DE69535375T2

DE69535375T2 - Lösliche polypeptidfraktionen des lag-3-proteins; verfahren zur herstellung; therapeutische zusamensetzung; antiidiotypischer antikörper

Info

Publication number: DE69535375T2
Application number: DE69535375T
Authority: DE
Inventors: Florence Faure; Thierry Hercend; Bertrand Huard; Frederic Triebel
Original assignee: Institut Gustave Roussy (IGR); Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Applied Research Systems ARS Holding NV
Current assignee: Institut Gustave Roussy (IGR); Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Applied Research Systems ARS Holding NV
Priority date: 1994-05-06
Filing date: 1995-05-05
Publication date: 2007-11-08
Anticipated expiration: 2015-05-06
Also published as: AU708825B2; CN1155904A; ES2281899T3; EP0758383A1; JP3700859B2; MX9605365A; DK0758383T3; PT758383E; US6143273A; AU2570195A; CA2189657A1; NO325828B1; CA2189657C; IL113617A0; ZA953629B; EP0758383B1; WO1995030750A2; RU2178306C2; KR970702917A; US5955300A

Description

Die Erfindung betrifft vom Membranenprotein LAG-3 abgeleitete, als Immunodepressoren nützliche lösliche Formen sowie Antikörper, die die spezifische Bindung des Proteins LAG-3 an Moleküle des CMH (größerer Histokompatibilitätskomplex) der Klasse II als Immunostimulans verhindern kann.
In WO-A 91/10682 wird ein als LAG-3 bezeichnetes Protein beschrieben.
Das Protein LAG-3 ist ein selektiv von den Zellen NK und den aktivierten Lymphozyten T ausgedrücktes Protein. Die Ähnlichkeit der Aminosäurensequenz, die verglichene Organisation Exon/Intron und die Chromosomen-Lokalisation zeigen, dass LAG-3 mit CD4 strukturverwandt ist. Die anfängliche Charakterisierung des Gens von LAG-3 wurde von TRIEBEL et al. (1) beschrieben.
Die entsprechende DNA kodiert für ein Transmembranen-Protein von 498 Aminosäuren vom Typ 1 mit 4 extrazellulären Sequenzen vom Immunoglobulintyp. LAG-3 ist ein Mitglied der Superfamilie der Immunoglobuline.
Das reife Protein umfasst 476 Aminosäuren (SEQ ID Nr. 1) mit einem theoretischen Molekulargewicht von 52 kD. Die extrazelluläre Region enthält 8 Zysteinreste und 4 potenzielle Situs von N-Glycosylation. Per Analyse per Western-Blot wurde nachgewiesen, dass LAG-3 im Innern der PHA-Blasten oder der aktivierten NK-Zellen eine offensichtliche Masse Mr von 70.000 hat. Nach der Behandlung durch die N-Glykosydase F wurde eine Größenverminderung auf 60 kD erreicht, was somit aufzeigt, dass natives LAG-3 glykolysiert ist. Weitere Einzelheiten werden in WO-A 91/10682 beschrieben.
BAIXERRS et al. in J. Exp. Med. 176, 327-337 (2) haben darüber hinaus beschrieben, dass die Bildung von Rosetten zwischen den durch LAG-3 transfizierten (LAG-3 an der Oberfläche ausdrückenden) Zellen und den das CMH der Klasse II ausdrückenden Lymphozyten B spezifisch von der Interaktion LAG-3/CMH der Klasse II abhängig war.
Dieses Ligand des CMH der Klasse II wurde überraschenderweise mit höheren Sätzen auf den aktivierten Lymphozyten CD8* (CMH Klasse I – eingeschränkt) detektiert als auf den aktivierten Lymphozyten CD4+. In vivo wurden nur einige verstreute Zellen LAG-3+ (CMH Klass II – eingeschränkt) in dem nicht hyperplasischen lymphoiden Gewebe mit primären lymphoiden Organen wieder gefunden, d. h. der Thymus und das Knochenmark. Zellen LAG-3+ wurden in hyperplasischen lymphoiden Knoten und Mandeln wieder gefunden sowie auf den mononukleierten Zellen aus peripherischem Blut (PBMC) von Injektionen von hohen Dosen von IL-2 erhaltenden Patienten.
Diese Beobachtungen bestätigen, dass LAG-3 ein Aktivierungs-Antigen durch Kontrast mit CD4 ist, das in einer Unterpopulation von Lymphozyten im Ruhezustand und anderen Zelltypen, insbesondere Macrophagen, ausgedrückt wird.
Das CMH umfasst die Moleküle der Klasse I und der Klasse II, die Membranen-Glycoproteine sind, die proteinhaltige Antigen-Fragmente an den Rezeptoren der Lymphozyten T (TCR) aufweisen. Die Moleküle der Klasse I sind für das Vorhandensein von Peptiden an den zytotoxischen Zellen CD8+ verantwortlich, die zum großen Teil aus endogen synthetisierten Proteinen abgeleitet sind, während die Moleküle der Klasse II an den Hilfs-Lymphozyten CD4+ Peptide aufweisen, die vornehmlich aus fremden Proteinen stammen, welche in den endozytischen Weg eingetreten, d. h. exogen sind. Die Hilfs-Lymphozyten T regeln und verstärken die Immunantwort, während die zytotoxischen Lymphozyten notwendig sind, um die Zellen unabhängig von dem die Antigene des „Nicht-Eigenen" ausdrückenden Gewebes, z. B. die viralen Antigene, zu zerstören. Der Mechanismus der Erkennung lässt zu einer effektiven Aktivität der Lymphozyten T führende intrazelluläre Signale intervenieren.
Es scheint, dass die fremden Antigene für die Initiierung einer Immunantwort mit Lymphozyten-Vermittlung Z (CD4-) erfasst, in Form von Peptiden von den spezialisierten Zellen internalisiert werden, wobei die Zellen das Antigen (APC) aufweisen. Die daraus resultierenden antigenischen Peptide werden an der Oberfläche der das Antigen aufweisenden Zellen erneut ausgedrückt, wo sie mit den Molekülen des CMH der Klasse II verbunden werden. Dieser Komplex CMH der Klasse II/Peptid wird vom Rezeptor des Lymphozyts T spezifisch erkannt, woraus eine Aktivierung der Hilfs-Leukozyten T resultiert.
Darüber hinaus haben von Rekombinationstechniken geschaffene Tiermodelle die Hervorhebung der in vivo von den Molekülen des CMH der Klasse II und ihrer Liganden gespielten Rolle erlaubt.
So hat sich herausgestellt, dass Mäuse mit Defiziten des CMH der Klasse II (3), die praktisch keine peripherischen Lymphozyten T CD4+ besaßen und nur einige unreife Lymphozyten CD4+ im Thymus hatten, völlig unfähig waren, auf die T-abhängigen Antigene zu reagieren.
Die mutierten Mäuse CD4-/- (4) haben eine deutlich verminderte Lymphozytenaktivität, zeigen jedoch eine normale Entwicklung und Funktion der Lymphozyten T CD8+, was aufzeigt, dass die Expression von CD4 auf den Tochterzellen und den Thymozyten CD4+ CD8+ für die Entwicklung nicht obligatorisch ist. Verglichen mit normalen Mäusen haben Mäuse mit einem Defizit an CD4 eine große Menge an Zellen CD4- CD8-.
Diese doppelt negativen Zellen sind am CMH der Klasse II eingeschränkt und fähig, das Antigen zu erkennen.
Wenn sie von Leishmania infiziert werden, weisen diese Mäuse trotz des Fehlens von CD4 eine Population von funktionalen Hilfsleukozyten T auf. Diese Zellen sind am CMH der Klasse II restriktiv und produzieren Interferon-γ, wenn sie durch das Antigen aktiviert werden, was anzeigt, dass die Abstammung der Lymphozyten T und ihre peripherische Funktion nicht notwendigerweise von der Funktion von CD4 abhängt.
Es ist nunmehr anerkannt, dass die durch die Region des CMH der Klasse II kodierten Proteine in zahlreichen Aspekten der Immunerkennung impliziert sind, unter Einschluss der Interaktion zwischen verschiedenen lymphoiden Zellen, wie den Lymphozyten, und den Zellen des Vorhandenseins des Antigens. Verschiedene Beobachtungen haben ebenfalls gezeigt, dass weitere Mechanismen, die nicht durch Vermittlung von CD4 stattfinden, in der Durchführungsfunktion der Hilfs-Lymphozyten T intervenieren.
Diese verschiedenen Beobachtungen unterstreichen die von der CMH der Klasse II und ihren Liganden im Immunsystem gespielte Rolle.
Darüber hinaus sind die Vorteile der zusammengesetzten Chimären-Moleküle des extra-zytoplasmischen Bereich von Proteinen, die in der Lage sind, sich an Liganden zu binden, und einer konstanten Region der menschlichen Immunoglobulin-Ketten (lg) für den Erhalt von löslichen Formen von Proteinen und nützlichen Zellrezeptoren, insbesondere als therapeutische Wirkstoffe bekannt.
So haben lösliche Formen von CD4 ihre Wirksamkeit bei der Inhibition einer Infektion durch HIV in vitro auf dosenabhängige Weise bewiesen.
Dennoch haben klinische Versuche mit löslichen Molekülen von CD4-lg es nicht erlaubt, den Nachweis einer erheblichen Verringerung der viralen Titer zu erbringen. Es wurden bis zu 20 g/ml lösliches CD4 in ihrem Serum ausdrückende transgene Mäuse gezüchtet. Diese Mäuse zeigten keinerlei Unterschied hinsichtlich ihrer Immunfunktion im Vergleich zu Vergleichsmäusen auf. Bisher wurde von keiner direkten Verbindung mit dem CMH der Klasse II von von CD4 ableitenden Molekülen berichtet. Das deutet stark darauf hin, dass die löslichen CD4 in vivo nicht mit den Molekülen der CMH der Klasse II interagieren.
Die Autoren der vorliegenden Erfindung haben auf überraschende Weise aufgezeigt, dass unterschiedliche Fragmente des extrazytoplasmischen Bereichs des Proteins LAG-3 enthaltende lösliche Moleküle in der Lage waren, sich mit den Molekülen des CMH der Klasse II zu verbinden und eine immunosuppressive Wirkung zu haben.
Die durch die Sequenz SEQ ID Nr. 1 dargestellte extrazytoplasmische Region von LAG-3 umfasst die sich jeweils von den Aminosäuren 1 bis +/- 49, 150 bis 239, 240 bis 330 und 331 bis 412 erstreckenden Bereiche D1, D2, D3, D4.
Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls eine lösliche Polypeptid-Fraktion, die durch die 4 extrazellulären Bereiche vom Immunoglobulintyp des Proteins LAG-3 (Aminosäure 1 bis 149, 150 bis 239, 240 bis 330 und 331 bis 412 der Sequenz SEQ ID Nr.1) und eventuell einer zusätzlichen Peptid-Sequenz an ihrem C-terminalen und/oder N-terminalen Ende gebildet wird, so dass ein Fusionsprotein gebildet wird. Der Begriff „Fusionsprotein" steht für einen Teil eines beliebigen Proteins, der die Änderung der physikalisch-chemischen Eigenschaften der Unterfragmente des extrazytoplasmischen Bereichs des Proteins LAG-3 erlaubt. Beispiele derartiger Fusionsproteine enthalten Fragmente des extrazytoplasmischen Bereichs von LAG-3, gemäß obiger Definition, die mit der Verbindungsregion -CH2-CH3 der schweren Kette eines menschlichen Immunoglobulins verbunden sind, bevorzugt einem Immunoglobulin vom Isotyp lgG4.
Derartige Fusionsproteine können dimerisch oder monomerisch sein. Diese Fusionsproteine können durch dem Fachmann gut bekannte Rekombinationstechniken erhalten werden, z. B. einer Technik, wie sie von Traunecker et al. (5) beschrieben wird.
Das Produktionsverfahren dieser Fusionsproteine mit einer mit einer Peptidsequenz von LAG-3 fusionierten Immunoglobulin-Region gemäß obiger Definition besteht darin, dass in einen Vektor die für die LAG-3 oder Derivate von LAG-3 entsprechenden Polypeptidregionen kodierenden Fragmente der DNAc eingefügt werden, eventuell nach Amplifikation durch PCR und der für die relevanten Region des Immunoglobulins kodierenden DNAc, die mit der für die entsprechenden Polypeptid-Regionen oder Derivate von LAG-3 kodierenden DNAc fusioniert ist und die nach Transfektion ausgedrückt wird, die Fragmente der DNAc in ein Expressionssystem, insbesondere Säugetierzellen, z. B. Eierstockzellen von Hamstern.
Die erfindungsgemäßen Fusionsproteine können ebenfalls durch Spaltung eines konjugierten LAG-3 lg erhalten werden, das derart konstruiert ist, dass es einen entsprechenden Spaltungssitus enthält.
Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls eine therapeutische Zusammensetzung mit immuno-suppressiver Aktivität mit einer erfindungsgemäßen löslichen Polypeptidfraktion. Diese Zusammensetzung ist nützlich für die Behandlung von Pathologien, die eine Immunosuppression erfordern, z. B. Auto-Immunkrankheiten.
Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls der Einsatz von den extrazellulären Bereich D1 erkennenden Antikörpern vom Typ Immunoglobulin des Proteins LAG-3 oder Fragmente derartiger Antikörper, insbesondere die Fragmente Fab, Fab', F(ab')₂ für die Zubereitung einer therapeutischen Zusammensetzung mit immunostimulierender Wirkung. Der Begriff „immunostimulierend" steht für eine zur Stimulierung der Reifung, der Differenzierung, der Proliferation und/oder der Funktion der LAG-3 ausdrückenden Zellen fähigen molekulare Einheit, d. h. Lymphozyten T oder aktive Zellen NK. Die Antikörper Anti-LAG-3 können als Potenzialisatoren von Impfstoffen oder Immunostimulantien bei immunodeprimierten Patienten eingesetzt werden, wie z. B. bei vom HIV ausgelösten Infektionskrankheiten oder mit immunosuppressiven Substanzen behandelten Krankheiten, oder zur Stimulierung des Immunsystems zur Elimination der ein anomales Verhalten aufweisenden eigenen Zellen eingesetzt werden, z. B. von Krebszellen.
Die immunostimulierende Aktivität der Antikörper Anti-LAG-3 ist insofern überraschend, als die Antikörper Anti-CD4 eine immunosuppressive Wirkung haben.
Derartige Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein; allerdings werden monoklonale Antikörper vorgezogen. Po lyklonale Antikörper können gemäß gut bekannten Verfahren zubereitet werden, wie z. B. dem von BENEDICT A. A. et al. (6) beschriebenen Verfahren. Bevorzugt werden monoklonale Antikörper, da sie spezifisch für ein einzigartiges Epitop sind und Ergebnisse mit einer besseren Reproduzierbarkeit liefern. Produktionsverfahren von monoklonalen Antikörpern sind im Stand der Technik gut bekannt, insbesondere das Verfahren, das von KOHLER und MILSTEIN beschrieben wird. Dieses Verfahren sowie Varianten desselben werden von YELTON et al. (7) beschrieben.
Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls gegen die erfindungsgemäßen Antikörper gerichtete Anti-Idiotypen-Antikörper, die das interne Bild von LAG-3 beinhalten und infolgedessen geeignet sind, sich mit dem CMH der Klasse II zu verbinden. Derartige Antikörper können insbesondere als Immunodepressoren und z. B. bei Auto-Immunkrankheiten eingesetzt werden.
Die therapeutischen Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen lösliche Proteine LAG-3 oder Antikörper gemäß obiger Definition sowie einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Diese Zusammensetzungen können gemäß den üblichen Techniken formuliert sein. Der Träger kann in Abhängigkeit von dem gewählten Verabreichungsweg: oral, parenteral, sublingual, rektal oder nasal eine variierte Form aufweisen.
Für die Zusammensetzungen mit parenteraler Verabreichung umfasst der Träger im Allgemeinen steriles Wasser sowie weitere eventuelle, die Löslichkeit oder die Fähigkeit zur Konservierung der Zusammensetzung fördernde Bestandteile. Die parenteralen Verabreichungswege können aus intravenösen, intramuskulären oder subkutanen Injektionen bestehen.
Die therapeutische Zusammensetzung kann eine verlängerte Freisetzung beinhalten, insbesondere bei Langzeitbehandlun gen, z. B. bei Auto-Immunerkrankungen. Die zu verabreichende Dosis hängt von dem behandelten Patienten ab, insbesondere von der Fähigkeit seines Immunsystems, den Grad des erwünschten Schutzes zu erreichen. Die präzisen Mengen der zu verabreichenden aktiven Bestandteile können ohne Anstrengungen von dem praktischen Arzt bestimmt werden, die die Behandlung einleitet.
Die erfindungsgemäßen therapeutischen Zusammensetzungen können neben dem löslichen LAG-3 oder den erfindungsgemäßen Antikörpern einen weiteren aktiven Bestandteil umfassen, der eventuell durch eine chemische Verbindung mit LAG-3 oder einem anderen erfindungsgemäßen Antikörper verbunden ist. Als Beispiel werden mit einem Toxin fusionierte erfindungsgemäße lösliche Proteine LAG-3 genannt: z. B. Ricin oder diphterisches Anatoxin, die geeignet sind, sich an Moleküle von CMH der Klasse II zu binden und Zielzellen abzutöten, z. B. Leukämie- oder Melanom- oder an einen Radio-Isotop fusionierte Zellen.
Die folgenden Beispiele sowie die beigefügten Referenzfiguren werden die Erfindung in weiteren Einzelheiten darstellen.
BEISPIEL 1
Proliferation von aktiven Lymphozytenstämmen T bei Vorhandensein von monoklonalen Antikörpern Anti-LAG-3
Die verwendeten monoklonalen Antikörper Anti-LAG3 waren 17 B4, beschrieben in BAIXERAS et al. (2) und angemeldet bei der CNCM unter der Nr. I-1240 am 10. Juli 1992 und 11 E3, beschrieben in HUARD et al. (8). Der Antikörper 17B4 erkennt spezifisch den extrazellulären Bereich D1 vom Immunoglobintyp des Proteins LAG-3, während der Antikörper 11E3 den extrazellulären Bereich D3 erkennt.
Diese Antikörper gehören zum Isotyp lgG1. Diese Antikörper wurden auf ihre biologische Wirkung auf aktivierte Lymphozyten T getestet, die von spezifischen Antigen-Peptiden oder umgearbeiteten Antigenen stimuliert werden, die von den durch Präsentationszellen des LAG-3 ausdrückenden autologen Antigens ausgedrückten Molekülen des CMH der Klasse II dargestellt werden.
Ein als 10 H3 bezeichneter monoklonaler Antikörper Anti-CD48 wurde als nicht relevanter (negativer Vergleichswert) Antikörper lgG1 verwendet.
Die saturierenden Konzentrationen an Antikörpern Anti-LAG-3 und Anti-CD48 wurden durch Immunofluoreszenz auf Blasten-PHA (Phytohämaglutin) und durch den Virus Epstein Barr (EBV) transformierte Zellstämme bestimmt. In den Proliferationsversuchen wurden die monoklonalen Antikörper in Höhe der 5-fachen saturierenden Konzentration hinzugefügt.
Die verwendeten Lymphozytenstämme T waren einerseits der von Lymphozyten peripherischen, gegen ein ein Fragment des Influenza-Hämaglutins (HA) mit einer Sequenz vortäuschenden Peptid trainierten Bluts abgeleitete Klon 154, welcher eine sich von der Aminosäure 306 bis 329 (Peptid p20) erstreckende Aminosäuresequenz hat, und andererseits der Klon 28, ein von peripherischen Lymphozyten eines einzigen menschlichen Spenders abgeleiteter Lymphozytklon T, die gegen das diphterische Anatoxin (DT) trainiert sind. Die Zellen der Präsentation des dem Klon 154 entsprechenden Antigens (APC) waren durch EBV desselben Spenders (DR3/DR11) wie T 154 abgeänderte Lymphozyten B. Dieser Klon war auf HLA DR7 beschränkt.
Für den Klon 154 wurden die APC (5 × 10⁶) 1 ½ Std. lang bei 37°C mit variablen Dosen des Peptids p20 inkubiert, dann gewaschen und bestrahlt (10.000 rad). Die Zellen wurden auf Mikrotitrationsplatten mit 96 Schälchen gleichzeitig mit den Zellen des Klons 154 (0,5 × 10⁵ bis 10 × 10⁵ Zelle/ml) in einem Verhältnis von 3/1 ausgebreitet. Für den Klon 28 betrug das Verhältnis reagierende Zellen/stimulierende Zellen 1.
Die Zellen APC HLA DR7/EBV wurden entweder mit Mitomycin behandelt oder bestrahlt und anschließend zu den Lymphozyten T bei Vorhandensein von DT hinzugefügt (das in der Kultur verblieb). Die endgültige Konzentration an Zellen des Klons 28 betrug 100.000 Zellen/ml.
³H-Thymidin (1 μCi/Schälchen) wurde in unterschiedlichen zeitlichen Intervallen ab Tag 2 bis zum Tag 10 der Kultur hinzugefügt.
Jedes Experiment wurde in drei Exemplaren realisiert.
Die Ergebnisse wurden als Durchschnitt der cpm und nach Abziehen der festgestellten cpm im negativen Vergleich ausgedrückt (mit den nicht mit Immunogenen geladenen APC zusammen kultivierte Lymphozyten T). Die Proliferationsversuche wurden auf Platten mit 96 Schälchen realisiert. Die Absorption von tritiiertem Thymidin der einzelnen Schälchen von 200 1 wurde nach Hinzufügen von 1 μCi Thymidin in den letzten 18 Stunden der Kultur gemessen. Die Ergebnisse wurden in Form von Durchschnitten von 3 Versuchen ausgedrückt. Die typische Abweichung betrug üblicherweise weniger als 12 % (bei Messungen von sehr geringen cpm etwas mehr). Weiterhin wurde der Überstand der gemischten Kultur (Klon 154/APC) zusammengefasst, auf Membranen von 0,22 pm gefiltert, in Proben unterteilt und bei -20°C bis zum Moment der Titrierung mithilfe von handelsüblichen Immuno-Versuchskits tiefgefroren: Titrationskit IL-2 und INF-α von Immunotech, Kit IFN-γ von Genzyme und Kit IL-4 von Cayman Chemicals.
Es wurde eine Bestimmungsstudie der Dosis realisiert, um die Proliferationsprofile des Klons 154 festzulegen, der mit dem spezifischen Antigen p20 in unterschiedlichen Konzentrationen zusammengebracht wurde und mit monoklonalen Antikörpern Anti-LAG-3 oder nicht relevanten monoklonalen Antikörpern (negativer Vergleichswert) zusammengebracht oder nicht zusammengebracht wurde.
Die einzelnen Ergebnisse der 16 unterschiedlichen Versuche haben aufgezeigt, dass unabhängig von der Konzentration an hinzugefügtem Antigen, der Ausgangspunkt bis zur Spitze der Proliferation nicht verändert war, aber systematisch eine erhebliche Verlängerung der Proliferation von mit den monoklonalen Antikörpern Anti-LAG-3 inkubierten Lymphozyten T beobachtet wurde. Es wurden Fragmente Fab des monoklonalen Antikörpers 17B4 zubereitet und in einem Proliferationsversuch des Klons 154 verwendet. Das Proliferationsprofil der durch das Antigen aktivierten Lymphozyten T mit den Fragmenten Fab 17B4 (15 μg/ml) war ähnlich dem Profil der bei Vorhandensein des vollständigen monoklonalen Antikörpers 17B4 (40 μg/ml) (1) inkubierten Zellen. Diese Ergebnisse zeigen, dass die beobachtete biologische Wirkung nicht auf eine durch die Region Fc der monoklonalen Antikörper Anti-LAG-3 hervorgerufene nicht spezifische Reaktion zurückzuführen ist.
Der Klon 28 wurde ebenfalls durch das Antigen (Tetanus-Anatoxin 10 mcg/ml) bei Vorhandensein der monoklonalen Antikörper 17B4 nach der gemeinsamen Kultur mit den entsprechenden APC bei Vorhandensein von DT stimuliert. Die Ergebnisse werden in 2 dargestellt.
Die mit dem Klon 28 beobachtete Wirkung der monoklonalen Antikörper Anti-LAG-3, nämlich die Verlängerung der Proliferation, ist ähnlich der Wirkung, die mit dem Klon 154 beobachtet wird.
Es wurden zur Messung der verschiedenen, nach der Stimulierung der in Anwesenheit von monoklonalen Antikörpern Anti-LAG-3 Zellen des Klons 154 eintretenden zellulären Ereignisse bestimmte Versuche realisiert.
Die Zellen wurden während der klassischen Antigen-Stimulation des Klons 154 bei Vorhandensein von monoklonalen Antikörpern Anti-LAG-3 oder Anti-CD48 geerntet oder bei Fehlen von Antikörpern auf die Expression der transmembranen Rezeptoren LAG-3 und CD25 getestet, und es wurden Proben des Kulturüberstandes in verschiedenen zeitlichen Intervallen nach der Stimulation aufgefangen und auf das Vorhandensein von IFN-γ, TNF-α, IL-4 und IL-2 getestet.
Versuche mit direkter Immunofluoreszenz mit 2 Farben (monoklonale Antikörper Anti-CD3 und monoklonale Antikörper anti-CD 25) haben aufgezeigt, dass die Rezeptoren für das IL-2 nach der Antigen-Stimulation schwach aber maßgeblich erhöht waren. Ähnliche Versuche mit den monoklonalen Antikörpern Anti-CD3 und 11E3 (Anti-LAG-3) haben aufgezeigt, das LAG-3 bereits am Tag nach der Aktivierung überexprimiert wurde. Darüber hinaus war die Sekretion von IL-2, IL-4, IFN-γ und TNF-α ebenfalls durch die Inkubation mit den monoklonalen Antikörpern Anti-LAG3 moduliert, was somit aufzeigte, dass unterschiedliche zelluläre Ereignisse durch das Vorhandensein von monoklonalen Antikörpern Anti-LAG-3 modifiziert waren und dass bestimmte Ereignisse bereits 24 Stunden nach der Stimulation eingetreten waren.
Diese Ergebnisse zeigen indirekt, dass das LAG-3 eine regulierende Rolle für die Zellen CD4+ spielt. Die Tatsache, dass die monoklonalen Antikörper Anti-LAG-3 die Proliferation erhöhen und damit wie Immunopotenzialisatoren wirken, deutet darauf hin, dass LAG-3 in die „Deaktivierung" von Lymphozyten T CD4+ mit einer negativen Rolle von LAG-3 bei der vom Antigen abhängigen Stimulation impliziert ist.
BEISPIEL 2
Transitorische Expression von Fusionsproteinen LAG-3
Es wurden von LAG-3 abweichende lösliche Proteine durch eine rekombinante DNA-Technik mithilfe von geeigneten Vektoren, unter Einschluss der für LAG-3 kodierenden DNA und der für ein Immunoglobulinfragment kodierenden DNA erhalten. Das transitorische Expressionssystem bestand aus transfizierten Zellen Cos. Dieses System ermöglicht die Produktion von mehreren mg rekombinanten Fusionsproteinen. Die Techniken der rekombinanten DNA wurden wie von MANIATIS et al. (22) beschrieben umgesetzt. Die Modifikationen erfolgten wie vom Hersteller empfohlen.
Konstruktion von LAG-3 D1-D4 lg und LRG-3 D1D2 lg
Es wurden für die Regionen D1D2 oder D1-D4 kodierende Fragmente ausgehend von einem DNA-Fragment (Sequenz FDC) unter Einschluss der DNAc LAG-3 (TRIEBEL et al. (1)) mithilfe der Polymerase Taq ohne Aktivität der gegen ein Aussetzen einer sehr hohen Temperatur relativ widerstandfähigen 5'-Endonuklease amplifiziert (30 Zyklen); auf die Amplifikation folgte eine Denaturierung bei 98°C (mit einem „DNA thermal cycle Perkin Elmer Cetus"). Es wurden spezifische Ausgangspunkte verwendet, wie in der nachstehenden Tabelle aufgezeigt.
Die resultierenden amplifizierten Fragmente (739 pb und 1312 pb jeweils für LRG-3 D1D2 und LAG-3 D1D4) wurden in ein Plasmid eingefügt pBs (Stratagene).
Nach dem Digerieren mit Xhol und Bgl II wurden Genabschnitte vorbereitet und in die Situs Xho I/Bam Hi des Vektors p CD7 – CDM8-lgG1 eingeführt (wobei p CDM7 von von Stratagene vertriebenem p CDM8 abgeleitet war), wie in 3 dargestellt, um die für CD8 kodierenden DNA-Sequenzen durch die für die Unterfragmente von LAG-3 kodierenden Sequenzen zu ersetzen. Die resultierenden Expressionsvektoren enthielten die für D1D2 oder D1-D4 kodierenden mit der für die Verbindungsregion -CH2-CH3 einer Kette von menschlichem IgG1 kodierenden DNA fusionierten Sequenzen.
TABELLE 3
CDM7 ist ein eukaryotischer von den Vektoren abgeleiteter Expressionsvektor, die von SEED et al. (10) für das Klonen von DNA und ihrer Expression in E. Coli und eukaryotischen Zellen entwickelt wurde. CM7 besitzt die folgenden Merkmale: (i) der Promotor des menschlichen Zytomegalovirus zur transitorischen Expression in Säugetierzellen; (ii) eine virale Herkunft von SV40 für eine autosomale Replikation der das Antigen T ausdrückenden Säugetierzellen; (iii) n VX (Typ Col E1) als plasmidischer Ursprung für eine hohe Anzahl von Kopien; (iv) eine Auswahl Sup F für die Widerstandsfähigkeit gegen Ampicillin und Tetracyclin in Stämmen von E. Coli Tet^amb und Amp^amb; (v) ein Replikationsursprung von M13 für die Freisetzung eines einfachen Zweiges; (vi) ein Promoter an ARN von T7; und (vii) ein Polylinker für ein wirksames Klonen von heterologer DNA.
Transitorische Expression in Zellen Cos
Zellen Cos (5 × 10⁶) wurden mit 30 μg DNA von geeigneten Expressionsvektoren durch Elektroporation (200 V, 1500 F, 30-40 msek.) mithilfe eines Geräts Cellject (Eurogentech, Lüttich, Belgien) transfiziert (die entweder für LAG-3 D1D2 lg, oder LAG-3 D1D4 lg oder CD8 lg kodieren) . Die Zellen wurden erneut verstrichen und auf einem 5 % fötales Kalbsserum enthaltenden Milieu kultiviert. Die Überstände wurden 6 Tage nach der Transfektion entnommen.
Die Synthese der Proteine der resultierenden Fusion wurde basierend auf den Überständen analysiert sowie die Zellextrakte von per Western-Blot-Analyse mit den monoklonalen Antikörpern 17B4 transfizierten Zellen. Das immunoreaktive Material wurde im Überstand von mit der für LAG-3 D1D2 lg oder LAG-3 D1-D4 lg kodierenden DNA transfizierten Zellen beobachtet.
Parallel dazu wurde ein rekombinantes Immunoadhäsin CD8 (CD8 lg) als negativer Vergleich mithilfe desselben Expressionssystems und des Expressionsvektors pCDM7-CDM8 (3) erhalten.
Die rekombinanten Proteine LAG-3 D1D2 lg, LAG-3 D1-D4 lg und CD8 lg wurden mithilfe des klassischen Verfahrens auf A-Sepharose-Protein gereinigt. Das resultierende Material wurde per SDS-PAGE analysiert, gefolgt von einer Einfärbung Coomassie oder einer Western-Blot-Analyse mithilfe von menschlichen Antikörpern Anti-lg.
BEISPIEL 3
Produktion von löslichen Unterfragmenten von LAG-3
Zwecks Produktion von großen Mengen an rekombinanten Proteinen wurde ein stabiles, aus transfizierten Säugetierzellen bestehendes Expressionssystem entwickelt. Die Wirtszellen sind von einer Verankerung abhängige, von an Dihydrofolat-Reduktase defizitären (dhfr) Zellen CHO und infolgedessen Glycin, ein Purin und Thymidin für ihr Wachstum benötigende, isolierte Eierstockzellen von Hamstern (CHO). Die ausschlaggebende Rolle der dhfr in der Synthese von Nuklein-Vorläufern kombiniert mit der Sensibilität der dhfr-defizitären Zellen gegenüber den analogen Zellen des Tetra-Hydrofolats, wie z. B. Methotrexat (MTX) weist zwei erhebliche Vorteile auf. Die Transfektion dieser Zellen mit das Gen dhfr enthaltenden Expressionsvektoren erlaubt die Sekretion von dhfr-resistenten, rekombinanten Klonen und die Kultur dieser Zellen und auf selektiven, wachsende Mengen von MTX enthaltenden Zellen resultiert in der Amplifikation des Gens dhfr und der DNA, die damit verbunden ist.
Konstruktion von LAG-3 D1, LAG-3 D1D2, LAG-3 D1-D4
Für die Regionen D1, D1D2 oder D1-D4 kodierende DNA-Fragmente wurden mithilfe eines PCR-Verfahrens amplifiziert, das identisch ist mit dem zuvor mithilfe der in der nachstehenden Tabelle aufgeführten Ansätze beschriebenen Verfahrens.
TABELLE 4
Die resultierenden amplifizierten Fragmente wurden von Sal I digeriert und in den Situs Sal I von pUC 18 (Stratagene) eingeführt.
Die amplifizierten Sequenzen wurden überprüft und die Genabschnitte in den Expressionsvektor pCLH3 AXS V2 DHFR h IVS wie von COLE et al. (Biotechnology 11, 1014-1024, 1993) (4) beschrieben untergeklont.
Dieser Vektor ist ein multifunktionaler eukaryotischer Expressionsvektor für die Expression von DNA und ihre Amplifikation in eukaryotischen Zellen. Er besitzt die folgenden Merkmale: (i) der Mäusepromoter des Gens des Metall-Thioneins-1 und eine Polyadenylations-Sequenz von SV40 (mit einem Situs Spleißen-Spender-Empfänger) zum Durchführen der Transkription des interessanten Gens, (ii) eine Sequenz A menschlicher Intervention mit dem Situs Spleißen-Spender-Empfänger des Gens der Untereinheit des Glycoproteins α für den Erhalt von hohen Transkriptionssätzen der DNA, (iii) die Sequenz pML mit dem Ursprung der Replikation von pBR 322 und einem Resistenzgen gegen Ampicillin für die bakterielle Amplifikation und (iv) und eine Transkriptionseinheit der dhfr von SV 40 zum Durchführen der Transkription der für die Auswahl und die Amplifikation der Transfektanten eingesetzten Sequenzen.
Stabile Expression in den Zellen CHO
Die für LAG-3 D1, LAG-3 D1D2 und LAG-3 D1-D4 kodierenden Expressionsvektoren wurden zur Transfektion der Zellen CHO DUKX herangezogen, und diese Zellen wurden auf einem selektiven Milieu kultiviert. Die zur Vermehrung unter diesen Bedingungen fähigen Zellen wurden zusammengeführt und auf einem steigende Mengen von MTX enthaltenden Milieu kultiviert.
Die Expressionssätze wurden per Western-Blot-Analyse mithilfe des monoklonalen Antikörpers 17B4 gemessen. Die hohe Sätze an löslichen, rekombinanten, von LAG-3 abgeleiteten Molekülen produzierende Klone wurden in Bioreaktoren ausgebracht und das von LAG-3 ableitende Material wurde per Ionen-Austausch-Chromatographie und Immuno-Affinität gereinigt.
Western-Blot-Analysen haben in den Überständen mit für LAG-3 D1, LAG-3 D1D2 und LAG-3 D1D4 kodierenden Expressionsvektoren transfizierter Zellen Bänder mit offensichtlichen Mr von 15 bis 18 kD, 34-36 kD (doppelte/und 55 kD (2 mögliche Bänder)) aufgezeigt. Die jeweiligen Mr dieses immunoreaktiven Materials entsprachen den erwarteten Mr von LAG-3 D1 lg (139 Aminosäuren und ein putativer N-Glycosylations-Situs), LAG-3 D1D2 lg (239 Aminosäuren mit 3 Glycosylations-Situs) und glykolisierte LAG-3 D1-D4 lg (412 Aminosäuren mit 4 Glycosylations-Situs).
BEISPIEL 4
Spezifische Verbindung der LAG-3 lg mit den den CMH der Klasse II ausdrückenden Zellen
Die Reaktivität der monoklonalen Antikörper und von LAG-3 D1-D4 lg wurde durch indirekte Immunofluoreszenz untersucht. Zielzellen (4 × 10⁵) wurden 30 Minuten lang bei 4°C bei Vorhandensein von LAG-3 D1-D4 lg, CD8 lg , einem monoklonalen Mäuse-Antikörper, (949) menschlichen Anti-CMH der Klasse II (DR, DP, DQ) konjugiert mit FITC (Isothiocyanat-Fluorid) eines Klons Coulter oder Mäuse-lg-FITC inkubiert: ein nicht relevantes, mit FITC konjugiertes Immunoglobulin G. Die Zellen wurden gewaschen und bei 4°C 30 Minuten lang entweder mit polyklonalem Ziegen-F(ab')₂ menschlichem mit Flureszein konjugiertem Anti-lg oder einem polyklonalen Ziegen-Antikörper mit Fluoreszein konjugiertem Mäuse-Anti-lg (Klon Coulter) inkubiert.
Zur Bestätigung der Verbindung LAG-3/CMH Klasse II wurden die LAG-3 D1-D4 lg mit positiven oder negativen Zellen CMH der Klasse II inkubiert. Vier den CMH der Klasse II ausdrückenden Lymphozytenstämme B (L31, Phil EBV, Raji, Sanchez und Personnaz) wurden mit monoklonalen Antikörpern 949 Anti-Klasse II behandelt, bei denen¹ die Überstände von mit der DNA transfizierten Zellen Cos entweder für LAG-3 D1-D4 lg oder für CD8 lg kodieren. Die fünf die unterschiedlichen Haplotypen der Moleküle des CMH der Klasse II ausdrückenden Zellstämme wurden vom LAG-3 lg auf dieselbe Weise erkannt wie von den monoklonalen Antikörpern Anti-Klasse II (positiver Vergleich), während der CD8 lg (negativer Vergleich) enthaltende Überstand sich nicht mit diesen Zellstämmen verbunden hat, wie hätte erwartet werden können. Es wurden vier negative Zellstämme CMH Klasse II (CEM, RJ, HSB2, K562) mit denselben Reagenzien wie oben behandelt. Keiner hat reagiert, weder mit den Anti-CMH Klasse II (negativer Vergleich), noch mit LAG-3 D1-D4 lg, was aufzeigt, dass die Verbindung von LAG-3 D1-D4 spezifisch für die Moleküle von CMH der Klasse II ist.
Zusätzliche Experimente wurden mithilfe von (i) mit für menschliches DR7 oder menschliches DP4 kodierenden Genen transfizierten oder nicht transfizierten Mäuse-Fibroblasten, (ii) die Moleküle des CMH der Klasse II ausdrückenden Mäusezellen, (ii) aktivierten menschlichen Zellen CD4+ oder CD8+ und (iv) die verschiedenen Hyplotypen der Moleküle CMH der Klasse II (8) ausdrückenden Lymphozytenstämmen T realisiert.
Im Gegensatz zu CD8 lg, verbindet sich LAG-3 D1-D4 lg mit allen das CMH der Klasse II ebenso wirksam ausdrückenden Zellen wie der monoklonale Antikörper 949 Anti-CMH Klasse II. LAG-3 D1-D4 lg verbindet sich mit allen getesteten Haplotypen DR und DP, den durch transfizierte Mäusezellen ausgedrückten Molekülen des menschlichen CMH der Klasse II, den Molekülen des Mäuse-CMH der Klasse II sowie durch Lymphozyten T CD4+ oder CD8+ ausgedrückten Molekülen des CMH der Klasse II.
Diese Ergebnisse erbringen zum ersten Mal den Nachweis dafür, dass lösliche, von einem Liganden des CMH der Klasse II abgeleitete Moleküle in der Lage sind, sich an die das CMH der Klasse II ausdrückenden Zellen zu binden.
Ähnliche Experimente haben gezeigt, dass LAG-3 D1D2 sich an das CMH Klasse II ausdrückende Zellen ebenso spezifisch und mit derselben Effizienz bindet wie LAG-3 D1-D4.
Verbindungsaktivität von LAG-3 lg und Zellverteilung der Liganden von LAG-3 lg
Die Fähigkeit dieses Immunoadhäsins, sich mit Zellliganden zu verbinden, wird mithilfe eines sich gegen die mit Fluoreszein gekennzeichneten, gegen menschliche Immunoglobuline gerichteten Ziegenserums gemessen.
In diesen Experimenten werden die Zielzellen zunächst mit einem menschlichen monoklonalen Antikörper oder einem Immunoadhäsin 30 Min. lang bei 4°C in 10 % FCS (fötales Kalbsserum) enthaltendem RPMI 1640 inkubiert. Anschließend werden diese Zellen mit einem Ziegenserum aus mit FITC gekennzeichneten Mäuse-Anti-Immunoglobulin (Coulter) bei den monoklonalen Mäuse-Antikörpern oder mit einem Ziegenserum aus mit FITC (Tago) markierten menschlichen Anti-Immunoglobulinen bei den Immunoadhäsinen inkubiert. Die Fluoreszenz wird nach zwei Waschungen durch Analyse von 3.000 Zellen auf einem Zytometer Elite (Coultronics, Hialeah, FL) gemessen. 9 zeigt die Bindungsquoten von LAG-3 lg, CD8 lg, dem Antikörper 949 oder dem Antikörper OKT3 (Anti-CD3, ATCC) an, die durch die Anzahl der in Abhängigkeit des Logarithmus der In tensität der gemessenen Fluoreszenz gezählten Zellen dargestellt werden.
LAG-3 lg bindet sich an transfizierte Mäuse-Fibroblasten für das Gen des Moleküls HLA DR₄ und bindet sich nicht an nicht transfizierte Zellen. CD8 lg ist nicht in der Lage, sich unter denselben Bedingungen an Fibroblasten HLA DR₄+ zu binden.
Die Zellverteilung der Liganden von LAG-3 lg wurde in einer Probe von Zellpopulationen per Immunofluoreszenz geschätzt.
LAG-3 lg wird in allen positiv getesteten Zellen der Klasse II aufgezeigt, unter Einschluss von durch den Virus Epstein-Barr abgeänderten Zellen B (die von nicht verwandten Spendern gewonnen wurden, unter Einschluss von 10 homozygoten Stämmen der Typisierung Dr₁ bis DR₁₀) sowie in aktivierten Zellen T und NK.
9 zeigt beispielhaft die Verbindung von LAG-3 lg auf für die Antigene der Klasse II positiven Zellen DAUDI.
Die durchschnittliche Intensität der Fluoreszenz mit LAG-3 lg ist ähnlich der Intensität, die mit dem spezifischen Antikörper 949 des Antigens der Klasse II beobachtet wird, Die Bindung von LAG-3 lg an DR₄ (9), DR₂, DR₇ oder DPw₄ (nicht dargestellt), die an der Oberfläche der Mäuse-Fibroblasten ausgedrückt werden, ist im Gegenteil schwächer als die, die beim Antikörper 949 beobachtet wurde.
Keine Verbindung wurde auf den negativen Zellstämmen bei den Antigenen der Klasse II des Ursprungs T (Zellen T des peripherischen Bluts, Stämme CEM, HSB2, REX), des Ursprungs B (Stamm RJ 2.2.5) oder des nicht lymphoiden Ursprungs (menschliche Stämme K562 krytho-mycloiden Ursprungs und aus Melanom-Zellen stammender Stamm) (nicht dargestellt) detektiert.
Darüber hinaus bindet sich LAG-3 lg an Moleküle der Klasse II des xenogenischen CMH, wie z. B. die durch das Mäuse-Lymphom A 20 ausgedrückten Antigene und die von mit Phytohämaglutinin stimulierten Blasten ausgedrückten Klassen II von Affen (Daten nicht dargestellt).
Die Bindungsspezifizität von LAG-3 lg wurde ebenfalls durch Hinzuziehung des monoklonalen Antikörpers 17B4 überprüft, dessen Fähigkeit zum Blockieren der Interaktionen LAG-3/CMH Klasse II in zellulären Adhäsionstests zuvor nachgewiesen wurde (10).
In diesen Experimenten werden die Moleküle LAG-3 lg 30 Minuten lang bei 4°C entweder mit dem Milieu allein oder mit 17B4 (1 mg/ml) oder mit OKT3 (1 mg/ml) vorab inkubiert, bevor sie mit Zellen DAUDI zusammengebracht werden.
10 zeigt, dass eine Vorhab-Inkubation von LAG-3 lg mit 17B4 die Bindung an die Zellen Klasse II+ inhibiert, während keinerlei Inhibition mit der Kontrolle OKT3 festgestellt wird.
BEISPIEL 5
Inhibition der Interaktion LAG-3/CMH Klasse II durch lösliche Fragmente von LAG-3
Die Inhibition der Interaktion LAG-3/CMH Klasse II durch die löslichen Fragmente von LAG-3 kann durch Vergleichs-Experimente mit den löslichen Fragmenten direkt bei der Bindung von LAG-3 lg auf den CMH Klasse II beobachtet werden.
Um zu überprüfen, ob die von den CHO produzierten löslichen Fragmente LAG-3D₁D₂ die Verbindung von von LAG-3 abgeleiteten Immunoadhäsinen verschieben konnten, wurden die folgenden Versuche durchgeführt:
Zellen DAUDI werden mit löslichen Fragmenten LAG-3D₁D₂ derart inkubiert, dass die Bindung dieser Moleküle an die Antigene der Klasse II des an der Oberfläche der Zellen DAUDI ausgedrückten CMH zugelassen wird.
In einer zweiten Stufe werden die Zellen bei Vorhandensein von LAG-3D₁D₄ lg in dimerischer Form oder von LAG-3D₁D₂ lg in monomerischer Form inkubiert.
Die Bindung dieser von LAG-3 abgeleiteten Immunoadhäsine wird mithilfe eines Ziegen-F(ab')2, mit Fluoreszein konjugiertem menschlichen Anti-lg (GAH FITC) gemessen.
Die kontrollierten Gruppen werden durch mit dimerischem LAG-3D₁D₄ lg oder monomerischem LAG-3D₁D₂ lg ohne Vorab-Inkubation mit den löslichen Fragmenten von LAG-3D₁D₂ inkubierte Zellen DAUDI dargestellt.
Die Ergebnisse werden in der Tabelle 5 wiedergegeben, die angibt, dass die löslichen Fragmente LAG-3D₁D₂ in der Lage sind, die in mono- oder dimerischer Form von LAG-3 abgeleiteten Immunoadhäsine zu verschieben.
TABELLE 5
Diese Daten bestätigen, dass die löslichen Fragmente LAG-3D₁D₂ sich an die Moleküle Klasse II des CMH binden.
Inhibition der Interaktion LAG-3/CMH Klasse II und CD4/CMH Klasse II
Die Bildung von Rosetten zwischen durch LAG-3 vom Wildtyp transfizierten Zellen Cos und durch das die Moleküle des CMH Klasse II ausdrückenden EBV umgewandelten Lymphozyten B wurde von BAIXERAS et al. (2) aufgezeigt. Diese Interaktion wird gleichzeitig durch monoklonale Antikörper Anit-LAG-3 und Anti-MCH Klasse II inhibiert.
Die in dieser Veröffentlichung beschriebene Methode wurde durch Ersatz der Visualisierung und des Auszählens der sich an die Lymphozyten B bindenden Zellen Cos durch das Auszählen der nach der Inkubation von mit ⁵¹Cr gekennzeichneten Lymphozyten B verbleibenden Radioaktivität mit LAG-3 ausdrückenden Zellen Cos (Verbindungsversuch) abgeändert.
Die eventuelle Inhibitorwirkung der von LAG-3 abgeleiteten löslichen Moleküle auf die Interaktion LAG-3/CMH Klasse II, aber auch die Interaktion CD4/CMH Klasse II wurden untersucht.
Es wurden Zellen Cos mit einem geeigneten (für LAG-3 vom Wildtyp oder CD4 kodierenden) Expressionsvektor transfiziert. Zwei Tage später wurden die Zellen Cos mit Trypsin behandelt und erneut in einer Menge von 0,05 × 10⁶ Zellen/Schälchen auf Platten für die Kultur von Gewebe im Schäl chenboden von 12 Schälchen ausgebracht. 24 Stunden später wurden mit ⁵¹Cr (5,5 × 10⁶) gekennzeichnete Zellen DAUDI auf dieser Einzelschicht aus Zellen Cos (endgültiges Volumen: 1 ml) 1 Stunde lang inkubiert. Die Zielzellen B wurden dann abgesaugt und die Schälchen 5 bis 7 Mal unter vorsichtigem tropfenweisem Hinzufügen von 1 ml Milieu gewaschen. Die Ränder der Schälchen wurden durch Absaugen mithilfe einer Pasteur-Pipette gewaschen. Die verbleibenden Zellen wurden mit 1 ml PBS lysiert; 1 % Triton 15 Minuten lang bei 37°C. Die Lysate wurden bei 3.000 U/Min. 10 Minuten lang zentrifugiert, und 100 μl des resultierenden Überstandes wurden ausgezählt.
LAG-3 D1-D4 lg wurde zur Inhibition der Interaktion LAG-3/CMH Klasse II und CD4/CMH Klasse II im Verbindungsversuch mit ⁵¹Cr eingesetzt. Die CD8 lg und menschlichen lgG1 wurden parallel getestet und als negative Vergleiche verwendet.
Es wurde eine erhebliche Inhibition der Interaktion LAG-3/Klasse II durch LAG-3 D1-D4 detektiert (5A). Dennoch kann die Interaktion LAG-3/CMH Klasse II teilweise und nicht spezifisch durch CD8 lg und die menschlichen lgG1 inhibiert werden. Andererseits stellt sich LAG-3 als ein potenzieller Inhibitor der Interaktion CD4/Klasse II (5B) unter experimentellen Bedingungen heraus, bei denen die Interaktion CD4/CMH Klasse II nicht durch CD8 lg oder menschliche lgG1 abgeändert war. Dies deutet darauf hin, dass die Interaktion LAG-3/Klasse II schwächer ist als die Interaktion CD4/Klasse II. Diese Ergebnisse stellen den ersten Nachweis eines möglichen Wettbewerbs von löslichen Molekülen bei einer Interaktion des CMH der Klasse II mit seinen Liganden dar.
BEISPIEL 6
Immunosuppressive Aktivität von LAG-3 D1-D4 lg
Es wurden funktionale Versuche mithilfe von oben beschriebenen Proliferationsversuchen für die biologische Aktivität der monoklonalen Antikörper Anti-LAG-3 durchgeführt.
3 Tage und 5 Tage (J3 und J5) nach der Antigen-Stimulation hat LAG-3 D1-D4 lg eine starke Inhibition der Proliferation des Klons 28 gezeigt, während menschliche CD8 lg und lgG keinerlei Wirkung hatten (6). Ähnliche Experimente wurden mit dem Klon 154 (7) realisiert und haben eine teilweise Inhibition bei Vorhandensein von LAG-3 lg gezeigt. Eine mit den monoklonalen Antikörpern Anti-LAG-3 hatte wie zuvor beobachtet diese umgekehrte Wirkung.
Eine erhebliche Inhibition der Zellproliferation von bei Vorhandensein von LAG-3 D1-D4 lg inkubierten Zellen wurde ebenfalls beim Klon 28 beobachtet.
Diese Beobachtungen zeigen, dass LAG-3 D1-D4 lg ein potenzieller Immuno-Suppressor der Proliferation von durch ein Antigen stimulierte Lymphozyten T ist und zeigen an, dass LAG-3 als ein „Löschfaktor" der von den CD4+ aktivierten Hilfslymphozyten T induzierten sekundären Immunantwort wirken könnte.
Die Rolle von LAG-31g bei der negativen Regulierung der Immunantworten der Zellen T.
Um aufzuzeigen, dass eine die Funktionen des Membranenmoleküls nachahmende lösliche Form von LAG-3 die Aktivierung von durch ein Antigen stimulierte Klone T CD4+ inhibieren konnte, wurden die folgenden Versuche mit dem Klon T 154 realisiert: Die Zellen T werden zuvor mit einer saturierenden Menge von LAG-3 lg (100 nM) Zellen T inkubiert. Die Zellen werden anschließend zweimal mit kaltem RPMI gewaschen und mit 10 g/ml gegen menschliche Immunoglobuline (Tago) gerichteten Ziegenantikörpern bei 4°C 30 Minuten lang inkubiert.
Nach zwei neuen Waschungen werden die Zellen in 10 % fötales Kalbsserum enthaltendem RPMI 2 Stunden lang bie 37°C vor dem Hinzufügen erneut suspendiert. Zum Koppeln („cross-link") der monoklonalen Antikörper wird ein Ziegen-Antikörper Anti-Maus zu 10 μg/ml (Tago) verwendet.
11 stellt ein Experiment dar, in dem der Klon T154 vorab mit mit einem zweiten Reagens (für die konstante Region des menschlichen Immunoglobulin spezifisches, polyklonales Serum) verbundenes („cross-link") LAG-3 lg inkubiert wurde. Die Bindungsquote von LAG-3 lg an die Zellen wird durch Immunofluoreszenz gemessen (11A). 11B zeigt, dass eine Inhibition von mehr als 50 % der Proliferation des Klons T154 von LAG-3 lg produziert wird. Unter denselben experimentellen Bedingungen wird keinerlei Wirkung mit der Kontrolle CD8 lg oder mit LAG-3 lg ohne „Cross-Linking" festgestellt (in der Figur nicht dargestellt).
11C zeigt ebenfalls, dass keine Wirkung beobachtet wird, wenn LAG-3 lg zum Verbinden („cross-link") der durch ein Antigen aufweisenden Zellen B ausgedrückten Moleküle der Klasse II des CMH verwendet wird.
Die eventuelle Wirkung von bei der Proliferation der Zellen T verbundenen („cross-link") monoklonalen Antikörper Antiklasse II wurden mit denen von LAG-3 lg verglichen. Es wird eine schwache Inhibition (unter 50 %) mit dem Antikörper 949 und dem Antikörper D1.12 (Anti-DR) beobachtet, die mit einem polyklonalen Anti-Mäuse-Ziegenserum (12) verbunden sind. Die Inhibition der Proliferation ist daher epitopabhängig, wobei die stärkste Wirkung mit dem Epitop von für die Verbindung mit den Klassen II spezifischem LAG-3 erhalten wird.
Die Wirkung von LAG-3 lg auf die Proliferation der Zellen T wurde ebenfalls unter Verwendung unterschiedlicher Signale auf einem anderen Klon T CD4+, dem spezifischen Klon TDEL des Peptids 34-53 des basischen Myelin-Proteins untersucht.
Eine Inhibition der Proliferation wird beobachtet (n=2), wenn TDEL mit dem (nicht dargestellten) Antigen, mit dem immobilisierten OKT3 (13A), mit Lektinen (PHA + PMA) (13B) und mit 5 Ul/ml von IL₂ (13C) stimuliert wird. Mit 100 Ul/ml von IL₂ (13D) wird keine Inhibition beobachtet.
Als Schlussfolgerung zeigen alle diese Ergebnisse an, dass LAG-3 und die Moleküle von CMH Klasse II, die jeweils Aktivierungs-Antigene der Zellen T sind, in der Inaktivierungsphase der Antworten der Zellen T implizierten Auswirkungs-Molekülen gleichzusetzen sind. Darüber hinaus zeigen diese Ergebnisse die Bedeutung der Interaktionen zwischen Zellen T bei der Kontrolle der zellulären Immunantwort auf.
BEISPIEL 7
Simulation der zellulären Zytotoxizität durch LAG-3 lg
Die Rolle von LAG-3 lg bei der zellulären Zytotoxizität wird an zwei Typen von Auswirkungszellen untersucht:

– den frisch entnommenen menschlichen Lymphozyten des peripherischen Bluts (PBL)
– den Zellen des Stammes S1B5 (Klon menschlicher Zellen NK)

Die zytotoxische Aktivität dieser Zellen wird durch Auszählen des im Milieu erneut ausgebrachten ⁵¹Cr durch zuvor gekennzeichnete Zielzellen bei Vorhandensein oder Nicht-Vorhandensein von LAG-3 lg im Milieu gemessen.
14 zeigt die Zytotoxizitätsquote von S1B5 bei einem Stamm durch das Virus Epstein-Barr abgeänderter menschlicher Zellen B mit den Antigenen der Klasse I und II des größeren Histokompatibilitätskomplexes (Stamm LAG 388) in Abhängigkeit von unterschiedlichen, zu den Kulturen hinzugefügten Reagenzien.
Die Messungen werden nach 4 Studien der gemeinsamen Kultur bei Verhältnissen Auswirkungs-Zellen/Zielzellen (S1B5/LAZ 388) von 3/1 (weiße Kolonnen) oder 1/1 (gestrichelte Kolonnen) realisiert.
Die negativen Kontrollen werden nur durch das Milieu (MED), das Immunoadhäsin CD8 lg und den monoklonalen Antikörper 17.B4 (Anti-LAG-3) gebildet.
Die positiven Kontrollen werden durch drei unterschiedliche Antikörper gebildet:

– den gegen die Antigene der Klasse II DR gerichteten Antikörper L243,
– den gegen die Antigene der Klasse II DR, DP, DQ gerichteten Antikörper 9.49
– den gegen die Antigene der Klasse I des größeren menschlichen Histokompatibilitäts-Komplexes gerichteten Antikörper W632.

Die Antikörper Anti-HLA Klasse I (W632) oder der Klasse II (L243) erhöhen die Lyse der Zielzellen (und nicht die Kontrolle 17B4). Die Immunoadhäsion LAG-3 lg erhöht die Lyse; die Kontrolle CD8 lg hat keine Wirkung.
15 zeigt die Ergebnisse eines dem vorherigen Experiment analogen Experiments, bei dem die Zytotoxizität der PBL gegenüber den Zellen DAUDI (HLA Klasse 1-) bei Verhältnissen Auswirkungsfaktor/Ziele von 50/1 (weiße Kolonnen) und 15/1 (gestrichelte Kolonnen) gemessen wird. Die in dem Milieu hinzugefügten Reagenzien sind dieselben wie die, die im ers ten Experiment verwendet werden, ausgenommen der Antikörper 9.49 und der Antikörper 17.B4. Der Antikörper 10H3 ist ein Immunoglobulin vom spezifischen Isotyp lgG1 des Oberflächen-Antigens CD45. Es wird als negative Kontrolle verwendet.
Keinerlei Veränderung wird mit einem gegen die Antigene der Klasse I des größeren Histokompatibilitäts-Komplexes (W632) gerichteten Antikörper beobachtet.
Die Daten dieser beiden Serien von Messungen zeigen an, dass LAG-3 lg verglichen mit negativen Kontrollen die Zytotoxizität der Zellen NK aktiviert. Diese Wirkung ist ähnlich der Wirkung, die mit gegen die Moleküle der Klasse II des CMH gerichteten Antikörpern beobachtet wird.
LISTE DER SEQUENZEN
I – ALLGEMEINE INFORMATIONEN

(1) ANTRAGSTELLER: INSTITUT GUSTAVE ROUSSY/INSERM, APPLIED RESEARCH SYSTEMS ARS HOLDING N. V.
(2) TITEL DER ERFINDUNG:
Von LAG-3 abgeleitete lösliche Polypeptidfraktionen; therapeutische Zusammensetzung, Verwendung der Antikörper Anti-LAG-3
(3) ANZAHL DER SEQUENZEN: 1

II – INFORMATIONEN FÜR DIE SEQUENZ SEQ ID Nr. 1
MERKMALE DER SEQUENZ

Typ: Nukleotid
Länge: 476
Anzahl der Zweige: doppelt
Konfiguration: linear
Molekültyp: DNAc
Organismus: Homo Sapiens
Gewebe: Lymphozyten T
Name: LAG-3

Beschreibung der Sequenz:
BIBLIOGRAPHISCHE REFERENZEN

1. TIEBEL T. et al., 1990, J. Exp. Med. 171, 1393-1405
2. BAIXERAS E. et al., 1992, J. Exp. Med. 176, 327-337
3. COSGROVE D. et al., 1991, Cell 66, 1051-1066
4. RAHEMTULLA A. et al., 1991, Nature 353, 180-184
5. TRAUNECKER A. et al., 1988, Nature 331, 84-86
6. BENEDICT A.A. et al., 1967, Methods in Immunology 1, 197-306 (1967)
7. YELTON D.E. et al., Ann. Rev? of Biochem? 50, 657-680 (1981)
8. HUARD B. et al., Immunogenetics 39:213
9. MANIATIS T. et al., (1982), Molecular cloining: A laboratory manual – Cold Spring Harbor Laboratory, New York.
10. SEED B., 1987, Nature 329, 840-842
11. COLE S.C. et al., Biothechnology 11, 1014-1024, 1993
12. COLE S.C. et al., Biothechnology 11, 1014-1024, 1993

TABELLE Nr. 1
TABELLE Nr. 2

Claims

Verwendung von Antikörpern, die das Immunsystem stimulieren und die den extrazellulären Bereich D1 vom Typ Immunoglobulin des Proteins LAG-3 erkennen, das die Aminosaüre 1 bis 149 der Sequenz ID Nr. 1 entspricht, oder von Fragmenten dieser Antikörper für die Zubereitung einer therapeutischen Zusammensetzung, die zur Behandlung von Krankheiten bestimmt ist, die durch Stimulation des Immunsystems gelindert oder vermeidbar werden.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die besagten Antikörper als Impfstoff-Potentialisatoren verwendet werden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die besagte Stimulation des Immunsystems der Stimulation der T-Lymphozyten entspricht.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die besagte Stimulation des Immunsystems der Stimulation der Reifung der T-Lymphozyten entspricht.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die besagte Stimulation der Immunantwort der Stimulation der Differenzierung der T-Lymphozyten entspricht.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die besagte Stimulation der Immunantwort der Stimulation der Proliferation der T-Lymphozyten entspricht.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die besagte Stimulation der Immunantwort der Stimulation der Funktion der T-Lymphozyten entspricht.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Antikörper monoklonale Antikörper oder Fragmente dieser Antikörper sind, vor allem die Fragmente Fab, Fab', F(ab')₂.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die besagten Krankheiten in der Gruppe ausgewählt sind, welche die Infektions- und Krebskrankheiten umfassen.
Lösliche Polypeptidfraktion, gebildet von den 4 extrazellulären Bereichen vom Typ Immunoglobulin des Proteins LAG-3, das die Aminosaüre 1 bis 412 der Sequenz ID Nr. 1 entspricht, dadurch gekennzeichnet, dass die Peptidsequenz LAG-3 außerdem an ihrem C-terminalen und/oder N-terminalen Ende eine zusätzliche Peptidsequenz einer Verbindungsregion -CH2-CH3 einer Immunoglobulinkette umfasst, so dass ein Fusionsprotein gebildet wird.
Lösliche Polypeptidfraktion nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Immunoglobulin vom Isotyp IgG4 ist.