DE69725100T2

DE69725100T2 - Verfahren und Satz zur Prüfung der Drogenempfindlichkeit von Mikroben, sowie Verfahren und Satz zur Missung der minimumhemmenden Konzentration von Mikroorganismen

Info

Publication number: DE69725100T2
Application number: DE69725100T
Authority: DE
Inventors: Noriaki Noda-shi Chiba-ken Hattori; Moto-o Noda-shi Nakajima; Keiko Noda-shi Yajitate
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1996-11-14
Filing date: 1997-11-13
Publication date: 2004-06-17
Anticipated expiration: 2017-11-14
Also published as: DE69725100D1; EP0844309A1; JP3636849B2; EP0844309B1; JPH10146199A; US5895751A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Verbesserung eines Verfahrens zum Testen mikrobieller Arzneimittel-Empfindlichkeit unter Verwendung eines herkömmlichen ATP-Verfahrens und insbesondere ein Verfahren und ein Set zum Testen mikrobieller Arzneimittel-Empfindlichkeit und ein Verfahren und ein Set zum Messen der minimalen Hemmkonzentration für Mikroorganismen, worin sehr verlässliche Evaluierungsergebnisse erhalten werden, indem eine falsche Bewertung aufgrund von Scheinresistenz von Mikroorganismen gegenüber Arzneimitteln verhindert wird. Das Verfahren zum Testen mikrobieller Arzneimittel-Empfindlichkeit ist auch ein antimikrobieller Anfälligkeitstest eines Arzneimittels.
Hintergrund der Erfindung
Das letztendliche Ziel eines Arzneimittel-Empfindlichkeitstests bei Chemotherapie ist die Bewertung der Wirksamkeit eines Arzneimittels gegen Mikroorganismen, die Infektionen auslösen (hierin im Folgenden auch als Pathogen bezeichnet), um eine geeignete Arzneimittelverabreichung zu bestimmen.
Auf der anderen Seite gibt es Fälle, in denen das Pathogen aufgrund der Verwendung einer großen Menge antiinfektiöser Wirkstoffe über einen langen Zeitraum gegen ein Arzneimittel resistent geworden ist.
In diesem Fall ist es für den Erfolg der Behandlung von Infektionen von großer Bedeutung, die Eigenschaften des betreffenden Pathogens zu ermitteln, vor allem in Bezug auf seine Arzneimittel-Empfindlichkeit oder Arzneimittel-Resistenz.
Herkömmliche Arzneimittel-Empfindlichkeitstests, wie beispielsweise das Scheibenverfahren, das Mikro-Flüssigkeitsverdünnungsverfahren (Flüssigmedium-Verdünnungsverfahren) und das Agarplatten-Verdünnungsverfahren (die hierin im Folgenden kollektiv als das herkömmliche Verfahren bezeichnet werden) bringen den Nachteil mit sich, dass, da eine Inkubationszeit von zumindest 16 bis 20 Stunden erforderlich ist, die Bewertung der Ergebnisse frühestens einen Tag nach Beginn der Untersuchung abgeschlossen werden kann, obwohl diese Verfahren sehr verlässliche Ergebnisse liefern.
Unter diesen Umständen wächst die Nachfrage nach einem Verfahren zum Testen von mikrobieller Arzneimittel-Resistenz, das rascher durchgeführt werden kann.
Herkömmlicherweise ist ein Verfahren zum Bewerten der Arzneimittel-Resistenz durch 3- bis 5-stündiges Kultivieren eines Mikroorganismus in einem das Arzneimittel enthaltenden Medium und Vergleichen der Menge an ATP im Mikroorganismus und der Menge an ATP im Mikroorganismus, der separat in einem Medium kultiviert wurde, das kein Arzneimittel enthielt, als Verfahren zum Testen mikrobieller Arzneimittel-Resistenz bekannt, dessen Bewertung rascher abgeschlossen werden kann (hierin im Folgenden als Verfahren zum Testen mikrobieller Arzneimittel-Empfindlichkeit unter Verwendung des herkömmlichen ATP-Verfahrens bezeichnet) (Japanische Patentanmeldung Veröffentlichung Nr. 370100/92).
Dieses Verfahren nach dem Stand der Technik basiert auf der Verwendung eines Luciferin-Luciferase-Systems als Lumineszenzreagens zur Messung von ATP-Werten. Das Verfahren bringt die folgenden Vorteile mit sich: die Detektionsgrenze von Mikroorganismen liegt bei 10³ CFU/ml, was eine sehr hohe Empfindlichkeit darstellt; die Proliferation und Deproliferation von Mikroorganismen kann bei einem Arzneimittel-Empfindlichkeitstest, bei dem die Menge der in das Medium inokulierten Mikroorganismen 10⁵ CFU/ml beträgt, gleich nach der Inokulation beobachtet werden; und die Kultivierungszeit kann im Vergleich zu dem herkömmlichen Verfahren stark reduziert werden (N. Hojer, L. Nilsson, S. Aosehn und A. Thore, Scand. J. Infect. Dis., Suppl. 9, 58–61 (1976) und A. Thore, L. Nilsson, N. Hojer, S. Ansehn und L. Brote, Acta Path. Microbiol. Scand. Sect. B, 86, 161–166 (1977)).
Die Ergebnisse dieses Verfahrens zum Testen mikrobieller Arzneimittel-Empfindlichkeit unter Verwendung des herkömmlichen ATP-Verfahrens sind oft widersprüchlich, d. h. es kommt zu Scheinresistenzergebnissen, wenn gramnegative Bazillen, wie beispielsweise Pseudomonas aeruginosa usw., auf ihre Resistenz gegenüber β-Lactam-Antibiotika untersucht werden (Vellend, H., S. A. Tuttle, M. Marza, L. Weinstein, G. L. Picciolo und E. W. Chappelle, NASA Technical Note (1974)).
Das heißt, das Verfahren zum Testen von Arzneimittel-Empfindlichkeit unter Verwendung des herkömmlichen ATP-Verfahrens bringt den bedeutenden Nachteil mit sich, dass aufgrund von Scheinresistenz von Mikroorganismen gegenüber Arzneimitteln falsche Ergebnisse erhalten werden, wodurch die Verlässlichkeit der Evaluierungsergebnisse verloren geht.
Wie weiter unten genauer erläutert ist, wurde davon ausgegangen, dass die Scheinresistenz beim Verfahren zum Testen von Arzneimittel-Empfindlichkeit unter Verwendung des herkömmlichen ATP-Verfahrens auf die Tatsache zurückzuführen ist, dass die untersuchten Mikroorganismen am Leben bleiben, auch wenn sie durch den Einfluss des Arzneimittels eine morphologische Transformation zu beispielsweise einem Sphäroplasten und zu Filamentformen durchlaufen.
Das heißt, diese Scheinresistenz tritt besonders häufig bei β-Lactam-Antibiotika auf, welche die Synthese von Zellwänden in einem Mikroorganismus hemmen, und wenn der Mikroorganismus in Gegenwart dieser Antibiotika kultiviert wird, überlebt der Mikroorganismus anfangs, während er beispielsweise eine morphologische Transformation zu einem Sphäroplast oder zu Filamentformen durchläuft, aber wenn die Kultivierung dann fortgesetzt wird, lysiert der Mikroorganismus schlussendlich und stirbt aufgrund des unterschiedlichen osmotischen Drucks in der Umgebung ab. Demgemäß überlebt der Mikroorganismus während einer morphologischen Transformation 3 bis 5 Stunden, und genau diesen Zeitraum erfordert das Verfahren zum Testen von mikrobieller Arzneimittel-Empfindlichkeit unter Verwendung des herkömmlichen ATP-Verfahrens, so dass das Er gebnis in diesem Fall "resistent" lauten wird, wohingegen der Mikroorganismus jedoch nach 16 bis 20 Stunden – der Zeitraum, den das herkömmliche Verfahren erfordert – abstirbt, so dass das Ergebnis in diesem Fall "empfindlich" lauten wird. Somit ergibt das Verfahren zum Testen von mikrobieller Arzneimittel-Empfindlichkeit unter Verwendung des herkömmlichen ATP-Verfahrens Scheinresistenz.
Gegenmaßnahmen gegen dieses Ergebnis der Scheinresistenz beim Verfahren zum Testen mikrobieller Arzneimittel-Empfindlichkeit unter Verwendung des herkömmlichen ATP-Verfahrens sind bekannte Verfahren, bei denen Mikroorganismen, die durch den Einfluss eines Arzneimittels morphologisch zu Formen von Filamenten, Sphäroplasten usw. transformiert werden, selektiv lysiert werden, indem ein Medium verdünnt oder ein Medium mit geringem osmotischem Druck verwendet wird (P. F. Wheat, J. G. M. Hastings und R. C. Spencer, J. Med. Microbiol. 25, 95–99 (1988) und E. G. Hornsten, L. E. Nilsson, N. Elwing und I. Lundstrom, Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 12, 171–175 (1989)).
Diese Ansätze sind zwar wirksam, wenn das Ziel ein spezifischer Mikroorganismus ist, zum Erreichen des vorliegenden Ziels des Arzneimittel-Empfindlichkeitstests, der auf ein weites Spektrum von Mikroorganismen ausgerichtet ist, sind sie jedoch nicht geeignet.
Ein Verfahren zum Messen der minimalen Hemmkonzentration unter Verwendung des herkömmlichen ATP-Verfahrens bringt außerdem den großen Nachteil mit sich, dass basierend auf dem Ergebnis der Scheinresistenz auf ähnliche Weise falsche Ergebnisse erhalten werden, wodurch die Verlässlichkeit der Evaluierungsergebnisse verloren geht.
Darüber hinaus bringt ein Verfahren zum Messen der minimalen bakteriziden Konzentration (MBK), d. h. der Mindestmenge eines Arzneimittels, bei der die Wachstumshemmwirkung des Arzneimittels auf einen Mikroorganismus auf bakterizide Weise wirkt, sowie ein Verfahren zum Messen des postantibiotischen Effekts (PAE), d. h. der Wirkung eines Arzneimittels, das, nachdem ein Mikroorganismus einige Stunden dem Arzneimittel ausgesetzt wurde, sogar in Abwesenheit des Arzneimittels weiter wirkt, ähnliche Nachteile mit.
Die Messung der MBK wird durch Kultivierung eines Mikroorganismus über Nacht in einem ein Arzneimittel enthaltendem Medium und darauffolgende Kultivierung in einem arzneimittelfreien Medium durchgeführt, um die minimale Konzentration des Arzneimittels zu bestimmen, bei der das Wachstum des Mikroorganismus nicht wieder einsetzt.
Die Messung des PAE wird durch mehrstündige (etwa 2 Stunden) Kultivierung eines Mikroorganismus in einem ein Arzneimittel enthaltenden Medium, 1000faches Verdünnen der Kultur mit einem arzneimittelfreien Medium und erneutes Kultivieren des Mikroorganismus durchgeführt, um den Zeitpunkt zu bestimmen, an dem das Wachstum des Mikroorganismus wieder einsetzt.
Zusammenfassung der Erfindung
Das Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zum Testen mikrobieller Arzneimittel-Resistenz und eines Verfahrens zum Messen der minimalen Hemmkonzentration für einen Mikroorganismus durch das ATP-Verfahren, das für ein weites Spektrum mikrobieller Spezies geeignet ist, zu keinen falschen Ergebnissen aufgrund von Scheinresistenz von Mikroorganismen führt und sehr verlässliche Evaluierungsergebnisse erzielt.
Als Ergebnis ihrer Anstrengungen, die oben genannten Probleme zu lösen, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung herausgefunden, dass EDTA (Chelatbildner), Triton X-100, Tween 20, Tween 40, ANHITOL (oberflächenaktives Mittel), 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol, 2-Amino-2-methyl-1-propanol, Ethylamin und Ethanolamin (Amine) einen Mikroorganismus, der durch den Einfluss eines Arzneimittels morphologisch zu einem Sphäroplast und zu Filamentformen transformiert ist, selektiv lysieren können, um so ATP herauszulösen.
Das eluierte ATP und anderes Hintergrund-ATP von nicht-mikrobiellen Materialien werden entfernt, und dann wird die verbleibende Menge an ATP im Mikroorganismus im Medium mit der Menge an ATP im Mikroorganismus, der separat in einem arzneimittelfreien Medium kultiviert wurde, verglichen, so dass eine falsche Bewertung aufgrund von Scheinresistenz von Mikroorganismen gegenüber einem Arzneimittel verhindert wird und verlässliche Ergebnisse erzielt werden. Von diesen Erkenntnissen ausgehend entwickelten die Erfinder die vorliegende Erfindung.
Das heißt, die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Testen mikrobieller Arzneimittel-Empfindlichkeit, wie es in den Ansprüchen 1 und 2 definiert ist.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung ein Set zum Testen mikrobieller Arzneimittel-Empfindlichkeit, wie es in Anspruch 4 definiert ist.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Messen der minimalen Hemmkonzentration für einen Mikroorganismus, wie es in Anspruch 3 definiert ist.
Kurzbeschreibung der Abbildungen
1 ist eine Lichtmikroskopaufnahme (Vergrößerung: 100fach), welche die Form eines Mikroorganismus zeigt, der 3 Stunden lang in einem Medium mit dem Antibiotikum PIPC kultiviert wurde. Die Zellen, dünn und lang gemacht durch den Einfluss des Antibiotikums, wurden nahe der Mitte beobachtet.
2 ist eine Lichtmikroskopaufnahme (Vergrößerung: 100fach), welche die Form eines Mikroorganismus zeigt, der 3 Stunden lang in einem Kontrollmedium kultiviert wurde, das kein Antibiotikum PIPC enthielt. Zu sehen sind die Mikroorganismen mit normaler Form (mit einer elliptischen Zelle oder 2 verbundenen Zellen), die nicht mit dem Antibiotikum behandelt wurden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Im ersten Schritt der vorliegenden Erfindung wird ein zu untersuchender Mikroorganismus in ein Medium, das ein Arzneimittel enthält, inokuliert und kultiviert.
Die hierin verwendeten Arzneimittel können jedes beliebige Arzneimittel sein, dass für einen mikrobiellen Arzneimittel-Empfindlichkeitstest für herkömmliche Mikroorganismen geeignet ist, beispielsweise Antibiotika, antibakterielle Wirkstoffe, Wirkstoffe gegen Pilzbefall usw.
Je nach den Kombinationen dieser Mikroorganismen mit Arzneimitteln gibt es Fälle, bei denen, während die Ergebnisse des herkömmlichen Verfahrens arzneimittelempfindlich sind, die Ergebnisse des Verfahrens zum Testen mikrobieller Arzneimittel-Empfindlichkeit unter Verwendung des herkömmlichen ATP-Verfahrens gegensätzliche Ergebnisse liefern (Scheinresistenz), so dass die Evaluierungsergebnisse unterschiedlich sein können.
Das Verfahren zum Testen mikrobieller Arzneimittel-Empfindlichkeit gemäß vorliegender Erfindung erhöht die Anzahl der Fälle, bei denen sich die Evaluierungsergebnisse zwischen dem herkömmlichen Verfahren und dem Verfahren zum Testen mikrobieller Arzneimittel-Empfindlichkeit unter Verwendung des herkömmlichen ATP-Verfahrens unterscheiden.
Die Wirkung der vorliegenden Erfindung ist besonders stark, wenn β-Lactam-Antibiotika verwendet werden, und somit sind β-Lactam-Antibiotika für die vorliegenden Erfindung besonders zu bevorzugen.
Das Medium kann ein festes, flüssiges oder halbflüssiges (Paste) Nährmedium sein, das sich für das Wachstum und die Vermehrung der zu untersuchenden Mikroorganismen eignet.
Das Medium kann jedes beliebige natürliche, synthetische oder halbsynthetische Medium sein.
Ein Mikroorganismus wird bei einer Temperatur, für eine Zeitraum und bei einem pH kultiviert, die für das Wachstum des zu untersuchenden Mikroorganismus geeignet sind, vorzugsweise bei 15 bis 50°C, 30 Minuten bis 30 Tage lang und bei einem pH von 4 bis 10.
Die zu untersuchenden Mikroorganismen, auf welche die vorliegende Erfindung angewandt wird, umfassen beliebige Mikroorganismen, wie beispielsweise Bakterien, Hefe, Pilze, Basidiomyceten und Tuberkelbazillen usw.
Das Verfahren zum Testen mikrobieller Arzneimittel-Empfindlichkeit von Tuberkelbazillen dauerte bisher 2 bis 3 Monate, aber mit der vorliegenden Erfindung kann der Test in etwa 30 Tagen durchgeführt werden.
Die Wirkung der vorliegenden Erfindung ist besonders stark, wenn die zu untersuchenden Mikroorganismen (beispielsweise Gram-negative Bazillen, wie z. B. Pseudomonas aeruginosa usw.) im herkömmlichen Verfahren als empfindlich bewertet werden, während das Verfahren zum Testen von Arzneimittel-Empfindlichkeit unter Verwendung des herkömmlichen ATP-Verfahrens sie häufig als resistent ausweist (Scheinresistenz), und daher ist Pseudomonas aeruginosa besonders bevorzugt.
Pseudomonas aeruginosa ist ein Mikroorganismus, der bekannt dafür ist, dass er Blutvergiftung, Meningitis, Bronchitis, Pneumonie, Infektionen nach Unfällen (ausgelöst und Verbrennungen verschiedener Grade, Druckgeschwüre usw.) auslöst, und es ist sehr wichtig, die Arzneimittel-Empfindlichkeit oder -Resistenz dieses Mikroorganismus in einem frühen Stadium zu bestimmen, um solche Infektionen zu behandeln.
Wenn die zu untersuchenden Mikroorganismen in ein Medium, das ein Arzneimittel enthält, inokuliert und darin kultiviert werden, durchlaufen manche Mikroorganismen eine morphologische Transformation zu beispielsweise Filament- und Sphäroplastformen.
Das heißt, die Mikroorganismen sind im Medium als Gemisch aus transformierten Formen und normalen Formen vorhanden.
Dann werden die durch den Einfluss eines Arzneimittels transformierten Formen der Mikroorganismen selektiv lysiert, und das erste ATP-Elutionsmittel zum Eluieren von ATP und das ATP-Deletionsmittel werden zum Medium zugesetzt, so dass das eluierte ATP und anderes Hintergrund-ATP, das von nicht-mikrobiellen Materialien herrührt, entfernt werden.
Das erste ATP-Elutionsmittel in der vorliegenden Erfindung ist ein Elutionsmittel, das eine Elution von ATP aus Mikroorganismen auslöst, deren Formen transformiert wurden, jedoch keine Elution von ATP aus Mikroorganismen, deren Formen nicht transformiert wurden, wobei Beispiele zumindest aus einem Chelatbildner, einem oberflächenaktiven Mittel und Amin ausgewählt sind.
Davon ist der Chelatbildner zumindest ein aus Ethylendiamintetraessigsäure, Nitrilotriessigsäure, Bis-(O-aminophenoxy)-ethan-N,N,N',N'-tetraessigsäure, Ethylenglykolbis-(βaminoethylether)N,N,N',N'-tetraessigsäure, trans-1,2-Diaminocyclohexantetraessigsäure, Diethylentriaminpentaessigsäure, Zitronensäure, Arginin, Hypoxanthin, 4,5-Dihydroxybenzol-1,3-disulfonsäure, Natriumphosphatglas und Verbindungen vom Kronenether-Typ sowie aus Derivaten und Vorläufern davon ausgewählter.
Diese werden vorzugsweise in einer Menge von 0,5 bis 50 mM eingesetzt.
Darüber hinaus ist das oberflächenaktive Mittel zumindest ein aus nichtionischen oberflächenaktiven Mitteln, wie beispielsweise Triton X-100, Tween 20, Tween 40 usw., anionischen oberflächenaktiven Mitteln und kationischen oberflächenaktiven Mitteln sowie zwitterionischen oberflächenaktiven Mitteln, wie beispielsweise ANHITOL usw., ausgewähltes.
Diese werden vorzugsweise in den folgenden Konzentrationen eingesetzt:
TRITON X-100 (nichtionisches oberflächenaktives Mittel): 0,0005 bis 0,05 %;
Tween 20 (nichtionisch): 0,01 bis 0,5 %;
Tween 40 (nichtionisch): 0,01 bis 0,5 %; und
ANHITOL (zwitterionisches oberflächenaktives Mittel): 0,002 bis 0,2 %.
Das Amin ist zumindest ein aus 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol, 2-Amino-2-methyl-1-propanol, Ethylamin, Ethanolamin und Analogen und Derivaten davon ausgewähltes.
Davon sind 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol und 2-Amino-2-methyl-1-propanol zu bevorzugen.
Diese werden vorzugsweise in einem Bereich von 0,01 bis 5 % verwendet.
Durch Verwendung einer geeigneten Arzneimittelkonzentration, die je nach Art des verwendeten Mediums, Mikroorganismus und der Arzneimittel bestimmt wird, kann das erste ATP-Elutionsmittel den morphologisch transformierten Mikroorganismus selektiv lysieren, um ATP aus dem Mikroorganismus zu eluieren.
Dann wird das ATP-Deletionsmittel zu diesem Medium zugesetzt, so dass das aus dem Mikroorganismus eluierte ATP und anderes Hintergrund-ATP, das von nichtmikrobiellen Materialien herrührt, entfernt werden.
Das ATP-Deletionsmittel kann ein beliebiges Enzym sein, das ATP zersetzt, wie beispielsweise Adenosinnucleotid-Deaminase, ATPase, Adenosinphosphat-Deaminase, Apyrase, basische Phosphatase, saure Phosphatase, Hexokinase, Adenosintriphosphatase usw.
Diese können in Kombination eingesetzt werden.
Das Mittel, das in ausreichender Menge vorliegt und für die Deletion geeignete Temperatur- und Zeitbedingungen aufweist, wird so verwendet, dass das aus dem Mikroorganismus eluierte ATP und anderes Hintergrund-ATP, das von nichtmikrobiellen Materialien herrührt, vollständig entfernt werden kann, während der darauf folgende Schritt des Messens der Lumineszenz nicht negativ beeinträchtigt wird.
Wenn beispielsweise Adenosinnucleotid-Deaminase verwendet werden soll, wird sie vorzugsweise in einer Menge von 0,03 bis 3 U/ml zugesetzt und bei 15 bis 50°C 1 bis 60 Minuten lang umgesetzt.
Dann wird die Menge an ATP im Mikroorganismus, die im Medium verbleibt, mit der Menge an ATP in der Kontrolle, d. h. in Mikroorganismen, die in einem Medium kultiviert wurden, dass kein Arzneimittel enthielt, und auf dieselbe Weise wie oben beschrieben behandelt wurde, verglichen, um die Arzneimittel-Empfindlichkeit der Mikroorganismen zu bestimmen.
Eine Messung der Menge an ATP in den betreffenden Mikroorganismen kann durchgeführt werden, indem das zweite ATP-Elutionsmittel auf den Mikroorganismus wirken gelassen wird, um ATP aus dem Mikroorganismus zu extrahieren und nach dem herkömmlichen Verfahren zum Messen von ATP zu messen.
Das zweite ATP-Elutionsmittel ist ein Elutionsmittel zum Eluieren von ATP aus dem betreffenden Mikroorganismus, dessen Form normal ist, wobei Beispiele herkömmliche ATP-Elutionsmittel, wie beispielsweise oberflächenaktive Mittel, insbesondere quaternäre Ammoniumsalze, wie z. B. Benzethoniumchlorid, Benzalkoniumchlorid usw., umfassen.
Das Verfahren zum Messen von ATP umfasst (1) ein Verfahren zur ATP-Bestimmung, bei dem ein ATP-Messreagens (hierin im Folgenden als Luciferin-Luciferase-System-Lumineszenzreagens bezeichnet), das aus Mg²⁺, Luciferin (Lumineszenzelement) und Luciferase (lumineszentes Enzym) besteht, auf eine Probe einwirken gelassen wird und dann die abgegebenen Biolumineszenz quantitativ bestimmt wird (siehe Method of Enzymatic Analysis, Bd. 7, S. 357 (1985)), (2) ein Verfahren zum Messen von ATP, bei dem Hexokinase in einer Probe in Gegenwart von Glucose auf ATP einwirken gelassen wird, um Glucose-6-phosphat zu bilden, und dann in Gegenwart von NADP eine Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase auf das Glucose-6-phosphat einwirken gelassen wird, wonach das Absorptionsvermögen des gebildeten NADPH bei 340 nm gemessen wird (siehe Method of Enzymatic Analysis, Bd. 7, S. 346 (1985)), (3) ein Verfahren zum Messen von ATP durch Amplifikation der Reaktion zur Bildung von Glucose-6-phosphat aus D-Glucose unter Verwendung einer Kombination von Hexokinase und Pyruvat-Kinase, wonach ATP unter Verwendung von 1-Methoxy-5-phenazinmethylsulfat und Isoluminol ATP in Bezug auf seine Lumineszenz quantifiziert wird (siehe Japanische Patentanmeldung Veröffentlichung Nr. 23900/89), und (4) ein Verfahren zum Messen von ATP durch Aufspalten von ATP in ADP und Phosphorsäure mit ATPase, typischerweise Adenosintriphosphatase, wonach die resultierende Phosphorsäure mit Molybdänsäure umgesetzt wird, um Phosphomolybdänsäure zu bilden, und die Phosphomolybdänsäure mit Ascorbinsäure umgesetzt wird, um schließlich den Grad der Blaufärbung zu messen, der von dem durch Reduktion gebildeten Molybdänblau herrührt (siehe Japanische Patentanmeldung Veröffentlichung Nr. 360700/92).
Von diesen Verfahren ist das Verfahren zur Bestimmung von ATP durch Wirkenlassen des Luciferin-Luciferase-Systems als Lumineszenzreagens auf ATP und quantitativen Bestimmung der abgegebenen Biolumineszenz zu bevorzugen, weil die Messung einfach und rasch durchgeführt werden kann und genaue und verlässliche Messergebnisse liefert.
Um die oben genannte Lumineszenzreaktion gleichmäßig durchzuführen, kann Albumin, Cyclodextrin, ein Puffermittel, ein Chelatbildner usw. zugesetzt werden.
Als Luciferin-Luciferase-System als Lumineszenzreagens kann jedes System verwendet werden, in dem ATP für die Lumineszenz erforderlich ist; beispielsweise können Systeme von Glühwürmchen, UMIHOTARU, RACHIA, Leuchtwürmern, UMISHIITAKE usw. verwendet werden; zu bevorzugen sind jedoch jene von Glühwürmchen und von klonierten Mikroorganismen.
Ein Reagens zur Bestimmung von ATP in Bezug auf Lumineszenz unter Verwendung des Luciferin-Luciferase-Systems als Lumineszenzreagens und ein Gerät zur Messung der Lumineszenz sind im Handel erhältlich, und solch ein im Handel erhältliches Set und Gerät können zur Bestimmung von ATP im Mikroorganismus durch Lumineszenz verwendet werden, um die vorliegende Erfindung auszuführen.
Ein Beispiel des Luciferin-Luciferase-Systems als Lumineszenzreagens (ATP-Messlösung) lautet wie folgt: 10 mM Magnesiumsulfat (Mg-Ion), 0,30 mM D-Luciferin (Lumineszenzelement), 1,0 mM EDTA (Stabilisator), 1,0 mM Dithiothreitol (Stabilisator), 0,51 mg/ml Luciola-cruciata-Luciferase (lumineszentes Enzym) und 0,2 % Rinderserumalbumin (BSA) (Stabilisator) in 50 mM HEPES-Puffer, pH 7,8 (siehe S. 846 in Bunseki Kagaku 44, Nr. 10, 845–851 (1955)).
ATP in durch den Einfluss eines Arzneimittels morphologisch transformierten Mikroorganismen sowie anderes Hintergrund-ATP wird mithilfe des ATP-Deletionsmittels gemeinsam mit dem ersten ATP-Elutionsmittel entfernt; dann wird ATP mit dem zweiten ATP-Elutionsmittel aus den verbleibenden Mikroorganismen eluiert, und ihre Menge wird unter Verwendung des Luciferin-Luciferase-Systems als Lumineszenzreagens be stimmt; dann wird die so bestimmte Menge an ATP (Lumineszenz) mit der Menge an ATP (Lumineszenz) in der Kontrolle, d. h. Mikroorganismen, die separat in einem arzneimittelfreien Medium kultiviert und auf dieselbe Weise wie oben behandelt wurden, verglichen, wodurch die Empfindlichkeit des Mikroorganismus gegenüber dem jeweiligen Arzneimittel evaluiert wird.
Beim Vergleich mit der Kontrolle wird der Mikroorganismus mit einer bedeutenden ATP-Reduktion als empfindlich bewertet, und der Mikroorganismus mit einer ähnlichen Menge an ATP wird als resistent bewertet.
Gemäß vorliegender Erfindung kann ein Verfahren und ein Set zum Testen mikrobieller Arzneimittel-Resistenz und ein Verfahren und ein Set zum Messen der minimalen Hemmkonzentration für einen Mikroorganismus bereitgestellt werden, durch das verlässliche Evaluierungsergebnisse erhalten werden, indem eine falsche Bewertung durch Scheinresistenz von Mikroorganismen gegenüber einem Arzneimittel verhindert wird.
Außerdem kann gemäß vorliegender Erfindung ein Verfahren zum Messen der minimalen bakteriziden Konzentration (MBK) eines Arzneimittels sowie ein Verfahren zum Messen des postantibiotischen Effekts (PAE) eines Arzneimittels, ein Effekt, der in Abwesenheit des Arzneimittels weiter wirkt, nachdem ein Mikroorganismus einige Stunden dem Arzneimittel ausgesetzt wurde, bereitgestellt werden.
Beispiele
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf die folgenden Versuchsbeispiele und Ausführungsformen im Detail erläutert.
Zunächst folgt ein Beispiel für in den Versuchsbeispielen und Ausführungsformen verwendete zu untersuchende Mikroorganismen, Medien und Arzneimittel.

(1) Medium: Eine mit Kationen ergänzte Mueller-Hinton-Bouillon (CSMHB) wurde hergestellt, indem Ca²⁺ und Mg²⁺ in einer Endkonzentration von 50 mg/ml bzw. 25 mg/ml zu einer Mueller-Hinton-Bouillon (Difco) zugesetzt wurden.
(2) Zu untersuchende Mikroorganismen: Eine Mikrobensuspension wurde erhalten, indem Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 über Nacht in dem oben genannten Medium kultiviert und dann in physiologischer Kochsalzlösung bei 5 × 10⁶ CFU/ml suspendiert wurde.
(3) Arzneimittel: Als Antibiotika bekannte Verbindungen. Ihre Abkürzungen und allgemeinen Bezeichnungen sind im Folgenden angeführt: FOM: Fosfomycin ASPC: Aspoxicillin PIPC: Piperacillin CEZ: Cefazolin GM: Gentamicin TOB: Tobramycin EM: Erythromycin ST: Sulfamethoxazoltrimethoprim S/C: Sulbactamcefoperazon AZT: Aztreonam I/C: Imipenemcilastatin CAZ: Ceftazidim CP: Chloramphenicol

Beispiel 1
Elution von ATP aus dem während Kultivierung in Gegenwart des β-Lactam-Antibiotikums PIPC morphologisch transformierten (in Filamentformen) Mikroorganismus Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.
Versuchsverfahren
Der Mikroorganismus Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 wurde in einer Endkonzentration von 5 × 10⁵ CFU/ml in 5 ml flüssiges Medium CSMNB, welches das Antibiotikum PIPC in einer Menge von 5 μg/ml enthielt (das 1,5fache der minimalen Hemmkonzentration (MHK)), inokuliert und 3 Stunden lang bei 37°C kultiviert, wodurch eine Kulturflüssigkeit (a) erhalten wurde, die den morphologisch transformierten Mikroorganismus enthielt.
Eine Lichtmikroskopaufnahme der Kulturflüssigkeit (a) (Vergrößerung: 100fach) ist in 1 zu sehen.
1 zeigt die Form des 3 Stunden lang in dem das Antibiotikum PIPC enthaltenden Medium kultivierten Mikroorganismus. Zellen, dünn und lang (Filamentform) gemacht durch den Einfluss des Antibiotikums, wurden nahe der Mitte beobachtet.
Die oben erhaltene Kulturflüssigkeit (a) wurde in 5 Gruppen geteilt (100 μl/Gruppe), und die ersten Elutionsmittel A bis D (Beschreibung folgt) wurden jeweils in 25 mM Tricin (pH 7,75) gelöst und den Gruppen 1 bis 4 zugesetzt; zu Gruppe 5 wurden nur 25 mM Tricin (pH 7,75) als Puffer zugesetzt, wonach das Ganze 30 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen wurde.
Arten und Konzentrationen der ersten ATP-Elutionsmittel

A: 5 mM EDTA (Chelatbildner)
B: 0,005% Triton X-100 (nichtionisches oberflächenaktives Mittel)
C: 0,02% ANHITOL (zwitterionisches oberflächenaktives Mittel)
D: 0,2% 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol (Amin)

Dann wurden 50 μl Luciferin-Luciferase-System als Lumineszenzreagens (Lucifer LU Plus^TM, Kikkoman Corporation) zugesetzt und sogleich für einen Gesamtzeitraum von 3 Sekunden unter Verwendung von Lumat LB9501 (Berthold Co., Ltd.) auf Lumineszenz gemessen.
Die oben genannte Lumineszenz wird als Summe von ATP, das mithilfe des ersten ATP-Elutionsmittels aus dem morphologisch transformierten Mikroorganismus eluiert wurde, und dem Hintergrund-ATP, das ursprünglich in der Kultur vorhanden ist, gemessen.
Die Messergebnisse für die Kulturflüssigkeit (a) sind in Tabelle 1 als Werte bezogen auf die Lumineszenz (als 100) in Gruppe 5, bei welcher der Mikroorganismus in 25 mM Tricin (pH 7,75), das kein ATP-Elutionsmittel enthielt, kultiviert wurde, zusammengefasst.
Die Ergebnisse in Tabelle 1 zeigen, dass die Konzentrationen von ATP in den Gruppen 1 bis 4, denen die erste ATP-Elution zugesetzt wurde, zumindest doppelt so hoch waren wie die der Gruppe 5, zu der die erste ATP-Elution nicht zugesetzt wurde, wodurch sich zeigt, dass ATP aus den morphologisch transformierten Mikroorganismen eluiert wurde.
Vergleichsbeispiel 1
Zum Vergleich wurde eine Kulturflüssigkeit (b), die den Mikroorganismus in normaler Form enthielt, als Kontrolle auf dieselbe Weise hergestellt wie oben, mit der Ausnahme, dass 5 ml flüssiges Medium CSMHB, das kein PIPC-Antibiotikum enthielt, anstelle der 5 ml des oben genannten flüssigen Mediums CSMHB, das PIPC-Antibiotikum enthielt, verwendet wurden.
Die Mikroskopaufnahme (Vergrößerung: 100fach) ist in 2 zu sehen.
2 zeigt eine Form des Mikroorganismus, der 3 Stunden lang in dem Kontrollmedium, das kein PIPC-Antibiotikum enthielt, kultiviert worden war. Die Mikroorganismen in normaler Form (mit einer elliptischen Zelle oder 2 verbundenen Zellen), die nicht mit dem Antibiotikum behandelt wurden, sind erkennbar.
Dann wurde die Kulturflüssigkeit (b) in 5 Gruppen (100 μl/Gruppe) geteilt, und die ersten ATP-Elutionsmittel A bis D wurden jeweils in 25 mM Tricin (pH 7,75) gelöst und den Gruppen 1 bis 4 zugesetzt; zu Gruppe 5 wurden nur 25 mM Tricin (pH 7,75) als Puffer zugesetzt, wonach das Ganze 30 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen wurde.
Dann wurde die Lumineszenz jeder Kontrollkultur (b) gemessen.
Die Ergebnisse der Kultur (b) sind ebenfalls in Tabelle 1 zu finden.
Tabelle 1. Elution von ATP aus filamentförmigem P. aeruginosa ATCC 27853 mit einem ersten ATP-Elutionsmittel
Die Ergebnisse in Tabelle 1 zeigen, dass in der Kontrollkultur (b) die Konzentrationen von ATP in den Gruppen 1 bis 4, denen das erste ATP-Elutionsmittel zugesetzt wurde, nahezu jener der Gruppe 5 entsprechen, wodurch sich ergibt, das keine Elution von ATP aus dem normalen Mikroorganismus stattfand – auch nicht, nachdem das ATP-Elutionsmittel zugesetzt worden war.
Im Gegensatz dazu waren in der Kultuflüssigkeit (a) gemäß vorliegender Erfindung, die durch Kultivieren im arzneimittelhältigen Medium erhalten wurde, die Konzentrationen von ATP in den Gruppen 1 bis 4, denen die erste ATP-Elution zugesetzt wurde, zumindest doppelt so hoch wie jene der Gruppe 5, der kein erstes ATP-Elutionsmittel zugesetzt wurde.
Aus den obigen Erläuterungen ergibt sich, dass jedes der oben beschriebenen ersten ATP-Elutionsmittel den durch den Einfluss des Arzneimittels morphologisch transformierten Mikroorganismus selektiv lysieren und so ATP daraus eluieren kann.
Weiters versteht sich, dass die Wirkung von 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol besonders gut ist.
Beispiel 1: Herstellung eines Sets zum Testen mikrobieller Arzneimittel-Resistenz
25 mM Tricinpuffer, pH 7,75, der 5 mM EDTA und 0,5 % 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol enthielt, wurde als erstes ATP-Elutionsmittel für einen durch den Einfluss des Arzneimittels morphologisch transformierten Mikroorganismus hergestellt, und 25 mM Tricinpuffer, pH 7,75, der 0,3 U/ml Adenosinnucleotiddeaminase enthielt, wurde als ATP-Deletionsmittel hergestellt.
Beispiel 2: Test der Arzneimittel-Empfindlichkeit von Pseudomonas aeruginosa gegenüber β-Lactam-Antibiotika
Ein Arzneimittel enthaltendes flüssiges Medium CSMHB, dem jedes der in Tabelle 2 in "Art" unter "Arzneimittel" angeführte β-Lactam-Antibiotika in einer vorgegebenen Konzentration zugesetzt wurde, wurde in einer Menge von 100 μl/Napf auf eine 96-Napf-Mikrotiterplatte gefüllt (weiß, Dynatech Co., Ltd.).
Dann wurde eine Suspension des Mikroorganismus Pseudomonas aeruginosa ATCC 27856 aseptisch in die Platte inokuliert, und zwar in einer Menge von 10 μl/Napf (End konzentration 5 × 10⁵ CFU/ml), und die Platte wurde 3 Stunden lang bei 37°C inkubiert.
Dann wurde ein weiter unten beschriebenes Reagens, das das erste ATP-Elutionsmittel und das ATP-Deletionsmittel enthielt, in einer Menge von 50 μl/Napf der Platte zugesetzt, so dass der durch den Einfluss des Arzneimittels morphologisch transformierte Mikroorganismus selektiv lysiert wurde, wodurch ATP herauseluiert wurde, und gleichzeitig wurden das eluierte ATP und sonstiges Hintergrund-ATP im Medium entfernt.
Reagens, das das erste ATP-Elutionsmittel und das ATP-Deletionsmittel enthält

5 mM EDTA (ATP-Elutionsmittel)
0,5% 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol (ATP-Elutionsmittel)
0,3 U/ml Adenosinnucleotid-Deaminase (ATP-Deletionsmittel)
25 mM Tricin (Puffer)
pH 7,75

Nachdem die Platte 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen worden war, wurden 50 μl des zweiten ATP-Elutionsmittels (0,2 % Benzalkoniumchlorid zugesetzt).
Dann wurden 50 μl des Luciferin-Luciferase-Systems als Lumineszenzreagens (Lucifer LU Plus, gelöst in 2,5% α-Cyclodextrin) zugesetzt, und seine Lumineszenz wurde mithilfe eines Verhältnistests in einem ML3000 (Dynatech) gemessen, um die Menge an ATP im Mikroorganismus zu bestimmen.
Das oben genannte α-Cyclodextrin wurde zum Neutralisieren des zweiten ATP-Elutionsmittels verwendet.
Die Menge an ATP im Mikroorganismus der Kontrolle wurde auf dieselbe Weise bestimmt wie oben, mit der Ausnahme, dass anstelle des antibiotikahältigen CSMHB-Mediums ein antibiotikafreies CSMHB-Medium verwendet wurde.
Die mikrobielle Arzneimittel-Empfindlichkeit unter Verwendung des ATP-Verfahrens wurde durch Bestimmung des ATP-Index bewertet. Das heißt, der ATP-Index wurde verwendet, um mithilfe der folgenden Standards die mikrobielle Empfindlichkeit und Resistenz zu bestimmen.
Standards zur Bewertung der Empfindlichkeit S und der Resistenz R)

ATP-Index = (X/Y) × 100
X = Lumineszenz von antibiotikahältigem CSMHB
Y = Lumineszenz von antibiotikafreiem CSMHB
ATP-Index ≤ 40: empfindlich (S)
ATP-Index ≥ 40: resistent (R)

Vergleichsbeispiel 1: Tests auf die Empfindlichkeit des Mikroorganismus Pseudomonas aeruginosa gegenüber β-Lactam-Antibiotika durch das herkömmliche ATP-Verfahren und das herkömmliche Verfahren
Zum Vergleich wurde die Empfindlichkeit (Anfälligkeit) des Mikroorganismus Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 gegenüber β-Lactam-Antibiotika mithilfe des Arzneimittel-Empfindlichkeitstests (hierin im Folgenden auch als herkömmliches ATP-Verfahren bezeichnet), wobei das herkömmliche ATP-Verfahren verwendet wurde, und mithilfe des herkömmlichen Verfahrens, d. h. des Mikro-Flüssigkeitsverdünnungsverfahrens, bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
Die Ergebnisse des herkömmliche ATP-Verfahrens wurden erhalten, indem gleich nach einer 3-stündigen Inkubation 50 μl des ATP-Extraktionsmittels und dann 50 ml des Luciferin-Luciferase-Systems als Lumineszenzreagens zugesetzt wurden, um seine Lumineszenz zu bestimmen, und daraus wurde der ATP-Index bestimmt und evaluiert.
Die Ergebnisse des herkömmlichen Verfahrens (Mikro-Flüssigkeitsverdünnungsverfahren) wurden nach dem Standardverfahren erhalten, das durch die Japanese Society of Chemotherapie geregelt wird.
Aus den Ergebnissen in Tabelle 2 ist ersichtlich, dass die Evaluierungsergebnisse der Arzneimittel-Empfindlichkeitstests an Pseudomonas aeruginosa mithilfe des herkömmlichen ATP-Verfahrens nur bei CEZ mit jenen des herkömmlichen Verfahren übereinstimmen. Bei anderen Arzneimitteln ergab das herkömmliche ATP-Verfahren im Gegensatz zu den herkömmlichen Verfahren Resistenz (d. h. Scheinresistenz), was bedeutet, dass die Evaluierungsergebnisse des herkömmlichen ATP-Vefahrens nicht verlässlich sind.
Auf der anderen Seite stimmten die Ergebnisse des Verfahrens zum Testen mikrobieller Arzneimittel-Resistenz unter Verwendung des ATP-Verfahrens gemäß vorliegender Erfindung bei allen Arzneimitteln, einschließlich CEZ, vollständig mit jenen des herkömmlichen Verfahrens überein.
Wie aus dem oben genannten erkennbar ist, kann die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Testen mikrobieller Arzneimittel-Resistenz durch das ATP-Verfahren bereitstellen, bei dem im herkömmlichen ATP-Verfahren eine falsche Bewertung aufgrund von Scheinresistenz von Mikroorganismen gegenüber einem Arzneimittel verhindert wird, wodurch sehr verlässliche Ergebnisse erzielt werden können.
Beispiel 3: Test der Arzneimittel-Empfindlichkeit von Pseudomonas aeruginosa gegenüber anderen Antibiotika als β-Lactam-Antibiotika
Ein Test der Arzneimittel-Empfindlichkeit von Pseudomonas aeruginosa gegenüber anderen Antibiotika als β-Lactam-Antibiotika wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2 durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die in Tabelle 3 angeführten Antibiotika anstelle der β-Lactam-Antibiotika verwendet wurden.
Vergleichsbeispiele: Herkömmliches ATP-Verfahren und herkömmliches Verfahren
Zum Vergleich wurde die Resistenz von Pseudomonas aeruginosa gegenüber anderen Antibiotika als β-Lactam-Antibiotika unter Verwendung des herkömmlichen ATP-Verfah rens und des herkömmlichen Verfahrens (d. h. des Mikro-Flüssigkeitsverdünnungsverfahrens) auf dieselbe Weise wie in Vergleichsbeispiel 1 getestet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefasst.
Die Evaluierungsergebnisse des vorliegenden Verfahrens, des herkömmlichen ATP-Verfahrens und des herkömmlichen Verfahrens sind ebenfalls in Tabelle 3 zu finden. Tabelle 3. Ergebnisse von Empfindlichkeitstests an Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 gegenüber anderen Antibiotika als β-Lactam-Antibiotika

R: resistent
E: empfindlich

Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 3 erkennbar ist, lauten die Evaluierungsergebnisse des herkömmlichen Verfahrens bei allen Konzentrationen gegenüber dem Antibiotikum FOM (Fosfomycin) anders als gegenüber β-Lactam-Antibiotika empfindlich, während das entsprechende Evaluierungsergebnis des herkömmlichen ATP-Verfahrens resistent lau tet. Außerdem lautet das Evaluierungsergebnis des herkömmlichen Verfahrens bei einer Konzentration von 50 μg/ml resistent gegenüber dem Antibiotikum ST (Sulfamethoxazoltrimethoprim), während das entsprechende Evaluierungsergebnis des herkömmlichen ATP-Verfahrens empfindlich lautet. Somit ergibt sich, dass die Evaluierungsergebnisse nicht verlässlich sind. Auf der anderen Seite stimmen die Ergebnisse des Verfahrens zum Testen mikrobieller Arzneimittel-Empfindlichkeit unter Verwendung des ATP-Verfahrens gemäß vorliegender Erfindung in allen Gruppen mit jenen des herkömmlichen Verfahrens überein.
Das ATP-Verfahren gemäß vorliegender Erfindung stimmte auch bei anderen Arzneimitteln mit dem herkömmlichen Verfahren überein, bei denen das herkömmliche ATP-Verfahren ebenfalls mit dem herkömmlichen Verfahren übereinstimmte.
Die vorliegende Erfindung kann ein Verfahren zum Testen mikrobieller Arzneimittel-Empfindlichkeit von Pseudomonas aeruginosa auch gegenüber anderen Antibiotika als β-Lactam-Antibiotika bereitstellen, bei dem eine falsche Bewertung aufgrund von Scheinresistenz des Mikroorganismus gegenüber einem Arzneimittel verhindert wird, um sehr verlässliche Ergebnisse zu erzielen. Wie aus den oben genannte Ergebnissen ersichtlich ist, kann das Verfahren zum Testen mikrobieller Arzneimittel-Resistenz gemäß vorliegender Erfindung nicht nur für β-Lactam-Antibiotika eingesetzt werden, sondern auch für ein weites Spektrum anderer Arzneimittel.
Beispiel 4: Test der Arzneimittel-Empfindlichkeit von anderen Mikroorganismen als Pseudomonas aeruginosa
Andere Mikroorganismen als Pseudomonas aeruginosa, d. h. Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923 und Enterococcus faecalis ATCC 29212, wurden als zu untersuchende Mikroorganismen verwendet, und ihre Empfindlichkeit gegenüber den jeweiligen Arzneimitteln, die in Tabelle 4 zusammengefasst ist, wurde mithilfe des Verfahrens zum Testen von Arzneimittel-Empfindlichkeit unter Verwendung des herkömmlichen ATP-Verfahrens und mithilfe des Verfahrens zum Testen von Arzneimittel-Empfindlichkeit unter Verwendung des ATP-Verfahrens gemäß vorliegender Erfindung bestimmt. Eine Korrelation dieser Verfahren mit dem Mikro-Flüssigkeitsverdünnungsverfahren als herkömmliches Verfahren (Standardverfahren) wurde durch Vergleich ihrer Ergebnisse untersucht.
Die Messungen wurden auf dieselbe Weise wie in Beispiel 2 durchgeführt.
Die Evaluierungsergebnisse der jeweiligen Messverfahren sind in Tabelle 4 zusammengefasst. Tabelle 4. Ergebnisse von Empfindlichkeitstests anderer Mikroorganismen als Pseudomonas aeruginosa gegenüber Antibiotika

R: resistent
E: empfindlich

Wie aus den Ergebnissen aus Tabelle 4 ersichtlich ist, ergab das herkömmliche ATP-Verfahren Scheinresistenz gegenüber den β-Lactam-Antibiotika (Arzneimittel) PIPC, AZT und CAZ, wenn der untersuchte Mikroorganismus Escherichia coli ATCC 25922 war.
Das Verfahren gemäß vorliegender Erfindung ergab keine solche Scheinresistenz, und die Ergebnisse des Verfahrens der vorliegenden Erfindung und des herkömmlichen Verfahrens stimmten komplett überein. Das ATP-Verfahren der vorliegenden Erfindung stimmte auch mit dem herkömmlichen Verfahren überein, sogar bei den anderen Mikroorganismen, bei denen das herkömmliche ATP-Verfahren mit dem herkömmlichen Verfahren übereinstimmte.
Das heißt, die vorliegende Erfindung kann ein Verfahren zum Testen mikrobieller Arzneimittel-Empfindlichkeit mit hoher Verlässlichkeit für ein weites Spektrum an Mikroorganismen, das nicht auf Pseudomonas aeruginosa beschränkt ist, und verschiedenste Arzneimittel bereitstellen.
Beispiel 5: Set zum Messen der minimalen Hemmkonzentration für Mikroorganismen
Die folgenden Verbindungen (A) und (B) wurden in 25 mM Tricin-Puffer, pH 7,55, verwendet.

(A) Erstes Elutionsmittel für durch ein Einfluss von Arzneimitteln morphologisch transformierte Mikroorganismen: 5 mM EDTA; und 0,5% 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol.
(B) ATP-Deletionsmittel: 0,3 U/ml Adenosinphoshatdeaminase.

Beispiel 6: Messung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) für einen Mikroorganismus
Die minimale Hemmkonzentration der einzelnen in Tabelle 5 angeführten Arzneimittel für den Mikroorganismus Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 wurde mithilfe des Verfahrens gemäß vorliegender Erfindung bestimmt, und seine Übereinstimmung mit dem Mikro-Flüssigkeitsverdünnungsverfahren und dem Agarplatten-Verdünnungsverfahren als herkömmliche Verfahren (Standardverfahren) wurde untersucht.
Zweifach-Reihenverdünnungen von 100 μg/ml bis 0,1 g/ml der in Tabelle 5 angeführten Arzneimittel wurden in CSMHB hergestellt und in einer Menge von 100 μl/Napf in eine 96-Napf-Mikrotiterplatte (weiß, Dynatech Co., Ltd.) gefüllt.
Die Empfindlichkeit des Mikroorganismus Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 gegenüber den einzelnen Arzneimitteln in verschiedenen Konzentrationen wurde mithilfe des in Beispiel 2 erläuterten Verfahrens bestimmt.
Die niedrigste Arzneimittelkonzentration, bei welcher der Mikroorganismus als empfindlich bewertet wurde, wurde als minimale Hemmkonzentration für den Mikroorganismus bestimmt.
Das herkömmliche Verfahren wurde laut dem Standardverfahren, das durch die Japanese Society of Chemotherapie reguliert ist, bewertet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefasst.
Tabelle 5. Messergebnisse der maximalen Hemmkonzentration für den Mikroorganismus Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 5 ersichtlich ist, stimmten die Messwerte der minimalen Hemmkonzentration für den Mikroorganismus gemäß vorliegender Erfindung mit jenen der herkömmlichen Verfahren (Mikro-Flüssigkeitsverdünnungsverfahren und Agarplatten-Verdünnungsverfahren) überein, mit einem Messfehler von plus oder minus 2 Stufen.
Aus den obigen Erläuterungen ergibt sich, dass das Verfahren zum Messen der minimalen Hemmkonzentration für Mikroorganismen mit sehr verlässlichen Evaluierungsergebnissen gemäß vorliegender Erfindung bereitgestellt werden kann.
Zusammengefasst kann gesagt werden, dass gemäß vorliegender Erfindung ein Verfahren und ein Set zum Testen mikrobieller Arzneimittel-Resistenz und ein Verfahren und ein Set zum Messen der minimalen Hemmkonzentration für einen Mikroorganismus bereitgestellt werden, durch die sehr verlässliche Evaluierungsergebnisse erzielt werden können, indem eine falsche Bewertung aufgrund von Scheinresistenz des Mikroorganismus gegenüber einem Arzneimittel verhindert wird.
Darüber hinaus werden gemäß vorliegender Erfindung ein sehr verlässliches Verfahren zum Messen des postantibiotischen Effekts (PAE), eines Effekts, der in Abwesenheit des Arzneimittels weiter wirkt, auch nachdem ein Mikroorganismus für einen kurzen Zeitraum dem Arzneimittel ausgesetzt und dann vom Arzneimittel befreit wurde, sowie ein sehr verlässliches Verfahren zum Messen der minimalen bakteriziden Konzentration (MBK) eines Arzneimittels bereitgestellt.

Claims

Verfahren zum Testen mikrobieller Arzneimittel-Empfindlichkeit, die folgenden Schritte umfassend: (1) Einimpfen und Kultivieren eines Mikroorganismus in einem) Arzneimittel-hältiges/n Medium; (2) Zugabe eines ersten ATP-Elutionsmittels und eines ATP-Deletionsmittels zur resultierenden Kultur, worin das erste ATP-Elutionsmittel zumindest eines, ausgewählt aus der aus Chelatbildnern, oberflächenaktiven Mitteln und Aminen bestehenden Gruppe, ist und das ATP-Elutionsmittel in der Lage ist, ATP aus einem Mikroorganismus, der durch den Einfluss eines Arzneimittels morphologisch transformiert ist, nicht aber aus einem nicht morphologisch transformierten Mikroorganismus zu eluieren und worin das ATP-Deletionsmittel ein beliebiges Enzym ist, das ATP zersetzt; (3) Zugabe eines zweiten ATP-Elutionsmittels zur im obigen Schritt (2) erhaltenen Kultur und Bestimmen des eluierten ATP, worin das zweite ATP-Elutionsmittel ein quaternäres Ammoniumsalz ist und in der Lage ist, ATP aus nicht morphologisch transformierten Formen des Mikroorganimus zu eluieren; (4) Einimpfen und Kultivieren eines Mikroorganismus in einem) Kontrollmedium, das das Arzneimittel nicht enthält, und Durchführung der obigen Schritte (2) und (3), um das ATP im Mikroorganismus zu bestimmen; sowie (5) Vergleich der in den obigen Schritten (3) und (4) erhaltenen ATP-Mengen.
Verfahren zum Testen mikrobieller Arzneimittel-Empfindlichkeit nach Anspruch 1, worin das Amin 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol, 2-Amino-2-methyl-1-propanol, Ethylamin oder Ethanolamin ist.
Verfahren zum Messen der minimalen Hemmkonzentration für einen Mikroorganismus, folgende Schritte umfassend: (1) Einimpfen und Kultivieren eines Mikroorganismus in einem) Arzneimittel-hältiges/n Medium; (2) Zugabe eines ersten ATP-Elutionsmittels und eines ATP-Deletionsmittels zur resultierenden Kultur, worin das erste ATP-Elutionsmittel zumindest eines, ausgewählt aus der aus Chelatbildnern, oberflächenaktiven Mitteln und Aminen bestehenden Gruppe, ist und das erste ATP-Elutionsmittel in der Lage ist, ATP aus einem Mikroorganismus, der durch den Einfluss eines Arzneimittels morphologisch transformiert ist, nicht aber aus einem nicht morphologisch transformierten Mikroorganismus zu eluieren; (3) Zugabe eines zweiten ATP-Elutionsmittels zur im obigen Schritt (2) erhaltenen Kultur und Bestimmen des eluierten ATP, worin das zweite ATP-Elutionsmittel ein quaternäres Ammoniumsalz ist und in der Lage ist, ATP aus nicht morphologisch transformierten Formen des Mikroorganimus zu eluieren; (4) Einimpfen und Kultivieren eines Mikroorganismus in einem) Kontrollmedium, das das Arzneimittel nicht enthält, und Durchführung der obigen Schritte (2) und (3), um das ATP im Mikroorganismus zu bestimmen; sowie (5) Vergleich der in den obigen Schritten (3) und (4) erhaltenen ATP-Mengen.
Set zum Testen mikrobieller Arzneimittel-Empfindlichkeit oder zum Messen der minimalen Hemmkonzentration für einen Mikroorganismus, umfassend die Bestandteile (A) bis (D): (A) ein erstes ATP-Elutionsmittel, worin das erste ATP-Elutionsmittel zumindest eines, ausgewählt aus der aus Chelatbildnern, oberflächenaktiven Mitteln und Aminen bestehenden Gruppe, ist und das erste ATP-Elutionsmittel fähig ist, ATP aus einem Mikroorganimus, der durch den Einfluss eines Arzneimittels morphologisch transformiert ist, nicht aber aus einem nicht morphologisch transformierten Mikroorganismus zu eluieren; (B) ein ATP-Deletionsmittel; (C) ein zweites ATP-Elutionsmittel, worin das zweite ATP-Elutionsmittel ein quaternäres Ammoniumsalz ist und fähig ist, ATP aus nicht morphologisch transformierten Formen des Mikroorganismus zu eluieren; sowie (D) ein Luciferin-Luciferase-System als Lumineszenzreagens.
Verwendung eines Sets nach Anspruch 4 für ein Verfahren zum Testen der mikrobiellen Arzneimittelempfindlichkeit oder zum Messen der minimalen Hemmkonzentration eines Arzneimittels für einen Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 3.