DE69531004T2 - p277 PEPTIDANALOGE, PHARMAZEUTISCHE ZUSAMMENSTELLUNG DAVON ZUR BEHANDLUNG UND DIAGNOSE VON DIABETES - Google Patents

Description

• GEBIET DER ERFINDUNG
• Die vorliegende Erfindung betrifft neue Peptide, die Varianten eines Epitops des menschlichen 60 kDa Hitzeschockproteins (hsp60) sind und pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese enthalten und Methoden für die Diagnose und Behandlung von insulinabhängiger Diabetes mellitus (IDDM), die solche Peptide verwenden.
• HINTERGRUND DER ERFINDUNG
• Typ I Diabetes oder IDDM ist eine Autoimmunerkrankung verursacht durch T-Zellen, die die Insulin produzierenden ß-Zellen, die in den Inseln des Pankreas lokalisiert sind, angreifen und zerstören (Castano und Eisenbarth, 1990). Der Autoimmunprozess, der in IDDM mündet, beginnt und schreitet ohne Symptome fort. Die Krankheit zeigt nur dann klinische Symptome, wenn der kumulative Verlust der β-Zellen die Kapazität der verbleibenden ß-Zellen Insulin bereit zu stellen übertrifft. In der Tat wird angenommen, dass der Zusammenbruch der Glukosehomeostase und klinische IDDM erst dann auftritt, wenn 80–90% der ß-Zellen durch das Immunsystem inaktiviert worden sind. Deshalb befinden sich Patienten, die als unter IDDM leidend identifiziert werden können bereits in einem fortgeschrittenen Stadium der Autoimmunzerstörung ihrer β-Zellen. Darüber hinaus kann die Diagnose einer beginnenden präklinischen Diabetes durch die Detektion immunologischer Marker der β-Zellen-Autoimmunität nur nach Beginn des Autoimmunprozesses erfolgen. Deshalb ist es die therapeutische Aufgabe, einen sicheren, spezifischen und effektiven Weg zu finden, den Autoimmunprozess abzustellen, der bereits begonnen hat.
• Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben diese Frage bereits an Studien an der spontanen Diabetes untersucht, die sich in Mäusen des NOD-Stammes, der als zuverlässiges Modell der humanen IDDM angesehen wird, entwickelt (Castano und Eisenbarth, 1990). NOD-Mäuse entwickeln im Alter von 4 Wochen eine Insulitis, die mit leichten peri-insulären Infil traten beginnt, die sich zu schweren intrainsulären Entzündungen entwickeln. Hyperglykämie, die eine Insulininsuffizienz darstellt, beginnt in den weiblichen Tieren unserer Zucht ungefähr um die 14–17 Lebenswoche. Ungefähr um die 35–40 Lebenswoche haben fast alle weiblichen NOD-Mäuse eine schwere Diabetes entwickelt und sterben meistens, wenn sie keine Insulinbehandlung erhalten. Männliche NOD-Mäuse haben eine niedrigere Inzidenz der Krankheit. Der Grund hierfür ist nicht klar. Es konnte gezeigt werden, dass die Diabetes der NOD-Mäuse durch autoimmune T-Zellen verursacht wird (Bendelac et al., 1987).
• In humanen IDDM Patienten als auch in NOD-Mäusen konnte eine T-Zell Reaktivität und Autoantikörper gegen verschiedene Antigene detektiert werden (Elias, 1994) und es ist nicht klar, ob die Immunität gegen eines der möglichen Zielantigene die primäre Ursache der Krankheit ist. Neben der Frage nach der Ursache besteht die Frage nach der Therapie.
• Es konnte gezeigt werden, dass der Beginn des Autoimmunprozesses in NOD-Mäusen verhindert werden kann, wenn die Mäuse vor Beginn der Diabetes verschiedenen Manipulationen unterworfen werden, z. B. einer strengen Diät, viralen Infektionen oder einer nicht spezifischen Stimulation des Immunsystems (Bowmann et al., 1994). NOD-Diabetes kann ebenso durch die Induktion einer immunologischen Toleranz in prä-diabetischen Mäusen gegen das Antigen Glutaminsäuredecarboxylase (GAD) verhindert werden (Kaufman et al., 1993; Tisch et al., 1993).
• Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben bereits gefunden, dass die Diabetes der NOD-Mäuse durch T-Zellen Vaccination verhindert werden kann, wenn man T-Zellen verwendet, die spezifisch für das p277 Peptid für die p277 Peptidsequenz des Human hsp60 Moleküls sind (Elias et al., 1991). Dieses Protein wurde früher als hsp65 bezeichnet, wird nun aber im Lichte einer genaueren Molekülgewichtsinformtion als hsp60 bezeichnet; beide Bezeichnungen betreffen dasselbe Protein.
• Das p277 Peptid, das ein Eptiop des Human hsp60 darstellt und in IDDM involviert ist und den Positionen 437–460 der Human hsp60 Sequenz entspricht, wurde zuerst beschrieben in der israelischen Patentanmeldung Nr. 94241 der vorliegenden Anmelder und in Elias und Cohen, 1994, und hat die folgende Sequenz:

  
• Es konnte gezeigt werden, dass die Verabreichung des p277 Peptid selbst zu Beginn der Insulitis die Entwicklung einer Diabetes verhindert, vermutlich durch Herunterregulieren der Anti-p277 Immunität, die essentiell für NOD Diabetes ist (Elias et al., 1991; israelische Patentanmeldung Nr. 94241). Neue Studien haben darauf hingewiesen, dass das p277 Peptid ebenso verwendet werden kann, die β-Zell Autoimmunität, die sich zu einem fortgeschrittenen Stadium entwickelt hat, umzukehren (Elias und Cohen, 1994).
• Das Labor der Erfinder hat neulich mitgeteilt, dass eine Form der Autoimmun-Diabetes durch Verabreichung einer sehr geringen Dosis des b-Zellen Toxin Streptozotocin (STZ) in der C57BL/KsJ Maus Stammlinie induziert werden kann (Elias et al., 1994). Während die geringe Standarddose von STZ von 40 mg/kg verabreicht täglich für 5 Tage normalerweise klinische Diabetes innerhalb von 3 Wochen induziert, induziert die Verabreichung von 30 mg/kg für 5 Tage klinische Diabetes erst nach einer Lagerperiode von ungefähr 3 Monaten. Dieses Modell einer induzierten Diabetes ist gekennzeichnet durch das in der Prodrome Periode auftrete von Autoantikörpern gegen Insulin, anti-idiotypischen Antikörpern gegen die Insulin Autoantikörper und Autoantikörper gegen hsp60. Die Mäuse können ebenso eine spontane T-Zellen Reaktivität gegen hsp60 und dessen p277 Peptid manifestieren (Elias et al., 1994). Deshalb scheint die geringere als die geringe Standarddosis von STZ einem Autoimmunprozess nicht unähnlich dem beobachteten in der spontanen Diabetes, die sich in NOD-Mäusen entwickelt, zu triggern (Elias et al., 1990).
• Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, solche Varianten des Peptids p277 bereit zu stellen, die nützlich für die Diagnose und Behandlung von IDDM sind.
• ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
• In einer Studie von Fragmenten und Varianten des Peptids p277 wurde unerwartet gefunden, dass die Peptide in welchen alleinig der Threoninrest durch einen Lysinrest ersetzt wurde und/oder ein oder beide Cysteinreste durch Valinreste ersetzt wurden, ebenso aktiv für die Behandlung von Diabetes wie p277 waren. Diese Ergebnisse waren umso mehr erstaunlich, als die Substitution der Cysteinreste durch Serinreste zu inaktiven Peptiden führte.
• Die vorliegende Erfindung betrifft Peptide, die die Sequenz I umfassen:

  

  
  wobei X₁ und X₂ jeweils ein Cys oder Val Rest und X₃ ein Cys Rest sind, jedoch X₁ und X₂ nicht beide Cys Rest sein kann, wenn X₃ ein Thr Rest ist.
• In einer besonderen Ausführung der Erfindung besteht das Peptid aus der Sequenz I, wobei beide X₁ und X₂ Cys und X₃ Thr oder Lys sind nachfolgend als p277(Lys¹⁹) bezeichnet (SEQ ID NR: 3) oder X₁ Val ist, X₂ Cys ist und X₃ Thr oder Lys ist, nachfolgend als p277(Val⁶) bezeichnet (SEQ ID NR: 4) und p277(Val⁶-Lys¹⁹) (SEQ ID NR: 5) respektive; oder X₁ ist Cys, X₂ ist Val und X₃ ist Thr oder Lys, nachfolgend als p277(Val¹¹) (SEQ ID NR: 6) und p277(Val¹¹-Lys²⁹) (SEQ ID NR: 7) respektive bezeichnet; oder beide X₁ und X₂ sind Val und X₃ ist Thr oder Lys, nachfolgend als p277(Va1⁵-Val¹¹) (SEQ ID NR: 8) und p277(Val^6,11-Lys¹⁹) (SEQ ID NR: 9) respektive bezeichnet. Das p277(Va1⁶-Val¹¹) Peptid wird nachfolgend als p277(V) bezeichnet.
• Es ist ebenso Gegenstand der vorliegenden Erfindung Methoden und Kits für die frühe Diagnose der IDDM bereit zu stellen, die ein Peptid der Sequenz I der Erfindung benutzen. Im Verlauf der sich entwickelnden IDDM exprimieren Tiere hsp60 Moleküle oder Moleküle, die hiermit kreuzreaktiv sind, die ihren Weg in das Blut und den Urin der Tiere finden. Sie exprimieren ebenso Antikörper und T-Zellen, die spezifisch gegen solche Moleküle gerichtet sind. Deshalb dient das Vorhandensein von hsp60 (oder Molekülen, die hiermit kreuzreaktiv sind) oder Antikörper oder T-Zellen, die spezifisch hierzu sind im Blut und Urin als ein Assay für die Detektion des IDDM Prozesses, bevor die Zerstörung der (β-Zzellen vollständig und das Individuum zu lebenslanger Diabetes verurteilt ist.
• Das Vorhandensein oder der Beginn einer IDDM in einem Patienten kann diagnostiziert werden durch Testen des Bluts oder Urins des besagten Patienten auf das Vorhandensein von hsp60 Antikörpern oder T-Zellen, die immunologisch reaktiv mit humanem hsp60 sind, durch Benutzen eines Peptids der Sequenz I der Erfindung als Antigen. In der Tat kann jede der bereits als mit dem Peptid p277 durchführbar beschriebenen Verfahren, wie diejenigen beschrieben in der PCT internationalen Anmeldung, veröffentlicht unter der Nr. WO 90/10449, verwendet werden, die p277 durch ein Peptid der Sequenz I der vorliegenden Erfindung substituieren.
• Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Diagnose der Anwesenheit oder des Beginns von IDDM in einem Patienten zur Verfügung, bestehend aus dem Testen des besagten Patienten auf die Anwesenheit von Anti-hsp60 Antikörpern oder von einer T-Zelle, die mit hsp60 immunoreagiert, wobei ein Ergebnis, das die positive Anwesenheit von Anti-hsp60 Antikörpern, von einer T-Zelle, die mit hsp60 immunoreagiert oder einer T-Zelle oder von einer T-Zelle, die mit hsp60 immunoreagiert, anzeigt, eine hohe Wahrscheinlichkeit der Anwesenheit oder des Beginns von IDDM anzeigt.
• Mit der Methode zur Diagnose von IDDM kann der Patient auf die Anwesenheit von Anti-hsp60 Antikörpern getestet werden, wobei die besagte Methode einen Radioimmunoassay oder einen ELISA-Test umfasst.
• Der Patient kann auch auf die Anwesenheit einer T-Zelle, die mit hsp60 immonoreagiert, getestet werden. In einer besonders bevorzugten Ausführung umfasst die Testmethode einen T-Zellen Proliferationstest, der die folgenden Schritte umfasst:
• (i) Herstellen einer mononuklearen Zellfraktion, die T-Zellen von einer aus dem Patienten erhaltenen Blutprobe enthält;
• (ii) Hinzufügen eines Antigens ausgewählt von einem Peptid der Sequenz I der Erfindung zur genannten mononuklearen Zellfraktion;
• (iii) Inkubieren dieser Zellfraktion in Anwesenheit des Antigens über einen geeigneten Zeitraum unter geeigneten Kultivierungsbedingungen;
• (iv) Hinzufügen eines markierten Nukleotids der inkubierten Zellkultur von (iii) zu einer geeigneten Zeit vor Ende der Inkubationszeit, um den Einbau des markierten Nukleotids in die DNA der proliferierenden T-Zellen zu ermöglichen; und
• (v) Bestimmen der Menge von proliferierenden T-Zellen durch Analyse der Menge von markiertem Nukleotid, das in die T-Zellen eingebaut ist.
• In dem oben genannten Schritt (iv) ist das markierte Nukleotid vorzugsweise ³H-Thymidin. Die Bestimmung der Anzahl der proliferierenden T-Zellen wird durch Berechnung des Stimulationsindexes der T-Zellen durch Standardmethoden vorgenommen.
• In einer weiteren Ausführung dieses Aspekts der Erfindung umfasst die Testmethode einen T-Zellen Zytokin Antworttest, in welchem die Schritte (i) bis (iii) wie in dem oben beschriebenen T-Zellen Proliferationstest sind und in einem vierten Schritt (iv) die Anwesenheit von Zytokin, wie etwa IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF? oder TGFß, die durch die Antworten in Lymphocyten in das Medium sezerniert werden, durch Standardmethoden mit kommerziell erhältlichen Kits detektiert werden.
• In einer weiteren Ausführung stellt die Erfindung eine in vivo Methode zur Verfügung, wobei ein Antigen, ausgewählt aus dem Peptid der Sequenz I, subkutan in einen Patienten injiziert wird und das Erscheinen einer detektierbaren Hautreaktion (DTH) beobachtet wird.
• Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso Mittel zum Durchführen solcher Assays, als auch Kits zum Durchführen solcher Assays. Diese Kits können hergestellt werden zur Durchführung eines jeden der verschiedenen Assays, die zur Durchführung der vorliegenden Erfindung benötigt werden. Ein jedes Kit enthält all die Materialien, die zur Durchführung eines einzelnen oder einer bestimmten Anzahl von Assays notwendig sind. Zum Beispiel kann solch ein Kit zur Bestimmung der Anwesenheit von hsp60 Antikörpern an die Festphase immobilisierter Peptide der Sequenz I und einen Antikörper, der fähig ist, die zu detektierende nicht variable Region des Anti-hsp60 Antikörpers zu erkennen, wie markiertes Anti-Human Fab, enthalten. Das Kit kann ebenso Anweisung zur Benutzung des Kits und Behälter zur Aufbewahrung des Materials des Kits enthalten. Jeder konventionelle Marker kann verwendet werden, wie etwa ein Radioisotop, ein Enzym, ein Chromophor oder ein Fluorophor. Ein typisches Radioisotop ist Jod-125 oder Schwefel-35. Typische Enzyme für diesen Zweck beinhalten Meerrettichoxidase, β-Galactosidase und Alkaline Phosphatase.
• Ein Kit zur Diagnose der Anwesenheit von IDDM durch Testen der Anwesenheit des Anti-hsp60 Antikörpers beinhaltet:
• (i) ein Antigen ausgewählt aus dem Peptid der Sequenz I; und
• (ii) einen markierten Antikörper, der fähig ist, die nicht variable Region der nachzuweisenden Anti-hsp60 Antikörper zu erkennen.
• Ein Kit zur Diagnose der Anwesenheit von IDDM durch Testen auf Anwesenheit einer T-Zelle, die mit hsp60 reagiert, umfasst:
• (i) ein Antigen ausgewählt aus dem Peptid der Sequenz I;
• (ii) ein geeignetes Medium für die Kultur von Lymphocyten (T-Zellen); und
• (iii) entweder ein markiertes Nukleotid für den T-Zell Proliferationstest oder ein Zytokin, z. B., IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNFα oder TGFβ, einen Assaykit für den Zytokintest.
• Für den in vivo Test wird das Kit nur ein Peptid der Sequenz I in einer zur Injektion geeigneten Form beinhalten.
• Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Mittel zur Verhinderung oder Behandlung von IDDM. Impfungen mit dem Peptid der Sequenz I der vorliegenden Erfindung als Antigen kann eine spezifische Herunterregulierung der Autoimmunität gegen dieses Antigen vermitteln und erzeugt effektiv eine Resistenz gegen den Autoimmunprozess von IDDM. Dasselbe gilt mit Hinblick auf die Impfung mit T-Zellen, die spezifisch gegen solche Antigene sind, in abgeschwächter oder avirulenter Form oder nachdem diese behandelt worden sind, um ihre Antigenität zu verbessern oder mit Fragmenten oder aktiven Fraktionen davon. Wenn gezeigt werden kann, dass der Patient sich bereits in der prä-klinischen oder Anfangsphase von IDDM befindet, kann eine Injektion mit einem solchen Antigen oder T-Zellen (oder Fraktionen) eine Herunterregulierung der Antiautoimmunität gegen dieses Antigen hervorrufen und dadurch den Autoimmunprozess anhalten, bevor ein signifikanter, permanenter Schaden verursacht wird. Das Peptid kann auch als therapeutisches Agents eingesetzt werden, das den Autoimmunprozess zum Stillstand bringt, auch wenn dieser weit fortgeschritten ist, wie bereits durch die Erfinder der vorliegenden Erfindung gezeigt werden konnte im Hinblick auf die Behandlung von NOD-Mäusen mit dem Peptid p277 (Elias und Cohen, 1994).
• Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Präparat zur Prävention oder zur Behandlung insulinabhängiger Diabetes Mellitus (IDDM) zur Verfügung, das aus einem T-Zellprodukt aus der folgenden Gruppe besteht: (a) Humane T-Zellen, die eine Spezifität für die p277 Sequenz des Human hsp60 manifestiert haben, deren Zellen durch Inkubation in der Anwesenheit des Peptids der Sequenz I aktiviert worden sind; (b) die humanen T-Zellen von (a), die strahlungsbehandelt oder anders abgeschwächt worden sind; (c) die humane T-Zellen von (a), die einer Druckbehandlung mittels hydrostatischem Druck, Behandlung mit einem chemischen Vernetzungsmittel und/oder Behandlung mit einem Cytoskelett Vernetzungsmittel unterzogen worden sind; (d) T-Zellfragmente oder Oberflächenproteine, die abgeworfen worden sind von den T-Zellen von (a), (b) oder (c); oder (e) ein Peptid, das im wesentlichen aus der variablen Region des Rezeptors von (a) spezifisch für das besagte Protein besteht oder ein Salz, funktionelle Derivate, Vorläuferproteine oder aktive Fraktionen davon.
• In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung enthält die Zubereitung autologe humane T-Zellen, die von dem zu behandelnden IDDM Patienten erhalten werden und die T-Zellen, die durch den in vitro Kontakt mit dem Peptid der Sequenz I aktiviert wurden. Solche spezifischen und aktivierten T-Zellen werden demselben Patienten verabreicht, von dem diese ursprünglich erhalten worden sind.
• Die vorliegende Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Zubereitung für die Prävention oder Behandlungen von IDDM zur Verfügung, die einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und als aktives Prinzip eine effektive Menge der Sequenz I, ein Salz oder ein funktionelles Derivat davon enthält. Der pharmazeutisch akzeptable Träger ist vorzugsweise ein Öl, wie eine Emulsion eines Mineralöls bekannt als inkomplettes Freund's Adjuvant (IFA). Jedoch sind IFA wie auch komplettes Freund's Adjuvant (CFA; eine Zubereitung von Mineralöl, die verschiedene Mengen von abgetöteten Organismen von Mycobakterien enthält) nicht für die menschliche Behandlung erlaubt, weil das Mineralöl nicht metabolisiert und durch den Körper abgebaut werden kann.
• Es wurde nun von den Erfindern gefunden, dass bestimmte Fettemulsionen, die seit mehreren Jahren für die intravenöse Ernährung von menschlichen Patienten verwendet werden, ebenso als Vehikel für die Peptidtherapie, die die Peptide der vorliegenden Erfindung benutzt, verwendet werden können. Zwei Beispiele solcher Emulsionen sind die kommerziell erhältlichen Fettemulsionen bekannt als Intralipid und Lipofundin. „Intralipid" ist eine eingetragene Marke der Kabi Pharmacia, Schweden, für eine Fettemulsion zur intravenösen Ernährung, beschrieben im US Patent Nr. 3,169,094. „Lipofundin" ist eine eingetragene Marke der B. Braun Melsungen, Deutschland. Beide enthalten Sojaöl als Fett (100 oder 200 g in 1.000 ml destilliertem Wasser: 10% oder 20%, respektive). Eigelbphospholipide werden als Emulgatoren im Intralipid (12 g/l destilliertes Wasser) und Eigelblezithin in Lipofundin (12 g/l destilliertes Wasser) verwendet. Isotonizität resultiert in Intralipid und Lipofundin durch Hinzufügen von Glycerol (25 g/l).
• Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Prävention oder Behandlung von IDDM, welches die Verabreichung an einem zu behandelnden Patienten mit einer pharmazeutischen Zubereitung beinhaltet, umfassend ein Peptid der Sequenz I oder eine Zubereitung umfassend T-Zellen, welche eine Spezifität gegen das Peptid der Sequenz I der Erfindung entwickelt haben.
• KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
• 1 zeigt die Stabilität von p277 und p277(Val⁶-Val¹¹). Die geschlossenen Kreise zeigen die Ergebnisse von p277 und die offenen Kreise von p277(Val⁶-Val¹¹). Die großen Kreise repräsentieren die Ergebnisse nach einer Woche der Lagerung, die mittelgroßen Kreise nach 9 Wochen und die kleinsten Kreise nach 20 Wochen.
• 2 zeigt, dass NOD T-Zellen des diabetogenischen Klons C9 als Antwort auf die Peptide p277 (geschlossene Kreise) und p277(Val⁶-Val¹¹) (offene Kreise) proliferieren.
• 3 zeigt, dass NOD Milz T-Zellen in Anwesenheit des Peptids p277(Lys¹⁹) proliferieren. Die Milz von 5 weiblichen NOD-Mäusen wurde in jeder Altersgruppe getestet auf T-Zell Proliferation als Antwort auf die Peptide p277(Lys¹⁹) (geschlossene Kreise) p277 (offene Kreise) und das Kontroll-Peptid p278 (geschlossene Rechtecke).
• 4 zeigt, dass NOD T-Zellen des diabetogenischen Klons C9 als Antwort auf das Peptid (Lys¹⁹) proliferieren.
• 5 zeigt die Effektivität einer Vorbehandlung mit p277(V) in IFA in der Prävention von STZ-induzierter Diabetes im Vergleich zur Kontrollbehandlung oder der Behandlung mit GADp34.
• DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
• Wo immer in der Erfindung ein „Peptid der Sequenz I" erwähnt wird, werden ebenso Salze und funktionelle Derivate davon eingeschlossen, solang wie die biologische Aktivität des Peptids im Hinblick auf Diabetes erhalten bleibt.
• Die durch die Erfindung erwägten Salze des Peptids I sind physiologisch akzeptable organische und anorganische Salze.
• Funktionelle Derivate des Peptids I nachfolgend benutzt sind Derivate, die von funktionellen Gruppen hergestellt werden, die als Seitenketten der Reste oder der N- oder C-terminalen Gruppen auftreten, durch bekannte Mittel und sind in der Erfindung solange beinhaltet, als sie pharmazeutisch akzeptabel bleiben, d. h. dass sie nicht die Aktivität der Peptide insofern zerstören, als dass ihre Ähnlichkeit zu der bekannten Aktivität von p277 betroffen wird, nicht toxische Eigenschaften tragen in Zubereitungen, die sie enthalten und keinen gegenteiligen Effekt auf die antigenen Eigenschaften davon ausüben. Es ist nicht beabsichtigt, dass solche funktionellen Gruppen solche Veränderungen, die eine Aminosäure effektiv in eine andere umwandeln, umfassen.
• Als Gegenstand der oben genannten Qualifikationen können diese Derivate z. B. aliphatische Ester von Carboxylgruppen, Amiden von Carboxylgruppen produziert durch Reaktionen mit Ammoniak oder mit primären oder mit sekundären Aminen, N-Acylderivaten von freien Aminogruppen von Aminosäureresten entstanden durch Reaktionen mit Acylgruppen (z. B. Alkanoyl oder carbocyclische Aroylgruppen) oder O-Acylderivate von freien Hydroxylgruppen (z. B. denen von Seryl oder Threonylresten) gebildet durch Reaktionen mit Acylgruppen, beinhalten.
• Das Peptid der Sequenz I der Erfindung kann als Immunogen in pharmazeutischer Zubereitung verwendet werden, besonders in Vaccinen für die Reduzierung und Behandlung von IDDM, als auch als Antigen in diagnostischer Zubereitung für die Diagnose von IDDM. Diese pharmazeutischen und diagnostischen Zubereitungen, welche in bekannter Art und Weise hergestellt werden können, bilden ebenso einen Anteil der vorliegenden Erfindung.
• Zur therapeutischen Behandlung oder als prophylaktisches Vaccin wird das Peptid der vorliegenden Erfindung vorzugsweise mit einem biologisch aktiven Träger verabreicht, der einen TH1→TH2- Shift der Autoimmun-T-Zellen hervorruft. T-Zellen des CD4 Helfertyps werden in zwei Gruppen klassifiziert, entsprechend ihrer Zytokine, die sie sezernieren, wenn sie aktiviert sind (Mosmann und Coffman, 1989): TH1 Zellen sezernieren IL-2 und IFN-γ, während TH2 Zellen IL-4 und IL-10 sezernieren. Solche Trägerstoffe sind vorzugsweise Emulsionen, die 10–20% Triglyzeride von pflanzlichen und/oder tierischen Ursprungs, 1,2–2,4% Phospholipide von pflanzlichen und/oder tierischen Ursprungs, 2,25–4,5% Osmo-Regulatoren, 0–0,5% Antioxidant und steriles Wasser auf 100% beinhalten. Solche Träger sind meist bevorzugt Intralipid oder Lipofundin. Die Verwendung solcher Trägerstoffe ist beschrieben in der israelischen Patentanmeldung Nr. 122 755, die an demselben Tag angemeldet wurde, wie die israelische Anmeldung der vorliegenden Anmeldung, Nr. 116 499, mit demselben Anmelder wie die vorliegende Anmeldung.
• Die therapeutische Zubereitung kann in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung oral oder paranteral, wie z. B. subkutan, intramuskulär, intravenös, intranasal oder intrarektal verabreicht werden.
• Die nachfolgenden Beispiele verdeutlichen die Effektivität der therapeutischen Behandlung mit den Verbindungen und Zubereitungen der vorliegenden Erfindung in einem wissenschaftlich akzeptierten Tiermodell der humanen IDDM.
• BEISPIELE
• Material und Methoden
• (i) Mäuse. Durch Inzucht erzeugte weibliche Mäuse des NOD/Lt Stammes wurden durch das Animal Breeding Center des Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel, zur Verfügung gestellt. Diese Mäuse entwickeln spontan eine Autoimmundiabetes in einem Alter von 14 bis 17 Wochen, die IDDM in Menschen nachahmt.
• (ii) Peptide. Peptide wurden synthetisiert mit Standard Fmoc Chemie mit einem ABIMED Synthesizer (FRG) und gereinigt durch HPLC mit reverser Phasenchromatographie. Die Sequenzen wurden durch Aminosäurenanalyse bestätigt. Die folgenden Peptide wurden synthetisiert: Das p277 Peptid; das Kontrollpeptid p278 der Sequenz: Asn-Glu-Asp-Gln-Lys-Ile-Gly-Ile-Glu-Ile-Ile-Lys-Arg-Thr-Leu-Lys-Ile (SEQ ID NR: 10), entsprechend den Positionen 458–474 des Human hsp60 Moleküls; Fragmente von p277: Die Aminohälfte von p277 (p277.N), die Carboxyhälfte von p277 (p277.C), und p277C kombiniert mit p278 (p277.C-p278); das Peptid p277(Lys¹⁹); und das Peptid p277 mit verschiedenen Aminosäuresubstitutionen für die zwei Cysteinresiduen in der Sequenz wie folgt: p277 mit überbrückten –SH-Gruppen (p277 (überbrückte Cytein-Cystein)); p277 mit beiden Cysteinresiduen ersetzt durch Valin (p277(Val⁶-Val¹¹)) oder durch Serin (p277(Ser⁶-Ser¹¹)),
• (iii) Behandlung und weiteres Voregehen. Mäuse wurden behandelt mit Emulsionen von p277 oder der anderen Peptide oder mit bovinem Serumalbumin (BSA, gekauft bei Sigma, St. Louis, MO, USA) in Volumen von 0,1 ml subkutan in den Rücken injiziert. Die Antigene wurden verdünnt in PBS und emulgiert in einem gleichen Volumen Mineralöl (inkomplettes Freund's Adjuvant (IFA); Sigma) oder 10% Intralipid. Die Mäuse wurden um 10 Uhr morgens auf ihre Blutglukoselevel getestet in einem nicht-diät lebenden Zustand wie beschrieben (Elias et al., 1991) zum Zeitpunkt der Behandlung (7, 12, 15 oder 17 Wochen Alter) und in den Mäusen, die überlebten, im Alter von 40 Wochen. Signifikante Hyperglykämie wurde bei Glukosekonzentrationen von 11,1 mM/L oder höher angenommen, weil diese Konzentration der Blutglukose. Signifikante Hyperglykämie wurde bei einer Glukosekonzentration von 11,1 mM/L oder höher angenommen, weil diese Konzentration der Blutglukose drei Standardabweichungen höher war als die durchschnittliche Blutglukosekonzentration, die in 100 gesunden Mäusen gemessen wurde (nicht gezeigt). Histologische Untersuchungen der Inseln des Pankreas wurde an Sektionen durchgeführt, die mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt waren. Die Schnitte wurden unabhängig von zwei Personen ausgewertet, die die Identität der Gruppen nicht kannten. Der Chi Square Test wurde benutzt, um die statistischen Differenzen zwischen den verschiedenen Behandlungen zu sichern.
• (iv) T-Zellen Proliferations Assay. Zellen des Klons C9 und Milzzellen Suspensionen, erhalten von weiblichen NOD-Mäusen, wurden auf T-Zellen Proliferation, wie bereits beschrieben, untersucht (Elias et al., 1991). Kurz gesagt wurden 1 × 10⁵ Klonzellen/ml oder 1 × 10⁶ Splenocyten/ml in Vierfachansätzen für 72 Std. in 0,2 ml Kulturmedium in Microtiter Wells in der Anwesenheit oder Abwesenheit von verschiedenen Antigenen bei einer Konzentration von 5 μg/ml inkubiert. Die Proliferation wurde gemessen durch die Inkorporation von [³H]-Thymidin in die DNA während der letzten 12 Stunden der Inkubation. Die Ergebnisse wurden mit dem Stimulationsindex berechnet: das Verhältnis der durchschnittlichen Test cpm in der Anwesenheit von Antigen zu den durchschnittlichen Hintergrund cpm in der Abwesenheit von Antigen. Die Standardabweichung zwischen den Vierfach-Ansätzen waren immer < 10% der durchschnittlichen cpm. Der Hintergrund war < 1000 cpm in Splenocyten Experimenten und < 200 cpm mit C9 Zellen. Die Milz einer jeden Maus wurde getrennt getestet. Die Ergebnisse jeder Gruppe der Mäuse sind gezeigt als Durchschnitt ±SD.
• BEISPIEL 1
• Behandlung der NOD-Mäuse mit p277 oder Fragmenten davon
• Um zu testen, ob jeweils eine der zwei 12-Aminosäure-Hälften des p277 Peptids alleine oder in Kombination in NOD-Mäusen genauso effektiv sind wie p277, wurden NOD-Mäuse im Alter von 7 Wochen mit 50 μg von verschiedenen Peptiden in Öl subkutan geimpft. Der Status der Mäuse wurde im Alter von 40 Wochen bestimmt.
• Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Man kann sehen, dass das Kontroll hsp60 Peptid p278 kein Effekt auf die Entwicklung der Krankheit hat: Von 40 behandelten Mäusen waren alle diabetisch und 90% im Alter von 40 Wochen tot. Im Gegensatz dazu verhinderte das p277 Peptid den Tod vollständig und heilte 60% der behandelten Mäuse. Die Fragmente von p277 waren weniger effektiv: Die Aminohälfte von p277 (p277.N), die Carboxy-Hälfte von p277 (p277.C) und eine Mixtur beider (p277.N„ p277.C) arbeiteten ungefähr halb so gut wie das intakte p277. Das Peptid p277.C wurde an das Peptid p278 angehängt synthetisiert, um ein längeres Peptid zu produzieren; jedoch war p277.C-p218 nicht besser als p277.C alleine. Daraus kann geschlossen werden, dass der volle therapeutische Effekt das intakte p277 Peptid erfordert.
• Tabelle 1 Behandlung von NOD Mäusen mit p277 oder einem Fragment davon Status nach 40 Wochen Diabetes

  
• BEISPIEL 2
• Behandlung der NOD-Mäuse mit p277 Substitutionspeptiden
• Die folgenden Peptide wurden in NOD-Mäusen getestet: p277, p277(überbrückte Cys-Cys), p277(Val⁶-Val¹¹) und p277(Ser⁵-Ser¹¹).
• NOD-Weibchen wurden behandelt mit 100 μg Peptid in einer 0,2 cc Emulsion Mineralöl (IFA) subkutan verabreicht. Die Mäuse wurden in der 12.. Lebenswoche behandelt und Diabetes trat in der 30. Lebenswoche auf.
• Wie in Tabelle 2 gezeigt, war p277(Val⁶-Val¹¹) genau so effektiv wie p277 bei der Behandlung von Diabetes, das Auftreten von Diabetes in unbehandelten Mäusen betrug 80% während p277 und p277(Val⁶-Va1¹¹) in behandelten Mäusen eine Inzidenz von 22% und 23% respektive zeigt. Auf der anderen Seite hatte weder p277(überbrückte Cy-Cys) noch p277(Ser⁶-Ser¹¹) einen therapeutischen Effekt. Zwei zusätzliche Varianten des p277, in denen die Cysteinreste an den Positionen 6 und 11 durch Alanin oder γ-Buttersäwereste ersetzt waren, waren auch nicht effektiv, wenn sie in vitro beide in Klon C9 Zellen und an NOD Milz T-Zellen getestet wurden. Weil diese beiden Peptide nicht durch Anti-p277 spezifische T-Zellen erkannt wurden (nicht gezeigt), wurden diese in vivo nicht weiter auf einen therapeutischen Effekt untersucht.
• Tabelle 2 Behandlung der NOD Mäuse mit p277 Substituenten

  
• BEISPIEL 3
• Stabilität von p277(Val⁶-Val¹¹)
• Da der Grund für das Ersetzen der Cysteine die problematische Stabiliät des p277 Peptids war, wurde die Stabilität von p277(Val⁶-Val¹¹) zu verschiedenen Zeitpunkten nach Synthese getestet. Das p277 Peptid ist instabil und zerfällt auch unter strengen Bedingungen (lyophilisiertes Puder in Vakuum, –20°C).
• Um die Stabilität von p277 mit seinem p277(Val⁶-Val¹¹) Analogon zu vergleichen, wurden beide Peptide zum selben Zeitpunkt synthetisiert und als trockenes Puder bei –20°C gelagert. Nach 1, 9 und 20 Wochen nach dem Datum der Synthese, wurde ein Aliquot gebogen, gelöst und getestet. Die Anzeige für die Stabilität der Peptide war deren Vermögen, T-Zellen des Klons C9 zu stimulieren. 1 zeigt die Ergebnisse des Experiments. Man kann sehen, dass während das native p277 fast seinen Effekt innerhalb von 9 Wochen und gänzlich nach 20 Wochen nach Synthese verloren hat, ist p277(Val⁶-Val¹¹) nach 20 Wochen der Lagerung unverändert.
• Da angenommen wird, dass die Instabilität von p277 durch die Cysteinresiduen verursacht wird, wird erwartet, dass jedes Analogon der vorliegenden Erfindung, welches die biologische Aktivität von p277 behält, ebenso eine gegenüber p277 gesteigerte Stabilität besitzt, ähnlich wie die für in diesem Beispiel gezeigte für p277(Val⁶-Val¹¹).
• BEISPIEL 4
• Behandlung von NOD weiblichen Mäusen mit p277 oder 277(Val⁶-Val¹¹) kehrt Insulitis um
• NOD weibliche Mäuse wurden subkutan im Alter von 12 Wochen mit 100 μg/Maus unmodifiziertem p277 oder p277(Val⁶-Val¹¹) in 0,1 cc Emulsion Mineralöl (inkomplettes Freunds'Adjuvant) behandelt. Kontrollmäuse erhielten eine Emulsion von PBS und Mineralöl. Im Alter von 6 Monaten wurden 5 Mäuse jeder Gruppe getötet, ihr Pankreas entfernt und in Bouin fixiert und Schnitte mit Hämatoxylin: Eosin gefärbt. Die Insulitis wurde in Blindversuchen ausgewertet. Da die Kontrollmäuse schwere Diabetes entwickelten, wurden sie im Alter von 5 Monaten getötet. Zu diesem Zeitpunkt hatten die Kontrollmäuse Blutglukoselevel im Rahmen von 29–48 mmol/L. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
• Tabelle 3 Behandlung von weiblichen NOD Mäusen mit p277 oder p277(Val⁶-Val¹¹) kehren Insulitis um

  
• Im Alter von 12 Wochen zu Zeit der Behandlung zeigten ungefähr 60% der Inseln in den unbehandelten Mäusen intra-insuläre Insulitis ungefähr 20% der Inseln hatten peri-insuläre Insulitis und ungefähr 20% der Inseln zeigten keine Insulitis. Intra-insuläre Infiltration wird als eine schwere Form der Insulitis in Verbindung mit dem Fehlen der ß-Zellfunktion angesehen. Wie in Tabelle 3 gezeigt, entwickelte sich ein beachtlicher Unterschied im Auftreten der Inseln in den zwei behandelnden Gruppen verglichen mit der Kontrollgruppe mit Öl alleine. Die Mäuse, die mit Öl behandelt wurden (Kontrolle) zeigten einen progressiven Abfall im Verhältnis der nicht betroffenen Inseln und nur 10% normale Inseln konnten im Alter von 22 Wochen gesehen werden, zu einer Zeit, zu der alle Mäuse offensichtlich diabetisch waren. Ungefähr 67% der Inseln zeigten intra-insuläre Insulitis bei 22 Wochen und die verbleibenden 23% der Inseln zeigten peri-insuläre Insulitis. Im Gegensatz zeigten Mäuse, die mit p277 oder mit p277(Val⁶-Val¹¹) behandelt wurden, einen Anstieg in der Anzahl der normalen Inseln (zwischen 25% und 52%) und einen Abfall in der Anzahl der Inseln mit intra-insulärer Insulitis (zwischen 6% und 17%). Die Inseln mit peri-insulärer Insulitis stiegen auf ungefähr 31% bis 69%. Daher waren die Behandlungen mit p277 und p277(Val⁶-Val¹¹) verbunden mit einem verbesserten histologischen Bild konsistent mit der Umkehr der Schwere der Insulitis, die nach Behandlung über 3 Monate fortbestand.
• Zusätzliche Ergebnisse zur Benutzung von p277(V) in weiblichen NOD-Mäusen.
• Fünfzehn zusätzliche Experimente wurden durchgeführt in Gruppen von 10 NOD weiblichen Mäusen, wobei jede mit p277(V) in Öl oder mit Öl alleine im Alter von 12 bis 15 Wochen behandelt wurde. Von insgesamt 150 Mäusen, die mit Öl allein behandelt wurden, entwickelten 90% Diabetes und 85% starben im alter von 32 Wochen. Im Gegensatz zeigten die mit p277(V) behandelten Mäuse eine Inzidenz von Diabetes von ungefähr 50% (p < 0,01) und nur 20% starben an schwerer Krankheit (p < 0,01%) Daher war Spätbehandlung mit p277(V) effektiv, um die Entwicklung einer lethalen Diabetes zum Stillstand zu bringen.
• BEISPIEL 5
• Peptidtherapie der Typ I Diabetes mit p277(Val⁶-Val¹¹) in Lipidemulsionen
• Die Autoimmunzerstörung der Insulin produzierenden β-Zellen im Pankreas ist durch T-Lymphocyten vermittelt. Ein entzündliches Infiltrat entwickelt sich um die pankreatischen Inseln im alter von 5 bis 8 Wochen und β-Zellen Zerstörung führt zur Insulindefizienz und offene Diabetes manifestiert sich im Alter von 14 bis 20 Wochen, die fast 100% der NOD-Mäuse im Alter von 35–40 Wochen betrifft.
• NOD weibliche Mäuse wurden subkutan mit 100 μg des Peptids 277(Val⁶-Val¹¹) in 0,1 ml PBS oder 10% Lipidemulsion bestehend aus 10% Sojabohnenöl, 1,2% Eiphospholipide und 2,25% Glyzerol (Intralipid, Kabi Pharmacia AB, Schweden) behandelt.
• Die Inzidenz von Diabetes im Alter von 6 Monten und die Produktion von Anti-p277(Val⁶-Val¹¹) Antikörpern war wie folgt. Diabetes wurde als persistierende Hyperglykämie diagnostiziert, Blutglukoselevel über 11,1 mmol/L wurden wenigstens zwei mal pro Woche mit einem Beckman Glukose Analyser II gemessen. Erfolgreiche Peptidbehandlung wurde durch Erreichen einer normalen Blutglukosekonzentration (geringer als 11,1 mmol/L) gemessen, zurückgehender intra-insulären Inflammatiion der pankreatischen Inseln (Insulitis) und Induktion von Antikörpern gegen das therapeutische Peptid wurden als Antikörper einer TH2-Typ Immunantwort angesehen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.
• Tabelle 4 Auftreten von Diabetes nach 6 Monaten

  
• Wie aus Tabelle 4 entnommen werden kann, war die Behandlung mit einem Peptid der vorliegenden Erfindung verabreicht in Intralipid effektiv im Reduzieren des Auftretens von Diabetes und Tod. Auf der anderen Seite war eine Behandlung verabreicht in PBS uneffektiv.
• BEISPIEL 6
• Die Peptide p277 und p277(Val⁶-Val¹¹) sind immunologisch kreuzreaktiv
• Zellen des T-Zellen Klons C9 isoliert aus prädiabetischen NOD Mäusen wurden inkubiert mit den Peptiden p277 (geschlossene Kreise), p277(Val⁶–Val¹¹) (offene Kreise), p277(Ser⁶-Ser¹¹) (geschlossene Quadrate) und p277(überbrückte Cys-Cys) (offene Rauten). Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt. Es wurde gefunden, dass der Klon C9 eine positive Proliferationsantwort nur au die Peptide p277 und p277(Val⁶-Val¹¹) entwickelt. Das beweist, dass p277 und p277(Val⁶-Val¹¹) kreuzreaktiv sind und dass die Peptide p277(Ser⁶-Ser¹¹) und p277(überbrückte Cys-Cys), die nicht therapeutisch effektiv sind, nicht immunologisch kreuzreaktiv sind
• BEISPIEL 7
• Frisch diagnostizierte IDDM Patienten zeigen T-Zell Proliferationsantworten auf p277 und p277(Val⁶-Val¹¹)
• Frisch diagnostizierte IDDM Patienten (2–4 Wochen) wurden in einem Proliferations Assay getestet. Periphere Blutlymphocyten wurden auf Ficol-Hypaque aus voll heparinisiertem Blut isoliert und auf Proliferation in vitro untersucht, gemessen als ³H-Thymidinincorporation, induziert durch die hsp60 Peptide p277, p277(Val⁶-Val¹¹) und das Kontrollpeptid p278. Die T-Zell Proliferationantwort ist als Stimulationsindex (SI) dargestellt: Das Verhältnis zwischen peptid-stimulierter Thymidin-Inkorporation und Hintergrund Thymidin-Inkorporation (kein Antigen zugefügt) durch die T-Zellen.
• Tabelle 5 Frisch diagnostizierte IDDM Patienten zeigen T-Zell proliferative Antworten auf p277 und p277(Val⁶-Val¹¹)

  
• Wie in Tabelle 5 gezeigt, antworten frisch diagnostizierte IDDM Patienten auf p277(Val⁶-Val¹¹) ebenso wie auf das p277 Peptid. Deshalb ist p277(Val⁶-Val¹¹) immunologisch äquivalent zu p277. Da der therapeutische Effekt von p277 durch immunologisches Erkennen vermittelt wird, weist der Umstand, dass p277(Val⁶-Val¹¹) immunologisch kreuz-reaktiv mit p277 ist, daraufhin, dass es anstelle von p277 bei der Behandlung von Diabetes behandelt werden kann.
• BEISPIEL 8
• T-Zellenantworten auf hsp60 und Peptid in IDDM und gesunden Individuen
• 21 IDDM Patienten und 14 gesunde Blutspender wurden untersucht auf hsp60 und p277(V) mit Hilfe des Proliferations Assays des Beispiels 7. Tabelle 6 und 7 zeigen die proliferative T-Zellenantwort (Stimulationsindex; SI) eines jeden Individuums auf das Kontrollantigen (Kontroll Ag), d. h., Tetanustoxin und Influenzavirus-Texasstamm auf gesamtrekombinantes hsp60 und auf p277(V). SI Werte von 3 oder größer wurden als positiv betrachtet.
• Tabelle 6 Proliferative T-Zell Antwort von IDDM Patienten

  
• Tabelle 7 Proliferative T-Zell Antwort von gesunden Blutspendern

  
• Tabelle 8 ist eine Zusammenfassung, die zeigt, dass 86% und 52% der Patienten auf hsp60 und p 277(V) verglichen mit 21% und 14% der Kontrollgruppen (p < 0,05) antworten. Daher war die IDDM Gruppe signifikant positiv für T-Zellen Antworten für hsp60 und p277(V). Dies führt zu der Schlussfolgerung, dass das Auftreten von hsp60 und p277(V) reaktiven Individuen unter IDDM Patienten höher ist als unter gesunden Menschen.
• Tabelle 8 Inzidenz positiver T-Zell Antwort in IDDM und gesunden Individuen

  
• Beispiel 9
• NOD T-Zellen Proliferation bei p277(Lys¹⁹)
• Das p277(Lys¹⁹) Peptid unterscheidet sich von p277 durch eine Aminosäure. Um zu bestätigen, dass p277(Lys¹⁹) ein Auto-Antigen in NOD IDDM ist, verglichen wir die T-Zell-Proliferation bei dem Peptid p277 mit dem p277(Lys¹⁹). 3 zeigt, dass T-Zellen von weiblicher NOD Milz bei p277(Lys¹⁹) im selben Ausmaß proliferiert wie bei p277. Keine Antwort gab es auf das Kontrollpeptid p278.
• Die oben stehenden Ergebnisse wurden bestätigt durch die Verwendung des Klons C9, einem diabetogenen NOD T-Zellen Klon, von dem gefunden wurde, dass er auf das humane Peptid 277 antwortet (Elias et al., 1991). Es wurde gefunden, dass C9 Zellen bei p277(Lys¹⁹) im selben Ausmaß proliferieren wie bei p277 (4).
• Beispiel 10
• Behandlung von weiblichen NOD Mäusen mit p277(Lys¹⁹)
• Die Erfinder haben kürzlich mitgeteilt, dass vorangeschrittene Insulitis in 3 Monate alten NOD Mäusen durch Behandlung der Mäuse mit einer einzelnen Injektion von humanem p277 gestoppt werden kann; die behandelten Mäuse entwickelten eine geringere Inzidenz von klinisch offener Diabetes und Tod durch schwere Hyperglykämie. Um zu testen, ob das Peptid p277(Lys¹⁹), das dasselbe Maus p277 Peptid darstellt, auch effektiv war, behandelten wir drei Monate alte weibliche NOD Mäuse mit 100 μg von entweder humanem p277 oder p277(Lys¹⁹) in IFA.
• Die Peptide p277 oder p277(Lys¹⁹) mit einer Konzentration von 2 mg/ml in phosphat- gepufferter Salzlösung (PBS) wurden mit einem gleichen Volumen von inkompletten Freund- Adjuvant (IFA) emulgiert. 0,1 ml (100 μg Peptid) der Emulsion, die jeweils das Peptid enthielt, wurden Gruppen von 10 weiblichen drei Monate alten NOD Mäusen subkutan injiziert. Kontrollmäusen wurde eine Emulsion aus PBS und IFA injiziert. Den Mäusen wurde alle vier Wochen eine Blutprobe entnommen und die Blutglukose-Level mit einem Beckmann Glukose Analyser II bestimmt. Das Auftreten von Hyperglykämie und Tod durch Diabetes wurde zum Zeitpunkt von 6 Lebensmonaten aufgezeichnet. Die Mäuse wurden als diabetisch angesehen, wenn ihre Blutglukose größer als 11 mmol/L war.
• Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt. Im Alter von 6 Monaten waren 90% der Kontrollmäuse offensichtlich hyperglykämisch und 60% waren an Diabetes gestorben. Im Gegensatz dazu verhinderte die Behandlung mit entweder p277 oder p277(Lys¹⁹) Diabetes (40% und 50% Auftreten, respektive) und Tod (10% und 20% Auftreten, respektive). Daher scheint das mauseigene Peptid p277(Lys¹⁹) ebenso effektiv zu sein wie das fremde p277 in der Therapie von fortgeschrittener Insulitis.
• Tabelle 9 Behandlung von Diabetes mit p277 oder p277 Lys¹⁹)

  
• Diese Ergebnisse zeigen, dass die proliferative Antwort von NOD T-Zellen detektiert mit human-hsp60 Molekül und seinem p277 Peptid das Äquivalent einer Autoimmunantwort auf Maus-hsp60 und Maus-p277(Lys¹⁹) Sequenz sind. Dies wurde gezeigt sowohl für den diabetogenischen C9 T-Zellen Klon als auch für die spontane Antwort, die sich in der Milz von prädiabetischen Mäusen entwickelt. Ferner war p277(Lys¹⁹) ebenso effektiv wie p277 in der Behandlung von Diabetes in NOD Mäusen. Milz T-Zellen von im Alter und im Geschlecht gleichen Mäusen anderer Stämme manifestierten keine spontane T-Zell-Proliferations-Antwort auf p277 (nicht gezeigt).
• Die Entdeckung einer Autoimmunität gegen Maus hsp60 Sequenz erfasst durch diabetogenische T-Zellen unterstützt die allgemeine Ansicht, dass IDDM durch einen Autoimmunprozess verursacht wird.
• Beispiel 11
• Behandlung der STZ-induzierten Diabetes mit p277(V)
• Streptozotocin (STZ) ist ein Beta-Zellen spezifisches Toxin, das toxische Diabetes verursachen kann durch Zerstören der Beta-Zellen innerhalb von 24–48 Stunden bei einmalig injizierter Gabe von 200 mg/kg. In kleinen subtoxischen Dosen verabreicht, induziert es in genetisch anfälligen Mäusen Insulitis, die zur Diabetes führt. Der inflammatorische Prozess kann 20–30 Tage dauern, abhängig von der Dosis STZ. Das Standardprotokoll für STZinduzierte Diabetes ist eine Dosis von 200 mg STZ pro kg Körpergewicht, verabreicht in 5 gleichen Dosen von je 40 mg/kg in aufeinanderfolgenden Tagen (Like und Rossini, 1976) und das Modell wird „geringe Dosis STZ" genannt. Wir fanden heraus, dass, wenn die gesamte Dosis auf 150 mg/kg (39 mg/kg × 5) reduziert wird, sich Diabetes innerhalb von 80 bis 100 Tagen entwickelt. Diese langsam fortschreitende Form STZ induzierten Diabetes spiegelt vermutlich besser die Autoimmun-Diabetes im Menschen wieder und ist von derselben Länge wie das präklinische Stadium der Spontan-Diabetes in NOD Mäusen (Castano und Eisenbarth, 1990). Ferner sind akute toxische Effekte vermindert, wenn die Dosis reduziert ist.
• Das 60 kDa Hitzeschock Protein (hsp60) spielt eine Rolle sowohl in NOD (Elias et al., 1990) als auch in STZ-induzierter Diabetes (Elias et al., 1994). Wir haben vormals gezeigt, dass sowohl Antikörper als auch T-Zellen Proliferations-Antworten auf hsp60 vor dem Auftreten offener Diabetes auftreten. T-Zellen Klone spezifisch gegen hsp60 wurden aus prädiabetischen NOD Mäusen erhalten und konnten Insulitis und Hyperglykämie auf junge NOD (Elias et al., 1991) oder τγιδ NOD Mäuse übertragen. Die NOD diabetogenischen T-Zellen Klone erkennen ein 24 Aminosäure langes Peptid der hsp60 Sequenz 437–460, das wir p277 nennen. STZ-induzierte Diabetes ist ebenso begleitet von anti-p277 T-Zell Antworten im präklinischen Stadium.
• Vorausgegangene Beispiele haben gezeigt, dass das p277(Val⁶-Val¹¹) Peptid NOD Mäuse beschützt. Dieses Experiment untersucht die Effizienz von p277(V) in dem geringen Dosis STZ Model.
• Männliche Mäuse, 10 pro Gruppe, wurden mit einer Dosis von STZ 30 mg/kg, täglich für 5 Tage behandelt. Eine Woche später wurden die Mäuse mit 100 μg von jeweils p277(V) in Öl, einem Peptid der Glutamat Decarboxylase (GADp34) beschrieben von Kaufman et al, 1993, das in die Diabetes von NOD Mäusen involviert sein soll oder Öl allein behandelt. Die Behandlung wurde am 85. Tag wiederholt. Am 100. Tag wurde den Mäusen Blutproben entnommen und ihr Blut auf Hyperglykämie untersucht. (Glukosekonzentration größer als 15 nmol/L). Die Ergebnisse sind in 5 zusammengefasst. Man kann sehen, dass der durchschnittliche Blutglukosewert der Gruppen von Mäusen behandelt mit GADp34 oder unbehandelt in dem hyperglykämischen Bereich liegen. Im Gegensatz dazu lag der durchschnittliche Blutglukosewert der Mäuse behandelt mit p277(V) in einem normalen Bereich. Daher kann p277(V) effektiv bei der Behandlung von Diabetes induziert C57BL/ksj Mäusen mit STZ als auch bei der spontanen Diabetes, die sich in den genetisch grundverschiedenen weiblichen NOD Mäusen entwickelt, sein. Die Anwendbarkeit einer p277(V) Therapie ist nicht beschränkt auf Diabetes eines einzigen Grundes oder eines einzigen Genotyps oder Geschlechts.
• Das Zitieren von bekannten methodischen Schritten, konventionellen methodischen Schritten, bekannten Methoden oder konventionellen Methoden ist in keiner Weise ein Eingeständnis, dass irgendein Aspekt, eine Beschreibung oder eine Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung im Stand der Technik offenbart, gelehrt oder vorgeschlagen ist.
• Die voranstehende Beschreibung der speziellen Ausgestaltung wird das Wesen der Erfindung so vollständig offenbaren, dass Andere durch Anwenden des Wissens des Stands der Technik (unter Einbeziehen des Inhalts der Zitate) solche speziellen Ausgestaltungen modifizieren und/oder für verschiedene Anwendungen adaptieren, ohne weitere unzumutbare Experimente und ohne sich von dem generellen Konzept der vorliegenden Erfindung zu lösen. Deshalb basieren solche Adaptionen und Modifikationen, die sich im Sinne und Rahmen von Äquivalenten der offenbarten Ausführung bewegen, auf der Lehre und der hier vorgestellten Anleitung. Es ist so zu verstehen, dass die hier verwendete Phraseologie oder Terminologie den Zweck der Beschreibung erfüllt und keine Begrenzung darstellt, so dass die Terminologie oder Phraseologie der vorliegenden Spezifikationen durch einen Fachmann im Lichte der Lehre und der hierin vorgestellten Anleitung in Kombination mit dem Stand der Technik zu interpretieren sind.
• Literatur
• Bendelac A, Carnaud C, Boitard C, Bach JF. (1987) Syngeneic transfer of autoimmune diabetes from diabetic NOD ice to healthy neonates. Requirement for both L3T4+ and Ly+-2+ T cells. J Exp Med, 166: 823–32.
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  Castano L, Eisenbarth GS. (1990) Type-I diabetes: a chronic autoimmune disease of human, mouse, and rat. Annu Rev Immunol, 8: 647–79.
  Elias, Dana. (1994) The NOD mouse: A model for autoimmune insulin-dependent diabetes. Autoimmune Disease Models. A Guidebook, pp 147–61.
  Elias D, Markovits D, Reshef T, van-Der Zee R and Cohen IR (1990) Induction and therapy of autoimmune diabetes in the non-obese diabetic (NOD/Lt) mouse by a 65-kDa heat shock protein. Proc Natl Acad Sci USA, 87: 1576–80.
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  Elias D, Reshef T, Birk OS, van der Zee R, Walker MD, Cohen IR. (1991) Vaccination against autoimmune mouse diabetes with a T-cell epitope of the human 65 kDa heat shock protein. Proc Natl Acad Sci USA, 88: 3088–91.
  Elias D. and Cohen IR. (1994) Peptide therapy for diabetes in NOD mice. The Lancet, 343: 704–06.
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  Like AA, Rossini AA (1976) Streptozotocin-induced pancreatic insulitis: new model of diabetes mellitus. Science, 193: 415–17.
  Mosmann T. R. and Coffman R. I. (1989) Ann Rev Immunol, 7: 145–73.
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• SEQUENZAUFLISTUNG
• (1) ALLGEMEINE INFORMATION:
• (i) ANMELDER
• (A) NAME: YEDA RESEARCH AND DEVELOPMENT CO. LTD.
• (B) STRAßE: P.O. Box 95
• (C) STADT: Rehovot
• (E) LAND: Israel
• (F) POSTLEITZAHL: 76100
• (A) NAME: Irun R. COHEN
• (B) STRAßE: 11 Hankin Street
• (C) STADT: Rehovot
• (E) LAND: Israel
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• (A) NAME: Dana ELIAS
• (B) STRAßE: 57 Derech Yavne
• (C) STADT: Rehovot
• (E) LAND: Israel
• (F) POSTLEITZAHL: 76344
• (A) NAME: Matityahu FRIDKIN
• (B) STRAßE: 23 Miller Street
• (C) STADT: Rehovot
• (E) LAND: Israel
• (F) POSTLEITZAHL: 76284
• (ii) TITEL DER ERFINDUNG: p277 PEPTIDANALOGE, PHARMAZEUTISCHE ZUSAMMESTELLUNG DAVON ZUR BEHANDLUNG UND DIAGNOSE VON DIABETES
• (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 10
• (iv) COMPUTERLESBARE FORM:
• (A) MEDIENTYP: Floppy disk
• (B) COMPUTER: IBM PC compatible
• (C) BETRIEBSSYSTEM:PC-DOS/MS-DOS
• (D) SOFTWARE: Patent In Release #1.0, Version #1.30 (EPO)
• (vi) DATEN FRÜHERER ANMELDUNGEN:
• (A) ANMELDENUMMER: IL 112094
• (B) ANMELDEDATUM: 21-DEC-1994
• (vi) DATEN FRÜHERER ANMELDUNGEN:
• (A) ANMELDENUMMER: IL 114460
• (B) ANMELDEDATUM: 05-JUL-1995
• (2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 1:
• (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
• (A) LÄNGE: 24 Aminosäuren
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• (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
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• (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
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• (xi) BESCHREIBUNG DER SEQUENZ: SEQ 1D NO: 10:
  

Claims (17)

1. Peptid der Sequenz I:

   

   wobei X₁ und X₂ jeweils ein Cys- oder Val-Rest und X₃ ein Thr- oder Lys-Rest sind, jedoch X₁ und X₂ nicht beide Cys-Reste sein können, wenn X₃ Thr ist, und Salze und funktionelle Derivate davon.
2. Peptid nach Anspruch 1 ausgewählt aus den Peptiden, die hierin bezeichnet sind als p277 (Val⁶), wobei X₁ Val, X₂ Cys und X₃ Thr ist; p277 (Val¹¹), wobei X₁ Cys, X₂ Val und X₃ Thr ist; p277 (Val⁶-Val¹¹), wobei sowohl X₁ als auch X₂ Val sind und X₃ Thr ist; p277 (Lys¹⁹), wobei sowohl X₁ als auch X₂ Cys sind und X₃ Lys ist; p277 (Val⁶-Val¹⁹), wobei X₁ Val, X₂ Cys und X₃ Lys ist; p277 (Val¹¹-Val¹⁹), wobei X₁ Cys, X₂ Val und X₃ Lys ist; p277 (Val^6,11-Val¹⁹), wobei sowohl X₁ als auch X₂ Val sind und X₃ Lys ist.
3. Verwendung eines Peptids nach Anspruch 1 oder 2 für die Herstellung einer Zusammensetzung zur Diagnose von insulinabhängigem Diabetes mellitus (im Folgenden IDDM genannt).
4. Verfahren zur Diagnose der Anwesenheit oder des Anfangsstadiums von IDDM in einem Patienten, umfassend das Testen von Blut oder Urin des Patienten mit einem Peptid nach Anspruch 1 oder 2 als Antigen auf die Anwesenheit von Antikörpern oder T-Zellen, die immunologisch mit menschlichem hsp60 reagieren, wobei ein Ergebnis, das die positive Anwesenheit von anti-hsp60-Antikörpern oder einer T-Zelle, die mit hsp60 immunreagiert, anzeigt, eine hohe Wahrscheinlichkeit der Anwesenheit oder eines Anfangsstadiums von IDDM anzeigt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Anwesenheit von anti-hsp60-Antikörpern durch einen Radioimmuntest oder durch einen ELISA-Test getestet wird.
6. Kit zur Diagnose der Anwesenheit von IDDM durch Testen der Anwesenheit von anti-hsp6O-Antikörpern nach dem Verfahren von Anspruch 4 oder 5, umfassend: (i) ein Antigen, das ein Peptid der Sequenz (1) in Anspruch 1 ist; und (ii) einen markierten Antikörper, der fähig ist, die nicht-variable Region der nachzuweisenden anti-hsp6O-Antikörper zu erkennen.
7. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Anwesenheit einer T-Zelle, die mit hsp60 immunreagiert, durch einen T-Zellen-Wachstumstest getestet wird, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (i) Herstellen einer mononucleären Zellfraktion, die T-Zellen von einer von dem Patienten erhaltenen Blutprobe enthält; (ii) Hinzufügen eines Antigens, das von einem Peptid nach Anspruch 1 ausgewählt ist, zu der mononucleären Zellfraktion; (iii) Inkubieren dieser Zellfraktion in Anwesenheit des Antigens über einen geeigneten Zeitraum unter geeigneten Kultivierungsbedingungen; (iv) Hinzufügen eines markierten Nucleotids zu der inkubierten Zellkultur von (iii) zu einer geeigneten Zeit vor Ende der Inkubationszeit, um den Einbau des markierten Nucleotids in die DNA der proliferierenden T-Zellen zu ermöglichen; und (v) Bestimmen der Menge von proliferierenden T-Zellen durch Analyse der Menge von markiertem Nucleotid, das in die T-Zellen eingebaut ist.
8. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Anwesenheit einer T-Zelle, die mit hsp60 immunreagiert, durch einen T-Zell-Cytokinantworttest bestimmt wird, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (i) Herstellen einer mononucleären Zellfraktion, die T-Zellen von einer von dem Patienten erhaltenen Blutprobe enthält; (ii) Hinzufügen eines Antigens, das von einem Peptid nach Anspruch 1 ausgewählt ist, zu der mononucleären Zellfraktion; (iii) Inkubieren dieser Zellfraktion in Anwesenheit des Antigens über einen geeigneten Zeitraum unter geeigneten Kultivierungsbedingungen; und (iv) Messen der Anwesenheit von durch die antwortenden Lymphocyten in das Medium abgegebenem Cytokin, wobei das Cytokin IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α oder TGFβ ist.
9. Kit zur Diagnose der Anwesenheit von IDDM durch Testen der Anwesenheit einer T-Zelle, die mit hsp60 immunreagiert, nach dem Verfahren von Anspruch 7, umfassend: (i) ein Antigen, das ein Peptid nach Anspruch 1 ist; (ii) ein markiertes Nucleotid; und (iii) ein geeignetes Medium zur Züchtung von Lymphocyten.
10. Kit zur Diagnose der Anwesenheit von IDDM durch Testen der Anwesenheit einer T-Zelle, die mit hsp60 immunreagiert, nach dem Verfahren von Anspruch 8, umfassend: (i) ein Antigen, das ein Peptid nach Anspruch 1 ist; (ii) ein geeignetes Medium zur Züchtung von Lymphocyten; und (iii) ein Testkit zur Messung der Anwesenheit des Cytokins, das durch die antwortenden Lymphocyten in das Medium sekretiert wird.
11. Zubereitung zur Vorbeugung oder Behandlung von IDDM, umfassend ein T-Zellprodukt, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) menschlichen T-Zellen, die Spezifität für die p277-Sequenz von menschlichem hsp60 zeigen, wobei die Zellen durch Inkubation in Anwesenheit eines Peptids der Sequenz I nach Anspruch 1 aktiviert wurden; (b) den menschlichen T-Zellen nach (a), die bestrahlt oder auf andere Weise abgeschwächt wurden; und (c) den menschlichen T-Zellen nach (a), die einer Druckbehandlung mittels hydrostatischen Druck, Behandlung mit einem chemischen Vernetzungsmittel und/oder Behandlung mit einem Cytoskelett-Vernetzungsmittel unterzogen wurden.
12. Zubereitung nach Anspruch 11, wobei die menschlichen T-Zellen nach (a) autologe T-Zellen sind, die vom zu behandelnden IDDM-Patienten erhalten werden, und die Spezifität der T-Zellen durch in-vitro-Kontakt mit dem Peptid der Sequenz 1 entwickelt wurde.
13. Zubereitung nach Anspruch 11 oder 12, wobei die T-Zellen in-vitro-Spezifität zu einem Peptid der Sequenz I nach Anspruch 1 entwickelt haben.
14. Arzneimittel, das ein Peptid der Sequenz I nach Anspruch 1 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
15. Arzneimittel nach Anspruch 14 zur Vorbeugung oder Behandlung von IDDM.
16. Arzneimittel nach Anspruch 14 oder 15, wobei das Peptid ein Peptid nach Anspruch 2 ist.
17. Verwendung eines Peptids nach Anspruch 1 oder 2 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Vorbeugung oder Behandlung von IDDM.