DE69535520T2

DE69535520T2 - Abgeänderter, verbesserter BRSV Lebend- Impfstoff

Info

Publication number: DE69535520T2
Application number: DE69535520T
Authority: DE
Inventors: Hsien-Jue Fort Dodge Chu
Original assignee: Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 1994-05-10
Filing date: 1995-05-08
Publication date: 2008-02-07
Anticipated expiration: 2015-05-09
Also published as: JP3993230B2; PT1820512E; EP0759780A1; MY111829A; WO1995030437A1; DE69518316T2; SI0759780T1; EP1820512A1; ZA953703B; ES2149361T3; AU2438795A; JP2007137905A; SI0968722T1; US5958423A; JPH10500113A; EP1820512B1; EP1844791A1; DK0759780T3; DE69518316D1; CA2189979A1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft verbesserte Verfahren zum Induzieren von schützender Immunität gegen bovines Respiratory-Syncytial-Virus (BRSV), insbesondere unter Einsatz eines modifizierten lebendigen Vakzins, das zur Verabreichung an Empfängertiere in einer einzigen Dosis geeignet ist.
Allgemeiner Stand der Technik
Bovines Respiratory-Syncytial-Virus ist heute als ein wichtiges ätiologisches Agens im bovinen respiratorischen Krankheitskomplex (Bovine Respiratory Disease Complex, BRDC) anerkannt. Die Erkrankung zeichnet sich durch beschleunigte Atmung, Husten, Appetitverlust, Augen- und Nasenausfluss und erhöhten Temperaturen aus. In einem akuten Ausbruch kann der Tod innerhalb von 48 Stunden nach dem Einsetzen der Symptome erfolgen.
BRSV infiziert Rinder jeden Alters, einschließlich säugender Kälber. BRSV wird als der häufigste virale Krankheitserreger in enzootischer Pneumonie in Kälbern erachtet und wurde auch mit Lungenemphysem unter gerade abgesetzten Kälbern in Zusammenhang gebracht. Folglich besteht Bedarf an einer wirksamen Prophylaxe gegen dieses Virus in Rindern und Milchviehherden.
Das Herstellen einer schützenden Immunität gegen BRSV ist problematisch. Wie in einigen anderen durch Viren vermittelten Erkrankungen korrelieren die Spiegel von Serum-Antikörpern gegen BRSV nicht unbedingt mit einem Schutz vor einer Erkrankung. Dieses Phänomen kann eine Rolle für lokal produziertes IgA, das gegen BRSV gerichtet ist (Kimman et al., J. Clin. Microbiol. 15: 1097-1106, 1987), und/oder ein Erfordernis zellulärer Immunität reflektieren, um eine wirksame Abwehr gegen dieses Virus aufzubringen. Das Herstellen einer schützenden Immunität in säugenden Kälbern präsentiert zusätzliche Hindernisse, da mütterliche Antikörper zu BRSV das injizierte Immunogen abreichern und tatsächlich das Vakzin neutralisieren können. Schließlich machen die Unannehmlichkeit und die Kosten mehrerer Vakzinationen ein Einzeldosis-Vakzin wünschenswert. Folglich besteht in der Technik Bedarf an Einfachdosis-BRSV-Vakzinformulierungen, die eine starke und vielfältige Immunantwort auslösen.
Der Standardverabreichungsplan für BRSV-Vakzine des Standes der Technik ist zwei Dosen (Stoff et al., J. Hyg. Camb. 93: 251-261, 1984; Thomas et al., Agri-Practice 5: 1986; und Syvrud et al., Vet. Med. 83: 429-430, 1988; Veterinary Pharmaceuticals & Biologicals, Ausgabe 8 1993/94, S. 484, 740-741, 956-960, 982-983). Wie in Kucera et al. (Agri-Practice, Vet. Med., Bd. 79, Oktober 1983, S. 1599-1604, 1983) gezeigt ist, induzierte eine einzige experimentelle BRSV-Vakzination verhältnismäßig niedrige Spiegel von Titer von serumneutralisierenden Antikörpern (SN-Antikörpertiter) zu BRSV, wohingegen zwei Dosen des Vakzins SN-Antikörperfiter von 1:10 bis 1:320 auslösten. Des Weiteren benötigten in Herden, die augenscheinlich während Feldversuchen BRSV ausgesetzt wurden, ungefähr 48 % nicht vakzinierter Tiere eine Behandlung von Atemwegserkrankung, verglichen mit 27 % und 21 % unter mit einem Einzeldosis- bzw. Zweifachdosis-Vakzin behandelten Tieren. Es wurde jedoch nicht schlüssig gezeigt, dass das kausale Agens für Atemwegserkrankung in den Feldversuchen BRSV war. Zudem wurde angemerkt, dass ein Einzeldosis-Vakzin nicht sehr immunogen zu sein schien. Spätere Auswertungen folgerten, dass zwei Dosen dieses Vakzins unerlässlich wären, um einen guten Schutz zu erhalten (Bovine Vet. Forum 1: Nr. 2, S. 2-16, 1986; Syvrud et al., Vet. Med. 429-430, 1988).
Vet. Immunol. Immunopathol., Bd. 22, Nr. 2, 1989 NL, Seiten 145-160, Kimman et al., beschreibt das Vorbereiten auf lokale und systemische Antikörper-Gedächtnisantworten auf bovines Respiratory-Syncytial-Virus und die Wirkung auf die Virusmenge, die Virusreplikation, den Verabreichungsweg und mütterliche Antikörper. J. Clin. Microbiol. Bd. 25, Nr. 6, 1987, Seiten 1097-1106, Kimman et al., beschreibt lokale und systemische Antikörperantwort auf bovines Respiratory-Syncytial-Virus und die Reinfektion in Kaibern mit und ohne mütterliche Antikörper. Vet. Q. Bd. 13, Nr. 1, 1991 NL, Seiten 47-59, Baker, offenbart immunpathologische Mechanismen auf humanes und bovines Respiratory-Syncytial-Virus. Semin. Immunol. Bd. 2, Nr. 5, 1990 USA, Seiten 369-374, Allison et al., offenbart und deren Wirkmodus.
Die europäische Patentanmeldung Nr. 129,923 (am 1. Februar 1985 veröffentlicht und am 9. Juli 1988 als ein Patent erteilt) beschreibt ein Verfahren zum Herstellen eines lebendigen BRSV-Vakzins, das das Lösen des lebendigen Vakzins in einem inaktivierten Vakzin, das ein oder mehrere Antigene (insbesondere inaktiviertes Influenzavirus) enthält, als eine Öl-in-Wasser-Emulsion formuliert, beinhaltet. In Jungtieren, die noch eine mütterliche Immunität aufwiesen, wurde eine Seroreaktion erhalten. Die Anmeldung beschreibt außerdem ein modifiziertes lebendiges Präparat, das BRSV und Adjuvans enthält. Es wurden zu der schützenden Wirksamkeit eines beliebigen BRSV-Vakzins gegen eine BRSV-Belastungsinfektion jedoch keine Daten dargelegt.
Eine Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein wirksames Vakzin gegen BRSV bereitzustellen, das eine schützende Immunität bereitstellt und eine von diesem Virus verursachte Erkrankung verhindert.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Adjuvans bereitzustellen, das zur Verwendung in einem BRSV-Vakzin geeignet ist, wobei das Adjuvans die Immunogenität des Virus verstärkt, so dass nach einer einzigen Dosis des Vakzins eine schützende Immunität ausgelöst wird.
Die Erfindung umfasst Verwendungen wie in den hieran angefügten Ansprüchen definiert.
Die Erfindung betrifft außerdem Zusammensetzungen zum Verstärken von Immunantworten, die ein Blockcopolymer, wie ein Polyoxypropylen/Polyoxyethylen-Blockcopolymer (POP/POE-Blockcopolymer), vorzugsweise Pluronic^® L121 (z. B. US-Patentschrift 4,772,466 ), und einen organischen Bestandteil, wie ein metabolisierbares Öl, z. B. ein ungesättigter Turpin-Kohlenwasserstoff, vorzugsweise Squalan (2,6,10,15,19,23-Hexamethyltetracosan) oder Squalen, umfassen. Die Zusammensetzung kann außerdem ein nichtionisches Detergens oder Tensid, vorzugsweise ein Polyoxyethylensorbitanmonooleat, wie ein Tween^®-Detergens, am meisten bevorzugt Tween^®-80, d. h. Polyoxyethylen(20)sorbitanmonooleat, enthalten.
In dieser Stammadjuvansmischung können das Blockcopolymer, das organische Öl und das Tensid in Mengen vorliegen, die von etwa 10 bis etwa 40 ml/l, etwa 20 bis etwa 80 ml/l bzw. etwa 1,5 bis etwa 6,5 ml/l reichen. In einer bevorzugten Ausführungsform des Stammadjuvans ist der organische Bestandteil Squalan, das in einer Menge von etwa 40 ml/l vorliegt, das Tensid ist Polyoxyethylensorbitanmonooleat (Tween^®-80), das in einer Menge von etwa 3,2 ml/l vorliegt, und das POP/POE-Blockcopolymer ist Pluronic^® L121, das in einer Menge von etwa 20 ml/l vorliegt. Pluronic^® L121 ist ein bei 15-40 °C flüssiges Copolymer, wobei der Polyoxypropylen-Bestandteil (POP-Bestandteil) ein Molekulargewicht von 3250 bis 4000 aufweist und der Polyoxyethylen-Bestandteil (POE-Bestandteil) etwa 10-20 %, vorzugsweise 10 % des gesamten Moleküls umfasst.
In einem anderen Gesichtspunkt betrifft die vorliegende Erfindung eine immunogene Zusammensetzung zum Immunisieren eines Tiers gegen eine Infektion durch bovines Respiratory-Syncytial-Virus (BRSV), die ein modifiziertes lebendiges BRS-Virus, kombiniert mit dem obigen Adjuvans und einem pharmazeutisch unbedenklichen Stabilisator, Trägerstoff oder Verdünnungsmittel, umfasst. Das Adjuvans liegt in dieser Vakzinzusammensetzung in einer Endkonzentration von etwa 1-25 Vol.-%, vorzugsweise 5 Vol.-% vor. Die Zusammensetzung kann außerdem andere Viren, wie infektiöses bovines Rhinotracheitisvirus (IBRV), bovine virale Diarrhoe (BVDV) und Parainfluenza-3 (Pi-3V), enthalten und kann über intramuskuläre oder subkutane Wege verabreicht werden.
In noch einem anderen Gesichtspunkt wird ein Verfahren zum Schützen eines Tiers vor einer von bovinem Respiratory-Syncytial-Virus verursachten Erkrankung, indem eine einzige Dosis des obigen Vakzins, das modifiziertes lebendiges BRSV und Adjuvans umfasst, verabreicht wird, beschrieben.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Wie hierin verwendet, ist ein „modifiziertes lebendiges Vakzin" ein Vakzin, das ein Virus umfasst, das geändert wurde, in der Regel durch Einbringen in Gewebekulturzellen, um dessen Fähigkeit, eine Erkrankung zu verursachen, abzuschwächen, das jedoch dessen Fähigkeit, vor einer Erkrankung oder Infektion zu schützen, aufrechterhält, wenn es an Tiere verabreicht wird.
„Adjuvans" steht für eine Zusammensetzung, die sich aus einer oder mehreren Substanzen zusammensetzt, die die Immunogenität und Wirksamkeit von BRSV verstärkt, wenn sie mit BRSV in einer Vakzinzusammensetzung kombiniert wird.
Eine „infektiöse Einheit" von BRSV ist als eine TCID₅₀ definiert oder die Virusmenge, die zum Infizieren oder Abtöten von 50 % von Gewebekulturzellen erforderlich ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Vakzine gegen BRSV, die zur Einzeldosisverabreichung geeignet sind. Die Vakzine sind von der Art eines modifizierten lebendigen Virus. Dies bietet den Vorteil des Bewahrens der Immunogenität und/oder Wirksamkeit des Virus, während dessen Virulenz verringert wird.
Das Vakzin kann aus frisch geernteten Viruskulturen mittels Verfahren hergestellt werden, die in der Technik standardmäßig sind (siehe Beispiel 1 unten). Das heißt, das Virus kann in Gewebekulturzellen, wie menschlichen diploiden Fibroblasten oder vorzugsweise MDBK-Zellen (Madin-Darby Bovine Kidney, bovine Madin-Darby-Nierenzellen) oder anderen bovinen Zellen, vermehrt werden. Das Wachstum des Virus wird mittels Standardtechniken überwacht (Beobachtung des zytopathischen Effekts, Immunfluoreszenz- oder andere auf Antikörper basierende Assays) und geerntet, wenn ein ausreichend hoher Virustiter erzielt wurde. Die Virusstammlösungen können vor Einbindung in die Vakzinformulierung mittels herkömmlicher Verfahren weiter konzentriert oder lyophilisiert werden. Andere Verfahren, wie die in Thomas et al., Agri-Practice, Bd. 7, Nr. 5, S. 26-30, beschriebenen, können eingesetzt werden.
Die Vakzine umfassen das modifizierte lebendige Virus, kombiniert mit einem oder mehreren pharmazeutisch unbedenklichen Stabilisatoren, Trägerstoffen und Adjuvantien. Zu zur Verwendung geeigneten Stabilisatoren Trägerstoffen zählen Kochsalzlösung, phosphatgepufferte Kochsalzlösung, minimales essentielles Medium (MEM) oder MEM mit HEPES-Puffer. Stabilisatoren beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Saccharose, Gelatine, Pepton, verdaute Proteinextrakte, wie NZ-Amin oder NZ-Amin-AS. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Adjuvans, das die Immunogenität des modifizierten lebendigen Virus verstärkt und für eine einzige Verabreichung zum Auslösen einer schützenden Immunität sorgt.
Zu geeigneten Adjuvantien zählen Squalan und Squalen (oder andere Öle tierischen Ursprungs); Blockcopolymere wie Pluronic^® (L121); Saponin; Detergentien wie Tween^®-80; Quil^® A, Mineralöle wie Drakeol^® oder Marcol^®, Pflanzenöle wie Erdnussöl; von Corynebacterium abgeleitete Adjuvantien wie Corynebacterium parvum; von Propionibacterium abgeleitete Adjuvantien wie Propionibacterium acne; Mycobacterium bovis (Bacillus Calmette-Gutirin oder BCG); Interleukine wie Interleukin-2 und Interleukin-12; Monokine wie Interleukin-1; Tumornekrosefaktor; Interferone wie gamma-Interferon; Kombinationen wie Saponin/Aluminiumhydroxid oder Quil^® A/Aluminiumhydroxid; Liposome; ISCOM-Adjuvans; Mycobacterium-Zellwandextrakt; synthetische Glykopeptide wie Muramyldipeptide oder andere Derivate; Avridin; Lipid A; Dextransulfat; DEAE-Dextran oder DEAE-Dextran mit Aluminiumphosphat; Carboxypolymethylen wie Carbopol^®; EMA und Acrylcopolymeremulsionen wie Neocryl^® A640 (wie z. B. in der US-Patentschrift 5,047,238 beschrieben); Proteine von Vaccinia oder Pockenvirus eines Tiers; Adjuvantien aus subviralen Partikeln wie Orbivirus; Choleratoxin; Dimethyldiocledecylammoniumbromid oder Mischungen davon.
Die Formulierung einer bevorzugten Adjuvansmischung ist in Beispiel 2 unten beschrieben.
Das Vakzin der vorliegenden Erfindung kann vorzugsweise über intramuskuläre oder subkutane Wege oder weniger bevorzugt über intranasale, intraperitoneale oder orale Wege verabreicht werden.
Zur Einzeldosisverabreichung sollte das Vakzin eine BRSV-Menge enthalten, die von etwa 10^3,0 bis etwa 10^6,0 TCID₅₀/ml, vorzugsweise 10⁴ bis 10⁵ TCID₅₀/ml entspricht. Etwa ein bis fünf ml, vorzugsweise 2 ml können pro Tier intramuskulär, subkutan oder intraperitoneal verabreicht werden. Ein bis zehn ml, vorzugsweise 2 bis 5 ml können oral oder intranasal verabreicht werden.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter veranschaulichen, ohne deren Schutzumfang einzuschränken.
Beispiel 1: Wachstum und Ernten von BRSV
A) Beschreibung von Virusstammlösungen:
BRSV kann von einer beliebigen Anzahl von leicht erhältlichen Quellen bezogen werden. In einer Ausführungsform kann der BRSV-Stamm 375 verwendet werden. Dieser virulente BRSV-Stamm stammte von der Iowa State University, Ames, Iowa, USA. Ein beliebiger geeigneter BRSV-Stamm wird in Betracht gezogen und in die Erfindung einbezogen. In ähnlicher Weise sind BHV-1, BVDV und PI-3V leicht erhältliche Viren. Wenn sie in virulenter Form bezogen werden, können diese Viren durch bekannte Mittel attenuiert werden, um modifizierte lebendige Viren bereitzustellen, die zum Vakzingebrauch geeignet sind. Die Viren können auch mittels herkömmlicher Verfahren abgetötet werden, um inaktivierte Viren bereitzustellen, die zum Vakzingebrauch geeignet sind. Verfahren zum Attenuieren oder Inaktivieren von Viren zum Vakzingebrauch sind wohl bekannt. Modifizierte lebendige und/oder abgetötete BRSV-, BHV-1-, BVDV- und PI-3V-Virus-Vakzine sind bekannt und im Handel erhältlich. Siehe beispielsweise Thomas et al., oben, und Veterinary Pharmaceuticals & Biologicals, oben, und Anhang 2, A-31-45.
B) Zellkultur:
Die MDBK(NBL-1)-Zelllinie, die frei von BVD ist, wurde von der American Type Culture Collection erworben. Sie wurde in OptiMEM (Gibco, Grand Island, NY, USA), das mit bis zu 10 Vol.-% Rinderserum, bis zu 0,5 % Lactalbuminhydrolysat (JRH, Lenexa, KS, USA), bis zu 30 mcg/ml Polymixin B (Phizer, NY, NY, USA) und Neomycin (Upjohn, Kalamazoo, MI, USA) und bis zu 2,5 mcg/ml Amphotericin B (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) supplementiert war, gehalten. Natriumpyruvat, Natriumhydrogencarbonat, Glucose, L-Glutamin und Calciumchlorid können ebenfalls nach Bedarf zugegeben werden, um das Zellwachstum aufrechtzuerhalten.
Zur Virusvermehrung wird OptiMEM, Eagle's MEM, Medium 199 oder ein äquivalentes Medium mit bis zu 2 % Rinderserum, bis zu 0,5 % Rinderserumalbumin, bis zu 0,5 % Lactalbuminhydrolysat, bis zu 30 mcg/ml Polymixin B und Neomycin und bis zu 2,5 mcg/ml Amphotericin B supplementiert. Natriumpyruvat, Natriumhydrogencarbonat, Glucose, 1-Glutamin und Calciumchlorid können ebenfalls nach Bedarf zugegeben werden, um das Zellwachstum aufrechtzuerhalten.
C) Inokulation von Kulturen:
Individuelle subkonfluente Kulturen von MDBK-Zellen wurden mit BRSV, BVDV, PI-3V oder BHV-1V unter Verwendung einer Infektionsmultiplizität von 1:5 bis 1:5000 infektiösen Einheiten pro Zelle inokuliert. Das Wachstumsmedium der Zellen wurde verworfen und durch Virusvermehrungsmedium (siehe oben) ersetzt, wonach das Saatvirus direkt in das Kulturgefäß gegeben wurde. Die mit Virus infizierten Kulturen wurden bei 36 °C gehalten.
Das Viruswachstum wurde mittels mikroskopischer Untersuchung auf zytopathischen Effekt oder mittels Fluoreszenz-Antikörper-Färbung ermittelt. Bei BRSV zeigten die infizierten Zellen die Bildung von Synzytium- und länglichen Spindelzellen, die fortschritt, bis im Wesentlichen die gesamte Zellschicht beteiligt war. Bei BHV-1V zeigten die infizierten Zellen eine zytoplasmatische Granulation, auf die eine Abrundung und/oder Ballonierung der infizierten Zellen folgte. Bei BVDV bilden die infizierten Zellen intrazelluläre Vakuolen, runden ab und hinterlassen begrenzte Bereiche, die frei von Zellen sind. Die zytopathischen Veränderungen in mit PI-3V infizierten Zellen ähneln denen in mit BHV-1V infizierten Zellen.
D) Ernten des Virus:
Die Kulturflüssigkeiten wurden in sterile Gefäße geerntet. Mehrere Ernten können beginnen, wenn 50 % der Zellschicht charakteristische Zytopathologie zeigt, und fortfahren, bis 100 % der Zellen betroffen sind. Die Virusflüssigkeiten können mittels Zentrifugierung oder Filtration geklärt werden oder auch nicht. Die Virusflüssigkeiten werden bei –50 °C oder kälter gelagert oder lyophilisiert und bei 2 bis 8 °C gelagert.
Zur Herstellung eines fertigen Vakzins werden die Virusstammlösungen, entweder für sich oder in Kombination, mit Adjuvans gemischt.
Wenn flüssige Virusstammlösungen verwendet werden, werden 19 Teile Virusstammlösung mit einem Teil Adjuvans, vorzugsweise dem Adjuvans von Beispiel 2 gemischt. Wenn lyophilisierte Virusstammlösungen verwendet werden, wird eine verdünnte Adjuvanslösung von 5 Vol.-% in Kochsalzlösung hergestellt (Mischen von 1 Teil Adjuvans mit 19 Teilen Kochsalzlösung). Die lyophilisierte Virusstammlösung wird mit dem verdünnten Adjuvans rekonstituiert (rehydriert), um die fertige Vakzinzusammensetzung zu bilden. Thimerisol kann der fertigen Formulierung bis zu einer Endkonzentration von 1:10.000 zugegeben werden.
Beispiel 2: Formulierung einer bevorzugten Adjuvansstammlösung

Ein bevorzugtes Adjuvans zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung wurde gemäß der folgenden Formulierung hergestellt:

Polyoxypropylen/Polyoxyethylen-Blockcopolymer (z. B. Pluronic^® L121, BASF, Parsippany, NY, USA)	20 ml
Squalan (z. B. Kodak, Rochester, NY, USA)	40 ml
Polyoxyethylensorbitanmonooleat (z. B. Tween^®-80, Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA)	3,2 ml
Gepufferte Salzlösung (z. B. D-V-PAS-Lösung, frei von Ca, Mg)	936,8 ml

Die Bestandteile werden gemischt und homogenisiert, bis eine stabile Masse oder Emulsion gebildet wird. Vor der Homogenisierung können die Bestandteile oder die Mischung autoklaviert werden. Die Emulsion kann mittels Filtration weiter sterilisiert werden. Formalin kann bis zu einer Endkonzentration von 0,2 zugegeben werden. Thimerosal kann bis zu einer Endverdünnung von 1:10.000 zugesetzt werden.
Beispiel 3: Verstärkung eines modifizierten lebendigen BRSV-Vakzins
Für diese Studie wurden zwei BRSV-Vakzine hergestellt, eines mit und eines ohne die in Beispiel 2 beschriebene Adjuvansmischung. Das Vakzin, dem Adjuvans fehlte, enthielt 2,52 log infektiöse Einheiten von BRSV pro 2 ml, während das Vakzin, das Adjuvans enthielt, 2,96 log infektiöse Einheiten pro 2 ml und 5 Vol.-% Adjuvans enthielt.
Jedes von zwanzig Rindern erhielt eine 2-ml-Dosis des Vakzins, dem Adjuvans fehlte, zehn intramuskulär und zehn subkutan. Fünf weitere Rinder erhielten eine 2-ml-Dosis des Vakzins, das Adjuvans enthielt. Alle Vakzinationen wurden nach 21 Tagen wiederholt. Serumproben wurden am sechsten Tag nach der zweiten Vakzination genommen und auf das Vorliegen von serumneutralisierenden Anti-BRSV-Antikörpern geprüft. Der Assay auf serumneutralisierende Antikörper ist in Beispiel 4 beschrieben.
Die Ergebnisse dieser Studie zeigten an, dass 4 der 5 Kälber, die mit dem Adjuvans enthaltenden BRSV-Vakzin inokuliert worden waren, einen Nachweis von Anti-BRSV-Antikörpern (Serokonversion) aufzeigten, während keines der zwanzig Tiere, die mit BRSV-Vakzin, dem Adjuvans fehlte, inokuliert worden waren, einen Nachweis von Antikörpern aufzeigten. Dies deutet darauf hin, dass das in Beispiel 2 beschriebene Adjuvans die Eigenschaft zum Verstärken der Immunogenität von modifizierten lebendigen BRSV-Vakzinen aufweist.
Beispiel 4: Einzeldosisverabreichung von verbessertem BRSV-Vakzin
Die folgende Vakzinations- und Belastungsinfektionsstudie wurde durchgeführt, um zu ermitteln, ob eine einzige Immunisierung mit modifiziertem lebendigem bovinem Respiratory-Syncytial-Virus (BRSV), das mit einem Adjuvans formuliert wurde, in Rindern eine schützende Immunität induzieren würde. Zweitens war die Studie darauf konzipiert, zu ermitteln, ob eine gleichzeitige Verabreichung von modifiziertem lebendigem bovinem viralem Diarrhoevirus (BVDV), bovinem Herpesvirus Typ 1 (BHV-1 oder IBRV) und bovinem Parainfluenzavirus (PI3) die Induzierung einer schützenden Immunität gegen BRSV stören würde.
A) Versuchsvakzine:
Modifiziertes lebendiges bovines Respiratory-Syncytial-Virus (BRSV) bei fünf Passagen über die Mastersaat hinaus wurde auf MDBK-Zellen (Madin-Darby Bovine Kidney, bovine Madin-Darby-Nierenzellen) bei der Masterzellstammlösungpassage 20 wachsen gelassen. Kurz gesagt, MDBK-Zellen wurden in 850-cm²-Rollerflaschen in einer Dichte von 3 × 10⁷ Zellen pro Rollerflasche in minimalem essentiellem Medium (MEM), das 5 % Rinderserum, 0,5 % LAH und 30 μg/ml Gentamycin enthielt, gepflanzt. Die Zellen wurden vor der Infektion mit Virus 2 Tage bei 37 °C wachsen gelassen. Das Medium wurde aus den Rollerflaschen dekantiert und das Virus mit einer Infektionsmultiplizität von 1:600 in 100 ml Virusvermehrungsmedium pro Flasche (MEM, das 2 % Rinderserum, 0,5 % LAH und 30 μg/ml Gentamycin enthielt) zugegeben. Sieben Tage nach der Infektion lag eine Zytopathologie von 100 % vor und die überstehenden Flüssigkeiten wurden geerntet. Das Virus wurde mit 25 Vol.-% SGGK3-Stabilisator stabilisiert und lyophilisiert. Am Tag der Vakzination wurde das lyophilisierte Virus mit 5 Vol.-% Adjuvans, das in Kochsalzlösungsverdünnungsmittel verdünnt worden war (siehe Beispiel 2), rekonstituiert. Das rekonstituierte BRSV-Virus wurde mit den PI3-, BVDV- und BHV-1-Viren kombiniert. Der Titer jedes Bestandteils des Vakzins wurde mittels Replikat-Titration am Tag der Vakzination bestimmt.
B) Verwendete Versuchstiere:
Insgesamt 30 Rinder wurden für diese Studie verwendet. Diese Rinder waren für BRSV empfänglich, wie von einem Titer von serumneutralisierenden Antikörpern (SN-Antikörpertiter) von < 2 am Tag der Vakzination für Versuchstiere und am Tag der Belastungsinfektion für Kontrollen angezeigt wurde. Die Tiere wurden im Freien mit Zugang zu einem Unterstand mit drei Wänden, der zur Südseite offen ist, gehalten. Die Kontrollen wurden vor der Belastungsinfektion von den zu vakzinierenden Tieren getrennt gehalten, um eine Aussetzung gegenüber dem Vakzinvirus zu verhindern. Einmal täglich wurde eine komplette Ration bereitgestellt, Heu und Wasser wurden ad libitum bereitgestellt.
C) Vakzination:
Ein Volumen von zwei ml des Kombinationsvakzins wurde jedem zu vakzinierenden Tier einmal verabreicht. Zwanzig (20) Tiere wurden vakziniert (zehn über den subkutanen Weg und zehn über den intramuskulären Weg) und die restlichen zehn Tiere wurden nicht vakziniert und dienten als Belastungsinfektionskontrollen.
D) Experimentelle Belastungsinfektion:
Die Tiere wurden vierzehn Tage nach der Vakzination einer Belastungsinfektion mit virulentem BRSV-Virus unterzogen. Mindestens 10^5,7 TCID₅₀ des virulenten BRSV-Virus wurden jedem Kalb an drei aufeinander folgenden Tagen mittels Aerosolbelastungsinfektion verabreicht.
E) Klinische Beobachtungen:
Die Rinder wurden täglich von Tag –2 bis 14 Tage nach der Belastungsinfektion auf klinische Anzeichen einer Erkrankung und von Fieber (Rektaltemperatur) beobachtet. Die Rinder wurden auf Anzeichen einer BRSV-Infektion beobachtet, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Nasen- und Augenausfluss, Bindehautentzündung, Husten, Kurzatmigkeit, Appetitlosigkeit und Depression. Die Rektaltemperatur wurde über den gesamten Beobachtungszeitraum täglich aufgezeichnet.
F) Assays:
1. Assay auf serumneutralisierende Antikörper (SN)
Reihenverdünnungen von hitzeinaktiviertem Serum wurden mit gleichen Volumina von Virussuspensionen in einem Neutralisationstest mit variierendem Serum/konstantem Virus unter Verwendung von 100 bis 500 TCID₅₀ BRSV gemischt. Die Serum/Virus-Mischung wurde 1 Stunde bei 37 °C inkubiert, dann auf VERO-Zellen in 96-Well-Mikrotiterplatten inokuliert. Das Vorliegen von SN-Antikörpertitern wurde von dem Fehlen des Virus angezeigt, wie über den zytopathischen Effekt nachgewiesen wurde. Zur Bestimmung der SN-Antikörpertiter wurden 50 % Neutralisationsendpunkte gemäß dem Verfahren von Reed und Muench berechnet.
2. Titration des Virus in Endverdünnung des Vakzins
Der BRSV-Virustiter in dem Vakzin wurde mittels Replikat-Titration am Tag der Vakzination bestimmt. Kurz gesagt, das Kombinationsvakzin wurde mit adäquaten neutralisierenden Antisera kombiniert. Die Mischung aus Vakzin und Antisera wurde 45 bis 60 Minuten bei 37 °C inkubiert. Reihenverdünnungen des Vakzins und der Antisera wurden hergestellt und auf VERO-Zellen inokuliert. Das Vorliegen des Virus wurde vom Vorliegen des zytopathischen Effekts angezeigt und mittels spezifischer Immunfluoreszenz (FA) bestätigt. Der Virustiter wurde an jedem Replikat mittels des Verfahrens von Reed und Muench berechnet. Der mittlere Titer der BRSV-Fraktion des Vakzins war 10^3,4 TCID₅₀ pro Dosis.
3. Titration des Challenge-Virus
Die Verdünnung des verabreichten BRSV-Challenge-Virus (BRSV-Virus zur Belastungsinfektion) wurde reihenverdünnt und auf MDBK-Zellen in 96-Well-Mikrotiterplatten inokuliert. Das Vorliegen des Virus wurde vom Vorliegen des zytopathischen Effekts angezeigt und mittels spezifischer Immunfluoreszenz bestätigt, wie für die Virusisolation beschrieben.

Um die Ergebnisse zu deuten, wurden wie folgt klinische Scores vergeben:

Klinisches Anzeichen	Score/Beobachtung
Nasenausfluss
Stark, serös	2
Mild, mukopurulent	2
Mäßig, mukopurulent	3
Stark, mukopurulent	4
Augenausfluss
Stark, serös	1
Mild, mukopurulent	2
Mäßig, mukopurulent	3
Stark, mukopurulent	4
Bindehautentzündung	2
Husten	2
Kurzatmigkeit	2
Appetitlosigkeit	1
Hyperämie und Rötung der Nasenschleimhaut	1
Fieber (muss mindestens 1 °F über der Baseline liegen)
103,5 bis 103,9 °F	1
104,0 bis 104,9 °F	2
105,0 bis 105,9 °F	3
≥ 106,0°F	4

Milder seröser Nasen- oder Augenausfluss wurde als für im Freien gehaltene Rinder normal erachtet. Fieber wurde nur als signifikant betrachtet, wenn es mindestens ein Grad über der Baseline-Körpertemperatur lag. Die Baseline-Körpertemperatur wurde als die durchschnittliche Körpertemperatur für jedes Tier am Tag vor der Belastungsinfektion und am Tag der Belastungsinfektion bestimmt.
Die klinischen Gesamtscores für jedes Tier wurden summiert. Die klinischen Scores der vakzinierten Tiere und der Kontrollen wurden mittels Mann-Whitney-Rangsummenanalyse verglichen.
Klinische Anzeichen einer Erkrankung wurden in den Kontrollrindern von Tag 5 bis Tag 10 nach der Belastungsinfektion beobachtet (Tabelle 1). Bei allen Kontrollen (100 %) wurde an mehreren Tagen beobachtet, dass sie Anzeichen einer Atemwegserkrankung aufwiesen. Zu spezifischen Anzeichen einer Atemwegserkrankung zählten starker seröser Nasenausfluss (tatsächlich von den Nasenöffnungen tropfender Ausfluss), mukopurulenter Nasenausfluss, Augenausfluss und Husten. Der durchschnittliche klinische Score für Kontrollkälber war 3,7.
Im Vergleich dazu waren Respirationsanzeichen in vakzinierten Tieren weniger verbreitet. Nur 40 % der vakzinierten Tiere wiesen jegliche Anzeichen einer Atemwegserkrankung auf und nur zwei (10 %) wiesen an mehreren Tagen klinische Anzeichen auf. Der durchschnittliche klinische Score für die vakzinierte Gruppe war 1,0. In den vakzinierten Tieren lag im Vergleich zu den Kontrollen mittels Mann-Whitney-Rangsummenanalyse eine statisch signifikante Verringerung der klinischen Erkrankung vor (p < 0,05).
Diese Daten zeigen, dass eine Einzeldosisverabreichung von mit Adjuvans versetztem modifiziertem lebendigem BRSV-Virus-Vakzin gemäß der Erfindung einen Schutz vor einer Belastungsinfektion mit virulentem BRSV bietet. Dieses Vakzin und dieses Verfahren sind wirksam, selbst wenn andere Vakzine zusammen mit dem BRSV-Vakzin verabreicht werden.
Folglich betrifft die Erfindung eine Vakzinzusammensetzung zum Immunisieren eines Tiers gegen eine Infektion durch bovines Respiratory-Syncytial-Virus (BRSV). Das Vakzin umfasst einen modifizierten lebendigen BRS-Virus, ein Adjuvans und einen pharmazeutisch unbedenklichen Trägerstoff, so dass die Kombination nach einer einzigen Verabreichung eine Immunität vor BRSV-Infektion bereitstellt und eine Immunantwort auslöst, die für BRSV spezifisch ist und aus zellulärer und lokaler (sekretorischer IgA-) Immunität ausgewählt ist.
Eine zelluläre Immunität beinhaltet die Stimulation von T-Helferzellen, T-Killerzellen und T-DH-Zellen (DH = delayed hypersensitivity, T-zellvermittelte Überempfindlichkeit) sowie die Stimulation der Produktion von Makrophagen, Monozyten und anderen Lymphokinen sowie Interferon. Das Vorliegen von zellulärer Immunität kann mittels herkömmlicher In-vitro- und In-vivo-Assays bestimmt werden. Lokale Immunität, wie sekretorisches IgA, kann mittels herkömmlicher ELISA- oder IFA-Assays bestimmt werden, die einen Titer von serumneutralisierenden Antikörpern von 1-2 oder höher zeigen. Erfindungsgemäß ist die zelluläre oder lokale Immunität als Folge für BRSV spezifisch oder wird mit BRSV in Zusammenhang gebracht.

Claims

Verwendung eines modifizierten lebendigen bovinen Respiratory-Syncytial-Virus und eines oder mehrerer Adjuvantien in Kombination mit einem oder mehreren pharmazeutisch unbedenklichen Stabilisator-Trägerstoffen und -Adjuvantien, wobei die Adjuvantien aus Adjuvantien ausgewählt sind, die eine vielfältige Immunantwort auf das modifizierte BRSV liefern, wobei die Adjuvantien aus denen ausgewählt sind, die eine zelluläre Immunität und eine lokale (sekretorische IgA-) Immunität bereitstellen und die weiterhin ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Squalan und Squalen (oder andere Öle tierischen Ursprungs); Polyoxypropylen/Polyoxyethylen-Blockcopolymeren, vorzugsweise Pluronic^® (L121); Saponin; nichtionischen Detergentien oder Tensiden, vorzugsweise ein Polyoxyethylen(20)sorbitanmonooleat, Tween^®-80; Quil^® A, Mineralölen, vorzugsweise Drakeol^® oder Marcol^®, Pflanzenölen; von Corynebacterium abgeleiteten Adjuvantien, vorzugsweise Corynebacterium parvum; von Propionibacterium abgeleiteten Adjuvantien, vorzugsweise Propionibacterium acne; Mycobacterium bovis (Bacillus Calmette-Guérin oder BCG); Interleukinen, die aus Interleukin-2 und Interleukin-12 ausgewählt sind; Monokinen, vorzugsweise Interleukin-1; Tumornekrosefaktor; Interferonen, vorzugsweise gamma-Interferon; Saponin/Aluminiumhydroxid- oder Quil^® A/Aluminiumhydroxid-Kombinationen; Liposomen; ISCOM-Adjuvans; Mycobacterium-Zellwandextrakt; synthetischen Glykopeptiden, vorzugsweise Muramyldipeptide oder andere Derivate; Avridin; Lipid A; Dextransulfat; DEAE-Dextran oder DEAE-Dextran mit Aluminiumphosphat; Carboxypolymethylen, vorzugsweise Carbopol^®; EMA; Acrylcopolymeremulsionen, vorzugsweise Neocryl^® A640; Proteine von Vaccinia oder Pockenvirus eines Tiers; Adjuvantien aus subviralen Partikeln, vorzugsweise Orbivirus; Choleratoxin; Dimethyldiocledecylammoniumbromid und Mischungen davon, bei der Herstellung eines Einfachdosis-Vakzins gegen bovines Respiratory-Syncytial-Virus, so dass das Vakzin nach einer einzigen Verabreichung eine schützende Immunität vor BRSV-Infektion auslöst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Adjuvans darüber hinaus ein Tensid umfasst.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei das Adjuvans außerdem ein Tensid umfasst, das in einer Endkonzentration von etwa 0,0015 bis 0,20 Vol.-% vorliegt.
Verwendung nach Anspruch 3 oder 4, wobei das Tensid ein Polyoxyethylensorbitanmonooleat ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Vakzin weiterhin bovines Rhinotracheitisvirus (BHV-IV), bovines virales Diarrhoevirus (BVDV) und Parainfluenza-3-Virus (PI-3 V) umfasst.