DE69612048T2

DE69612048T2 - Method für die Herstellung von Sekundärmetaboliten

Info

Publication number: DE69612048T2
Application number: DE69612048T
Authority: DE
Inventors: Stephanie Gail Burton; Edmund Petrus Jacobs; Winston Daniel Leukes; Peter Dale Rose; Ronald Douglas Sanderson
Original assignee: Water Research Commission
Current assignee: Water Research Commission
Priority date: 1995-09-01
Filing date: 1996-09-02
Publication date: 2001-10-11
Anticipated expiration: 2016-09-03
Also published as: ATE199701T1; EP0761608B1; DE69612048D1; US5945002A; EP0761608A3; EP0761608A2; DK0761608T3; GR3036003T3

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Sekundärmetaboliten und ferner auf die Behandlung von Abwasser in einem Bioreaktor unter Nutzung der Fähigkeit bestimmter Mikroorganismen, Sekundärmetabolite herzustellen.
In Gegenwart einer Nährlösung von ausreichend hoher Konzentration zeigen die meisten Mikroorganismen exponentielles Wachstum. Dies wird auch hierin als primäres Wachstum bezeichnet. Wenn die Konzentration der Nährlösung sinkt, schalten die Mikroorganismen als Antwort auf den durch Nährstoffmangel verursachten Streß um, was hier als Sekundärmetabolismus bezeichnet wird, indem sie beginnen, Sekundärmetabolite zu produzieren.
Bestimmte Sekundärmetabolite haben nützliche Eigenschaften. Phanerochaete chrysosporium zum Beispiel ist ein Fadenpilz, der in der Lage ist, einen breiten Bereich von hartnäckigen aromatischen Schadstoffen abzubauen. Diese Verbindungen umfassen Verbindungen vom Typ BTEX (Benzol, Toluol, Ethylbenzol und Xylol), DDT, TCDD (2,3,7,8- Tetrachlordibenzo-p-dioxin), Benz(a)pyren, Lindan und bestimmte PCB-Verwandte. Dieser Organismus wurde somit als Kandidat zur biologischen Sanierung von Abwässern; die solche Schadstoffe enthalten, in Erwägung gezogen.
Diese Abbaufähigkeit ist teilweise eine Folge der Sekretion, während des Sekundärmetabolismus, ausgelöst durch nahrungsmittellimitierende Bedingungen, von einer Gruppe von H&sub2;O&sub2;-produzierenden Oxidasen ebenso wie einer Gruppe von Peroxidasen, genannt Ligninperoxidase (LiP). In Gesamtzellkulturen tritt jedoch ein bestimmter Grad an Bioabbau dieser Komponenten unabhängig von der Sekretion dieser Enzyme auf.
Verschiedene Probleme sind bei dem Versuch aufgetreten, eine effiziente Herstellung der ligninolytischen Enzyme dieses Pilzes zu erreichen und bei der Verwendung des Pilzes für die Abwasserbehandlung unter Einsatz herkömmlicher Bioreaktortechnologie. Existierende Verfahren zur Herstellung von Sekundärmetaboliten für ausgedehnte Zeiträume sind normalerweise aufeinander folgende Batchverfahren. Die Verfahren sind häufig langsam und die Ausbeuten gering und Schwierigkeiten bei dem Versuch, die Verfahren im großen Umfang zur kommerziellen Nutzung zu erhöhen, sind aufgetreten. In jedem Zyklus des Batchverfahrens ist eine lange lag-Phase. Danach dauert die primäre Wachstumsphase ungefähr 3 Tage an, nach der der Sekundärmetabolismus startet. Die Enzyme von Interesse sind normalerweise nach 5 Tagen hergestellt und die Herstellung endet normalerweise nach 7 Tagen. Nach ungefähr 8 Tagen beginnen die Mikroorganismen Sporen zu bilden und zu sterben.
US-A-4554075 offenbart ein Verfahren zum Abbau chlororganischer Verbindungen, die im flüssigen Abfall oder Abwasser enthalten sind, unter Verwendung eines weiß-roten Pilzes als der aktive Bestandteil in dem chlororganischen Abbau. Der Pilz wurde auf aufgerauhten Scheiben eines rotierenden biologischen Kontaktreaktors kultiviert, um Mycelmatten oder -filme auf den Scheiben zu bilden. Danach wurde der Pilz durch Nahrungsmittelentzug veranlaßt, in ein Stadium des Sekundärmetabolismus einzutreten. Mit dem Pilz im Stadium des Sekundärmetabolismus wird der flüssige Abfall oder das Abwasser dem Pilz auf den rotierenden Scheiben ausgesetzt, was zu einem Abbau der chlororganischen Verbindungen im flüssigen Abfall oder Abwasser führt. Die Scheiben sind zum Teil in die Flüssigkeit eingetaucht und der abgeschlossene Raum über dem Flüssigkeitsniveau besitzt eine sauerstoffangereicherte Atmosphäre. Verbesserungen in der Wirksamkeit und der aktiven Lebenszeit des Pilzes werden durch die Zugabe von Stickstoff, Nährstoffmineralien und einem Detergenz zum Abwasser erreicht, wobei der Prozess trotzdem im wesentlich ein Batchverfahren ist.
Venkatadri et al. "Cultivation of Phanerochaete chrysosporium and production of lignin peroxidase in novel biofilm reactor systems: hollow fiber reactor and silicone membrane reactor" Water Research. Vol. 27, No.4, April 1993, Exeter, GB, Seiten 591-596 offenbart einen Hohlfaserreaktor, der einen Biofilm aus Phanerochaete chrysosporium, immobilisiert an der Außenseite der Fasern, besitzt und ein Flüssigmedium, das in den Fasern fließt, umfaßt. Es erwähnt die Verwendung von P. chrysosporium zur Behandlung von Abfall. Der Austausch von Nährstoffen und metabolischen Produkten findet durch die Mikroporenstruktur der Hohlfasern statt und das flüssige Medium ist auf die Innenseite der Fasern beschränkt. Das Wachstum des Biofilms wird durch die Zirkulation eines Wachstumsmediums durch die Fasern erreicht. Nach Wachstum des Biofilms wird das Wachstumsmedium durch ein Produktionsmedium ersetzt, das zur Entwicklung von Ligninperoxidaseaktivität führt. Das Verfahren ist im wesentlichen ein Batchverfahren.
Es ist Zweck der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Produktion von Sekundärmetaboliten zur Verfügung zu stellen, das auf einer beständigen Grundlage arbeiten kann. Entsprechend der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Sekundärmetaboliten zur Verfügung gestellt, wobei die Methode umfaßt: die Bereitstellung eines porösen Substrates, das einen Micran gebundenen Biofilm eines Mikrorganismus besitzt;
das Strömen einer Nährstofflösung durch das Substrat mit einer Geschwindigkeit, die ausreichend niedrig ist, daß sich ein Nährstoffgradient über den Biofilm aufbaut, so daß die Nährstoffkonzentration bei einem hohen Niveau entlang des Gradienten ausreichend hoch ist, um Primärwachstum eines Mikroorganismus zu unterstützen, und die Nährstoffkonzentration bei einem niedrigen Niveau entlang des Gradienten ausreichend niedrig ist, um den Sekundärmetabolismus in dem Mikroorganismus zu induzieren, wobei ein Sekundärmetabolit auf einer kontinuierlichen Basis erzeugt wird.
Das Substrat kann in der Form einer Hohlfasermembran vorliegen, wobei der Biofilm sich auf der Außenseite der Membran befindet.
Die Hohlfasermembran kann eine relativ dünne, poröse Haut auf der Innenseite besitzen und eine relativ dicke, fingerähnliche, außen nicht mit der Haut versehene Hohlraumstruktur, die von der Haut nach außen verläuft, besitzen. Sie kann einen Außendurchmesser von ungefähr 2 mm besitzen, eine poröse Haut mit einer Dicke von 1 um und eine Hohlraumstruktur mit einer Dicke von ungefähr 300 um haben.
Die Außenseite des Biofilms kann mit einem sauerstoffhaltigen Gas in Kontakt gebracht werden, um Sauerstoff für den Metabolismus bereitzustellen. Das sauerstoffhaltige Gas kann Luft sein.
Das sauerstoffhaltige Gas kann über die äußere Oberfläche des Biofilms geblasen werden, um Sporen und tote Zellen des Mikroorganismus abzutragen.
Der Mikroorganismus kann ein Fadenpilz sein. Der Fadenpilz kann Phanerochaete chrysosporium sein.
Weiterhin ist entsprechend der Erfindung ein Verfahren zur Behandlung nährstoffhaltigen Abwassers, das organische Verunreinigungen enthält, durch die Aktivität eines Sekunkdärmetaboliten zur Verfügung gestellt, wobei das Verfahren umfaßt:
Bereitstellen eines porösen Substrats, an dem ein Biofilm eines Mikroorganismus gebunden ist;
das Strömen des Abwassers durch das Substrat mit einer Geschwindigkeit, die ausreichend niedrig ist, daß sich ein Nährstoffgradient über den Biofilm aufbaut, so daß die Nährstoffkonzentration mit einem hohen Niveau entlang des Gradienten ausreichend hoch ist, um Primärwachstum des Mikroorganismus zu unterstützen, und die Nährstoffkonzentration bei einem niedrigen Niveau entlang des Gradienten ausreichend niedrig ist, um Sekundärmetabolismus des Mikroorganismus zu induzieren, wobei ein Sekundärmetabolit auf einer kontinuierlichen Basis erzeugt wird.
Die Erfindung wird nun mehr im Detail mit Hilfe von Beispielen und unter Bezugnahme auf die beigefügten Diagramme und Zeichnungen erläutert.
In den Zeichnungen:
Fig. 1 zeigt eine Bioreaktorinstallation für die kontinuierliche Behandlung von Abwasser durch den Fluß des Abwassers durch einen Biofilm;
Fig. 2 ist ein Querschnitt durch eine Hohlfasermembran, die im Bioreaktor verwendet wird, um den Biofilm zu unterstützen;
Fig. 3 bis 13 sind graphische Darstellungen verschiedener experimenteller Ergebnisse.
Unter Bezugnahme auf die Zeichnungen im Detail gibt die Referenznummer 10 allgemein eine Abwasserbehandlungsinstallation an, in der Abwasser, das zu behandeln ist, über die Leitung 12 in das Reservoir 14 geleitet wird. Das Abwasser wird vom Reservoir abgezogen und mit Hilfe der Pumpe 16 durch einen Hohlfasermembranbioreaktor 18 gepumpt. Der Membranbioreaktor 18 umfaßt eine große Anzahl von kapillaren Hohlfasermembranen 20, die in der Hülle 22 eingeschlossen sind. Das Abwasser fließt durch das kapillare Lumen 24 der Hohlfasermembranen 20 vom einen Ende zum anderen. Das aus dem anderen Ende der Hohlfasermembranen 20 herausfließende Wasser wird in das Reservoir 14 zur Rezirkulation zurückgeleitet.
Einiges Abwasser permittiert durch die Membran 20 und wird im extrakapillaren Raum des Bioreaktors gesammelt, von wo es durch eine Auswaschleitung 26 abgeführt wird.
Der extrakapillare Raum des Bioreaktors 18 ist mit Hilfe von Luft ventiliert, welche über die Luftzufuhr 28 in die Umhüllung geblasen wird und die Umhüllung zusammen mit dem Permeat über die Ablaufverbindung 26 verläßt.
Um den Bioreaktor 18 zur Produktion vorzubereiten, werden die Hohlfasermembranen 20 mit einem geeigneten Mikroorganismus sowie P. chrysosporium inokuliert. Das kann mit, Hilfe der reversen Filtration durchgeführt werden, d. h. durch Etablieren eines reversen Flusses von Wasser durch die Membran, wobei das Wasser Sporen des Mikroorganismus in Suspension trägt. Während eines Zeitabschnitts kann sich der Organismus an die Membran anheften. Hat dieses stattgefunden, ist der Bioreaktor fertig zum Gebrauch.
Das Abwasser enthält Nährstoffe, die das Wachstum des Mikroorganismus unterstützen. Als eine Konsequenz entwickelt sich ein Biofilm 30 des immobilisierten Mikroorganismus an der Außenseite der Membran 20. Die Membran 20 kann eine Polysulfon- oder Polyethylensulfonultrafiltrationsmembran sein, die eine poröse Haut 32 auf der Innenseite und eine Hohlraumstruktür 34, bestehend aus einem fingerähnlichen Hohlraum, der von der Haut nacl< außen verläuft, besitzt. Die Membran 20 wird typischerweise einen Durchmesser von 2 mm haben, die Haut 32 eine Dicke von ungefähr 1 um und die Hohlraumstruktur 34 eine Dicke von bis zu 300 um. Solche Membranen sind in unserer anhängigen Europäischen Patentanmeldung 96304167.8, eingereicht am 06. Juni 1996 und mit einer beanspruchten Priorität vom ZA 95/4648 vom 6. Juni 1995 beschrieben. Publikationsnummer EP-A- 0 747 112. Die Hohlraumstruktur 34 bildet offene Durchgänge, welche um ein Vielfaches größer im Querschnitt sind, als die Poren der Haut 32. Dies ermöglicht die Entwicklung eines relativ dicken Biofilms von ungefähr 300 um auf der Membran 20, wobei der Biofilm eng an die Membran gebunden ist.
Der Fluß des Permeats durch die Membran sollte niedrig genug sein, so daß sich ein Nährstoffgradient über den Biofilm aufbaut. In der Nähe des Lumens 24 der Membran sollte die Nährstoffkonzentration hoch genug sein, um das Primärwachstum der Biofilmpopulation zu unterstützen, wobei in einer Richtung auf die Außenseite des Biofilms hin die Nährstoffkonzentration auf ein Niveau fallen sollte, was die Biofilmpopulation dazu anregt, auf den Sekundärmetabolismus zu wechseln, was zur Produktion von Sekundärmetaboliten führt.
Wenn eine neue Biomasse entsteht, werden die älteren Zellen nach außen hin ersetzt, bis sie sich von der Außenseite der Oberfläche des Biofilms lösen. Wenn die Zellen von der Innenseite des Biofilms an die Außenseite gelangen, bewegen sie sich von einer Umgebung, die nährstoffreich ist und daher das Primärwachstum unterstützt, zu einer Umgebung, die nährstoffarm ist und den Mikroorganismus dazu veranlaßt, zum sekundären Metabolismus umzuschalten und daher zur Produktion von Sekundärmetaboliten führt. Der Prozeß ist stabil und andauernd und kann daher auf einer kontinuierlichen Basis durchgeführt werden. Ebenso kann die Dicke des Biofilms und die Immobilisierung des Organismus dazu beitragen, daß die Produktionsrate des Sekundärmetaboliten hoch ist.
Die Luft, die durch die Bioreaktorhülle geblasen wird, dient der Versorgung mit Sauerstoff, der für das Überleben des Biofilms notwendig ist und trägt außerdem Sporen und tote Zellen fort, die von der äußeren Oberfläche des Biofilmes abgegeben werden.
Das in den Zeichnungen verdeutlichte Verfahren führt zu einem ausflußbehandelten Abwasser in der Ablaufverbindung 26, wobei die Sekundärmetabolite, die produziert worden sind, dazu dienen, die Verunreinigungen im Abwasser abzubauen. Jedoch wird auch ge würdigt, daß das Verfahren auch für den spezifischen Zweck der Herstellung von wertvollen Sekundärmetabolitprodukten genutzt werden kann. In diesem Fall wird eine Nährstofflösung durch einen Bioreaktor gegeben und das Permeat enthält die Sekundärmetabolitprodukte, die über die Ablaufverbindung des Reaktors abgezapft werden können.

Experimentelle Ergebnisse

Ein Membranbioreaktorsystem wurde für die kontinuierliche Herstellung von LiP in geringen Mengen entwickelt, wobei eine hohe Biomassedichte erhalten wurde. Das Ziel war die Bestimmung einiger der Faktoren, die die Fähigkeit des Systems bei der Entfernung von Cresol aus einem synthetischen Abwasser beeinflussen. Cresol wurde als eine Modellverunreinigung benutzt, da es ein einfaches Beispiel für eine phenolische Verbindung ist und cresolische Abwässer in vielen Industrien weit verbreitet sind.
Der Membranreaktor wurde als ein Gradostat zur kontinuierlichen Sekundärmetabolitherstellung betrieben. Das beinhaltete die Inokulation des Reaktors mit Pilzsporen auf einer Membran mit einer ringförmigen Wandmorphologie, wie in der vorher erwähnten anhängigen Patentanmeldung beschrieben. Der Reaktor wurde mit Wachstumsmedium vom Lumen bis zu den extrakapillaren Räumen durchdrungen. Angefeuchtete Luft wurde auf die extrakapillaren Räume des Membranreaktors aufgebracht, um den sich entwickelnden Biofilm mit dem notwendigen Sauerstoff zu versorgen, eine relativ hohe Scherungsumgebung, um tote Biomasse vom auf der Membran immobilisierten Biofilm zu entfernen und um den Ausfluß vom Reaktor auszuwaschen, zur Verfügung gestellt. Das führte zur Entwicklung eines dichten, dicken, kontinuierlichen Biofilms auf der Membran.
Die Etablierung diffusiver Nährstoffgradienten radial über den Biofilm wurde ermöglicht. Diese Gradienten ergaben sich aus der Erschöpfung der Nährstoffe und des Wachstumsmediums beim Durchdringendes Biofilms. Das führte dazu, daß in der Biomasse, die dem Lumen am nächsten angesiedelt ist, eine nährstoffreiche Umgebung existiert, während die Biomasse, die radial entfernt von dem Lumen der Kapillarmembran liegt, nährstoffarme Bedingungen vorfindet, so daß diese Biomasse zum Sekundärmetabolismus umschaltet und die ligninolytischen Enzyme produziert. Diese Biomasse stirbt schließlich oder sporuliert und löst siöh von der Außenseite des Biofilms ab. Somit wird eine Zone neuer Biomasse kontinuierlich vom Lumenende des Biofilms her gebildet, während eine Zone von Biomasse immer ligninolytische Enzyme produziert und die tote Biomasse und Sporen kontinuierlich abgelöst werden. Dies führt zu einem kontinuierlichen, dynamischen Gleichgewicht, das über lange Zeitperioden erhalten werden kann.
Anfängliche Studien haben gezeigt, daß der hauptsächliche Faktor, der die Entfernungsrate des Creosols, eine modellaromatische Verbindung, aus einem synthetischen Wachstumsmedium beeinflußt, der Transmembranfluß des Mediums ist. Es wird vermutet, daß dieses Phänomen nicht nur eine einfache Funktion der Verweildauer des Creosols im Biofilm ist, sondern eine komplexe Interaktion von verschiedenen Faktoren umfaßt.
Es wurde dann ein biologischer Kontakter mit Umkehrfluß und hohen volumetrischen Stoffübergangskoeffizienten entwickelt, um folgende Eigenschaften zu erzielen:
(1) eine große Anzahl von Hohlfasermembranen, vollständig voneinander getrennt, können in einem kleinvolumigen Reaktor konfiguriert werden. Die Tatsache, daß die Membranen nicht in Kontakt miteinander stehen, ist für die saubere Biofilmunterscheidung jeder Membran wichtig.
(2) Die Membranen sind in einer wechselseitigen senkrechten Konfiguration angeordnet und besitzen getrennte Flüssigkeitszufuhrkanäle für jede Richtung, die eine Flexibilität ün Bereich von Nährstoffzufuhr und Produktextraktion ermöglichen.
(3) Trotzt der großen Menge von zur Verfügung gestellter Membranoberfläche sind die individuellen Membranen ausreichend groß, um Starling-Fließbedingungen vorzubeugen, die das System nachteilig beeinflussen würden.
(4) Luft kann quer zu den Membranen verabreicht werden, um einen guten Massentransfer zur Verfügung zu stellen, ohne auf zu hohe Drücke oder hohe Fließgeschwindigkeiten zurückgreifen zu müssen, wie es der Fall mit axial Flußsystemen wäre.
Phanerochaete chrysosporium DSM 1556 (äquivalent zu ATCC 34541) wurde eingesetzt. Das verwendete Wachstumsmedium war ähnlich dem von Tien und Kirk (Tien, M und Kirk" T K (1988) Lignin Peroxidase of Phanerochaete chrysösporium, Methods Enzymology, verwendeten, mit der Ausnahme, daß Veratrylalkolol ausgeschlossen wurde.
Die verwendeten Membranen waren äußerlich unbehäutete Polysulfonkapillaren, wie in der zuvor erwähnten, anhängigen Patentanmeldung beschrieben.
Vor Benutzung wurden die Reaktoren mit Formaldehyd sterilisiert und mit sterilem destillierten Wasser gespült. Die Reaktoren wurden mit einer Suspension aus Sporen und homogenisiertem Mycel inokuliert. Diese wurden durch Waschen von Schrägagar, enthaltend Sporolationsmedium (wie bei Tien und Kirk beschrieben), zuvor 7 Tage inokuliert, gewonnen. Das Wachstumsmedium wurde durch beide Kanäle des Reaktors für 4 Tage rezirkuliert, bis eine LiP-Herstellung beobachtet wurde. Danach wurde zu frischem Wachstumsmedium Cresol hinzugefügt und durch die Reaktoren rezirkuliert. Die zwei Reaktoren arbeiteten wie folgt:
Reaktor 1: hoher Durchfluß Reaktor 2: niedriger Durchfluß
Proben wurden ebenso von dem aufkommenden Ausfluß, wie auch von dem rezirkulierten Medium, als eine Kontrolle, zur selben Zeit gesammelt. Diese wurden auf die p- Creosolkonzentration, ebenso wie auf den pH und das relative Redoxpotential hin untersucht. Proben von dem Ausfluß des Reaktors wurden auch 24 Stunden nach Erscheinen genommen und auf die p-Creosolkonzentration hin untersucht.
p-Creosol wurde unter Verwendung einer Beckman-System-Gold-HPLC-Einheit mit Beckman-System-Gold-Software für Chromatographieanlaysen bestimmt. Eine Reversphasen- Machery-Nagel Nucleosil 5 u-Säule wurde mit Wasser : Acetonotril (6 : 4) in der mobilen Phase und einer Flußrate von 1 ml/min verwendet. p-Creosol wurde mit Hilfe eines Diode-Array- UV-Detektors bei 254 nm detektiert. Die Tests wurden in doppelter Ausführung durchgeführt und die Durschnittswerte verwendet.
Die Reaktoren liefen für eine Gesamtzeit von 160 Stunden. Die Versuche des Creosolabbaus begannen nach einer Laufzeit von 96 Stunden, nach der sich ein geeigneter Biofilm würde haben etablieren können.
Die Reaktorleistung wurde im Sinne von Wirksamkeit bewertet, welche hier, als die Reduktion der Creosolkonzentration im Medium nach einem einzigen Durchfluß durch den Biofilm, ausgedrückt als prozentuale Entfernung von Creosol aus dem rezirkulierten Medium, definiert ist. Die Reaktorleistung ist auch im Sinne von Produktivität ausgedrückt worden, welche als die Menge entfernten Creosols in mg pro Zeiteinheit definiert wurde. Die Wirksamkeit des Reaktors 1 ist in Fig. 3 und die des Reaktors 2 in Fig. 4 durch graphische Darstellungen der prozentualen Creosolentfernung gegen die Zeit (in Stunden) dargestellt. Die Pfeile geben an, wenn ein frisches Mediumreservoir, enthaltend Creosol, angehängt wurde. Die angegebenen Zeiten sind nach dem Zufügen des p-Creosols angegeben.
Die maximale Effizienz des Creosolabbaus erreicht in Reaktor 1 52% Entfernung in einem einzigen Durchgang durch den Reaktor. Die Wirksamkeit wurde für ungefähr 6 Stunden gehalten, bevor ein scharfes Absinken in der Wirksamkeit beobachtet werden konnte. Es konnte auch gesehen werden, daß die maximale Wirksamkeit kurz, nachdem frisches Wachstumsmedium zugefügt worden war, erreicht wurde.
Ähnliche Entwicklungen wurden in Reaktor 2 beobachtet. Die maximale Creosolentfernungswirksamkeit, 100% anhaltend für ungefähr 20 Stunden in diesem Fall, wurde kurz nach einem Mediumswechsel erreicht. Die Reaktorproduktivitäten über die Zeitdauer des Experiments sind in Fig. 5 für Reaktor 1 und Fig. 6 für Reaktor 2 als graphische Darstellungen der Reaktorproduktivität (in mg entfernten Creosols pro m² pro Stunde) wiedergegeben.
In Fig. 5 (Reaktor 1) ist eine anfängliche lag-Periode in der Produktivität erwähnenswert. Diese ist gefolgt von einer Periode offensichtlichen exponentiellen Anstiegs in der Produktivität über die Zeit. Dies steht im Widerspruch mit den Ergebnissen der Bioreaktorwirksamkeit. Eine ähnliche Entwicklung kann in Fig. 6 (Reaktor 2) beobachtet werden. In diesem Fall zeigt: die Bioreaktorproduktivität einen ähnlichen Trend zur Bioreaktorwirksarnkeit dahingehend, daß die Zufuhr von frischem Medium einen verstärkten Effekt hat. Da diese Reaktionen transient vermittelt sind, wird vorgeschlagen, daß der Biofilm sich nicht im kontinuierlichen Stadium befindet, sondern sich konstant als Ergebnis eines Wechsels des Futtermediums ändert.
Proben des Ausflusses aus Reaktor 2, welche für 24 Stunden stehengelassen worden waren, zeigten keine Spur von Creosol, was darauf hindeutet, daß die ligninolytischen Enzyme und/oder die Biomasse, die aus dem Reaktor herausgewaschen worden ist, noch aktiv bei der Entfernung von Creosol ist.
Weitere Verminderungen der Creosolkonzentrationen von 0-30% wurden in dem Ausfluß von Reaktor 1 nach 24 Stunden beobachtet. Obwohl dieser noch eine signifikante Menge von verbleibenden Creosol hinterläßt, ist er ein relativ hoher Durchflußreaktor, so daß der Reaktorausfluß leicht bis zum Erreichen des vollständigen Abbaus wieder eingesetzt werden könnte.
Die Bioreaktorleistung ist durch Fluß, pH und Redoxpotential beeinflußt.
Der Einfluß des Flusses: Die Mediumversorgungsraten beider Reaktoren wurden nicht geändert, aber dem Fluß wurde es ermöglicht, sich selbst während des Experimentes zu ändern, so daß die Effekte von verschiedenen Transmembranflußraten bestimmt werden konnten. Die beobachteten Flußveränderungen über die Zeit während des Experiments sind in Fig. 7 für Reaktor 1 und Fig. 8 für Reaktor 2 als graphische Darstellungen des Flusses (in Litern pro m² pro Stunde) gegen die Zeit (in Stunden) wiedergegeben. Wie in den Fig. 7 und 8 gezeigt, wurde ein relativ starker Anstieg des Flusses in beiden Reaktoren beobachtet. Der Einfluß verschiedener Flußraten auf die Bioreaktorleistung ist in den Fig. 9 und 13 dargestellt. Die prozentuale Entfernung von Creosol als Funktion des Flusses (in Litern pro m² pro Stunde) ist in Fig. 9 für Reaktor 1 und in Fig. 10 für Reaktor 2 gezeigt. Die Reaktorproduktivität (in mg entfernten Creosols pro m² pro Stunde) als Funktion des Flusses (in Litern pro m² pro Stunde) ist in Fig. 11 für Reaktor 1 und in Fig. 12 für Reaktor 2 gezeigt.
Fig. 9 (Reaktor 1) zeigt das Ansteigen der Wirksamkeit mit Ansteigen der Flussrate bis zu einer Rate von ungefähr 0,025 l.m&supmin;².hr&supmin;¹. Danach wird ein nicht liniares Absinken der Creosolentfernung mit Ansteigen der Flußraten beobachtet. Diese Entwicklung wird nicht in Fig. 10 (Reaktor 2) beobachtet. Das legt nahe, daß einige wichtige Arbeitsparameter, andere als der Fluß, einen wichtigen Einfluß auf die Abbauwirksamkeit haben.
Das Kombinieren der Ergebnisse von Reaktor 1 und Reaktor 2 (Fig. 13) ergibt eine verständlichere Darstellung der Beziehung zwischen Fluß und Reaktorproduktivität. Sehr niedrige Produktivitäten werden bei extrem niedrigen Flüssen (< 0,005 l.m&supmin;²hr&supmin;¹) erreicht. Die Hauptproduktivität scheint in einem Bereich von 1000 mg.m-².hr&supmin;¹ zu liegen, erreicht bei Flußraten von über 0,1 l.m&supmin;².h&supmin;¹. Die Beziehung zwischen Fluß und Produktivität ergibt wertvolle Informationen für Betriebsbedingungen im Sinne von Fluß und Membranoberflächenbereich, die notwendig sind, um eine gegebene Produktivität der Creosolentfernung zu erreichen.
Einfluß von pH und Redoxpotential: Um zu bestimmen, ob die Wechsel in Wirksamkeit und Produktivität aufgrund der Wechsel in der Umgebung durch den pilzlichen Metabolismus hervorgerufen worden sind (der Pilz hat ein Absenken des Medium-pH's und ein Ansteigen des Redoxpotentials des Mediums gezeigt), wurde die Reaktorwirksamkeit und Produktivität mit pH und Redoxpotential verglichen. Es wurde herausgefunden, daß die Einflüsse von pH und Redoxpotential komplex waren. Zusammengefaßt wurde gefunden, daß:
(1) In Reaktor 1 (hohe Flußbedingungen) die Produktivität direkt zum Redoxpotential des Mediums und umgekehrt zum Medium-pH in Beziehung steht. Das Gegenteil wurde für die Reaktorwirksamkeit gefunden, wo die umgekehrte Beziehung zwischen Redoxpotential und Wirksamkeit und die direkte Beziehung zwischen pH und Wirksamkeit gefunden wurden.
(b) In Reaktor 2 (niedrige Flußbedingungen) sich eine direkte Beziehung zwischen dem Redoxpotential des Mediums und sowohl der Produktivität als auch der Entfernungswirksamkeit zeigte. Eine umgekehrte Beziehung wurde zwischen dem ph und sowohl der Produktivität als auch der Wirksamkeit gefunden.
Die Ergebnisse der experimentellen Arbeit haben gezeigt, daß bei Verwenden eines synthetischen Abwassers verschiedene Faktoren eine wichtige Rolle in der Leistung des getesteten Systems spielen. Der wichtigste von diesen scheint der Fluß zu sein. Unter Bedingungen von hohem Fluß (oberhalb 0,01 l.m&supmin;².hr&supmin;¹ im Falle des jeweilig verwendeten Mediums) ist der Fluß direkt proportional zur Produktivität und umgekehrt proportional zur Wirksamkeit. Unter Bedingungen von niedrigem Fluß (< 0,01 l.m&supmin;².hr&supmin;¹) sind sowohl Produktivität als auch Wirksamkeit direkt proportional zum Fluß. Das ist darin begründet, daß theoretisch die Flußrate direkt proportional zu der Menge der zur Verfügung gestellten Nährstoffe für den pilzlichen Biofilm ist und die zugeführten Nährstoffe scheinen ein anderer wichtiger Betriebsparameter bei der Verwendung des Systems zu sein.
Es wurde herausgefunden, daß die Creosolentfernungswirksamkeit von 100% bei einer Produktivität von 508 mg entfernten Creosols pro m² pro Stunde erreicht werden kann. Das bedeutet, daß 113 l von 100 ppm p-Creosol enthaltenden synthetischen Abwassers in einem Tag in einem einzigen Durchlauf unter Verwendung eines /m²-Reaktors behandelt werden könnten. Ein größerer Durchsatz kann durch Betreiben des Reaktors im Wiederverwendungsmodus bei höheren Flüssen erreicht werden.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Sekundärmetaboliten, welches die Bereitstellung eines porösen Substrates einschließt, an das ein Mikroorganismus-Biofilm gebunden ist, dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt:

daß man eine Nährstofflösung durch das Substrat mit einer Geschwindigkeit strömen läßt, die ausreichend niedrig ist, daß sich ein Nährstoffgradient über den Biofilm aufbaut, so daß die Nährstoffkonzentration bei einem hohen Niveau entlang des Gradienten ausreichend hoch ist, um Primärwachstum des Mikroorganismus zu unterstützen, und die Nährstoffkonzentration bei einem niedrigen Niveau entlang des Gradienten ausreichend niedrig ist, um Sekundärmetabolismus im Mikroorganismus zu induzieren, wodurch auf einer kontinuierlichen Basis ein Sekundärmetabolit erzeugt wird.

2. Verfahren zur Behandlung nährstoffhaltigen Abwassers, das organische Verunreinigungen enthält, durch die Aktivität von Sekundärmetaboliten auf besagte Verunreinigungen, und welches die Bereitstellung eines porösen Substrates einschließt, an das ein Mikroorganismus-Biofilm gebunden ist, dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt:

daß man das Abwasser durch das Substrat mit einer Geschwindigkeit strömen läßt, die ausreichend niedrig ist, daß sich ein Nährstoffgradient über den Biofilm aufbaut, so daß die Nährstoffkonzentration bei einem hohen Niveau entlang des Gradienten ausreichend hoch ist, um Primärwachstum des Mikroorganismus zu unterstützen, und die Nährstoffkonzentration bei einem niedrigen Niveau entlang des Gradienten ausreichend niedrig ist, um Sekundärmetabolismus im Mikroorganismus zu induzieren, wodurch auf einer kontinuierlichen Basis ein Sekundärmetabolit erzeugt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat in der Form einer Hohlfasermembran vorliegt, wobei der Biofilm sich auf der Außenseite der Membran befindet.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Hohlfasermembran eine poröse Haut auf der Innenseite aufweist und eine fingerähnliche, außen nicht mit Haut versehene Hohlraumstruktur, die von der Haut nach außen verläuft, wobei die nicht mit Haut versehene Hohlraumstruktur dicker ist als die poröse Haut.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Hohlfasermembran einen Außendurchmesser von 2 mm besitzt, wobei eine poröse Haut eine Dicke von 1 um besitzt und eine Hohlraumstruktur eine Dicke von 300 um besitzt.

6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Außenseite des Biofilms mit einem sauerstoffhaltigen Gas in Kontakt gebracht wird, um Sauerstoff für den Metabolismus bereitzustellen.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das sauerstoffhaltige Gas Luft ist.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das sauerstoffhaltige Gas über die äußere Oberfläche des Biofilms geblasen wird, um Sporen und tote Zellen des Mikroorganismus abzutragen.

9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus ein Fadenpilz ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Fadenpilz Phanerochaete chrysosporium ist.