DE69711632T2 - Methode zur dissoziation von biotin komplexen - Google Patents
Methode zur dissoziation von biotin komplexenInfo
- Publication number
- DE69711632T2 DE69711632T2 DE69711632T DE69711632T DE69711632T2 DE 69711632 T2 DE69711632 T2 DE 69711632T2 DE 69711632 T DE69711632 T DE 69711632T DE 69711632 T DE69711632 T DE 69711632T DE 69711632 T2 DE69711632 T2 DE 69711632T2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- biotin
- complex
- biotinylated
- compound
- nucleic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical class N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 title claims abstract description 216
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 111
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims abstract description 131
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims abstract description 131
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims abstract description 130
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 64
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 64
- -1 biotin compound Chemical class 0.000 claims abstract description 51
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims abstract description 16
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 68
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 51
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 49
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 49
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 claims description 32
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 31
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 31
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims description 27
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 26
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims description 20
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 claims description 19
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 claims description 19
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 18
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 claims description 16
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 13
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 12
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 claims description 10
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 8
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 7
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 6
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 claims description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 4
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 claims description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 4
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 108091006004 biotinylated proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 86
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 44
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 37
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 37
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 33
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 27
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 20
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 15
- 108010027090 biotin-streptavidin complex Proteins 0.000 description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 14
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 14
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 14
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 14
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 11
- 150000001615 biotins Chemical class 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 10
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 10
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 9
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 9
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 9
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 9
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 9
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 8
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 7
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 7
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 6
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 230000001036 exonucleolytic effect Effects 0.000 description 6
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N triammonium citrate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[NH4+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 5
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 5
- 238000001254 matrix assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrum Methods 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 5
- 108010062513 snake venom phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 5
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 5
- BRARRAHGNDUELT-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxypicolinic acid Chemical compound OC(=O)C1=NC=CC=C1O BRARRAHGNDUELT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 4
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dithiobis(6-nitrobenzoic acid) Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C(O)=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N Aniline Chemical compound NC1=CC=CC=C1 PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010086093 Mung Bean Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 2
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 2
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 229910000069 nitrogen hydride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 2
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 2
- 235000012431 wafers Nutrition 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UVGHPGOONBRLCX-NJSLBKSFSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 6-[5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoylamino]hexanoate Chemical compound C([C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1)CCCC(=O)NCCCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O UVGHPGOONBRLCX-NJSLBKSFSA-N 0.000 description 1
- LLIANSAISVOLHR-GBCQHVBFSA-N 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxidanylidene-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoic acid Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21.N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 LLIANSAISVOLHR-GBCQHVBFSA-N 0.000 description 1
- DEQPBRIACBATHE-FXQIFTODSA-N 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]-2-iminopentanoic acid Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCC(=N)C(=O)O)SC[C@@H]21 DEQPBRIACBATHE-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 238000004252 FT/ICR mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004566 IR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N N,N-bis{2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl}glycine Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BAQMYDQNMFBZNA-UHFFFAOYSA-N N-biotinyl-L-lysine Natural products N1C(=O)NC2C(CCCCC(=O)NCCCCC(N)C(O)=O)SCC21 BAQMYDQNMFBZNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 1
- 108090001050 Phosphoric Diester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004861 Phosphoric Diester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 102000009609 Pyrophosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108010009413 Pyrophosphatases Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000001745 anti-biotin effect Effects 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- BAQMYDQNMFBZNA-MNXVOIDGSA-N biocytin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)NCCCC[C@H](N)C(O)=O)SC[C@@H]21 BAQMYDQNMFBZNA-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 1
- XFLVBMBRLSCJAI-ZKWXMUAHSA-N biotin amide Chemical class N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)N)SC[C@@H]21 XFLVBMBRLSCJAI-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- 108700021042 biotin binding protein Proteins 0.000 description 1
- 102000043871 biotin binding protein Human genes 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 239000000337 buffer salt Substances 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 238000005515 capillary zone electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 150000003841 chloride salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000306 component Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000005289 controlled pore glass Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000013500 data storage Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 108010052305 exodeoxyribonuclease III Proteins 0.000 description 1
- 239000011152 fibreglass Substances 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000005040 ion trap Methods 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000001293 nucleolytic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000003998 snake venom Substances 0.000 description 1
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 1
- 238000003746 solid phase reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/6823—Release of bound markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
- Heute sind viele leistungsfähige Techniken, die sich von der molekularbiologischen Forschung herleiten, in der routinemäßigen Diagnostik oder forensischen Anwendung verwendungsreif. Hervorragende Beispiele sind die Polymerase-Kettenreaktion, PCR (Saiki et al., Science, 230, 1350-1355, 1985), basierend auf einer zyklischen, Template-gerichteten Verlängerungsreaktion von Primern; die Analyse des Restriktionsfragmentlängen- Polymophismus (Kann Y. W. and A. M. Dozy, Lancet 2: 910-912 (1978)); und die Ligase-Kettenreaktion (Barany, F. (1991) Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 88, 189- 193) zur Detektion von bekannten Punktmutationen an der Ligationsstelle von benachbarten Oligonukleotiden.
- Es erscheint in der näheren Zukunft wahrscheinlich, dass die Verwendung dieser Techniken zur Analyse von DNA sich ausweitet oder konventionelle diagnostische Verfahren, basierend beispielsweise auf der Detektion von Metaboliten, die mit Erkrankungen assoziiert sind, verdrängt.
- Gegenwärtig ist das gebräuchlichste Werkzeug zur Analyse von DNA die Auftrennung von Fragmenten durch Gelelektrophorese. Aber in vielen Fällen ist die elektrophoretische Analyse und nachfolgende Detektion der markierten Fragmente zeitaufwendiger als die Durchführung der enzymatischen Reaktion, und deshalb der zeitbestimmende Schritt.
- Techniken zur Detektion sind in der Entwicklung, die die Signalerfassung verstärken und eine automatisierte und parallele Probenbearbeitung bereitstellen, und werden wahrscheinlich zu einer kostengünstigen und zeitsparenden Probenbearbeitung in diagnostischen und forensischen Anwendungen führen. Auch große DNA-Sequenzierungsprojekte wie die Human Genome Initiative, die versuchen, Gene oder komplette Genome für Forschungs- und Diagnosezwecke zu sequenzieren, erfordern automatisierte Techniken mit einem hohen Durchsatz, um eine rechtzeitige Vollendung des Projektes sicherzustellen.
- Ein vielversprechendes Werkzeug, das zumindest einige dieser Kriterien erfüllt, ist die Analyse von DNA-Fragmenten durch Matrix Assisted Laserdesorption/Ionization Flugzeit (MALDI-TOF) Massenspektrometrie (Karas, M. und Hillenkamp, F. (1988) Anal.Chem., 60, 2299-2301).
- Das Biotin-Streptavidin System ist ein allgemein verbreitetes und nützliches Werkzeug zur Reinigung von biotinylierten Stoffen (X. Tong und L. M. Smith (1992) Anal.Chem., 64, 2672-2677), z. B. Produkten aus PCR- oder Sequenzierreaktionen. Streptavidin (und ebenso Avidin) sind bakterielle Proteine, die feste Komplexe mit Biotin bilden, einschließlich Biotin, das an andere Moleküle wie Nukleinsäuren konjugiert ist. Die Stabilität des Biotin-Streptavidin Komplexes während intensivem Waschen erlaubt die Entfernung von unspezifisch gebundenen und nicht biotinylierten Stoffen, was für den Erfolg der Analyse von Reaktionsprodukten von großer Wichtigkeit ist. Die Eigenschaften des Biotin-Streptavidin Komplexes können in Systemen verwendet werden, die eine Biotin-Bindung an Streptavidin an einem Trägermaterial und eine Immobilisierung von biotinylierten Molekülen anwenden. Die Festphase, einschließlich der komplexierten biotinylierten Moleküle, kann für die weitere Handhabung mit physikalischen Mitteln gesammelt werden, einschließlich i) Entfernung von überschüssigen Reaktionskomponenten wie Puffersalze, Enzyme oder Desoxynukleotid-Triphosphate (dNTPs) oder ii) Durchführung von enzymatischen Reaktionen wie nukleolytische Verdaue und Festphasen- Sequenzierung.
- Ein breites Spektrum von Anwendungen des Biotin-Streptavidin Systems ist bekannt und sogar Techniken, die bis jetzt noch nicht entwickelt sind, werden an dieses System angepasst werden können (siehe, z. B. Stahl et al. Nucleic Acids Research. (1988) 16, 3025-3038; Hultman et al. Nucleic Acid Res. (1989) 17, 4937-4946; Hornes et al. Genet. Anal. (1990) 7, 145-150).
- Obwohl der Biotin-Streptavidin Komplex ein Ergebnis von nicht kovalenter Bindung ist, ist die Affinität von Streptavidin für Biotin etwa eine Million Mal stärker als die der meisten Wechselwirkungen von Antikörper und Antigen. Jedoch für die Analyse von Reaktionsprodukten ist es wichtig, Bedingungen für eine effektive Dissoziation des Komplexes bereitzustellen, um die Analytenmoleküle ohne Modifikation zurück zu gewinnen.
- Gegenwärtig ist die Rückgewinnung von biotinylierten Substraten gegründet auf die Dissoziation des Biotin-Streptavidin Komplexes unter Verwendung von Substanzen wie Phenol, Harnstoff oder am meisten bevorzugt 95%igem Formamid bei Temperaturen zwischen 25 und 100ºC (Cocuzza et al. U.S. Patent No. 5,484,701, 1996).
- Aber es wurde gezeigt, dass die Verwendung von Formamid schädlich für die Kristallisation der Probe ist, einem notwendigen Verfahren für die MALDI- TOF-Analyse und für zahlreiche enzymatische Reaktionen (z. B. Reaktionen, bei denen alkalische Phosphatase verwendet wird). Darum sind Verfahren, die auf der Verwendung von Formamid basieren, nur für nachfolgende gelektrophoretische Analysen brauchbar, aber schädlich, wenn enzymatische Reaktionen durchgeführt werden sollten, die das isolierte Material einbeziehen, oder wenn andere analytische Werkzeuge angewendet werden. Der endo- oder exonukleolytische Verdau, beispielsweise von PCR-Produkten, profitiert von einem Verfahren, das die Isolierung von einzelsträngigen PCR-Produkten, die nach der Reinigung verdaut werden können, erlaubt.
- Die Gelelektrophorese, die in der DNA-Diagnostik der limitierende Faktor bezüglich Zeit und Probendurchsatz ist, wird in naher Zukunft durch effizientere Techniken ersetzt werden.
- In einem Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Dissoziation eines Komplexes, der eine Biotin-Verbindung und eine Biotin-bindende Verbindung umfasst, bereit. Das Verfahren schließt in Kontakt bringen des Komplexes mit einer wirksamen Menge an Ammoniak oder eines primären Amins unter Bedingungen, so dass der Komplex dissoziiert wird und dabei eine Biotin- Verbindung und eine Biotin-bindende Verbindung gebildet wird, ein.
- In bevorzugten Ausführungsformen wird der Komplex mit Ammoniak oder einem primären Amin bei einer Temperatur von zwischen etwa 25º und etwa 100º in Kontakt gebracht. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Biotin-Verbindung ein biotinyliertes Makromolekül. In bevorzugten Ausführungsformen ist das biotinylerte Makromolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer biotinylierten Nukleinsäuresequenz, einem biotinylierten Protein, einem biotinylierten Kohlehydrat und einem biotinylierten Lipid. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Biotin-bindende Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Avidin, Streptavidin und Derivaten davon.
- In bevorzugten Ausführungsformen, ist die Biotin-bindende Verbindung an ein Trägermaterial immobilisiert. In bevorzugten Ausführungsformen ist das Trägermaterial ein Magnetbead.
- In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen wird die Biotin- Verbindung nach dem Schritt des in Kontakt bringens von der Biotin-bindenden Verbindung getrennt. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Biotin- Verbindung nach dem Schritt des Abtrennens gereinigt. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Biotin-Verbindung mit einem Verfahren gereinigt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lyophilisierung, Präzipitation, Filtration und Dialyse.
- In bevorzugten Ausführungsformen wird der Komplex vor dem Schritt des in Kontakt bringens gereinigt.
- In anderen bevorzugten Ausführungsformen ist die Biotin-Verbindung an ein Trägermaterial immobilisiert.
- In bevorzugten Ausführungsformen wird nach der Dissoziation des Komplexes mindestes eine der Biotin-Verbindung oder Biotin-bindenden Verbindung durch Massenspektrometrie analysiert.
- In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen behält die Biotin- bindende Verbindung nach der Dissoziation des Komplexes eine Biotin-bindende Aktivität. In bevorzugten Ausführungsformen bleibt nach der Dissoziation des Komplexes der Biotin-Anteil der Biotin-Verbindung im Wesentlichen intakt.
- In besonders bevorzugten Ausführungsformen wird Ammoniak verwendet.
- In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Analyse einer biotinylierten Nukleinsäure bereit. Das Verfahren schließt die Schritte des in Kontakt bringens der biotinylierten Nukleinsäure mit einer Biotin-bindenden Verbindung, wobei ein Komplex aus biotinylierter Nukleinsäure : Biotin-bindender Verbindung gebildet wird und des in Kontakt bringens des Komplexes mit einer wirksamen Menge an Ammoniak oder eines primären Amins unter Bedingungen, so dass der Komplex dissoziiert wird, wobei eine biotinylierten Nukleinsäure und eine Biotin-bindende Verbindung freigesetzt werden; und das Analysieren der biotinylierten Nukleinsäure ein.
- In bevorzugten Ausführungsformen ist die Nukleinsäure DNA. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Biotin-bindende Verbindung immobilisiert. In bevorzugten Ausführungsformen wird die biotinylierte Nukleinsäure durch Massenspektrometrie analysiert. In bevorzugten Ausführungsformen wird Ammoniak verwendet.
- Somit stellt das betreffende Verfahren in einer Ausführungsform ein Verfahren zur Isolierung biotinylerter einzelsträngiger oder doppelsträngiger DNA aus enzymatischen Reaktionen zum Zweck der Reinigung und Probenkonditionierung dar, die von einer nachfolgenden Analyse (z. B.: Massenspektrometrie) oder weiteren enzymatischen Reaktionen gefolgt werden kann.
- Die oben genannten und weitere charakteristische Eigenschaften und Vorteile der gegenwärtigen Erfindung werden deutlicher durch die nachfolgende genaue Beschreibung und die Ansprüche.
- Fig. 1 ist eine schematische Darstellung der Reinigung von biotinylierten PCR-Produkten, wobei die Reaktion in Lösung durchgeführt wird.
- Fig. 2 ist eine schematische Darstellung von zwei verschiedenen Mitteln zur Detektion von Sanger-Sequenzierprodukten.
- Fig. 3 ist eine schematische Darstellung von verschiedenen Mitteln zur Detektion von Produkten eines PCR-Verdaus mit Einzelstrang- oder Doppelstrang-spezifischen Endo- oder Exonukleasen, um DNA- Sequenzinformation zu erstellen.
- Fig. 4 zeigt ein MALDI-TOF MS-Spektrum eines biotinylierten 20mer Oligodesoxynukleotids (SEQ ID NO: 1), immobilisiert an Streptavidin-Dynabeads und rückgewonnen unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens.
- Fig. 5 zeigt ein MALDI-TOF MS-Spektrum eines PCR-Produkts der Hepatitis B-Kernantigen codierenden DNA-Region, gereinigt mit Streptavidin- Dynabeads und rückgewonnen von den Beads unter Verwendung von Ammoniumhydroxid, wie in Beispiel 2 beschrieben.
- Fig. 6 zeigt ein Massenspektrum der A-Reaktion der Sanger- Sequenzierreaktion, gereinigt mit M-280 Streptavidin-Dynabeads.
- Fig. 7 zeigt ein Massenspektrum eines exonukleolytischen Verdaus eines 60mer PCR-Produkts.
- Fig. 8 zeigt ein Massenspektrum eines exonukleolytischen Verdaus eines an Dynabeads immobilisierten biotinylierten 25mers.
- Im Allgemeinen kennzeichnet die Erfindung ein Verfahren zur Dissoziation von Biotin-Verbindungen, einschließlich Biotin-konjugierter (biotinylierter) Kohlehydrate, Proteine, Polypeptide, Peptide und Nukleinsäuremoleküle (z. B. doppelsträngige oder einzelsträngige DNA oder RNA) von Biotin-bindenden Verbindungen, einschließlich Streptavidin- oder Avidin-Verbindungen. Einmal isoliert, kann die Biotin-Verbindung (oder die Biotin-bindende Verbindung) unter Verwendung zahlreicher Verfahren analysiert werden und/oder in weiteren enzymatischen Reaktionen eingesetzt werden.
- Der Begriff "Biotin-Verbindung", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf Biotin und Biotin-Derivate und Analoga. Somit beeinhaltet "Biotin- Verbindungen" Verbindungen so wie Biotin, Imminobiotin und kovalente oder nicht kovalente Addukte von Biotin mit anderen Anteilen. Bevorzugte Biotin- Verbindungen behalten die Fähigkeit, an Avidin oder Streptavidin oder andere Biotin-bindende Verbindungen zu binden. Beispielsweise wurde Biotin verwendet, um eine Vielzahl von Molekülen zu derivatisieren, einschließlich sowohl kleiner Moleküle (beispielsweise chelatbildende Mittel, z. B. ¹&sup8;&sup6;Re-Chelatoren konjugiert mit Biotin, siehe, z. B. U.S. Patent 5,283,342 nach Gustavson et al.) als auch großer Moleküle, einschließlich Biomoleküle (z. B. Nukleinsäuren (einschließlich DNA, RNA, DNA/RNA chimären Molekülen, Nukleinsäure-Analoga und Peptid- Nukleinsäuren), Proteine (einschließlich Enzymen und Antikörpern), Kohlehydrate, Lipide und dergleichen). Verfahren, um Biotin an andere Moleküle zu konjugieren ("Biotinylisierung") sind im Fachgebiet gut bekannt, und eine Vielzahl biotinylierender Reagenzien ist kommerziell erhältlich (z. B. von Pierce, Rockford, IL). Eine Vielzahl von verbindenden oder vernetzenden Agenzien so wie Protein A, Carbodiimid, Dimaleimid, Dithio-bis-Nitrobenzoesäure (DTNB), N- Succinyl-S-Acetyl-Thioacetat (SATA) und N-Succinimidyl-3-(2-Pyridyldithio)- Propionat (SPDP), 6-Hydrazinoncotimid (HYNIC), N&sub3;S und N&sub2;S&sub2; können in gut bekannten Verfahren zur Synthese von Biotinamid-Analoga oder Biotin- Verbindungen verwendet werden. Biotin kann zum Beispiel konjugiert werden durch DTPA unter Verwendung der bizyklischen Anhydrid-Methode von Hnatowich et al. Int. J. Appl. Radiat. Isotop. 33: 327 (1982). Außerdem können Sulfosuccinimidyl 6-(Bitinamido)-Hexanoat (NHS-LC-Biotin (welches bei Pierce gekauft werden kann), "Biocytin", ein Lysin-Konjugat des Biotins, von Nutzen sein, um Biotin-Verbindungen herzustellen wegen der Verfügbarkeit eines primären Amins. Außerdem können entsprechende Biotin-Säurechloride oder Vorläufer von Säuren mit einem Aminoderivat durch bekannte Verfahren verbunden werden. Somit ist die Präparation einer Vielzahl von Anteilen, die an eine Biotin-Verbindung konjugiert werden, möglich. Überdies kann die Biotin- Verbindung, falls gewünscht, an ein Trägermaterial konjugiert werden.
- Der Begriff "konjugiert", wie er hierin verwendet wird, bedeutet ionisch oder kovalent verknüpft oder verbunden (z. B. durch Verwendung eines derivatisierenden Reagenz).
- Der Begriff "Biotin-bindende Verbindung" bezieht sich auf eine Verbindung, die fest, aber nicht kovalent mit der Biotin-Verbindung konjugiert sein kann. Biotin-bindende Verbindungen schließen Avidin und Streptavidin, ebenso wie Derivate und Analoga von diesen ein, einschließlich Avidin oder Streptavidin konjugiert an andere Anteile (so wie andere Proteine). Bevorzugte Biotin-bindende Verbindungen schließen Avidin, Streptavidin, kovalente Addukte von Avidin und Streptavidin, und Fusionsproteine ein, die einen Bereich aufweisen, der Biotin-bindende Aktivität besitzt. In bestimmten Ausführungsformen können Anti-Biotin Antikörper als Biotin-bindende Verbindung eingesetzt werden. Die kovalente Bindung von Biotin-bindenden Verbindungen so wie Streptavidin ist gut bekannt, und einige Streptavidinkonjugierte Trägermaterialien sind kommerziell erhältlich (z. B. Dynabeads magnetische Mikrobeads, Dynal, Hamburg, Deutschland). Somit sind Biotin- bindende Verbindungen, gekoppelt an einen unlöslichen Träger, in der vorliegenden Erfindung nützlich.
- Ein "Trägermaterial" bezieht sich auf einen Träger, der aus einem festen oder unlöslichen Material sein kann (z. B. ein Material, das durch Filtration, Präzipitation, magnetischer Separation oder dergleichen von einem Reaktionsgemisch separiert werden kann). Exemplarische Trägermaterialien schließen Kügelchen (so wie Sepharose, Sephadex, Polystyrol, Polyacrylamid, Cellulose, Teflon, Glas (einschließlich Controlled-Pore-Glas), Gold oder Platin); flache Träger so wie Membranen (z. B. aus Cellulose, Nitrocellulose, Polystyrol, Polyester, Polycarbonat, Polyamid, Nylon, Glasfaser, Polydivinylidendifluorid und Teflon, Glasplatten, Metallplatten (einschließlich Gold, Platin, Silber, Kupfer und rostfreiem Stahl); Siliziumplättchen, Mikrotiterplatten und dergleichen ein. Flache Trägermaterialen können mit Vertiefungen, Rillen, Filterböden und dergleichen versehen sein, wie im Fachgebiet bekannt.
- Ein "Komplex aus Biotin-Verbindung : Biotin-bindende Verbindung" bezieht sich auf einen nicht kovalenten Komplex, gebildet durch die Bindung einer Biotin- Verbindung an eine Biotin-bindende Verbindung.
- Der Begriff "analysieren", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf die Detektion oder Charakterisierung von einem Molekül oder Anteil. Somit kann ein Molekül durch eine Vielzahl von bekannten Techniken analysiert werden, einschließlich spektrometrischer Techniken wie UV/VIS-, IR- oder NMR- Spektroskopie, Massenspektroskopie, Chromatographie, Elektrophorese oder andere im Fachgebiet bekannte Verfahren oder Kombinationen davon. "Analysieren" kann auch Verfahren wie die Sequenzierung von Nukleinsäuren beinhalten.
- Der Begriff "Ammoniak", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf NH&sub3; oder jedes Salz davon. Somit kann, abhängig vom verwendeten Lösungsmittel und dem pH des Lösungsmittels, Ammoniak als NH&sub3; vorliegen, oder kann in Form eines Ammoniumsalzes oder einer Ammoniumverbindung vorliegen. Zum Beispiel kann Ammoniak in wässriger Lösung größtenteils als Ammoniumhydroxid vorhanden sein (abhängig vom pH), aber wird hierin allgemein als "Ammoniak" bezeichnet.
- Der Begriff "primäres Amin", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Verbindung, die die Formel NH&sub2;R' oder N + H&sub3;R' besitzt, worin R' eine Alkyl- (einschließlich Cycloalkyl-), Alkenyl-, Alkinyl- oder Arylgruppe ist und unabhängig für jedes Vorkommen ausgewählt werden kann. Wenn R' eine Alkylgruppe ist, kann die Alkylgruppe 1 bis 12 Kohlenstoffatome in einer geradlinigen oder verzweigten Kette besitzen. Niedrigere Alkyle (die von 1 bis 6 Kohlenstoffatome in einer geradlinigen oder verzweigten Kette besitzen) sind bevorzugt. Eine bevorzugte Arylgruppe ist Phenyl, welches substituiert oder nicht substituiert sein kann. Exemplarische Amine schließen Methylamin und Anilin ein.
- Es wird angenommen, dass kleine Amine (z. B. solche Moleküle mit kleiner sterischer Größe, z. B. worin mindestens ein R' Wasserstoff oder eine kleine Alkylgruppe wie Methyl ist) effektiver sind als größere Amine zur Dissoziation von Komplexen aus Biotin-Verbindung : Biotin-bindender Verbindung. Somit sind Amine, bei denen jedes R' sterisch klein ist (z. B. Wasserstoff oder eine kleine Alkylgruppe wie Methyl) bevorzugt. Im Allgemeinen wird ein Amin ausgewählt werden gemäß Faktoren so wie Preis, Effizienz, Handhabbarkeit, Einfachheit der Reinigung des gewünschten Produkts und dergleichen. Ammoniak wird am meisten bevorzugt verwendet, zumindest teilweise, weil Ammoniak Biotin-Komplexe effizient spaltet und preiswert ist, sowohl als Gas oder Ammoniumhydroxid in Lösung leicht zu handhaben ist und leicht zu entfernen ist, wenn die Reaktion vollständig ist (z. B. durch Lyophilisierung). Wie nachfolgend genauer beschrieben, erlaubt die Verwendung von Ammoniak als Spaltungsreagenz eine einfache Reinigung von Biotin-Verbindungen durch Entfernung des überschüssigen Ammoniaks unter Vakuum. Somit wird in bestimmten Ausführungsformen ein Amin, das ausreichend flüchtig ist, um durch Lyophilisierung entfernt zu werden, bevorzugt. Jedoch auch andere Verfahren der Reinigung einer Biotin-Verbindung oder einer Biotin-bindenden Verbindung (oder ein Gemisch aus beiden) können angewendet werden, einschließlich beispielsweise Dialyse, Gelelektrophorese, Kapillarzonenelektrophorese, Affinitätschromatographie, Kristallisation, Säulenchromatographie (z. B. Gel- oder Ionenaustausch-Chromatographie), HPLC und dergleichen.
- Die Verfahren der Erfindung sind besonders nützlich zur Reinigung biotinylierter Verbindungen. Eine biotinylierte Verbindung kann zum Beispiel leicht von nicht biotinylierten Verbindungen getrennt werden einfach durch in Kontakt bringen eines Reaktionsgemisches mit einer immobilisierten Biotin- bindenden Verbindung, z. B. kovalent an ein Trägermaterial gebunden, gefolgt von Abtrennung und Waschen des immobilisierten Komplexes von Biotin- Verbindung und Biotin-bindender Verbindung. Das biotinylierte Molekül kann dann durch Dissoziation des Komplexes aus Biotin - Biotin-bindender Verbindung isoliert werden, gefolgt von Abtrennung der Biotin-Verbindung vom Trägermaterial. Die gereinigte biotinylierte Verbindung kann dann lyophilisiert, ferner durch konventionelle Techniken oder dergleichen gereinigt werden. Der Fachmann wird schätzen, dass eine Biotin-bindende Verbindung durch eine analoges Verfahren gereinigt werden kann, z. B. durch in Kontakt bringen eines Reaktionsgemisches, das eine Biotin-bindende Verbindung enthält, mit einer immobilisierten Biotin-Verbindung, um einem Komplex zu bilden, gefolgt von Reinigung und nachfolgender Dissoziation des Komplexes.
- Im Fall von biotinylierten Nukleinsäuren kann das Biotin-Streptavidin System zur Isolierung von entweder einzelsträngigen oder doppelsträngigen Nukleinsäuren, z. B. DNA, verwendet werden. Eine bevorzugte Anwendung ist die Isolierung eines doppelsträngigen PCR-Produkts, die nachfolgende Entfernung des nicht biotinylierten Strangs und nachgeschaltete Verarbeitung der Einzelstränge (Mitchell, L. G., et al. (1994) "Advances in Biomagnetic Separation," Eaton Publishing, Natick, MA, USA, Seite 31-48). Gegenwärtig wird die Denaturierung von doppelsträngigen Produkten an Streptavidin- Dynabeads bevorzugt durchgeführt unter Verwendung von 0,1 M NaOH. Andere Anwendungen schließen die Reinigung von PCR- und LCR-Produkten genauso wie die Reinigung von DNA-Sequenzierprodukten ein (Jurinke, C.; et al., (1996) Anal Biochemistry, 237, im Druck).
- Die genaue Wirkungsweise von Ammoniak und anderen primären Aminen bei der Biotin-Dekomplexierung ist nicht bekannt. Man nimmt an, dass der pH des Reaktionssystems wichtig ist, um Biotin und Biotin-bindende Verbindungen effektiv in einer vernünftigen Zeit zu dekomplexieren. Jedoch ist bekannt, dass Biotin-Komplexe stabil sind bis hinauf zu einem relativ hohen pH in Abwesenheit von Ammoniak. Insbesondere ist 0,1 M Natriumhydroxidlösung (bei einem pH von etwa 13) weniger effektiv bei der Spaltung von Komplexen Biotin- Verbindung : Biotin-bindende Verbindung als 25%ige Ammoniumhydroxidlösung. Ammoniak ist bekannt als ein starker Wasserstoffbrücken Donor-Akzeptor. Ohne den Wunsch, an irgendeine Theorie gebunden zu werden, wird angenommen, dass die Ammoniakmoleküle klein genug sind, um in den Biotin-Komplex zu diffundieren und die Bindungen (z. B. Wasserstoffbrücken) des Biotin-Anteils mit einer Biotin-bindenden Verbindung zu zerbrechen. Die Biotin-Verbindung behält nach der Behandlung mit Ammoniak die Fähigkeit, an eine Biotin-bindende Verbindung zu binden und der Biotin-Anteil bleibt im Wesentlichen intakt.
- Somit kann der pH des Reaktionsgemisches die Rate der Komplex- Dissoziation beeinflussen. In bevorzugten Ausführungsformen ist der pH des Reaktionsgemisches im Bereich von etwa 7,0 bis etwa 14,0, mehr bevorzugt von etwa 8,0 bis etwa 13,0.
- Die Konzentration des Ammoniaks oder eines anderen Amins ist ebenso wichtig. Eine bevorzugte Konzentration ist mindestens etwa 5% Ammoniak oder Amin, mehr bevorzugt mindestens etwa 10% und noch mehr bevorzugt mindestens etwa 15% (Gew./Vol.). Höhere Konzentrationen resultieren im Allgemeinen in einer schnelleren Dissoziation des Komplexes. Dementsprechend ist eine Ammoniak-Konzentration von 25-28% bevorzugt. Eine Ammoniak- Konzentration von 25-28% kann leicht erreicht werden mit kommerziell erhältlichen Ammoniumhydroxid-Lösungen.
- Die Temperatur, bei der die Spaltungsreaktion durchgeführt wird, beeinflusst ebenso die Rate der Komplex-Dissoziation. Die Temperatur wird ausgewählt nach Erwägungen so wie der Reaktionsgeschwindigkeit (die bei höheren Temperaturen schneller ist) und der Stabilität der Komponenten (z. B. der Biotin-Verbindung und der Biotin-bindenden Verbindung), die im Allgemeinen bei höheren Temperaturen weniger stabil sein werden. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Temperatur im Bereich von etwa 25ºC bis etwa 100ºC, mehr bevorzugt von etwa 40ºC bis etwa 80ºC. Eine bevorzugte Temperatur ist etwa 60ºC. In bestimmten Ausführungsformen kann es bevorzugt sein, die Spaltungsreaktion unter Druck (z. B. im Bereich von 1-200 atm) oder in einem geschlossenen Reaktionsgefäß (so wie ein Einschlussrohr oder eine Bombe) durchzuführen.
- Das Reaktionsgemisch kann ein wässriges Gemisch so wie eine Lösung oder Suspension sein oder es kann ein nicht wässriges Lösungsmittel verwendet werden, einschließlich z. B. Methanol, Ethanol, Acetonitril, Dimethylformamid und dergleichen. Gemische von Lösungsmitteln können ebenso verwendet werden (z. B. Wasser/Methanol oder Wasser/Acetonitril). Das Lösungsmittel wird im Allgemeinen so ausgewählt, dass es mit mindestens einer der Biotin- Verbindung, der Biotin-bindenden Verbindung oder dem Amin kompatibel ist. Die Wahl eines geeigneten Lösungsmittels ist für den Fachmann Routine. Wässrige Lösungsmittel werden im Allgemeinen bevorzugt.
- Natürlich wird es der Fachmann schätzen, dass nicht alle Biotin- Verbindungen (oder Biotin-bindende Verbindungen) bei allen Reaktionsbedingungen stabil sind. Wo beispielsweise eine Biotin-Verbindung ein biotinyliertes Protein (z. B. ein biotinylierter Antikörper) ist, können heftige Bedingungen so wie ein hoher pH und hohe Temperaturen den Protein-Anteil denaturieren. Somit werden die Bedingungen im Allgemeinen so ausgewählt, daß unerwünschte Denaturierung oder Zerstörung von mindestens einer der Biotin- Verbindung oder Biotin-bindenden Verbindung vermieden wird.
- Das erfindungsgemäße Verfahren kann verwendet werden, um eine Biotin-Verbindung zu reinigen. Beispielsweise umfasst das Verfahren in einer bevorzugten Ausführungsform, die Schritte des in Kontakt bringens eines Komplexes aus Biotin-Verbindung : Biotin-bindender Verbindung mit einer wirksamen Menge an Ammoniak unter Bedingungen, so dass der Komplex dissoziiert wird, wobei eine Biotin-Verbindung und eine Biotin-bindende Verbindung gebildet werden. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen schließt das Verfahren vor dem Dissoziationsschritt einen Reinigungsschritt des Komplexes aus Biotin-Verbindung : Biotin-bindender Verbindung durch Abtrennung des Komplexes von mindestens einer Verunreinigung ein. Somit kann die Biotin- Verbindung aus einem Komplex-Reaktionsgemisch gereinigt werden durch in Kontakt bringen eines Reaktionsgemisches umfassend eine Biotin-Verbindung mit einem Trägermaterial umfassend eine immobilisierte Biotin-bindende Verbindung, gefolgt von einer Reinigung des Komplexes und nachfolgender Freisetzung der Biotin-Verbindung aus dem Komplex durch Behandlung mit Ammoniak oder einem primären Amin. Beispiele für die Reinigung beispielsweise von Nukleinsäuren durch die Verfahren der Erfindung werden nachfolgend geliefert. Es wurde herausgefunden, dass die erfindungsgemäßen Verfahren besonders nützlich sind, wenn eine Biotin-Verbindung nachfolgend der Dissoziation des Komplexes durch Massenspektrometrie analysiert werden soll. In dieser Ausführungsform ist die Verwendung von Ammoniak als Amin bevorzugt.
- Somit stellt die Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform ein einfaches Verfahren zur Isolierung Biotin-konjugierter Moleküle aus Biotin- Streptavidin Komplexen bereit. Das Verfahren ist kompatibel mit nachfolgender massenspektroskopischer Analyse der isolierten Biotin-konjugierten Moleküle.
- Das betreffende Verfahren stellt ein massenspektrometrisch-kompatibles Verfahren dar, um intakte und unmodifizierte biotinylierte Moleküle aus Biotin- Streptavidin Komplexen durch eine kurze Behandlung eines Komplexes mit einem Amin (z. B. Ammoniak, der auch als Ammoniumhydroxid bereitgestellt werden kann) freizusetzen, bevorzugt bei leicht erhöhten Temperaturen. Mehrere massenspektrometrische Arten können für die Detektion der gewonnenen Produkte verwendet werden, einschließlich Ionisierung durch Matrix Assisted Laserdesorption/Ionization (MALDI), kontinuierlichem oder gepulstem Elektrospray (Es) oder Massive Cluster Impact (MCI); und Detektionsarten einschließlich linearer Flugzeit oder Flugzeit mit Reflectron (TOF), einfachem oder mehrfachem Quadrupol, einfachem oder mehrfachem Magnetsektor, Fourier- Transformations-Ionencyclotron-Resonanz (ICR), Ionenfalle und Kombinationen davon. Für die Ionisierung können zahlreiche Kombinationen von Matrix/Wellenlänge (MALDI) oder Kombinationen von Lösungsmitteln (ESI) verwendet werden.
- Dieses neue Verfahren ist von hervorragender Wichtigkeit für alle Verfahren, die auf einer schnellen und quantitativen Rückgewinnung von Biotin- konjugierten Materialien aus Biotin-Streptavidin Komplexen und nachfolgenden enzymatischen Reaktionen und Analysen via Techniken beruhen, die durch organische Verunreinigungen negativ beeinflusst werden. Diese schließen beispielsweise die Analyse von PCR- oder DNA-Sequenzierprodukten durch Massenspektrometrie zu diagnostischen Zwecken mit ein.
- Fig. 1 veranschaulicht eine Ausführungsform der Erfindung. Fig. 1 ist eine schematische Darstellung der Reinigung von biotinylierten PCR-Produkten, wobei die Reaktion in Lösung durchgeführt wird. In diesem Schema steht A für das biotinylierte PCR-Produkt, R steht für die Reaktionskomponenten und Verunreinigungen und H steht für das Streptavidin-beschichtete Trägermaterial (z. B. Streptavidin-Dynabeads oder Multititerplatten).
- In Schritt 1 dieser Ausführungsform wird eine PCR-Reaktion mit mindestens einem biotinylierten Primer durchgeführt. Die Biotin-Gruppe kann entweder an der 5'-Hydroxylgruppe des Primers oder an einer inneren Base angeheftet sein. Bei der Auswahl geeigneter Bedingungen, die im Fachgebiet bekannt sind, wird in Anwesenheit von Puffer, Template, Desoxynukleotiden und einer thermostabilen DNA-Polymerase (gesammelt als R dargestellt) ein biotinyliertes PCR-Produkt (A) erzeugt.
- Weil kurze Primer effizienter immobilisieren als längere PCR-Produkte, wird der nicht verlängerte Primer in Schritt 2 der Fig. 1 durch Ultrafiltration über Größenausschluss-Membranen entfernt, nach Verfahren, die im Fachgebiet beschrieben sind. Nach der Ultrafiltration ist das PCR-Produkt manchmal von Enzymen und/oder einigen Pufferkomponenten (R) begleitet. Zur weiteren Reinigung kann das PCR-Produkt an ein Trägermaterial (H), mit einer darauf immobilisierten Biotin-bindenden Verbindung (z. B. Streptavidin oder Avidin) besitzt, komplexiert werden. Die Bedingungen der Komplexierung können variieren; geeignete Bedingungen schließen eine Inkubation bei Umgebungstemperatur in Anwesenheit von 2 M Natriumchlorid oder Ammoniumchlorid und einem pH von etwa 7,5 ein. Die Beschaffenheit des Trägermaterials kann variieren und schließt z. B. magnetische Partikel (z. B. Beads), Multititerplatten mit oder ohne Filterplatten, Glas, Siliziumplättchen mit oder ohne Vertiefungen, Kunststoffe, Papier, flache Arrays, Kapillaren, Agarose oder Sepharose ein. Streptavidin-beschichtete magnetische Beads (Dynabeads, Dynal, Inc.) werden bevorzugt.
- In Schritt 3 der Fig. 1 kann wegen der Stabilität des Biotin-Streptavidin Komplexes intensiv gewaschen werden, um alle überschüssigen Reaktionskomponenten vor der Rückgewinnung des PCR-Produkts zu entfernen. Das komplexierte und gereinigte PCR-Produkt wird dann mit einem kleinen Volumen an 25%igem Ammoniumhydroxid behandelt, bevorzugt bei etwa 50- 60ºC, um die Biotin-Streptavidin Wechselwirkung zu überwinden.
- In Schritt 4 der Fig. 1 ist das reine PCR-Produkt lediglich von Ammoniumhydroxid begleitet. Das Ammoniumhydroxid kann leicht entfernt werden durch Lyophilisierung oder Ethanolpräzipitation, beide Methoden sind im Fachgebiet bekannt. Das reine PCR-Produkt wird wieder gelöst, am meisten bevorzugt in ultrareinem Wasser. Andere Bedingungen können gewählt werden, zum Beispiel variierende Puffer als Lösungsmittel. Das PCR-Produkt kann nun in nachgeschalteten Anwendungen eingesetzt werden, z. B. enzymatischer Reaktionen oder Detektion, beispielsweise via Massenspektrometrie oder Gelelektrophorese in Plattengelen oder Kapillaren, wie im Fachgebiet beschrieben.
- Die Verwendung von Ammoniak zur Dissoziation des Biotin-Streptavidin Komplexes ist von besonderem Interesse für die Detektion der DNA unter Verwendung von Massenspektrometrie. Es ist bekannt, dass die Heterogenität von Kationen zu einer Verbreiterung des Massensignals führt und mit dem Verfahren der Detektion interferiert. Somit würde die spektrometrische Detektion daraus einen Nutzen ziehen, wenn kationische Homogenität erreicht werden könnte. Die Verfahren der Erfindung stellen DNA mit einer homogenen Kationenverteilung bereit, da die meisten der Phosphatgruppen nach der Behandlung mit Ammoniak ein Ammonium-Gegenion tragen. Ein anderer Vorteil ist, dass DNA mit Ammonium-Gegenionen dafür bekannt ist, bevorzugte Eigenschaften für die massenspektromtrische (z. B. MALDI-TOF) MS-Analyse zu besitzen.
- Eine zweite Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens ist in Fig. 2 erläutert. Es stellt die Detektion von Sanger-Sequenzierprodukten und die Verwendung eines Biotin-Streptavidin Komplexes im Verfahren heraus. Fig. 2 ist eine schematische Darstellung von zwei verschiedenen Mitteln zur Detektion von Sanger-Sequenzierprodukten. Auf der linken Seite dieses Schemas wird ein biotinylierter Primer verwendet und die Reaktion wird in Lösung durchgeführt mit anschließender Immobilisierung, Reinigung, Ammoniumhydroxid-Behandlung und Detektion. Auf der rechten Seite wird die Reaktion als Festphasen-Reaktion durchgeführt. In diesem Schema steht B für biotinylierte Produkte der Primerverlängerung, R steht für Reaktionskomponenten und Verunreinigungen, C steht für Template-DNA und H steht für das Streptavidin-beschichtete Trägermaterial.
- Wie in Fig. 2 in der linken Spalte im ersten Schritt gezeigt, wird eine Sanger-Sequenzierreaktion mit einem biotinylierten Primer in Lösung durchgeführt. Die Produkte, die bei dieser Primerverlängerungs-Reaktion entstehen, sind doppelsträngige Nukleinsäuren, bestehend aus dem verlängerten biotinylierten Primer (B) und dem Template-Strang (C). Im zweiten Schritt, wie in Fig. 2 gezeigt, wird der biotinylierte Komplex an ein Streptavidin-beschichtetes Trägermaterial (H) immobilisiert (wie oben beschrieben). Aufgrund der Stabilität des Biotin-Streptavidin Komplexes kann der immobilisierte Komplex von überschüssigen Reaktionskomponenten, Nebenprodukten und Verunreinigungen (R) abgetrennt werden, wie oben beschrieben. Im dritten Schritt wird die Template-DNA von den biotinylierten Primer-Verlängerungsprodukten (B) denaturiert durch Methoden, die im Fachgebiet bekannt sind. Eine Lösung von 8 M Harnstoff wurde zum Zweck der Denaturierung verwendet. Weitere Waschschritte, bevorzugt mit ultrareinem Wasser, wurden durchgeführt, um den Harnstoff und den Template-Strang zu entfernen. Im vierten Schritt wurde das gereinigte biotinylierte Sequenzierungsprodukt (B) durch Behandlung mit 25%igem Ammoniumhydroxid wiedergewonnen. Die Entfernung des Ammoniumhydroxids kann unter Verwendung von Ethanolpräzipitation oder Lyophilisierung durchgeführt werden, wie oben beschrieben. Die biotinylierten Produkte können in ultrareinem Wasser resuspendiert werden und durch Massenspektrometrie oder Gelelektrophorese analysiert oder weiteren enzymatischen Reaktionen unterworfen werden.
- In einer Variation dieser zweiten Ausführungsform wird die Sequenzierreaktion an einem Trägermaterial durchgeführt. Fig. 2, rechte Spalte veranschaulicht diese Variation. Im ersten Schritt wird der biotinylierte Primer an ein Streptavidin-beschichtetes Trägermaterial (H) immobilisiert. Im zweiten Schritt erfolgt ein Annealing des Template-Strangs an den immobilisierten biotinylierten Primer. Im dritten Schritt wird eine Sequenzier-Reaktion, so wie die Sanger-Sequenzierung, durchgeführt. Im vierten Schritt werden Reaktionskomponenten und Verunreinigungen (R) durch Waschen entfernt. Das Template wird denaturiert vom biotinylierten verlängerten Primer unter Verwendung von Harnstoff wie oben beschrieben und weitere Waschschritte werden durchgeführt. In Schritt S werden die gereinigten biotinylierten Produkte der Verlängerung (B) wie oben beschrieben durch Behandlung mit Ammoniumhydroxid gewonnen, und weiteren Analysen unterzogen, beispielsweise via Massenspektrometrie, Elektrophorese oder weiteren enzymatischen Reaktionen.
- Eine dritte Ausführungsform der gegenwärtigen Erfindung ist in Fig. 3 veranschaulicht. Fig. 3 ist eine schematische Darstellung verschiedener Mittel, um Produkte des PCR-Verdaus mit Einzel- oder Doppelstrang-spezifischen Endo- oder Exonukleasen zu detektieren, um DNA-Sequenzinformation zu erzeugen. In diesem Schema steht A für ein biotinyliertes PCR-Produkt, D steht für ein verdautes biotinyliertes PCR-Produkt, E steht für ein biotinyliertes einzelsträngiges PCR-Verdauprodukt, F steht für ein unverdautes biotinyliertes einzelsträngiges PCR-Verdauprodukt, G steht für ein verdautes biotinyliertes einzelsträngiges PCR-Verdauprodukt, H steht für ein Streptavidin-beschichtetes Trägermaterial und R steht für Reaktionskomponenten und Verunreinigungen.
- Diese Ausführungsform zeichnet sich aus durch das Sequenzieren der PCR-Produkte mit Endo- oder Exonukleasen und der Verwendung des Biotin- Streptavidin Komplexes in diesem Verfahren. Im ersten Schritt wird, wie in Fig. 3 linke Spalte gezeigt, eine PCR-Reaktion mit einem biotinylierten Primer durchgeführt. Vor weiteren Reaktionen werden nicht eingebaute Primer durch Ultrafiltration über eine Molekulargewichts-Ausschluss-Membran entfernt (wie oben beschrieben). Im zweiten Schritt wird das biotinylierte PCR-Produkt (A) einem Verdau mit doppelstrangspezifischen Enzymen unterzogen. Dies kann beispielsweise unter Verwendung von DNase I durchgeführt werden, die den Doppelstrang statistisch an jeder Phosphodiester-Bindung schneidet. Die Reaktion kann auf solche Weise durchgeführt werden, dass jeder bei der PCR- Reaktion entstehende Doppelstrang statistisch genau einmal geschnitten wird (Low, C. M. L. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12 4865-4879). Eine zweite Methode ist die Verwendung von Exonuklease III, die Doppelstrang-DNA vom 3'-Ende des Moleküls her verdaut. Eine dritte Methode verwendet Typ 2 Restriktions-Endonukleasen, um RFLPs in Kombination mit nachfolgender Analyse durchzuführen, beispielsweise via Massenspektrometrie oder Elektrophorese. In dem dritten Schritt werden die biotinylierten Verdau-Produkte (D) des Schrittes 2 an ein Streptavidin-beschichtetes Trägermaterial (H) immobilisiert (wie oben beschrieben). In Schritt 4 werden die immobilisierten biotinylierten Produkte von den Reaktionskomponenten und Verunreinigungen (R) (wie oben beschrieben) abgetrennt und die hybridisierten, nicht biotinylierten Produkte werden unter Verwendung eines denaturierenden Mittels wie Harnstoff (wie oben für die zweite Ausführungsform beschrieben) entfernt. Die biotinylierten Produkte (E) werden vom Trägermaterial durch Behandlung mit Ammoniumhydroxid freigesetzt. Nach Entfernung des Ammoniumhydroxids unter Verwendung von Ethanolpräzipitation oder Lyophilisierung können die biotinylierten Produkte (E) beispielsweise in ultrareinem Wasser resuspendiert und beispielsweise via Massenspektrometrie oder Elektrophorese analysiert werden.
- Eine Variation dieser Ausführungsform zeichnet sich durch das Sequenzieren der PCR-Produkte mit Einzelstrang-spezifischen Endo- oder Exonukleasen und der Verwendung eines Biotin-Streptavidin Komplexes in dem Verfahren aus. In Fig. 3 ("Variation 1") ist dies veranschaulicht. Das biotinylierte PCR-Produkt (A) wird nach Ultrafiltration (Schritt 2) an ein Streptavidin-beschichtetes Trägermaterial (H) immobilisiert. In Schritt 3 wird der nicht biotinylierte Strang unter Verwendung von Harnstoff denaturiert und weitere Waschschritte werden durchgeführt. In Schritt 4 kann das immobilisierte biotinylierte einzelstängige PCR-Produkt (F) mit einer Einzelstrang-spezifischen Endo- oder Exonuklease verdaut werden. Für den Endonuklease-Verdau wird eine Nuklease aus Mungbohnen oder eine S1-Nuklease bevorzugt, während für den Exonuklease-Verdau eine Phosphodiesterase aus Kalbsmilz oder aus Schlangengift bevorzugt wird, wobei letztere besonders bevorzugt wird. Die immobilisierten Verdau-Produkte (G) werden durch weiteres Waschen in Schritt 5 gereinigt und werden vom Trägermaterial unter Behandlung von Ammoniumhydroxid rückgewonnen. Wie vorher beschrieben, können die rückgewonnenen biotinylierten Produkte (G) nach Ethanol-Präzipitation oder Lyophilisierung analysiert werden.
- In einer anderen Variation dieser Ausführungsform (in Fig. 3 als "Variation 2" gezeigt) wird ein immobilisiertes einzelsträngiges PCR-Produkt (F) (wie oben in Schritt 3 beschrieben) in Schritt S mit Ammoniumhydroxid behandelt, um das biotinylierte einzelsträngige PCR-Produkt (F) zurück zu gewinnen. Das Ammoniumhydroxid wird durch z. B. Ethanolpräzipitation oder Lyophilisierung entfernt und die DNA wird in ultrareinem Wasser resuspendiert. In Schritt S wird das isolierte einzelsträngige PCR-Produkt (F) mit einer Einzelstrang-spezifischen Endo- oder Exonuklease verdaut, bevorzugt Nuklease aus Mungbohnen, S1-Nuklease beziehungsweise Phosphodiesterase aus Schlangengift.
- In Schritt 6 werden die Verdau-Produkte (G) dann analysiert, beispielsweise via Massenspektrometrie oder Elektrophorese.
- Unter den Vorteilen der Verfahren der Erfindung sind: i) es gibt keine Notwendigkeit, strenge, denaturierende oder toxische organische Komponenten so wie Phenol oder Formamid zu verwenden, ii) Biotin-Streptavidin Komplexe können unter milden Bedingungen gespalten werden, iii) flüchtige Amine, so wie Ammoniak, können leicht und schnell entfernt werden (beispielsweise durch Lyophilisierung), iv) das zurückgewonnene Material kann ohne weitere Reinigung enzymatischen Reaktionen oder z. B. massenspektrometrischen Analysen unterzogen werden, v) eine gleichzeitige Spaltung des Biotin-Streptavidin Komplexes und Kationenaustausch. Demgemäss wird das Verfahren der Erfindung die Anwendbarkeit des Biotin-Streptavidin Systems bedeutend ausweiten durch Bereitstellung einer milden und selektiven Methode zur Rückgewinnung der Biomoleküle nach Immobilisierung zu weiteren enzymatischen Reaktionen oder Analysen.
- Die folgenden Beispiele veranschaulichen, aber beschränken nicht das Verfahren der vorliegenden Erfindung.
- Die Beispiele 1-5 veranschaulichen die Nützlichkeit der Verfahren der Erfindung in zahlreichen Anwendungen in der Diagnostik und der DNA- Sequenzierung. Im Allgemeinen beinhalten die erläuterten Beispiele mindestens einige der Folgenden Schritte:
- 1. Durchführung (a) einer enzymatischen Reaktion unter Anwendung von biotinylierter DNA in Lösung beziehungsweise (b) an ein Trägermaterial über einen Biotin-Streptavidin Komplex immobilisierte DNA.
- 2. Abtrennung überschüssiger biotinylierter Primer, wenn nötig unter Verwendung von Größenausschluß-Ultrafiltrations-Membranen.
- 3. Immobilisierung der Produkte aus Schritt 1a durch Komplexierung der biotinylierten DNA an ein Biotin-bindendes Protein, das von einer Feststoff- Phase getragen wird.
- 4. Abtrennung des Komplexes aus Schritt 3 oder Schritt 1b von der flüssigen Phase. Weitere Optionen schließen das Waschen zur Entfernung von Reaktionskomponenten und Verunreinigungen, Konditionierung der immobilisierten Nukleinsäuren, enzymatische Reaktionen und Isolierung des nicht biotinylierten Strangs eines DNA-Duplex für nachgeschaltete Anwendungen ein.
- 5. Behandlung des abgetrennten und manipulierten Komplexes aus Schritt 4 mit Ammoniumhydroxid zur Isolierung der biotinylierten Moleküle.
- 6. Vollständige Entfernung des Ammoniumhydroxids durch Lyophilisierung oder Präzipitation mit Ethanol.
- 7. Nachgeschaltete Behandlung des isolierten Materials, z. B. Analyse von Produkten durch MALDI-TOF MS oder weitere enzymatische Reaktionen.
- Wie oben beschrieben, ist der Effekt von Ammoniumhydroxid auf die immobilisierten Nukleinsäuren eine Funktion von Temperatur und Inkubationszeit. Wenn das immobilisierte Material für eine kurze Zeit bei Umgebungstemperatur immobilisiert wird, ist das Hauptverfahren die Denaturierung der immobilisierten doppelsträngigen Moleküle. Aber Inkubation der immobilisierten DNA mit Ammoniumhydroxid bei erhöhten Temperaturen (bevorzugt 37-80ºC) führt zur Dissoziation des Biotin-Streptavidin Komplexes.
- Für dieses Beispiel wurden 100 umol biotinylierte Oligodesoxynukleotide (20mer) 5'd(bio-AGCTCTATATCGGGAAGCCT)3' (SEQ ID NO: 1) an 50 ul Streptavidin-Dynabeads M-280 immobilisiert. Die Beads wurden gemäß den Anleitungen des Herstellers vorbereitet. Die Beads wurden schließlich in 50 ul B/W-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl) resuspendiert. Die Oligodesoxynukleotide wurden in einem Volumen von 1 ul zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde bei Umgebungstemperatur für 30 Minuten inkubiert. Nach der Immobilisierung wurden die Beads zweimal mit 100 ul Ammoniumcitrat-Puffer (0,07 M) gewaschen. Die Beads wurden einmal mit ultrareinem Wasser gewaschen, 25 ul einer 25%igen Ammoniumhydroxid- Lösung wurden zugegeben und die Beads wurden vorsichtig resuspendiert. Die Suspension wurde bei 60ºC für 10 Minuten inkubiert und die Beads wurden unter Verwendung eines Magnetpartikel-Sammlers (Dynal, Hamburg, Deutschland) von der Lösung abgetrennt. Der Überstand wurde aufbewahrt und das Vorgehen wurde einmal wiederholt. Beide Überstände wurden in einem einzigen Gefäß gesammelt. Die Lösung wurde für 30 Minuten lyophilisiert und in 4 ul ultrareinem Wasser wieder gelöst. Von dieser Lösung wurden 0,5 ul analysiert mit MALDI-TOF Massenspektrometrie (Fig. 4) (wie in Beispiel 2, Schritt 4 beschrieben).
- Fig. 4 zeigt ein MALDI-TOF MS-Spektrum eines biotinylierten 20mer Oligodesoxynukleotids (SEQ ID NO: 1), immobilisiert an Streptavidin-Dynabeads und zurückgewonnen unter Verwendung der oben beschriebenen Methode. Der theoretische Massenwert des biotinylierten Oligodesoxynukleotids beträgt 6522 Da. Der erhaltene Massenwert beträgt in Übereinstimmung mit der vorhergesagten Masse 6529,8 Da. Das Spektrum zeigt, dass ein biotinyliertes Oligodesoxynukleotid von den Beads entfernt wurde. Die mit Sternchen markierten Signale sind zurückzuführen auf Verunreinigungen, die im Verfahren der Ionisation und Desorption auftreten, auch, wenn Ammoniumhydroxid nicht angewendet wird.
- Dieses Beispiel demonstriert, dass biotinylierte DNA aus einem Biotin- Streptavin Komplex unter Verwendung von Ammoniumhydroxid bei erhöhten Temperaturen rückgewonnen werden kann. Das Oligodesoxynukleotid und die angeheftete Biotin-Gruppe bleiben während des Verfahrens intakt und werden nicht modifiziert. Dies kann daraus geschlossen werden, dass keine Veränderung des Molekulargewichts des Originalmoleküls beobachtet wurde bei einer MALDI- TOF massenspektrometrischen Analyse, nachdem das Oligodesoxynukleotid dem beschriebenen Verfahren unterzogen wurde. Weitere Experimente zeigten, dass das gewonnene, biotinylierte Molekül wiederum an Streptavidin komplexiert werden kann, auch dies weist auf eine intakte Biotin-Gruppe hin.
- Eine PCR wurde durchgeführt mit 1 ul eines ersten Primerpaars, gerichtet gegen das Gen für das Kernprotein des Hepatitis B Virus. Das geschachtelte Amplifikationsprodukt hat eine Länge von 67 bp. 100 umol jeden Primers, 2,5 Pfu(exo-)-DNA-Polymerase (Stratagene, Heidelberg, Deutschland), eine Endkonzentration von 200 uM von jedem dNTP und 2 ul 10x Pfu Puffer (200 mM Tris-Hcl, pH 8,75, 100 mM KCl, 100 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 20 mM MgSO&sub4;, 1% Triton X-100, 1 mg/ml BSA, Stratagene, Heidelberg, Deutschland) wurden in einem Gesamtvolumen von 50 ul verwendet. Die Reaktionen wurden in einem Thermocycler (OmniGene, MWG-Biotech, Ebersberg, Deutschland) durchgeführt unter Verwendung des Folgenden Temperaturprogramms: 94ºC für 1 Minute, 60ºC für 1 Minute und 72ºC für 1 Minute mit 20 Zyklen. Sequenz der Oligodesoxynukleotid-Primer (HPLC-gereinigt, bezogen von MWG-Biotech, Ebersberg, Deutschland):
- HBV13: 5'-d(TTGCCTGAGTGCAGTATGGT-)3' (SEQ ID NO: 2)
- HBV15bio: 5'd(bio-AGCTCTATATCGGGAAGCCT)3' (SEQ ID NO: 3)
- Reinigung der in Schritt 1 erhaltenen oben erwähnten PCR-Produkte erfolgte nach Folgendem Verfahren: Ultrafiltration wurde unter Verwendung von Ultrafree-MC Filtrationseinheiten (Millipore, Eschborn, Deutschland) nach dem Protokoll des Herstellers durchgeführt, mit einer Zentrifgugation bei 8000 Umdrehungen pro Minute (rpm) für 20 Minuten. 25 ul (10 ug/ul) Streptavidin- Dynabeads M280 (Dynal, Hamburg, Deutschland) wurden nach den Anweisungen des Herstellers vorbereitet und in 25 pl B/W-Puffer (10 mM Tris- Hcl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl) resuspendiert. Diese Suspension wurde zu den PCR-Proben (noch immer in der Filtrationseinheit) zugefügt und das Gemisch wurde unter sanftem Schütteln für 15 Minuten bei Umgebungstemperatur inkubiert. Die Suspension wurde in ein 1,5 ml Eppendorfgefäß überführt und der Überstand wurde mit Hilfe eines Magnet-Partikel-Sammlers MPC (Dynal, Hamburg, Deutschland) abgetrennt. Die Beads wurden zweimal mit 50 ul einer 0,07 M Ammoniumcitrat-Lösung, pH 8,0 gewaschen (der Überstand wurde jedes Mal unter Verwendung des MPC entfernt).
- Um das PCR-Produkt (ein Doppelstrang aus 67 Basenpaaren) zu entfernen, wurden die Beads in 25 ul einer 25%igen NH&sub4;OH Suprapur (Merck, Darmstadt, Deutschland) resuspendiert und bei 60ºC für zehn Minuten inkubiert. Der Überstand wurde entfernt und aufbewahrt, und die NH&sub4;OH-Behandlung wurde einmal wiederholt. Beide Überstände wurden in einem Speedvac getrocknet und in 4 ul untrareinem Wasser (MilliQ UF plus, Millipore, Eschborn, Deutschland) resuspendiert. Für die MALDI-TOF MS-Analyse wurden 0,5 ul dieser Präparation verwendet.
- Ein halber Mikroliter (0,5 ul) der Probe wurde auf den Probenhalter pipettiert, dann sofort mit 0,5 ul einer Matrix-Lösung (0,7 M 3- Hydroxypicolinsäure in 50%igem Acetonitril, 70 mM Ammoniumcitrat) gemischt. Diese Mischung wurde bei Umgebungstemperatur getrocknet und in das Massenspektrometer (Fig. 5) eingeführt. Alle Spektren wurden im positiven Ionenmodus unter Verwendung eines Finnigan MAT Vision 2000 (Finnigan MAT, Bremen, Deutschland) aufgenommen, ausgerüstet mit einem Reflektron (5 keV Ionenquelle, 20 keV Nachbeschleunigung) und einem 337 nm Stickstofflaser. Die Kalibrierung wurde mit einer Mischung eines Nukleinsäuren-40mers und eines 100mers gemacht. Jede Probe wurde mit verschiedenen Laserenergien gemessen. In den negativen (Kontroll-) Proben wurde das PCR-Produkt bei niedrigen oder hohen Laserenergien nicht detektiert. In den positiven Proben wurde das PCR-Produkt an verschiedenen Stellen der Probenspots und auch bei verschiedenen Laserenergien detektiert.
- Fig. 5 zeigt ein MALDI-TOF MS-Spektrum eines PCR-Produkts der Hepatitis B Kern-Antigen codierenden DNA-Region, gereinigt mit Streptavidin- Dynabeads und rückgewonnen von den Beads unter Verwendung von Ammoniumhydroxid, wie oben beschrieben.
- Der theoretische Massenwert des nicht biotinylierten Strangs ist 20792,4 Da. Der theoretische Massenwert des biotinylierten Strangs ist 20886,9 Da. Die durchschnittliche Masse beider Stränge ist 20839,7 Da. Der Massenwert des erhaltenen Signals ist 20812,5 Da. Da doppelsträngige DNA- Moleküle während des Verfahrens der Ionisiation und der Desorption denaturiert werden, werden die PCR-Produkte als einzelsträngige Moleküle detektiert und der erhaltene Massenwert stellt die durchschnittliche Masse beider Einzelstränge dar.
- Dieses Beispiel demonstriert, dass die MALDI-TOF MS-Analyse von PCR- Produkten mit der hierin beschriebenen Methode vereinbar ist. Verglichen mit den gegenwärtig verwendeten Reinigungsverfahren führt die vorgestellte Kombination aus einem Streptavidin-beschichteten Trägermaterial, einem biotinylierten Analyten und der Rückgewinnung des PCR-Produkts unter Verwendung von Ammoniumhydroxid zu einer verbesserten Probenverarbeitung und Analyse.
- Für die Streptavidin-Biotin Reinigung wurde ein biotinylierter USP (Universal Sequencing Primer), der HPLC-gereinigt von Pharmacia Biotech (Freiburg, Deutschland) geliefert wurde, verwendet. Die Primersequenz wurde so gestaltet, dass 10 Basen stromabwärts der Primer-Bindungsstelle sequenziert werden würde. Die Reaktion wurde unter Verwendung von Reagenzien aus dem Sequenzier-Kit für Sequenase Version 2,0 (Amersham, Arlington Heights, Illinois, USA) durchgeführt.
- Für das Annealing von Primer und Template wurden 40 umol bioUSP (1 ul) und 40 umol des Templates (1 ul) mit 4 ul des Sequenase-Puffers (5X) inkubiert, für 2 Minuten auf 65ºC erhitzt und dann langsam auf Umgebungstemperatur abgekühlt. Zu dem Annealing-Gemisch wurden 1 ul Mn- Puffer (geliefert im Kit des Herstellers), 1 ul Dithiothreitol (DTT), 2 ul ultrareines Wasser (MilliQ, Millpore, Eschborn, Deutschland) und 2 ul verdünnte Sequenase 2,0 (6 U, verdünnt mit Pyrophosphatase) zugegeben.
- Nach der Zugabe der Sequenase wurden 3 ul des Reaktionsgemischs in jedes der Terminations-Gemische (A, C, G und T, je 4 ul) pipettiert. Die Gemische wurden für 20 Minuten bei 34ºC inkubiert. Jede Reaktion wurde mit 1,5 ul 500 mM EDTA gestoppt.
- Nach dem Stoppen der Terminationsreaktion mit EDTA wurden die Sequenzierprodukte an Streptavidin-Beads, die nach dem Protokoll des Herstellers vorbereitet wurden, immobilisiert. Zu jeder Reaktion wurden 20 ul der vorgewaschenen Beads zugegeben und bei Umgebungstemperatur unter sanftem Schütteln für 15 Minuten inkubiert. Nach der Immobilisierung wurden die Beads zweimal mit B/W-Puffer (siehe oben) und einmal mit ultrareinem Wasser gewaschen. Das Template wurde dann vom immobilisierten Strang mit ultrareinem Wasser bei 95ºC für 2 Minuten denaturiert. Nach der Denaturierung wurden die Beads zweimal mit 0,07 M Ammoniumcitrat und einmal mit ultrareinem Wasser gewaschen.
- Die immobilisierten Sequenzierprodukte wurden von den Beads mit 20 ul 25%igem Ammoniak bei 60ºC für 10 Minuten gespalten; die Spaltungsreaktion wurde zweimal durchgeführt und die Überstände wurden vereinigt. Die Proben wurden dann lyophilisiert, in 4 ul ultrareinem Wasser resuspendiert und direkt für die MALDI-TOF MS verwendet.
- Die Reaktionsprodukte wurden unter Verwendung von MALDI-TOF MS (Fig. 6) nach dem in Beispiel 2, Schritt 4 beschriebenen Verfahren analysiert.
- Primer 17mer (Molekulargewicht 5744,4 Da):
- 5'd(bioGTAAAACGACGGCCAGT)3' (SEQ ID NO: 4),
- Template 50mer (Molekulargewicht 15338 Da):
- 5'd(TTGCGTACACACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCTC) 3' (SEQ ID NO: 5)
- Sowohl Primer als auch Template (etwa 0,2 umol) wurden an einem Milligen 7500 unter Verwendung von β-Cyanoethylphosphoamidit Chemie synthetisiert (Sinha, N. D.; et al. (1984) Nucleic Acid Res. 12, 4539-4577) und via RP-HPLC gereinigt.
- Fig. 6 zeigt die Reaktion der Sanger-Sequenzierreaktion, gereinigt mit M-280 Strepatavidin-Dynabeads. Die Sequenzierreaktion wurde in Lösung durchgeführt und die Sequenzierprodukte wurden mit Dynabeads gefangen. Die Reaktionsbestandteile so wie Salze, Enzyme, dNTPs und Didesoxynukleotid- Triphosphate (ddNTPs) wurden durch Waschen entfernt und die Sequenzierprodukte wurden für MALDI-TOF MS-Analyse unter Verwendung von Ammoniumhydroxid, rückgewonnen, wie oben beschrieben.
- Drei Terminationsprodukte mit einer Länge von 22-, 26- beziehungsweise 27 Basen wurden in der A-Reaktion erwartet. Diese Produkte sind durch die Signale bei 7282,6 Da, 8502,5 Da beziehungsweise 8809,5 Da vertreten. Die Signale bei 5721,3 Da und 15325 Da stellen Primer beziehungsweise Template dar. Das Signal bei 9131,5 Da ist zurückzuführen auf eine Einzel- Nukleotidverlängerung des Durchgangsprodukts.
- Dieses Beispiel und Beispiele 4 und 5, siehe unten, demonstrieren die Nützlichkeit des Verfahrens der Erfindung für die DNA-Sequenzierung. Dieses Beispiel zeigt, dass das Verfahren mit der Analyse der konventionellen Sanger- Sequenzierung kompatibel ist.
- Das Reaktionsgemisch enthielt 200 uM dCTP, dTTP und 200 uM C&sup7;- Deaza-dATP und C&sup7;-Deaza-dGTP, 100 pmol des nach vorn gerichteten und des reversen Primers, 100 ng M13mp18 RF und 2,5 U von Pfu(exo-) DNA- Polymerase (Stratagene, Heidelberg, Deutschland) in einer gepufferten Lösung (20 mM Tris-HCl, pH 8,75, 10 mM KCl, 10 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 2 mM MgSO&sub4;, 0,1% Triton X-100, 0,1 mg/ml BSA, Stratagene, Heidelberg, Deutschland) von 100 ul. Die Reaktionen wurden in einem Thermocycler (OmniGene, MWG-Biotech, Ebersberg, Deutschland) durchgeführt unter Verwendung des Folgenden Temperaturprogramms: Initialer Denaturierungsschritt von 3 min 94ºC gefolgt von 25 Zyklen von 94ºC für 1 Minute, 48ºC für 1 Minute und 72ºC 1 Minute.
- Der reverse Primer (etwa 0,2 umol) wurde an einem Milligen 7500 synthetisiert und mit RP-HPLC gereinigt. Der biotinylierte nach vorn gerichtete Primer wurde in HPLC-gereinigter Form von Pharmacia Biotech erworben.
- Sequenzen:
- Nach vorn gerichteter Primer: 5'd(bio-GTAAAACGACGGCCAGT)3' (SEQ ID NO: 6)
- Reverser Primer: 5'd(GAGATCTCCTAGGGGCC)3' (SEQ ID NO: 7)
- Das PCR-Produkt wurde von nicht eingebautem Primer durch Ultrafiltration durch eine 10000 Da Molekulargewicht-Ausschluß-Membran getrennt. Ultrafiltration wurde unter Verwendung von Ultrafree-MC Filtrationseinheiten (Millipore, Eschborn, Deutschland) nach dem Protokoll des Herstellers durchgeführt, mit einer Zentrifgugation bei 8000 Umdrehungen pro Minute (rpm) für 20 Minuten.
- 25 ul (10 ug/ul) Streptavidin-Dynabeads M-280 mit einer nominellen Größe von 2,8 um (Dynal, Hamburg, Deutschland) wurden nach den Anweisungen des Herstellers vorbereitet und in 25 ul B/W-Puffer (10 mM Tris- HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl) resuspendiert. Diese Suspension wurde zu den PCR-Proben (noch immer in der Filtrationseinheit) zugefügt und das Gemisch wurde unter sanftem Schütteln für 15 Minuten bei Umgebungstemperatur inkubiert. Die Suspension wurde in ein 1,5 ml Eppendorfgefäß überführt und der Überstand wurde mit Hilfe eines Magnet-Partikel-Sammlers MPC (Dynal, Hamburg, Deutschland) abgetrennt. Nach der Immobilisierung wurde das doppelsträngige PCR-Produkt unter Verwendung von 20 ul 8 M Harnstoff denaturiert. Nach Entfernen des Harnstoffs (enthaltend den nicht biotinylierten Strang) wurden die Beads zweimal mit 50 ul 0,07 M Ammoniumcitrat-Lösung, pH 8,0 gewaschen (der Überstand wurde jedes Mal unter Verwendung des MPC entfernt). Um die Spaltungsreaktion durchzuführen und das biotinylierte einzelsträngige PCR-Produkt rückzugewinnen wurden die Beads in 25 ul 25%igem NH&sub4;OH Suprapur (Merck, Darmstadt, Deutschland) resuspendiert und bei 60ºC für 10 Minuten inkubiert. Der Überstand wurde entfernt und aufbewahrt, die NH&sub4;OH-Behandlung wurde einmal wiederholt. Beide Überstände wurden in einem Speedvac getrocknet und in 2 ul ultrareinem Wasser (MilliQ UF plus, Millipore, Eschborn, Deutschland) resuspendiert.
- 1 ul der resuspendierten DNA aus Schritt 2 wurde mit 0,2 · 10&supmin;³ U von Phosphodiesterase aus Schlangengift (Boehringer Mannheim, Deutschland) gemischt und für 20 min bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion wurde mit 1 ul Matrix- Lösung (0,7 M 3-Hydroxypicolinsäure in 50%igem Acetonitril, 70 mM Ammoniumcitrat) gemischt und direkt für MALDI-TOF MS-Analyse verwendet.
- Die Reaktionsprodukte wurden unter Verwendung von MALDI-TOF MS (Fig. 7) nach der oben beschriebenen Methode analysiert.
- Fig. 7 zeigt ein Spektrum eines exonukleolytischen Verdaus eines 60mer PCR-Produkts. Das biotinylierte PCR-Produkt wurde an Streptavidin- Dynabeads immobilisiert und mit 8 M Harnstoff denaturiert. Der biotinylierte Einzelstrang wurde rückgewonnen von den Beads unter Verwendung einer Ammoniumhydroxid-Behandlung. Nach Lyophilisierung wurde das einzelsträngige 60mer mit Phosphodiesterase aus Schlangengift verdaut. Wie in Beispiel 4 beschrieben, stellt das Spektrum eine Verdauzeit von 20 Minuten bei 37ºC dar.
- 400 umol des biotinylierten 25mer Oligonukleotids wurden mit 2 mg Dynabeads nach dem Protokoll des Herstellers in einem Gesamtvolumen von 100 ul inkubiert.
- Das immobilisierte Oligonukleotid wurde durch Zugabe von 3 ul Phosphodiesterase aus Schlangengift (6 · 10&supmin;³ U) (Boehringer Mannheim, Deutschland) bei Raumtemperatur verdaut.
- Aliquote von 20 ul wurden nach Verdau für 4, 10, 15, 20 und 25 Minuten entnommen und demselben Reinigungsverfahren unterzogen wie in Beispiel 2, Schritt 2, oben beschrieben.
- Die Reaktionsprodukte wurden unter Verwendung von MALDI-TOF MS nach dem oben beschriebenen Verfahren (Fig. 8) analysiert.
- Für den Verdau wurde ein 5'-biotinyliertes Oligonukleotid, HPLC- gereinigt, von Biometra (Göttingen, Deutschland) bezogen.
- Sequenz: 5'(bio-TACATTCCCAACCGCGTGGCACAAT)3' (SEQ ID NO: 8)
- Fig. 8 zeigt einen exonukleolytischen Verdau eines biotinylierten, an Dynabeads immobilisierten 25mers. Nach 4 Minuten Verdau mit Phosphodiesterase aus Schlangengift wurden die Produkte gereinigt und von den Beads entfernt, wie oben beschrieben. Von diesem Spektrum kann die Basensequenz von Base 13 bis Base 25 gesehen werden.
- Die Beispiele 4 und 5 demonstrieren, dass das hierin beschriebene Verfahren für die Isolierung von einzelsträngiger DNA verwendet werden kann, die nachfolgender enzymatischer Degradation zugänglich ist. Beispiel 4 zeigt eine Anwendung, wobei die Bildung eines Biotin-Streptavidin Komplexes, gefolgt von einer Behandlung mit Ammoniumhydroxid verwendet wird, um ein Einzelstrang- PCR-Produkt zum Zweck des Verdaus mit einer Einzelstrang-spezifischen Exonuklease für die Bestimmung der Nukleotidsequenz zu isolieren. Dieses Experiment zeigt auch, dass das rückgewonnene biotinylierte Material unmodifiziert und für enzymatische Reaktionen zugänglich bleibt. In Beispiel 5 wurde der Verdau durchgeführt, während das einzelsträngige PCR-Produkt noch immobilisiert war und die Produkte wurden unter Verwendung des hierin vorgestellten Spaltungsverfahrens gewonnen.
- Anhand der Beispiele kann gesehen werden, dass das betreffende Verfahren ein Verfahren bereitstellt für die Reinigung und Analyse von biotinylierten Molekülen. Das erfindungsgemäße Verfahren ist kompatibel mit massenspektrometrischen Analysen und mit dem Potential für die Durchführung weiterer enzymatischer Reaktionen.
- (1) ALLGEMEINE ANGABEN:
- (i) ANMELDER: Jurinke, Christian, et al.
- (ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Methode zur Dissoziation von Biotin-Komplexen
- (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 8
- (iv) KORRESPONDENZADRESSE:
- (A) NAME: Foley, Hoag & Eliot LLP
- (B) STRASSE: One Post Office Square
- (C) ORT: Boston
- (D) BUNDESLAND: Massachusetts
- (E) LAND: USA
- (F) POSTLEITZAHL: 02109-2170
- (v) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
- (A) DATENTRÄGER: Floppy Disk
- (B) COMPUTER: IBM PC Compatible
- (C) BETRIEBSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
- (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.25
- (vi) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG
- (A) ANMELDENUMMER:
- (B) ANMELDETAG: 13-Mai-1997
- (C) KLASSIFIZIERUNG:
- (vii) DATEN DER URANMELDUNG:
- (A) ANMELDENUMMER: 08/649,876
- (B) ANMELDETAG: 13-Mai-1996
- (viii) ANWALT/VERTRETERINFORMATION:
- (A) NAME: Beth E. Arnold
- (B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 000000
- (C) REFERENZ/PROZESSLISTENNUMMER: SQA-022.25
- (ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION:
- (A) TELEFON: (617)832-1294
- (B) TELEFAX: (617)832-7000
- (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 1:
- (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: Einzel
- (D) TOPOLOGIE: Linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: Andere Nukleinsäure
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
- AGCTCTATAT CGGGAAGCCT
- (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 2:
- (ii) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: Einzel
- (D) TOPOLOGIE: Linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: Andere Nukleinsäure
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
- AGCTCTATAT CGGGAAGCCT
- (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:
- (iii) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: Einzel
- (D) TOPOLOGIE: Linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: Andere Nukleinsäure
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
- AGCTCTATAT CGGGAAGCCT
- (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 4:
- (iv) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 17 Basenpaare
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: Einzel
- (D) TOPOLOGIE: Linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: Andere Nukleinsäure
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
- GTAAAACGAC GGCCAGT
- (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 5:
- (v) SEQUENZKENNZEICHEN;
- (A) LÄNGE: 50 Basenpaare
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: Einzel
- (D) TOPOLOGIE: Linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: Andere Nukleinsäure
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
- TTGCGTACAC ACTGGCCGTC GTTTTACAAC GTCGTGACTG GGAAAACCTC
- (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 6:
- (vi) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 17 Basenpaare
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: Einzel
- (D) TOPOLOGIE: Linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: Andere Nukleinsäure
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
- GTAAAACGAC GGCCAGT
- (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 7:
- (vii) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 17 Basenpaare
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: Einzel
- (D) TOPOLOGIE: Linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: Andere Nukleinsäure
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
- GAGATCTCCT AGGGGCC
- (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 8:
- (viii) SEQUENZKENNZEICHEN:
- (A) LÄNGE: 25 Basenpaare
- (B) ART: Nukleinsäure
- (C) STRANGFORM: Einzel
- (D) TOPOLOGIE: Linear
- (ii) ART DES MOLEKÜLS: Andere Nukleinsäure
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NQ:8:
- TACATTCCCA ACCGCGTGGC ACAAT
Claims (28)
1. Verfahren zur Dissoziation eines Komplexes aus einer Biotin-
Verbindung : Biotin-bindender Verbindung, wobei das Verfahren umfasst:
In Kontakt bringen des Komplexes mit einer wirksamen Menge an
Ammoniak oder eines primären Amins unter Bedingungen, so daß der
Komplex dissoziiert;
wobei eine Biotin-Verbindung und eine Biotin-bindende Verbindung
gebildet werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1 worin der Komplex mit einem primären Amin bei
einer Temperatur von zwischen etwa 25º und etwa 100º in Kontakt gebracht
wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Komplex mit einem primären Amin
bei einem pH von zwischen etwa 7 und etwa 14 in Kontakt gebracht wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Komplex mit einem primären Amin in
einer Konzentration von zwischen etwa 5% und etwa 28% in Kontakt
gebracht wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Biotin-Verbindung ein biotinyliertes
Makromolekül ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, worin das biotinylierte Makromolekül
ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einer biotinylierten
Nukleinsäuresequenz, einem biotinylierten Protein, einem biotinylierten
Kohlehydrat und einem biotinylierten Lipid.
7. Verfahren nach Anspruch 1 worin die Biotin-bindende Verbindung
ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Avidin, Streptavidin und
Derivaten davon.
8. Verfahren nach Anspruch 7, worin die Biotin-bindende Verbindung an ein
Trägermaterial immobilisiert ist.
9. Verfahren nach Anspruch 8, worin das Trägermaterial ein Magnetbead ist.
10. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Biotin-Verbindung nach dem in
Kontakt bringen von der Biotin-bindenden Verbindung abgetrennt wird.
11, Verfahren nach Anspruch 10, worin die Biotin-Verbindung nach dem
Abtrennen gereinigt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11, worin die Biotin-Verbindung gereinigt wird mit
einem Verfahren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
Lyophilisierung, Präzipitation, Filtration und Dialyse.
13. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Komplex vor dem in Kontakt bringen
gereinigt wird.
14. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Biotin-Verbindung an ein
Trägermaterial immobilisiert ist.
15. Verfahren nach Anspruch 1, worin nach der Dissoziation des Komplexes
mindestens eine der Biotin-Verbindung oder Biotin-bindenden Verbindung
durch Massenspektrometrie analysiert wird.
16. Verfahren nach Anspruch 1, worin nach der Dissoziation des Komplexes die
Biotin-bindende Verbindung eine Biotin-bindende Aktivität behält.
17. Verfahren nach Anspruch 1, worin nach der Dissoziation des Komplexes der
Biotin-Anteil der Biotin-Verbindung im Wesentlichen intakt bleibt.
18. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Amin die Formel NH&sub2;R' oder N + H&sub3;R'
besitzt, worin R' ein Alkyl (einschließlich Cycloalkyl), Alkenyl, Alkinyl oder
Aryl, ist und unabhängig für jedes Vorkommen ausgewählt wird.
19. Verfahren nach Anspruch 1, worin das primäre Amin ausgewählt wird nach
sterischer Größe oder Wasserstoffbindungs-Fähigkeit, um eine Dissoziation
zu bewerkstelligen.
20. Verfahren zur Analyse einer biotinylierten Nukleinsäure, umfassend
in Kontakt bringen der biotinylierten Nukleinsäure mit einer Biotin-
bindenden Verbindung, wobei ein Komplex aus biotinylierter
Nukleinsäure : Biotin-bindender Verbindung gebildet wird;
in Kontakt bringen des Komplexes mit einer wirksamen Menge an
Ammoniak oder eines primären Amins unter Bedingungen, so daß der
Komplex dissoziiert;
wobei eine biotinylierte Nukleinsäure und eine Biotin-bindende
Verbindung freigesetzt werden; und
Analysieren der biotinylierten Nukleinsäure.
21. Verfahren nach Anspruch 20, worin die Nukleinsäure DNA ist.
22. Verfahren nach Anspruch 20, worin die Biotin-bindende Verbindung an ein
Trägermaterial immobilisiert wird.
23. Verfahren nach Anspruch 20, worin die biotinylierte Nukleinsäure durch
Massenspektrometrie analysiert wird.
24. Verfahren nach Anspruch 8, worin der Komplex vor dem in Kontakt bringen
mit einer wirksamen Menge eines primären Amins gereinigt wird.
25. Verfahren nach Anspruch 20 oder 22, worin die biotinylierte Nukleinsäure
nach dem in Kontakt bringen des Komplexes mit einer wirksamen Menge
eines primären Amins einer enzymatischen Reaktion unterworfen wird.
26. Verfahren nach Anspruch 20 oder 22, worin die biotinylierte Nukleinsäure
vor dem in Kontakt bringen mit einer Biotin-bindenden Verbindung, wobei
ein Komplex aus biotinylierter Nukleinsäure : Biotin-bindender Verbindung
gebildet wird, einer enzymatischen Reaktion unterworfen wird.
27. Verfahren nach Anspruch 20, worin das primäre Amin ausgewählt wird nach
sterischer Größe oder Wasserstoffbindungs-Fähigkeit, um eine Dissoziation
zu bewerkstelligen.
28. Verfahren nach Anspruch 20, worin das Amin die Formel NH&sub2;R' oder
N + H&sub3;R' besitzt, worin R' ein Alkyl (einschließlich Cycloalkyl), Alkenyl, Alkinyl
oder Aryl, ist und unabhängig für jedes Vorkommen ausgewählt wird.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/649,876 US6022688A (en) | 1996-05-13 | 1996-05-13 | Method for dissociating biotin complexes |
| PCT/US1997/008052 WO1997043617A2 (en) | 1996-05-13 | 1997-05-13 | Method for dissociating biotin complexes |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE69711632D1 DE69711632D1 (de) | 2002-05-08 |
| DE69711632T2 true DE69711632T2 (de) | 2002-10-24 |
Family
ID=24606585
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE69711632T Expired - Lifetime DE69711632T2 (de) | 1996-05-13 | 1997-05-13 | Methode zur dissoziation von biotin komplexen |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6022688A (de) |
| EP (1) | EP0914471B1 (de) |
| JP (1) | JP2000510702A (de) |
| AT (1) | ATE215612T1 (de) |
| AU (1) | AU714707B2 (de) |
| CA (1) | CA2253582A1 (de) |
| DE (1) | DE69711632T2 (de) |
| HK (1) | HK1018967A1 (de) |
| WO (1) | WO1997043617A2 (de) |
Families Citing this family (74)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5795714A (en) * | 1992-11-06 | 1998-08-18 | Trustees Of Boston University | Method for replicating an array of nucleic acid probes |
| US6436635B1 (en) * | 1992-11-06 | 2002-08-20 | Boston University | Solid phase sequencing of double-stranded nucleic acids |
| US5605798A (en) * | 1993-01-07 | 1997-02-25 | Sequenom, Inc. | DNA diagnostic based on mass spectrometry |
| DE69433811T2 (de) | 1993-01-07 | 2005-06-23 | Sequenom, Inc., San Diego | Dns - sequenzierung durch massenspektronomie |
| US6194144B1 (en) | 1993-01-07 | 2001-02-27 | Sequenom, Inc. | DNA sequencing by mass spectrometry |
| US20060063193A1 (en) * | 1995-04-11 | 2006-03-23 | Dong-Jing Fu | Solid phase sequencing of double-stranded nucleic acids |
| US7803529B1 (en) * | 1995-04-11 | 2010-09-28 | Sequenom, Inc. | Solid phase sequencing of biopolymers |
| US6146854A (en) * | 1995-08-31 | 2000-11-14 | Sequenom, Inc. | Filtration processes, kits and devices for isolating plasmids |
| EP0886681A1 (de) | 1996-03-04 | 1998-12-30 | Genetrace Systems, Inc. | Verfahren zur suche von nukleinsäuren mit massenspektroskopie |
| US6022688A (en) * | 1996-05-13 | 2000-02-08 | Sequenom, Inc. | Method for dissociating biotin complexes |
| US5965363A (en) * | 1996-09-19 | 1999-10-12 | Genetrace Systems Inc. | Methods of preparing nucleic acids for mass spectrometric analysis |
| US5777324A (en) | 1996-09-19 | 1998-07-07 | Sequenom, Inc. | Method and apparatus for maldi analysis |
| US7285422B1 (en) * | 1997-01-23 | 2007-10-23 | Sequenom, Inc. | Systems and methods for preparing and analyzing low volume analyte array elements |
| AU735416B2 (en) * | 1996-11-06 | 2001-07-05 | Sequenom, Inc. | Dna diagnostics based on mass spectrometry |
| US6133436A (en) | 1996-11-06 | 2000-10-17 | Sequenom, Inc. | Beads bound to a solid support and to nucleic acids |
| ATE319855T1 (de) | 1996-12-10 | 2006-03-15 | Sequenom Inc | Abspaltbare, nicht-flüchtige moleküle zur massenmarkierung |
| US6323351B1 (en) | 1997-06-30 | 2001-11-27 | The Dow Chemical Company | Process for the direct oxidation of olefins to olefin oxides |
| US6207370B1 (en) | 1997-09-02 | 2001-03-27 | Sequenom, Inc. | Diagnostics based on mass spectrometric detection of translated target polypeptides |
| US6225061B1 (en) | 1999-03-10 | 2001-05-01 | Sequenom, Inc. | Systems and methods for performing reactions in an unsealed environment |
| US20010049438A1 (en) * | 1999-03-19 | 2001-12-06 | Dix Connie Kim | Purification of primer extension products |
| US20020009394A1 (en) | 1999-04-02 | 2002-01-24 | Hubert Koster | Automated process line |
| US7917301B1 (en) | 2000-09-19 | 2011-03-29 | Sequenom, Inc. | Method and device for identifying a biological sample |
| US20030190644A1 (en) | 1999-10-13 | 2003-10-09 | Andreas Braun | Methods for generating databases and databases for identifying polymorphic genetic markers |
| US20030207297A1 (en) * | 1999-10-13 | 2003-11-06 | Hubert Koster | Methods for generating databases and databases for identifying polymorphic genetic markers |
| JP2001245698A (ja) * | 1999-11-22 | 2001-09-11 | Xiao Bing Wang | 核酸検出法 |
| AU2001268468A1 (en) | 2000-06-13 | 2001-12-24 | The Trustees Of Boston University | Use of nucleotide analogs in the analysis of oligonucleotide mixtures and in highly multiplexed nucleic acid sequencing |
| AU2002245047A1 (en) * | 2000-10-30 | 2002-07-24 | Sequenom, Inc. | Method and apparatus for delivery of submicroliter volumes onto a substrate |
| GB0102568D0 (en) * | 2001-02-01 | 2001-03-21 | Magnetic Biosolutions Sweden A | Method |
| US20030036057A1 (en) * | 2001-03-09 | 2003-02-20 | Andreas Braun | Genes and polymorphisms associated with cardiovascular disease and their use |
| US20020155587A1 (en) | 2001-04-20 | 2002-10-24 | Sequenom, Inc. | System and method for testing a biological sample |
| US7858560B2 (en) * | 2001-07-16 | 2010-12-28 | Caprotec Bioanalytics Gmbh | Capture compounds, collections thereof and methods for analyzing the proteome and complex compositions |
| EP1450957A1 (de) * | 2001-10-26 | 2004-09-01 | Sequenom, Inc. | Verfahren und vorrichtung für probenhandhabungs-fertigungssysteme mit hohem durchsatz |
| US20030166007A1 (en) * | 2002-01-28 | 2003-09-04 | Mds Proteomics Inc. | Chemical proteomics |
| US20030157575A1 (en) * | 2002-01-28 | 2003-08-21 | Shane Climie | Chemical proteomics |
| WO2003066882A2 (en) * | 2002-02-06 | 2003-08-14 | Tethys Bioscience, Inc. | Method and apparatus for validating dna sequences without sequencing |
| KR20020041344A (ko) * | 2002-02-26 | 2002-06-01 | 김희태 | 멤브레인 크로마토그래프 기법을 활용하여핵산중합반응으로 증폭된 핵산을 검출하는 방법 |
| AU2003224674A1 (en) * | 2002-03-11 | 2003-09-29 | Hk Pharmaceuticals, Inc. | Compounds and methods for analyzing the proteome |
| EP1501863A4 (de) * | 2002-05-03 | 2007-01-24 | Sequenom Inc | Kinaseankerproteinmuteine, peptide davon und damit im zusammenhang stehende verfahren |
| AU2003301353A1 (en) * | 2002-10-18 | 2004-05-04 | Cylene Pharmaceuticals | Processes for identifying quadruplex-targeted antiviral molecules |
| CN1774511B (zh) * | 2002-11-27 | 2013-08-21 | 斯昆诺有限公司 | 用于序列变异检测和发现的基于断裂的方法和系统 |
| EP2259068B1 (de) * | 2003-01-16 | 2013-08-14 | caprotec bioanalytics GmbH | Fangverbindungen und Verfahren zur Analyse des Proteoms |
| ES2338654T5 (es) | 2003-01-29 | 2017-12-11 | 454 Life Sciences Corporation | Amplificación de ácidos nucleicos en emulsión de perlas |
| US20070141570A1 (en) * | 2003-03-07 | 2007-06-21 | Sequenom, Inc. | Association of polymorphic kinase anchor proteins with cardiac phenotypes and related methods |
| EP1618216A2 (de) * | 2003-04-25 | 2006-01-25 | Sequenom, Inc. | Auf fragmentierung beruhende verfahren und systeme zur de-novo-sequenzierung |
| WO2005010145A2 (en) | 2003-07-05 | 2005-02-03 | The Johns Hopkins University | Method and compositions for detection and enumeration of genetic variations |
| EP2107129B1 (de) | 2003-07-31 | 2012-08-22 | Sequenom, Inc. | Verfahren für Multiplex-Polymerasekettenreaktionen auf hohem Niveau und homogene Massenausdehnungsreaktionen zur Genotypisierung von Polymorphismen |
| WO2005074417A2 (en) * | 2003-09-03 | 2005-08-18 | Salk Institute For Biological Studies | Multiple antigen detection assays and reagents |
| US9394565B2 (en) * | 2003-09-05 | 2016-07-19 | Agena Bioscience, Inc. | Allele-specific sequence variation analysis |
| US7927797B2 (en) * | 2004-01-28 | 2011-04-19 | 454 Life Sciences Corporation | Nucleic acid amplification with continuous flow emulsion |
| US7608394B2 (en) | 2004-03-26 | 2009-10-27 | Sequenom, Inc. | Methods and compositions for phenotype identification based on nucleic acid methylation |
| US9249456B2 (en) * | 2004-03-26 | 2016-02-02 | Agena Bioscience, Inc. | Base specific cleavage of methylation-specific amplification products in combination with mass analysis |
| CN101072882A (zh) * | 2004-09-10 | 2007-11-14 | 塞昆纳姆股份有限公司 | 用于核酸长程序列分析的方法 |
| US20090291437A1 (en) * | 2005-11-02 | 2009-11-26 | O'brien Sean | Methods for targeting quadruplex sequences |
| EP2236623A1 (de) | 2006-06-05 | 2010-10-06 | Cancer Care Ontario | Feststellung des Risikos für Kolorektalkrebs |
| CA2679954A1 (en) | 2007-03-05 | 2008-09-12 | Cancer Care Ontario | Assessment of risk for colorectal cancer |
| US8097422B2 (en) | 2007-06-20 | 2012-01-17 | Salk Institute For Biological Studies | Kir channel modulators |
| WO2009039122A2 (en) | 2007-09-17 | 2009-03-26 | Sequenom, Inc. | Integrated robotic sample transfer device |
| JP2011502162A (ja) * | 2007-10-29 | 2011-01-20 | ザ ユニバーシティー オブ カリフォルニア | 変形性関節症遺伝子治療 |
| US20100159506A1 (en) * | 2008-07-25 | 2010-06-24 | Cellscape Corporation | Methods and systems for genetic analysis of fetal nucleated red blood cells |
| WO2010087994A2 (en) | 2009-01-30 | 2010-08-05 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Methods for ligation and uses thereof |
| WO2011034115A1 (ja) * | 2009-09-17 | 2011-03-24 | Jsr株式会社 | アビジンとビオチン誘導体の解離方法及び解離剤 |
| US8774488B2 (en) | 2010-03-11 | 2014-07-08 | Cellscape Corporation | Method and device for identification of nucleated red blood cells from a maternal blood sample |
| US9139874B2 (en) | 2011-07-07 | 2015-09-22 | Life Technologies Corporation | Bi-directional sequencing compositions and methods |
| SG11201404991YA (en) | 2012-02-23 | 2014-09-26 | Stage Cell Therapeutics Gmbh | Chromatographic isolation of cells and other complex biological materials |
| EP3250928A1 (de) * | 2015-01-26 | 2017-12-06 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts | Verfahren zur quantitativen freisetzung von biotinylierten peptiden und proteinen aus streptavidin-komplexen |
| EP3353310B1 (de) | 2015-09-25 | 2020-04-29 | H. Hoffnabb-La Roche Ag | Verfahren zur herstellung von thioestern unter verwendung einer sortase a |
| JP6998863B2 (ja) | 2015-09-25 | 2022-02-04 | エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー | 深共融溶媒におけるソルターゼａを利用したアミド基転移 |
| JP6998862B2 (ja) | 2015-09-25 | 2022-02-04 | エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー | 可溶性ソルターゼａ |
| EP4218833A1 (de) | 2015-10-01 | 2023-08-02 | Whitehead Institute for Biomedical Research | Markierung von antikörpern |
| MA45489A (fr) | 2015-10-22 | 2018-08-29 | Juno Therapeutics Gmbh | Procédés de culture de cellules, kits et appareil associés |
| CN108474002B (zh) | 2015-10-22 | 2023-05-23 | 朱诺治疗学有限公司 | 用于转导的方法、反应剂盒、反应剂和设备 |
| WO2017167712A1 (en) | 2016-03-30 | 2017-10-05 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Improved sortase |
| MA49288A (fr) | 2017-04-27 | 2020-03-04 | Juno Therapeutics Gmbh | Reactifs particulaires oligomères et leurs méthodes d'utilisation |
| CA3145575A1 (en) | 2020-02-03 | 2021-08-12 | Illumina, Inc. | Biotin-streptavidin cleavage composition and library fragment cleavage |
Family Cites Families (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5283342A (en) * | 1992-06-09 | 1994-02-01 | Neorx Corporation | Biotinylated small molecules |
| US4282287A (en) | 1980-01-24 | 1981-08-04 | Giese Roger W | Biochemical avidin-biotin multiple-layer system |
| EP0120807B1 (de) * | 1983-02-24 | 1989-01-18 | Ciba-Geigy Ag | Reaktivfarbstoffe, deren Herstellung und Verwendung |
| US4762881A (en) | 1987-01-09 | 1988-08-09 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Photoreactive benzoylphenylalanines and related peptides |
| US5252743A (en) | 1989-11-13 | 1993-10-12 | Affymax Technologies N.V. | Spatially-addressable immobilization of anti-ligands on surfaces |
| WO1991011533A1 (en) * | 1990-01-26 | 1991-08-08 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Method for isolating primer extension products from template-directed dna polymerase reactions |
| US5387505A (en) * | 1990-05-04 | 1995-02-07 | Eastman Kodak Company | Preparation and isolation of single-stranded biotinylated nucleic acids by heat avidin-biotin cleavage |
| US5292444A (en) * | 1992-10-02 | 1994-03-08 | Exxon Research And Engineering Company | Lube oil compositions containing fullerene-grafted polymers |
| US5605798A (en) | 1993-01-07 | 1997-02-25 | Sequenom, Inc. | DNA diagnostic based on mass spectrometry |
| DE69433811T2 (de) * | 1993-01-07 | 2005-06-23 | Sequenom, Inc., San Diego | Dns - sequenzierung durch massenspektronomie |
| US5527675A (en) * | 1993-08-20 | 1996-06-18 | Millipore Corporation | Method for degradation and sequencing of polymers which sequentially eliminate terminal residues |
| US5643722A (en) | 1994-05-11 | 1997-07-01 | Trustees Of Boston University | Methods for the detection and isolation of proteins |
| JP3612092B2 (ja) * | 1994-09-07 | 2005-01-19 | 株式会社日立製作所 | Ｄｎａの分離・分取法及びその解析法 |
| US5830655A (en) | 1995-05-22 | 1998-11-03 | Sri International | Oligonucleotide sizing using cleavable primers |
| US5605708A (en) | 1995-09-11 | 1997-02-25 | Cummins Eagle, Inc. | Rounder apparatus for processing bakery dough |
| US5928906A (en) | 1996-05-09 | 1999-07-27 | Sequenom, Inc. | Process for direct sequencing during template amplification |
| US6022688A (en) * | 1996-05-13 | 2000-02-08 | Sequenom, Inc. | Method for dissociating biotin complexes |
| DE19782096T1 (de) | 1996-11-06 | 2000-03-23 | Sequenom Inc | Immobiliserung von Nucleinsäuren in hoher Dichte |
| AU735416B2 (en) | 1996-11-06 | 2001-07-05 | Sequenom, Inc. | Dna diagnostics based on mass spectrometry |
| US6133436A (en) | 1996-11-06 | 2000-10-17 | Sequenom, Inc. | Beads bound to a solid support and to nucleic acids |
| US5900481A (en) | 1996-11-06 | 1999-05-04 | Sequenom, Inc. | Bead linkers for immobilizing nucleic acids to solid supports |
| EP0937097B1 (de) | 1996-11-06 | 2001-08-16 | Sequenom, Inc. | Zusammensetzungen und verfahren zur immobilisierung von nukleinsäure auf festträgern |
-
1996
- 1996-05-13 US US08/649,876 patent/US6022688A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-05-13 CA CA002253582A patent/CA2253582A1/en not_active Abandoned
- 1997-05-13 AU AU31232/97A patent/AU714707B2/en not_active Ceased
- 1997-05-13 DE DE69711632T patent/DE69711632T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-05-13 AT AT97926469T patent/ATE215612T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-05-13 WO PCT/US1997/008052 patent/WO1997043617A2/en active IP Right Grant
- 1997-05-13 JP JP09541041A patent/JP2000510702A/ja not_active Ceased
- 1997-05-13 EP EP97926469A patent/EP0914471B1/de not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-06-21 US US09/337,388 patent/US6303309B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-30 HK HK99102761A patent/HK1018967A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU714707B2 (en) | 2000-01-06 |
| EP0914471B1 (de) | 2002-04-03 |
| JP2000510702A (ja) | 2000-08-22 |
| EP0914471A2 (de) | 1999-05-12 |
| US6022688A (en) | 2000-02-08 |
| ATE215612T1 (de) | 2002-04-15 |
| US6303309B1 (en) | 2001-10-16 |
| HK1018967A1 (en) | 2000-01-14 |
| DE69711632D1 (de) | 2002-05-08 |
| WO1997043617A2 (en) | 1997-11-20 |
| CA2253582A1 (en) | 1997-11-20 |
| AU3123297A (en) | 1997-12-05 |
| WO1997043617A3 (en) | 1998-02-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE69711632T2 (de) | Methode zur dissoziation von biotin komplexen | |
| EP0925373B1 (de) | Verfahren zum nachweis von nukleinsäuren unter ermittlung der masse | |
| DE69626196T2 (de) | Dna-diagnostik mittels massenspektrometrie | |
| DE69605669T2 (de) | Bestimmung der Oligonucleotid-Länge unter Verwendung von spaltbaren Primern | |
| DE69708865T2 (de) | Verfahren zur direkten sequenzierung während "template"-amplifikation | |
| DE69322266T2 (de) | Proben zusammensetzung und verfahren | |
| US8133701B2 (en) | Detection and quantification of biomolecules using mass spectrometry | |
| US9051608B2 (en) | Detection and quantification of biomolecules using mass spectrometry | |
| DE68918657T2 (de) | Verfahren zum Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen. | |
| CA2671864C (en) | Detection and quantification of biomolecules using mass spectrometry | |
| DE3885027T2 (de) | Amplifikationsverfahren zum Nachweis von Polynukleotide. | |
| DE3689412T2 (de) | Verfahren zur durchführung von hybridisierungstests von nukleinsäuren. | |
| DE69534389T2 (de) | Mit PNA- und Amidat-Etiketten bestückte Festphasenträger | |
| EP1036202B1 (de) | Verfahren zur identifikation von nucleinsäuren durch matrix-assistierte laser desorptions/ionisations massenspektrometrie | |
| DE69927343T2 (de) | Verfahren und mittel zur analyse der nukleotidsequenz von nukleinsäuren | |
| DE60128900T2 (de) | Massenmarker | |
| DE60033825T2 (de) | Detektion von unterschieden in nukleinsäuren durch inhibierung spontaner dna verzweigungsmigration | |
| DE3888653T2 (de) | Verfahren und Testsatz zum Nachweis einer Nukleinsäure-Sequenz. | |
| DE3853993T2 (de) | Verfahren zum nachweis der zielnukleinsäure in einem specimen. | |
| DE69215169T2 (de) | Nachweis von komplementären Nukleotid-Sequenzen | |
| DE19941756A1 (de) | Verfahren zur Verwendung von oligomeren Nucleinsäure-Protein-Konjugaten als Reagenzien für immunologische Nachweisverfahren insbesondere die Immuno-PCR | |
| Miyaguchi | Improved polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism genotyping of toxic pufferfish by liquid chromatography/mass spectrometry | |
| DE10253068A1 (de) | Verfahren zur Analyse von Methylierungsmustern in Nukleinsäuren mittels Massenspektrometrie | |
| CA2415260A1 (en) | Methods of screening nucleic acids using mass spectrometry |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8364 | No opposition during term of opposition |