B-Zellen aus der Gewebematrix möglicherweise nicht repräsentativ ist.
Die CMRF-56-Expression auf humanen Zelllinien bildet eine Parallele zu der Expression der CMRF-44- und CD83-Antigene, da sie in vielerlei Hinsicht auf HD-abgeleitete Zelllinien und B-Zelllinien beschränkt ist, während diese Antigene bei Zelllinien myeloiden Ursprungs fehlen. Ein ähnliches Muster beobachtet man nach der Aktivierung von ER-negativen PBMC- oder ER-positiven PBMC-Populationen, wobei die Expression von CMRF-56 und CD83 auf B-Lymphocyten leicht induzierbar ist. Obwohl alle Blut-B-Lymphocyten diese Antigene nach in-vitro-Aktivierung exprimieren, zeigen diese Antigene auf isolierten Mandel-Lymphocyten deutlich unterschiedliche Expressionsniveaus, wobei CD83 auf einem beträchtlich kleineren Prozentanteil von B-Lymphocyten exprimiert wird als CMRF-56, während CMRF-44 eine erheblich höhere Expression zeigte.
Bei Verwendung einer Reihe von einzelnen Stimuli wurde eine vernachlässigbare Expression dieser Antigene auf der CD14-positiven Monocytenpopulation beobachtet. Dennoch kann die Expression von CD83 und CMRF-44 auf Zellen myeloiden Ursprungs nach langfristiger Kultur in Gegenwart von besonderen Cytokin-Kombinationen induziert werden. Diese Zellen ähneln stark DC in Bezug auf Funktion und Phänotyp, und wie in dieser Studie gezeigt wurde, exprimieren diese Mo-DC in vitro auch das CMRF-56-Antigen.
Es ist klar, dass die Spezifität von CMRF-56 und CD83 für DC-Populationen nicht absolut ist, aber das Studium dieser Antigene in Verbindung mit B-Lymphocytenmarkern liefert ein hochselektives Mittel zum Identifizieren von DC-Populationen in einem frühen Stadium der Aktivierung, sowohl in situ als auch innerhalb von isolierten Leukocytenpopulationen. Die Hochregulierung dieser Moleküle ist mit einer Phase erheblicher Aktivierung der DC-Funktion verbunden. Diese DC erfahren also eine Hochregulierung der costimulatorischen Moleküle CD80, CD86^{30,32,19,14,43}, CD40³³ und von Adhäsionsmolekülen, wie ICAM-1^7,44.
Um es zusammenzufassen, das CMRF-56-Antigen wird wie die anderen assoziierten Antigene CMRF-44 und CD83 auf der L428-Zelllinie exprimiert. Dennoch kann anhand der vorgelegten serologischen Daten das CMRF-56-antigenische Epitop eindeutig vom CMRF-44-Antigen unterschieden werden. Das CD83-Antigen, das auf serologischem Niveau einige Parallelen zum CMRF-56-Antigen aufweist, ist als Zelloberflächenprotein, das unabhängig vom CMRF-56-Antigen verkappt, eindeutig von diesem unterschieden. Weitere Beweise für die unterschiedliche Natur dieser beiden Antigene wurden erhalten, indem bewiesen wurde, dass der mAb CMRF-56 CD83-transfizierte Zellen oder rekombinantes Material nicht bindet. Der mAb CMRF-56 wird also zu einem weiteren mAb mit Spezifität für DC.
Der CMRF-56-mAb markiert über den 48-h-Beobachtungszeitraum keine Cytokin- oder LPS-stimulierten Blutmonocyten. Dadurch ist der CMRF-56-mAb vielleicht besonders nützlich als Reagens zur Bestimmung der festgelegten monocytischen Zellen aus festgelegten DC-Vorläufern. Es ist klar, dass das CMRF-56-Antigen als Teil des DC-Aktivierungs-/Differenzierungs-Wegs hochreguliert wird. Die in 5 dokumentierte Kinetik der Hochregulierung lässt vermuten, dass das CMRF-56-Antigen später exprimiert wird als CD83, aber länger überdauert als CD83, das anscheinend nach 48 h herunterreguliert wird.
Gewerbliche Anwendung
Es gibt mehrere Verwendungen, denen die Antikörper der Erfindung (die das Aktivierungsantigen CMRF-56 erkennen und binden) zugeführt werden können. Zu diesen Verwendungen gehören (1) die Identifizierung (für diagnostische Zwecke) von aktivierten DC und (2) die Reinigung/Konzentration von aktivierten DC, und diese Verwendungen stellen dementsprechend weitere Aspekte dieser Erfindung dar.
Zu den diagnostischen Anwendungen des vorliegenden beispielhaften mAb CMRF-56 gehören die Ermöglichung einer Bewertung von aktivierten (CMRF-56- positiven) gegenüber nichtaktivierten (CMRF-56-negativen) DC, die bei der Diagnose und/oder Therapie von Krankheiten wie Krebs von Nutzen sein kann.
Bei solchen Anwendungen könnten beliebige Assayverfahren auf immunologischer Basis, die in der Technik bekannt sind, eingesetzt werden, um die Menge der aktivierten DC in einer Probe zu quantifizieren. Solche Verfahren sind bei Tijssen zusammengefasst²⁴, wie Durchflusscytometrie, ELISA, RIA und Fluoreszenzmikroskopie und andere.
Zur Isolierung von aktivierten DC kann wiederum jedes beliebige Verfahren oder Reinigungssystem, bei dem die Antikörper (oder ihre Bindungsfragmente) als primäres immunologisches Reagens eingesetzt werden, verwendet werden. Viele solche Verfahren sind bekannt, wie auch viele Reinigungssysteme, die es erlauben, diese Verfahren umzusetzen. Ein Beispiel für ein kommerziell erhältliches Reinigungssystem ist das Avidin-Biotin-Immunoaffinitätssystem²⁹ von CellPro, Inc., Washington, USA. Siehe auch US-Patente 5,215,927, 5,225,353, 5,262,334, 5,240,856 und WO 92/07243, das am 30. April 1992 veröffentlicht wurde. Bei diesem System werden direkt oder indirekt ein biotinylierter monoklonaler Antikörper, der gegen eine Zielzelle gerichtet ist, und eine Säule, die immobilisiertes Avidin enthält, eingesetzt, und es kann wie folgt leicht so angepasst werden, dass damit aktivierte humane dendritische Zellen, in diesem Fall aus humanem peripherem Blut, extrahiert werden können, wobei der beispielhafte mAb CMRF-56 verwendet wird:

1. Eine Probe von humanem peripherem Blut, das die humanen dendritischen Zellen enthält, wird mit dem biotinylierten mAb CMRF-56 gemischt und inkubiert, so dass mAb-CMRF-56/Human-DC-Komplexe entstehen können.
2. Nach der Inkubation wird das Gemisch in eine CellPro-Durchfluss-Immunoadsorptionssäule eingeführt, die mit avidinbeschichteten Kügelchen gefüllt ist, wobei die starke Affinität zwischen Biotin und Avidin bewirkt, dass der biotinbeschichtete mAb CMRF-56 (zusammen mit den hu manen DC, an die er gebunden hat) an den avidinbeschichteten Kügelchen haften bleibt.
3. Nachdem im Gemisch vorhandene unerwünschte Zellen weggewaschen wurden, werden abgefangene aktivierte humane DC durch leichtes Schütteln aus der Säule entfernt und stehen für die Verwendung zur Verfügung.

Variationen über dieses Thema unter Verwendung des mAb CMRF-56 als primären Antikörper (zur Bindung an aktivierte DC) und eines biotinylierten sekundären Antikörpers (zur Bindung an den mAb CMRF-56) können ebenfalls eingesetzt werden.
Man wird sich darüber im Klaren sein, dass die Probe des humanen peripheren Bluts vor dem Mischen mit dem mAb CMRF-56 gemäß der obigen Vorschrift so behandelt werden sollte, dass gewährleistet ist, dass die DC, die die Probe enthält, aktiviert sind. Dies kann leicht zum Beispiel durch Inkubation der Probe über Nacht erreicht werden.
Zur Verwendung in der obigen Vorschrift kann der mAb CMRF-56 nach einem von mehreren herkömmlichen Verfahren biotinyliert werden. Zum Beispiel kann das Biotinylierungsverfahren von Berenson et al.²⁹ eingesetzt werden.
Ein möglicher und bevorzugter vorbereitender Schritt bei den oben skizzierten Verfahren ist die Anreicherung von DC in der Probe durch Gradientenzentrifugation^25–27. Während bei diesem wahlfreien Anreicherungsschritt jedes geeignete bekannte Gradientenmedium (wie Albumin oder Metrizamid) eingesetzt werden kann, wird jedoch vorzugsweise ein Nycodenz-Medium (Nycomed Pharma, Oslo, Norwegen) in Bezug auf 16 Stunden lang kultivierte, an T-Lymphocyten abgereicherte mononukleäre Zellen des peripheren Bluts verwendet²⁸. Die Anmelderin fand heraus, dass die Verwendung dieses Gradienten zuverlässig eine Population von Zellen geringer Dichte ergibt, die in hohem Maße an DC angereichert ist.
Der Fachmann wird sich darüber im Klaren sein, dass es außer der Avidin-Biotin-Immunoaffinitätschromatographie noch zahlreiche andere Mittel zur Immunselektion von dendritischen Zellen gibt. Dazu gehören unter anderem die Immunselektion unter Verwendung von Magnetkügelchen, Ferrofluiden, Tauchstäbchen, Petri-Schalen und eine große Vielzahl anderer fester Phasen, die so derivatisiert werden können, dass sie mit mAb CMRF-56 markierte DC spezifisch binden.
Sobald sie nach dem obigen oder irgendeinem anderen geeigneten verfahren gereinigt/konzentriert wurden, können die aktivierten DC in Forschungs- oder kommerziellen Anwendungen eingesetzt werden. Eine solche potentiell kommerzielle Anwendung für aktivierte DC ist die Verwendung als Bestandteil einer immunpotenzierenden Zusammensetzung zusammen mit einem vor Krankheit schützenden Antigen entweder für die Prophylaxe oder für die Therapie. Vermutlich würden solche Zusammensetzungen sowohl die Geschwindigkeit als auch die Effizienz der gegen das schützende Antigen erzeugten Immunantwort erhöhen.
Dem Fachmann auf diesem Gebiet werden selbstverständlich noch andere Anwendungen der aktivierten DC einfallen.
Eine weitere, in betracht gezogene Anwendung des mAb CMRF-56 ist bei der Zielsteuerung von aktivierten DC bei Patienten zur Induktion einer Immunsuppression.
Man sollte sich darüber im Klaren sein, dass die obige Beschreibung nur beispielhaft ist und dass die vorliegende Erfindung nicht darauf beschränkt ist.
Hinterlegung
Das Hybridom CMRF-56 (erzeugt unter Verwendung der Myelomzelllinie NS-1) wurde hinterlegt, um eine zusätzliche Offenbarung der Erfindung vorzunehmen. Die Hinterlegung erfolgte bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, am 9. Oktober 1996. Das Hybridom CMRF-56 erhielt die ATCC-Zugriffsnummer HB 12202.
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Claims

Antikörper oder Antikörper-Bindungsfragment, das spezifisch an ein Epitop bindet, das sich auf der Oberfläche von dendritischen Zellen befindet, die spezifisch von dem Antikörper, der von der Hybridomzelllinie CMRF-56 mit der ATCC-Zugriffsnummer HB 12202 sezerniert wird, erkannt werden.
Antikörper oder Antikörperfragment gemäß Anspruch 1, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Isolierter Antikörper gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Antikörper nicht an die Aktivierungsantigene CMRF-44 und CD83 bindet.
Hybridomzelllinie CMRF-56 mit der ATCC-Zugriffsnummer HB 12202.
Monoklonaler Antikörper gemäß Anspruch 2, der von der Hybridomzelllinie CMRF-56 mit der ATCC-Zugriffsnummer HB 12202 sezerniert wird, wobei der monoklonale Antikörper spezifisch an ein Epitop auf aktivierten humanen dendritischen Zellen bindet, aber nicht an die Aktivierungsantigene CMRF-44 und CD83 bindet.
Verfahren zur Reinigung von aktivierten dendritischen Zellen aus einer Probe, die solche dendritischen Zellen enthält, die folgenden Schritte umfassend (i) In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem Antikörper oder Antikörper-Bindungsfragment gemäß einem der Ansprüche 1, 2, 3 oder 5; und (ii) Gewinnen von aktivierten dendritischen Zellen, die an den Antikörper oder das Antikörper-Bindungsfragment gebunden haben.
Verfahren zum Identifizieren von aktivierten dendritischen Zellen in einer Probe, die folgenden Schritte umfassend: (i) In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem Antikörper oder Antikörper-Bindungsfragment gemäß einem der Ansprüche 1, 2, 3 oder 5 unter Bildung eines Komplexes aus Antikörper und aktivierter dendritischer Zelle; und (ii) Nachweisen der Anwesenheit von Komplexen aus Antikörper und dendritischer Zelle.
Verfahren gemäß Anspruch 6 oder 7, wobei der Antikörper biotinyliert ist.
Reinigungssystem zur Verwendung beim Reinigen und/oder Konzentrieren von aktivierten dendritischen Zellen aus einer Probe, die solche Zellen enthält, wobei das Reinigungssystem einen Antikörper oder ein Antikörper-Bindungsfragment gemäß einem der Ansprüche 1, 2, 3 oder 5 beinhaltet.
Reinigungssystem gemäß Anspruch 9, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Reinigungssystem gemäß Anspruch 10, wobei der Antikörper biotinyliert ist.
Assaykit, das einen Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1, 2, 3 oder 5 zur Verwendung als diagnostischer Marker für aktivierte dendritische Zellen enthält.
Verwendung des Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 1, 2, 3 oder 5 zum Identifizieren von aktivierten dendritischen Zellen in einer Probe.
Verwendung des Antikörpers gemäß einem der Ansprüche 1, 2, 3 oder 5 bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren zum Identifizieren von aktivierten dendritischen Zellen.