DE69516141T2

DE69516141T2 - Enzymhemmer

Info

Publication number: DE69516141T2
Application number: DE69516141T
Authority: DE
Inventors: Alice Clark; Ifeyinwa Davies; James Drysdale; Francis Dson; Witold Franzmann; Graham Knowles; Richard M J Palmer; Alan Sawyer; George Shearer; Steven Smith
Original assignee: Wellcome Foundation Ltd
Current assignee: Wellcome Foundation Ltd
Priority date: 1994-06-15
Filing date: 1995-06-14
Publication date: 2000-10-19
Anticipated expiration: 2015-06-15
Also published as: NO308655B1; NZ289157A; JP2000026402A; EP0765308A1; USRE39576E1; ES2145282T3; DK0765308T3; KR100430207B1; ZA954940B; HU9603454D0; BR9507995A; FI965019A0; JP2989010B2; PT765308E; ES2189322T3; CY2455B1; CN1155276A; HK1003935A1; IL114142A0; CA2192668A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Amidinosulfon-Derivate, Verfahren zu ihrer Herstellung, sie enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen und ihre Verwendung in der Therapie, insbesondere ihre Verwendung als selektive Hemmstoffe für die induzierbare Stickoxid-Synthase.
Es ist sei den frühen 1980iger Jahren bekannt, daß die durch Acetylcholin hervorgerufene Gefäßerschlaffung von der Gegenwart des Endothels abhängig ist, und diese Wirkung wurde einem labilen humoralen Faktor zugeschrieben, genannt Endothel-abgeleiteter relaxierender Faktor ("endothelium-derived relaxing factor", EDRF). Die Wirkung von Glyceryltrinitrat als Vasodilatator ist seit mehr als 100 Jahren bekannt, und es ist nun bekannt, daß NO die Wirkkomponente von Amylnitrit, Glyceryltrinitrit und anderen Nitrovasodilatatoren ist. Die kürzliche Identifizierung von EDRF als NO fiel mit der Entdeckung eines biochemischen Reaktionswegs zusammen, wonach NO aus der Aminosäure L-Arginin durch das Enzym NO-Synthase synthetisiert wird.
NO ist der endogene Stimulator für das lösliche Guanylatcyclat-Enzym und ist an einer Anzahl biologischer Wirkungen zusätzlich zur Endothelabhängigen Relaxation beteiligt, einschließlich der Zelltoxizität von phagozytischen Zellen und der Zell-Zell-Kommunikation im zentralen Nervensystem (siehe Moncada et al., Biochemical Pharmacology, 38, 1709-1715 (1989) und Moncada et al., Pharmacological Reviews, 43, 109-142 (1991)). Es wird nun angenommen, daß eine übermäßige NO-Produktion an einer Anzahl von Zuständen beteiligt sein kann, einschließlich von Zuständen, die systemische Hypotonie wie septischen Schock und Therapie mit bestimmten Cytokinen und viele Entzündungskrankheiten wie Arthritis einschließen.
Die Synthese von NO aus L-Arginin kann durch das L-Arginin-Analogon NG-Monomethyl-L-Arginin (L-NMMA) gehemmt werden, und die therapeutische Verwendung von L-NMMA für die Behandlung von septischem (toxischem) Schock und von anderen Typen systemischer Hypotonie wurde vorgeschlagen (WO 91/04024 und GB-A-2240041). Die therapeutische Verwendung bestimmter anderer NO-Synthasehemmer neben L-NMMA für den gleichen Zweck wurde ebenfalls in WO 91/04024 und in EP-A-0446699 vorgeschlagen.
Es wurde kürzlich offensichtlich, daß es wenigstens drei Isoenzyme von NO-Synthase wie folgt gibt (zusammengefaßt in Knowles und Moncada, Biochem. J. (1994) 298, 249-258)
(i) ein konstitutives, Ca&spplus;&spplus;/Calmodulin-abhängiges Enzym (eNOS), das in vaskulären Endothelzellen vorhanden ist und NO als Antwort auf Rezeptor- oder physikalische Stimulierung freisetzt.
(ii) ein konstitutives, Ca&spplus;&spplus;/Calmodulin-abhängiges Enzym (nNOS), das sich im Gehirn und einigen peripheren Nervensystemen befindet, welches NO als Antwort auf Rezeptor- oder physikalische Stimulierung freisetzt.
(iii) ein Ca&spplus;&spplus;-unabhängiges Enzym (iNOS), das nach Aktivierung der glatten Gefäßmuskulatur, von Makrophagen, Endothelzellen und einer Anzahl anderer Zellen durch Endotoxin und Cytokine induziert wird. Sobald sie exprimiert ist, synthetisiert diese induzierbare NO-Synthase NO für lange Zeiträume.
Das von eNOS und nNOS freigesetzte NO wirkt als Transduktionsmechanismus, der verschiedenen physiologischen Reaktionen zugrunde liegt. Das durch iNOS erzeugte NO wirkt als cytotoxisches Molekül für eindringende Mikroorganismen. Es scheint ebenfalls, daß die nachteiligen Wirkungen der überschüssigen NO-Produktion; insbesondere die pathologische Vasodilätätion, der vaskuläre Austritt und die Gewebeschädigung, zu weiten Teilen aus den Wirkungen von durch iNOS synthetisiertem NO resultiert.
Die bis jetzt zur therapeutischen Verwendung vorgeschlagenen NO- Synthasehemmer, wie L-NMMA und Nitroarginin, sind nicht-selektiv dahingehend, daß sie alle NO-Synthase-Isoenzyme hemmen. Die Verwendung eines nicht-selektiven NO-Synthasehemmers erfordert, daß große Sorgfalt verwendet wird, um die potentiell ernsthaften Konsequenzen einer Überinhibierung des eNOS zu vermeiden, einschließlich Hypertonie und möglicher Thrombosen und Gewebeschädigung. Insbesondere wurde für den Fall der therapeutischen Verwendung von L-NMMA für die Behandlung von septischem und/oder toxischem Schock empfohlen, daß der Patient einer kontinuierlichen Blutdrucküberwachung während der Behandlung unterliegen muß. Während nicht-selektive NO- Synthasehemmer eine therapeutische Nützlichkeit aufweisen, mit der Maßgabe, daß entsprechende Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, würden daher NO- Synthasehemmer, die selektiv in dem Sinne sind, daß sie iNOS in einem beträchtlich größerem Ausmaß als eNOS hemmen, von noch größerem therapeutischem Nutzen und viel leichter zu verwenden sein.
Die Patentanmeldung WO 93/13055 offenbart eine Gruppe von Amidino- Derivaten der Formel (0):
und Salze und pharmazeutisch akzeptable Ester und Amide davon, worin:
R¹ eine lineare oder verzweigtkettige C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl-Gruppe, eine C&sub2;&submin;&sub6;- Alkenyl-Gruppe, eine C&sub2;&submin;&sub6;-Alkinyl-Gruppe, eine C&sub3;&submin;&sub6;-Cycloalkyl-Gruppe oder eine C&sub1;&submin;&sub6;-Cycloalkyl-C&sub1;&submin;&sub6;-alkyl-Gruppe ist;
Q eine Alkylen-, Alkenylen- oder Alkinylen-Gruppe mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen ist, die gegebenenfalls mit einer oder mehreren C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl- Gruppen substituiert sein kann; oder Q eine Gruppe der Formel -(CH&sub2;)pX(CH&sub2;)q-, worin p 2 oder 3 ist, q 1 oder 2 ist und X S(O)x ist, worin x 0, 1 oder 2 ist, O oder NR² ist, worin R² H oder C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl ist; oder Q eine Gruppe der Formel -(CH&sub2;)rA(CH&sub2;)s- ist, worin r 0, 1 oder 2 ist, s 0, 1 oder 2 ist und A ein 3- bis 6-gliedriger carbocyclischer oder heterocyclischer Ring ist, der gegebenenfalls mit einem oder mehreren geeigneten Substituenten substituiert sein kann, wie C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl, C&sub1;&submin;&sub6;- Alkoxy, Hydroxy, Halogen, Nitro, Cyano, Trifluor-C&sub1;&submin;&sub6;-alkyl, Amino, C&sub1;&submin;&sub6;- Alkylamino oder Di-C&sub1;&submin;&sub6;-alkylamino, die eine Wirkung als Hemmstoffe des NO- Synthaseenzyms aufweisen.
Die Autoren der vorliegenden Erfindung haben eine besondere Gruppe von Verbindungen gefunden, die selektive Hemmstoffe für iNOS mit wenig oder keiner Wirkung auf eNOS sind. Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung Verbindungen der Formel (I):
bereit, worin
R¹ Methyl oder Fluormethyl ist, oder ein Salz, einen Ester, ein Amid oder einen physiologisch akzeptablen Prodrug ("Vorarzneistoff") davon.
Alternativ stellt die vorliegende Erfindung eine Verbindung bereit, ausgewählt aus 2-Amino-6-(1-iminoethylamino)-4,4-dioxo-4-thiahexansäure und 2-Amino-6-(1-imino-2-fluorethylamino)-4, 4-dioxo-4-thiahexansäure. Bevorzugt sind die Verbindungen in der R-Konfiguration.
Die Verbindungen der Formel (I) können eine Anzahl von asymmetrischen Zentren im Molekül einschließen, abhängig von der genauen Bedeutung der verschiedenen Gruppen, und Formel (I) soll alle möglichen Isomere einschließen. Die Verbindungen der Formel (I) schließen alle ein asymmetrisches Zentrum in der Gruppe
ein, und obwohl die natürliche L-Chiralität von Arginin bevorzugt ist, ist es wieder beabsichtigt, daß die Formel alle möglichen Isomere einschließen sollte, entweder individuell oder vermischt in beliebigen Verhältnissen.
Geeignete Salze schließen diejenigen ein, die mit sowohl organischen als auch anorganischen Säuren gebildet werden. Solche Säureadditionssalze werden normalerweise pharmazeutisch akzeptabel sein, obwohl nicht pharmazeutisch akzeptable Salze bei der Herstellung und Reinigung der betreffenden Verbindung nützlich sein können. Somit schließen bevorzugte Salze diejenigen ein, die aus Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Zitronensäure, Weinsäure, Phosphorsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Essigsäure, Trifluoressigsäure, Bernsteinsäure, Oxalsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Oxalessigsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Benzolsulfonsäure und Isethionsäure gebildet werden. Salze der Verbindungen der Formel (I) können hergestellt werden durch Umsetzen der entsprechenden Verbindung in Form der freien Base mit der entsprechenden Säure.
In pharmazeutisch akzeptablen Estern und Amiden der Verbindungen der Formel (I) kann die Säuregruppe durch -CO&sub2;R³, worin R³ z. B. C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl, Aryl oder Aryl-C&sub1;&submin;&sub3;-alkyl ist, oder -COR&sup4; ersetzt sein, worin R&sup4; der Rest einer geeigneten natürlichen oder synthetischen Aminosäure ist.
Mit dem Begriff "physiologisch akzeptabler Prodrug" sind Derivate von Verbindungen der Formel (I) gemeint, die die gleiche physiologische Funktion wie die freie Verbindung der Formel (I) haben, z. B. indem sie im Körper dazu konvertierbar sind. Solche Prodrugs können eine Wirksamkeit als solche aufweisen oder nicht.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ebenfalls Verbindungen der Formel (I) wie zuvor definiert und alle Salze, Ester, Amide und physiologisch akzeptablen Prodrugs davön zur Verwendung in der Medizin bereit, insbesondere bei der Behandlung von Zuständen, in denen die Hemmung der NO-Produktion aus L-Arginin durch die Wirkung der NO-Synthase von Vorteil ist, und noch spezieller von Zuständen, in denen die Hemmung der NO-Produktion durch die iNOS-Isoenzym-Überproduktion durch eNOS von Vorteil ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Verbindung der Formel (I) und aller Salze, Ester, Amide und physiologisch akzeptablen Prodrugs davon in der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung eines Zustandes bereit, in dem ein Vorteil in der Hemmung der NO-Produktion aus Arginin durch die Wirkung der NO- Synthase und noch spezieller durch die Wirkung von iNOS besteht.
In einem weiteren Aspekt wird die Verwendung einer Verbindung der Formel (I) oder eines Salzes, Esters, Amids oder physiologisch akzeptablen Prodrugs davon in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Schockzuständen bereitgestellt, die aus der Überproduktion von NO durch iNOS resultieren, wie septischer Schock, oder von Schock, der durch plötzliches Leberversagen oder durch Therapie mit Cytokinen, wie TNF, IL-1 und IL-2, oder Therapie mit Cytokin-induzierenden Mitteln, z. B. 5,6-Dimethylxanthenonessigsäure, verursacht wird.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt die Verwendung einer Verbindung der Formel (I) oder eines Salzes, Esters, Amids oder physiologisch akzeptablen Prodrugs davon in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines entzündlichen Zustandes, wie Arthritis, bereit.
Andere Zustände, in denen ein Vorteil in der selektiven Hemmung von iNOS besteht, schließen einen weiten Bereich von Autoimmun- und/oder entzündlichen Krankheiten ein, wie diejenigen der Gelenke (z. B. rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis), des Magen-Darm-Trakts (z. B. ulzeröse Kolitis und andere entzündliche Darmkrankheiten, Gastritis und Schleimhautentzündungen, die aus einer Infektion herrühren, wobei das Darmleiden von nicht-steroidalen entzündungshemmenden Arzneistoffen hervorgerufen wird), der Lunge (ausgewachsenes Respiratory-Distress-Syndrom, Asthma), des Herzen (Myokarditis), des Nervengewebes (z. B. multiple Sklerose), der Bauchspeicheldrüse (z. B. Diabetes melitus), der Niere (z. B. Glomerulonephritis), der Haut (z. B. Dermatitis, Psoriasis, Urtikarie), ebenso wie von transplantierten Organen (Abstoßung) und Mehrfach-Organkrankheiten (z. B. systemischer Lupus Erythematosis). Ferner gibt es Beweise für die Überproduktion von NO durch iNOS in der Atherosklerose. Deshalb stellt noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung die Verwendung einer Verbindung der Formel (I) oder eines Salzes, Esters, Amids oder physiologisch akzeptablen Prodrugs davon in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Behandlung der obigen Zustände bereit.
Die Hemmung von nNOS und/oder iNOS ist von Nutzen bei der Behandlung von Krankheiten des Nervensystems aufgrund Überproduktion von NO durch dieses Isoenzym, insbesondere bei der Behandlung von zerebraler Ischaxnie. Andere Krankheiten schließen ZNS-Trauma, Epilepsie, AIDS, Demenz, chronische neurodegenerative Erkrankung und chronischen Schmerz und Zustände ein, in denen nicht-adrenergische, nicht-cholinergische Nerven beteiligt sein können, wie Priapismus, Fettleibigkeit und Hyperphagie. Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung ebenfalls die Verwendung einer Verbindung der Formel (I) oder eines Salzes, Esters, Amids oder physiologisch akzeptablen Prodrugs davon in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Behandlung der obigen Zustände bereit.
Weiterhin kann die Hemmung der NO-Synthase von Vorteil bei der Verhinderung von mit einer HIV-Infektion verbundenem Lymphozytenverlust, bei der Erhöhung der Strahlenempfindlichkeit von Tumoren während einer Strahlentherapie und bei der Reduzierung von Tumorwachstum und Metastasen sein.
Die Hemmung von sowohl iNOS als auch nNOS kann von Nutzen bei der Behandlung bestimmter Zustände sein, in denen beide Isoenzyme eine Rolle spielen, z. B. von ZNS-Zuständen, wie zerebrale Ischämie.
Der hier verwendete Bezug auf "Behandlung" eines Patienten soll die Prophylaxe einschließen; der Begriff "Säugetier" soll einen Menschen oder ein Tier einschließen.
Die Wirkung von Verbindungen der Formel (I) und aller Salze, Ester, Amide und physiologisch akzeptablen Prodrugs davon als NO-Synthasehemmer kann unter Verwendung isolierter menschlicher oder Nagetier-Enzyme, des Aortenringes der Ratte oder in vivo in Mäusen gemäß nachfolgend beschriebener Methoden bestimmt werden.
Obwohl es möglich ist, die Verbindungen der Formel (I) und alle Salze, Ester, Amide und physiologisch akzeptablen Prodrugs davon als Rohchemikalie zu verabreichen, ist es bevorzugt, sie als pharmazeutische Formulierung anzubieten. Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Formulierung bereit, die eine Verbindung der Formel (I) und alle Salze, Ester, Amide und physiologisch akzeptablen Prodrugs davon zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Trägern dafür und gegebenenfalls einem oder mehreren anderen therapeutischen Bestandteilen umfaßt. Der (die) Träger muß (müssen) in dem Sinne "akzeptabel" sein, daß er (sie) mit den anderen Bestandteilen der Formulierung verträglich und nicht nachteilig für den Empfänger davon ist (sind).
Die Formulierungen schließen diejenigen ein, die zur oralen, parenteralen (einschließlich subkutanen, intradermalen, intramuskulären, intravenösen und intraartikulären), rektalen und topischen (einschließlich dermalen, bukkalen, sublingualen und intraokularen) Verabreichung geeignet sind, obwohl der am meisten geeignete Weg z. B. vom Zustand und dem Leiden des Empfängers abhängen kann. Die Formulierungen können zweckmäßig in Einheitsarzneiform angeboten werden und können durch jedes der auf dem Gebiet der Pharmazie wohlbekannten Verfahren hergestellt werden. Alle Verfahren schließen den Schritt des In-Verbindung-Bringens einer Verbindung der Formel (I) und aller Salze, Ester, Amide und physiologisch akzeptablen Prodrugs davon ("Wirkstoff") mit dem Träger ein, der aus einem oder mehreren Nebenbestandteilen besteht. Allgemein werden die Formulierungen durch gleichförmiges und inniges In-Verbindung-Bringen des Wirkstoff mit flüssigen Trägern oder feinverteilten festen Trägern oder beiden und, falls erforderlich, anschließendem Formen des Produkts zur gewünschten Formulierung hergestellt.
Formulierungen der vorliegenden Erfindung, die zur oralen Verabreichung geeignet sind, können als diskrete Einheiten, wie Kapseln, Kachets oder Tabletten, angeboten werden, die eine vorher festgelegte Menge des Wirkstoffs enthalten; als Pulver oder Granalien; als Lösung oder Suspension in einer wäßrigen oder nicht-wäßrigen Flüssigkeit; oder als flüssige Öl-in- Wasser-Emulsion oder flüssigeWasser-in-Öl-Emulsion. Der Wirkstoff kann ebenfalls als Bolus, Elektuarium oder Paste angeboten werden.
Eine Tablette kann hergestellt werden durch Verpressen oder Formen, gegebenenfalls mit einem oder mehreren Nebenbestandteilen. Verpreßte Tabletten können hergestellt werden durch Verpressen des Wirkstoffs in freifließender Form, wie ein Pulver oder Granalien, gegebenenfalls vermischt mit einem Bindemittel, Gleitmittel, inerten Verdünnungsmittel, Schmiermittel, oberflächenaktiven oder Dispergiermittel, in einer geeigneten Maschine. Geformte Tabletten können hergestellt werden durch Formen einer Mischung der pulverförmigen, mit einem inerten flüssigen Verdünnungsmittel angefeuchteten Verbindung in einer geeigneten Maschine. Die Tabletten können gegebenenfalls umhüllt oder gekerbt werden und können so formuliert werden, um eine langsame oder kontrollierte Freisetzung des Wirkstoffs darin bereitzustellen.
Formulierungen zur parenteralen Verabreichung schließen wäßrige und nicht-wäßrige sterile Injektionslösungen ein, die Oxidations-Inhibitoren, Puffermittel, Bakteriostatika und gelöste Stoffe enthalten können, die die Formulierung isotonisch zum Blut des beabsichtigten Empfängers machen; und wäßrige und nich-wäßrige sterile Suspensionen, die Supendiermittel und Verdickungsmittel einschließen können. Die Formulierungen können in Einheitsdösis- oder Mehrfachdosisbehältern angeboten werden, z. B. versiegelten Ampullen und Phiolen, und können in einem gefriergetrockneten (lyophilisierten) Zustand gelagert werden, der nur die Zugabe des sterilen flüssigen Trägers erfordert, z. B. Kochsalzlösung oder Wasser für Injektionen, direkt vor der Verwendung. Unvorbereitete Injektionslösungen und Suspensionen können aus sterilen Pulvern, Granalien und Tabletten der zuvor beschriebenen Art hergestellt werden.
Formulierung zur rektalen Verabreichung können als Suppositorium mit den gewöhnlichen Trägern, wie Kakaobutter oder Polyethylenglykol, angeboten werden.
Formulierungen zur topischen Verabreichung in den Mund, z. B. bukkal oder sublingual, schließen Lutschtabletten, die den Wirkstoff in einer geschmackskorrigierten Basis, wie Saccharose und Gummi arabicum oder Ttagacanth-Harz, umfassen, und Pastillen ein, die den Wirkstoff in einer Basis, wie Gelatine und Glycerin oder Saccharose und Gummi arabicum, umfassen.
Bevorzugte Einheitsarzneiformulieren sind diejenigen, die eine wirksame Dosis des Wirkstoffs wie nachfolgend angegeben oder einen entsprechenden Bruchteil davon enthalten.
Es ist selbstverständlich, daß die Formulierungen dieser Erfindung zusätzlich zu den oben besonders genannten Bestandteilen andere Mittel einschließen können, die hinsichtlich des Typs der betreffenden Formulierung auf diesem Gebiet herkömmlich sind, z. B. können diejenigen, die zur oralen Verabreichung geeignet sind, Geschmacksmittel einschließen.
Die Verbindungen der Erfindung können oral oder über eine Injektion in einer Dosis von 0,1 bis 1500 mg/kg pro Tag, bevorzugt 0,1 bis 500 mg/kg pro Tag verabreicht werden. Der Dosisbereich für erwachsene Menschen beträgt allgemein 5 mg bis 35 g/Tag und bevorzugt 5 mg bis 2 g/Tag. Tabletten oder andere Darreichungsformen, die in diskreten Einheiten angeboten werden, können zweckmäßig eine Menge der Verbindung der Erfindung enthalten, die in einer solchen Dosierung oder als Mehrfaches derselben wirksam ist, z. B. Einheiten, die 5 bis 500 mg, gewöhnlich ca. 10 bis 200 mg enthalten.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können in Kombination mit einem oder mehreren anderen Wirkstoffen verabreicht werden. Solche anderen Wirkstoffe, die zur gleichzeitigen Verabreichung geeignet sind, werden einem Arzt ersichtlich sein, aber könnten z. B. ein entzündungshemmendes Mittel sein, wie ein Kortikosteroid, z. B. Methylprednisolon. Verbindungen der Formel (I) sind kompetitive Hemmstoffe bezüglich L-Argiriin, und es muß natürlich nicht angemessen sein, Patienten gleichzeitig mit Zubereitungen (z. B. parenteraler Gesamternährung) zu behandeln, die einen hohen LArginin-Gehalt aufweisen.
Die Verbindungen der Formel (I) und alle Salze, Ester, Amide und physiologisch akzeptablen Prodrugs davon werden bevorzugt oral oder durch Injektion (intravenös oder subkutan) verabreicht. Die genaue, an einen Patienten verabreichte Verbindungsmenge wird in der Veranwortlichkeit des behandelnden Arztes liegen. Jedoch wird die eingesetzte Dosis von einer Anzahl von Faktoren abhängen, einschließlich des Alters und Geschlechts des Patienten, des präzisen, behandelten Leidens und seiner Schwere. Ebenso kann der Verabreichungsweg vom Zustand und seiner Schwere abhängen.
Verbindungen der Formel (I) sind neu, und entsprechend stellt ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung davon bereit.
Verbindungen der Formel (I) können hergestellt werden:
(a) durch Oxidation einer Verbindung der Formel (II):
Die Oxidation kann durch auf dem Gebiet bekannte Verfahren durchgeführt werden, z. B. durch Behandlung mit einer sauerstoffreichen Verbindung, wie 30%igem Wasserstoffperoxid und 0,5 M Ammoniummolybdat in Perchlorsäure.
Verbindungen der Formel (II) können durch Reaktion einer Aminosäure der Formel (III):
oder eines geschützten Derivats davon mit einer Verbindung der Formel (IV):
worin L eine Abgangsgruppe ist und R¹ wie zuvor definiert ist, gefolgt von Entfernung gegebenenfalls vorliegender Schutzgruppen unter Erhalt einer Verbindung der Formel (II) hergestellt werden.
Geeignete Abgangsgruppen L schließen -ORSund -SR&sup5; ein, worin R&sup5; eine Niederalkyl-Gruppe ist, z. B. C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl, bevorzugt Methyl oder Ethyl.
Die Verbindung der Formel (III) wird allgemein in einer Form verwendet, in der die Aminosäurefunktionalität durch geeignete Schutzgruppen geschützt ist, und in diesem Zusammenhang kann auf T.W. Greene und P.G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2. Auflage, John Wiley and Sons Inc., 1991, verwiesen werden. Die Schutzgruppen können dann in herkömmlicher Weise (loc. cit.) als Endstufe des Verfahrens unter Erhalt der Verbindung der Formel (II) entfernt werden. Z. B. kann die Aminosäurefunktionalität als Kupfersalz geschützt werden, wobei das Entschützen auf einer Ionenaustauschersäule stattfindet, die zur Entfernung anorganischer Ionen aus der Reaktionsmischung eingesetzt wird.
Die Verbindungen der Formel (IV) können in Form der freien Base oder als Säureadditionssalz, z. B. Hydrochlorid- oder Hydrojodidsalz, verwendet werden.
Die Reaktion wird allgemein in einem geeigneten Lösungsmittel in Gegenwart von Base, z. B. einem Alkalimetallhydroxid wie Natriumhydroxid, bevorzugt bei einem pH von ca. 9 bis 11 und allgemein bei einer Temperatur von 0ºC bis zur Rückflußtemperatur des Lösungsmittels, bevorzugt 0 bis 50ºC, durchgeführt. Das bevorzugte Lösungsmittel ist Wasser, obwohl die Reaktion ebenfalls in einem polaren Lösungsmittel durchgeführt werden kann, wie einem niederen Alkohol, z. B. Methanol oder Ethanol, oder einem Amid, z. B. Dimethylformamid, entweder allein oder im Gemisch mit Wasser, und dies kann unter bestimmtem Umständen vorteilhaft sein.
Die Verbindungen der Formel (III) sind im allgemeinen bekannte Verbindungen, die zu entsprechenden geschützten Derivaten in bekannter Weise konvertiert werden können. Die Imidate und Thioimidate der Formel (IV) (L ist -OR&sup5; bzw. -SR&sup5;) sind ebenfalls allgemein bekannte Verbindungen, und die Reaktion solcher Verbindungen mit einem primären Amin wird z. B. in "The Chemistry of Amidines and Imidates", Band 2, Hrsg. Saul Patai und Zvi Rappaport, John Wiley and Sons Inc., 1991, erörtert.
(b) Durch das Entschützen einer Verbindung der Formel (V):
worin R¹ wie zuvor definiert ist, Q Wasserstoff oder eine Carboxyl- Schutzgruppe ist und Q' eine Schutzgruppe ist, gegebenenfalls gefolgt von Konvertierung zu einer anderen Verbindung der Formel (I). Beispiele für geeignete Schutzgruppen schließen Tertbutoxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl, Alkyl, tert-Butyl, Benzyl etc. ein. Andere geeignete Gruppen, die verwendet werden können, werden dem Durchschnittsfachmann auf diesem Gebiet bekannt sein. Wenn die Schutzgruppe säurelabil ist, wie z. B. im Fall, daß Q Alkyl ist, kann die Reaktion durch saure Hydrolyse durchgeführt werden, z. B. durch Reaktion mit Chlorwasserstoff in Dioxan, HBr/Essigsäure in Eisessig oder Trifluoressigsäure in Dichlormethan, bei einer nicht-extremen Temperatur von -5 bis 100ºC, bevorzugt bei Raumtemperatur. Wenn die Schutzgruppe durch Hydrogenolyse abspaltbar ist, z. B. Benzyloxycarbonyl, kann das Entschützen unter Verwendung von Wasserstoff über einem Katalysator, z. B. Palladium/Aktivkohle, durchgeführt werden.
Verbindungen der Formel (V) können durch die Reaktion einer Verbindung der Formel (VI):
worin Q und Q' wie zuvor definiert sind, mit einer Verbindung der Formel (VII):
worin R¹ wie zuvor definiert ist, Y O oder S ist und R¹&sup6; C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl, Phenyl-C&sub1;&submin;&sub6;-alkyl oder Naphthyl-C&sub1;&submin;&sub6;-alkyl ist, z. B. Benzyl, hergestellt werden. Die Reaktion kann in geeigneter Weise in einem polaren Lösungsmittel, z. B. einem C&sub1;&submin;&sub6;-Alkohol, wie Methanol oder Ethanol, bei einer nicht-extremen Temperatur von -50 bis 150ºC, z. B. -5º bis 50ºC, wie Raumtemperatur, durchgeführt werden.
Bestimmte Verbindungen der Formel (VII), worin Y S ist, sind neu und können wie nachfolgend beschrieben hergestellt werden.
Verbindungen der Formel (VI) können durch Oxidation einer Verbindung der Formel (VIII):
worin Q und Q' wie zuvor definiert sind und Q" eine geeignete Schutzgruppe ist, z. B. Benzyloxycarbonyl, gefolgt von Entfernung der Schutzgruppe Q" hergestellt werden. Die Oxidationsreaktion kann durch auf diesem Gebiet bekannte Standardverfahren durchgeführt werden, z. B. gemäß dem in Tet. Lett. (1981) 22 (14), 1287 beschriebenen Verfahren oder durch Reaktion mit m-Chlorbenzoesäure, um das Sulfoxid-Produkt zu ergeben, gefolgt von Reaktion mit "Oxon", falls das Sulfon-Produkt erforderlich ist. Die Reaktion wird in geeigneter Weise in einem polaren Lösungsmittel durchgeführt, z. B. Wasser oder einem niederen Alkohol, wie Ethanol, oder einer Mischung daraus.
Die Entfernung der Schutzgruppe kann durch dem Fachmann bekannte Standardverfahren bewirkt werden, z. B. mit katalytischen Transferhydrierungsbedingungen wobei z. B. Ameisensäure in Alkohol wie Methanol verwendet wird, in Gegenwart eines geeigneten Katalysators, wie 10% Palladium auf Aktivkohle.
Verbindungen der Formel (VIII) können hergestellt werden durch Reaktion (i) einer Verbindung der Formel:
worin M&spplus; ein geeignetes Kation ist, z. B. Na&spplus;, mit einer Verbindung der Formel (X):
worin Q" wie zuvor definiert ist und R¹&sup7; eine C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl-Gruppe oder eine Aryl-Gruppe ist, gefolgt von Schützen der Carboxy- und Amino-Gruppen mit Schutzgruppen Q und Q' oder umgekehrt.
Verbindungen der Formel (IX) werden normalerweise nicht isoliert und können durch reduzierende Spaltung einer Verbindung der Formel (XI) hergestellt werden:
Die Spaltung kann durchgeführt werden durch auf diesem Gebiet bekannte Verfahren, z. B. durch Verwendung von Natrium in flüssigem Ammoniak bei einer Temperatur von -78 bis 0ºC und bevorzugt ca. -40ºC.
Verbindungen der Formel (IX) können ebenfalls durch Behandlung einer Verbindung der Formel (XII):
mit einer geeigneten anorganischen Base, z. B. Natriumhydrogencarbonat, gebildet werden. Die Reaktion wird in einem geeigneten Lösungsmittel durchgeführt, z. B. DMF.
(ii) Durch Reaktion einer Verbindung der Formel (XII) wie zuvor definiert mit einer geeigneten organischen Base, z. B. DBU. Die Reaktion wird in einem geeigneten Lösungsmittel, z. B. Toluol, bei einer nicht-extremen Temperatur von 0 bis 100ºC, bevorzugt Raumtemperatur, durchgeführt.
Verbindungen der Formel (X), (XI) und (XII) sind handelsüblich oder können durch dem Fachmann schon bekannte Verfahren hergestellt werden.
Zwischenstufen der Formel (VII') können hergestellt werden durch Reaktion einer Verbindung der Formel (XIII):
mit einem Reagens der Formel R¹&sup6;L', geeigneterweise PhCH&sub2;L', worin R¹&sup6; wie zuvor definiert ist und L' eine geeignete Abgangsgruppe ist, z. B. ein Halogenatom, wie Chlor.
Verbindungen der Formel (XIII) sind handelsüblich oder können durch dem Fachmann bekannte Verfahren hergestellt werden.
Die vorliegende Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele erläutert:

Zwischenstufe A

Herstellung von t-Butyl-6-amino-2-t-butoxycarbonylamino-4,4-dioxo-4- thiahexanoatformiatsalz

t-Butyl-6-benzyloxycarbonylamino-2-t-butoxycarbonylamino-4,4-dioxo-4- thiahexanoat (152 mg), aufgelöst in 5% Ameisensäure/Methanol (8 ml), wurde zu einer gerührten Suspension aus 10% Pd/C in 5% Ameisensäure/Methanol (2 ml) bei 0ºC hinzugetropft. Die Reaktionsmischung wurde bei 0ºC für 1 h und dann bei Raumtemperatur für 1 bis 2 h gerührt. Die Reaktionsmischung wurde durch Hyflo filtriert und der Katalysator mit Methanol (25 ml) und Wasser (25 ml) gewaschen. Das Filtrat wurde auf ein Viertel des Volumens im Vakuum aufkonzentriert und mit Wasser (25 ml) verdünnt. Dieses Vorgehen wurde zweimal wiederholt, und dann wurde im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in Wasser aufgelöst und gefriergetrocknet, um einen schmutzigweißen Feststoff (111 mg) zu ergeben.

Zwischenstufe 1B

Herstellung von S-Benzyl-2-fluorthioacetimidathydrobromid

Fluorthioacetamid (3,39 g) und Benzylbromid (6,23 g) wurden in Chloroform (40 ml) unter Stickstoff für 16 h zum Rückfluß erhitzt. Nach Abkühlen wurde die Mischung mit Ether (200 ml) verdünnt und der resultierende orangefarbene Feststoff abfiltriert. Der Feststoff wurde mit mehr Ether gewaschen und über P&sub2;O&sub5; im Vakuum unter Erhalt von 5,19 g des gewünschten Produkts getrocknet.

Zwischenstufe C

Herstellung von S-Benzylthioacetimidathydrochlorid (Zwischenstufe)

Eine Mischung aus Thioacetamid (15,0 g, 0,20 mol) und Benzylchlorid (25,3 g, 0,20 mol) in Chloroform (75 ml) wurde für 90 min im Rückfluß erhitzt (das Thioacetamid erforderte -40 min. um in Lösung zu gehen). Die Reaktionsmischung wurde dann auf Raumtemperatur abkühlen gelassen und bei 0ºC über Nacht stehen gelassen, wobei sich farblose Kristalle als Schicht auf der Oberfläche bildeten. Das Produkt wurde abfiltriert, mit kaltem 10% Ether-Chloroform gewaschen und zur Trockene abgesaugt, um die Titelverbindung (25,55 g) als farblose Prismen zu ergeben. Smp. = 161-163ºC.
Das Hydrobromidsalz wurde in einem analogen Verfahren in 85%iger Ausbeute hergestellt; Smp. = 184-186ºC (Zers.).

Beispiel 1

Herstellung von 2-Amino-6-(1-imino-2-fluorethylamino)-4,4-dioxo-4- thiahexansäuredihydrobromid

(a) t-Butyl-2-t-butoxycarbonylamino-6-(1-imino-2-fluorethylamino)-4,4-dioxo-4-thiahexanoathydrobromid

Zu Zwischenstufe A (609 mg) in Ethanol (10 ml) bei 0ºC wurde Zwischenstufe 1B (407 mg) in einer Portion hinzugegeben. Die Mischung wurde bei 0ºC für 1 h und dann bei Raumtemperatur für 2 h gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand zwischen Wsser und Ether aufgetrennt. Die wäßrige Schicht wurde zweimal mit mehr Ether gewaschen und dann im Vakuum aufkonzentriert. Das zurückbleibende Harz wurde durch Säulenchromatographie an Silica unter Elution mit Dichlormethan-Methanol (8 : 1) gereinigt, um einen farblosen Schaum (317 mg) zu ergeben.

(b) 2-Amino-6-(1-imino-2-fluorethylamino)-4,4-dioxo-4- thiahexansäuredihydrobromid

t-Butyl-2-t-butoxycarbonylamino-6-(1-imino-2-fluorethylamino)-4,4- dioxo-4-thiahexanoathydrobromid (300 mg) wurde in Eisessig (4,5 ml) aufgelöst und gekühlt, während HBr in Essigsäure (45% G/V, 1,5 ml) hinzugegeben wurde. Die Mischung wurde dann bei Raumtemperatur für 2 h gerührt. Die flüchtigen Stoffe wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand in Wasser aufgelöst. Die Lösung wurde im Vakuum zur Trockene eingedampft, und dieses Vorgehen wurde zweimal wiederholt. Ethanol wurde zum Rückstand hinzugegeben und die Mischung im Vakuum zu einem schmutzigweißen Schaum aufkonzentriert. Dieser Stoff konnte durch Auflösen in einem Minimum von warmem Ethanol und Ausfällen des Produkts mit Ether weiter gereinigt werden, um einen weißen hygroskopischen Feststoff (220 mg) als Dihydrat zu ergeben.

Beispiel 2

Herstellung von 2-Amino-6-(1-iminoethylamino)-4,4-dioxo-4- thiahexansäure

Verfahren A

(a) S-[2-(1-Iminoethylamino)ethyl]cystein

S-(2-Aminoethyl)cysteinhydrobromid (12,25 g, 50 mmol) wurde in warmem Wasser (50 ml) aufgelöst und mit basischem Kupfercarbonat (5,85 g) behandelt. Die Lösung wurde abgekühlt und durch Hyflo filtriert, und der Rückstand wurde mit Wasser gewaschen.
Die blaue Lösung des kupfergeschützten Cystein-Derivats wurde gerührt und auf 10ºC abgekühlt. Der pH wurde durch Zugabe von 2 N Natriumhydroxid auf 10 bis 11 eingestellt, wobei Ethylacetimidathydrochlorid (9,375 g, 75 mmol) portionsweise hinzugegeben wurde. Die Temperatur ließ man auf Raumtemperatur ansteigen, und die Lösung wurde durch Zugabe von 2 N Salzsäure auf pH 3 eingestellt. Die Lösung wurde auf eine Dowex AG50WX8- Säule (100 ml Bettvolumen) aufgetragen, mit Wasser gewaschen und mit 0,2 N Ammoniak-Lösung eluiert. Die Ninhydrin-positiven Fraktionen wurde aufgefangen und die Ammoniak-Lösung durch Verdampfen im Vakuum entfernt. Die zurückbleibende Lösung wurde durch Zugabe von 2 N Salzsäure auf pH 4 eingestellt. Die Lösung würde an einem Rotationsverdampfer unter Erhalt von 3 g S-[2-(1-Iminoethylamino)ethyl]cysteinhydrochlorid zur Trockene eingedampft, das in einem Vakuumexsikkator getrocknet wurde.

(b) 2-Amino-6-(1-iminoethylamino)-4,4-dioxo-4-thiahexansäure

Eine Lösung aus S-[2-(1-Iminoethylamino)ethyl]cystein (3,25 g, 10 mmol) in 1 M Perchlorsäure (20 ml) wurde mit 30%iger Wasserstoffperoxid- Lösung (6,8 ml, 60 mmol) und 0,5 M Ammoniummolybdat (1 ml) behandelt. Die Temperatur der resultierenden Reaktion wurde durch Wasserkühlung auf 30ºC gehalten. Die Reaktionsmischung wurde für 2 h bei 25ºC gerührt, und danach wurde sie auf eine AG 1X8 (Acetat)-Ionenaustauschersäule (50 ml, 60 mmol) gegeben. Die Aminosäure wurde aus der Säule mit Wasser eluiert, und das Lösungsmittel wurde aus den Ninhydrin-positiven Fraktionen unter Erhalt eines Öls verdampft. Das Öl wurde mit Ethanol behandelt und erneut im Vakuum eingedampft. Das zurückbleibende Öl (ca. 4 g) wurde durch Flash- Säulenchromatographie unter Verwendung von Methanol/Ammoniak (9 : 1) als Elutionsmittel unter Erhalt von 0,8 g 2-Amino-6-(1-iminoethylamino)-4,4- dioxo-4-thiahexansäure gereinigt.

Verfahren B

(a) S-(2-Benzyloxycarbonylaminoethyl)cysteinsulfat

Flüssiges Ammoniak (6 l) wurde im Reaktor gerührt, und L-Cystein (300 g, 1,25 mol) wurde vorsichtig hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde für 1 h gerührt. Natrium (115 g, 5 mol) wurde stückweise während 2 h hinzugegeben. Es bildete sich eine graue Lösung. 2-(Benzyloxycarbonylamino)ethanphenylsulfonat (836 g, 2,5 mol) wurde portionsweise während 15 min hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde mit Ammoniak unter Rückfluß über Nacht gerührt. Das Ammoniak wurde durch Abschalten des Kreislaufes verdampfen gelassen. Die Reaktion wurde über Nacht stehen gelassen, dann wurden 9 l Wasser hinzugegeben und die Reaktion unter Rühren auf 40ºC erwärmt. Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und filtriert. Das Filtrat wurde mit verdünnter Schwefelsäure neutralisiert. Ein weiß-gelber Feststoff wurde durch Filtration entfernt und in einem Vakuumofen bei 80ºC getrocknet. 715 g der Titelverbindung wurden erhalten. Smp. = 220-221,5ºC.

(b) S-(2-Benzyloxycarbonylaminoethyl)-N-butyloxy- carbonylcystein

Butyloxycarbonylanhydrid (24 g, 0,11 mol) wurde in drei Portionen während 1 1/2 h zu einer gerührten und eisgekühlten Suspension aus feingemahlenem S-(2-Benzyloxycarbonylaminoethyl)cysteinsulfat (39,5 g, 0,1 mol) in Dioxan (400 ml) und Wasser (200 ml) hinzugegeben, wobei der pH durch Zugabe von ca. 200 ml 1 M Natriumhydroxid auf 9,5 eingestellt wurde. Das Dioxan wurde im Vakuum entfernt und Ethylacetat zur wäßrigen Lösung hinzugegeben. Die wäßrige Schicht wurde durch Zugabe von wäßriger Schwefelsäure auf pH 2,8 eingestellt und filtriert. Das Filtrat wurde mit Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetat-Extrakte wurden vereinigt, mit Wasser und Salzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum unter Erhalt von 42,95 g der Titelverbindung verdampft.

(c) S-(2-Benzyloxycarbonylaminoethyl)-N-butyloxycarbonylcystein-tert-butylester

Eine Lösung aus S-(2-Benzyloxycarbonylaminoethyl)-N-butyloxycarbonylcystein (3,98 g, 10 mmol) in trockenem Benzol (15 ml) wurde zum Rückfluß erhitzt und etwas Benzol zur Entfernung letzter Spuren von Feuchtigkeit abdestilliert. Zur obigen Lösung im Rückfluß wurde während 20 min N,N-Dimethylformamid-di-tert-butylacetal (8,2 g, 40 mmol) hinzugetropft. Die Reaktionsmischung wurde dann im Rückfluß für 30 min erhitzt, bis keine weitere Veränderung durch DC beobachtet wurde. Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, mit Wasser (15 ml) behandelt und gerührt. Die Phasen wurden getrennt und die organische Schicht mit 10% KHCO&sub3; (3 · 10 ml) und Salzlösung (2 · 10 ml) gewaschen. Die wäßrigen Phasen wurden mit frischem Ether-Benzol (1 : 1) (2 · 15 ml) gewaschen und die vier vereinigten Extrakte über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, mit Activkohle behandelt, filtriert und zur Trockene unter Erhalt eines blaßbraunen Öls eingedampft. Das Rohmaterial wurde durch Flash-Chromatographie über SiO&sub2; unter Verwendung von 65% Cyclohexan-Ethylacetat als Elutionsmittel gereinigt. 2,56 g des Titelprodukts wurden als beinahe farbloses Öl erhalten.

(d) 2-(Butyloxycarbonylamino)-6-(benzyloxycarbonylamino)-4,4- dioxo-4-thiahexansäure-tert-butylester

Zu S-(2-Benzyloxycarbonylaminoethyl)-N-butyloxycarbonylcystein-tertbutylester (454 mg, 1,0 mmol) in Methanol (5 ml) bei 0ºC wurde eine Lösung aus "Oxon" (925 mg, 3,0 mmol) in Wasser (5 ml) während 10 min hinzugetropft. Während der Zugabe wurde eine exotherme Reaktion beobachtet, und die Temperatur wurde unterhalb 2ºC durch externe Eiskühlung gehalten. Die Reaktionsmischung wurde für 4 h bei 0ºC gerührt und dann während 10 h auf 15ºC erwärmen gelassen. Aufgrund der sehr viskosen Reaktionsmischung wurden zusätzlich Aliquote von Methanol (4 ml)und Wasser (2 ml) zur Erleichterung des Rührens hinzugegeben. Eine weitere Portion "Oxon" (308 mg, 1,0 mmol) in Wasser (1,5 ml) wurde hinzugegeben und die Mischung für weitere 14 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde dann mit Ether (3 · 25 ml) behandelt und die etherische Lösung jedes Mal vom festen Rückstand ablaufen gelassen. Die vereinigten etherischen Extrakte wurden über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, filtriert und zur Trockene unter Erhalt von 0,428 g der Titelverbindung als farbloses Öl eingedampft, das sich schnell zu einem weißen Feststoff verfestigte. Smp. = 116-118ºC.

(e) 2-(Butyloxycarbonylamino)-6-amino-4,4-dioxo-4- thiahexansäure-tert-butylester

Zu einer Lösung aus 2-(Butyloxycarbonylamino)-6-(benzyloxycarbonylamino)-4,4-dioxo-4-thiahexansäure-tert-butylester (200 mg) in Methanol (5 ml) wurde Pd/C (50%) (Degussa-Typ) (200 mg) hinzugegeben und die Mischung bei Raumtemperatur hydriert, bis keine weitere Veränderung beobachtet wurde. Die Reaktionsmischung wurde dann durch ein Hyflo-Kissen filtriert und der Rückstand mit frischem Methanol (2 · 2 ml) gewaschen. Die vereinigten Filtrate wurden zur Trockene unter Erhalt von 119 mg der Titelverbindung als beinahe farbloses Glas eingedampft.

(f) 2-(Butyloxycarbonylamino)-6-(1-iminoethylamino)-4,4- dioxo-4-thiahexansäure-tert-butylesterhydrochlorid

Zu einer Lösung aus 2-(Butyloxycarbonylamino)-6-amino-4,4-dioxo-4- thiahexansäure-tert-butylester (340 mg) in Methanol (10 ml) wurde portionsweise Zwischenstufe C (202 mg) hinzugegeben. Nach Rühren bei 0ºC für 30 min wurde die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und dann zur Trockene eingedampft. Der ölige Rückstand wurde mit Wasser (2 ml) behandelt und mit Ether (4 · 4 ml) zur Entfernung des Benzylmercaptans extrahiert. Die organischen Extrakte wurden mit frischem Wasser (2 ml) gewaschen und die vereinigten Extrakte im Vakuum bei 40ºC unter Erhalt von 396 mg der Titelverbindung als farbloses Glas eingedampft.

(g) 2-Amino-6-(1-iminoethylamino)-4,4-dioxo-4-thiahexansäuredihydrochlorid

Zu einer Lösung aus 2-(Butyloxycarbonylamino)-6-(1-iminoethylamino)- 4,4-dioxo-4-thiahexansäure-tert-butylesterhydrochlorid (300 mg) in Dioxan (15 ml) wurde 4 N HCl/Dioxan (10 ml) hinzugegeben und die Mischung bei Raumtemperatur für 24 h stehengelassen. Die Reaktionsmischung wurde dann zur Trockene eingedampft und der halbfeste Rückstand mit Wasser (2 ml) behandelt und unter Erhalt eines farblosen Glases eingedampft. Das Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie an SiO&sub2; unter Verwendung von CH&sub3;CN : CH&sub3;CO&sub2;H : H&sub2;O (5 : 2 : 2) als Elutionsmittel unter Erhalt von 172,5 mg der Titelverbindung gereinigt.

Beispiel 3

Biologische Aktivität

Die Hemmung gereinigter menschlicher NO-Synthasen wurden im Anschluß an die Herstellung von menschlichem nNOS (Furfine et al. (1993) Biochem. 32, 8512-8517), iNOS (Sherman et al. (1993) Biochem. 32, 11600-11605) und eNOS (Garvey et al. (1994) Arch. Bioch. Biophys., im Druck) wie beschrieben bestimmt. Ihre Aktivität wurde durch die Konvertierung von [¹&sup4;C]-L-Arginin zu Citrullin, wie beschrieben von Schmidt et al. ((1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 365-369), in Reaktionsmischungen (100 ul) verfolgt, die 50 mM HEPES pH 7,0, 8 uM Tetrahydrobiopterin, 1 mM NADPH und 0,5 uM [¹&sup4;C]-L-Arginin (30 000 Impulse/min) bei 30ºC enthielten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 nachfolgend gezeigt. Tabelle 1: Hemmung gereinigter menschlicher NOS-Isoenzyme
* Diese Hemmung war stark zeitabhängig an iNOS; ein Kd-Wert von 0,1 uM wurde unter Annahme einer iNOS- gegenüber eNOS-Selektivität von 790 [> 2000-fach größer als L-NMMA] bestimmt.
Die Hemmung von rekombinantem menschlichen iNOS wurde im Anschluß an die Expression in einem Baculovirus/Insekten-Zellsystem bestimmt (Charles et al. (1994) in: The Biology of Nitric Oxide 4, Moncada S., Feelisch M.; Busse R. und Higgs E. A., Hrsg., Portland Press, London, S. 316-320), wobei das Insekten-Cytosol auf NO-Synthase in einem Mikrotiterplatten-Assay auf der Grundlage des spektrophotometrischen Assays getestet wurde, der zuvor beschrieben wurde (Knowles et al. (1990) Biochem. Biophys. Res. Commun. 172, 1042-1048). Der Assay wurde bei 37ºC in Reaktionsmischungen durchgeführt, die HEPES (100 mM), DTT (0,1 mM), Tetrahydrobiopterin (5 uM), NADPH (100 uM), Hämoglobin (5 uM), L-Arginin (30 uM) und Hemmstoff (0-300 uM) enthielten, wobei die Extinktionsänderung bei 405-420 nm gemessen und die Steady-State-Hemmung zwischen 15 und 30 min Inkubation bestimmt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 nachfolgend gezeigt.
Die Hemmung von eNOS und iNOS in situ in Aortenringen der Ratte wurde durch Messung der Zunahme der durch NO-Synthasehemmung verursachten Ringspannung bestimmt. Für Untersuchungen des Basaltonus (der eNOS widerspiegelt) wurden Ringe der Brustaorta mit intaktem Endothel hergestellt, wie zuvor beschrieben (Rees et al. (1989) Br. J. Pharmacol. 96, 418-424), und kumulative Konzentrationskurven wurden für die Hemmstoffe in Gegenwart einer Grenzkonzentration von Phenylephrin (ED&sub1;&sub0; 10 nM) erhalten. Für Untersuchungen des induzierten glatten Muskeltonus (der iNOS widerspiegelt) wurden vom Endothel bloßgelegte Ringe LPS (0,1 ug/ml aus S. typhosa) in Gegenwart von Phenylephrin bei ca. ED&sub9;&sub0; für 6 h ausgesetzt, wie zuvor beschrieben (Rees et al. (1990) Biochem. Biophys. Res. Commun. 173, 541-547). Während dieser Zeit trat ein fortschreitender Tonusverlust wegen der iNOS-Induktion auf. Kumulative Konzentrationskurven wurden dann für die Hemmstoffe erhalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 nachfolgend gezeigt.
Die NO- Synthasewirksamkeits- und Selektivitätsdaten sind Mittelwert ± SEM aus (n) Experimenten.
Die Hemmung von eNOS und iNOS in vivo wurde durch die Wirkungen von Hemmstoffen auf den Blutdruck in entweder normalen (eNOS) oder durch Endotoxin im Schock befindlichen (iNOS) Mäusen bei Bewußtsein beurteilt. Weibliche CD-1-Mäuse (25-35 g) wurde kurz mit Isofluoran (2%) anästhesiert. Leitungskanülen wurden in die Oberschenkelvene implantiert, subkutan zum Ausgang an der Oberseite des Rückens durchgeführt und an ein Drehgelenkhalteseilsystem zur kontinuierlichen Überwachung des Blutdrucks bzw. zur Hemmstoffverabreichung angeschlossen. Im Anschluß an die Erholung von der Operation würden Tiere mit mittleren Blutdrücken im Normalbereich (90 bis 110 mmHg) verwendet, um kumulative Konzentrationskurven für Hemmstoffe auf den Blutdruck entweder ohne weitere Behandlung ("normale Mäuse") oder 7 h nach Verabreichung von Lipopolysaccharid (12,5 mg/kg LPS aus E. coli 026:B6, intravenös während 30 s) zu erhalten, um Schock zu induzieren ("Mäuse im Schockzustand"). In normalen Mäusen hatte Beispiel 2 keine Wirkung auf den Blutdruck im Dosisbereich von 1 bis 1000 mg/kg. Jedoch konnte Beispiel 2 in Mäusen im Schockzustand den Blutdruck vollständig in den Normalbereich wiederherstellen.
Die Wirkungen von Beispiel 2 auf den Endotoxin-induzierten vaskulären Austritt wurden in Ratten wie von Laszlo et al. beschrieben untersucht ((1994) Brit. J. Pharmacol. 111, 1309-1315). Beispiel 2 verursachte in Dosen von bis 5 mg/kg bei gleichzeitiger Verabreichung mit Endotoxin keine Verschlimmerung des Endotoxin-induzierten Plasmaaustritts, anders als nicht-selektive Hemmstoffe, wie L-NMMA. Jedoch hob Beispiel 2 den iNOS- abhängigen verzögerten Plasmaaustritt bei einem ED&sub5;&sub0; von 1 mg/kg auf.

Claims

1. Verbindung der Formel (I):

worin R¹ Methyl oder Fluormethyl ist, oder ein Salz, Ester, Amid oder physiologisch akzeptabler Prodrug davon.

2. Verbindung der Formel (I) gemäß Anspruch 1, worin die Verbindung ausgewählt ist aus

2-Amino-6-(1-iminoethylamino)-4,4-dioxo-4-thiahexansäure; und

2-Amino-6-(1-imino-2-fluorethylamino)-4,4-dioxo-4- thiahexansäure;

oder einem Salz, Ester, Amid oder physiologisch akzeptablen Prodrug davon.

3. 2-Amino-6-(1-iminoethylamino)-4,4-dioxo-4-thiahexansäure.

4. (R)-2-Amino-6-(1-iminoethylamino)-4,4-dioxo-4-thiahexansäure.

5. Verbindung der Formel (I) wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert oder ein Salz, Ester, Amid oder physiologisch akzeptabler Prodrug davon zur Verwendung in der Medizin.

6. Verwendung einer Verbindung der Formel (I) wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert oder eines Salzes, Esters, Amids oder physiologisch akzeptablen Prodrugs davon in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Zustandes, in dem ein Vorteil in der Hemmung der Stickoxid-Produktion aus Arginin durch die Wirkung der NO-Synthase besteht.

7. Pharmazeutische Formulierung, umfassend eine Verbindung der Formel (I) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder ein Salz, einen Ester, ein Amid oder einen physiologisch akzeptablen Prodrug davon zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Trägern dafür und gegebenenfalls einem oder mehreren anderen therapeutischen Bestandteilen.

8. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I) wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert oder eines Salzes, Esters, Amids oder physiologisch akzeptablen Prodrugs davon, welches umfaßt:

(a) Oxidation einer Verbindung der Formel (II):

worin R¹ wie zuvor definiert ist; oder

(b) Entschützen einer Verbindung der Formel (V):

worin R¹ wie zuvor definiert ist, Q Wasserstoff oder eine Carboxyl- Schutzgruppe ist und Q' eine Schutzgruppe ist, gegebenenfalls gefolgt von Konvertierung zu einer anderen Verbindung der Formel (I).