DE69434988T2

DE69434988T2 - Tumornekrose-faktor-gamma

Info

Publication number: DE69434988T2
Application number: DE69434988T
Authority: DE
Inventors: Guo-Liang Darnestown YU; Jian Gaithersburg NI; Craig A. Laytonsville ROSEN
Original assignee: Human Genome Sciences Inc
Current assignee: Human Genome Sciences Inc
Priority date: 1994-11-07
Filing date: 1994-11-07
Publication date: 2008-03-06
Anticipated expiration: 2014-11-08
Also published as: CA2203655A1; KR100507431B1; JPH10509030A; ATE364614T1; AU1254795A; CA2203655C; ES2285701T3; EP0792278A1; DE69434988D1; EP0792278B1; JP4046349B2; KR970707141A; AU708972B2; WO1996014328A1; EP0792278A4

Description

Diese Erfindung betrifft neu identifizierte Polynucleotide, Polypeptide, die von derartigen Polynucleotiden codiert werden, die Verwendung derartiger Polynucleotide und Polypeptide sowie die Herstellung derartiger Polynucleotide und Polypeptide. Genauer gesagt wurde das Polypeptid der vorliegenden Erfindung als neues Mitglied der Tumornekrose-Faktor-Familie identifiziert und wird nachstehend als „TNF-gamma" bezeichnet. Die Erfindung betrifft auch die Hemmung der Wirkung derartiger Polypeptide.
Die menschlichen Tumornekrose-Faktoren α (TNF-α) und β (TNF-β oder Lymphotoxin) sind verwandte Mitglieder der umfangreichen Klasse der Polypeptidmediatoren, die die Interferone, Interleukine und Wachstumsfaktoren einschließt, die insgesamt als Cytokine bezeichnet werden (Beutler, B. und Cerami, A., Annu. Rev. Immunol., 7: 625-655 (1989)).
Der Tumornekrose-Faktor (TNF-α und TNF-β) wurde ursprünglich aufgrund seiner anti-Tumoraktivität entdeckt, jetzt wird er jedoch als pleiotropes Cytokin anerkannt, das eine wichtige Rolle bei der Immunregulation und Entzündung spielt. Bisher gibt es acht bekannte Mitglieder der TNF-verwandten Cytokinfamilie, TNF-α, TNF-ß (Lymphotoxin-α), LT-β und Liganden für die Fas-, CD30-, CD27-, CD40- und 41BB-Rezeptoren. Diese Proteine besitzen konservierte C-terminale Sequenzen und variable N-terminale Sequenzen, die mit Ausnahme von TNF-β häufig als Membrananker verwendet werden. Sowohl TNF-α als auch TNF-β wirken als Homotrimere, wenn sie an TNF-Rezeptoren binden.
TNF wird von zahlreichen Zelltypen einschließlich Monocyten, Fibroblasten, T-Zellen, natürlichen Killer (NK)-Zellen und hauptsächlich von aktivierten Makrophagen produziert. Über TNF-α wurde berichtet, dass er eine Rolle bei der schnellen Nekrose von Tumoren, bei der Immunstimulierung, bei Autoimmunerkrankungen, bei der Transplantatabstoßung, bei der Resistenz gegenüber Parasiten, beim Erzeugen einer anti-viralen Reaktion, beim septischen Schock, bei der Wachstumsregulierung, bei vaskulären Endotheleffekten und bei Stoffwechseleffekten spielt. TNF-α ist auch der Auslöser dafür, dass Endothelzellen verschiedene Faktoren einschließlich PAI-1, IL-1, GM-CSF und IL-6 sekretieren, um die Zellproliferation zu fördern. Außerdem reguliert TNF-α verschiedene Zelladhäsionsmoleküle wie E-Selectin, ICAM-1 und VCAM-1 hoch. Es wurde auch gezeigt, dass TNF-α und der Fas-Ligand den programmierten Zelltod induzieren.
Der erste Schritt bei der Induktion der verschiedenen, durch TNF oder LT vermittelten Zellreaktionen ist deren Bindung an spezifische Zelloberflächenrezeptoren. Zwei unterschiedliche TNF-Rezeptoren mit etwa 55 KDa (TNF-R1) und 75 KDa (TNF-R2) wurden identifiziert (Hohman, H. P. et al., J. Biol Chem., 264:14927-14934 (1989)), und menschliche und Maus-cDNAs, die beiden Rezeptortypen entsprechen, wurden isoliert und charakterisiert (Loetscher, H. et al., Cell, 61:351 (1990)). Beide TNF-Rs teilen dieselbe typische Struktur der Zelloberflächenrezeptoren einschließlich extrazelluärer, transmembraner und intrazellulärer Regionen.
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung wurde als neues Mitglied der TNF-Familie, basierend auf der Struktur-, Aminosäuresequenzhomologie und funktionalen Ähnlichkeiten identifiziert, beispielsweise ist TNF-gamma ein proinflammatorisches Protein.
Nach einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein neues, reifes Polypeptid bereitgestellt, das TNF-gamma ist. Ferner werden hier biologisch aktive und diagnostisch oder therapeutisch nützliche Fragmente, Analoga und Derivate davon beschrieben. Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung ist menschlichen Ursprungs.
Nach einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden isolierte Nucleinsäuremoleküle, die menschlichen TNF-gamma codieren, einschließlich mRNAs, DNAs, cDNAs, genomischer DNAs bereitgestellt. Ferner werden hier Analoga und biologisch aktive und diagnostisch oder therapeutisch nützliche Fragmente und Derivate davon beschrieben.
Nach einem noch weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung derartiger Polypeptide durch rekombinante Verfahren beschrieben, umfassend die Züchtung rekombinanter prokaryontischer und/oder eukaryontischer Wirtszellen, die eine menschliche TNF-gamma-Nucleinsäure sequenz enthalten, unter Bedingungen, die die Expression des Proteins fördern, und nachfolgende Gewinnung des Proteins.
Nach einem noch weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Nutzung eines derartigen Polypeptids oder Polynucleotids, das ein derartiges Polypeptid codiert, zur Durchmusterung nach Agonisten und Antagonisten und für therapeutische Zwecke, beispielsweise Wundheilung, bereitgestellt, um Tumorproliferation zu hemmen, um Resistenz gegenüber Parasiten, Bakterien und Viren bereitzustellen, um inflammatorische Aktivitäten zu induzieren, um die Proliferation von Endothelzellen und bestimmten hämatopoietischen Zellen zu induzieren, um Restenose zu behandeln und um bestimmte Autoimmunkrankheiten zu verhindern.
Nach einem noch weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden auch Nucleinsäuresonden bereitgestellt, umfassend Nucleinsäuremoleküle mit ausreichender Länge, die an menschliche TNF-gamma-Sequenzen spezifisch hybridisieren.
Es werden TNF-gamma-Agonisten beschrieben, die TNF-gamma nachahmen und die an TNF-gamma-Rezeptoren binden, um Reaktionen vom TNF-gamma-Typ hervorzurufen.
Nach einem noch weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Antagonisten für derartige Polypeptide bereitgestellt, die verwendet werden können, um die Wirkung derartiger Polypeptide zu hemmen, um beispielsweise septischen Schock, Entzündung, cerebrale Malaria, die Aktivierung des HIV-Virus, Transplantatabstoßung, Knochenresorption und Kachäxie zu verhindern.
Nach einem noch weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden diagnostische Test zum Nachweis von Erkrankungen bereitgestellt, die im Zusammenhang mit der Unterexpression und Überexpression des TNF-gamma-Polypeptids und den Nucleinsäuresequenzen stehen, die ein derartiges Polypeptid codieren.
Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung sollten für den Fachmann aufgrund der hier gemachten Ausführungen offensichtlich sein.
Die folgenden Zeichnungen sind veranschaulichend für die erfindungsgemäßen Ausführungsformen und bedeuten nicht, dass der von den Patentansprüchen umfasste Umfang der Erfindung begrenzt wird.
1 stellt die cDNA und die entsprechende abgeleitete Aminosäuresequenz des Polypeptids der vorliegenden Erfindung dar. Die ersten 25 Aminosäuren (unterstrichen) sind die vermeintliche Leader-Sequenz. Es werden die standardmäßigen Abkürzungen mit einem Buchstaben für Aminosäuren verwendet.
2 stellt eine Aminosäuresequenz-Ausrichtung zwischen TNF-gamma und anderen Mitgliedern der TNF-Familie dar. TNF-gamma enthält die konservierten Aminosäurereste der TNF-Familie, wie durch die schattierten Bereiche dargestellt.
3A ist eine RNA-Blot-Analyse, die die menschlichen Gewebe zeigt, in denen TNF-gamma exprimiert wird. RNA aus den angegebenen Geweben wurden mit markierter TNF-gamma-cDNA getestet. TNF-gamma-mRNA kommt hauptsächlich in den Nieren vor, da 3A eine deutliche Bande zeigt. Andere Spuren scheinen eine starke Hybridisierung zu zeigen, jedoch sind diese tatsächlich unspezifische, verschmierte Bereiche.
3B ist eine RNA-Blot-Analyse, die zeigt, dass TNF-gamma hauptsächlich in HUVEC-Zellen (menschliche Nabelschnurvenenendothelzellen) exprimiert wird, wobei es sich dabei um Spur 9 handelt. Spur 6 und Spur 8 sind unspezifische verschmierte Bereiche. RNA aus den angegebenen Zelllinien wurde mit markierter TNF-gamma-cDNA getestet. Spur 1 ist CAMA1 (Brustkrebs); Spur 2 AN3CA (Uteruskrebs); Spur 3, SK.UT.1 (Uteruskrebs); Spur 4, MG63 (Osteoblastom); Spur 5, HOS (Osteoblastom); Spur 6, MCF7 (Brustkrebs); Spur 7, OVCAR-3 (Eierstockkrebs); Spur 8, CAOV-3 (Eierstockkrebs); Spur 9, HUVEC; Spur 10, AOSMIC (glatte Muskulatur); Spur 11, Vorhautfibroblast.
4 ist ein Photo eines Gels nach der Elektrophorese von TNF-gamma, der durch bakterielle Expression und Reinigung hergestellt wurde.
5 ist ein Photo eines Gels nach der Baculovirus-Expression von TNF-gamma.
6A ist ein Photo von WEHT 164-Zellen, die nicht behandelt wurden (oben links) und nach Exposition gegenüber TNF-α, TNF-β und TNF-gamma. Zellen, die eine verlängerte, nicht-runde Morphologie besitzen, wurden lysiert. Der zugegebene TNF betrug etwa 0,5 μg/ml. Die Photos wurden 72 Stunden nach der Zugabe von TNF aufgenommen.
6B stellt die Fähigkeit von TNF-gamma im Vergleich zu TNF-α und TNF-β dar, das WEHT 164-Zellwachstum zu hemmen.
7 stellt die Fähigkeit von rekombinantem TNF-gamma, TNF-α und TNF-β dar, den WEHT 164-Zelltod zu induzieren.
8 stellt die Fähigkeit von rekombinantem TNF-α, TNF-β und TNF-gamma dar, morphologische Veränderungen in L929-Zellen zu induzieren. Die morphologische Veränderung wird durch dunkle, runde Zellen angezeigt. Die Zellen wurden mit von E. coli produziertem rekombinantem TNF bei etwa 0,5 μg/ml behandelt. Die Photos wurden 72 Stunden nach der Zugabe von TNF aufgenommen. Die Morphologieänderung zeigt an, dass die Zellen abgetötet wurden.
9 ist eine graphische Darstellung der Wirkung von TNF-gamma, TNF-α und TNF-β auf Venenendothelzellen. Die Zellproliferation wurde unter Verwendung eines MTS-Tests quantifiziert, nachdem die Venenendothelzellen mit im Handel erhältlichem TNF-α und TNF-β und von E. coli produziertem TNF-gamma behandelt worden waren.
10 ist ein Photo von HL60-Zellen, wobei die Kontrolle zeigt, dass die HL60-Zellen voneinander verstreut wurden; TNF-α und TNF-gamma induzieren die Zelladhäsion und den Zell-Zell-Kontakt, wie durch die aneinanderhaftenden Zellen unten rechts dargestellt.
11 zeigt, dass TNF-gamma an zwei bekannte lösliche TNF-Rezeptoren, nämlich sTNF RI (p55) und sTNF RII (p75), nicht signifikant bindet.
Nach einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine isolierte Nucleinsäure (Polynucleotid) bereitgestellt, die das reife Polypeptid mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz von 1 oder das reife Polypeptid codiert, das von der cDNA des am 26. Oktober 1994 mit der ATCC-Hinterlegungsnr. 75927 hinterlegten Clons codiert wird.
Ein Polynucleotid, das ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, kann aus der menschlichen Niere und den Endothelzellen der Nabelschnurvene erhalten werden. Das Polypeptid dieser Erfindung wurde in einer cDNA-Genbank entdeckt, die von einer menschlichen Endothelzelle der Nabelschnurvene stammte. Es ist strukturell mit der TNF-Familie verwandt. Es enthält einen offenen Leserahmen, der ein Protein mit 174 Aminosäureresten codiert, von denen etwa die ersten 25 Aminosäurereste die vermeintliche Leader-Sequenz sind, so dass das reife Protein 149 Aminosäuren umfasst. Das Protein zeigt am C-Terminus den höchsten Homologiegrad mit Kaninchen-TNF-α mit 38% Identität und 58 % Ähnlichkeit über einen Bereich von 111 Aminosäuren. Sequenzen, die bei allen Mitgliedern der TNF-Familie konserviert sind, sind auch in TNF-gamma konserviert (vgl. 2). Die fettgedruckten Buchstaben zeigen die konservierten Aminosäurereste an. Die TNF-gamma-mRNA wird in den menschlichen Endotheizellen der Nabelschnurvene spezifisch exprimiert, wie in der RNA-Blot-Analyse von 3B dargestellt.
Das Polynucleotid der vorliegenden Erfindung kann in Form von RNA oder in Form von DNA vorliegen, wobei DNA cDNA, genomische DNA und synthetische DNA einschließt. Die DNA kann doppelsträngig oder einzelsträngig sein, und falls sie einzelsträngig ist, kann sie der codierende Strang oder nicht-codierende (Antisense-) Strang sein. Die codierende Sequenz, die das reife Polypeptid codiert, kann mit der codierenden Sequenz, die in 1 dargestellt ist, oder mit derjenigen des hinterlegten Clons identisch sein oder kann eine unterschiedliche codierende Sequenz sein, wobei die codierende Sequenz als Folge der Redundanz oder Degenerierung des genetischen Codes dasselbe reife Polypeptid codiert, wie die DNA von 1 oder die hinterlegte cDNA.
Das Polynucleotid, das das reife Polypeptid von 1 oder das reife Polypeptid codiert, das von der hinterlegten cDNA codiert wird, schließt ein, ist jedoch nicht begrenzt auf: ausschließlich die codierende Sequenz für das reife Polypeptid; die codierende Sequenz für das reife Polypeptid und die zusätzliche codierende Sequenz wie eine Leader- oder sekretorische Sequenz oder eine Proproteinsequenz; die codierende Sequenz für das reife Polypeptid (und gegebenenfalls die zusätzliche codierende Sequenz) und die nicht-codierende Sequenz wie Introns oder die nicht-codierende Sequenz 5' und/oder 3' der codierenden Sequenz für das reife Polypeptid.
Daher umfasst der Begriff „Polynucleotid, das ein Polypeptid codiert" ein Polynucleotid, das nur die codierende Sequenz für das Polypeptid einschließt, sowie ein Polynucleotid, das eine zusätzliche codierende und/oder nicht-codierende Sequenz einschließt.
Ferner werden hier Varianten der hier vorstehend beschriebenen Polynucleotide beschrieben, die Fragmente, Analoga und Derivate des Polypeptids mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz von 1 oder des Polypeptids codieren, das von der cDNA des hinterlegten Clons codiert wird. Die Variante des Polynucleotids kann eine natürlich auftretende Allelovariante des Polynucleotids oder eine nicht-natürlich auftretende Variante des Polynucleotids sein.
Daher schließt die vorliegende Erfindung Polynucleotide ein, die dasselbe reife Polypeptid, wie in 1 dargestellt, oder dasselbe reife Polypeptid codieren, das von der cDNA des hinterlegten Clons codiert wird. Ferner werden hier Varianten derartiger Polynucleotide beschrieben, wobei die Varianten ein Fragment, Derivat oder Analogon des Polypeptids von 1 oder des Polypeptids codieren, das von der cDNA des hinterlegten Clons codiert wird. Derartige Nucleotidvarianten schließen Deletionsvarianten, Substitutionsvarianten und Additions- oder Insertionsvarianten ein.
Wie hier vorstehend angegeben, kann das Polynucleotid eine codierende Sequenz besitzen, die eine natürlich auftretende allele Variante der in 1 dargestellten codierenden Sequenz oder der codierenden Sequenz des hinterlegten Clons ist. Wie im Fachgebiet bekannt, ist eine allele Variante eine alternierende Form einer Polynucleotidsequenz, die eine Substitution, Deletion oder Addition einer oder mehrerer Nucleotide aufweisen kann, die die Funktion des codierten Polypeptids im Wesentlichen nicht ändert.
Die vorliegende Erfindung schließt auch Polynucleotide ein, wobei die codierende Sequenz für das reife Polypeptid in demselben Leserahmen an eine Polynucleotidsequenz fusioniert sein kann, die die Expression und Sekretion eines Polypeptids aus einer Wirtszelle unterstützt, beispielsweise eine Leader-Sequenz, die als sekretorische Sequenz zur Kontrolle des Transports eines Polypeptids aus der Zelle wirkt. Das Polypeptid mit einer Leader-Sequenz ist ein Präprotein, wobei die Leader-Sequenz von der Wirtszelle gespalten werden kann, so dass die reife Form des Polypeptids erzeugt wird. Die Polynucleotide können auch ein Proprotein codieren, das das reife Protein plus zusätzliche Aminosäurereste am 5'-Ende ist. Ein reifes Protein mit einer Prosequenz ist ein Proprotein und ist eine inaktive Form des Proteins. Wenn die Prosequenz einmal gespalten wird, bleibt ein aktives, reifes Protein zurück.
Daher kann beispielsweise das Polynucleotid der vorliegenden Erfindung ein reifes Protein oder ein Protein mit einer Prosequenz oder ein Protein, das sowohl eine Prosequenz als auch eine Präsequenz (Leader-Sequenz) besitzt, codieren.
Die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können auch eine codierende Sequenz im Leserahmen an eine Marker-Sequenz fusioniert haben, die die Reinigung des Polypeptids der vorliegenden Erfindung erlaubt. Die Marker-Sequenz kann eine Hexa-Histidin-Markierung sein, die von einem pQE-9-Vektor bereitgestellt wird, um im Falle eines bakteriellen Wirts für die Reinigung des an den Marker fusionierten reifen Polypeptids zu sorgen, oder beispielsweise kann die Marker-Sequenz eine Hämagglutinin (HA)-Markierung sein, wenn ein Säugerwirt, z.B. COS7-Zellen, verwendet wird. Die HA-Markierung entspricht einem Epitop, das vom Influenza-Hämagglutinin-Protein stammt (Wilson, I. et al., Cell, 37:767 (1984)).
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Polynucleotide, die mit den vorstehend beschriebenen Sequenzen hybridisieren, falls es mindestens eine 50%ige und vorzugsweise eine 70%ige Identität zwischen den Sequenzen gibt. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere Polynucleotide, die mit den vorstehend beschriebenen Sequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisieren. Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff „stringente Bedingungen", dass die Hybridisierung nur erfolgt, falls mindestens 95% und vorzugsweise mindestens 97% Identität zwischen den Sequenzen besteht. Die Polynucleotide, die mit den vorstehend beschriebenen Polynucleotiden in einer bevorzugten Ausführungsform hybridisieren, codieren Polypeptide, die im Wesentlichen dieselbe biologische Funktion oder Aktivität beibehalten wie das Polypeptid, das von der cDNA von 1 oder der hinterlegten cDNA codiert wird.
Die Hinterlegung(en), auf die hier Bezug genommen wird, wird/werden nach den Bestimmungen des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke des Patentverfahrens erhalten. Diese Hinterlegungen werden ausschließlich der Einfachheit halber für den Fachmann bereitgestellt und sind kein Zugeständnis, dass eine Hinterlegung nach 35 U.S.C. §112 erforderlich ist. Die Sequenz der Polynucleotide, die in den hinterlegten Materialien enthalten ist, sowie die Aminosäuresequenz der dadurch codierten Polypeptide sind hier durch Bezugnahme einbezogen und sind hier im Falle eines Konfliktes mit irgendeiner Beschreibung der Sequenzen hierin maßgebend. Eine Lizenz kann erforderlich sein, um die hinterlegten Materialien herzustellen, zu verwenden oder zu verkaufen und es wird keine derartige Lizenz hiermit gewährt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein TNF-gamma-Polypeptid, das die abgeleitete Aminosäuresequenz von 1 besitzt oder das die Aminosäuresequenz besitzt, die von der hinterlegten cDNA codiert wird. Ferner werden hier Fragmente, Analoga und Derivate eines derartigen Polypeptids beschrieben.
Die Begriffe „Fragment", „Derivat" und „Analogon" bei Bezugnahme auf das Polypeptid von 1 oder dasjenige, das von der hinterlegten cDNA codiert wird, bedeutet ein Polypeptid, das im Wesentlichen dieselbe biologische Funktion oder Aktivität wie ein derartiges Polypeptid beibehält. Daher schließt ein Analogon ein Proprotein ein, das durch Spaltung des Proproteinanteils aktiviert werden kann, ein aktives, reifes Polypeptid herzustellen.
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann ein rekombinantes Polypeptid, ein natürliches Polypeptid oder ein synthetisches Polypeptid, vorzugsweise ein rekombinantes Polypeptid sein.
Das Fragment, Derivat oder Analogon des Polypeptids von 1 oder dasjenige, das von der hinterlegten cDNA codiert wird, kann (i) eines sein, in dem ein oder mehrere der Aminosäurereste mit einem konservierten oder nicht-konserviertem Aminosäurerest (vorzugsweise einem konservierten Aminosäurerest) substituiert ist, und ein derartiger substituierter Aminosäurerest kann einer sein, der durch den genetischen Code codiert wird oder nicht, oder (ii) eines sein, in dem ein oder mehrere der Aminosäurereste eine Substituentengruppe einschließen, oder (iii) eines sein, in dem das reife Polypeptid mit einer anderen Verbindung fusioniert ist, wie eine Verbindung, um die Halbwertszeit des Polypeptids zu erhöhen (beispielsweise Polyethylenglycol), oder (iv) eines sein, in dem die zusätzlichen Aminosäuren mit dem reifen Polypeptid fusioniert sind, wie eine Leader- oder sekretorische Sequenz oder eine Sequenz, die für die Reinigung des reifen Polypeptids verwendet wird, oder ein Proproteinsequenz. Derartige Fragmente, Derivate und Analoga werden aufgrund der hier gemachten Ausführungen als im Anwendungsbereich des Fachmanns liegend betrachtet.
Die Polypeptide und Polynucleotide der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise in einer isolierten Form bereitgestellt und sind vorzugsweise zur Homogenität gereinigt.
Der Begriff „isoliert" bedeutet, dass das Material aus seiner ursprünglichen Umgebung (z.B. die natürliche Umgebung, falls es natürlich auftritt) entfernt wird. Beispielsweise ist ein natürlich auftretendes Polynucleotid oder Polypeptid, das in einem lebenden Tier vorliegt, nicht isoliert, aber dasselbe Polynucleotid oder Polypeptid, dass von einigen oder allen der gemeinsam existierenden Materialien im natürlichen System getrennt ist, ist isoliert. Derartige Polynucleotide könnten Teil eines Vektors sein und/oder derartige Polynucleotide oder Polypeptide könnten Teil einer Zusammensetzung sein, und immer noch isoliert sein, dadurch dass ein derartiger Vektor oder eine derartige Zusammensetzung nicht Teil ihrer natürlichen Umgebung ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Vektoren, die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung einschließen, Wirtszellen, die gentechnisch mit erfindungsgemäßen Vektoren hergestellt werden, und die Herstellung der erfindungsgemäßen Polypeptide durch rekombinante Verfahren.
Wirtszellen werden mit den erfindungsgemäßen Vektoren, die beispielsweise ein Clonierungsvektor oder ein Expressionsvektor sein können, gentechnisch verändert (transduziert oder transformiert oder transfiziert). Der Vektor kann beispielsweise in Form eines Plasmids, eines Viruspartikels, eines Phagen etc. vorliegen. Die gentechnisch veränderten Wirtszellen können in herkömmlichen, dementsprechend modifizierten Nährmedien gezüchtet werden, um Promotoren zu aktivieren, Transformanten zu selektieren oder die TNF-gamma-Gene zu amplifizieren. Die Kulturbedingungen wie Temperatur, pH-Wert und dergleichen sind diejenigen, die bisher bei der für die Expression gewählten Wirtszelle verwendet wurden, und sind für den Fachmann offensichtlich.
Die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können zur Herstellung von Polypeptiden durch rekombinante Verfahren verwendet werden. Daher kann beispielsweise das Polynucleotid in irgendeinen einer Vielzahl von Expressionsvektoren zur Expression eines Polypeptids eingeschlossen sein. Derartige Vektoren schließen chromosomale, nicht-chromosomale und synthetische DNA-Sequenzen ein, z.B. Derivate von SV40; bakterielle Plasmide; Phagen-DNA; Baculovirus; Hefeplasmide; Vektoren, die von Kombinationen von Plasmiden und Phagen-DNA, Virus-DNA wie Vaccinia, Adenovirus, Geflügelpockenvirus und Pseudorabies stammen. Es kann jedoch jeder andere Vektor verwendet werden, solange er replizierbar und im Wirt lebensfähig ist.
Die geeignete DNA-Sequenz kann in den Vektor durch eine Vielfalt von Verfahren eingebaut werden. Im Allgemeinen wird die DNA in (eine) geeignete Restriktionsendonucleaseschnittstelle(n) durch im Fachgebiet bekannte Verfahren eingebaut. Derartige Verfahren und andere werden als im Anwendungsbereich des Fachmanns liegend betrachtet.
Die DNA-Sequenz im Expressionsvektor ist funktional an (eine) geeignete Expressionskontrollsequenz(en) (Promotor) gebunden, um die mRNA-Synthese zu lenken. Als repräsentative Beispiele derartiger Promotoren können erwähnt werden: der LTR- oder SV40-Promotor, der E. coli-lac- oder -trp-, der Lamda-Phagen-P_L-Promotor und andere Promotoren, von denen bekannt ist, dass sie die Expression von Genen in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen oder ihren Viren steuern. Der Expressionsvektor enthält auch eine ribosomale Bindungsstelle zur Translationsinitiation und einen Transkriptionsterminator. Der Vektor kann auch geeignete Sequenzen zur Amplifizierung der Expression einschließen.
Zusätzlich enthalten die Expressionsvektoren vorzugsweise ein oder mehrere Selektionsmarkergene, um ein phänotypisches Merkmal zur Selektion transformierter Wirtszellen wie Dihydrofolatreduktase oder Neomycin-Resistenz für die eukaryontische Zellkultur oder wie Tetracyclin- oder Ampicillin-Resistenz in E. coli bereitzustellen.
Der Vektor, der die geeignete DNA-Sequenz, wie hier vorstehend beschrieben, sowie einen geeigneten Promotor oder eine Kontrollsequenz enthält, kann verwendet werden, um einen geeigneten Wirt zu transformieren, so dass der Wirt das Protein exprimieren kann.
Als repräsentative Beispiele geeigneter Wirte können Bakterienzellen wie E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; Pilzzellen wie Hefe; Insektenzellen wie Drosophila S2 und Sf9; tierische Zellen wie CHO, COS oder Bowes-Melanom; Adenoviren; Pflanzenzellen etc. erwähnt werden. Die Wahl eines geeigneten Wirts wird aufgrund der hier gemachten Ausführungen als im Anwendungsbereich des Fachmanns liegend betrachtet.
Genauer gesagt schließt die vorliegende Erfindung auch rekombinante Konstrukte ein, die eine oder mehrere der Sequenzen umfassen, die vorstehend umfangreich beschrieben wurden. Die Konstrukte umfassen einen Vektor wie ein Plasmid oder einen viralen Vektor, in den eine erfindungsgemäße Sequenz in Vorwärts- oder Rückwärtsorientierung eingebaut wurde. In einem bevorzugten Aspekt dieser Ausführungsform umfasst das Konstrukt ferner regulatorische Sequenzen einschließlich beispielsweise eines Promotors, der funktional an die Sequenz gebunden ist. Dem Fachmann sind eine große Anzahl geeigneter Vektoren und Promotoren bekannt und sie sind im Handel erhältlich. Die folgenden Vektoren sind Beispiele. Bakteriell: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBS, pD10, Phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia). Eukaryontisch: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). Jedoch kann jedes andere Plasmid oder jeder andere Vektor verwendet werden, solange sie replizierbar und im Wirt lebensfähig sind.
Promotorbereiche können von jedem gewünschten Gen unter Verwendung von CAT (Chloramphenicol-Transferase)-Vektoren oder anderen Vektoren mit Selektionsmarkern ausgewählt werden. Zwei geeignete Vektoren sind PKK232-8 und PCM7. Besonders zu erwähnende bakterielle Promotoren schließen lacI, lacZ, T3, T7, gpt, lambda P_R, P_L und trp ein. Eukaryontische Promotoren schließen den sehr frühen CMV, HSV-Thymidinkinase, frühen und späten SV40, LTRs aus Retroviren und Maus-Metallothionein-I ein. Die Auswahl des geeigneten Vektors und Promotors liegt genau im Bereich des Fachwissens.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Wirtszellen, die die vorstehend beschriebenen Konstrukte enthalten. Die Wirtszelle kann eine höhere eukaryontische Zelle wie eine Säugerzelle sein oder eine niedrigere eukaryontische Zelle wie eine Hefezelle sein, oder die Wirtszelle kann eine prokaryontische Zelle wie eine Bakterienzelle sein. Die Einführung des Konstruktes in die Wirtszelle kann durch Calciumphosphattransfektion, DEAE-Dextran vermittelte Transfektion oder Elektroporation erfolgen (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)).
Die Konstrukte in Wirtszellen können auf herkömmliche Weise verwendet werden, um das Genprodukt zu produzieren, das von der rekombinanten Sequenz codiert wird. Alternativ können die erfindungsgemäßen Polypeptide durch herkömmliche Peptidsynthesegeräte synthetisch produziert werden.
Reife Proteine können in Säugerzellen, Hefe, Bakterien oder anderen Zellen unter der Kontrolle von geeigneten Promotoren exprimiert werden. Zellfreie Translationssysteme können unter Verwendung von RNAs, die von den DNA-Konstrukten der vorliegenden Erfindung stammen ebenfalls verwendet werden, um derartige Proteine herzustellen. Geeignete Clonierungs- und Expressionsvektoren zur Verwendung bei prokaryontischen und eukaryontischen Wirten werden von Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Zweite Auflage, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), beschrieben.
Die Transkription der DNA, die die Polypeptide der vorliegenden Erfindung codiert, durch höhere Eukaryonten wird durch den Einbau einer Enhancer-Sequenz in den Vektor erhöht. Die Enhancer sind cis-agierende DNA-Elemente, gewöhnlich von 10 bis 300 bp, die auf einen Promotor wirken, um seine Transkription zu erhöhen. Beispiele schließen den SV40-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs 100 bp bis 270 bp, einen frühen Promotor-Enhancer des Cytomegalievirus, den Polyoma-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs und Adenovirus-Enhancer ein.
Im Allgemeinen schließen rekombinante Expressionsvektoren Replikationsursprünge und Selektionsmarker ein, die die Transformation der Wirtszelle erlauben, z.B. das Ampicillin-Resistenzgen von E. coli und das TRP1-Gen von S. cerevisiae, und einen Promotor, der von einem stark exprimiertem Gen stammt, um die Transkription der stromabwärtsliegenden Struktursequenz zu lenken. Derartige Promotoren können von Operons stammen, die unter anderem glycolytische Enzyme wie 3-Phosphoglycerat-Kinase (PGK), α-Faktor, saure Phosphatase oder Hitzeschockproteine codieren. Die heterologe Struktursequenz wird im geeigneten Leserahmen mit Translationsinitiations- und Terminationssequenzen zusammengefügt und vorzugsweise mit einer Leader-Sequenz, die die Sekretion des translatierten Proteins in den periplasmatischen Raum oder das extrazelluläre Medium lenken kann. Fakultativ kann die heterologe Sequenz ein Fusionsprotein codieren, das ein N-terminales Identifizierungspeptid einschließt, das die gewünschten Merkmale verleiht, z.B. die Stabilisierung oder die vereinfachte Reinigung des exprimierten rekombinanten Produkts.
Nützliche Expressionsvektoren für die bakterielle Verwendung werden durch Einbau einer Struktur-DNA-Sequenz, die ein gewünschtes Protein codiert, zusammen mit geeigneten Translationsinitatiations- und Terminationssignalen in einem funktionierenden Leserahmen mit einem funktionalen Promotor konstruiert. Der Vektor umfasst einen oder mehrere phänotypisch selektierbare Marker und einen Replikationsursprung, um die Aufrechterhaltung des Vektors sicherzustellen und, falls gewünscht, die Amplifizierung im Wirt bereitzustellen. Geeignete prokaryontische Wirte zur Transformation schließen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene Spezies innerhalb der Gattungen Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus ein, obwohl wahlweise andere verwendet werden können.
Als repräsentatives, aber nicht begrenzendes Beispiel können nützliche Expressionsvektoren für die bakterielle Verwendung einen selektierbaren Marker und einen bakteriellen Replikationsursprung umfassen, die von im Handel erhältlichen Plasmiden stammen, die genetische Elemente des gut bekannten Clonierungsvektors pBR322 (ATCC 37017) enthalten. Derartige im Handel erhältliche Vektoren schließen beispielsweise pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA) ein. Diese pBR322-„Rückgrat"-Abschnitte werden mit einem geeigneten Promotor und der zu exprimierenden Struktursequenz kombiniert.
Nach der Transformation eines geeigneten Wirtsstammes und der Züchtung des Wirtsstamms zu einer geeigneten Zelldichte wird der gewählte Promotor durch geeignete Mittel induziert (z.B. Temperaturänderung oder chemische Induktion), und die Zellen werden für einen zusätzlichen Zeitraum gezüchtet.
Die Zellen werden typischerweise durch Zentrifugation geerntet, durch physikalische oder chemische Mittel aufgebrochen, und der sich ergebende Rohextrakt wird für weitere Reinigung aufbewahrt.
Die mikrobiellen Zellen, die bei der Expression der Proteine verwendet werden, können durch jedes geeignete Verfahren aufgebrochen werden, einschließlich Einfrier-Auftau-Zyklus, Ultraschall, mechanisches Aufbrechen oder die Verwendung von zelllysierenden Agenzien, wobei derartige Verfahren dem Fachmann gut bekannt sind.
Verschiedene Säugerzellkultursysteme können ebenfalls verwendet werden, um rekombinantes Protein zu exprimieren. Beispiele von Säugerexpressionsystemen schließen die von Gluzman, Cell, 23: 175 (1981) beschriebenen COS-7-Linien der Affennierenfibroblasten und andere Zelllinien ein, die einen kompatiblen Vektor exprimieren können, beispielsweise die C127-, 3T3-, CHO-, HeLa- und BHK-Zelllinien. Säuger-Expressionsvektoren umfassen einen Replikationsursprung, einen geeigneten Promotor und Enhancer und auch alle notwenigen ribosomalen Bindungsstellen, eine Polyadenylierungsstelle, Spleiß-donor- und -akzeptorstellen, Transkriptionsterminationssequenzen und flankierende nicht-translatierte 5'-Sequenzen. DNA-Sequenzen, die von der SV-40-Spleißstelle stammen, und Polyadenylierungsstellen können verwendet werden, um die erforderlichen nicht-transkribierten genetischen Elemente bereitzustellen.
Die TNF-gamma-Polypeptide können aus rekombinanten Zellkulturen durch Verfahren einschließlich Ammoniumsulfat- oder Ethanolfällung, Säureextraktion, Anionen- oder Kationenaustauschchromatographie, Phosphocellulosechromatographie, hydrophobe Chromatographie, Affinitäts-chromatographie, Hydroxylapatitchromatographie und Lektinchromatographie gewonnen und gereinigt werden. Es können gegebenenfalls Proteinrückfaltungsschritte zur Vervollständigung der Konfiguration des reifen Proteins durchgeführt werden. Schließlich kann Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) für die Endreinigungsschritte verwendet werden.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können ein natürlich gereinigtes Produkt oder ein Produkt aus chemisch-synthetischen Verfahren sein oder durch rekombinante Verfahren aus einem prokaryontischen oder eukaryontischen Wirt (beispielsweise aus bakteriellen, Hefe-, höheren Pflanzen-, Insekten- und Säugerzellen in Kultur) produziert werden. Abhängig von dem in einem rekombinanten Herstellungsverfahren verwendeten Wirt können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung glycosyliert sein oder nicht-glycosyliert sein. Erfindungsgemäße Polypeptide können auch einen Anfangsmethioninrest einschließen.
Das TNF-gamma-Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um Tumorzellwachstum oder Neoplasie zu hemmen. Das TNF-gamma-Polypeptid kann für die Tumorzerstörung durch Apoptose verantwortlich sein, die durch Membran-Blebbin (Zeiose), Kondensierung des Cytoplasmas und die Aktivierung endogener Endonuclease charakterisiert ist (7). Wie in Tabelle 1 gezeigt, besitzt TNF-gamma eine starke cytotoxische Aktivität für die getesteten Zelllinien, die eine anormale Zellproliferation und -Regulation aufweisen, beispielsweise die Fibrosarkom- und Karzinomzelllinie. Dies ist auch in 6A, 6B und 8 dargestellt, bei denen gezeigt wird, dass TNF-gamma die Fähigkeit besitzt, L929- und WEHT 164-Zellwachstum durch cytotoxische Aktivität zu hemmen. WEHT 164-Zellen sind Maus-Fibrosarkomzellen. Ein bevorzugtes Verfahren der Verabreichung von TNF-gamma beinhaltet die direkte Injektion in den Tumor.
Die Zelladhäsionaktivität von TNF-gamma kann für die Wundheilung verwendet werden. Wie in Tabelle 1 und 9 dargestellt, besitzt TNF-gamma eine starke Proliferationswirkung auf Endothelzellen, was ein Zeichen dafür ist, dass TNF-gamma eine Rolle bei der Wundheilung spielt. Die Zelladhäsionswirkungen von TNF-gamma können auch eine Rolle bei der Wundheilung spielen.
TNF-gamma kann auch verwendet werden, um Krankheiten zu behandeln, die eine wachstumsfördernde Aktivität erfordern, beispielsweise Restenose. Wie vorstehend angegeben, wird gezeigt, dass TNF-gamma starke Proliferationswirkungen auf das Endothelzellwachstum besitzt. Demnach kann TNF-gamma auch verwendet werden, um die Hämatopoese und Endothelzellentwicklung zu regulieren.
Das TNF-gamma-Polypeptid ist durch seine Fähigkeit, die Aktivierung von T-Zellen zu stimulieren, ein wichtiger Mediator der Immunantwort. Demnach kann dieses Polypeptid verwendet werden, eine Immunantwort gegen eine Vielzahl von parasitären, bakteriellen und viralen Infektionen zu stimulieren. TNF-gamma kann virusinfizierte Zellen lysieren und daher verwendet werden, um HIV-infizierte Zellen zu behindern.

Das TNF-gamma-Polypeptid kann auch verwendet werden, um Autoimmunkrankheiten wie Typ I-Diabetes durch Erhöhung der T-Zellproliferationsantwort zu behandeln. Tabelle 1 Zusammenfassung der TNF-gamma-Aktivität

Zelllinien	Quelle und Typ	Aktivität
Zelllinien	Quelle und Typ	Cytotoxizität	Proliferation	Differenzierung	Adhäsion
L929	Maus-Fibroblast	+	–	–	–
WEHI 164	Maus-Fibrosarkom	+++	–	–	–
NRK-54E	Rattenniere epithelartig	+	–	–	–
THP-1	menschliche Monocyten-Leukämie	+	–	++	++
HL-60	menschliche Promyelocyten-Leukämie	–	–	–	++
Raji	menschliches Burkitt-Lymphom	–	–	–	–
Jurkat	menschliche T-Zell-Leukämie	++	–	–	–
Primär	menschliche Venenendothelzellen	–	++	–	?
Primär	menschliche Arterienendothelzellen	+*	++	–	?
A-431	menschliches epidermoides Karzinom	++	–	–	–
293	menschliche embryonale Niere	–	++	–	–

* Nur bei hoher Dosierung. Die Anzahl der + gibt den relativen Aktivitätsspiegel an. – gibt keine nachgewiesene Aktivität in dem getesteten Konzentrationsbereich an.

Die Polynucleotide und Polypeptide der vorliegenden Erfindung können als Forschungsreagenzien und Materialen zum Finden von Behandlungen und von Diagnostika von Krankheiten des Menschen verwendet werden.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Identifizierung des Rezeptors für TNF-gamma bereit. Das Gen, das den Rezeptor codiert, kann durch zahlreiche, dem Fachmann bekannte Verfahren, beispielsweise Liganden-Panning und FACS-Sortierung identifiziert werden (Coligan, et al., Current Protocols in Immun., 1 (2), Kapitel 5, (1991)). Vorzugsweise wird die Expressionsclonierung verwendet, wobei polyadenylierte RNA aus einer Zelle hergestellt wird, die auf TNF-gamma reagiert, und eine cDNA-Genbank, die aus dieser RNA hergestellt wird, wird in Pools aufgeteilt und verwendet, um COS-Zellen oder andere Zellen zu transfizieren, die nicht auf TNF-gamma reagieren. Transfizierte Zellen, die auf Objektträgern gezüchtet werden, werden markiertem TNF-gamma ausgesetzt. TNF-gamma kann durch eine Vielfalt von Mitteln einschließlich Jodierung oder Einschluss einer Erkennungsstelle für eine ortspezifische Proteinkinase markiert werden. Nach der Fixierung und Inkubation werden die Objektträger einer Autoradiographieanalyse unterzogen. Positive Pools werden identifiziert und Subpools werden unter Verwendung eines sich wiederholenden Verfahrens der Subpoolbildung und erneuten Durchmusterung hergestellt und erneut transfiziert, so dass sich schließlich ein Einzelclon ergibt, der den vermeintlichen Rezeptor codiert.
Als alternativer Ansatz für die Rezeptoridentifizierung kann markiertes TNF-gamma mit der Zellmembran oder Extraktzubereitungen, die das Rezeptormolekül exprimieren, über Photoaffinität vernetzt werden. Vernetztes Material wird durch PAGE aufgelöst und einem Röntgenfilm ausgesetzt. Der markierte Komplex, der den TNF-gamma-Rezeptor enthält, kann ausgeschnitten, in Peptidfragmente aufgelöst und einer Proteinmikrosequenzierung unterzogen werden. Die aus der Mikrosequenzierung erhaltene Aminosäuresequenz würde verwendet werden, um eine Reihe von degenerierten Oligonucleotidsonden zur Durchmusterung einer cDNA-Genbank zu konstruieren, um das Gen zu identifizieren, das den vermeintlichen Rezeptor codiert.
TNF-gamma bindet nicht signifikant an zwei lösliche TNF-Rezeptoren, sTNF-RI (p55) und sTNF-RII (p75). Demnach kann TNF-gamma Aktivitäten einschließlich denen bekannter TNF-Proteine und zusätzlich zu denen bekannter TNF-Proteine aufweisen (vgl. 11).
Ferner wird hier ein Verfahren zur Durchmusterung von Verbindungen offenbart, um diejenigen zu identifizieren, die TNF-gamma nachahmen (Agonisten) oder die Wirkung von TNF-gamma verhindern. Ein Beispiel eines derartigen Verfahrens nutzt die Fähigkeit von TNF-gamma, die Proliferation der menschlichen Endothelzellen in Gegenwart des Comitogens Con A zu stimulieren.
Die Endothelzellen werden erhalten und in flachbödigen Kulturplatten mit 96 Vertiefungen (Costar, Cambridge, MA) in RPM1 1640, ergänzt mit 10% hitze inaktiviertem fötalem Rinderserum (Hyclone Labs, Logan, UT), 1% L-Glutamin, 100 E/ml Penicillin, 100 μg/ml Steptomycin, 0,1% Gentamycin (Gibco Life Technologies, Grand Island, NY), in Gegenwart von 2 μg/ml Con-A (Calbiochem, La Jolla, KA) gezüchtet. Con-A und die zu durchmusternde Verbindung werden zu einem Endvolumen von 0,2 ml zugegeben. Nach 60 h bei 37°C werden die Kulturen mit 1 μCi [³H]-Thymidin (5 Ci/mMol; 1 Ci = 37 BGq; NEN) 12-18 h gepulst und auf Glasfaserfiltern (PhD; Cambridge Technology, Watertown, MA) geerntet. Der mittlere [³H]-Thymidin-Einbau (ZpM; Zählimpulse pro Minute) der dreifach angesetzten Kulturen wird unter Verwendung eines Flüssigkeitsszintillationszählers (Beckman Instruments, Irvine, KA) bestimmt. Ein signifikanter [³H]-Thymidin-Einbau zeigt die Stimulierung der Endothelzellproliferation.
Alternativ würde man die Reaktion eines bekannten zweiten Botensystems nach der Interaktion von TNF-gamma und des Rezeptors messen und in Gegenwart oder Abwesenheit der Verbindung vergleichen. Derartige zweite Botensysteme schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf cAMP-Guanylatcyclase, Ionenkanäle oder Phosphoinositid-Hydrolyse.
Um auf Antagonisten zu testen, wird der vorstehend beschriebene Test durchgeführt, jedoch wird in diesem Test TNF-gamma zusammen mit der zu durchmusternden Verbindung zugegeben, und die Fähigkeit der Verbindung, den [³H]-Thymidin-Einbau in Gegenwart von TNF-gamma zu hemmen, zeigt, dass die Verbindung ein Antagonist zu TNF-gamma ist. Alternativ können TNF-gamma-Antagonisten durch Kombinieren von TNF-gamma und einem potentiellen Antagonisten mit membrangebundenen TNF-gamma-Rezeptoren oder rekombinanten Rezeptoren unter geeigneten Bedingungen für einen kompetitiven Inhibitionstest nachgewiesen werden. TNF-gamma kann z.B. durch Radioaktivität markiert werden, so dass die Anzahl der an den Rezeptor gebundenen TNF-gamma-Moleküle die Wirksamkeit des potenziellen Antagonisten bestimmen kann.
Alternativ wird eine Säugerzelle oder eine Membranzubereitung, die den TNF-gamma-Rezeptor exprimiert, mit markiertem TNF-gamma in Gegenwart der Verbindung inkubiert. Die Fähigkeit der Verbindung, diese Interaktion zu erhöhen oder zu blockieren, könnte dann gemessen werden.
Als Antagonisten können für TNF-gamma spezifische Antikörper verwendet werden, indem sie an TNF-gamma binden und ihn daran hindern, an seinen Rezeptor zu binden. Monoclonale Antikörper sind in dieser Hinsicht besonders effektiv. Für den TNF-gamma-Rezeptor spezifische Antikörper können jedoch verschiedene zelluläre Reaktionen vermitteln, die dazu neigen, die Wirkungen von TNF-gamma bei der Interaktion mit seinem Rezeptor zu agonisieren.
Potenzielle TNF-gamma-Antagonisten schließen auch TNF-gamma-Mutanten ein, die an den TNF-gamma-Rezeptor binden und keine zweite Botenreaktion hervorrufen, um den Rezeptor von seinem natürlichen Liganden wirksam abzublocken. Spezifisch konstruierte Oligonucleotide und kleine Moleküle können auch an den TNF-gamma-Rezeptor binden und ihn von TNF-gamma abblocken. Beispiele kleiner Moleküle schließen ein, sind aber nicht auf kleine Peptide oder peptidartige Moleküle begrenzt.
Ein weiterer potenzieller TNF-gamma-Antagonist ist eine lösliche Form des TNF-gamma-Rezeptors, der an TNF-gamma bindet und ihn daran hindert, mit membrangebundenen TNF-gamma-Rezeptoren zu interagieren. Auf diese Weise werden die Rezeptoren nicht durch TNF-gamma stimuliert.
Ein weiterer potenzieller TNF-gamma-Antagonist ist ein Antisense-Konstrukt, das unter Verwendung von Antisense-Technologie hergestellt wird. Antisense-Technologie kann verwendet werden, um die Genexpression über die Bildung einer Dreifachhelix oder durch Antisense-DNA oder -RNA zu kontrollieren, wobei beide Verfahren auf der Bindung eines Polynucleotids an DNA oder RNA basieren. Beispielsweise wird der codierende 5'-Teil der Polynucleotidsequenz, die die reifen Polypeptide der vorliegenden Erfindung codiert, verwendet, um ein Antisense-RNA-Oligonucleotid von einer Länge von 10 bis 40 Basenpaaren zu konstruieren. Ein DNA-Oligonucleotid wird konstruiert, so dass es zu dem an der Transkription beteiligten Region des Gens komplementär ist (Dreifachhelix – vgl. Lee et al., Nucl. Acids Res., 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456 (1988); und Dervan et al., Science, 251: 1360 (1991)), so dass die Transkription und Produktion von TNF-gamma verhindert werden. Das Antisense-RNA-Oligonucleotid hybridisiert mit der mRNA in vivo und blockiert die Translation des mRNA-Moleküls in das TNF-gamma-Polypeptid (Antisense – Okano, J. Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)). Die vorstehend beschriebenen Oligonucleotide können auch an Zellen verabreicht werden, so dass die Antisense-RNA oder Antisense-DNA in vivo exprimiert werden kann, um die Produktion von TNF-gamma zu hemmen.
TNF-Antagonisten können ebenfalls verwendet werden, um Kachexie zu behandeln, die ein Lipid-klärender Defekt ist, der auf einen systemischen Mangel an Lipoproteinlipase zurückzuführen ist, die von TNF-gamma supprimiert wird. Die TNF-gamma-Antagonisten werden auch verwendet, um cerebrale Malaria zu behandeln, bei der TNF-gamma eine pathogene Rolle zu spielen scheint. Die Antagonisten können auch verwendet werden, um rheumatoide Arthritis zu behandeln, indem die TNF-gamma induzierte Produktion von inflammatorischen Cytokinen wie IL-1 in den synovialen Zellen gehemmt wird. Bei der Behandlung von Arthritis wird TNF-gamma vorzugsweise intraartikulär injiziert.
Die TNF-gamma-Antagonisten können auch verwendet werden, um die Transplantatabstoßung zu verhindern, indem die Stimulierung des Immunsystems in Gegenwart eines Transplantats durch TNF-gamma verhindert wird.
Die TNF-gamma-Antagonisten können auch verwendet werden, um Osteoporose zu behandeln, da TNF-gamma die Knochenresorption induzieren kann.
Die TNF-gamma-Antagonisten können auch als Anti-Entzündungsreagenzien verwendet werden, da TNF-gamma eine erhöhte inflammatorische Reaktion vermittelt.
Die Antagonisten können auch verwendet werden, um endotoxischen Schock zu behandeln, der auch als septischer Schock bezeichnet wird. Dieser kritische Zustand ist auf eine übertriebene Reaktion auf eine bakterielle Infektion oder andere Arten von Infektionen zurückzuführen. Diese Reaktion führt zu erhöhten TNF-gamma-Spiegeln, die Schock und Gewebeverletzung verursachen.
Die Antagonisten können in einer Zusammensetzung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger verwendet werden, z.B. wie hier nachstehend beschrieben.
Fragmente des TNF-gamma-Gens mit der gesamten Länge können als Hybridisierungssonde für eine cDNA-Genbank verwendet werden, um das Gen mit der gesamten Länge zu isolieren und um andere Gene zu isolieren, die eine hohe Sequenzähnlichkeit mit dem Gen oder ähnliche biologische Aktivität besitzen. Sonden dieser Art können beispielsweise zwischen 20 und 2000 Basen besitzen. Vorzugsweise besitzen die Sonden zwischen 30 und 50 Basenpaare. Die Sonde kann auch verwendet werden, um einen cDNA-Clon, der einem Transkript mit der gesamten Länge entspricht, und einen genomischen Clon oder Clone zu identifizieren, die das vollständige TNF-gamma-Gen einschließlich regulatorischer und Promotorregionen, Exons und Introns enthalten. Ein Beispiel einer Durchmusterung umfasst die Isolierung der codierenden Region des TNF-gamma-Gens, indem die bekannte DNA-Sequenz verwendet wird, um eine Oligonucleotidsonde zu synthetisieren. Die markierten Oligonucleotide mit einer Sequenz, die zu derjenigen des Gens der vorliegenden Erfindung komplementär ist, werden verwendet, um eine Bank aus menschlicher cDNA, genomischer DNA oder mRNA zu durchmustern, um zu bestimmen, mit welchen Mitgliedern der Bank die Sonde hybridisieren.
Die TNF-gamma-Polypeptide und Antagonisten der vorliegenden Erfindung und die hier beschriebenen Agonisten können in Kombination mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger verwendet werden. Derartige Zusammensetzungen umfassen eine therapeutisch wirksame Menge der Verbindung und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Excipienten. Ein derartiger Träger schließt ein, ist jedoch nicht begrenzt auf Salzlösung, gepufferte Salzlösung, Dextrose, Wasser, Glycerin, Ethanol und Kombinationen davon. Die Formulierung sollte für die Verabreichungsart geeignet sein.
Die Erfindung schließt auch eine pharmazeutische Packung oder einen Kit ein, der einen oder mehrere Behälter umfasst, die mit einem oder mehreren Inhaltsstoffen der erfindungsgemäßen Arzneimittel gefüllt sind. Mit (einem) derartigen Behälter(n) kann ein Hinweis in der Form assoziiert sein, die von einer Regierungsbehörde vorgeschrieben ist, um die Herstellung, die Verwendung oder den Verkauf von Pharmazeutika oder biologischen Produkten zu regeln, wobei der Hinweis die Genehmigung der Behörde hinsichtlich der Herstellung, der Verwendung oder des Verkaufs für die Verabreichung beim Menschen widerspiegelt. Zusätzlich können die Arzneimittel der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit anderen therapeutischen Verbindungen verwendet werden.
Die Arzneimittel können in geeigneter Weise wie auf topischen, intravenösen, intraperitonealen, intramuskulären, subkutanen, intranasalen oder intradermalen Wegen verabreicht werden. Die Arzneimittel werden in einer Menge verabreicht, die zur Behandlung und/oder Prophylaxe der spezifischen Indikation wirksam ist. Im Allgemeinen werden sie in einer Menge von mindestens etwa 10 μg/kg Körpergewicht verabreicht und in den meisten Fällen werden sie in einer Menge verabreicht, die etwa 8 mg/kg Körpergewicht pro Tag nicht übersteigt. In den meisten Fällen liegt die Dosierung in einem Bereich von etwa 10 μg/kg bis etwa 1 mg/kg Körpergewicht täglich, wobei die Verabreichungswege, Symptome etc. berücksichtigt werden.
Die TNF-gamma-Polypeptide und Agonisten und Antagonisten, die Polypeptide sind, können nach der vorliegenden Erfindung auch durch Expression derartiger Polypeptide in vivo verwendet werden, was häufig als „Gentherapie" bezeichnet wird.
So können beispielsweise Zellen aus einem Patienten mit einem Polynucleotid (DNA oder RNA) verändert werden, das ein Polypeptid ex vivo codiert, wobei die veränderten Zellen dann einem Patienten bereitgestellt werden, der mit dem Polypeptid behandelt werden soll. Derartige Verfahren sind im Fachgebiet gut bekannt und sind aufgrund der hier gemachten Ausführungen offensichtlich. Beispielsweise können die Zellen durch Verwendung eines retroviralen Partikels hergestellt werden, das RNA enthält, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert.
Auf ähnliche Weise können die Zellen in vivo zur Expression eines Polypeptids in vivo beispielsweise durch im Fachgebiet bekannte Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise kann eine Produzentenzelle zur Produktion eines retroviralen Partikels, das RNA enthält, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, einem Patienten zur Veränderung von Zellen in vivo und zur Expression des Polypeptids in vivo verabreicht werden. Diese und andere Verfahren zur Verabreichung eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung durch ein derartiges Verfahren sollten dem Fachmann aufgrund der hier gemachten Ausführungen offensichtlich sein. Beispielsweise kann das Expressionsvehikel zur Veränderung von Zellen ein anderes sein als ein Retrovirus, beispielsweise ein Adenovirus, das verwendet werden kann, um Zellen in vivo nach der Kombination mit einem geeigneten Verabreichungsvehikel herzustellen.
Diese Erfindung betrifft auch die Verwendung des TNF-gamma-Gens als Teil eines diagnostischen Tests zum Nachweis von Krankheiten oder Anfälligkeiten für Krankheiten, die mit dem Vorliegen von mutiertem TNF-gamma im Zusammenhang stehen. Derartige Erkrankungen stehen mit der Unterexpression von TNF-gamma in Zusammenhang, beispielsweise die abnormale Zellproliferation wie Tumore und Krebsarten.
Individuen, die Mutationen im menschlichen TNF-gamma-Gen tragen, können auf DNA-Ebene durch eine Vielzahl von Techniken nachgewiesen werden. Nucleinsäuren zur Diagnose können von Zellen eines Patienten wie aus Blut, Urin, Speichel, Gewebebiopsie- und Autopsiematerial erhalten werden. Die genomische DNA kann direkt für den Nachweis verwendet werden oder kann enzymatisch unter Verwendung von PCR vor der Analyse amplifiziert werden (Saiki et al., Nature, 324: 163-166 (1986)). RNA oder cDNA kann auch für denselben Zweck verwendet werden. Als Beispiel können zur TNF-gamma codierenden Nucleinsäure komplementäre PCR-Primer verwendet werden, um TNF-gamma-Mutationen zu identifizieren und zu analysieren. Beispielsweise können Deletionen und Insertionen durch eine Größenänderung des amplifizierten Produkts im Vergleich zum normalen Genotyp nachgewiesen werden. Punktmutationen können durch Hybridisieren von amplifizierter DNA mit radiomarkierter TNF-gamma-RNA oder alternativ mit radiomarkierten TNF-gamma-Antisense-DNA-Sequenzen identifiziert werden. Ideal gepaarte Sequenzen können von fehlgepaarten Duplexmolekülen durch RNase A-Spaltung oder durch Unterschiede in den Schmelztemperaturen nachgewiesen werden.
Genetisches Testen basierend auf DNA-Sequenzunterschieden kann durch den Nachweis der Änderung in der elektrophoretischen Mobilität von DNA-Fragmenten in Gelen mit oder ohne denaturierende Mittel erfolgen. Kleine Sequenzdeletionen und -Insertionen können durch hoch auflösende Gelelektrophorese sichtbar gemacht werden. DNA-Fragmente von verschiedenen Sequenzen können auf denaturierenden Formamidin-Gradientengelen unterschieden werden, bei denen die Mobilitäten von verschiedenen DNA-Fragmenten im Gel bei bestimmten Positionen gemäß ihren spezifischen Schmelz- oder Teilschmelztemperaturen verzögert werden (vgl. z.B. Myers et al., Science, 230: 1242 (1985)).
Sequenzänderungen an spezifischen Stellen können auch durch Nucleaseschutz-Tests wie RNase- und S1-Schutz oder chemische Spaltungsverfahren (z.B. Cotton et al., PNAS, USA, 85: 4397-4401 (1985)) aufgedeckt werden.
Daher kann der Nachweis einer spezifischen DNA-Sequenz durch Verfahren wie Hybridisierung, RNase-Schutz, chemische Spaltung, direkte DNA-Sequenzierung oder Verwendung von Restriktionsenzymen (z.B. Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP)) und Southern-Blot-Analyse der genomischen DNA erreicht werden.
Zusätzlich zu einer herkömmlicheren Gelelektrophorese und DNA-Sequenzierung können Mutationen auch in der in-situ-Analyse nachgewiesen werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen diagnostischen in-vitro-Test zum Nachweis von veränderten Spiegeln des TNF-gamma-Proteins in verschiedenen Geweben, da eine Überexpression der Proteine im Vergleich zu normalen Kontrollgewebeproben das Vorhandensein einer Krankheit oder einer Anfälligkeit für eine Krankheit, beispielsweise Tumore und cerebrale Malaria, nachweisen kann. Tests, die verwendet werden, um TNF-gamma-Proteinspiegel in einer von einem Wirt stammenden Probe nachzuweisen, sind dem Fachmann gut bekannt und schließen Radioimmuntests, kompetitive Bindungstests, Western-Blot-Analyse, ELISA-Tests und den „Sandwich"-Test ein. Ein ELISA-Test (Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1(2), Kapitel 6, (1991)) umfasst zuerst die Herstellung eines für das TNF-gamma-Antigen spezifischen Antikörpers, vorzugsweise eines monoclonalen Antikörpers. Zusätzlich wird ein Reporterantikörper gegen den monoclonalen Antikörper hergestellt. An den Reporterantikörper wird ein Nachweisreagenz gebunden, wie Radioaktivität, Fluoreszenz oder in diesem Beispiel Meerrettichperoxidase-Enzym. Einem Wirt wird nun eine Probe entnommen und auf einem festen Träger, z.B. einer Polystyrolschale, inkubiert, die die Proteine in der Probe bindet. Jegliche freien Proteinbindestellen auf der Schale werden dann bedeckt, indem mit einem unspezifischen Protein wie BSA inkubiert wird. Anschließend wird der monoclonale Antikörper in der Schale inkubiert; in dieser Zeit binden die monoclonalen Antikörper an alle an die Polystyrolschale gebundenen TNF-gamma-Proteine. Alle nicht-gebundenen monoclonalen Antikörper werden mit Puffer ausgewaschen. Der an die Meerrettichperoxidase gebundene Reporterantikörper wird nun in die Schale gegeben, was zur Bindung des Reporterantikörpers an jeden monoclonalen, an TNF-gamma gebundenen Antikörper führt. Nicht-gebundener Reporterantikörper wird dann ausgewaschen. Die Peroxidase-Substrate werden dann der Schale zugegeben und die Farbmenge, die sich in einem bestimmten Zeitraum entwickelt hat, ist ein Maß für die TNF-gamma-Proteinmenge, die in einem bestimmten Volumen einer Patientenprobe vorliegt, wenn sie mit einer Standardkurve verglichen wird.
Ein Kompetitionstest kann verwendet werden, wobei die für TNF-gamma spezifischen Antikörper an einen festen Träger gebunden werden und markiertes TNF-gamma und eine vom Wirt stammende Probe über den festen Träger geschickt werden, und die beispielsweise durch Flüssigkeitsszintillationschromatographie nachgewiesene Menge der Markierung mit einer TNF-gamma-Menge in der Probe korreliert werden kann.
Ein „Sandwich"-Test ähnelt einem ELISA-Test. Bei einem „Sandwich"-Test wird TNF-gamma über einen festen Träger gegeben und bindet den an den festen Träger gebundenen Antikörper. Ein zweiter Antikörper wird dann an den TNF-gamma gebunden. Ein dritter Antikörper, der markiert ist und für den zweiten Antikörper spezifisch ist, wird dann über den festen Träger gegeben und bindet den zweiten Antikörper, und dann kann eine Menge quantifiziert werden.
Die Sequenzen der vorliegenden Erfindung sind auch für die Chromosomenidentifizierung wertvoll. Die Sequenz wird spezifisch an einen bestimmten Ort auf einem einzelnen menschlichen Chromosom gelenkt und kann damit hybridisieren. Außerdem gibt es einen aktuellen Bedarf zur Identifizierung bestimmter Orte auf dem Chromosom. Es stehen derzeit wenige Chromosomen markierende Reagenzien, die auf aktuellen Sequenzdaten (Wiederholungspolymorphismus) basieren, zur Markierung eines Chromosomenortes zur Verfügung. Die Kartierung der DNAs auf Chromosomen nach der vorliegenden Erfindung ist ein wichtiger erster Schritt bei der Korrelation jener Sequenzen mit Genen, die mit einer Krankheit assoziiert sind.
Kurz gesagt können Sequenzen auf Chromosomen durch Herstellung von PCR-Primern (vorzugsweise 15-25 bp) aus der cDNA kartiert werden. Die Computeranalyse der nicht-translatierten 3'-Region der Sequenz wird verwendet, um schnell Primer zu selektieren, die nicht mehr als ein Exon in der genomischen DNA umfassen, so dass daher der Amplifizierungsprozess erschwert wird. Diese Primer werden dann für die PCR-Durchmusterung von somatischen Zellhybriden verwendet, die einzelne menschliche Chromosomen enthalten. Nur jene Hybride, die das menschliche Gen enthalten, das dem Primer entspricht, ergeben ein amplifiziertes Fragment.
Die PCR-Kartierung der somatischen Zellhybride ist ein schnelles Verfahren zur Zuordnung einer bestimmten DNA zu einem bestimmten Chromosom. Unter Verwendung der vorliegenden Erfindung mit denselben Oligonucleotidprimern kann eine Sublokalisierung mit Fragmentreihen aus spezifischen Chromosomen oder Pools großer genomischer Clone auf eine analoge Weise erreicht werden. Andere Kartierungsstrategien, die auf ähnliche Weise genutzt werden können, um sein Chromosom zu kartieren, schließen in-situ-Hybridisierung, Vordurchmustern mit markierten, durchflusssortierten Chromosomen und die Vorauswahl durch Hybridiserung ein, um Chromosomen-spezifische cDNA-Genbanken zu konstruieren.
Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) eines cDNA-Clons auf einen chromosomalen Metaphasen-Ausstrich kann verwendet werden, um in einem Schritt eine genaue chromosomale Lokalisierung bereitzustellen. Dieses Verfahren kann mit cDNA verwendet werden, die so kurz wie 500 oder 600 Basen ist; jedoch besitzen Clone, die größer als 2.000 bp sind, eine höhere Bindungswahrscheinlichkeit an einen einzigartigen Chromosomenort mit genügend Signalintensität für den einfachen Nachweis. FISH erfordert die Verwendung der Clone, von denen die exprimierte sequenzmarkierte Stelle (EST) stammte, und je länger, desto besser. Beispielsweise sind 2.000 bp gut, 4.000 sind besser, und mehr als 4.000 sind wahrscheinlich nicht notwendig, um gute Ergebnisse in einem vernünftigen Zeitraum zu erhalten. Für einen Überblick zu dieser Technik vgl. Verma et al., Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon, Press, New York (1988).
Wenn eine Sequenz einmal auf einem präzisen Chromosomenort kartiert wurde, kann die physikalische Position der Sequenz auf dem Chromosom mit den Daten der genetischen Karte korreliert werden. Derartige Daten findet man beispielsweise bei V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (erhältlich online über Johns Hopkins University Welch Medical Library). Die Beziehung zwischen Genen und Krankheiten, die auf demselben Chromosomenort kartiert wurden, werden dann durch Kopplungsanalyse (gemeinsame Vererbung von physikalisch benachbarten Genen) identifiziert.
Anschließend ist es erforderlich, die Unterschiede bei der cDNA oder den genomischen Sequenzen zwischen betroffenen und nicht betroffenen Individuen zu bestimmen. Falls eine Mutation in einigen oder allen betroffenen Individuen, jedoch in keinem normalen Individuum beobachtet wird, dann ist die Mutation wahrscheinlich das verursachende Agens der Krankheit.
Mit der derzeitigen Auflösung der physikalischen Kartierung und den genetischen Kartierungsverfahren könnte eine cDNA, die auf einer mit der Krankheit assoziierten chromosomalen Region präzise zugeordnet wird, eine sein, die zwischen 50 und 500 potenzielle verursachende Gene aufweist. (Dies setzt eine Kartierungsauflösung von einer Megabase und ein Gen pro 20 kb voraus.)
Die Polypetide, ihre Fragmente oder anderen Derivate oder Analoga davon oder Zellen, die sie exprimieren, können als Immunogen verwendet werden, um dagegen Antikörper zu produzieren. Diese Antikörper können beispielsweise polyclonale oder monoclonale Antikörper sein. Die vorliegende Erfindung schließt auch chimäre, Einzelketten- und humanisierte Antikörper sowie Fab-Fragmente oder das Produkt einer Fab-Expressionsgenbank ein. Verschiedene, im Fachgebiet bekannte Verfahren können für die Herstellung derartiger Antikörper und Fragmente verwendet werden.
Antikörper, die gegen die Polypeptide erzeugt wurden, die einer Sequenz der vorliegenden Erfindung entsprechen, können durch direkte Injektion der Polypetide in ein Tier oder durch Verabreichung der Polypetide an ein Tier, vorzugsweise ein nicht-menschliches erhalten werden. Der so erhaltene Antikörper bindet dann die Polypeptide selbst. Auf diese Weise kann sogar eine Sequenz, die nur ein Fragment der Polypeptide codiert, verwendet werden, um Antikörper zu erzeugen, die die ganzen nativen Polypeptide binden. Derartige Antikörper können dann verwendet werden, um das Polypeptid aus Gewebe zu isolieren, das jenes Polypeptid exprimiert.
Zur Herstellung monoclonaler Antikörper kann jedes Verfahren verwendet werden, das Antikörper bereitstellt, die durch kontinuierliche Zelllinienkulturen produziert werden. Beispiele schließen das Hybridomverfahren (Köhler und Milstein, 1975, Nature, 256: 495-497), das Triom-Verfahren, das menschliche B- Zell-Hybridomverfahren (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72), das EBV Hybridomverfahren (Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., S. 77-96) ein, um menschliche monoclonal Antikörper zu erzeugen.
Zur Herstellung von Einzelkettenantikörpern beschriebene Verfahren ( US-Patent 4,946,778 ) können angepasst werden, um Einzelkettenantikörper gegen immunogene Polypeptidprodukte dieser Erfindung zu produzieren. Es können auch transgene Mäuse verwendet werden, um humanisierte Antikörper gegen immunogene Polypeptidprodukte dieser Erfindung zu exprimieren.
Die vorliegende Erfindung wird ferner unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben; jedoch sollte klar sein, dass die vorliegende Erfindung nicht auf derartige Beispiele begrenzt ist. Alle Teile oder Mengen, sofern nicht anders spezifiziert, sind nach Gewicht angegeben.
Um das Verständnis der folgenden Beispiele zu erleichtern, werden bestimmte, häufig auftretende Verfahren und/oder Begriffe beschrieben.
„Plasmide" werden mit einem kleinen p bezeichnet, dem Großbuchstaben und/oder Zahlen vorangestellt sind und/oder folgen. Die hier aufgeführten Ausgangsplasmide sind entweder im Handel erhältlich, öffentlich auf einer uneingeschränkten Basis erhältlich oder können aus zur Verfügung stehenden Plasmiden nach veröffentlichten Verfahren konstruiert werden. Außerdem sind äquivalente Plasmide zu den beschriebenen im Fachgebiet bekannt und sind für den Fachmann offensichtlich.
„Verdau" einer DNA bezieht sich auf die katalytische Spaltung der DNA mit einem Restriktionsenzym, das nur auf bestimmte Sequenzen in der DNA wirkt. Die verschiedenen, hier verwendeten Restriktionsenzyme sind im Handel erhältlich und ihre Reaktionsbedingungen, Cofaktoren und anderen Anforderungen wurden so verwendet, wie es dem Fachmann bekannt wäre. Für analytische Zwecke wird typischerweise 1 μg Plasmid oder DNA-Fragment mit etwa 2 Enzymeinheiten in etwa 20 μl Pufferlösung verwendet. Für die Zwecke der Isolierung von DNA-Fragmenten zur Plasmidkonstruktion werden typischerweise 5 bis 50 μg DNA mit 20 bis 250 Enzymeinheiten in einem größeren Volumen gespalten. Geeignete Puffer und Substratmengen für bestimmte Restriktionsenzyme werden vom Hersteller spezifiziert. Gewöhnlich werden Inkubationszeiten von etwa 1 Stunde bei 37°C verwendet, können aber nach den Anweisungen der Anbieter variieren. Nach dem Verdau wird die Reaktion direkt auf einem Polyacrylamidgel einer Elektrophorese unterzogen, um das gewünschte Fragment zu isolieren.
Die Größentrennung der gespaltenen Fragmente erfolgt unter Verwendung von 8-prozentigem Polyacryamidgel, beschrieben von Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980).
„Oligonucleotide" bezieht sich entweder auf ein einzelsträngiges Polydesoxynucleotid oder zwei komplementäre Polydesoxynucleotidstränge, die chemisch synthetisiert sein können. Derartige synthetische Oligonucleotide besitzen kein 5'-Phosphat und ligieren daher nicht mit einem anderen Oligonucleotid ohne Zugabe eines Phosphats von einem ATP in Gegenwart einer Kinase. Ein synthetisches Oligonucleotid ligiert mit einem Fragment, das nicht dephosphoryliert wurde. „Ligierung" bezieht sich auf den Prozess der Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen zwei doppelsträngigen Nucleinsäurefragmenten (Maniatis, T. et al., id., S. 146). Wenn nicht anders angegeben, kann die Ligierung unter Verwendung von bekannten Puffern und Bedingungen mit 10 Einheiten T4-DNA-Ligase („Ligase") pro 0,5 μg etwa äquimolaren Mengen der zu ligierenden DNA-Fragmente erfolgen.
Wenn nicht anders angegeben, wurde die Transformation durchgeführt, wie in dem Verfahren von Graham, F. und Van der Eb, A:, Virology, 52: 456-457 (1973) beschrieben.
Beispiel 1
Bakterielle Expression und Reinigung von TNF-Gamma
Die DNA-Sequenz, die TNF-gamma codiert, ATCC # 75927, wird zuerst unter Verwendung von PCR-Oligonucleotidprimern amplifiziert, die den 5'-Sequenzen des TNF-gamma-Proteins und den Vektor-Sequenzen 3' zum TNF-gamma-Gen entsprechen. Den 5'- bzw. 3'-Sequenzen wurden zusätzliche Nucleotide angefügt, die TNF-gamma entsprechen. Der 5'-Oligonucleotidprimer besitzt die Sequenz 5' GCGCGGATCCACCATGAGACGCTTTTTAAGCAAAGTC 3', enthält eine BamHI-Restriktionsenzymschnittstelle, gefolgt von den ersten 24 Nucleotiden der TNF-gamma codierenden Sequenz, ausgehend von der angenommenen terminalen Aminosäure des prozessierten Proteincodons. Die 3'-Sequenz 5' CGCGTCTAGACTATAGTAAGAAGGCTCCAAAGAAGG 3' enthält komplementäre Sequenzen zu einer XbaI-Schnittstelle, und es folgen darauf 22 Nucleotide von TNF-gamma und komplementäre Sequenzen zu einer pQE-9-Vektorsequenz, die sich 3' zur TNF-gamma-DNA-Insertion befindet. Die Restriktionsenzymschnittstellen entsprechen den Restriktionsenzymschnittstellen auf dem bakteriellen Expressionsvektor pQE-9 (Qiagen). pQE-9 wurde dann mit BamHI und XbaI gespalten. Die amplifizierten Sequenzen wurden in pQE-9 ligiert und wurden im Leserahmen mit der Sequenz eingebaut, die die Histidin-Markierung und die RBS codiert. Das Ligierungsgemisch wurde dann verwendet, um einen E. coli-Stamm, der von Qiagen unter dem Handelsnamen M15/rep 4 erhältlich ist, durch das bei Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Cold Spring Laborstory Press, (1989) beschriebene Verfahren zu transformieren. M15/rep4 enthält Mehrfachkopien von Plasmid pREP4, das den lacI-Repressor exprimiert und auch Kanamycin-Resistenz (Kan^r) verleiht. Die Transformanten werden durch ihr Vermögen, auf LB-Platten zu wachsen, identifiziert, und Ampicillin/Kanamycin-resistente Kolonien wurden ausgewählt. Plasmid-DNA wurde isoliert und durch Restriktionsanalyse bestätigt. Clone, die die gewünschten Konstrukte enthielten, wurden über Nacht (Ü/N) in Flüssigkultur in LB-Medien, ergänzt sowohl mit Amp (100 μg/ml) als auch Kan (25 μg/ml), gezüchtet. Die Ü/N-Kultur wird verwendet, um eine große Kultur in einem Verhältnis von 1:100 bis 1:250 anzuimpfen. Die Zellen wurden bis zu einer optischen Dichte von 600 (O.D.⁶⁰⁰) zwischen 0,4 und 0,6 gezüchtet. IPTG („Isopropyl-B-Dthiogalactopyranosid") wurde dann bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben. IPTG induziert durch Inaktivierung des lacI-Repressors, wobei der P/O freigegeben wird, was zu einer erhöhten Genexpression führt. Die Zellen wurden weitere 3 bis 4 Stunden gezüchtet. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation geerntet. Das Zellpellet wurde in dem chaotropen Agens 6 molares Guanidin-HCl solubilisiert. Nach der Klärung wurde solubilisiertes TNF-gamma aus dieser Lösung durch Chromatographie auf einer Nickel-Chelat-Säule unter Bedingungen gereinigt, die die feste Bindung durch Proteine zulassen, die die 6-His-Markierung enthalten (Hochuli, E. et al., J. Chromatography 411: 177-184 (1984)). TNF-gamma wurde ferner durch einen zweiten Lauf über die Nickel-Chelat-Säule gereinigt. TNF- gamma (90% rein) wurde von der Säule in 6 molarem Guanidin-HCl pH 5,0 eluiert und für Renaturierungszwecke in PBS-Puffer dialysiert. Das Expressionsprodukt wurde einer SDS-PAGE unterworfen, und die Ergebnisse kann man in 4 sehen, wobei M Molekulargewichtsmarker sind; Spur 1 ist induziertes Zelllysat; Spur 2 ist nicht-induziertes Zelllysat; Spur 3 ist das das TNF-gamma-Protein nach zwei Nickel-Chelat-Säulen-Reinigungen; Spur 4 ist das TNF-gamma-Protein nach einer Säulen-Reinigung.
Beispiel 2
Clonierung und Expression von TNF-gamma unter Verwendung des Baculovirus-Expressionsystems
Die DNA-Sequenz, die das TNF-gamma-Protein mit der gesamten Länge, ATCC # 75927, codiert, wurde unter Verwendung von PCR-Oligonucleotidprimern amplifiziert, die den 5'- und 3'-Sequenzen der Gene entsprechen:
Der 5'-Primer besitzt die Sequenz 5' GCGCGGATCCACCATGAGACGCTTTTTAAGCAAAGTC 3' und enthält eine BamHI-Restriktionsenzymschnittstelle (fettgedruckt), gefolgt von 24 Nucleotiden des TNF-gamma-Gens (das Startcodon für die Translation „ATG" ist unterstrichen).
Der 3'-Primer besitzt die Sequenz 5' CGCGTCTAGACTATAGTAAGAAGGCTCCAAAGAAGG 3' und enthält die Schnittstelle für die Restriktionsendonuclease XbaI und 22 Nucleotide, die komplementär zur nicht-translatierten 3'-Sequenz des TNF-gamma-Gens sind. Die amplifzierten Sequenzen wurden aus einem 1%-igen Agarosegel unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits („Geneclean", BIO 101 Inc., La Jolla, Ka.) isoliert. Das Fragment wurde dann mit den Endonucleasen BamHI und XbaI gespalten und dann noch einmal auf einem 1%-igen Agarosegel gereinigt. Dieses Fragment wird als F2 bezeichnet.
Der Vektor pA2 (Modifizierung des pVL941-Vektors, nachstehend diskutiert) wird für die Expression des TNF-gamma-Proteins unter Verwendung des Baculovirus-Expressionssystems verwendet (für einen Überblick vgl.: Summers, M.D. und Smith, G.E. 1987, A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin Nr. 1555). Dieser Expressionsvektor enthält den starken Polyhedrin-Promotor des Autographs californica-Kernpolyedervirus (AcMNPV), gefolgt von den Erkennungsstellen für die Restriktionsendonucleasen BamHI und XbaI. Die Polyadenylierungssteile des Affen-Virus (SV) 40 wird für eine effiziente Polyadenylierung verwendet. Für eine einfache Selektion des rekombinanten Virus wird das beta-Galactosidase-Gen aus E.coli in derselben Orientierung wie der Polyhedrin-Promotor eingebaut, gefolgt von dem Polyadenylierungssignal des Polyhedrin-Gens. Die Polyhedrinsequenzen werden an beiden Seiten von Virus-Sequenzen für die zellvermittelte homologe Rekombination der gemeinsam transfizierten Wildtyp-Virus-DNA flankiert. Viele andere Baculovirusvektoren könnten anstelle von pA2 verwendet werden, wie pRG1, pAc373, pVL941 und pAcIM1 (Luckow, V.A. und Summers, M.D., Virology, 170: 31-39).
Das Plasmid wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und XbaI gespalten und dann unter Verwendung von Kalbsdarmphosphatase durch im Fachgebiet bekannte Verfahren dephosphoryliert. Die DNA wurde dann aus einem 1%-igen Agaraosegel unter Verwendung des im Handel erhältlichen Kits („Geneclean” BIO 101 Inc., La Jolla, Ka.) isoliert. Diese Vektor-DNA wird als V2 bezeichnet.
Das Fragment F2 und das dephosphorylierte Plasmid V2 wurden mit T4-DNA-Ligase ligiert. E.coli-XL1-blue-Zellen wurden dann transformiert. Die Sequenz des clonierten Fragments wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
5 μg des Plasmids pBac TNF-gamma wurden mit 1,0 μg eines im Handel erhältlichen linearisierten Baculovirus („BaculoGold^TM-Baculovirus-DNA", Pharmingen, San Diego, Ka.) unter Verwendung des Lipofektionsverfahrens gemeinsam transformiert (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413-7417 (1987)).
1 μg BaculoGold^TM-Virus-DNA und 5 μg des Plasmids pBac TNF-gamma wurden in einer sterilen Vertiefung einer Mikrotiterplatte, enthaltend 50 μl serumfreies Grace-Medium (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD), gemischt. Danach wurden 10 μl Lipofectin plus 90 μl Grace-Medium zugegeben, gemischt und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde das Transfektionsgemisch tropfenweise zu den Sf9-Insektenzellen (ATCC CRL 1711) gegeben, die in einer 35 mm-Gewebekulturplatte mit 1 ml Grace-Medium ohne Serum ausgesät wurden. Die Platte wurde hin- und hergeschüttelt, um die neu zugegebene Lösung zu vermischen. Die Platte wurde dann 5 Stunden bei 27°C inkubiert. Nach 5 Stunden wurde die Transfektionslösung von der Platte entfernt und 1 ml Grace-Insektenmedium, ergänzt mit 10%-igem fötalem Kälberserum, wurde zugegeben. Die Platte wurde in einen Inkubator zurückgestellt und die Züchtung wurde vier Tage bei 27°C fortgesetzt.
Nach vier Tagen wurde der Überstand gesammelt und ein Plaque-Test durchgeführt, der ähnlich war, wie von Summers und Smith (a.a.O.) beschrieben. Als Modifizierung wurde ein Agarosegel mit „Blue Gal" (Life Technologies Inc., Gaithersburg) verwendet, das eine einfache Isolierung der blau gefärbten Plaques zulässt. (Eine detaillierte Beschreibung eines „Plaque-Tests" kann man auch im Benutzerleitfaden für Insektenzellkultur und Baculovirologie, vertrieben von Life Technologies Inc., Gaithersburg, Seite 9-10 finden).
Vier Tage nach der Reihenverdünnung wurde das Virus den Zellen zugegeben, blau gefärbte Plaques wurden mit der Spitze einer Eppendorfpipette aufgenommen. Der die rekombinanten Viren enthaltende Agar wurde dann in einem Eppendorf-Röhrchen resuspendiert, das 200 μl Grace-Medium enthielt. Der Agar wurde durch kurze Zentrifugation entfernt, und der das rekombinante Baculovirus enthaltende Überstand wurde verwendet, um Sf9-Zellen zu infizieren, die in 35 mm-Schalen ausgesät wurden. Vier Tage später wurden die Überstände dieser Kulturschalen geerntet und dann bei 4°C aufbewahrt.
Sf9-Zellen wurden in Grace-Medium, ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem FBS, gezüchtet. Die Zellen wurden mit dem rekombinanten Baculovirus V-TNF-gamma bei einer Infektionsmuliplizität (MOI) von 2 infiziert. Sechs Stunden später wurde das Medium entfernt und durch SF900 II-Medium ohne Methionin und Cystein (Life Technologies Inc., Gaithersburg) ersetzt. 42 Stunden später wurden 5 μCi ³⁵S-Methionin und 5 μCi ³⁵S-Cystein (Amersham) zugegeben. Die Zellen wurden 16 Stunden weiter inkubiert, bevor sie durch Zentrifugation geerntet wurden, und die markierten Proteine wurden durch SDS-PAGE und Autoradiographie sichtbar gemacht. 5 zeigt das Gel, in dem die Spuren 1 und 3 das Medium von TNF-gamma und die Kontrolle sind; Spuren 2 und 4 sind das Zelllysat von TNF-Gamma und die Kontrolle.
Beispiel 3
Expression von rekombinantem TNF-gamma in COS-Zellen
Das Expressionsplasmid TNF-gamma HA stammt von dem Vektor pcDNAI/Amp (Invitrogen), enthaltend: 1) SV40-Replikationsursprung, 2) Ampicillin-Resistenzgen, 3) E.coli-Replikationsursprung, 4) CMV-Promotor, gefolgt von einer Polylinkerregion, einem SV40-Intron und einer Polyadenylierungsstelle. Ein DNA-Fragment, das den gesamten TNF-gamma-Vorläufer und eine HA-Markierung codiert, die im Leserahmen an sein 3'-Ende fusioniert ist, wurde in die Polylinkerregion des Vektors cloniert, daher wird die Expression des rekombinanten Proteins unter dem CMV-Promotor gelenkt. Die HA-Markierung entspricht einem Epitop, das vom Influenza-Hämagglutininprotein stammt, wie früher beschrieben (I. Wilson, H. Niman, R. Heighten, A. Cherenson, M. Connolly und R. Lerner, 1984, Cell 37, 767). Der Einbau der HA-Markierung in unser Zielprotein erlaubt den einfachen Nachweis des rekombinanten Proteins mit einem Antikörper, der das HA-Epitop erkennt.
Die Plasmidkonstruktionsstrategie wird wie folgt beschrieben:
Die DNA-Sequenz, die TNF-gamma codiert, ATCC # 75927, wurde durch PCR an dem ursprünglichen EST konstruiert, der unter Verwendung von zwei Primern cloniert wurde: der 5'-Primer (derselbe wie für das Baculo-Beispiel) enthält eine BamHI-Schnittstelle, auf die 24 Nucleotide der TNF-gamma codierenden Sequenz, ausgehend vom Startcodon, folgen; die 3'-Sequenz 5' CGCTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGATAGTAAGAAGGCTCCAAAG 3' enthält komplementäre Sequenzen zur XbaI-Schnittstelle, dem Translationsstoppcodon, der HA-Markierung und den letzten 18 Nucleotiden der TNF-gamma codierenden Sequenz (das Stopp-Codon nicht einschließend). Daher enthält das PCR-Produkt eine BamHI-Schnittstelle, die TNF-gamma codierende Sequenz, gefolgt von einer im Leserahmen fusionierten HA-Markierung, ein Translationsterminationsstoppcodon neben der HA-Markierung und eine XbaI-Schnittstelle. Das PCR amplifizierte DNA-Fragment und der Vektor pcDNAI/Amp wurden mit BamHI- und XbaI-Restriktionsenzym gespalten und ligiert. Das Ligierungsgemisch wurde in den E. coli-Stamm SURF (erhältlich von Stratagene Cloning Systems, 11099 North Torreg Pines Road, La Jolla, KA 92037) transformiert, die transformierte Kultur wurde auf Ampicillin-Medienplatten ausplattiert, und resistente Kolonien wurden ausgewählt. Die Plasmid-DNA wurde aus den Transformanten isoliert und durch Restriktionsanalyse auf das Vorliegen des richtigen Fragments untersucht. Zur Expression des rekombinanten TNF-gamma wurden COS-Zellen mit dem Expressionsvektor durch das DEAE-DEXTRAN-Verfahren transfiziert. (J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)). Die Expression des TNF-gamma-HA-Proteins wurde durch Radiomarkierung und ein Immunpräzipitationsverfahren nachgewiesen. (E. Harlow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)). Die Zellen wurden zwei Tage nach der Transfektion 8 Stunden mit ³⁵S-Cystein markiert. Die Kulturmedien wurden dann gesammelt, und die Zellen wurden mit Detergens lysiert (RIPA-Puffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 1% NP-40, 0,5% DOC, 50 mM Tris, pH 7,5). (Wilson, I. et al., Id. 37: 767 (1984)). Sowohl das Zelllysat als auch die Kulturmedien wurden mit einem monoclonalen HA-spezifischen Antikörper präzipitiert. Die präzipitierten Proteine wurden auf 15%-igen SDS-PAGE-Gelen analysiert.
Beispiel 4
Expressionsmuster von TNF-gamma in menschlichem Gewebe
Es wurde eine RNA-Blot-Analyse durchgeführt, um die Expressionsspiegel von TNF-gamma in menschlichen Geweben zu untersuchen. Die zellulären Gesamt-RNA-Proben wurden mit dem RNAzol^TM B-System (Biotecx Laborstories, Inc. 6023 South Loop East, Houston, TX 77033) isoliert. Etwa 2 μg (für den RNA-Blot von 3A) der Gesamt-RNA, die aus jedem menschlichen spezifizierten Gewebe isoliert wurde, wurden auf 1%-igem Agarose-Formaldeyd-Gel getrennt und auf einen Nylonfilter übertragen (Sambrook, Fritsch und Maniatis, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, (1989)). Die Markierungsreaktion erfolgte nach dem Stratagene-Prime-It-Kit mit 50 ng TNF-gamma-cDNA, um ³²P-markierte TNF-gamma-cDNA herzustellen. Die markierte DNA wurde mit einer Select-G-50-Säule (5 Prime – 3 Prime, Inc. 5603 Arapahoe Road, Boulder, CO 80303) gereinigt. Der Filter wurde dann mit radioaktiv markiertem TNF-gamma-Gen mit 1.000.000 ZpM („cpm"; Zerfälle pro Minute)/ml in 0,5 M NaPO₄, pH 7,4 und 7% SDS über Nacht bei 65°C markiert. Nachdem er zweimal bei Raumtemperatur und zweimal bei 60°C mit 0,5 × SSC, 0,1% SDS gewaschen worden war, wurde der Filter bei –70°C über Nacht einem Verstärkerschirm exponiert. Die Boten-RNA für TNF-gamma ist in der Niere reichlich vorhanden (3B).
Dieselbe Reaktion wurde für die in 3B gezeigten Ergebnisse durchgeführt, wobei die einzige Änderung darin bestand, dass 10 μg Poly(A)-RNA aus den angegebenen Geweben verwendet wurden. Die Boten-RNA für TNF-gamma wird hauptsächlich in HUVEC-Zellen exprimiert (3B).
Beispiel 5
Fähigkeit von rekombinantem TNF-gamma, das WEHT 164- und L929-Zellwachstum zu hemmen, die Zelladäsion in HL-60-Zellen zu induzieren und das Endothelzellwachstum zu fördern.
Die adhärenten Zielzellen wurden aus konfluenten Kulturen durch Trypsinierung in PBS hergestellt und nicht-adhärente Zielzellen wurden aus stationären Kulturen geerntet und einmal mit Medium gewaschen. Die Zielzellen wurden mit 3 × 10⁵ Zellen/ml in Medium, enthaltend 10% FKS, suspendiert. 0,1 ml Aliquots wurden in flachbödige Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen dispensiert, enthaltend 0,1 ml reihenverdünnte Testproben von Zellen (WEHT 164 und L929). Die Inkubation wurde 70 Stunden fortgesetzt. TNF-α, TNF-β und TNF-gamma wurden zu einer Konzentration von 0,5 μg/ml zugegeben. Die Cytotoxizität und Proliferationsaktivität wurde unter Verwendung eines MTS-Tests quantifiziert, der durch Zugabe von 20 μl MTS und Phenazinmethosulfat (PMS)-Lösung zu jeder Vertiefung erfolgte. Nach einer 3-ständigen Inkubation wurde die CD bei 492 nm von einem ELISA-Plattenlesegerät gemessen. Die OD₄₉₂ ist proportional zur Anzahl der lebensfähigen Zellen in den Vertiefungen. Die prozentuale Cytotoxizität wurde wie folgt berechnet: % Cytotoxizität = (100 – OD_{experimentiell}/OD_Kontrolle) × 100. Die Photos wurden nach 72 Stunden aufgenommen. Wie von 6A und 8 dargestellt, induzierte TNF-gamma eine Morphologieänderung, die als dunkle runde Zellen erschien, die abgetötet sind.
In der graphischen Darstellung von 6B wurde der Test durchgeführt, wie vorstehend beschrieben, jedoch wurden ansteigende Mengen an TNF zugegeben. Die Ergebnisse zeigen, dass TNF-gamma ein Inhibitor der WEHT 164-Zellen ist.
Um die Adhäsionsfähigkeit von TNF-gamma zu testen, wurden HL-60-Zellen verwendet, und die Zelladäsion und der Zell-Zell-Kontakt wurden durch Beobachtung unter dem Mikroskop gemessen und subjektiv durch zwei unabhängige Forscher bewertet. 10 veranschaulicht die Fähigkeit von TNF-gamma, die Zelladhäsion zu induzieren.
In dem Test zum Testen auf die Fähigkeit von TNF-gamma, das Endothelwachstum zu fördern, wurde der Proliferationsindex (PI) wie folgt berechnet: PI = OD_{experimentiell}/OD_Kontrolle. 8 zeigt, dass TNF-gamma ein Promotor des Endothelzellwachstums ist.
Beispiel 6
Messung der Apoptosefähigkeit von TNF-gamma
In einem ersten Inkubationsschritt wird ein anti-Histon-Antikörper adsorptiv an die Wand eines Mikrotiterplattenmoduls fixiert. Anschließend werden die unspezifischen Bindungsstellen an der Wand durch Behandlung mit Inkubationspuffer (z.B. Blockierungslösung) gesättigt. Während des zweiten Inkubationsschrittes binden die Nucleosomen, die in der WEHT 164-Zellprobe enthalten sind, die mit TNF-α, TNF-β oder TNF-gamma behandelt wurde, über ihre Histonkomponenten an den immobilisierten anti-Histon-Antikörper. Im dritten Inkubationsschritt reagiert anti-DNA-Peroxidase (POD) mit dem DNA-Anteil des Nucleosoms. Nach der Entfernung des ganzen nicht-gebundenen Peroxidase-Konjugats durch einen Waschschritt wird die Menge der im Immunkomplex zugerückgehaltenen Peroxidase photometrisch mit ABTS (2,2'-Azino-di-[3-ethylbenzthiazolinsulfonat)) als Substrat bestimmt. Der anti-Histon-Antikörper reagiert mit den Histonen H1, H2A, H2B, H3 und H4 aus der Probe. Der anti-DNA-POD-Antikörper bindet an einzel- und doppelsträngige DNA. Daher erlaubt der ELISA-Test den Nachweis von Mono- und Oligonucleosomen und kann verwendet werden, um den apoptotischen Zelltod zu messen. Der Grad des Zelltods wird durch die Menge an cytoplasmatischen Histon assoziierten DNA-Fragmenten gemessen, die als die Absorption A405nm/A490 angegeben werden. (Vgl. Boehringer Mannheim Katalog, 0990 C 93 2 1541170) (vgl. 7)
Beispiel 7
Rezeptorbindungstest unter Verwendung von TNF-gamma
TNF-α und TNF-gamma wurden mittels Ni-NTA-Affinitäschromatographie unter Verwendung der 6-His-Markierung gereinigt, und 1 μg/Vertiefung wurde einer Nickelchelat-beschichteten Platte mit 96-Vertiefungen (Xenopore Corp.) zugegeben und 2 Stunden inkubiert. Nach dreimaligem Waschen wurden jeder Vertiefung 100 ng menschliche lösliche TNF-Rezeptoren, sTNF RI oder sTNF RII, zugegeben und 2 Stunden inkubiert. Die Platte wurde dreimal gewaschen und mit alkalischer Phosphatasemarkierter polyclonaler Antikörper gegen sTNF RI oder sTNF RII (200 μl) wurde zugegeben. Die Substratlösung, 200 μl, wurde jeder Vertiefung zugegeben und die Platte wurde 2 Stunden inkubiert. Die OD wurde unter Verwendung eines ELISA-Lesegeräts gemessen (Testwellenlänge 450 nm, Korrekturwellenlänge 590 nm). Die in 11 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass TNF-gamma an sTNF-Rezeptoren nicht signifikant bindet.
Angesichts der vorstehenden Ausführungen sind zahlreiche Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung möglich, und daher kann die Erfindung im Umfang der beigefügten Patentansprüche anderweitig, als im Besonderen beschrieben, praktiziert werden. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Polynucleotid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) Polynucleotiden, die zumindest die reife Form des Polypeptids mit der in SEQ ID NO: 2 gezeigten abgeleiteten Aminosäuresequenz codieren; (b) Polynucleotiden mit der codierenden Sequenz wie in SEQ ID NO: 2 gezeigt, die mindestens die reife Form des Polypeptids codiert; (c) Polynucleotiden, die das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von zumindest der reifen Form des Polypeptids codieren, das durch die in ATCC 75927 enthaltene cDNA codiert wird; (d) Polynucleotiden mit der codierenden Sequenz der cDNA, die in ATCC 75927 enthalten ist, die zumindest die reife Form des Polypeptids codiert; und (e) Polynucleotiden, die zumindest 95 % identisch sind mit einem der Polynucleotide nach (a) bis (d), die ein Polypeptid codieren, das vorentzündliche Cytokin-Freisetzung aus T-Zellen stimuliert.
Polynucleotid nach Anspruch 1, das DNA ist.
DNA nach Anspruch 2, die genomische DNA ist.
Polynucleotid nach Anspruch 1, das RNA ist.
Vektor, der das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 enthält.
Vektor nach Anspruch 5, in dem das Polynucleotid funktionell mit einer Expressionskontrollsequenz verknüpft ist, die die Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen ermöglicht.
Wirtszelle, die mit dem Vektor nach Anspruch 5 oder 6 gentechnisch verändert ist.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids mit TNF-gamma-Aktivität, umfassend das Züchten der Wirtszelle nach Anspruch 8 und das Gewinnen des Polypeptids, das durch das Polynucleotid codiert wird, aus der Kultur.
Verfahren zur Herstellung von Zellen, die in der Lage sind, ein Polypeptid mit TNF-gamma-Aktivität zu exprimieren, welches das gentechnische Verändern der Zellen mit dem Vektor nach Anspruch 5 oder 6 umfasst.
Polypeptid mit der Aminosäuresequenz, die durch ein Polynucleotid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert wird, oder durch das Verfahren nach Anspruch 8 erhältlich ist.
Antikörper gegen das Polypeptid nach Anspruch 10.
Antagonist/Inhibitor gegen das Polypeptid nach Anspruch 10, der ein Antikörper nach Anspruch 11 oder ein Antisense-Konstrukt ist, das in der Lage ist, an ein Transkript des Polynucleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zu hybridisieren.
Nucleinsäuremolekül, das spezifisch an ein Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 hybridisiert.
Arzneimittel, welches das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder das Polypeptid nach Anspruch 10 und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Diagnostische Zusammensetzung, die das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 13 oder den Antikörper nach Anspruch 11 umfasst.
Verwendung des Polypeptids nach Anspruch 10 oder des Polynucleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Wundheilung, zur Hemmung von Tumorproliferation oder Neoplasie, zur Behandlung von Restenose oder zur Prävention von Autoimmunerkrankungen.
Verwendung des Antagonisten nach Anspruch 12 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Kachexie, cerebraler Malaria, rheumatoider Arthritis, Osteoporose, endotoxischem (septischem) Schock, zur Prävention von Transplantatabstoßung oder das als entzündungshemmendes Mittel nützlich ist.
Verfahren zur Identifizierung von Agonisten und Antagonisten zu dem Polypeptid nach Anspruch 10, umfassend: (a) selektives Kombinieren von Endothelzellen, Concanavalin-A, der Verbindung, die gescreent werden soll, [3H]-Thymidin, in Anwesenheit oder Abwesenheit des Polypeptids nach Anspruch 10; (b) Messen des [3H]-Thymidin-Einbaus durch die Endothelzellen; und (c) Bestimmen, ob die Verbindung den [3H]-Thymidin-Einbau verstärkt oder blockiert.
In vitro-Verfahren zur Diagnose eines Tumors oder der Anfälligkeit für einen Tumor, umfassend den Nachweis einer mutierten Form der Nucleinsäuresequenz, die das Polypeptid nach Anspruch 10 codiert.
Antiköper nach Anspruch 11, der ein polyclonaler Antikörper ist.
Antikörper nach Anspruch 11, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem monoclonalen Antikörper; (b) einem chimären Antikörper, (c) einem Einzelkettenantikörper; und (d) einem Fab-Fragment.
Zelle, die den Antikörper nach Anspruch 11 produziert.
Hybridom, das den Antikörper nach Anspruch 11 produziert.