DE69433107T2

DE69433107T2 - Rekombinante dnase b aus streptococcus pyogenes

Info

Publication number: DE69433107T2
Application number: DE69433107T
Authority: DE
Inventors: W. Craig ADAMS; P. Patty PANG; Marina C. Belei
Original assignee: Beckman Coulter Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1993-06-23
Filing date: 1994-05-18
Publication date: 2004-07-08
Anticipated expiration: 2014-05-19
Also published as: US6420152B1; JP2005046151A; DE69433107D1; CA2141535A1; EP0660874A1; ATE248918T1; JP3644961B2; EP0660874B1; WO1995000650A1; EP1380648A3; JPH08500741A; EP1380648A2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Diese Erfindung bezieht sich auf rekombinante DNase B, die aus dem pathogenen Bakterium Streptococcus pyogenes abstammt, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verfahren zu ihrer Verwendung.
Trotz der Fortschritte bei der Prävention und Behandlung von bakteriellen Infektionen, stellen eine Anzahl von bakteriellen Pathogenen weiterhin ernsthafte Probleme in der medizinischen Praxis dar und verursachen weiterhin ernsthafte, sogar tödliche Krankheiten. Eines dieser Pathogene ist S. pyogenes. Unter den von S. pyogenes verursachten Krankheiten finden sich Streptokkenpharyngitis, Scharlach und ihre suppurativen Komplikationen, einschließlich zervikaler Adenitis, Otitis media, Mastoiditis, Peritonsillarabszesse, Meningitis, Pneumonitis, Lungenentzündung, Puerperalsepsis, Zellulitis der Haut, Impetigo, Lymphangitis, Erysipel, akute Glomerulonephritis und rheumatisches Fieber.
Solche Infektionen treten häufig in Krankenhäusern auf (nosokomiale Infektion, insbesondere bei Patienten, deren normale Immunsystemfunktion unterdrückt ist. Die letztere Kategorie schließt Patienten mit AIDS ein, Patienten, die immunsuppressive Arzneimittel für Krebs oder zur Prävention von Transplantationszurückweisung einnehmen, und Patienten mit schlechter Zirkulation, z. B. Patienten mit Diabetes.
Da diese Krankheiten schnelle und wirksame Behandlung zum Auslöschen der suppurativen Läsionen und zur Prävention von Folgekrankheiten, die durch immunologische Reaktionen auf persistierende suppurative Läsionen hervorgerufen werden, erfordern, ist eine schnelle Diagnose des Vorhandenseins von S. pyogenes in Patienten essentiell, bei denen Infektionen vermutet werden. Ein Versagen bei der Diagnose von S. pyogenes kann die Behandlung stark verkomplizieren oder sie sogar unmöglich machen.
Obgleich gegenwärtig Verfahren zum Nachweis von S. pyogenes verfügbar sind, sind diese Verfahren mit Mängeln behaftet, insbesondere bei der klinischen Anwendung.
Unter den Verfahren zum Nachweis von S. pyogenes findet sich der Nachweis des Vorhandenseins von Antikörpern gegen DNase B, einem DNA-abbauenden Enzym, das von S. pyogenes hergestellt wird. Dieses Enzym, das von S. pyogenes während der Infektion ausgeschieden wird, leitet die Entwicklung beträchtlicher Antikörpertiter von in Patienten ein, die daraufhin akutes rheumatisches Fieber und akute Glomerulonephritis zu entwickeln.
Wenngleich andere auf Serum basierende diagnostische Tests für diese rheumatischen Fieber und Glomerulonephritis, einschließlich des Nachweises von Antikörpern gegen Streptolysin Ound gegen Hyaluronidase erhältlich sind, bieten Tests für Anti-DNase B-Antikörper gewisse Vorteile, da DNase B unter fast allen Stämmen der Gruppe A betahämolytische Streptokokken gefunden wird und da hohe DNase B-Titer in Patienten mit Infektionen der Haut und des Pharynx gefunden werden.
Wenngleich es eine Anzahl von kommerziell erhältlichen Tests für den Test von Anti-DNase B-Antikörpern gibt, haben diese Tests Nachteile. Wie oben angedeutet, besteht ein großer Bedarf nach einem verbesserten Test.
Die kommerziell erhältlichen Tests fallen in drei Kategorien: (1) ein auf DNase B-Inhibition basierender Test, der die Fähigkeit des Antikörpers enzymatische Aktivität zu hemmen nutzt; (2) ein Latex-Agglutinations-Test für einen Antikörper gegen eine Vielzahl von S. pyogenes-Antigenen; und (3) ein turbidimetrischer Inhibitions-Test.
ELISA-Tests wurden auch im Forschungslaboratorium eingesetzt, diese haben sich aber, wie unten detailliert ausgeführt, noch nicht als geeignet für den Routine-Klinikeinsatz erwiesen.
Der DNase B-Inhibitions-Test ist sehr langsam und erfordert zur Durchführung typischerweise zwischen 4–8 Stunden. In Situationen, in denen also eine schnelle Bestätigung des Anti-DNase B-Antikörpers erforderlich ist, damit die Behandlung so schnell wie möglich eingeleitet werden kann, sofern das Vorhandensein von S. pyogenes bestätigt wird, ist der Enzym-Inhibitions-Test nicht besonders nützlich.
Der Latex-Agglutinations-Test ist gestaltet, Antikörper gegen fünf S. pyogenes-Antigene nachzuweisen. Testergebnisse zeigen allerdings eine schlechte Übereinstimmung zwischen dem Latex-Agglutinations-Test und einem spezifischen Anti-DNase B-Test. In einer Studie, G. C. Klein & W. L. Jones, "Comparison of the Streptozyme Test with the Antistreptolysin O, Antideoxyribonuclease B, and Antihyaluronidase Tests," App. Microbiol. 21: 257–259 (1971), waren 12 von 80 Patienten, die in dem Latex-Agglutinations-Test negativ testeten, in Wirklichkeit positiv für Anti-DNase B-Antikörper. Dieser hohe Grad von fälschlicherweise negativen Ergebnissen bedeutet, dass der Test für den klinischen Einsatz nicht wünschenswert ist.
Der turbidimetrische Inhibitions-Test hängt von der Inhibition der Agglutination von Latexpartikeln ab, die mit Anti-DNase B-Antikörpern beschichtet sind, indem eine begrenzte Menge einer unreinen Zubereitung von DNase B in Gegenwart von Anti-DNase B-Antikörper-enthaltendem Serum, welches um den Antikörper auf den Latexpartikeln konkurriert. Dieser Test, der in dem U.S.-Patent Nr. 5 055 395 beschrieben wird und hiermit per Referenz eingeschlossen wird, ist relativ unempfindlich. Er ist daher nicht geeignet für die Verwendung in frühen Stadien von S. pyogenes-Infektion, und es ist genau dieser Zeitraum, in dem ein genauer Nachweis des Anti-DNase B-Antikörpers am wichtigsten ist. Darüber hinaus sind die in dem turbidimetrischen Inhibitions-Test eingesetzten Reagenzien schwer herzustellen.
Auf ELISA basierende Tests für Anti-DNase B-Antikörper werden in M. A. Gerber et al., "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay of Antibodies in Human Sera to Streptococcal DNase B," J. Lab. Clin. Med. 95: 258–265 (1980), dargestellt. Wenngleich sich diese Tests als wirksame Forschungswerkzeuge erwiesen haben, ist ihre Hochskalierung für kommerzielle Verwendung, insbesondere für die klinische Praxis, nicht durchführbar. Dies ist damit begründet, dass solche Hochskalierung die Herstellung und Reinigung von DNase B-Enzym von Streptococcus pyogenes erfordern würde, das, wie oben detailliert ausgeführt, ein ernstzunehmendes Pathogen ist. Es werden für das Kultivieren dieses pathogenen Bakteriums in erforderlicher Menge zur Produktion ausreichenden Enzyms zur Kommerzialisierung des ELISA-Tests nicht nur extrem teure Eindämmungsverfahren erforderlich sein, sondern die für das Wachstum von S. pyogenes erforderlichen Medien sind sehr komplex und teuer. Diese Bedenken haben die Entwicklung von einer kommerziellen Version des ELISA-Tests für Anti-DNase B-Antikörper stark behindert.
Es besteht daher eine Nachfrage nach einem verbesserten, schnellen und spezifischen Test für Anti-DNase B-Antikörper. Vorzugsweise würde ein solcher Test von einem Arzt in seinem Büro einsetzbar sein und würde eine minimale Ausrüstung erfordern. Dies ist damit begründet, dass Patienten mit Krankheiten, wie Streptokokkenpharyngitis und Scharlach, üblicherweise vor der Einweisung ins Krankenhaus ihren Hausarzt aufsuchen und eine genaue Diagnose von S. pyogenes-Infektion zu diesem Zeitpunkt gegenüber einer darauf folgenden Diagnose, die nur durchgeführt wird, wenn der Patient eingewiesen wurde, bevorzugt wäre.
Die Entwicklung eines solchen verbesserten Tests hängt von der Erhältlichkeit von großen Mengen des DNase B-Enzyms selbst ab. Es besteht daher weiterhin ein Bedarf für ein Verfahren zur Herstellung von S. pyogenes-DNase B-Enzym unter Verwendung eines Verfahrens, das hochskaliert werden kann, um kommerzielle Mengen des Enzyms herzustellen, ohne dass komplexe, schwer in den Griff zu kriegende und teure Eindämmungsmaßnahmen erforderlich sind.
Einige Verfahren wurden bereits ausprobiert, wie in Wadström et al. (Proceedings of the International Symposium on Electrofocusing and Isotachophoresis, 1976, 443–453) beschrieben. Es beschreibt die Reinigung von bakteriellen Enzymen und Toxinen mittels isoelektrischer Fokussierung und Isotachophorese im präparativen Maßstab. Die Reinigung führt in der Abtrennung von DNasen von S. pyogenes zu zwei Komponenten. T. Yutsudo et al., 1992, FEBS LETTERS, 308(1), 30–34, beschreibt dann eine Faktor N-Sequenz, die eine Aminosäuresequenz aufweist, die verschieden ist von der der vorliegenden Erfindung, wenngleich sie eine DNase B ist, einer Komponente der DNasen von S. pyogenes. Darüber hinaus zeigt die in dem Dokument offenbarte Sequenz mitogene Aktivität, anders als die DNase-Fraktion der vorliegenden Erfindung, die frei von mitogener Aktivität sind.
Die europäische Patentpublikation 0613947 von Yutsudo et al. beschreibt auf der anderen Seite ein anderes als das in der vorliegenden Erfindung beanspruchte Protein. Ausgehend von dem Aminosäurerest 221, wie in SEQ ID NO: 1, auf Seite 13 der Beschreibung des Dokumentes gezeigt, liest sich die Sequenz Ala-Ala-Pro-Ile-Tyr-. In dem Dokument ist weder eine Anleitung bereitgestellt, noch wird darauf hingewiesen, dass das Entfernen eines besonderen Restes anstelle von irgendeinem der anderen mehr als 200 Reste in dem Protein zur Herstellung eines Produktes führt, das frei von mitogener Aktivität ist.
Auf der anderen Seite beschreibt EP 0266686 ein Latex-Agglutinationsverfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen Streptokokken Desoxyribonuklease B, bei welchem gegen Streptokokken Desoxyribonuklease B gerichtete Antikörper auf den Partikeln einer Suspension oder Dispersion lokalisiert sind. Die Suspension oder Dispersion dieses Typs wird mit einer Streptokokken DNase B-Lösung und der Probe, die zu bestimmen ist, gemischt, welche die Streptokokken DNA-Lösung, enthaltend einen Proteaseinhibitor, und die Streptokokken DNase B umfasst, die, wenn erforderlich, kreuzvernetzt wird.
ZUSAMMENFASSUNG
Wir haben das Gen für S. pyogenes-DNase B in Escherichia coli kloniert und exprimiert, was eine bequeme und effiziente Herstellung von DNase B-Enzym ermöglicht, ohne dass die Kultivierung von S. pyogenes erforderlich ist.
Das Klonierungsverfahren führt zu im Wesentlichen gereinigter DNA, die für eine Aminosäuresequenz kodiert, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus der Aminosäuresequenz von: (i) Streptococcus pyogenes-DNase B-Enzym, wie in 4 unten gezeigt, wobei das Enzym an seinem Aminoterminus einen Arginin-(R)-Rest einschließt, der von einem Leader-Peptid abstammt und in dem natürlichen DNase B-Enzym nicht vorhanden ist; und (ii) einer Sequenz, die ein funktionelles Äquivalent von S. pyogenes-DNase B-Enzym kodiert, das gegebenenfalls mindestens einen Rest des Leader-Peptids einschließt. Die DNA ist im Wesentlichen frei von DNA, außer von DNA, die DNA sind die S. pyogenes-DNase B-Sequenz aus 4 kodieren, die nicht DANN sind, die ein funktionelles Äquivalent von S. pyogenes-DNase B-Enzym kodieren, und DNA, die das Leader-Peptid kodiert.
Vorzugsweise umfasst die DNA ferner eine DNA-Sequenz, die für ein Leader-Peptid kodiert, das an den Aminoterminus von S. pyogenes-DNase B-Enzym fusioniert ist.
Am meisten bevorzugt ist die klonierte DNA die DNA, deren Sequenz in 3 angegeben wird, einschließlich der DNA, die für die gesamte Aminosäuresequenz von S. pyogenes-DNase B-Enzym und das Leader-Peptid kodiert.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung sind Expressionsvektoren für Streptococcus pyogenes-DNase B-Enzym, umfassend die oben beschriebenen DNA-Sequenzen, welche mit mindestens einer mit einer geeigneten bakteriellen Wirtszelle kompatiblen Kontrollsequenz funktionsfähig verknüpft sind. Vorzugsweise ist der Expressionsvektor ein Plasmidvektor. Typischerweise ist die DNA, welche das Streptococcus pyogenes-DNase B-Enzym kodiert, mit mindestens einer Sequenz aus dem Bakteriophagen λ verknüpft.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine bakterielle Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor gemäß der Erfindung in einer Weise transformiert ist, transfiziert oder infiziert ist, die der transformierten Wirtszelle erlaubt Streptococcus pyogenes-DNase B, die von einer DNA, die innerhalb des Expressionsvektors eingeschlossen ist, kodiert wird, in einer nachweisbaren Menge zu exprimieren. Die exprimierte S. pyogenes-DNase B kann entweder von der ganzen das Enzym produzierenden Zelle ausgeschieden oder nicht ausgeschieden werden und kann in löslicher oder unlöslicher Form sein.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist im wesentlichen gereinigtes S. pyogenes DNase B Enzym, welches ein Protein mit einer Aminosäuresequenz aus 4 umfasst.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von im Wesentlichen gereinigtem Streptococcus pyogenes-DNase B-Enzyms, umfassend:

(1) das Züchten der bakteriellen Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor gemäß der vorliegenden Erfindung transformiert wird;
(2) das Verwenden der gezüchteten bakteriellen Wirtszelle, um das DNase B-Enzym zu exprimieren; und
(3) das Reinigen des Enzyms aus der gezüchteten bakteriellen Wirtszelle.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist das Streptococcus pyogenes-DNase B-Enzym, das an seinem Aminoterminus mit einer Leadersequenz fusioniert wird, wobei das Leader-Peptid die Sequenz M-N-L-L-G-S-R-R-V-F-S-K-K-C-R-L-V-K-F-S-M-V-A-L-V-S-A-T-M-A-V-T-T-V-T-L-E-N-T-A-L-A-R (SEQ ID NO: 1) aufweist.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Translations- oder Transkriptionsfusion von allen oder einem Teil des S. pyogenes-DNase B-Gens oder Proteins mit einem anderen Gen oder Protein, wobei die resultierende genetische Konstruktion einige veränderte Eigenschaften hat. Diese Eigenschaften schließen ein: (1) RNA-Expression auf hohem Niveau; (2) Proteinexpression auf hohem Niveau; (3) ein zweites funktionelles Enzym, Rezeptor oder anderes aktives Protein in der Fusion; (4) die Fusion der DNase B an einen Affinitätsliganden; (5) die Herstellung eines Proteins mit höherem Molekulargewicht; und (6) erhöhte Immunreaktivität.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist im Wesentlichen gereinigtes natürliches Streptococcus pyogenes-DNase B-Enzym, das im Wesentlichen frei von Proteinen ist, außer Streptokokken-DNase B-Enzym und das an seinem Aminoterminus mit einer Leadersequenz fusionierte Streptokokken-DNase B-Enzym. Das im Wesentlichen gereinigte Protein ist im Wesentlichen frei von mitogener Aktivität. Das im Wesentlichen gereinigte Protein kann, in Abhängigkeit von dem isoelektrischen Punkt (pI) weiter zu zwei Fraktionen gereinigt werden, der Fraktion I und der Fraktion II. Jede Fraktion kann zu einer Präparation gereinigt werden, die im Wesentlichen frei von anderen Fraktionen ist.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Herstellung von im Wesentlichen gereinigter, natürlicher S. pyogenes-DNase B-Enzym kann umfassen:

(1) das Absorbieren an oder das Eluieren von Diethylaminoethylzellulose zur Herstellung eines ersten Eluats;
(2) das Chromatographieren des ersten Eluats an Phenylagarose zur Herstellung eines zweiten Eluats;
(3) das Chromatographieren des zweiten Eluats an Heparinagarose zur Herstellung eines dritten Eluats; und
(4) das Chromatographiefokussieren des dritten Eluats zur Herstellung eines im Wesentlichen gereinigten DNase B-Enzyms. Vorzugsweise umfasst das Verfahren weiterhin die Reinigung von der im Wesentlichen gereinigten DNase B durch Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie. Die Abtrennung der Fraktionen I und II findet an dem Chromatographie-Fokussierungsschritt statt als eine Konsequenz der abweichenden pIs der Enzyme der beiden Fraktionen.

Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine einzelsträngige Nukleinsäureprobe, die mit wenigstens ungefähr 17 Nukleotiden der DNA-Sequenz, die für die aminoterminalen 24 Aminosäuren des Streptococcus pyogenes-DNase B-Enzyms kodieren, hybridisiert, nicht einschließend beliebige Teile der Leadersequenz davon, mit nicht mehr als ungefähr einem Fehler von 30%.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt Abschnitte der DNA-Sequenz von ausreichender Größe und Spezifität ein, um als Primerstellen für Amplifikationsreaktionen, wie Polymerasekettenreaktion (PCR), Ligasekettenreaktion (LCR), RCR oder andere DNA-Amplifikationsreaktionen, zu dienen. Die gleichen Abschnitte der DNA-Sequenz von S. pyogenes B können auch als spezifische Sonden zum Nachweis von homologen Sequenzen ohne DNA-Amplifikation dienen.
Die im Wesentlichen gereinigte S. pyogenes-DNase B kann mittels allgemeiner, im Stand der Technik bekannter Methoden zur Herstellung von Antikörpern verwendet werden, die spezifisch die DNase B binden. Die Antikörper können entweder polyklonal oder monoklonal sein.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis und/oder Bestimmen von Anti-Streptococcus pyogenes-DNase B-Antikörper in einer Testprobe. Das Verfahren umfasst die Schritte:

(1) das Bereitstellen einer Testprobe, die im Verdacht steht, Anti-Streptococcus pyogenes-DNase B-Antikörper zu enthalten;
(2) das Zugeben einer Menge von Streptococcus pyogenes-DNase B-Enzym gemäß der vorliegenden Erfindung zu der Testprobe, wobei die Menge zur Herstellung eines nachweisbaren Niveaus enzymatischer Aktivität in Abwesenheit der Inhibition der enzymatischen Aktivität durch Anti-DNase B-Antikörper in der Testprobe ausreicht; und
(3) das Bestimmen des Niveaus der Aktivität des DNase B-Enzyms in der Testprobe mittels Durchführen eines Enzymtests zum Nachweisen und/oder Bestimmen des Anti-Streptococcus pyogenes-Antikörpers in der Testprobe.

Ein alternatives Verfahren zur Bestimmung von Anti-DNase B-Antikörper umfasst die Schritte:

(1) das Binden von Streptococcus pyogenes-DNase B-Enzym gemäß der vorliegenden Erfindung an einen festen Träger, wie Latexpartikel;
(2) das Umsetzen einer Testprobe, die im Verdacht steht, Anti-Streptococcus pyogenes-DNase B-Antikörper zu enthalten, mit dem an den festen Träger gebundenen Streptococcus pyogenes-DNase B-Enzym, um den Antikörper an das Enzym zu binden und somit an den festen Träger; und
(3) das Nachweisen des an den festen Träger gebundenen Antikörpers, zum Nachweisen und/oder zum Bestimmen des Antikörpers in der Testprobe.

Dieser Ansatz kann für nephelometrische, turbidimetrische, Agglutinations- oder ELISA-Verfahren der Quantifikation verwendet werden.
Ein alternatives Verfahren zum Nachweisen von S. pyogenes-DNase B-Antikörper umfasst:

(1) das Herstellen einer gepufferten Lösung der DNase B; (2) das Umsetzen der gepufferten DNase B-Lösung mit einer Testprobe, die im Verdacht steht, Anti-S. pyogenes-DNase B-Antikörper zu enthalten; und (3) das Nachweisen einer Reaktion zwischen der DNase B und dem Anti-DNase B-Antikörper durch Beobachten und/oder Messen einer Änderung der Lichtabsorption und/oder Lichtstreuung in der Lösung.

Ein weiteres alternatives Verfahren zum Nachweisen des Anti-DNase B-Antikörpers ist Kapillarelektrophorese.
Da die klonierte Sequenz einen mit dem S. pyogenes-DNase B-Gen assoziierten Promotor einschließt, ist ein weiterer Aspekt der Erfindung ein Verfahren zur Verwendung des Promotors, der ursprünglich mit dem S. pyogenes-DNase B-Gen assoziiert war, zum Exprimieren eines Proteins, außer DNase B. Dieses Verfahren umfasst:

(1) das Abtrennen des Promotors, der ursprünglich mit dem S. pyogenes-DNase B-Gen assoziiert war, aus dem S. pyogenes-DNase B-Gen;
(2) das funktionsfähige Verknüpfen des Promotors mit einem Strukturgen für ein S. pyogenes-Protein, außer dem Gen für DNase B; und
(3) das Exprimieren des Proteins, das von dem Strukturgen kodiert wird.

Das Protein kann in S. pyogenes oder in einem anderen Prokaryonten, außer S. pyogenes, exprimiert werden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine im Wesentlichen gereinigte Promotorsequenz, die von der Promotorsequenz abstammt, die ursprünglich mit S. pyogenes-DNase B assoziiert war, die darin eine Startstelle für die Transkription und Stellen, die homolog zu den Konsensusstellen –10 und –35 des Bakterienpromotors sind, einschließt.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Leadersequenz M-N-L-L-G-S-R-R-V-F-S-K-K-C-R-L-V-K-F-S-M-V-A-L-V-S-A-T-M-A-V-T-T-V-T-L-E-N-T-A-L-A-R (SEQ ID NO: 1) zur Expression eines Proteins in einem Prokaryonten. Dieser Aspekt leitet sich aus dem Befund ab, dass, wenn das gesamte klonierte DNase B-DNA-Segment, einschließlich des Leader-Peptids, in Escherichia coli exprimiert wird, das Protein in das Kulturmedium ausgeschieden wird. Ein Verfahren zur Verwendung des Leader-Peptids zur Expression eines Proteins in einem Prokaryonten umfasst:

(1) das Fusionieren der für das Protein kodierenden DNA, mit für das Leader-Peptid kodierender DNA, so dass die fusionierte DNA für ein rekombinantes Protein kodiert, mit einem einzelnen Leserahmen, wobei das Leader-Peptid an dem Aminoterminus des Proteins liegt;
(2) das Einführen der fusionierten DNA in den Prokaryonten; und
(3) das Exprimieren der fusionierten DNA in dem Prokaryonten, so dass das rekombinante Protein in einer gewinnbaren Menge erzeugt wird.

Der Prokaryont kann E. coli sein oder ein Gram-positives Bakterium, wie eine Staphylokokken-, Streptokokken- oder Streptomyces-Spezies.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
Diese und andere Merkmale, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden besser verstanden werden durch Bezug auf die folgende Beschreibung, anliegende Ansprüche und die begleitenden Figuren, wobei:
1 zeigt eine partielle Restriktionskarte der Region, die die klonierte DNase B enthält, wobei die Region der chimären DNA in dem Klon und die Lokalisation des Gens für DNase B angezeigt wird;
2 zeigt die Lokalisation der Subklone der klonierten DNA von 1 und zeigt Nukleaseaktivität, die von den Subklonen erzeugt wird;
3 zeigt die DNA-Sequenz des Klons, dessen partielle Restriktionskarte in 1 gezeigt ist;
4 zeigt die Aminosäuresequenz des rekombinanten DNase B-Proteins, das aus der DNA-Sequenz aus 2 abstammt, wobei der Aminoterminus als Ergebnis des Sequenzierens von natürlich vorkommender, gereinigter DNase B bestimmt wurde;
5 zeigt die DNA-Sequenz einer Konstruktion zum Fusionieren des Bakteriophagen-λ-Promotors mit der die DNase B-Sequenz kodierenden DNA, zusammen mit den Primern, die für PCR bei der Herstellung der Konstruktion verwendet wurden;
6 ist ein Graph, der die Inaktivierung von rekombinanter DNase B durch humanes Anti-DNase B-Serum abbildet;
7 zeigt die DNA-Sequenz stromaufwärts von dem offenen Leserahmen in der klonierten DNA und die Konsensussequenz von einem E. coli-Promotor;
8 ist eine Korrelationskurve, die die Übereinstimmung zwischen der Bestimmung des Anti-DNase B-Antikörpers in menschlichem Serum unter Verwendung rekombinanten DNase B-Enzyms und unter Verwendung kommerziell erhältlichen DNase B-Enzyms, das von S. pyogenes isoliert wurde, zeigt; und
9 ist ein Graph, der die im Wesentlichen abwesende mitogene Aktivität von beiden rekombinanten DNase B und gereinigten Präparationen von natürlich vorkommender DNase B zeigt.
BESCHREIBUNG
Um der Nachfrage nach einer kommerziell verwendbaren Quelle von Streptococcus pyogenes-DNase B-Enzym zu entsprechen, haben wir das Gen für DNase B aus S. pyogenes-genomischer DNA in Escherichia coli kloniert. Trotz der bedeutenden evolutionären Unterschiede zwischen S. pyogenes und E. coli, wie dies sowohl durch die bedeutende Divergenz in der Sequenz der 18 S ribosomalen RNAs der beiden Spezies, als auch durch den wesentlichen Unterschied in Morphologie und anderen taxonomischen Charakteristika angezeigt wird (E. coli ist ein Gram-negatives Bazillus, während S. pyogenes eine Gram-positive Kokke ist) angezeigt wird, haben wir ein solch hohes Niveau der Expression des klonierten Gens in E. coli sowie der Aktivität des exprimierten Proteins erreicht, dass eine Rasteruntersuchung mittels eines enzymatischen Tests durchgeführt werden konnte, der von der Aktivität des exprimierten Proteins abhängt.
I. KLONIERUNG UND EXPRESSION DES STREPTOKOKKEN-DNASE B-GENS IN E. COLI
Die Klonierung und Expression von Streptococcus pyogenes-DNase B-Gen in E. coli macht die folgenden Schritte erforderlich, die mit Bedacht optimiert wurden, um die Klonierung des intakten Gens in einer Form zu erreichen, in der das aktive Enzym von dem Gen exprimiert wird:

(1) das Isolieren von genomischer DNA;
(2) das Herstellen von genomischen DNA-Fragmenten zur DNA-Klonierung;
(3) das Einschließen von DNA-Fragmenten in Klonierungsvektoren;
(4) das Infizieren von Bakterien und Selektion; und
(5) das Exprimieren und das Rasteruntersuchen;
(6) das Charakterisieren des Klons und das DNA-Sequenzieren.

A. Das Isolieren von genomischer DNA
Die genomische DNA wird vorzugsweise aus S. pyogenes unter Bedingungen isoliert, die sowohl die Aktivität von endogener Nuklease minimieren als auch andere Faktoren minimieren, die DNA abbauen oder denaturieren können. Dies macht Zelllyse und Abbau von Protein erforderlich. Ein bevorzugtes Verfahren zum Lysieren von Zellen ist die Inkubation mit proteolytischen Enzymachromopeptidase bei 65°C, gefolgt von der Inkubation mit dem chaotropischen Detergens Natriumdodecylsulfat (SDS). Dieses Verfahren wird am Bevorzugtesten in Gegenwart von einem Chelatisierungsmittel, wie EDTA, durchgeführt. Alternativ können andere Proteasen, wie Pronase und Proteinase K, zur Lyse der Zellen verwendet werden. Andere Lyseverfahren sind im Stand der Technik bekannt (S. Horinouchi et al., "A New Isolation Method of Plasmid Deoxyribonucleic Acid from Staphylococcus aureus Using a Lytic Enzyme of Achromobacter lyticus," Agric. Biol. Chem. 41: 2487–2489 (1977)).
Vorzugsweise wird die DNA dann mit Phenol oder Phenol-Chloroform extrahiert, und die extrahierte DNA wird mit Ethanol präzipitiert. Eine geeignete Extraktionssequenz sind zwei Extraktionen mit einem gleichen Volumen von Phenol, gefolgt von einer Extraktion mit einem 1 : 1-Gemisch von Phenol/Chloroform (Beispiel 1). Der Extraktionspuffer enthält vorzugsweise ein Chelatisierungsmittel, wie EDTA, zur Minimierung der Nukleaseaktivität. Solche Methoden sind wohlbekannt und beschrieben, z. B. in D. M. Wallace, "Large- and Small-Scale Phenol Extractions," Meth. Enzymol. 152: 33–40 (1987) und in D. M. Wallace, "Precipitation of Nucleic Acid," Meth. Enzymol. 152: 41–48 (1987).
Eine geeignete Quelle von DNA ist der Stamm ATCC Nr. 14289 von S. pyogenes, auch bekannt als C203S., eine nicht-M-enthaltende Variante vom Stamm C203. Allerdings könnten ähnliche Methoden für andere Stämme von S. pyogenes, die das Gen für DNase B enthalten, verwendet werden.
Vorzugsweise wird die isolierte DNA nach Extraktion und Ethanolpräzipitation mit RNase A behandelt und dann weiter in einem Cäsium-Chlorid-Gradienten gereinigt.
B. Herstellung von DNA-Fragmenten zum Klonieren
Die isolierte genomische DNA wird vorzugsweise vor dem Klonieren fragmentiert. Am meisten bevorzugt wird die Fragmentierung durchgeführt, indem die DNA durch eine Spritzennadel, am meisten bevorzugt in einer 25-Gauge-Spritzennadel, ungefähr 300 Mal passiert wird. Dies führt zu gescherter DNA mit einer durchschnittlichen Größe von ungefähr 6–8 kb.
In einer weniger bevorzugten Alternative kann ein Teilverdau mit einer Restriktionsendonuklease verwendet werden, wie z. B. Sau 3A oder Mbo I. Dies ist z. B. in A. -M. Frischauf, "Digestion of DNA: Size Fractionation," Meth. Enzymol. 152: 183–189 (1987), die per Referenz eingeschlossen wird, beschrieben.
C. Einschluss von DNA-Fragmenten in Klonierungsvektoren
Der nächste Schritt ist der Einschluss von den DNA-Fragmenten in den geeigneten Klonierungsvektor. Solch ein Klonierungsvektor umfasst typischerweise die für S. pyogenes-DNase B kodierende DNA-Sequenz, die funktionsfähig mit mindestens eine Kontrollsequenz verknüpft ist, die mit einer geeigneten bakteriellen Wirtszelle kompatibel ist. Solche Kontrollsequenzen schließen Operatoren und Promotoren ein. Geeignete Promotoren schließen Bakteriophage-λ-p_L-Promotor, einen Hybrid-trp-lac-Promotor und Bakteriophage-T7-Promotor ein. Der Klonierungsvektor umfasst ferner vorzugsweise eine geeignete Ribosomenbindungsstelle zur Expression. Ein bevorzugter Klonierungsvektor ist λgt11 (R. A. Young und R. W. Davis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1194 (1983), der die durch einen lac-Promotor kontrollierte Expression erlaubt, der in den Vektor eingeschlossen wird und funktionsfähig mit der klonierten DNA verknüpft ist. Andere geeignete Klonierungsvektoren sind im Stand der Technik allgemein bekannt und beschrieben, z. B. in J. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, Bd. 3, Kap. 17, betitelt "Expression of Cloned Genes in Escherichia coli", und hier per Referenz eingeschlossen. Für den Phagen λgt11 wird die DNA in eine Eco RI-Stelle insertiert. Für solches Klonieren wird die gescherte DNA vorzugsweise unter Verwendung von E. coli-Ligase und dann T4-DNA-Polymerase präpariert, gefolgt von dem Zugeben von Eco RI-Linkern. Diese Eco RI-terminierten Fragmente können nach Verdau mit Eco RI-Restriktionsendonuklease an λgt11-Arme ligiert werden. Vorzugsweise werden die internen Eco RI-Stellen durch Verwendung von Eco RI-Methylase während dieses Verdauverfahrens blockiert, da die Restriktionsendonuklease methylierte DNA an den Adeninresten in der Erkennungsstelle durch die Methylase nicht verdaut.
Nach Abschluss der Ligationsreaktion wird die DNA in Bakteriophage-λ-Köpfe in vitro verpackt unter Verwendung eines aus Bakterien hergestellten Gemisches von Extrakten, wobei die Bakterien mit Bakteriophage-λ-Mutanten der Gene infiziert sind, die für den Zusammenbau der Phagen erforderlich sind. Verpackungsverfahren sind im Stand der Technik wohlbekannt und beschrieben, z. B. in Sambrook et al., supra, Bd. 1, S. 2.95–2.108.
D. Infektion von Bakterien und Selektion
Die mittels in vitro-Verpackung zusammengesetzten Phagenpartikel werden zur Infektion von empfänglichen E. coli-Bakterien verwendet. Ein besonders bevorzugter Stamm von bakteriellen Wirtszellen ist Y1090 (-pMC9), das heißt, dem das pMC9-Plasmid fehlt. Ein geeignetes Verfahren ist es, die Plaques mit einem Topagar zu überdecken, überdeckt von DNase-Testagar (Difco, Detroit, Michigan), enthaltend 0,01% Toluidin blue 0 als ein Farbindikator. Dies erlaubt den Nachweis von Plaques, die das DNase B-Gen exprimieren.
Das unerwartet hohe Niveau der Expression des DNase B-Gens in diesem System erlaubte den direkten Nachweis von positiven Klonen mittels direkten Nachweises der resultierenden enzymatischen Aktivität, ohne dass eine immunologische Rasteruntersuchung erforderlich ist, die üblicherweise erforderlich ist für den Nachweis der klonierten Genprodukte.
Ein Verfahren zur Herstellung von im Wesentlichen gereinigtem Streptococcus pyogenes-DNase B-Enzym unter Verwendung von transfizierten Wirtszellen kann umfassen:

(a) das Züchten einer bakteriellen Wirtszelle, die mit einem geeigneten Expressionsvektor, der ein Bakteriophage-λ-Derivat sein kann, transformiert ist;
(b) die Verwendung der gezüchteten transformierten bakteriellen Wirtszelle zur Expression des DNase B-Enzyms; und
(c) das Reinigen des Enzyms aus der gezüchteten transformierten bakteriellen Wirtszelle.

E. Charakterisierung des Klons und DNA-Sequenzierung
Der λgt11-Phage, enthaltend das S. pyogenes-DNase B-Gen (bezeichnet mit 2–6) wurde isoliert, und die DNA wurde aus dem Phagen hergestellt. Dieser Klon wurde mittels Restriktionsanalyse analysiert, und die Ergebnisse sind in 1 gezeigt. Die Analyse von Eco-RI- und Eco-RI/Sac I-Subklonen auf das Vorhandensein von Nukleaseaktivität zeigt, dass Teile des DNase B-Gens innerhalb der internen Sac-I- bis zu der Eco-RI-Region lokalisiert waren, wie in 2 gezeigt.
Das Sequenzieren der klonierten DNA kann unter Verwendung von Standardmethoden durchgeführt werden, z. B. des Sanger-Didesoxynukleotid-Kettenterminationsverfahren. Die Sequenzanalyse kann durch Primingsynthese innerhalb des λgt11-Phagen über die Region hinweg eingeleitet werden, die im Verdacht steht, DNase-Aktivität zu haben. Ergebnisse solcher Sequenzierung sind in 3 gezeigt.
Die klonierte DNA, deren Sequenz in 3 gezeigt ist, schließt einen langen, offenen Leserahmen (ORF) ein. Die Aminosäuresequenz, die aus der Translation dieses ORF abstammt, ist in den 3 und 4 gezeigt. Die Aminosäuresequenz des 5'-terminalen Abschnitts dieses ORF, beginnend bei Aminosäure 44 (Gln), stimmt überein mit der Aminosäuresequenz, die durch Sequenzieren gereinigter, natürlich vorkommender S. pyogenes-DNase B (Sektion IV) abgeleitet wurde.
Entsprechend schließt die Erfindung im Wesentlichen gereinigte DANN ein, umfassend DNA, die für eine Aminosäuresequenz kodiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus der Aminosäuresequenz von (i) Streptococcus-pyogenes-DNase B- Enzym, wie in 4 gezeigt. Die DNA ist im Wesentlichen frei von DNA, die nicht die Aminosäuresequenz von 4 kodiert, außer für ein Leader-Peptid, das an den Aminoterminus von S. pyogenes-DNase B-Enzym fusioniert ist. Wie weiter unten beschrieben, schließt das Translationsprodukt, das aus dem offenen Leserahmen hergestellt wurde, ein Leader-Peptid ein.
F. Insertion des klonierten Gens für S. pyogenes-DNase B in E. coli-Expressionsplasmid Δ33, das DNase B unter Regulation des Bakteriophagen λpL-Promotors herstellt Das klonierte Gen für S. pyogenes-DNase B kann auf das E. coli-Expressionsplasmid Δ33 übertragen werden, das das klonierte Gen unter Kontrolle des Bakteriophagen λ-Promotors-pL exprimiert. Das S. pyogenes-DNase B-Gen wird vorzugsweise mittels PCR zum Anfügen modifizierter Enden an das DNase B-Gen aus dem λ2–6-Klon in das Expressionsplasmid insertiert. Die folgenden Nukleotide können als Primer für die PCR-Reaktion gemäß Standard-PCR-Verfahren mit Thermus-aquaticus-DNA-Polymerase verwendet werden:
Diese Primer können mit λgt11-DNase B-Klon-2–6-DNA als Matrize (engl. template) zur Amplifikation verwendet werden. Die resultierenden Amplifikationsprodukte können mit der Endonuklease Bam HI und Sal I vor der Insertierung in den Δ33-Expressionsvektor verdaut werden. Dies erzeugt eine translationale Fusion, die durch den pL-Promotor reguliert wird. Ein geeigneter Stamm von E. coli (C600C1⁺, gal K) wird mit der insertierten DNA transformiert, und die das Plasma enthaltenden Bakterien können durch Selektion mit Ampicillin selektiert werden. DNA kann aus diesen Kolonien mittels Standard-Minipräparationstechniken hergestellt werden, z. B. jene, die in F. M. Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology" (John Wiley & Sons, New York (1987) § 1.6, beschrieben sind, gefolgt von Schneiden des isolierten Plasmids mit den geeigneten Restriktionsendonukleasen (Bam HI und Sal I) um zu bestimmen, ob das Plasmid das gewünschte rekombinante Fragment enthält. Plasmide der gewünschten Konstruktion können in einen E. coli-Wirtsstamm eingebracht werden, der der Induktion durch Nalidixinsäure-Protokoll unterzogen wird, wie in J. E. Mott et al., "Maximizing gene expression from plasmid vectors containing the λpL promoter: Strategies for overproducing transcription termination factor ρ," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 88–92 (1985), das per Referenz eingeschlossen wird, beschrieben ist. Es ist im Stand der Technik bekannt, dass Nalidixinsäure DNA schädigt und recA-Protein induziert, ein Rückgewinnungsprotein (engl. recovery protein) für E. coli. Das recA-Protein hat Proteaseaktivität, was zur Inaktivierung von λCI⁺-Repressor führt; diese Inaktivierung führt zur Überexpression durch den pL-Promotor. Andere Verfahren zur Transkriptionsaktivierung des pL-Promotors können auch verwendet werden. Wenn Nalidixinsäure-Induktion verwendet wird, werden substantielle Mengen von DNase B aus der Zelle ausgeschieden.
II. EIGENSCHAFTEN VON REKOMBINANT HERGESTELLTEM ENZYM
Das rekombinant hergestellte Enzym aus λ 2–6-Phage enthält ein Leader-Peptid, das an des Aminoterminus der DNase fusioniert ist. Dieses Leader-Peptid hat die Sequenz M-N-L-L-G-S-R-R-V-F-S-K-K-C-R-L-V-K-F-S-M-V-A-L-V-S-A-T-M-A-V-T-T-V-T-L-E-N-T-A-L-A-R (SEQ ID NO: 1).
Immunoinhibitions-Tests (Beispiel 7) zeigen, dass rekombinante S. pyogenes-DNase B durch Anti-DNase B-Enzym in menschlichem Serum in einer Weise inhibiert wird, die identisch ist mit nicht-rekombinantem DNase B-Enzym, basierend auf der Fähigkeit der DNase, einen DNA-Farbstoffkomplex als Substrat zu benutzen.
IV. VERWENDUNG DES LEADER-PEPTIDS FÜR S. PYOGENES-DNASE B-ENZYM
Das Leader-Peptid für DNase B mit der Aminosäuresequenz M-N-L-L-G-S-R-R-V-F-S-K-K-C-R-L-V-K-F-S-M-V-A-L-V-S-A-T-M-A-V-T-T-V-T-L-E-N-T-A-L-A-R (SEQ ID NO: 1) kann zur Expression und Herstellung von rekombinanten Proteinen in Bakterien verwendet werden. Ein geeignetes Verfahren zur Verwendung des Leader-Peptids umfasst:

(1) das Fusionieren der DNA, die für das Protein kodiert, an DNA, die für ein Leader-Peptid mit einer Aminosäuresequenz von M-N-L-L-G-S-R-R-V-F-S-K-K-C-R-L-V-K-F-S-M-V-A-L-V-S-A-T-M-A-V-T-T-V-T-L-E-N-T-A-L-A-R (SEQ ID NO: 1), so dass die fusionierte DNA ein rekombinantes Protein mit einem Einzel-Leserahmen bildet, wobei das Leader-Peptid an dem Aminoterminus des Proteins liegt;
(2) das Einführen der fusionierten DNA in den Prokaryonten; und
(3) das Exprimieren der fusionierten DNA in dem Prokaryonten, so dass das rekombinante Protein in einer gewinnbaren Menge hergestellt wird.

Das Bakterium kann Escherichia coli oder alternativ ein Gram-positives Bakterium, wie eine Staphylokokke, Streptokokke und Streptomyces, sein.
Vorzugsweise wird das rekombinante Protein von einem Prokaryonten in sein Kulturmedium ausgeschieden, so dass es aus dem Kulturmedium gewonnen werden kann.
Verfahren zum Fusionieren des DNA-Segmentes, das für das Leader-Peptid kodiert, an das Gen, das für das Protein kodiert, das herzustellen ist, sind in dem Stand der Technik allgemein bekannt und schließen Stumpfenden-Ligation (engl. blunt-end ligation) ein. Stumpfenden-Ligation wird typischerweise mit T4-Ligase durchgeführt (V. Sgaramella & H. G. Khorana, "Studies on Polynucleotides. CXII. Total Synthesis of the Structural Gene for an Alanine Transfer RNA from Yeast. Enzymic Joining of the Chemically Synthesized Polydeoxynucleotides to Form the DNA Duplex Representing Nucleotide Sequence 1 to 20, "J. Mol. Biol. 72: 427 (1972); V. Sgaramella & S. D. Ehrlich, "Use of the T4 Polynucleotide Ligase in the Joining of Flush-Ended DNA Segments Generated by Restriction Endonucleases, "Eur. J. Biochem. 86: 531 (1978)), und wird vorzugsweise in Gegenwart von Kondensierungsmitteln, wie Polyethylenglykol oder Hexaminkobaltchlorid, durchgeführt.
Alternativ, kann die Endonuklease zur Erzeugung kohäsiver Enden zur Ligation verwendet werden, sofern eine geeignete Restriktionsendonuklease existiert, die kohäsive Enden erzeugt und beide schneiden kann, sowohl den Abschnitt der DNA, der für den Linker kodiert, der dem Carboxyl-Terminus des Linkers entspricht, als auch den Abschnitt des Gens, der für das Protein kodiert, der dem Aminoterminus des Proteins entspricht.
V. REINIGUNG VON S. PYOGENES-DNASE B-ENZYM
A. Reinigung von natürlicher S. pyogenes-DNase B
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein verbessertes Verfahren zur Reinigung von natürlichem S. pyogenes-DNase B-Enzym. Dieses Verfahren wurde entwickelt, indem Polyacrylamidgel-Analyse der DNase B verwendet wurde, die in den kommerziellen Testreagenzien gefunden wurde, und ein Vergleich zu dem Verhalten in der Gelelektro phorese des rekombinanten Enzyms. Das Reinigungsverfahren setzt die folgenden Schritte ein, beginnend mit einem groben Extrakt oder anderer Quelle des Enzyms: (1) das Absorbieren an und Elution von Diethylaminoethylzellulose zur Herstellung eines ersten Eluats; (2) das Chromatographieren des ersten Eluats auf Phenylagarose zur Herstellung eines zweiten Eluats; (3) das Chromatographieren des zweiten Eluats auf Heparinagarose zur Herstellung eines dritten Eluats; und (4) das Chromatographiefokussieren des dritten Eluats zur Herstellung des im Wesentlichen gereinigten DNase B-Enzyms. Das Chromatographiefokussieren wird vorzugsweise auf einer Mono-P-Säule durchgeführt. Vorzugsweise wird die gereinigte DNase weiter fraktioniert, um Ampholyte, die während des Chromatographiefokussierens verwendet werden, zu entfernen, unter Verwendung von Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie auf C4 mit einem Gradienten von 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser und 0,08% Trifluoressigsäure in Acetonitril.
Das Reinigungsverfahren führt zu im Wesentlichen gereinigtem Streptococcus pyogenes-DNase B-Enzym, das im Wesentlichen frei von Proteinen ist, außer Streptococcus-DNase B-Enzym und außer Streptococcus-DNase B-Enzym, das mit seinem Aminoterminus mit einem Leader-Peptid fusioniert ist. Das im Wesentlichen gereinigte Protein ist im Wesentlichen frei von mitogener Aktivität (siehe Beispiel 6 unten).
Die Reinigung führt zu zwei im Wesentlichen gereinigten DNase B-Fraktionen, die sich in der Ladung unterscheiden. Jede der Fraktionen ist im Wesentlichen frei von der anderen Fraktion und anderen Proteinen. Diese Fraktionen werden als Fraktion I, welche aus der Chromatofokussierungssäule bei pH 8,55–8,4 eluiert, und Fraktion II, welche aus der Chromatofokussierungssäule bei pH 8,22–8,13 eluiert, bezeichnet. Die Molekulargewichtsdaten, die aus Massenspektroskopie (Beispiel 3) erhalten wurden, zeigen an, dass der Unterschied des Molekulargewichts zwischen den Fraktionen I und II der gereinigten natürlichen DNase B mit einer geringfügigen Modifikation von einer ansonsten identischen Aminosäuresequenz übereinstimmt. Eine mögliche Modifikation ist die Deaminierung, welche den angemessenen pI-Shift verursachen würde.
Das gereinigte Protein kann sequenziert werden. Die ersten 23 Aminosäuren der beiden Fraktionen I und II erzeugten die folgenden lesbaren Sequenzen: Q-T-Q-V-S-N-D-V-V-L-N-D-G-A-S-X-Y-L-N-E-A-L-A (SEQ ID NO: 4), wobei X Tryptophan oder Lysin darstellt.
Wie weiter unten im Detail beschrieben, stellt diese Sequenz ein Mittel zur Gestaltung von Sonden dar, die geeignet sind zur Hybridisierung mit mindestens einer DNA-Sequenz, die für die aminoterminale Aminosäuresequenz des Gens kodiert.
B. Reinigung von rekombinant hergestelltem S. pyogenes-DNase B-Enzym
Rekombinante S. pyogenes-DNase B, welche auf hohem Niveau in den chimären Zellen vorhanden ist, kann durch ähnliche Methoden gereinigt werden. Z. B. kann die rekombinante DNase B mittels Chromatographie auf Q-Sepharose (Trimethylaminomethylagarose), Ammoniumsulfatpräzipitation, Chromatographie auf Heparinsepharose und Chromatographie auf Q-Sepharose aus Phagenlysaten gereinigt wurden, die aus E. coli gesammelt wurden, die mit λ-DNase B 2–6-Phagen infiziert wurden. Die rekombinante DNase B, die in E. coli hergestellt wurde, die mit rekombinantem Plasmid Δ33 transfiziert wurde, das S. pyogenes-DNase B aus dem pL-Promotor exprimiert, kann mittels Chromatographie auf Heparinsepharose, Chromatographie auf Q-Sepharose und Umkehrphasen-Hochdruck-flüssigkeits-Chromatographie gereinigt werden. Andere Reinigungsverfahren sind bekannt und können von einem Fachmann verwendet werden.
VI. HERSTELLUNG VON DNA-PROBEN, DIE IN DER LAGE SIND, MIT DER KLONIERTEN DNA ZU HYBRIDISIEREN
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Herstellung von einer Einzelstrang-Nukleinsäuresonde, die mit der DNA-Sequenz hybridisiert, die für die aminoterminalen 24 Aminosäuren des S. pyogenes-DNase B-Enzyms kodiert, mit nicht mehr als ungefähr 30% Fehler. Die Nukleinsäuresonde kann RNA oder DNA sein. Vorzugsweise, wenn die Probe DNA ist, ist der Grad des Fehlers unter Standard-stringenten Bedingungen nicht größer als ungefähr 10%, d. h., solche, die in S. Ausubel et al., in Current Protocols in Molecular Biology (Wiley-Interscience, New York, 1990) beschrieben werden.
Geeignete Sequenzen für solche Sonden können durch Verwendung der Codon-Verwendungstabelle (engl. codon usage table) für enterische Bakterien Gene abgeleitet werden, die für die relevanten Aminosäuren in Tabelle 1 bereitstehen.
CODON-VERWENDUNG FÜR AMINOSÄUREN IN DER AMINOTERMINALEN REGION VON S. PYOGENES-DNASE
Ein Beispiel einer Sonde ist unten gezeigt:
Probe 1): C-A-P-U-A-C-N-C-A-R-T-N-W-S-N-A-A-Y-G-A-Y-G-T (SEQ ID NO: 5)
In dieser Sequenz stellt R ein Purin dar (d. h. A oder G), Y stellt ein Pyrimidin dar (T oder C), S stellt G oder C dar, W stellt A oder T dar und N stellt eine beliebige der vier üblichen Desoxyribonukleotide dar (d. h. A, G, C oder T).
Diese Sonde und andere Sonden können durch Verfahren synthetisiert werden, die im Stand der Technik allgemein bekannt sind, wie Festphasen-DNA-Synthese mittels des Phosphortriester- oder Phosphittriester-Verfahren, wie z. B. in "Nucleic Acids in Chemistry and Biology" (G. M. Blackburn & M. J. Gait, Hrsg., IRL Press, Oxford, 1990), Kap. 3, S. 106–123, offenbart.
VI. VERWENDUNG DES STROMAUFWÄRTS-PROMOTORS, DER MIT S. PYOGENES-DNASE B ASSOZIIERT IST
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Isolation und Verwendung eines Stromaufwärts-Promotors, der ursprünglich mit dem S. pyogenes-DNase B-Gen assoziiert ist, zur Expression eines Proteins, außer DNase B. Der Nachweis dieser Promotorsequenz wird weiter unten in Beispiel 11 beschrieben.
Die Promotorsequenz wird in dem λ 2–6 Klon zurückgehalten. Diese Sequenz schließt eine Startstelle zur Transkription und Stellen ein, die im Wesentlichen homolog zu den Konsensusstellen –10 und –35 für bakterielle Promotoren sind (Beispiel 11), etc. Diese im Wesentlichen gereinigte Promotorsequenz liegt innerhalb des Bereichs der Erfindung.
Ein Verfahren zur Verwendung dieser Promotorsequenz zur Expression eines Proteins, außer DNase B, umfasst:

Das Protein kann in S. pyogenes oder in einem Prokaryonten außer S. pyogenes, wie E. coli, exprimiert werden. Der Promotor kann in einen Vektor oder in ein Plasmid zur Expression eines Gens, das funktionsfähig mit dem Promotor in dem Vektor oder Plasmid verknüpft ist, eingeschlossen werden.
VII. VERWENDUNG VON IM WESENTLICHEN GEREINIGTEM DNASE B-ENZYM
Die vorliegende Erfindung schließt ferner verschiedene Verwendungen von im Wesentlichen gereinigtem S. pyogenes-DNase B-Enzym ein, unabhängig davon, ob sie aus natürlichen Quellen oder mittels rekombinanter DNA-Methoden hergestellt wurden.
A. Verwendung des Enzyms zur Herstellung von Antikörpern
Unter den Verwendungen des Enzyms, das nach den erfindungsgemäßen vorliegenden Verfahren hergestellt wurde, ist die Herstellung von Antikörpern. Die Antikörper können entweder polyklonal oder monoklonal sein. Die Herstellung von beiden, polyklonalen und monoklonalen, Antikörpern wird in E. Harlow und D. Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual" (Gold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1988), S. 53–318, beschrieben. Die resultierenden Antikörper können zum Nachweis des S. pyogenes-Enzyms, d. h. in im Verdacht stehenden Kulturen, verwendet werden.
B. Verwendung des Enzyms zum Nachweis von Anti-DNase B-Antikörper
Eine wichtige Verwendung des im Wesentlichen gereinigten S. pyogenes-DNase B-Enzyms der vorliegenden Erfindung ist der Nachweis von Anti-S. pyogenes-DNase B-Antikörpern, wie z. B. in Serum. Wie oben beschrieben, zeigt das Vorhandensein von solchen Antikörpern eine aktive S. pyogenes-Infektion und ein Warnsignal an, dass ernsthafte suppurative Folgekrankheiten auftreten könnte.
Ein Verfahren zum Nachweis des Anti-DNase B-Antikörpers beruht auf der Tatsache, dass der Antikörper in der Lage ist, die Aktivität des Enzyms zu inhibieren. Solch ein Verfahren kann die folgenden Schritte umfassen:

(1) das Bereitstellen einer Testprobe, die im Verdacht steht, Anti-S. pyogenes-DNase B-Antikörper zu enthalten;
(2) das Zugeben einer Menge des S. pyogenes-DNase B-Enzyms gemäß der Erfindung zu der Testprobe, wobei die Menge ausreichend ist zur Herstellung eines nachweisbaren Niveaus von enzymatischer Aktivität in Abwesenheit von Inhibition der enzymatischen Aktivität durch Anti-DNase B-Antikörper in der Testprobe; und
(3) das Bestimmen des Niveaus der Aktivität von DNase B-Enzym in der Testprobe mittels Durchführen eines Enzym-Tests zum Nachweisen und/oder Bestimmen des Anti-S. pyogenes-Antikörpers in der Testprobe.

Der Enzym-Test kann mittels Standardverfahren durchgeführt werden, wie der DNA-Farbstoffkomplex-Abbau-Test von Wampole Laboratories (Cranbury, NJ). Dieser Test beruht auf der Fähigkeit der DNase, einen DNA-Farbstoffkomplex als Substrat zu verwenden. Dieser Komplex zeigt eine maximale Absorptionswellenlänge von 642 nm. Da der Farbstoffkomplex allerdings durch DNase abgebaut wird, gibt es eine Verschiebung in der maximalen Absorptionswellenlänge und eine Verminderung in der Absorption bei 642 nm. Andere enzymatische Tests sind erhältlich, wie viskosimetrische Tests, welche die Fähigkeit des Enzyms messen, lange DNA-Moleküle zu depolymerisieren, wodurch die Viskosität der DNA-enthaltenden Lösungen stark reduziert wird. Alternativ können die Tests durchgeführt werden, indem radioaktive DNA als Substrat verwendet wird und die Freisetzung von Radioaktivität nach Inkubation quantifiziert wird. Andere Verfahren für den Test der Desoxyribonuklease sind im Stand der Technik wohlbekannt.
Ein alternativer Test für Anti-DNase B-Enzym-Antikörper in Serum ist ein ELISA-Test. Dieser Test umfasst:

(1) das Binden des S. pyogenes-DNase B-Enzyms der vorliegenden Erfindung an einen festen Träger;
(2) das Umsetzen einer Testprobe, die im Verdacht steht, Anti-S. pyogenes-DNase B-Antikörper zu enthalten, mit dem S. pyogenes-DNase B-Enzym zum Binden des Antikörpers an das Enzym, und daher an den festen Träger; und
(3) das Nachweisen des Antikörpers, der an den festen Träger gebunden ist, zum Nachweisen und/oder Bestimmen des Antikörpers in der Testprobe.

ELISA-Verfahren sind im Stand der Technik wohlbekannt und beschrieben, z. B. in P. Tijssen, "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays" (Elsevier, Amsterdam, 1985). Der verwendete feste Träger ist typischerweise Plastik, wie Polystyrol, aber auch andere feste Träger, wie Nitrozellulose, können verwendet werden. Das Nachweisen des gebundenen Antikörpers wird typischerweise durch Zugeben eines zweiten Antikörpers, der spezifisch für den ersten Antikörper ist, durchgeführt; wobei der zweite Antikörper nicht das S. pyogenes-DNase B-Enzym bindet. Solch ein Antikörper kann z. B. Enzym-markiertes anti-humanes Immunoglobulin G sein. Die Enzymmarkierung ist typischerweise alkalische Phosphatase, λ-Galactosidase, Glucoseoxidase oder Meerrettichperoxidase. Solche Enzyme ergeben Produkte, die eine optische Absorption im sichtbaren Spektrum haben und entweder visuell oder mit einem Spektrophotometer nachgewiesen werden können.
Andere Methoden zum Nachweisen und/oder Bestimmen der Bildung von Antigen-Antikörper-Komplexen können auch zum Nachweisen (engl. Test) von Anti-DNase B-Antikörper in Serum verwendet werden. Diese Methoden weisen einen aggregierten Antigen-Antikörper-Komplex nach, hier ein Enzym-Antikörper-Komplex, durch Änderung der Lichtabsorption oder Verteilung. Im Allgemeinen umfasst ein solcher Test:

(1) das Herstellen einer gepufferten Lösung der DNase B der vorliegenden Erfindung;
(2) das Umsetzen der gepufferten DNase B-Lösung mit einer Testprobe, die im Verdacht steht, Anti-S. pyogenes-DNase B-Antikörper zu enthalten; und
(3) das Nachweisen einer Reaktion zwischen der DNase B und dem Anti-DNase B-Antikörper durch Beobachten und/oder Messen einer Änderung in der Lichtabsorption und/oder Lichtstreuung in der Lösung.

Die Reaktion zwischen der DNase B und der Anti-DNase B kann durch Nephelometrie oder Turbidimetrie nachgewiesen werden. Ein anderes alternatives Verfahren zum Nachweisen von Anti-DNase B-Antikörper ist Kapillarelektrophorese.
C. Andere Verwendungen
Das rekombinante Protein kann zur Vakzineentwicklung, zum Immunisieren gegen S. pyogenes in empfänglichen Individuen, verwendet werden und kann ferner als ein Aerosol bei der Behandlung von Lungenviskositätssymptomen in Erkrankungen, wie zystische Fibrose verwendet werden, wenn die Viskosität auf Exsudat, enthaltend hohe Konzentrationen von DNA, zurückgeht.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele sind für veranschaulichende Zwecke beabsichtigt und sind nicht beabsichtigt, die Erfindung zu beschränken.
Beispiel 1
Klonierung von Streptococcus pyogenes-DNase B-Gen
Das S. pyogenes-DNase B-Gen wurde mittels eines auf Aktivität basierenden kolorimetrischen Nachweises der Nukleaseaktivität, die von einem rekombinanten λ-Bakteriophagen erzeugt wurde, identifiziert. Der Phage war ein Produkt einer λ-Bibliothek, die gescherte DNA enthielt, die aus genomischer DNA von S. pyogenes (Lansfield Gruppe, ATCC Nr. 14289) gereinigt wurde.
Herstellung einer chromosomalen DNA aus S. pyogenes
Der S. pyogenes-Stamm ATCC 14289 wurde auf Todd-Hewitt-Agarplatten ausgezogen und bei 37°C für zwei Tage inkubiert. Eine einzelne Kolonie wurde zur Inokulation eines Liters Todd Hewitt-Medium mit 10% Kälberserum verwendet. Die Kultur wurde bei 37°C unter Schütteln für ungefähr 36 Stunden kultiviert, um eine hohe Dichte zu erlauben.
Die Zellen wurden mittels Zentrifugation in einer Beckmann J6-Zentrifuge bei 3500 UpM bei 4°C für 45 Minuten gesammelt. Die Zellpellets wurden in 25 ml 40 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA resuspendiert. Die proteolytische Enzymachromopeptidase (60 mg) (Wampole) in 1 ml Puffer, wurde zugegeben, und das Gemisch wurde bei 65°C für eine Stunde inkubiert. Es war keine Lyse sichtbar. Ein Gesamtvolumen von 20 ml 10% SDS wurde dann zugegeben, und die Inkubation wurde für eine Stunde fortgeführt. Die Lyse war sehr sichtbar. 50 Millimeter des Puffers wurden dann zugegeben, um die Konzentration von SDS auf 2,5% zu reduzieren.
Das Gemisch wurde zweimal mit einem gleichen Volumen Phenol extrahiert, gefolgt von einer Extraktion mit Phenol/Chloroform (1 : 1). Die DNA in der wässrigen Phase wurde mittels Ethanol präzipitiert. Die DNA wurde durch Zentrifugation gewonnen. Das Pellet wurde in 4 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA (TE) resuspendiert. RNase A (50 μl bei 10 mg/ml) wurde zugegeben, und das Gemisch wurde bei 37°C für 3 Stunden inkubiert.
Die DNA wurde weiter in einem Cäsiumchlorid-Gradienten gereinigt. Die Endkonzentration von DNA betrug ungefähr 0,5 mg/ml.
Konstruktion von S. pyogenes-Bibliothek in λgt11
Die isolierte chromosomale DNA (300 μml) wurde zu 200 μl TE-Puffer zugegeben. Das Gemisch wurde durch eine 1 ml-Spritze mit einer 25-Gauge-Nadel ungefähr 300mal passiert um die DNA auf eine durchschnittliche Größe von 6 kb zu scheren.
Die gescherte DNA (150 μl) wurde mit E. coli-Ligase zur Reparatur der vorhandenen Nicks in der DNA behandelt, die andernfalls nach weiteren Manipulationen zu Lücken geworden wären. Zu 150 μl der DNA wurden 20 μl 10 × E. coli-Ligasepuffer (0,5 M Tris-HCl, pH 7,6, 100 mM MgCl₂, 100 mM Dithiothreitol und 500 μg/ml Rinderserumalbumin) zugegeben, 20 μl NAD⁺ (36 mM) und 7 μl E. coli-Ligase (New England Biolabs, Beverly, Mass., 4 Einheiten/μl) wurden zu der DNA zugegeben, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 4–5 Stunden stehengelassen. Die Ligase wurde bei 65°C 15 Minuten hitzegetötet. Die DNA wurde mittels Ethanol präzipitiert.
Eco RI-Stellen in der Ligase-behandelten DNA wurden mit Eco-Methylase gemäß dem Protokoll des Herstellers (Promega, Madison, Wis.) methyliert. Dies wurde durchgeführt um interne Eco RI-Stellen, deren Spaltung mit dem Klonierungsverfahren interferieren würde, zu blockieren.
Die gescherten Enden der DNA wurden repariert mit T4-DNA-Polymerase durch Zugeben von 30 μl 0,1 M MgCl₂, 20 μl 2,5 mM eines jeden der vier Desoxyribonukleosidtriphosphate und 2 μl T4-DNR-Polymerase (3000 U/ml) zu dem DNA-Gemisch nach der Methylierung zugegeben. Die Reaktion wurde für 15 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt. Das Gemisch wurde einmal mit Phenol/Chloroform und dann mit Ether extrahiert. Die DNA in der wässrigen Fraktion wurde dann mit Ethanol präzipitiert.
Die Eco-RI-Linker wurden an die DNA ligiert. Die verwendeten Linker waren Octamere von New England Biolabs. Nach der Linker-Ligation wurde die DNA mit einem Überschuss von Eco-RI-Restriktions-Endonukleaseenzym verdaut. DNA des gewünschten Größenbereichs, namentlich 6–8 kb, wurde aus dem Agarosegel nach der Elektrophorese gereinigt. Die DNA wurde mittels Ethanolpräzipitation konzentriert und war dann bereit zur Ligation in λgt11.
Ungefähr 2 μg gescherter DNA wurden mit 1 μg der λgt11-Arme, die vorher mit Eco RI-Restriktionsendonuklease verdaut worden waren und bei denen die terminalen Phosphatreste durch Behandlung mit alkalischer Phosphatase entfernt worden waren, verbunden. Die Ligation wurde mit Bakteriophagen-T4-Ligase in einem Gesamtvolumen von 5 μl durchgeführt. Die Ligationsreaktion wurde bei 4°C über Nacht durchgeführt.
Das gesamte Ligationsgemisch wurde in vitro unter Verwendung des Promega (Madison, Wis.)-Verpackungsextrakts verpackt. Ein μl des verpackten Phagen wurde auf einem Rasen von Y 1090 E. coli in Gegenwart von Isopropylthio-β-D-galactosid (IPG) und dem chromogenen Substrat 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid) (Xgal) ausplattiert, ungefähr 5% der Plaques waren blau. Die Verpackungseffizienz war ungefähr 10⁶ Plaques pro μg DNA.
Rasteruntersuchen von λ-rekombinanten Klonen mit Nukleaseaktivität
Die nicht-amplifizierte Bibliothek (10 μl) wurde mit 0,1 ml einer Übernacht-Kultur von LE 392 ausplattiert. Nach fünf Stunden wurden die Platten mit 0,5 × BBL-DNase-Testagar plus 0,01% Toluidin blue plus 10 mM MgCl₂ überdeckt. Eine Gesamtzahl von 10 Platten wurde rasteruntersucht. 44 rosa Plaques (potentiell Nuklease-positiv) wurden erneut rasteruntersucht. Neun der 44 rosa Plaques erwiesen sich in der wiederholten Rasteruntersuchung konsistent als positiv für Nukleaseaktivität.
Da die Herstellung von S. pyogenes-DNase für die Wirtsbakterien E. coli schädlich ist, war die Plaquegröße dieser Nuklease-positiven Klone viel kleiner als die der Nuklease-negativen Klone. Entsprechend bestand ein Selektionsdruck zur Akkumulation von Mutationen, die die Nukleaseaktivität verringern, was die Aufgabe der Isolierung eines stabilen Nuklease-positiven Klons verkompliziert.
Einer der Vorzüge der Selektion und Rasteruntersuchungsverfahren der vorliegenden Erfindung ist es, den Selektionsdruck zu verringern, um stabile Nuklease-positive Klone zuzulassen. Dazu wurde E. coli-Stamm Y1090 ohne das Plasmid pMC9 als Wirt für Nuklease-tragenden Phagen verwendet. Es wurden Plattenlysate verwendet, um Vorräte zu erzeugen, um die Klone Plaque-zu-reinigen. Für dieses Verfahren wurde der Wirt und der Phage direkt auf 0,5 × BBL-DNase-Testagar plus 0,01% Toluidin blue plus 10 mM MgCl₂ ausplattiert, anstatt sie nach 5 Stunden Inkubation zu überlagern.
Die Lysate der neun rekombinanten Klone wurden auf SDS-Polyacrylamidgelen, die DNA enthielten, analysiert. Die Nuklease behielt in allen neun Klonen ihre Aktivität nach SDS-Denaturierung, und alle hatten das gleiche Molekulargewicht von ungefähr 25 kd.
Diese neun Lysate wurden auf dem PhastGel-System mit IEF 3–9-Gelen zur Elektrofokussierung analysiert. Nach der Elektrophorese wurden die Gele mit 3,5 ml DNase-Substrat (Streptonase-B-Kit) (Difco, Detroit, Michigan) in 1% Agarose in TAE (40 mM Tris, 5 mM Natriumacetat, 1 mM EDTA, pH 8) überlagert. Die Aktivitätsbanden für alle neun Lysate an der Kante des Basisendes des Gels deuten auf einen sehr hohen pI für die klonierte Nuklease hin. Dies deutete auch darauf hin, dass alle neun Klone das gleiche Gen enthielten.
Insbesondere ein als bezeichneter 2–6 Phage, der DNase-Aktivität zeigte, wurde weiter analysiert. Der λ-DNase B- 2–6-Klon wurde mit Restriktionsendonuklease-Analyse analysiert, um das DNA-Fragment zu charakterisieren. Der S. pyogenes-genomische Einschluss in den λ-Vektor in dem 2–6-Klon betrug ungefähr 5,2 kb. Die Lokalisierung des Nukleasegens wurde durch Subklonieren kleiner Regionen des DNase 2–6-Klons zurück in λgt11 und Austesten der Subklone auf Nukleaseaktivität bestimmt. 2 zeigt die Lokalisierung von verschiedenen Subklonen und ihre Nukleaseaktivität. Subklone 1 und 4 erzeugten Nukleaseaktivität, waren aber sehr instabil. Subklone 2 und 3 fehlte Nukleaseaktivität, aber sie waren stabil. Die Ergebnisse dieser Subklonierung deuteten darauf hin, dass wenigstens ein Teil des DNase B-Gens in dem internen Sac-I/Eco-RI-Fragment liegt. Die aminoterminale Sequenz des DNase B-Proteins wurde zusammen mit dem genetischen Code zur Erzeugung eines Satzes von degenerierten Oligonukleotiden verwendet, der zur Hybridisierung des DNase-2-6-Einschlusses und einiger der Subklone verwendet wurde. Diese Oligonukleotide hybridisierten mit dem 3,5 kb-Eco-RI-Fragment in DNase B 2–6 und dem Sac-I/Eco-RI-Fragment in Subklon 3. Diese Daten zeigen zusammen mit den Subklonierungsdaten, dass die Transkription des Nukleasegens sehr wahrscheinlich von links nach rechts, wie dargestellt, ist, und dass die Sac-I-Stelle innerhalb des DNase B-Gens liegt.
Das Kartographieren der S. pyogenes-DNA in Nachbarschaft zu dem 5,2 kb-Einschluss wurde mittels genomischer DNA-Blot-Hybridisierung durchgeführt. Die 3,5 kb- und 1,5 kb-Eco RI-Fragmente des λ-DNase-2–6-DBA wurden Gel-gereinigt und mit ³²P durch Zufallsprimen (engl. random priming) markiert. Die gleichen genomischen Blots wurden mit zwei Proben nacheinander hybridisiert. Eine partielle Restriktionsendonuklease-Karte der Einschlüsse und ihrer benachbarten Regionen in dem S. pyogenes-Chromosom wird in 1 gezeigt.
Beispiel 2
Sequenzieren des Klons 2–6, der das S. pyogenes-DNase B enthält
Eine Nukleotidsequenzanalyse des Klons 2–6 wurde mittels Di-desoxynukleotid-Kettenterminations-Verfahren nach Sanger et al., supra, durchgeführt. Die Sequenzanalyse wurde durch Primingsynthese von innerhalb des λgt11-Phagen des Klons 2–6 über die im Verdacht stehende Region mit DNase-Aktivität hinweg eingeleitet. Die Ergebnisse des Sequenzierens sind in 3 und 4 gezeigt. Die S. pyogenes-DNase B liegt innerhalb des ersten vollständigen offenen Leserahmens der Sequenz.
Beispiel 3
Reinigung von nativer S. pyogenes-DNase B
Native S. pyogenes-DNase B wurde gereinigt unter Verwendung eines kommerziellen DNase B-Test-Reagenzes als ein Marker der richtigen Nuklease. In anderen Worten wurden die Ergebnisse aus der Gelelektrophorese in Extrakten, die aus S. pyogenes ATCC Nr. 14289 hergestellt wurden, mit Polyacrylamidgel-Elektrophorese-Ergebnissen, die mit der DNase B in dem kommerziellen Kit erhalten wurden, verglichen. Das Reinigungsverfahren schloss ein: Chargenabsorption auf DE-23 Diethylaminoethylzellulose (Whatman); (2) Chromatographie auf Phenylsepharose^® (Pharmacia, Uppsala, Schweden); (3) Chromatographie auf Heparin-Sepharose^® (Pharmacia); und (4) Mono-P-Chromatofokussierung.
Bakterienkulturen
Streptococcus pyogenes ATCC Nr. 14289 (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland), das aus A. Bernheimer C203S (nicht-M-enthaltende Variante von C203) abstammt, wurde als Bakterienquelle für die Sammlung von DNase B-enthaltenden Kulturmedien verwendet, wobei das Enzym von den Bakterien in das Kulturmedium ausgeschieden wird. Volumina von Gehirn-Herz-Infusionsmedien (1 Liter) (Difco Laboratories, Detroit, Michigan), die mit 0,01% gewaschenen, roten Blutzellen aus Ziege ergänzt wurden, wurde mit 1 ml einer frischen Übernacht-Kultur inokuliert. Diese Kulturen wurden für 20 Stunden bei mäßiger Bewegung (300 UpM) bei 37°C in 2-Liter-Erlenmeyer-Flaschen wachsen gelassen. Vor der Reinigung wurde das Kulturmedium aufgeklart und durch Filtration unter Verwendung eines Pellicon-Filters (0,22 μm Duropore GVLP-Membran) sterilisiert, gefolgt von Filtration durch einen 0,45 μm-Einwegfiltrationsapparat (Nalgene, Nalge Co., Rochester, New York). Ungefähr 105 Liter Kulturmedium wurden mit diesem Verfahren verarbeitet.
Chargen-Absorption auf Diethylaminoethylzellulose
Die aufgeklarten Medien wurden durch Ultrafiltration unter Verwendung des Pellicon-Apparates und einer 10-K-Membran (PLGC, regenerierte Zellulose) mit einer Filterfläche von ungefähr 0,46 m² bei einer Flussrate von 120 ml/min und einem Druck von 20 Pfund pro Quadratinch (1,4 kg/cm²) konzentriert. Das Initialvolumen von 105 Liter Medium wurde schließlich auf 4 Liter konzentriert mit einer Proteinkonzentration von 2,3 mg/ml.
Diethylaminoethylzellulose (DEAE-Zellulose) (DE23, Whatman, England) wurde mittels Waschen mit 15 Volumina 0,5 M HCl, gefolgt von einer zweiten Wäsche mit 15 Volumina von 0,5 M NaOH regeneriert. Nach der Wiederholung des Waschens mit Natriumhydroxid wurde die DEAE-Zellulose mit Wasser gewaschen, bis sie neutral war. Schließlich wurde die Zellulose über Nacht in TMC-Puffer (1 mM Tris, 1 mM MgCl, 1 mM CaCl₂, pH 7,5) äquilibriert.
Die äquilibrierte nasse Zellulose (100 g) wurde zu 500 ml konzentriertem S. pyogenes-Medienüberstand zugegeben. Das Gemisch wurde vor der Zentrifugation bei 3500 UpM für 45 Minuten bei 300 UpM für 20 Minuten bei 4°C geschüttelt. Die Zellulose wurde mit 450 ml TMC-Puffer gewaschen, und die zwei Überstände wurden kombiniert.
Chromatographie auf Phenylsepharose
Die Überstände der Diethylaminoethylzellulose-Chargen-Absorption wurden mittels Filtration durch eine 0,45 μm-Membran aufgeklart. Ammoniumsulfat wurde auf 0,8 M vor dem Passieren durch Phenylsepharose CL 45 (Pharmacia, Uppsala, Schweden) zugegeben, mit 0,8 M Ammoniumsulfat, 20 mM Natriumphosphat (pH 8,0) äquilibriert.
Die 80 ml-Phenylsepharosesäule wurde bei 1,85 ml/min mit 1100 ml der Probe bei einer Konzentration von 258 μg/ml beladen. Die DNase-Aktivität wurde in dem Durchlauf vor der Konzentration durch Ultrafiltration unter Verwendung einer 10 kd-Membran gesammelt (Diaflo YM10, Amicon Division, W. R. Grace & Co.). Die abschließende Proteinkonzentration betrug 0,245 mg/ml.
Chromatographie auf Heparin-Sepharose
Der konzentrierte Ausfluss aus der Phenylsepharosesäule wurde gegen Heparin-Puffer A (20 mM HEPES, pH 7,9, 2 mM Dithiothreitol, 10 mM MgCl₂, 0,2 mM EDTA, 0,1 NaCl, 10% Glyzerin dialysiert. Eine Heparinsepharose CL-6B (Pharmacia)-Säule (80 ml) wurde mit Heparin-Puffer A äquilibriert vor der Beladung bei einer Flussrate von 1,0 ml/min. Nach Waschen der Säule mit 3 Volumina Heparin-Puffer A wurde ein Gradient zwischen 0% und 100% Puffer B bei einer Flussrate von 2,2 ml/min laufengelassen. Der Puffer B war der gleiche wie Puffer A, außer dass die Konzentration von Natriumchlorid 1,0 mol/l war. Die DNase- Aktivität eluierte bei 350 mM NaCl in einem Volumen von ungefähr 250 ml. Die DNase-Aktivität wurde durch Ultrafiltration konzentriert.
Mono-P-Chromatofokussierung
Die konzentrierte DNase-Fraktion wurde vor der Chromatofokussierung gegen 25 mM Diethanolamin, pH 9,5, dialysiert. Die Mono P 5/20-Säule (Pharmacia, Piscataway, N. J.) wurde in dem Ladepuffer (25 nM Ethanolamin, pH 9,5) äquilibriert, wurde mit 500 μl der Probe injiziert und mit 9 ml Ladepuffer gewaschen. Die Säule wurde mit 100% Puffer B eluiert (10% Polypuffer 96 (Pharmacia), pH 6,0). Das eluierte Gesamtvolumen betrug 34 ml; Fraktionen von 0,5 ml wurden gesammelt. Zwei Aktivitätspeaks wurden bei pH 8,55– 8,4 (Fraktionen 25–29) gesammelt, die hier als Fraktion I bezeichnet wird, und 8,22–8,13 (Fraktionen 34–35), die hier als Fraktion II bezeichnet wird. Die gesammelten Fraktionen wurden mittels isoelektrischer Fokussierungsaktivitätsgele, Silberfärbung und mittels SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese analysiert.
Umkehrphasen-Hochdrucksflüssigkeits-Chromatographie
Die Peakfraktionen von der Chromatofokussierungssäule wurden weiter gereinigt, um die Ampholyte, die für die Chromatofokussierung verwendet wurden, mittels Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie unter Verwendung einer C4-Säule (Beckman System Gold Instrument, Beckman Instruments, Fullerton, Kalifornien) zu entfernen. Proben wurden in Puffer A geladen (0,1% Trifluoressigsäure in Wasser) und ein Gradient von 0% bis 100% Puffer B (0,8% Trifluoressigsäure in Acetonitril) wurde zum Eluieren der Säule bei einer Flussrate von 1 ml/min verwendet. Diese Proteine eluierten in 65% Puffer B in einem Volumen von ungefähr 1 ml.
SDS und isoelektrische Analyse
SDS-Polyacrylamidgel-Analyse wurde von allen Proben unter Verwendung des PHAST-System (Pharmacia LKB, Piscataway, New Jersey) automatisierten Instrumentes (engl. PHAST-system automated instrument) durchgeführt. Die SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese wurde auf den PhastGel 10– 15%-Gelen durchgeführt. Isoelektrische Gele wurden unter Verwendung der PhastGel-IEF-3–9-Gele laufengelassen. Silberfärbung von beiden, den SDS und den isoelektrischen Gelen, wurde unter Verwendung des PhastSystems automatisierte Färbevorrichtung (engl. PhastSystem automated staining device) (Pharmacia LKB) durchgeführt. Aktivitäts-Tests der DNase-Proben wurden auf den isoelektrischen Fokussierungsgelen mittels Überlagern der Gele mit 5 ml einer 1%igen geschmolzenen Agaroselösung, enthaltend Phosphatgepufferte Salze und 1 ml rekonstituierten DNase-Substratfarbstoff (Wampole), nach der Elektrophorese durchgeführt. Die Inkubation von IEF-Gelen mit der Substratüberlagerung bei Raumtemperatur führte durch das Umwandeln des blauen Substratfarbstoffs in eine rosa Farbe, die um die Nukleaseaktivität herum zentriert war, zu dem Nachweis der Aktivität. Aktivitäts-Tests der SDS-denaturierten Proben wurden unter Verwendung eines SDS-14%-Polyacrylamidgels durchgeführt, das in Gegenwart von 500 μg/ml Hering-Testes-DNA polymerisiert worden war. Nach der Elektrophorese wurden die Gele mit Wasser gespült und mit 40 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM MgCl₂, 0,02% Natriumazid für 2 Stunden bei 37°C äquilibriert. Ethidiumbromid wurde bis zu 1 μg/ml zugegeben, um die Nukleaseaktivität, die als Ergebnis des Abbaus der DNA durch die Nuklease sichtbar ist, zu beobachten.
Proteinsequenzierung
Die aminoterminalen Sequenzen der Fraktionen I und II der gereinigten DNase wurden unter Verwendung eines Applied Biosystems (Foster City, Kalifornien)-477-Sequenators bestimmt. Proben von jedem der gereinigten Enzyme (Fraktionen I und II) wurden in einen Applied Biosystems(Foster City, CA)-470-Proteinsequenzierer geladen. Die ersten 23 Aminosäuren von beiden Fraktionen I und II erzeugten die folgenden lesbaren Sequenzen: Q-T-Q-V-S-N-D-V-V-L-N-D-G-A-S-X-Y-L-N-E-A-L-A (SEQ ID NO: 4), wobei X für eine Aminosäure steht, die nicht definitiv identifiziert werden konnte, aber mit größter Wahrscheinlichkeit entweder Tryptophan oder Lysin ist.
Massenspektroskopische Analyse
Ionen-Sprüh-Massenspektralanalyse wurde mit der rekombinanten DNase B (Beispiel 1) und den Fraktionen I und II der gereinigten nativen DNase B unter Verwendung des Finnigan MAT TSQ 700 Dreistufen-Quadrupol-Massenspektrometer (engl. triple-stage quadrupole-mass-spectrometer), der mit dem Finnigan-Elektrospray-Ionisierungssystem ausgestattet ist, durchgeführt. Proben wurden mittels Umkehrphasen-Fraktionierung unter Verwendung einer C4-Säule, wie oben beschrieben, hergestellt. Die DNase B-Proteine eluierten bei 65% Puffer B und wurden zur Lagerung lyophilisiert. Vor der Injektion wurden die Proben bei einer Flussrate von 1 μl/min in Acetonitril-Wasser-Essigsäure (50 : 50 : 1) gelöst.
Die Molekulargewichte, die mittels massenspektroskopischer Analyse bestimmt wurden, sind die folgenden: rekombinante DNase B (Beispiel 1) -- 25,549; Fraktion I der gereinigten natürlichen DNase B -- 25,390; Fraktion II der gereinigten natürlichen DNase B -- 25,397. Diese Ergebnisse stimmen mit den Ergebnissen der Nukleotid- und Aminosäuresequenzierung überein, die darauf hindeuten, dass die rekombinante DNase B eine zusätzliche Aminosäure an dem Aminoterminus hat. Der Unterschied der Molekulargewichte zwischen Fraktionen I und II der gereinigten natürlichen DNase B stimmt überein mit einer geringen Modifikation einer ansonsten identischen Aminosäuresequenz. Eine mögliche Modifikation ist eine Deaminierung, die den entsprechenden pI-Shift verursachen würde.
Beispiel 4
Reinigung und aminoterminale Sequenzanalyse von rekombinanter S. pyogenes-DNase B, die aus Bakteriophage-λ-2–6-Klon hergestellt wurde
Das rekombinante DNase B-Protein in dem λ-DNase B 2–6-Phagenlysat wurde auf einem SDS-Polyacrylamidgel mittels Western-Blot-Analyse identifiziert. Kaninchen-Antikörper gegen kommerzielle DNase B wurde zum Nachweisen des Vorhandenseins von rekombinanter DNase B verwendet. Lediglich eine Proteinbande war nachweisbar. Coomassie-Blau-Färbung auf einem SBS-Polyacrylamidgel zeigt, dass das rekombinante DNase B-Protein ungefähr 5% des Gesamtproteins in dem Lysat ausmachte. Nur eine Nuklease wurde in einem SDS-DNA-Polyacrylamidgel-System nachgewiesen. Die Nuklease hat ein geschätztes Molekulargewicht von 25.000 Daltons.
Das Reinigen des rekombinanten DNase B-Proteins wurde unter Verwendung eines SBS-Polyacrylamidgels und eines Nukleaseaktivitäts-Tests unter Verwendung des Substrats, das in einem kommerziellen DNase B-Test-Kit zur Kontrolle verwendet wurde, überwacht. Das Reinigungsverfahren schließt ein: (1) das Chromatographieren auf Q-Sepharose (Trimethylaminomethylagarose); (2) die Ammoniumsulfatpräzipitation; (3) das Chromatographieren auf Heparin-Agarose; und (4) das Chromatographieren auf Q-Sepharose. Zwei Liter eines λ-DNase B-2,6-Phagenlysats wurden als eine Übernacht-Kultur in Luria-Medium, die mit 10 mM MgCl₂ ergänzt wurde, hergestellt. Der Überstand wurde nach Zentrifugation der Kultur in einer Beckman Instruments (Fullerton, CA)-Zentrifuge bei 3635 × g bei 4°C für 45 Mi nuten zum Entfernen der Zelldebris gesammelt (das Volumen des Überstandes betrug 1900 ml).
Die Lysate wurden durch eine 0,45 μl-Filtrationseinheit zum Entfernen von restlichen Bakterien und Zelldebris gefiltert. Dieses Filtrat wurde dann durch eine ungefähr 200 ml Säule Q-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ, die mit 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, äquilibriert worden war) passiert. Der Durchfluss aus der Säule wurde gesammelt. Zu dieser Fraktion wurde langsam Ammoniumsulfat bis zu einer Endkonzentration von 80% bei Raumtemperatur zum Konzentrieren des Lysats zugegeben. Die entsalzten Proteine wurden bei 15.000 × g für 30 Minuten zentrifugiert.
Glyzerin wurde zu den dialysierten Proteinen zu einer Endkonzentration von 10% zugegeben. Diese Präparation wurde durch eine 0,45 μm-Filtereinheit filtriert. Die Leitfähigkeit dieser Proteinpräparation wurde bestimmt, und die Proteinpräparation wurde mit 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, so verdünnt, dass die Leitfähigkeit die gleiche war, wie die einer Lösung von 20 mM Tris, pH 7,5, 25 mM NaCl, 10% Glyzerin (Puffer A). Das Endvolumen betrug 1800 ml.
Die Probe wurde auf eine Heparin-Sepharosesäule (ungefähr 100 ml) in einem Pharmacia-FPLC-System bei einer Flussrate von 120 ml/h geladen. Die Säule wurde mit 400 ml Puffer A gewaschen. Die DNase B wurde mit einem Liter eines Gradienten von 25 mM bis 500 mM NaCl in Puffer A eluiert. Die DNase-Aktivität eluierte bei ungefähr 125 mM NaCl in einem Volumen von ungefähr 175 ml.
Die DNase-Fraktion, die aus der Heparin-Agarosesäule eluierte, wurde gegen 20 mM Tris-HCl, pH 8,5, dialysiert und wurde auf eine ungefähr 175-ml-Q-Sepharosesäule geladen, die in 20 mM Tris-HCl, pH 8,5, äquilibriert worden war. Der Durchfluss aus der Q-Sepharosesäule wurde mittels isoelektrischer Fokussierungsaktivitätsgele, Silberfärbung und mittels SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese gesammelt und analysiert. Die Präparation von rekombinantem DNase B-Protein war 99% homogen. Die Proteinkonzentration in dem endgültigen Eluat (110 ml) betrug ungefähr 100 μg/ml. Dies entspricht einer Ausbeute von ungefähr 5,5 mg/l Kultur. Das Endprodukt wurde dann einer Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie unterzogen, wie oben in Beispiel 3 beschrieben.
Die aminoterminale Sequenz der gereinigten rekombinanten DNase B wurde unter Verwendung eines Beckman Mikrosequenziersystems (engl. microsequencing system) 2020/Gold bestimmt. Die Aminosäuresequenz war identisch mit der von natürlicher S. pyogenes-DNase B, außer dass der Aminoterminus Arginin (R) war. Dieses Arginin entstand aus dem Verfahren zur Herstellung der rekombinanten DNase B.
Eine spektroskopische Analyse der DNase B zeigte, dass die DNase homogen war.
Beispiel 5
Klonierung und Expression von S. pyogenes-DNase B-Enzym in Escherichia coli-Plasmid unter Regulation durch den pL-Promotor
Ein zusätzliches genetisches Konstrukt wurde hergestellt, um die gesteuerte Expression des S. pyogenes-DNase B-Gens unter Verwendung eines Plasmidvektors, der den Bakteriophagen-λ-Promotor pL einschließt, zu demonstrieren. Dieses Konstrukt wurde durch Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) zum Einschluss modifizierter Enden an das DNase B-Gen in dem λ 2–6-Klon hergestellt. Die folgenden Oligonukleotide wurden auf dem Pharmacia-Gene-Assembler-Plus-DNA-Synthesizer nach den Empfehlungen des Herstellers gestaltet und synthetisiert:
Diese Oligonukleotide wurden als Primer in einer PCR-Reaktion unter Verwendung des AmpliTaq-Kits (Perkin-Elmer-Cetus, Norwalk, CT) nach den Anweisungen des Herstellers eingegeben. Die Endkonzentration von MgCl₂ wurde auf 4 mM eingestellt, und es wurde eine 20 Zyklen-Reaktion unter Verwendung des Perkin-Elmer-480-Thermal-Cyclers durchgeführt (37°C, 2 Minuten; 72°C, 3 Minuten; 95°C, 2 Minuten). DNA des λgt11-Klons 2–6 (100 mg) wurde als Matrize (engl. template) zusammen mit 200 μM eines jeden Primers verwendet. Das resultierende amplifizierte Produkt wurde weiter vor dem Einschluss in den Δ33-Expressionsvektor mit Bam HI und Sal I verdaut. Diese Manipulationen erzeugten eine translationale Fusion mit der Sequenz, die in 5 gezeigt ist, die durch den λ-pL-Promotor reguliert wird.
C 600 Cl⁺, galK^–-Bakterien wurden mit dem Ligationsgemisch transformiert und auf LB-Amp-Platten ausplattiert. Danach wurde eine Minipräparation der DNA durchgeführt (F. M. Ausubel et al., Hrsg., "Current Protocols in Molecular Biology" (John Wiley, 1987), Abschnitt 1.6), gefolgt von Schneiden des Plasmids mit den Enzymen Bam HI und Sal I um zu bestimmen, ob das Plasmid das rekombinante DNase B-Fragment umfasst. Plasmide des gewünschten Konstrukts wurden weiter in den AR120-Wirtsstamm transformiert. Die Wirtszellen mit Plasmiden, die rekombinante DNase B umfassen, wurden dann zur Induktion dem Nalidixinsäure-Protokolls (Mott et al., supra) unterzogen. Die Kolonien, die das transformierte AR120 umfassten, wurden von den Agarplatten abgehoben und in Superbroth inokuliert (Basis: 12 g Trypton, 24 g Hefeextrakt, 5 ml Glyzerin, 900 ml destilliertes H₂O; Salze pro Liter der Base: 1,7 g KHP₂O₄, 15,8 g KHP₂O₄ (wasserfrei), 100 ml destilliertes H₂O) plus 100 μg/ml Ampicillin, und bei 37°C gezüchtet, bis die optische Dichte der Kultur bei 650 nm 0,4 entsprach.
Daraufhin wurde Nalidixinsäure zu dem inokulierten Gemisch bei einer Endkonzentration von 60 μg/ml zugegeben. Die Kultur wurde bei 37°C für ungefähr 8 Stunden oder alternativ über Nacht (ungefähr 16 Stunden) inkubiert. Alle Zellfraktionen, einschließlich des Überstands der Kultur, wurden auf DNase B-Aktivität hin untersucht, die Zellpellets wurden ultraschallgemischt (engl. sonicated), und die Überstände der ultraschallgemischten Zellpellets.
Zur Übernacht-Induktion wurde DNase B von den E. coli-Zellen ausgeschieden. Die 8 Stunden-Induktion hatte die meiste der DNase B aus den Zellen ausgeschieden mit ungefähr 30% innerhalb, die aus dem ultraschallgemischten Überstand gewonnen wurden. Die Mengen der DNase B waren groß genug um mittels Coomassie brilliant blue-Färbung auf Polyacrylamidgel-Elektrophorese visualisiert zu werden.
Beispiel 6
Reinigung von rekombinanter S. pyogenes-DNase B in E. coli unter Regulation des pL-Promotors
Eine Menge (6 Liter) eines rekombinanten DNase B-Klons wurde wie in Beispiel 5 beschrieben in Superbroth wachsen gelassen und über Nacht induziert. Der Überstand wurde geerntet und mit einem Pellicon-Konzentrator unter Verwendung einer 10K-Membran konzentriert; die Konzentration ergab ein Volumen von 600 ml.
Das konzentrierte Extrakt wurde gegen Heparin-Puffer A (20 mM HEPES, pH 7,9, 2 mM Dithiothreitol, 10 mM MgCl₂, 0,2 mM EDTA, 0,1 M NaCl, 10% Glyzerin) dialysiert. Die Heparin säule wurde geladen, laufen gelassen und wie in Beispiel 3 eluiert.
Das Eluat aus der Heparinsäule wurde in 20 mM Ethanolamin, pH 8,5, dialysiert. Geringe Mengen von fremden Proteinen wurden aus der DNase B-Präparation durch Chargen-Absorption auf Q-Sepharose absorbiert. Eine Menge von Q-Sepharose (100 ml) wurde mit 20 nM Ethanolamin, pH 8,5, äquilibriert und zu 100 ml der Heparin-DNase B-Fraktion zugegeben.
Es wurde der Q-Sepharose erlaubt an das Extrakt in einem Chargenverfahren für 20 Minuten bei 4°C zu binden. Nach dem Binden wurde die Q-Sepharose durch eine 0,45 μm-Filtrationseinheit gefiltert. Der Niederschlag wurde schließlich vor der Abtrennung mittels Zentrifugation mit 50 ml 20 mM Ethanolamin, pH 8,5, für 20 Minuten durch Zentrifugation gewaschen. Die zwei Eluate aus diesem Verfahren wurden kombiniert und mittels Umkehrphasenchromatographie, Aminosäuresequenzierung und massenspektroskopischer Analyse analysiert. Für die Umkehrphasenchromatographie wurde 1 ml der gereinigten DNase B über eine C4-Säule passiert und bei 65% Puffer B in einem Volumen von 1 ml eluiert. Es wurden die gleichen Puffer verwendet wie für die Reinigung der nativen DNase B in Beispiel 3.
Die Aminosäuresequenz wurde unter Verwendung eines Beckman-Microsequencing-Systems 2020/Gold bestimmt. Die Aminosäuresequenz lautete R-Q-T-Q-V-S-N-D-V-V-L-N-D-G-A-S-K-Y-L-N-E-A-L-A-W-T-F-N-D-S-P-N-Y-Y-K-T-L-G (SEQ ID NO: 6).
Es wurde ferner eine massenspektroskopische Analyse mit einem vergleichbaren Ergebnis in der gleichen Weise durchgeführt, wie sie für die natürliche DNase B beschrieben wurde.
Beispiel 7
Präparation von DNA-Sonde, entsprechend der aminoterminalen Sequenz des DNase B-Enzyms
Unter Verwendung der Codon-Verwendung für auf hohem Niveau exprimierte Gene in enterischen Bakterien nach dem VAX GCG-Programm (Tabelle 1) wurden die folgenden degenerierten Sonden hergestellt: C-A-P-U-A-C-N-C-A-R-T-N-W-S-N-A-A-Y-G-A-Y-G-T (SEQ ID NO: 5). In dieser Sequenz ist R ein Purin (d. h. A oder G), Y ein Pyrimidin (T oder C), S ist G oder C, W ist A oder T und N ist eine beliebige der vier gebräuchlichen Desoxyribonukleotide. Diese Sonde hybridisierte effizient an λgt11-Klon 2,6, was bestätigt, dass das native DNase B-Protein aus dem klonierten Gen abstammt.
Beispiel 8
Inhibition von rekombinanter DNase B durch Anti-DNase B-Antikörper
Um zu zeigen, dass die rekombinante S. pyogenes-DNase B in ihren Eigenschaften der natürlichen DNase B gleichwertig ist, wurde ein Immunoinhibitions-Test durchgeführt. Die rekombinante DNase B wurde mit kommerziell erhältlicher natürlicher DNase B in einem Inhibitions-Test unter Verwendung von positivem humanen Kontrollserum, enthaltend Anti-DNase B-Antikörper verglichen. Der verwendete Test basierte auf der Fähigkeit der DNase B, einen DNA-Farbstoffkomplex als Substrat zu verwenden. Dieser Komplex zeigt eine maximale optische Absorption bei 642 nm. Allerdings wird der DNA-Farbstoffkomplex durch DNase abgebaut; es gibt eine Verschiebung in der maximalen Absorptionswellenlänge und die Enzymaktivität wird durch eine Abnahme der gemessenen Absorption bei 642 nm angezeigt. Wie in 6 gezeigt, wird das rekombinante Enzym in identischer Weise wie die natürliche S. pyogenes-DNase B durch humanes Serum, enthaltend Anti-DNase B-Enzym, als Ergebnis einer Immunreaktion gegen natürlich vorkommende S. pyogenes-DNase B, inaktiviert.
Beispiel 9
Bestimmung, dass die Transkription des DNase B-Gens von einem Streptokokken-Promotor in dem Δ2–6-Klon ausgeht
Wie in Beispiel 4 gezeigt, gab es ein hohes Niveau der Expression von DNase B-Gen aus dem λ2–6-Klon. Um die Startstelle des starken Bakterienpromotors, der für diese Expression verantwortlich ist, zu bestimmen, wurde ein in vitro-runoff-Transkriptions-Test unter Verwendung von E. coli-RNA-Polymerase durchgeführt. Dieser Test erlaubt es, eine präzise Base des Transkriptionsstarts mittels Vergleich der Längen eines transkriptionalen RNA-runoffs mit einer Sanger-Didesoxysequenzleiter zu bestimmen. Dieser Test stellt starke Beweise für die Startstelle der Transkription in E. coli bereit. Vergleiche mit bekannten transkriptionalen Startstellen einer Vielzahl von Streptokokken bestätigten ferner, dass diese Stelle die für die Streptokokken Transkription verantwortliche Region ist (J. Ferretti & R. Curtiss, "Streptococcal Genetics" (1987), S. 293 ("Compilation of Nucleotide Sequences that Signal the Initiation of Transcription and Translation in Streptococci").
In einer Runoff-Transkriptionsreaktion erkennt die RNA-Polymerase Promotorregionen und leitet die Transkription ein. Das Enzym fällt schließlich von dem Ende der Matrize ab, daher ist dies Runoff-Transkription. Dies ist ein Standardverfahren zum Studium der Transkriptionsstartstellen.
Ein PCR-Fragment, das die Stromaufwärtsregion von DNase B-Gen einschließt, wurde als eine Matrize für eine in vitro- runoff-Transkriptionsreaktion mit E. coli-RNA-Polymerase hergestellt. Unter Verwendung von zwei Oligonukleotiden, Oligonukleotid #246 an Positionen 298 bis 280, und Oligonukleotid #267 (in 3 nicht gezeigt), wurde ein PCR-DNA-Produkt von ungefähr 290 Basenpaaren hergestellt, und das Fragment wurde nach Gelelektrophorese gereinigt. Die Runoff-Transkriptionsreaktion wurde in 30 mM Tris, pH 8, 120 mM KCl, 4 mM MgCl₂, 10 mM 2-Mercaptoethanol, 4 mM Spermidin, 0,4 mM ATP, 0,4 mM CTP, 0,4 mM GTP, 0,08 mM UTP, 80 Einheiten RNAsin (Promega), 1 Einheit RNA-Polymerase (Promega) und 5 μl [³²P] UTP in einem Gesamtvolumen von 100 μl durchgeführt. Das Gemisch wurde bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Um die Reaktion abzubrechen, wurden 10 μl 0,5 M EDTA zugegeben.
Die Probe wurde verdünnt und auf einem Sequenziergel elektrophoretisch aufgetrennt. Um die Größe des Transkripts genau zu bestimmen, wurde eine Sequenzierungsreaktion unter Verwendung von Oligonukleotid 246 auf 2–6-DNA durchgeführt. Die Reaktion wurde unter Verwendung des GIBCO/BRL (Bethesda, MD)-Cyle Sequencing-Kits durchgeführt. Der Startpunkt der Sequenzierungsleiter ist der gleiche wie der des Runoff-Punktes des Runoff-Transkripts. Durch Analysieren des Transkriptionsprodukts zusammen mit der Sequenzierungsleiter in einem Harnstoff-Polyacrylamidgel wurde die Lokalisation der Transkriptionsinitiationsstelle bestimmt.
7 zeigt die DNA-Sequenz, die stromaufwärts von dem offenen Leserahmen unter der Konsensussequenz von einem E. coli-Promotor (D. K. Hawley & W. R. McClure, Nucl. Acids Res. 11: 2237–2255 (1983)) liegt. Die Transkriptionsdaten zeigen, dass es zwei mögliche Startstellen für RNA-Polymerase gibt, Position 96 und 97. Diese Stellen sind in 7 durch einen Stern markiert. Die Regionen –35 und – 10 sind unterstrichen.
Beispiel 10
Gleichwertigkeit von gereinigter rekombinanter S. pyogenes-DNase B und natürlicher DNase B bei der Reaktion mit Anti-DNase-Antikörper in humanen Serumproben
Um zu zeigen, dass rekombinante DNase B bei ihrer Reaktion mit Anti-DNase-Antikörper in humanen Serumproben im Wesentlichen gleichwertig ist mit natürlicher DNase B in Form von kommerzieller Streptonase B, wurde das gereinigte DNase B-Enzym anstelle der kommerziellen Streptonase B in dem Streptonase B-Test verwendet. Zehn Patientenproben von Boston Biomedica (Boston, MA) wurden gemäß den Anweisungen, die in dem Streptonase B-Diagnostik-Kit bereitgestellt waren, getestet. Die gleichen Proben wurden ferner unter Verwendung gereinigter rekombinanter DNase B getestet, die verdünnt war um ähnliche Nukleaseaktivität wie die rekonstituierte Streptonase B zu ergeben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt und in Form einer Korrelationskurve in 8 abgebildet.
TABELLE 2 GLEICHWERTIGKEIT VON REKOMBINANTER DNASE B MIT ISOLIERTER DNASE B BEI DER BESTIMMUNG VON ANTI-DNASE B-ANTIKÖRPERTITER
Wie gesehen werden kann, ist die Korrelation zwischen den Ergebnissen unter Verwendung der kommerziellen Streptonase B und denen der gereinigten rekombinanten DNase sehr hoch. Die gereinigte rekombinante DNase B reagiert im Wesentlichen in gleicher Weise mit der Anti-DNase-Antikörper, das in Serum gefunden wird, wie die kommerzielle Streptonase B.
Beispiel 11
Abwesenheit von mitogener Aktivität bei der gereinigten natürlichen DNase B
Um zu bestimmen, ob die gereinigte natürliche DNase B mitogene Aktivität in einem humanen Lymphozyten-Mitogenitätsaktivitäts-Test aufweist, wurden verschiedene Fraktionen der gereinigten natürlichen S. pyogenes-DNase B in einem Mitogenitäts-Aktivitäts-Test gemäß dem von T. Yutsudo et al., "A New Type of Mitogenic Factor Produced by Streptococcus pyogenes, "FEBS Lett. 308: 30–34 (1992) verwendeten, getestet. Für das Testen der DNase B auf mitogene Aktivität wurden humane Lymphozyten unter Verwendung einer Ficoll-Paque-(Pharmacia)-Ein-Schritt-Gradientenverfahren isoliert, das wie von dem Hersteller beschrieben durchgeführt wurde. Die Lymphozyten wurden in einer Mikrotiterplatte (96 Vertiefungen) bei einer Konzentration von 10⁵ Zellen/Vertiefung ausplattiert. Nach 3 Tagen des Kultivierens in einer befeuchteten Atmosphäre (37°C, 5% CO₂, 1 μCi Tritium-markiertes Thymidin (Amersham, Arlington Heights, IL) wurde 1 mCi/ml zu jeder Vertiefung zugegeben. Nach zusätzlichen 24 Stunden des Kultivierens wurden die Zellen in Glasröhrchen transferiert unter Verwendung von 20 μl 100 mM EDTA in MEM-Medien mit 10% fötalem Rinderserum ge löst. Nach dem Waschen der Vertiefungen mit zusätzlichen 200 μl MEM mit 10% fötalem Rinderserum wurden 500 μl 10% Trichloressigsäure (TCA) zu jedem Glasröhrchen zugegeben um das eingeschlossene Tritium-markierte Thymidin zu präzipitieren. Das TCA/Zellgemisch wurde auf Eis für 20 Minuten vor der Filtration auf Glasfiltern (Schleicher und Schuell, Keene, NH) inkubiert. Die Filter wurden weiter vor dem Trocknen und Zählen mittels Szintillation mit 5% TCA und 100% Ethanol gewaschen. Concanavalin A (1 μg/ml bis 100 μg/ml, wie angezeigt) wurde als Positivkontrolle für mitogene Aktivität verwendet.
Die Ergebnisse sind in 9 für E. coli-DNase I, für die Heparin-Sepharose-Fraktion von Beispiel 3, für gereinigte Fraktionen I und II von Beispiel 3 und für die rekombinante S. pyogenes-DNase B von Beispiel 3 gezeigt. Die Ergebnisse deuten an, dass beide, sowohl die gereinigten Fraktionen I und II, als auch die rekombinante DNase B im Wesentlichen frei von mitogener Aktivität sind. Die Heparin-Sepharose-Fraktion zeigte nachweisbare mitogene Aktivität, welche nach weiterer Reinigung entfernt wurde. Dies zeigt an, dass jedwede mitogene Aktivität nicht in dem DNase B-Protein liegt, sondern in einer oder mehreren Kontaminanten.
VORTEILE DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Erhalten hochgereinigten S. pyogenes-DNase B-Enzyms bereit, ohne dass es erforderlich ist, große Mengen von S. pyogenes zu kultivieren, welches ein teures und riskantes Verfahren ist. Das Enzym kann erhalten werden, ohne dass es von anderen Proteinen von S. pyogenes gereinigt werden muss; statt dessen kann das Enzym von mit rekombinanten Phagen infiziertem Escherichia coli oder von E. coli, das mit einem geeigneten Expressionsvektor transfiziert wurde, ge reinigt werden. Der Expressionsvektor kann so ausgewählt werden, dass die Expression optimiert wird.
Die S. pyogenes-DNase B kann dann verwendet werden um Anti-DNase B-Antikörper in Serum in einem Test, der spezifisch für DNase B ist, zu untersuchen. Insbesondere macht es die Erhältlichkeit von gereinigter DNase B möglich, einen ELISA-Test unter Verwendung des gereinigten Enzyms, das an eine Festphase adsorbiert ist, zu verwenden, welches ein Test ist, der für breite Anwendung und leichte und bequeme Durchführung geeignet ist. Der Test ist ferner von hoher Empfindlichkeit und Spezifität. Solch ein Test ist insbesondere geeignet für klinische Anwendungen zur Detektion von S. pyogenes-Infektion.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Im wesentlichen gereinigte DNA, umfassend DNA, welche die in 4 gezeigte Aminosäuresequenz des Streptococcus pyogenes DNaseB Enzyms kodiert.
Im wesentlichen gereinigte DNA, umfassend DNA, welche die in SEQ ID 8 gezeigte Aminosäuresequenz kodiert.
Expressionsvektor für Streptococcus pyogenes DNase B Enzym, umfassend eine DNA-Sequenz nach Anspruch 1, welche mit mindestens einer mit einer geeigneten bakteriellen Wirtszelle kompatiblen Kontrollsequenz funktionsfähig verknüpft ist.
Vektor nach Anspruch 3, wobei die DNA-Sequenz, welche das Streptococcus pyogenes DNase B Enzym kodiert, mit mindestens einer Sequenz vom Bakteriophagen λ verknüpft ist.
Bakterielle Wirtszelle, welche mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 3 in einer Weise transformiert ist, die der transformierten bakteriellen Wirtszelle erlaubt, Streptococcus pyogenes DNase B, welche durch die im Expressionsvektor nach Anspruch 3 inkorporierten DNA kodiert wird, in einer nachweisbaren Menge zu exprimieren.
Im wesentlichen gereinigtes Streptococcus pyogenes DNase B Enzym, umfassend ein Protein mit der in 4 gezeigten Aminosäuresequenz, wobei das Protein an seinem Aminoterminus einen Arginin(R)-Rest enthält, der vom Leader-Peptid abstammt und im natürlich vorkommenden DNase B Enyzm nicht vorhanden ist.
Verfahren zur Herstellung von im wesentlichen gereinigtem Streptococcus pyogenes DNase B Enzym, umfassend (a) das Züchten einer bakteriellen Wirtszelle nach Anspruch 5, (b) das Verwenden der gezüchteten, bakteriellen Wirtszelle, um das DNase B Enzym zu exprimieren, und (c) das Reinigen des Enzyms aus der gezüchteten, bakteriellen Wirtszelle.
Transkriptionsfusion, umfassend die mit einem anderen Gen fusionierte Streptococcus pyogenes DNase B DNA-Sequenz nach Anspruch 1, die durch die Fusion eine nachweisbare Eigenschaft aufweist, die bezüglich der Eigenschaft der Sequenz nach Anspruch 1 oder der Eigenschaft des durch die Sequenz nach Anspruch 1 kodierten Proteins verändert ist, wobei die veränderte Eigenschaft ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus (1) einer RNA-Expression mit hohem Niveau, (2) einer Proteinexpression mit hohem Niveau, (3) einem zweiten funktionellen Enzym, Rezeptor oder anderen aktiven Protein in der Fusion, (4) einer Fusion der DNase B an einen Affinitätsliganden, (5) der Herstellung eines Proteins mit höherem Molekulargewicht und (6) einer erhöhten Immunoreaktivität.
Translationsfusion, umfassend das mit einem anderen Protein fusionierte, durch die Streptococcus pyogenes DNase B DNA-Sequenz nach Anspruch 1 kodierte Protein, das durch die Fusion eine nachweisbare Eigenschaft aufweist, die bezüglich der Eigenschaft des durch die DNA-Sequenz nach Anspruch 1 kodierten Proteins verändert ist, wobei die veränderte Eigenschaft ausgewählt ist aus (1) einer RNA-Expression mit hohem Niveau, (2) einer Proteinexpression mit hohem Niveau, (3) einem zweiten funktionellen Enzym, Rezeptor oder anderen aktiven Protein in der Fusion, (4) einer Fusion der DNase B an einen Affinitätsliganden, (5) der Herstellung eines Proteins mit höherem Molekulargewicht und (6) einer erhöhten Immunoreaktivität.
Im wesentlichen gereinigtes Streptococcus pyogenes DNase B Enzym nach Anspruch 6, welches im wesentlichen frei von Proteinen ist, außer (1) das Streptococcus pyogenes DNase B Enzym und (2) das an seinem Aminoterminus mit einem Leader-Peptid fusionierte Streptococcus pyogenes DNase B Enzym, wobei das im wesentlichen gereinigte Protein im wesentlichen frei von mitogener Aktivität ist.
Im wesentlichen gereinigtes Streptococcus pyogenes DNase B Enzym nach Anspruch 10, welches Fraktion I des S. pyogenes DNase B Enzyms umfaßt und im wesentlichen frei von Fraktion II des S. pyogenes DNase B Enzyms ist, wobei die Fraktion I der Höchstwert der Aktivität ist, welcher durch Chromatographiefokussierung zwischen pH 8,55 bis 8,4 erhältlich ist.
Im wesentlichen gereinigtes Streptococcus pyogenes DNase B Enzym nach Anspruch 10, welches Fraktion II des S. pyogenes DNase B Enzyms umfaßt und im wesentlichen frei von Fraktion I des S.pyogenes DNase B Enzyms ist, wobei die Fraktion II der Höchstwert der Aktivität ist, welcher durch Chromatographiefokussierung zwischen pH 8,22 bis 8,13 erhältlich ist.
Verfahren zur Herstellung von im wesentlichen gereinigtem Streptococcus pyogenes DNase B Enzym nach Anspruch 10, umfassend (a) das Absorbieren eines DNase B enthaltenden Kulturmediums an und das Eluieren von Diethylaminoethylzellulose zur Herstellung eines ersten Eluats, (b) das Chromatographieren des ersten Eluats an Phenylagarose zur Herstellung eines zweiten Eluats, (c) das Chromatographieren des zweiten Eluats an Heparinagarose zur Herstellung eines dritten Eluats und (g) das Chromatographiefokussieren des dritten Eluats zur Herstellung eines im wesentlichen gereinigten DNase B Enzyms.
Verfahren nach Anspruch 13, weiter umfassend die Reinigung der im wesentli chen gereinigten DNase durch Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie.
Verfahren zur Verwendung eines Promotors, welcher ursprünglich mit dem Streptococcus pyogenes DNase B Gen assoziiert ist, um ein anderes S. pyogenes Protein als DNase B zu exprimieren, umfassend (a) das Abtrennen des Promotors, welcher ursprünglich mit dem S. pyogenes DNase B Gen assoziiert ist, vom S. pyogenes DNase B Gen, (b) das funktionsfähige Verknüpfen des Promotors mit einem anderen Strukturgen für ein S. pyogenes Protein als das Gen für DNase B und (c) das Exprimieren des Proteins, welches durch das Strukturgen kodiert wird.
Verfahren zum Nachweis und/oder zur Bestimmung von Anti-Streptococcus pyogenes DNase B Antikörper in einer Testprobe, welches die Schritte (a) des Bindens eines Streptococcus pyogenes DNase Enzyms nach Anspruch 6, hergestellt durch das Verfahren nach Anspruch 7, nach Anspruch 10 oder hergestellt durch das Verfahren nach Anspruch 13, an einen festen Träger, (b) des Umsetzens einer Testprobe, die im Verdacht steht, Anti-S. pyogenes DNase B Antikörper zu enthalten, mit dem an den festen Trägern gebundenen S. pyogenes DNase B Enzym, um den Antikörper an das Enzym zu binden und somit an den festen Träger, und (c) des Nachweisens des an den festen Träger gebundenen Antikörpers zum Nachweis und/oder zur Bestimmung des Antikörpers in der Testprobe, umfaßt.
Verfahren zum Nachweis und/oder Bestimmung von Anti-Streptococcus pyogenes DNase B Antikörper in einer Testprobe, welches die Schritte (a) des Bereitstellens einer Testprobe, die im Verdacht steht, Anti-S. pyogenes DNase B Antikörper zu enthalten, (b) des Zugebens einer Menge von S. pyogenes DNase B Enzym nach Anspruch 5, hergestellt durch das Verfahren nach Anspruch 6, nach Anspruch 9 oder hergestellt durch das Verfahren nach Anspruch 12, zu der Testprobe, wobei die Menge ausreichend ist, um ein nachweisbares Niveau enzymatischer Aktivität durch den Anti-DNAse B Antikörper in der Testprobe zu erzeugen, und (c) des Bestimmens eines Aktivitätsniveaus des DNase B Enzyms in einer Testprobe durch die Durchführung eines Enzymtests zum Nachweis und/oder zur Bestimmung des Anti-S. pyogenes DNase B Antikörpers in einer Testprobe, umfaßt.
Verfahren zum Nachweis und/oder zur Bestimmung von Anti-Streptococcus pyogenes DNase B Antikörper in einer Testprobe, welches die Schritte (a) des Herstellens einer gepufferten Lösung des DNase B Enzyms nach Anspruch 6, hergestellt durch das Verfahren nach Anspruch 7, nach Anspruch 10 oder hergestellt durch das Verfahren nach Anspruch 13, (b) des Umsetzens der gepufferten DNase B Lösung mit einer Testprobe, welche im Verdacht steht, Anti S. pyogenes DNase B Antikörper zu enthalten, und (c) des Nachweisens einer Reaktion zwischen der DNase B und dem DNase B Antikörper durch Beobachten und/oder Messen einer Änderung in der Lichtabsorption oder Lichtstreuung in der Lösung, umfaßt.
Im wesentlichen gereinigte Promotorsequenz, die mit der in 7 gezeigten Streptococcus pyogenes DNase assoziiert ist.
Verfahren zur Verwendung eines Leader-Peptids, das mit Streptococcus pyogenes DNase B Enzym assoziiert ist, um ein Protein in einem Prokaryonten zu exprimieren, umfassend (a) das Fusionieren der für das Protein kodierenden DNA an für das Leader-Peptid kodierende DNA, wobei das Leader-Peptid die Sequenz M-N-L-L-G-S-R-R-V-F-S-K-K-C-R-L-V-K-F-S-M-V-A-L-V-S-A-T-M-A-V-T-T-V-T-L-E-N-T-A-L-A-R (SEQ ID Nr. 1) aufweist, so daß die fusionierte DNA für ein rekombinantes Protein mit einem einzelnen Leserahmen kodiert, wobei das Leader-Peptid am Aminoterminus des Proteins vorliegt, (b) das Einführen der fusionierten DNA in den Prokaryonten und (c) das Exprimieren der fusionierten DNA in dem Prokaryonten, so daß das rekombinante Protein in einer gewinnbaren Menge erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei der Prokaryont Escherichia coli ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei der Prokaryont ein Gram-positives Bakerium, ausgewählt aus Staphylococcus-, Streptococcus- und Streptomycis-Arten, ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei das rekombinante Protein in das Kulturmedium des Prokaryonten ausgeschieden wird.