DE69431404T2

DE69431404T2 - Verfahren zur mikroverkapselung von antigenen und verwendung der zusammensetzungen als impfstoffe

Info

Publication number: DE69431404T2
Application number: DE69431404T
Authority: DE
Inventors: L. Cleland; Amy Lim; Frank Powell
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1993-10-22
Filing date: 1994-10-13
Publication date: 2003-04-30
Anticipated expiration: 2014-10-14
Also published as: AU7980794A; ATE224184T1; ES2184769T3; CA2172509A1; DE69431404D1; EP0724432B1; CA2172509C; EP0724432A1; JPH09504027A; WO1995011010A1; DK0724432T3

Description

Hintergrund der Erfindung

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Mikroeinkapselung von Antigenen zur Verwendung als therapeutische oder prophylaktische Vakzinen.

Beschreibung des Hintergrunds und des verwandten Standes der Technik

Herkömmliche Immunisierungsprotokolle erfordern typischerweise mehrfache Expositionen des Patienten mit Antigen, für gewöhnlich durch Injektionen einer Vakzinenformulierung in Intervallen von Wochen oder Monaten. Es besteht im Fach ein Bedarf, das Antigen von Interesse dem Patienten in einer Formulierung zuzuführen, die das Antigen in Antigen-Schüben in Abständen von Tagen bis Monaten freisetzt, damit die Notwendigkeit mehrfacher Injektionen herabgesetzt wird. Der erste Antigen-Schub kann durch Zusatz von löslichem Antigen zur Vakzinen-Formulierung angereichert sein. Die Effizienz solcher Vakzinen kann durch Zusatz eines Adjuvans in löslicher und/oder mikroeingekapselter Form weiter verbessert werden.
Rekombinante Untereinheiten-Vakzinen sind für eine Reihe von Viren, einschließlich Herpes, Malaria, Hepatitis, Maul- und Klauensäuche und HIV hergestellt: worden. Gegenwärtig wird gp120 als guter Kandidat für eine HIV-Untereinheiten-1/akzine angesehen, da (i) gp120 bekanntermaßen die CD4-bindende Domäne besitzt, durch die sich HIV an dessen Zielzellen anheftet, (ii) HIV-Infektiosität durch Antikörper gegen gp120 in vitro neutralisiert werden kann, (iii) die Mehrheit der im Serum von HIV-infizierten Individuen vorhandene in-vitro-Neutralisationsaktivität mit einer gp120-Affinitätssäule entfernt werden kann und (iv) der gp120/gp41-Komplex für die Übertragung von HIV durch Zell-Zell-Fusion essentiell zu sein scheint. Rekombinante Untereinheiten-Vakzinen werden beschrieben in Bermann et al., PCT/US91/02250 (publiziert als WO 91/15238 am 17. Oktober 1991). Siehe auch beispielsweise Hu et al., Nature 328, 721-724 (1987) (rekombinante Vaccina-Virus-HIV-env-Vakzine); Arthur et al., J. Virol. '53(12), 5046- 5053 (1989) (gereinigtes gp120); und Bergman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5200-5204 (1988) (rekombinantes Hüll-Glykoprotein gpr120). In der Literatur ist das Herstellen einer Vakzine, die eine Kombination verschiedener HIV-Isolate oder -Isolat- Untereinheiten darstellt, vorgeschlagen worden. Siehe beispielsweise Berman et al. PCT/US91/02250 (publiziert als WO 91/15238 am 17. Oktober 1991) und Rusche et al., PCT/US89/04302 (publiziert als WO 90/03984 am 19. Oktober 1991).
Verschiedene Antigene können in der Formulierung entweder in denselben Mikrokügelchen oder als Mischung von Mikrokügelchen kombiniert werden, um eine multivalente oder Multitarget-Vakzine bereitzustellen. Da weiters Mikrokügelchen, falls gewünscht, so konstruiert werden können, dass sie einen zweiten Antigen- und/oder Adjuvans- Schub ("Auto-Boost") freisetzen, kann ein einzelnes Vakzinenpräparat so konstruiert werden, dass Populationen von Mikrokügelchen vermischt werden, die ihre Antigen- und/oder Adjuvans-Schübe in mehreren vorgeschriebenen Intervallen freisetzen, wenn solche Mehrfachexpositionen gegenüber Antigen und/oder Adjuvans gewünscht werden.
Bevorzugte Adjuvantien zur Verwendung in Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung umfassen Saponine und ihre Derivate. Beispielsweise offenbart US-A-5.057.540 die Verwendung von Quillaja-Saponinen, einer Mischung von aus der Rinde des Baums Quillaja saponaria extrahierten Triterpen-Glykosiden, als Immunadjuvantien. Saponine können auch aus anderen Pflanzen, wie z. B. Sojabohnen, isoliert werden (US-A-4.524.067). White et al. (Immunology of Proteins and Peptides VI, M. Z. Atassi (Hrsg.), Plenum Press, NY (1991)) offenbaren die Verwendung von QS21 als Adjuvans für ein T-unabhängiges Antigen. Wu et al. (J. Immunol. 148, 1519-1525 (1992)) offenbaren die Verwendung von Q21 als Adjuvans für das HIV-1-Hüllprotein gp160 in Mäusen. Newman et al. (AIDS Research and Human Retrovirus 8, 141 3-1418 (1992)) offenbaren die Verwendung von Q21 als Adjuvans für das HIV-1-Hüllprotein gp160 in Rhesusaffen. Kensil et al. (J. Am. Vet. Med. Assoc. 199m 1423-1427 (1991)) offenbaren die Verwendung von Q21 als Adjuvans für das Katzen-Leukämievirus-Untergruppe-Agp70-Protei n.
Polymermatrizes zur Bildung von Mikrokügelchen werden ebenfalls in der Literatur beschrieben. Beispielsweise offenbaren Chang et al. (Bioengineering 1, 25-32 (1976)) semipermeabfe Mikrokügelchen, die Enzyme, Hormone, Vakzine und andere biologische Materialien enthalten. US-A-5.075.109 offenbart ein Verfahren zur Potenzierung einer Immunantwort durch Verabreichung einer Mischung von zumindest zwei Populationen von Mikrokügelchen, die bioaktive Agenzien in der Weise enthalten, dass eine der Mikrokügelchen-Populationen eine Größe zwischen etwa 1 bis 10 um aufweist. US- A-4.293.539 offenbart eine Formulierung kontrollierter Freisetzung eines Wirkstoffs in einem Copolymer, das von etwa 60 bis 95 Gew.-% Milchsäure und etwa 40 bis etwa 4 Gew.-% Glykolsäure herrührt. US-A-4.919.929 offenbart die Verabreichung einer antigenen Substanz in einer geformten Struktur eines biokompatiblen Matrixmaterials. US- A-4.767.628 offenbart eine Zusammensetzung, die ein aktives, säurestabiles Polypeptid und ein Polylactid umfasst, die das Polypeptid mit etwa konstanter Geschwindigkeit in im Wesentlichen einphasiger Weise freisetzt, wenn sie einer wässrigen physiologischen Umgebung ausgesetzt wird. US-A-4.962.091 offenbart eine Mikrosuspension von wasserlöslichen, makromolekularen Polypeptiden in einer Polylactidmatrix. US-A-4.849.228 und US-A-4.728.721 offenbaren ein bioabbaubares, hochmolekulares Polymer, das dadurch gekennzeichnet ist, dass der Gehalt von wasserlöslichen, niedermolekularen Verbindungen, berechnet aufgrund der Annahme, dass solche Verbindungen einbasige Säuren sind, weniger als 0,01 Mol pro 100 Gramm des hochmolekularen Polymers beträgt. US-A-4.902.515 und US-A-4.719.246 offenbaren Polylactid-Zusammensetzungen, die Segmente von Poly(R-Lactid) mit ineinander greifenden Segmenten von Poly(S-Lactid) enthalten. US-A-4.990.336 offenbart ein mehrphasiges Retard-System, das in Mikrokügelchen eingekapselten Allergenextrakt umfasst, wobei die Mikrokügelchen aus biologisch abbaubarem Polymer bestehen, das eine anhaftende, mehrphasige Freisetzung des Allergens erlaubt. Dieses System umfasst einen ersten Anteil des Allergenextrakts, der bei Injektion in der Lage ist, auf eine Weise freigesetzt zu werden, wodurch die anfängliche Allergenität auf die Hervorrufung einer sanften lokalen Reaktion ähnlich derjenigen minimiert ist, die normalerweise bei niedrigen Dosen herkömmlicher Allergen-Verabreichung beobachtet wird, sowie sekundäre Anteile von Allergenextrakt, die einen wesentlich höheren Level von Allergenextrakt in Dosen liefern, die zu einer ernsthaften Reaktion im Patienten führen könnten, abgesehen von der Freisetzung des ersten Anteils des Allergenextrakts. US-A-4.897.268 offenbart ein Mikrokügelchen-Zufuhrsystem, worin die Inhaltsstoffe in biologisch abbaubaren Copolymer-Exzipienten mit variierenden Molverhältnissen eingekapselt sind, sodass die Zufuhr der Inhaltsstoffe mit konstanter Geschwindigkeit über eine anhaltende Zeitspanne erfolgt. Alonso et al. (Pharmaceutical Research 10(7), 945-953) offenbaren Formulierungen kontrollierter Freisetzung basierend auf Poly(Milchsäure)- (PLA-) und Poly(Milchsäure/Glykolsäure)- (PGLA-) Mikrokügelchen, die eine Tetanus-Vakzine enthalten.
Verschiedene Wasser-in-Öl-Emulsionen werden in der Literatur beschrieben. Demnach offenbaren beispielsweise US-A-4.917.893 und US-A-4.652.411 die Produktion eines Mikrokügelchens durch Herstellung einer Wasser-in-Öl-Emulsion, die eine innere wässrige Schicht, die ein wasserlösliches Medikament enthält, eine Medikament zurückhaltende Substanz und eine Ölschicht, die eine polymere Substanz enthält, umfasst; die innere, wässrige Schicht wird auf eine Viskosität von nicht weniger als etwa 5000 Centipoise eingedickt oder verfestigt. Die gebildete Emulsion wird In-Wasser-Trocknung unterzogen. US-A-4.954.298 offenbart die Produktion von Mikrokapseln durch Herstellung einer Wasser-in-Öl-Emulsion bestehend aus einer wasserlösliöhen, Medikament enthaltenden Lösung als innere wässrige Phase und einer Polymer enthaltenden Lösung als Ölphase, wobei die Emulsion in einer wässrigen Phase dispergiert und die gebildete Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsion In-Wasser-Trocknung unterzogen wird, wobei die Viskosität der zur Herstellung der Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsion verwendeten Wasser-in-Öl- Emulsion auf etwa 150 bis etwa 10.000 Centipoise eingestellt wird.
Demgemäß ist es ein Ziel der Erfindung, eine mikroeingekapselte Vakzinenformulierung bereitzustellen, die ein oder mehrere Adjuvantien enthalten kann.
Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, eine Vakzine zur Prophylaxe gegen und/oder Behandlung von HIV-Infektion bereitzustellen.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahren zur Herstellung von Mikrokügelchen.
Dieses Ziel und andere Ziele sind für den gewöhnlich Fachkundigen nachvollziehbar.

Zusammenfassung der Erfindung

Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung die Zufuhr eines Antigens oder mehrerer Antigene an einen Wirt in einem Mikrokügelchen-Format bereit. Das Antigen oder die Antigene können gleichzeitig mit einem in demselben Mikrokügelchen verpackten Adjuvans oder in einem anderen Zufuhr-Format zugeführt werden; alternativ dazu kann ein Adjuvans vor oder nach den Antigen enthaltenden Mikrokügelchen bereitgestellt oder unabhängig in Mikrokügelchen verpackt werden. Die Mikrokügelchen der vorliegenden Erfindung setzen das Antigen und/oder Adjuvans Adjuvans in drei Phasen frei: einem ersten Schub, einer langsamen Freisetzung und einem zweiten Schub. Bevorzugte Adjuvantien zur Verwendung in Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung umfassen Saponine und ihre Derivate.
Ein Aspekt der Erfindung ist eine Zusammensetzung, die eine Population von polymeren Mikrokügelchen, die ein Antigen einkapseln umfasst, worin: die Population aus einer Emulsion erzeugt wird, die ein wässriges Antigen und ein Polymer umfasst, worin: vorerwähntes Polymer ein Polymer von Milchsäure oder ein Copolymer von Glykolsäure mit Milchsäure umfasst; vorerwähnte Mikrokügelchen einen mittleren Durchmesser von etwa 20 bis 100 um aufweisen; und vorerwähnte Mikrokügelchen ein Antigen-Freisetzungsprofil aufweisen, das durch drei Phasen gekennzeichnet ist: eine erste Phase, worin 0,5 bis weniger als 30% des Antigens in einem ersten Schub über einen Zeitraum von etwa einem Tag freigesetzt werden; eine zweite Phase, die der vorerwähnten ersten Phase folgt, worin 0 bis 10% des Antigens über einen Zeitraum von etwa 30 bis 200 Tagen freigesetzt werden; und eine dritte Phase, die der vorerwähnten zweiten Phase folgt, worin zumindest 50% des Antigens in einem zweiten Schub über einen Zeitraum von etwa 10 bis 30 Tagen freigesetzt werden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine Zusammensetzung zur Verwendung als Vakzine, umfassend in PGLA-Mikrokügelchen eingekapseltes Antigen und lösliches Antigen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine in Anspruch 1 beanspruchte Zusammensetzung zur Verwendung als Vakzine.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Einkapselung von Antigen in Mikrokügelchen, umfassend
(a) das Lösen von PLGA-Polymer in einem organischen Lösungsmittel, um eine Lösung herzustellen, worin vorerwähntes Polymer ein Polymer von Milchsäure oder ein Copolymer von Glykolsäure mit Milchsäure umfasst;
(b) das Zusetzen von Antigen zur Lösung aus (a), um eine eine erste Emulsion umfassende PLGA-Antigen-Mischung herzustellen;
(c) das Zusetzen der Mischung aus Schritt (b) zu einem Emulgationsbad, um eine zweite Emulsion umfassende Mikrokügelchen herzustellen;
(d) das Härten der Mikrokügelchen aus Schritt (b), um das eingekapselte Antigen umfassende, gehärtete Mikrokügelchen herzustellen.

Kurzbeschreibung der Abbildungen

Fig. 1 ist eine grafische Darstellung des substanziellen Erosionsvorgangs für PLGA-Mikrokügelchen. PLGA-Mikrokügelchen werden typischerweise vor der Verabreichung hydratisiert. Wasser hydrolysiert die Esterbindungen im PLGA-Gerüst, wie im eingefügten Diagramm gezeigt ist, was zu einer substanziellen Erosion des Polymers im Zeitverlauf führt. Die Hydrolysegeschwindigkeit hängt vom Wassergehalt der Mikrokügelchen, der Lösungsmittelumgebung (z. B. pH) und der Temperatur ab. Die Zahl der Spaltungen im Polymergerüst, die zur Fragmentierung der Mikrokügelchen erforderlich ist, hängt vom Molekulargewicht des Polymers ab.
Fig. 2 ist eine grafische Darstellung der In-vivo-Abbaugeschwindigkeit für PLGA-Polymere modifiziert nach Miller et al. (). Biomed. Mater. Res. 11, 711-719 (1977)). Die X- Achse repräsentiert das relative Verhältnis von entweder Lactid, oder Glykolid für jedes PLGA. Die langsamsten Abbauraten für ein gegebenes Polymer-Molekulargewicht treten für die Polymilchsäure- (PLA-) und Polyglykolsäure- (PGA-) Systeme auf. Die schnellste Abbaugeschwindigkeit wurde mit PLGA erzielt, das denselben Molanteil an Lactid und Glykolid enthält. Die In-vivo-Halbwertszeit zum vollständigen Abbau wurde durch histologische Untersuchungen bei Ratten gemessen.
Fig. 3 ist eine grafische Darstellung des Mikrokügelchen-Herstellungsprozesses unter Verwendung eines doppelten Emulgationsverfahrens. PLGA-Polymere mit unterschiedlichen Molekulargewichten wurden Methylenchlorid zugegeben und gelöst Eine Lösung von MN rgp120 wurde dann unter Homogenisierung in das Methylenchlorid injiziert. Die homogenisierte Lösung wurde dann einer Lösung von Polyvinylalkohol (PVA) zugesetzt. Die PVA-Lösung wurde in einigen Experimenten mit Methylenchlorid (1,5 Vol.-%) gesättigt. Die PVA- und Polymerlösungen wurden in einem Fermenter mit einem Liter vermischt, um die endgültige Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsion zu bilden. Die gebildeten Mikrokügelchen wurden dann in das Härtungsbad transferiert, das einen Wasserüberschuss enthielt, um das verbleibende Methylenchlorid zu extrahieren. Die gehärteten Mikrokügelchen wurden dann gewaschen und durch Lyophilisierung oder Tieftemperatur = (5ºC) Stickstoff- (Fließbett-) oder Vakuumtrocknung getrocknet, um die endgültigen Mikrokügelchen für In-vivo- und In-vitro-Analyse herzustellen. Die in Schrägschrift aufgelisteten Punkte sind die Variablen für jeden Prozessschritt.
Fig. 4 ist eine grafische Darstellung eines Air-Lift- (Fließbett-) Trocknungssystems für die Stickstofftrocknung von PLGA-Mikrokügelchen. (a) Aufschlämmung aus einer Diafiltrationseinheit wird in die Kammer mit dem oberen Kolben (b) oberhalb des Einlasses gepumpt. Der obere Kolben wird dann abwärts bewegt und die überschüssige Flüssigkeit durch Applizieren von Stickstoff durch den oberen Einlass hinausgepresst (c). Der Luftstrom wird dann umgeleitet, um die Mikrokügelchen durch Spülen mit Stickstoff über den unteren Einlass (d) und Freisetzung des Stickstoffs über den oberen Einlass (c) zu suspendieren. Nach Vollständiger Trocknung (1 bis 2 Tage) wird das trockene Pulver entfernt, indem ein Sammelgefäß (Seitenarmkolben, nicht gezeigt) am Auslass platziert, der obere Kolben (b) über dem Auslass bewegt und Stickstoffdruck am unteren Einlass (d) appliziert wird, während am Sammelgefäß mit Vakuum angesaugt wird. Alternativ dazu kann der Trockner so konstruiert sein, dass beide Kolben fix angeschweißt sind und der obere Kolben über dem Einlass für die Aufschlämmung angeordnet ist. Nach dem Hineinpumpen der Aufschlämmung wird der Aufschlämmungsauslass-Seitenarm während der Trocknung durch ein Ventil abgesperrt.
Fig. 5 ist eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme von Mikrokügelchen, die mit 12 kDa- (50 : 50 Lactid : Glykolid) PLGA von Boehringer Ingelheim (BI) bei Raumtemperatur mit überschüssigem Methylenchlorid in der zweiten Emulsion hergestellt wurden. Der letzte Trocknungsschritt war eine Lyophilisierung. Die Mikrokügelchen hatten eine Proteinbeladung von 1 Gew.-% (8% Effizienz) und einen ersten Schub von mehr als 50% des engekapselten Materials.
Fig. 6 ist eine rasterelektronenmikroskopische Abbildung von Mikrokügelchen, die mit 12 kDa- (50 : 50 Lactid : Glykolid) PLGA unter bevorzugten Prozessbedingungen hergestellt wurden. Diese Mikrokügelchen wurden bei niedriger Temperatur (0ºC) ohne überschüssiges Methylenchlorid in der zweiten Emulsion hergestellt. Der letzte Trocknungsschritt war Lyophilisierung. Die Mikrokügelchen hatten eine Proteinbeladung von 3 Gew.-% (58% Effizienz) und einen ersten Schub von mehr als 50% des engekapselten Materials.
Fig. 7 ist eine rasterelektronenmikroskopische Abbildung von Mikrokügelchen, die mit einem 50 : 50-Massenverhältnis von nieder- (12 kDa) und hochmolekularem (100 kDa) PLGA (50 : 50 Lactid : Glykolid) von BI unter bevorzugten Prozessbedingungen hergestellt wurden. Diese Mikrokügelchen wurden bei niedriger Temperatur (0ºC) ohne überschüssiges Methylenchlorid in der zweiten Emulsion hergestellt. Der letzte Trocknungsschritt war eine Lyophilisierung. Die Mikrokügelchen hatten eine Proteinbeladung von 1,8 Gew.-% (100% Effizienz) und einen ersten Schub von mehr als 15% des engekapselten Materials.
Fig. 8 ist eine grafische Darstellung der In-vitro-Freisetzung von MN rgp120 aus PLGA- Mikrokügelchen. Die Mikrokügelchen wurden durch Verwendung eines 50 : 50 Massenverhältnisses von nieder- (12 kDa) und hochmolekularem (100 kDa) PLGA (50 : 50 Lactid : Glykolid), geliefert von Medisorb Technologies International L. P. (MTI), hergestellt. Die Mikrokügelchen hatten eine Proteinbeladung von 4,4 Gew.-%, und der letzte Trocknungsschritt war eine Lyophilisierung.
Fig. 9(a) ist eine grafische Darstellung des fernen Ultraviolett-Zirkulardichroismus von MN rgp120, freigesetzt aus Mikrokügelchen nach Inkubation für 1 Stunde bei 37ºC in Freisetzungsmedium. Die Kontrollen sind unbehandeltes Protein in demselben Medium, inkubiert mit (--) oder ohne (-) Placebo-PLGA-Mikrokügelchen. Es wurden Mikrokügelchen analysiert, die mit 12 kDa- (50 : 50 Lactid : Glykolid) PLGA von BI (...) und einem 50 : 50-Massenverhältnis von 12 kDa- und 100 kDa-PLGA (75 : 25 Lactid : Glykolid) von BI (-...-) hergestellt waren. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass aus den Mikrokügelchen freigesetztes MN rgp120 in dessen Sekundärstruktur nicht verändert wird.
Fig. 9(b) ist eine grafische Darstellung des nahen Ultraviolett-Zirkulardichroismus von MN rgp120, freigesetzt aus Mikrokügelchen nach Inkubation für 1 Stunde bei 37ºC in Freisetzungsmedium. Die Kontrollen sind unbehandeltes Protein in demselben Medium, inkubiert mit (--) oder ohne (-) Placebo-PLGA-Mikrokügelchen. Es wurden Mikrokügelchen analysiert, die mit 12 kDa- (50 : 50) PLGA von BI (...) und einem 50 : 50-Massenverhältnis von 12 kDa- und 100 kDa-PLGA (75 : 25 Lactid : Glykolid) von BI (-...-) hergestellt waren. Diese Daten beweisen, dass aus den Mikrokügelchen freigesetztes MN rgp120 in dessen Tertiärstuktur nicht verändert wird.
Fig. 10 ist eine grafische Darstellung der. Dosis-Antwort des In-vivo-Autoboosts aus PLGA-Formulierungen, wie gemessen anhand des Antikörpertiters gegen MN rgp120. Meerschweinchen wurden mit variierenden Mengen einer MN rgp120-Formulierung (12 kDa- (75 : 25 Lactid : Glykolid) PLGA, 2,4 Gew.-% MN rgp120) dosiert. Die aus den PLGA-Formulierungen zugeführte Gesamtdosis betrug 14 ( ), 42 ( ) oder 112 ( ) ug MN rgp120. Eine Kontrollgruppe mit 30 ug MN rgp120, formuliert mit 60 ug Alaun (RehydrageliM) wurde ebenfalls eingeschlossen (O). Allen Tieren wurde eine einzelne Injektion zum Zeitpunkt 0 Wochen verabreicht, und es wurden die Antikörpertiter im Zeitverlauf gemessen. Die Antikörpertiter von Alaun/gp120-immunisierten Tieren nahmen 4-5 Wochen nach der anfänglichen Immunisierung stets ab.
Fig. 11 ist eine grafische Darstellung der Dosis-Antwort des In-vivo-Autoboosts aus PLGA-Formulierungen, wie gemessen anhand des Antikörpertiters gegen die V3-Schleife von MN rgp120. Meerschweinchen wurden mit variierenden Mengen einer gp120-Formulierung (12 kDa- (75 : 25 Lactid : Glykolid) PLGA, 2,4 Gew.-% MN rgp120) dosiert. Die aus den PLGA-Formulierunf; en zugeführte Gesamtdosis betrug 14 ( ), 42 ( ) oder 112 ( ) ug MN rgp120. Eine Kontrollgruppe mit 30 ug MN rgp120, formuliert mit 60 ug Alaun (RehydragelTM) wurde ebenfalls einbezogen (O). Allen Tieren wurde eine einzelne Injektion zum Zeitpunkt 0 Wochen verabreicht, und die Antikörpertiter im Zeitverlauf wurden gemessen. Der 14 Wochen-Zeitpunkt für die Alaunkontrolle ist ein geschätzter Titer, da diese Gruppe nach 8 Wochen geboostet wurde. Die Antikörpertiter von Alaun/gp120-immunisierten Tieren nahmen 4-5 Wochen nach der anfänglichen Immunisierung stets ab.
Fig. 12 ist eine grafische Darstellung der Wirkung der Mikroeinkapselung auf die Immunogenität von MN rgp120 und QS21, wie gemessen anhand von Antikörpertitern gegen MN rgp120. Meerschweinchen wurden an Woche 0 mit MN rgp120 in verschiedenen Formulierungen immunisiert: 15 ug eingekapseltes und 15 ug lösliches MN rgp120 (O), 30 ug MN rgp120 mit b0 ug Alaun (Kontrolle, ), 30 ug eingekapseltes MN rgp120 ( ), 30 ug eingekapseltes MN rgp120 und 50 ug lösliches QS21 (Ii) und 25 ug eingekapseltes MN rgp120 und 19 ug eingekapseltes QS21 in denselben Mikrokügeichen (·). Die eingekapselte MN rgp120-Formulierung wurde mit einer 50 : 50-Massenverhältnis-Mischung von 12 kDa- (75 : 25 Lactid : Glykolid) und 100 kDa- (75 : 25 Lactid : Glykolid) PLGA von Boehringer Ingelheim (BI) (5 Gew.-% MN rgp120) hergestellt. Die eingekapselte MN rgp120/QS21-Formulierung bestand aus MN rgp120 sowie Q521 in denselben Mikrokügelchen, die mit einer 50 : 50-Massenverhältnis-Mischung von 12 kDa- (75 : 25 Lactid : Glykolid) und 100 kDa- (75 : 25 Lactid : Glykolid) PLGA von BI (2,5 Gew.-% MN rgp120, 1,9 Gew.-% QS21) hergestellt wurden.
Fig. 13 ist eine grafische Darstellung der Wirkung der Mikroeinkapselung auf die Immunogenität von MN rgp120 und QS21, wie gemessen anhand von Antikörpertitern gegen die V3-Schleife von MN rgp120. Meerschweinchen wurden in Woche 0 mit MN rgp120 in verschiedenen Formulierungen immunisiert: 15 ug eingekapseltes und 15 ug lösliches MN rgp120 (O), 30 ug MN rgp120 mit 60 ug Alaun (Kontrolle, ), 30 ug eingekapseltes MN rgp120 ( ), 30 ug eingekapseltes MN rgp120 und 50 ug lösliches QS21 (0) und 25 ug eingekapseltes MN rgp120 und 19 ug eingekapseltes QS21 in denselben Mikrokügelchen ( ). Die eingekapselte MN rgp120-Formulierung wurde mit einer 50 : 50-Massenverhältnis-Mischung von 12 kDa- (75 : 25 Lactid : Glykolid) und 100 kDa- (75 : 25 Lactid : Glykolid) PLGA von BI (5 Gew.-% MN rgp120) hergestellt. Die eingekapselte MN rgp120/QS21-Formulierung bestand aus MN rgp120 sowie QS21 in denselben Mikrokügelchen, die mit einer 50 : 50-Massenverhältnis-Mischung von 12 kDa- (75 : 25 Lactid : Glykolid) und 100 kDa- (75 : 25 Lactid : Glykolid) PLGA von BI (2,5 Gew.-% MN rgp120, 1,9 Gew.-% QS21) hergestellt wurden.

Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

A. Definitionen

Die Begriffe "Polylactid" und "PLGA" werden wie hierin verwendet hierin austauschbar verwendet und beziehen sich auf ein Polymer von Milchsäure alleine, ein Polymer von Glykolsäure alleine, eine Mischung von solchen Polymeren, ein Copolymer von Glykolsäure mit Milchsäure, eine Mischung von solchen Copolymeren oder eine Mischung von solchen Polymeren und Copolymeren. Ein bevorzugte Polymermatrix für die Bildung der Mikrokügelchen der vorliegenden Erfindung ist Poly(D-L-Lactid-co-Glykolid).
Der Begriff "Antigen" bezeichnet wie hierin verwendet eine Verbindung die ein oder mehrere Epitope enthält, gegen die eine Immunantwort erwünscht ist. Typische Antigene umfassen Nucleinsäuren, Proteine, Polypeptide, Peptide, Polysaccharide und Haptenkonjugate. Komplexe Mischungen von Antigenen sind in dieser Definition ebenfalls umfasst, wie z. B. abgetötete ganze Zellen, Bakterien oder Viren oder Fraktionen davon.
Der Begriff "Adjuvans" bezeichnet wie hierin verwendet eine Substanz, die ihrerseits keine Immunepitope mit einem Antigen von Interesse gemeinsam hat, die jedoch die Immunantwort auf das Antigen von Interesse stimuliert.
Der Ausdruck "therapeutische Menge" bezeichnet wie hierin verwendet eine Menge, die Symptome einer Störung oder responsiven, pathologisch physiologischen Kondition verhindert oder verbessert. In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist die verabreichte Menge ausreichend, eine Immunantwort auszulösen, die im Wesentlichen die Infektion oder Ausbreitung des infektiösen Agens im Rezipienten verhindert.
Der Begriff "Polyol" bezeichnet wie hierin verwendet einen Kohlenwasserstoff, der zumindest zwei an Kohlenstoffatome Hydroxylgruppen umfasst. Beispiele von Polyolen, die zur Praktizierung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen Zuckeralkohole, wie z. B. Mannitol und Trehalose, und Polyether.
Der Begriff "Polyether" bezeichnet wie hierin verwendet einen Kohlenwasserstoff, der zumindest drei Etherbindungen enthält. Polyether können andere funktionelle Gruppen umfassen. Zur Praktizierung der Erfindung nützliche Polyether schließen Polyethylenglykol (PEG) ein.
Die Ausdrücke "trockenes Antigen" oder "trockenes Adjuvans" bezeichnen wie hierin verwendet ein Antigen oder Adjuvans, das einer Trocknungsprozedur, wie z. B. Lyophilisierung unterzogen wurde, sodass zumindest etwa 50% von dessen Feuchtigkeit entfernt worden ist.
Der Begriff "Einkapselung" bezeichnet wie hierin verwendet ein Verfahren zur Formulierung eines aktiven Agens, wie z. B. eines Antigens und/oder Adjuvans in eine Zusammensetzung, die zur kontrollierten Freisetzung des aktiven Agens zweckdienlich ist. Beispiele einkapselnder Materialien, die für die vorliegende Erfindung zweckdienlich sind, umfassen Polymere oder Copolymere von Milch- oder Glykolsäure oder Mischungen solcher Polymere und/oder Copolymere, die für gewöhnlich als "Polylactide" oder "PLGA" bezeichnet werden, obgleich irgendein Polyester oder einkapselndes Material verwendet werden kann. Der begriff "Coeinkapselung" bezieht sich wie hierin verwendet auf den Einschluss von zwei oder mehreren aktiven Agenzien, wie z. B. Adjuvans und Antigen, mehr als ein Antigen, mehr als ein Adjuvans, usw. in dasselbe Mikrokügelchen.
Der Begriff "Beimischen" bezeichnet wie hierin verwendet den Zusatz eines Exzipienten zu einem Antigen oder Adjuvans von Interesse, wie z. B. durch Mischung von trockenen Reagenzien oder Mischung eines trockenen Reagens mit einem Reagens in Lösung oder Suspension, oder Mischung wässriger Formulierungen von Reagenzien.
Der Begriff "Exzipient" bezeichnet wie hierin verwendet einen einer pharmazeutischen Zusammensetzung zugesetzten, nicht therapeutischen Träger, der pharmazeutisch annehmbar, d. h. für Rezipienten bei angewendeten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch ist. Geeignete Exzipienten und ihre Formulierungen sind beschrieben in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Aufl. (1980), Mack Publishing Co., Oslo et al. (Hrsg.).
Der Ausdruck "organisches Lösungsmittel" meint wie hierin verwendet jedes Kohlenstoffverbindungen enthaltende Lösungsmittel. Beispielhafte organische Lösungsmittel umfassen halogenierte Kohlenwasserstoffe, Ether, Ester, Alkohole und Ketone, wie z. B. Methylenchlorid, Ethylacetat, eine Mischung von Ethylacetat und Benzylalkohol oder Aceton, Dimethylsulfoxid, Tetrahydrofuran, Dimethylformamid und Ethanol.
"Behandeln" eines Antigens oder Adjuvans mit einem organischen Lösungsmittel bezieht sich wie hierin verwendet auf die Mischung eines trockenen Antigens oder Adjuvans mit einem organischen Lösungsmittel, oder Herstellung einer Emulsion eines Antigens oder Adjuvans in einer wässrigen Formulierung mit einem organischen Lösungsmittel, Erzeugung einer Grenzfläche zwischen einem Antigen oder Adjuvans in einer wässrigen Formulierung mit einem organischen Lösungsmittel oder Extraktion eines Antigens oder Adjuvans aus einer wässrigen Formulierung mit einem organischen Lösungsmittel.
"Polypeptid" bezieht sich wie hierin verwendet im Allgemeinen auf Peptide und Proteine mit zumindest etwa zwei Aminosäuren.
"Vakzine" bezieht sich wie hierin verwendet auf eine Formulierung eines Antigens, von der beabsichtigt ist, eine prophylaktische oder therapeutische Reaktion in einem Wirten bereitzustellen, wenn der Wirt dem Antigen ausgesetzt wird. Beispielhafte Vakzinen umfassen Vakzinen gegen Krankheiten wie Hepatitis, Polio, Herpes, Maul- und Klauenseuche, Diphtherie, Tetanus, Pertussis und Malaria, und Infektionen mit Agenzien wie Cytomegalovirus, HIV und Haemophilus sp. gerichtete Vakzinen. Bevorzugte Vakzinen hierin umfassen gp120, Vacciinia-Virus-HIV-env-rekombinante Vakzine und gp160.
"Fließbett" bezieht sich wie hierin verwendet im Allgemeinen auf ein Bett von granulären Partikeln, durch die ein Gasstrom langsam aufwärts fließt, sodass mit weiterer Erhöhung der Gasgeschwindigkeit die Poren und Kanäle sich vergrößern und die Partikel weiter voneinander getrennt werden. Umfasst in dieser Definition sind Fließ- oder Festbett-Konfigurationen einschließlich, jedoch nicht eingeschränkt auf Schlämm- und Tropfbett-Reaktorsysteme. Im Fließbett verwendete Gase sind vorzugsweise Stickstoff, Sauerstoff und Kohlendioxid. obwohl jedes trockene Gas, das die Entfernung von Wasser und/oder anderen Lösungsmitteln erleichtert, verwendet werden kann. Die Verfahren zur Konstruktion eines Fließ- oder Festbettsystems ist der Wissenschaft weitgehend bekannt, wie auch Beispiels von Fließbettsystemen, die zur Praktizierung der vorliegenden Erfindung zweckdienlich sind (siehe beispielsweise Perry & Chilton (Chemical Engineers' Handbook, R. H. Perry und C. H. Chilton (Hrsg.), 5. Aufl., S. 4-20-4-40, 5-52-5- 55 (1973)).
Der Begriff "Härten" wie hierin in Bezug auf Mikrokügelchen verwendet, bezieht sich auf die Extraktion von überschüssigem Lösungsmittel aus der Polymerphase.

B8. Allgemeine Verfahren

Im Allgemeinen wird die Mikroeinkapselung eines Antigens oder Adjuvans gemäß dem in Fig. 3 kurz dargestellten Protokoll durchgeführt. Kurz gefasst wird PLGA mit gewünschtem Verhältnis Lactid zu Glykolid (etwa 100 : 0 bis 0 : 100 Gew.-%, bevorzugter etwa 65 : 35 bis 35 : 65, insbesondere bevorzugt etwa 50 : 50) und gewünschter Eigenviskosität (im Allgemeinen etwa 0,1 bis 1, 2 dl/g, vorzugsweise etwa 0,2 bis 0,8 dl/g) zuerst in einem organischen Lösungsmittel wie z. B. Methylenchlorid, oder Ethylacetat mit oder ohne Benzylalkohol oder Aceton in der gewünschten Konzentration (im Allgemeinen etwa 0,05 bis 1,0 g/l, vorzugsweise etwa 0,3 bis 0,6 g/l) gelöst. Eine konzentrierte Antigen- oder Adjuvans-Lösung (zum Beispiel typischerweise zumindest 0,1 mg/ml für Polypeptide, vorzugsweise höher als etwa 100 mg/ml, abhängig beispielsweise von der Art des Polypeptids und der gewünschten Kernbeladung) wird dann in die Polymerlösung bei gleichzeitiger Homogenisierung bei etwa 15.000 bis 25.000 U/min auf geeignete Weise Injiziert (wie z. B. mit einer Kanüle Nr. 25) Trockenes Antigen oder Adjuvans kann anstelle von wässrigem Antigen oder Adjuvans verwendet werden. Nach Homogenisierung (im Allgemeinen etwa 0,5 bis 5 Minuten, bevorzugter für 1 Minute) wird die Emulsion dem Reaktionskessel (Emulgationsbad) oder statischem Mischer (nicht gezeigt) zugesetzt, um eine zweite Emulsion zu bilden. Das Emulgationsbad ist typischerweise eine Polyvinylalkohollösung die optional Ethylacetat enthält. Der Reaktionskessel wird mit hoher Geschwindigkeit (im Allgemeinen etwa 1.700 bis 2.500 U/min) gerührt, um kleine Mikrokügelchen (etwa 20 bis 100 um mittleren Durchmessers) zu erzeugen. Die zweite Emulsion wird nach einer ausreichen Zeitspanne, im Allgemeinen etwa 0,5 bis 10 min. vorzugsweise etwa 1 Minute in ein Härtungsbad transferiert und für eine geeignete Zeitspanne, im Allgemeinen etwa 1 bis 24 Stunden, vorzugsweise etwa 1 Stunde sanft gerührt. Wenn die Härtung vervollständigt ist, werden die Mikrokügelchen vorfiltriert (z. B. mit einer Maschenweite von 150 um), konzentriert und diafiltriert. Diafiltration wird geeigneterweise in einer Amicon-Rührzelle (2.500 ml), vorzugsweise mit einem Filter von etwa 16 oder 20 um, erzielt. Die Mikrokügelchen werden gewaschen, typischerweise mit etwa 1 bis 100 l, vorzugsweise etwa 15 l vorfiltriertem Wasser, und typischerweise mit etwa 1 bis 100 l, bevorzugter 15 l0,1% Tween® 20. Die endgültigen Mikrokügelchen werden vom Filter entfernt, in Wasser resuspendiert und in Fläschchen gefüllt, vorzugsweise mit etwa 500 ml/Fläschchen in 3 cm³-Fläschchen, Die Mikrokügelchen können dann getrocknet werden. Das Trocknen umfasst Verfahren wie z. B. Lyophilisierung, Vakuumtrocknung und Fließbetttrocknung.
Drei weitere beispielhafte Verfahren können zur Herstellung von Mikrokügelchen verwendet werden. Das erste Verfahren verwendet eine Lösungsmittelverdampfungstechnik. Ein festes oder flüssiges, aktives Agens wird einem das Polymer enthaltendem Lösungsmittel zugesetzt. Das aktive Agens wird dann im organischen Lösungsmittel emulgiert. Diese Emulsion wird dann auf eine Oberfläche gesprüht, um Mikrokügelchen zu erzeugen und das verbleibende organische Lösungsmittel unter Vakuum entfernt. Das zweite Verfahren umfasst einen Phasentrennungsprozess, der häufig als Koazervation bezeichnet wird. Eine erste Emulsion eines wässrigen oder festen, aktiven, in das Polymer enthaltendem organischem Lösungsmittel dispergierten Agens wird einer Lösung von Nicht-Lösungsmittel, für gewöhnlich Silikonöl zugesetzt. Durch Anwendung von Lösungsmitteln, die das Polymer nicht lösen (Nicht-Lösungsmittel), jedoch das zum Lösen des Polymers verwendete, organische Lösungsmittel (z. B. Methylenchlorid oder Ethylacetat) extrahieren, fällt dann das Polymer aus der Lösung und bildet Mikrokügelchen, sofern sich dieser Prozess während des Rührens ereignet. Das dritte Verfahren verwendet eine Beschichtungstechnik. Eine erste Emulsion, die das aktive Agens enthält und in einem organischen Lösungsmittel mit dem Polymer dispergiert ist, wird durch einen Luft-Suspension-Beschichtungsapparat verarbeitet, was die endgültigen Mikrokügelchen ergibt.
Wenn Antigen und Adjuvans aus denselben Mikrokügelchen heraus zu verabreichen sind, kann eine Lösung, die sowohl Antigen-, als auch Adjuvanslösungen enthält, oder können Lösungen, die Antigen und Adjuvans getrennt enthalten, der Polymerlösung zugesetzt werden. Auf ähnliche Weise können lösliches Antigen und trockenes Adjuvans, trockenes Antigen und lösliches Adjuvans, oder trockenes Antigen und trockenes Adjuvans verwendet werden. Die Mikrokügelchen der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise durch einen Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulgationsprozess gebildet.
Im Allgemeinen können sowohl wässrige Formulierungen, als auch trockene Polypetid- Antigene oder -Adjuvantien mit einem Exzipienten vermengt werden, um für eine stabilisierende Wirkung vor der Behandlung mit einem organischen Lösungsmittel, wie z. B. Methylenchlorid, zu sorgen. Eine wässrige Formulierung eines Polypeptids kann ein Polypeptid in Suspension oder in Lösung sein. Typischerweise wird eine wässrige Formulierung des Exzipienten einer wässrigen Formulierung des Polypeptids zugesetzt, obgleich ein trockener Exzipienten zugesetzt werden kann und umgekehrt. Eine wässrige Formulierung eines Polypeptids und eines Exzipienten kann auch durch Lyophilisierung oder andere Mittel getrocknet werden. Solche getrockneten Formulierungen können vor der Behandlung mit einem organischen Lösungsmittel in wässrige Formulierungen rekonstituiert werden.
Der zur Stabilisierung eines Polypeptid-Antigens oder Adjuvans von Interesse verwendete Exzipient ist typischerweise ein Polyol mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 70.000 kDa. Beispiele für Polyole, die verwendet werden können, umfassen Trehalose (laufende U.S.S.N. 08/021.421, eingereicht am 23. Februar 1993), Mannitol und Polyethylenglykol (PEG). Typischerweise betragen die Massenverhältnisse zwischen Trehalose und Polypeptid etwa 1000 : 1 bis 1 : 1000, vorzugsweise etwa 100 : 1 bis 1 : 100, bevorzugter etwa 1 : 1 bis 1 : 10, insbesondere bevorzugt etwa 1 : 3 bis 1 : 4. Typische Massenverhältnisse zwischen Mannitol und Polypeptid liegen bei 100 : 1 bis 1 : 100, vorzugsweise etwa 1 : 1 bis 1 : 10, bevorzugter etwa 1 : 1 bis 1 : 2. Typischerweise beträgt das Massenverhältnis von PEG zu Polypeptid etwa 100 : 1 bis 1 : 100, vorzugsweise etwa 1 : 1 bis 1 : 10. Bevorzugte Verhältnisse werden auf Basis einer Exzipienten-Konzentration gewählt, die eine maximale Löslichkeit des Polypeptids bei minimaler Denaturierung des Polypeptids erlaubt.
Die Formulierungen der vorliegenden Erfindung können ein Konservierungsmittel, einen oder mehrere Puffer, mehrere Exzipienten, wie z. B. Polyethylenglykol (PEG), zusätzlich zu Trehalose oder Mannitol, oder ein nichtionisches Tensid, wie z. B. Tween® 20 enthalten. Nichtionische Tenside umfassen Polysorbate, wie z. B. Polysorbat 20 oder 80, und Poloxamere, wie z. B. Poloxamer 184 oder 188, Pluronic®-Polyole oder andere Ethylenoxid/Propylenoxid-Blockcopolymere usw. Wirksame Mengen, die eine stabile wässrige Formulierung ergeben, werden verwendet, üblicherweise im Bereich von etwa 0,1% (Gew./Vol.) bis etwa 30% (Gew./Vol.).
Der pH der Formulierungen dieser Erfindung beträgt im Allgemeinen etwa 5 bis 8, vorzugsweise etwa 6,5 bis 7,5. Geeignete Puffer zur Erzielung dieses pH-Werts umfassen in Abhängigkeit vom gewünschten pH beispielsweise Phosphat-, Tris-, Citrat-, Succinat-, Acetat- oder Histidin-Puffer. Vorzugsweise liegt der Puffer im Bereich von etwa 2 mM bis etwa 100 mM.
Beispiele für geeignete Konservierungsmittel für die Formulierung umfassen Phenol, Benzylalkohol, m-Kresol; Methylparaben, Propylparaben, Benzalkoniumchlorid und Benzethoniumchlorid. Bevorzugte Konservierungsmittel umfassen etwa 0,2 bis 0,4% (Gew./Vol.) Phenol und etwa 0,7 bis 1% (Gew./Vol.) Benzylalkohol, obgleich die Art von Konservierungsmittel und der Konzentrationsbereich nicht entscheidend sind.
Im Allgemeinen können die Formulierungen der vorliegenden Erfindung andere Komponenten in Mengen enthalten, die der Herstellung stabiler Formen nicht abträglich sind, und in Mengen, die für wirksame, sichere pharmazeutische Verabreichnung geeignet sind. Beispielsweise können andere pharmazeutisch annehmbare, den Fachkundigen bekannte Exzipienten einen Teil der gegenständlichen Zusammensetzungen bilden. Diese umfassen beispielsweise Salze, verschiedene Flüller, zusätzliche Pufferagenzien, Chelatbildner, Antioxidantien, Co-Lösungsmittel und dergleichen; spezielle Beispiele dafür umfassen Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Salze ("Tris-Puffer") und Dinatriumedetat.
Antigene von Interesse, die hierin zweckdienlich sind, umfassen beispielsweise HIV-Antigene, wie z. B. gp120, gp160, gag, pol, Nef, Tat und Rev; Malaria-Antigene, wie z. B. CS-Proteine und Sporozoite 2; Hepatitis B-Antigene, einschließlich Pre-SI, Pre-S2, HBc- Ag, HBsAg und HBeAg; Influenza-Antigene, wie z. B. HA, NP und NA; Hepatitis A- Oberflächenantigene; Herpes-Virus-Antigene, wie z. B. EBV gp340, EBV gp85, HSV gB, HSV gD, HSV gH und HSV frühes Proteinprodukt; Cytomegalovirus-Antigene, wie z. B. gB, gH und IE-Protein gP72; Respiratory-syncytial-Virus-Antigene, wie z. B. F-Protein, G- Protein und N-Protein. Polypeptide oder Proteinfragmente, die Immunepitope definieren, und Aminosäurevarianten von Proteinen, Polypeptiden oder Peptiden können anstelle von Proteinen voller Länge verwendet werden. Polypeptide und Peptide können auch an Haptene konjugiert werden.
Mehrwertige Vakzinen körnen mit Gemischen von Antigenen formuliert werden, die entweder zuerst vermischt und dann eingekapselt oder zuerst eingekapselt und danach in einer Formulierung zur Verabreichung an einen Patienten vermischt werden. Solche Mischungen können von zwei bis hinauf zu etwa 100 Antigenen bestehen. Die Antigene können antigene Determinanten aus demselben Organismus, wie z. B. gp120-Polypeptide, die aus geografisch unterschiedlichen HIV-Stämmen isoliert wurden, oder aus unterschiedlichen Organismen darstellen, wie z. B. Diphtherie-Petussis-Tetanus-Vakzine.
Beispielhafte Adjuvantien von Interesse, die für die vorliegende Erfindung zweckdienlich sind, umfassen Saponine, wie z. B. QS21, Muramyldipeptid, Muramyltripeptid und Verbindungen mit einem Muramylpeptidkern, Mycobakterien-Extrakte, Aluminiumhydroxid, Proteine, wie z. B. Gamma-Interferon und Tumornekrosefaktor, Phosphatidylcholin, Squalen, Pluronic®-Polyole und Freund'sches Adjuvans (eine Mineralölemulsion) (siehe Hintergrund-Abschnitt dieser Anmeldung bezüglich Literaturstellen). Obwohl ein Antigen wünschenswerterweise zusammen mit einem Adjuvans verabreicht wird, erfordern Auffrischungen mit Antigen für gewöhnlich kein Adjuvans. PLGA und andere Polymere können ebenfalls als Adjuvantien dienen.
Typischerweise wird ein Artigen von Interesse in PLGA-Mikrokügelchen formuliert, um eine gewünschte Zeitspanne zwischen erstem und zweitem Antigen-Schub und eine gewünschte Antigen-Menge bei jedem Schub bereitzustellen. Die Menge an Antigen im ersten Schub kann durch lösliches Antigen in der Formulierung gesteigert werden. Vorzugsweise ist ein Adjuvans mikroeingekapselt, obgleich dem Patienten auch ein lösliches Adjuvans verabreicht werden kann.
Die Mikrokügelchen, lösliches Antigen und/oder Adjuvans werden gemeinsam mit beliebigen erforderlichen Cofaktoren pharmazeutisch annehmbaren, sterilen, isotonischen Formulierungen zugesetzt und werden gegebenenfalls auf standardmäßige, gut fachbekannte Weise verabreicht. Mikrokügelchen-Formulierungen werden typischerweise als trockenes Pulver gelagert.
Die an den Patienten verabreichte, in der Therapie zu verwendende Menge an Antigen wird formuliert und die Dosis gemäß üblicher medizinischer Praxis festgesetzt, wobei die zu behandelnde Störung, der Zustand des einzelnen Patienten, die Verabreichungsstelle, das Verabreichungsverfahren und andere, den behandelnden Ärzten bekannte Faktoren berücksichtigt werden. In ähnlicher Weise hängt die Dosis der verabreichten Vakzine von den Eigenschaften des verwendeten Antigens, d. h. von dessen Bindungsaktivität und In-vivo-Halbwertszeit im Plasma, von der Konzentration des Antigens in der Formulierung, dem Verabreichungsweg der Stelle und Rate der Dosierung, der klinischen Toleranz des jeweiligen Patienten, des pathologischen Affektion des Patienten und dergleichen, wie es Ärzten bestens bekannt ist. Im Allgemeinen werden Dosierungen von etwa 0,1 bis 1000 mg pro Patient und Verabreichung bevorzugt. Es können während einer Abfolge aufeinander folgender Impfungen auch unterschiedliche Dosierungen eingesetzt werden; der behandelnde Arzt kann eine erste Impfung verabreichen und dann mit relativ geringeren Dosen an Adjuvans auffrischen ("boosten").
Es ist vorgesehen, dass Injektionen (intramuskulär oder subkutan) der hauptsächliche Weg für die therapeutische Verabreichung des eingekapselten Adjuvans dieser Erfindung sind, obgleich die Zufuhr über Katheter oder chirurgische Schläuche auch angewendet wird. Alternative Wege umfassen Suspensionen, Tabletten, Kapseln und dergleichen für orale Verabreichung, im Handel erhältliche Vernebler für flüssige Formulierungen und Inhalation von lyophilisierten oder aerosolisierten Mikrokapseln und Suppositorien für rektale oder vaginale Verabreichung. Flüssige Formulierungen können nach Rekonstitution aus Pulver-Formulierungen angewendet werden.
Die Eignung der gewählten Impfparameter, z. B. Dosis, Schema, Adjuvans-Wahl und dergleichen, kann durch Entnahme von Serum-Aliquoten aus dem Patienten und Testen auf Antikörpertiter im Verlauf des Immunisierungsprotokolls bestimmt werden. Alternativ dazu kann die Gegenwart von T-Zellen oder anderen Zellen des Immunsystems nach herkömmlichen Verfahren bestimmt werden. Zusätzlich kann der klinische Zustand des Patienten auf die gewünschte Wirkung, z. B. antiinfektiöse Wirkung, hin beobachtet werden. Wenn unzureichende Immunisierung erzielt wird, dann kann der Patient mit weiteren Impfungen geboostet und die Impfparameter in einer Weise modifiziert werden, von der eine Potenzierung der Immunantwort erwartet werden kann, z. B. Erhöhung der Antigen- und/oder Adjuvansmenge, Komplexierung des Antigens mit einem Träger oder dessen Konjugation an ein immunogenes Protein oder Variierung des Verabreichungsweges.
Die Mikrokügelchen der vorliegenden Erfindung sind so konstruiert, dass sie ihren Inhalt in drei Phasen freisetzen, bestehend aus einem ersten Schub, einer langsamen Freisetzung und einem zweiten Schub. Die Abbaugeschwindigkeit für die Mikrokügelchen der Erfindung ist teilweise durch das Verhältnis von Lactid zu Glykolid im Polymer und das Molekulargewicht des Polymers bestimmt. Polymere verschiedener Molekulargewichte (oder Eigenviskositäten) können gemischt werden, um ein gewünschtes, gepulstes Abbauprofil zu liefern. Darüber hinaus können Populationen von Mikrokügelchen, die so konstruiert sind, dass ihr zweiter Schub zu verschiedenen Zeitpunkten auftritt, vermischt werden, um mehrfache Expositionen gegenüber dem Antigen und/oder Adjuvans zu gewünschten Zeitpunkten zu ergeben. In ähnlicher Weise können Mischungen von Antigenen und/oder Adjuvantien entweder gemeinsam in denselben Mikrokügelchen oder als Mischungen von Mikrokügelchen bereitgestellt werden, um multivalente oder Kombinationsvakzinen zu ergeben. Folglich kann anstelle des Erhalts von drei Immunisierungen mit herkömmlicher DTP-Vakzine (Diphtherie, Tetanus und Pertussis) nach 2, 4 und 6 Monaten, eine einzige, mikroeingekapselte Vakzine mit Mikrokügelchen vorgesehen werden, die für Schübe nach 2, 4 und 6 Monaten sorgen.
Die Mikrokügelchen der vorliegenden Erfindung können in jeder gewünschten Größe hergestellt werden, und zwar im Bereich von etwa 0,1 bis mehr als etwa 100 um Durchmesser durch Variation der Prozessparameter, wie z. B. Rührgeschwindigkeit, im zweiten Emulgationsschritt verwendetes Lösungsmittelvolumen, Temperatur, PLGA-Konzentration und Eigenviskosität des PLGA-Polymers. Die Beziehung zwischen diesen Parametern wird unten ausführlich diskutiert. Die Mikrokügelchen der vorliegenden Erfindung besitzen einen mittleren Durchmesser von im Allgemeinen etwa 20 bis 100 um, vorzugsweise etwa 20 bis 50 um, bevorzugter 30 um.
Die HIV-Vakzine der vorliegenden Erfindung umfasst typischerweise drei Populationen von PGLA-Mikrokügelchen: Mikrokügelchen, die 1 bis 5 Gew.-% gp120 enthalten und mit einem 50 : 50-Massenverhältnis von PGLA-Polymeren mit Eigenviskositäten von 0,2 und 0,75 dl/g erzeugt wurden, worin das Verhältnis zwischen Lactid und Glykolid 50 : 50 betrug (Präparat 1); Mikrokügelchen, die 1 bis 8 Gew.-% QS21 enthalten und mit einem 50 : 50-Massenverhältnis von PGLA-Polymeren mit Eigenviskositäten von 0,2 und 0,75 dl/g erzeugt wurden, worin das Verhältnis zwischen Lactid und Glykolid 50 : 50 betrug (Präparat 2); und Mikrokügelchen, die 1 bis 5 Gew.-% gp120 enthalten und mit PGLA-Polymeren mit Eigenviskositäten von 0,7 bis 1,2 dl/g erzeugt wurden, worin das Verhältnis zwischen Lactid und Glykolid 50 : 50 betrug (Präparat 3). Lösliches gp120 wird in der Vakzine ebenfalls in einer Konzentration von etwa 300 bis 1000 mg/Dosis, noch bevorzugter 300 bis 600 mg/Dosis, bereitgestellt. Lösliches QS21 wird in der Vakzine ebenfalls in einer Konzentration von etwa 50 bis 200 mg/Dosis, noch bevorzugter 50 bis 100 mg/Dosis, bereitgestellt. Diese Vakzinen-Formulierung führt zu einer anfänglichen Exposition des Patienten gegenüber 300 bis 600 mg gp120 und 50 bis 100 mg QS21 zum Zeitpunkt der parenteralen Impfung, einer langsamen Freisetzung von unter 50 mg gp120 und unter 10 mg QS21 während etwa 120 bis 180 Tagen, einer Exposition ("Autoboost") gegenüber etwa 300 bis 600 mg gp120 und 50 bis 100 mg QS21 nach etvva 30 bis 60 Tagen, die aus dem zweiten Schub der Mikrokügelchen-Präparate 1 und 2 resultiert; und einem weiteren Autoboost mit etwa 300 bis 600 mg gp120 nach etwa 30 bis 60 Tagen, der aus dem zweiten Schub des Mikrokügelchen-Präparats 3 resultiert.
Weitere Einzelheiten der Erfindung finden sich in den folgenden Beispielen, die den Schutzumfang der Erfindung näher definieren. Alle hierin zitierten Literaturstellen sind hierin ausdrücklich zur Gänze durch Verweis aufgenommen.

BEISPIELE

1. Materialien und Verfahren

A. PLGA

Poly(D-L-Lactid-co-Glykolid) (PLGA) wurde von Boehringer Ingelheim (BI) und Medisorb Technologies International L. P. (MTl) bezogen. Verschiedene Molekulargewichte und Verhältnisse Lactid : Glykolid des PLGA wurden verwendet, um den Einfluss dieser Parameter auf die Eigenschaften der Mikrokügelchen zu ermitteln (Tabelle 1). PLGA mit 12 kDa und 100 kDa wurden von BI erhalten und PLGA mit 18 kDa und 100 kDa wurde von MTI erhalten. Die Polymerzusammensetzungen waren entweder 50 : 50 oder 75 : 25 Lactid : Glykolid. Die 10%ige Polyvinylalkohollösung (PVA Airvol 205, Air Products) wurde durch Auflösen von festem PVA in warmem Wasser (etwa 80ºC) hergestellt. Die endgültige PVA-Lösung wurde mit 0,22 um-Millipak-Filter von Millipore filtriert. Methylenchlorid (technische Qualität) wurde von Baxter S/P bezogen. Tabelle 1: Für Mikrokügelchen-Formulierungen verwendetes Poly(lactid-co-glykolid) (PLGA)
a Eigenviskosität der Polymere, gelöst in Chloroform. NA bedeutet "nicht verfügbar".
b Die Molekulargewichte wurden mittels Gelchromatographie mit Polystyrolstandards bestimmt, die Polymere gelöst und in Methylenchlorid bei Raumtemperatur analysiert. Das angegebene Molekulargewicht ist ein gewichtsgemittelter Wert. Die Werte für BI-Polymere sind Näherungen, da dem Produkt keine Spezifikationen beigelegt waren*.
c Lactid : Clykolid-Molverhältnis in PLGA liegt, wie durch den Lieferanten gemessen, für gewöhnlich innerhalb von 3% der Spezifikationen. Die Spezifikationen für diese Polymere waren entweder 50 : 50 oder 75 : 25 Lactid : Glykolid.
* Schätzungen, basierend auf den Spezifikationen für den Polymertyp. Tatsächliche Werte nicht verfügbar.

B. Herstellung von rgp120

MN rgpi 20 (Chargen-Nr. Y16531/G90577) wurde von Genentech Inc. als Bulkware mit 2,3 mg/ml Protein in 20 mM Tris, 0,120 M NaCl, pH 7,4 geliefert. Es wurde mit einem Amicon-Rührzellenkonzentrator unter Verwendung einer YM-Membran nmt einem MG- Cutoff von 30.000 bei 4ºC auf eine Endkonzentration von 154 mg/ml konzentriert und bei 2 bis 8ºC gelagert.

C. Herstellung von QS21

Lyophilisiertes Q21 (etwa zu 80% rein, Chargen-Nr. D1949) wurde von Cambridge Biotech (Cambridge, MA) geliefert. Q21 bei 200 mg/ml wurde durch Auflösen des lyophilisierten Pulvers in 50% Ethanol/Wasser hergestellt. Q21 wurde im Bestreben, die Einkapselungseffizienz und Freisetzungsrate zu steigern, auch in 50% Ethanol mit 20% Tween® 20 gelöst. Die QS21-Lösungen wurden am Tag der Einkapselung hergestellt und verwendet.

D. Mikroeinkapselung von gp120

Die Herstellung von rgp120-Mikrokügelchen wurde durch eine Doppelemulsion Wasser-in-Öl-in-Wasser (WOW) wie oben allgemein diskutiert durchgeführt. Im Speziellen waren die PLGA-Konzentrationen in Methylenchlorid 0,3 bis 0,6 g/ml und die erste Emulsion wurde bei 15.000 U/min und 0-1ºC im Wasserbad homogenisiert. Nach einer Minute Homogenisierung wurde die erste Emulsion (10 ml) zu 900 ml 1,5% Methylenchlorid enthaltender, 10%iger PVA-Lösung zugegeben und bei hoher Geschwindigkeit (800 bis 2.500 U/min) für 1 Minute im Reaktionskessel emulgiert (2 bis 8ºC). Um die Einkapselungseffizienz zu steigern, wurde die zweite Emulsion auch mit 10% PVA durchgeführt, das kein Methylenchlorid enthielt und die Temperatur der zweiten Emulsion wurde bei 0-3ºC gehalten. Um die herabgesetzte Temperatur zu erreichen, wurde das Ethylenglykol im Kühlmantel des Reaktionskessels bei -15ºC gehalten. Die zweite Emulsion wurde dann in das Härtungsbad transferiert, das 12 Liter vorfiltriertes Wasser (MilliQ-Wassersystem, Millipore Corp.) bei 2 bis 8ºC enthielt. Die Mikrokügelchen wurden für 1 Stunde härten gelassen. Die gehärteten Mikrokügelchen wurden auf etwa 1,5 l eingeengt und gegen 15 l vorfiltriertes Wasser, gefolgt von 15 l 0,1% Tween® 20 diafiltriert. Die Amicon-Rührzelle (2,5 I) wurde mit verschiedenen Filtersystemen in Abhängigkeit von der gewünschten Partikelgröße betrieben. Nach dem Waschen wurden die Mikrokügelchen bis zur Trockene eingeengt: Die konzentrierten Mikrokügelchen wurden mittels Zellschaber vom Filter entfernt und in vorfiltriertem Wasser mit etwa 0,3 g/ml resuspendiert.
Drei verschiedene Trocknungsverfahren wurden verwendet, um die Mikrokügelchen zu trocknen: Lyophilisierung, Vakuumtrocknung und Fließbetttrocknung unter Verwendung des in Fig. 4 gezeigten Systems oder einer 5 ml-Amicon-Rührzelle. Eine Suspension der endgültigen Mikrokügelchen wurde dem Airlift-Trockner (Fig. 4) oder einer Rührzelle zugegeben und die restliche Flüssigkeit durch Aufbringen eines leichten (etwa 2 psi) Stickstoff-Überdrucks auf die Säule (Stickstoffstrom nach unten) entfernt. Nachdem die Restflüssigkeit entfernt war, wurde der Stickstoffstrom nach oben durch den Airlift- Trockner oder die Amicon-Rührzelle gerichtet, um die Mikrokügelchen zu suspendieren. Die Stickstoffleitung wurde für die Rührzelle an ein Vorfilter (0,22 um) und für den Airlift-Trockner an eine Trockensäule mit Vorfiltern angeschlossen. Das Wasserbad war an den Mantel des Airlift-Trockners angeschlossen, im das System auf 5ºC zu halten.
Die Amicon-Rührzellen-Trocknung wurde in einem Kühlraum mit 2 bis 8ºC durchgeführt. Einige Ansätze wurden auch bei höheren Temperaturen (10ºC oder 15ºC) vakuumgetrocknet, um den Trocknungsprozess zu beschleunigen, ohne den ersten Schub zu erhöhen.

E. Einkapselung von QS21

QS21 wurde in 50% Ethanol mit oder ohne Tween® 20 wie oben beschrieben gelöst. Wie bei den rgp120-Lösungen wurde die QS21-Lösung in die Polymerphase injiziert. Für Mikrokügelchen-Präparate, die sowohl rgp120, als auch QS21 enthielten, wurde die rgp120-Lösung nach der Q521-Lösung in die Polymerphase injiziert, um die potentielle Wechselwirkung zwischen rgp120 und dem Ethanol in der QS21-Lösung zu vermindern. Die Mikroeinkapselung von QS21 wurde unter Bedingungen durchgeführt, die ähnlich jenen zuvor für rgp120 beschriebenen wären.

F. Mikrokügelchen-Größenanalyse

Die scheinbaren Durchmesser der Mikrokügelchen in Wasser wurden mit einem Brinkmann Teilchengrößen-Analysator Modell 2010 (Lens A, Messbereich 1 bis 150 um) gemessen.

G. Rasterelektronenmikroskopie von Mikrokügelchen

Größe und Aussehen der getrockneten Mikrokügelchen wurden mit einem Phillips- REM, Modell 525M analysiert. Die Mikrokügelchen wurden mit Gold-Palladium mittels HummerXP, Anatech, auf eine Dicke von 10 nm beschichtet.

H. Mikrokügelchen-Beladung und Freisetzungscharakteristik für MN rgp120

Der Proteingehalt der MN rgp120-PG LA-Mikrokügelchen wurde wie folgt bestimmt. Getrocknete Mikrokügelchen (10 bis 20 mg) wurden zu 1 ml 1 N NaOH zugesetzt und durch Schütteln bei Raumtemperatur über 2 bis 16 Stunden lösen gellassen. rpg120- Standards wurden durch Zusatz von 5 N NaOH zur MN rgp120-Stammlösung (1,5 mg/ml) hergestellt, um eine 1 N NaOH-Lösung zu ergeben. In 1 N NaOH wird Tyrosin deprotoniert, was eine signifikante Verschiebung des Absorptionsmaximums ergibt, wodurch in 1 N NaOH gelöstes Protein ein unterschiedliches Absorptionsspektrum als das native Protein in Puffer mit neutralem pH aufweist. Standardlösungen, die unterschiedliche Konzentrationen an MN rgp120 in 1 N NaOH enthielten, wurden verwendet, um die verschobenen Absorptionsmaxima des Proteins und den Extinktionskoeffizienten bei dieser Wellenlänge zu bestimmen. Der Extinktionskoeffizient für MN rgp120 in 1 N NaOH betrug 1,39 cm&supmin;¹(mg/ml)&supmin;¹ bei 284 nm.
Die aus den Mikrokügelchen freigesetzte Proteinmenge wurde durch den BCA-Proteintest von Pierce Chemical Co. bestimmt. Getrocknete sowie "nasse" Mikrokügelchen wurden analysiert. "Nasse" Mikrokügelchen wurden als Mikrokügelchen definiert, die aus der Diafiltrationszelle entfernt und in Freisetzungsmedium ohne weitere Verarbeitung suspendiert waren. Die freigesetzte Proteinmenge wurde dann verwendet, um den aus den Mikrokügelchen freigesetzten Prozentsatz MN rgp120 (Prozent des insgesamt eingesetzten) zu berechnen, und zwar auf Basis der Mikrokügelchenmasse im Freisetzungsgerät, der Proteinbeladung der Mikrokügelchen und dem Volumen des Freisetzungsmediums (20 mg Mikrokügelchen in 300 ul 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 0,02 Gew.-% Tween® 20, 0,02% NaN&sub3;, pH 7,4).

I. Charakterisierung der rgp120-Freisetzung aus Mikrokügelchen

Das aus den Mikrokügelchen nach 1 Stunde Inkubation im Freisetzungsmedium freigesetzte MN rgp120 wurde mittels Zirkulardichrismus, analytischen HPLC-Tests, wie z. B. Umkehrphasen, Größenausschluss, CD4-Bindung und Clipping, sowie ELISAs auf Epitope für das Gesamtprotein (Gesamt-MN) und die V3-Schleife analysiert. Die Aggregation von rgp120 wurde mittels einer SEC HPLC quantifiziert. Eine TSK G3000 SW XL-Säule (0,78 · 30 cm), äquilibriert in 0,4 M KPO&sub4;, pH 7,0, wurde mit einer Durchflussrate von 0,5 ml/min verwendet. Kompetitive Bindungstests (natives, markiertes gp120 gegenüber der Probe) wurden durchgeführt, um die Bindung von CD4-IgG an aus den Mikrokügelchen freigesetztes gp120 bestimmen. Für die Mikrokügelchen-Präparate, die an Meerschweinchen verabreicht wurden, wurden auch Endotoxin-Tests durchgeführt.

J. Bestimmung der QS21-Mikrokügelchen-Beladung

Die in die PLGA-Mikrokügelchen eingekapselte QS21-Menge wurde durch Auflösen der Mikrokügelchen in 1 N NaOH bei Raumtemperatur über Nacht bestimmt. Die vollständig gelösten Lösungen wurden mit 6 N HCl neutralisiert. Die Proben wurden dann auf eine SEC-Säule, TSK G3000SW XL (0,78 · 30 cm), äquilibriert in 0,4 M KPO&sub4;, pH 7,0 injiziert. Die Laufbedingungen für die Säule waren dieselben wie jene, die für die SEC- Analyse von rpg120 verwendet wurden. Da QS21 sich in 1 N NaOH zersetzt, enthielten die Chromatogramme der SEC-Analyse mehrere Peaks. Um die QS21-Gesamtmenge zu quantifizieren, wurden die QS21 und dessen Abbauprodukten entsprechenden Peakflächen zur Bestimmung der Kernbeladung verwendet. Als Standards wurden bekannte QS21-Mengen Plazebo-Mikrokügelchen zugesetzt und dann mit 1 N NaOH behandelt. SEC-Analyse wurde an den Standards durchgeführt und die Peakflächen aus den Standards wurden verwendet, um die Menge von QS21 in jeder Probe zu berechnen.

K. Bestimmung der QS21-Freisetzung aus Mikrokügelchen

Aus Mikrokügelchen freigesetztes QS21 wurde durch RP-HPLC an einer 5 um YMC C4 (0,46 · 25 cm) mit einer Durchflussrate von 1 ml/Minute und Detektion bei 214 nm quantifiziert. Es wurde ein linearer Gradient in 15 Minuten von 25 bis 75% Lösung B gefahren (Lösung A: 0,1% TFA in Wasser; Lösung B: 0,1% TFA in 90% Acetonitril). QS21-Kontrollen wurden ebenfalls gefahren. In der RP-HPLC-Analyse eluiert der rgp 120-Peak vor dem QS21-Peak und daher liefert dieses Verfahren die gleichzeitige Detektion von aus Mikrokügeichen freigesetztem QS21 und rgp120.

L. Meerschweinchen-Studien

Meerschweinchen (Hartley-Stamm) wurden von Charles River Laboratories geliefert. Die Tiere wurden durch subkutane Verabreichung (200 ul) der Formulierungen immunisiert. Nach Immunisierung wurden den Tieren durch Herzpunktur in den Woclhen 4, 6, 8, 14 und 20 Blut abgenommen. Die Tierseren jeder Gruppe (fünf Tiere pro Gruppe in jedem Experiment) zu einem gegebenen Zeitpunkt wurden gepoolt und auf Antikörper gegen MN rgp120 oder die V3-Schleife von MN rgp120 oder das lineare Peptid der V3-Schleife von MN rgp120 als Beschichtungsprotein an den Mikrotiterplatten analysiert. Die Antikörpertiter wurden durch Reihenverdünnung der Proben bestimmt. Der Endpunkttiterwert wurde als derjenige Verdünnungsfaktor definiert, der einen um das Zweifache über dem Hintergrund liegenden Wert ergab und wurde durch Interpolation der Reihenverdünnungswerte bestimmt.
In gesonderten Studien wurden die Meerschweinchen nach 0, 1 und 2 Monaten mit verschiedenen Formulierungen subkutan (200 ul) immunisiert. Nach 70 Tagen wurde den Tieren durch Herzpunktur Blut abgenommen. Die Sera jeder Gruppe wurden gepoolt und auf die Fähigkeit hin analysiert, sowohl MN-, als auch ALA-1-Stämme von HIV-1 zu neutralisieren. Die Virusstämme wurden aus infizierten H9-Zellen hergestellt. Ein Virus- Beimpfungstiter, der zur vollständigen Abtötung von Zellen in 7 Tagen ausreichte, wurde mit Reihenverdünnungen (3fach) der Testsera inkubiert und dann MT4 T-Lymphzellen in 100/0 FCS/RPMI-1640-Zellkulturmedien zugesetzt. Die Kulturen wurden bei 37ºC für 7 Tage inkubiert und die Zelllebensfähigkeit dann durch den MTT-Färbetest über Messungen der optischen Dichte bei 570-650 nm quantifiziert (Mosmann, J. Immunol. Methods 65, 55-63 (1983)). Die Endpunkt-Titerwerte für die Virusneutralisation wurde als derjenige Verdünnungsfaktor definiert, der einen Messwert der optischen Dichte um das Zweifache über dem Hintergrund ungeschützter (abgetöteter) Zellen lieferte. Diese Titer betrugen typischerweise das Doppelte der bei 50% Schutz berechneten.

M. Clipping-Tests

Um zu bestimmen, ob Proteolyse der V3-Schleife von MN rgp120 erfolgte, wurde das Protein in 0,1% Dodecylsulfat/20 mM Dithiothreitol denaturiert und mittels Größenausschluss-Chromatographie analysiert. Geclipptes MN rgp120 eluiert in Form von zwei Spezies. Der Anteil an geclipptem Protein wird aus der Peakfläche für das intakte Protein berechnet.

II. Ergebnisse

A. Verfahrensmodifizierungen für verbesserte Beladungseffizienz, erster Schub

Diese und andere Einkapselungsstudien zeigten eine empirische Korrelation zwischen Einkapselungseffizienz (E), welche das Verhältnis von experimenteller zu theoretischer Proteinbeladung ist, und der Zusammensetzung der ersten Phase:
worin up die Viskosität der Polymerphase, Va/Vo das Volumsverhältnis von wässriger zu organischer Lösung der ersten Emulsion, VMeCl&sub2; das Volumen von Methylenchlorid in der zweiten Emulsion vor Polymerzusatz und T die Temperatur der ersten und zweiten Emulsion ist. Wie frühere Studien anzeigten, lieferte die Erhöhung der Polymerkonzentration in der ersten Phase von 0,1 auf 0,3 g PLGA/ml Methylenchlorid zu einem zweifachen Anstieg der Einkapselungseffizienz (auf etwa 40%).
Um die Einkapselungs- und Beladungseffizienz weiter zu steigern, wurde die Wirkung der Temperatur auf die gp120-Einkapselung untersucht. Diese Untersuchungen wurden mit einem 50 : 50-Massenverhältnis von 12 kDa- und 100 kDa-PLGA (75 : 25 Lactid : Glykolid, Boehringer Ingelheim) bei einer Polymerkonzentration von 0,3 g/ml und einem Volumsverhältnis von 0,1 ml/ml wässriger zu organischer Phase durchgeführt. Unter diesen Bedingungen war die Einkapselungseffizienz 22% für Raumtemperatur-Betrieb und 55% für Niedertemperatur-Betrieb (0ºC, Tabelle 2). Diese Ergebnisse wiesen darauf hin, dass eine Herabsetzung der Betriebstemperatur die Prozesseffizienz drastisch erhöhte. Die Proteinbeladung wurde ebenfalls durch Betrieb bei niedrigerer Temperatur von 1,2 auf 2,8 Vol.-% erhöht. Die herabgesetzte Temperatur der ersten Emulsion erhöht die Viskosität der Polymerlösung und setzt die Verschmelzungsneigung der wässrigen Tröpfchen herab. Die zweite Emulsion kann ebenfalls durch herabgesetzte Temperatur stabilisiert werden, da die noch unentwickelten Mikrokügelchen weniger gegenüber Scherkräften empfindlich sind. In beiden Fällen sollte die niedrigere Temperatur die Proteinlösung durch deren Erstarrung in kleine Tröpfchen, die sich während der Homogenisierung bilden, weiter stabilisieren. Tabelle 2: Einfluss von Temperatur und überschüssigem Methylenchlorid auf Einkapselungseffizienz, Beladung und ersten Schuba
a Mikrokügelchen wurden wie im Text beschrieben hergestellt.
b Die Mikrokügelchen wurden auf Freisetzung von gp120 entweder noch feucht nach der Herstellung oder nach der Trocknung durch Lyophilisierung ("lyo.") oder im Vakuum ("vak.", 5ºC für 1 Woche) analysiert.
C Ein 50 : 50-Massenverhältnis von nieder- und hochmolekularem PLGA wurde zur Herstellung dieser Mikrokügelchen verwendet.
d Die zweite Emulsion (Reaktionskessel mit 10% PVA) war entweder mit 1,5% Methylenchlorid gesättigt oder enthielt kein Methylenchlorid vor dem Zusatz der ersten Emulsion.
e RT bedeutet Raumtemperatur (etwa 25ºC). Diese Temperatur entspricht der Betriebstemperatur sowohl der ersten, als auch der zweiten Emulsion.
f NB bedeutet "nicht bestimmt".
Der Einfluss der Methylenchloridsättigung in der ersten Emulsion wurde ebenfalls untersucht. Wenn die Menge des Methylenchlorids in der zweiten Emulsion vor Polymerzusatz herabgesetzt wird, sollte die Einkapselungseffizienz ansteigen (Gleichung 1). Es wurden auf diese Analyse dieselben Bedingungen wie in der Temperaturstudie angewendet. Die Einkapselung wurde bei 0ºC durchgeführt, wobei die zweite Emulsion entweder mit Methylenchlorid (1,5%) gesättigt war oder kein Methylenchlorid enthielt. Entfernung von überschüssigem Methylenchlorid aus der zweiten Emulsion erhöhte die Einkapselungseffizienz von 55% auf 96% (Proteinbeladung: 2,8 bis 4,9 Gew.-%, siehe Tabelle 2). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die zweite Emulsion kein Methylenchlorid vor Polymerzusatz erfordert. Die Entfernung von überschüssigem Methylenchlorid aus der zweiten Emulsion verursacht eine schnellere Extraktion des Lösungsmittels aus den Mikrokügelchen und erlaubt dadurch eine schnellere Härtung der Mikrokügelchen, wodurch eine höhere Menge Protein eingeschlossen wird.
Um diese Beobachtungen weiter zu bestätigen, wurde ein anderes Polymersystem unter denselben Bedingungen verwendet. Diese Polymermischung, 50 : 50-Massenverhältnis von 18 kDa-PLGA (75 : 25 Lactid : Glykolid, MTI), war in Methylenchlorid bei derselben Konzentration von 0,3 g/ml weniger viskos als die vorhergehende Mischung. Daher betrug die Einkapselungseffizienz bei Raumtemperatur mit Methylenchlorid in der zweiten Emulsion nur 11%. Durch Herabsetzung der Betriebstemperatur auf 0ºC und Entfernung des Methylenchlorids aus der zweiten Emulsion wurde die Einkapselungseffizienz auf 86% gesteigert. Diese Änderungen erhöhten auch die Proteinbeladung von 0,6 auf 4, 4 Gew.-% (Tabelle 2). Zusätzlich wurde der erste Schub aus den feuchten (unmittelbar nach der Herstellung analysiert), lyophilisierten und vakuumgetrockneten Mikrokügelchen durch Verminderung der Betriebstemperatur und Entfernen des überschüssigen Methylenchlorids aus der zweiten Emulsion signifikant herabgesetzt (Tabelle 2). Der erste Schub bei niedriger Proteinbeladung (weniger als 10 Gew.-%) kann empirisch mit dem Kehrwert der Einkapselungseffizienz, wie in Gleichung 1 definiert, korreliert werden. Durch Herabsetzung der Betriebstemperatur und Entfernung des überschüssigen Lösungsmittels wurden Prozesseffizienz, Proteinbeladung und erster Schub verbessert.
Gleichung 1 gibt zu erkennen, dass die Einkapselungseffizienz durch Erhöhung der Viskosität der Polymerphase und Herabsetzung des Verhältnisses zwischen wässrigem und organischem Volumen in der ersten Phase ansteigt. Die Viskosität der ersten Phase steigt mit Erhöhung von Polymerkonzentration (g PLGA/ml Methylenchlorid) und Molekulargewicht an. Um die Beziehung zwischen Polymer-Molekulargewicht und Einkapselungseffizienz zu untersuchen, wurden Mikrokügelchen durch Verwendung mehrerer Polymere unter denselben Prozessbedingungen (Va/Vo = 0,1, 0,3 g/ml PILGA, herabgesetzte Temperatur, kein überschüssiges Methylenchlorid) hergestellt. Die anfänglichen Studien wurden durchgeführt, um Unterschiede in der Viskosität der Polymere von zwei gesonderten Lieferanten zu beurteilen. Eine Mischung eines gleichen Massenverhältnisses von hoch- und niedermolekularen Polymeren von jedem Lieferanten, MTI und BI, wurde für die Mikroeinkapselung verwendet. Die aus 12 kDa- und 100 kDa- (75 : 25 Lactid : Glykolid) PLGA von BI hergestellten Mikrokügelchen lieferten eine Proteinbeladung von 5 Gew.-% und eine Einkapselungseffizienz von 98%. Die mit 18 kDa- und 100 kDa- (50 : 50 Lactid : Glykolid) PLGA von MTI hergestellten Mikrokügelchen lieferten eine etwas niedrigere Proteinbeladung (4,4 Gew.-%) und eine herabgesetzte Einkapselungseffizienz (86%, Tabelle 3). Der erste Schub aus beiden Präparaten nach Lyophilisierung war gleichwertig (32 bis 37%). Diese Ergebnisse wiesen darauf hin, dass unter diesen Bedingungen keine signifikanten Unterschiede zwischen den Polymeren von verschiedenen Herstellern vorlagen. Tabelle 3. Korrelation zwischen Polymereigenschaften und Einkapselungseffizienz, Beladung und erstem Schuba
a Die Mikrokügelchen wurden wie im Text beschrieben hergestellt.
b Die Mikrokügelchen wurden auf Freisetzung von gp120 entweder noch feucht nach der Herstellung oder nach der Trocknung durch Lyophilisierung ("lyo.") oder Vakuum ("vak.", 5ºC für 1 Woche) analysiert.
c Ein 50 : 50-Massenverhältnis von nieder- und hochmolekularem PLGA wurde zur Herstellung dieser Mikrokügelchen verwendet.
d NB bedeutet "nicht bestimmt".
Zusätzlich wurden das Molekulargewicht und die Zusammensetzung des PLGA auf ihren Einfluss auf die Einkapselungseffizienz hin untersucht. Niedermolekulare Polymere beider Lieferanten wurden analysiert. Aus 12 kDa- (75 : 25 Lactid : Glykolid) oder 12 kDa- (50 : 50 Lactid : Glykolid) PLGA von BI hergestellte Mikrokügelchen waren in ihren endgültigen Eigenschaften nur geringfügig unterschiedlich. Beide Präparate von Mikrokügelchen wurden unter denselben Bedingungen hergestellt (Va/Vo = 0,1, 0,3 mg/ml PLGA, herabgesetzte Temperatur, kein überschüssiges Methylenchlorid). Unter Verwendung des 12 kDa- (75 : 25 Lactid : Glykolid) PLGA wurde eine Einkapselungseffizienz von 47% erzielt, und die Mikrokügelchen hatten eine Proteinbeladung von 2,4 Gew.-%. Diese Mikrokügelchen wiesen ferner einen mäßigen ersten Schub für dasjenige Material auf, das nicht getrocknet worden ist (36% für feuchte Mikrokügelchen, Tabelle 3). Unter Verwendung des 12 kDa- (50 : 50 Lactid : Glykolid) PLGA wurde eine Einkapselungseffizienz von 58% erzielt, und die Proteinbeladung war 3,0 Gew.-%. Obgleich das 12 kDa- (50 : 50 Lactid : Glykolid) PLGA eine geringfügig bessere Proteinbeladung aufwies, war der erste Schub stärker (43%), und daher war die Beladung der Mikrokilgelchen nach dem ersten Schub nahezu gleich (1,5 Gew.-% für 75 : 25 Lactid : Glykolid und 1,7 Gew.-% für 50 : 50 Lactid : Glykolid). In beiden Fällen war die Einkapselungseffizienz niedriger als die Mischung mit gleichem Massenverhältnis von nieder- und hochmolekularem PLGA (Tabelle 3).
Um die Einkapselungseffizienz zu steigern, wurde die Viskosität der niedermolekularen Polymerlösungen durch Erhöhen der Polymerkonzentration auf 0,6 g/ml erhöht. Eine Erhöhung der Polymerkonzentration ohne Erhöhung der zur ersten Phase zugesetzten gp120-Menge lieferte eine Herabsetzung der theoretischen Proteinbeladung. Diese Beziehung wird durch eine einfache Massenbilanz der Komponenten im System beschrieben:
wobei L die theoretische Beladung (gp120-Massenbruch der Gesamtmenge), [PLGA] die PLGA-Konzentration (g PLGA/ml Methylenchlorid) in der ersten Phase und [gp120] die gp120-Konzentration (g/ml) der in die erste Phase injizierten, wässrigen Lösung ist. Daher verminderte unter diesen Bedingungen die Erhöhung der PLGA-Konzentration von 0,3 auf 0,6 g/ml die theoretische Beladung um etwa die Hälfte auf 2,6%. Diese Experimente wurden mit den von MTI erhaltenen, niedermolekularen Polymeren (18 kDa) durchgeführt. Sowohl für 50 : 50-, als auch 75 : 25-Lactid : Glykolid-PLGA war die Einkapselungseffizienz drastisch verbessert (92 bis 96%), und die Proteinbeladung war 2,4 bis 2,5 Gew.-% (Tabelle 3). Zusätzlich waren die ersten Schübe beider Präparate nahezu gleich, und das lyophilisierte Material zeigte einen mäßigen ersten Schub (Tabelle 3). Daher wurde eine hohe Einkapselungseffizienz (über 90%) mit dem niedermolekularen PLGA erzielt, wenn die PLGA-Konzentration in der ersten Phase auf 0,6 g/ml erhöht wurde. Diese Ergebnisse sind eine weitere Bestätigung für Gleichung 1, da die erhöhte Viskosität der ersten Phase durch Erhöhung der PLGA-Konzentration erzielt wurde.
Im Gegensatz zum niedermolekularen PLGA war das hochmolekulare PLGA in Methylenchlorid bei 0,3 g/ml sehr viskos. Mikroeinkapselung von gp120 in 100 kDa- (75 : 25 Lactid : Glykolid) PLGA von MTI bei 0,3 g/ml (VJVC, = 0,1, herabgesetzte Temperatur, kein überschüssiges Methylenchlorid) ergab eine 100%ige Einkapselung des Proteins und eine Proteinbeladung von 5,1 Gew.-%. Diese Mikrokügelchen wiesen ferner selbst nach der Trocknung einen sehr schwachen ersten Schub auf (Tabelle 3). Da das hochmolekulare PLGA viel viskoser als das niedermolekulare PLGA ist, sollte eine Mischung beider Polymere eine ausreichende Viskosität liefern, um Einkapselung bei 0,3 g PLGA/ml Methylenchlorid zu erlauben und den bei Verwendung des niedermolekularen PLGA erhaltenen, starken ersten Schub zu vermindern. Um diese Hypothese zu testen, wurden gleiche Massenverhältnisse von nieder- und hochmolekularem PLGA von beiden Lieferanten verwendet, um gp120 wie oben beschrieben einzukapseln. Diese Präparate wurden mit hoher Einkapselungseffizienz (über 85%) durchgeführt, und beide lyophilisierten Präparate wiesen schwächere erste Schübe auf, als die ausschließlich mit niedermolekularem PLGA hergestellten Mikrokügelchen.
Erhöhung der Viskosität der ersten Emulsion durch Änderungen im Polymer (Konzentration oder Molekulargewicht) oder Herabsetzungen der Temperatur liefert einen Anstieg der Größe der endgültigen Mikrokügelchen. Im Allgemeinen wird die Korrelation zwischen Mikrokügelchen-Durchmesser D und Prozessparametern empirisch beschrieben durch:
wobei wr die Rührgeschwindigkeit in der zweiten Emulsion darstellt (U/min).
Wenn die Temperatur auf 0ºC herabgesetzt und überschüssiges Methylenchlorid der zweiten Emulsion zugesetzt: wurde, änderte sich der Mikrokügelchen-Durchmesser für diejenigen Präparate nicht, die mit einer Mischung der hoch- und niedermolekularen Polymere hergestellt waren (Tabelle 4). Wenn jedoch die Temperatur der Emulsionen herabgesetzt und überschüssiges Methylenchlorid entfernt wurde, war der Durchmesser der unter denselben Bedingungen hergestellten Mikrokügelchen um den Faktor zwei erhöht. Die Erhöhung der PLGA-Konzentration von 0,3 auf 0,6 g/ml ergab ebenfalls eine Verdoppelung des Mikrokügelchen-Durchmessers unter der Annahme, dass das niedermolekulare PLGA von BI oder MTI unter denselben Prozessbedingungen etwa denselben Durchmesser liefert (Tabelle 4). Das hochmolekulare PLGA (100 kDa, MTI) war in der Methylenchloridphase viskoser, und der Durchmesser der mit diesem Polymer hergestellten Mikrokügelchen war dreimal größer als beim niedermolekularen PLGA, obwohl die Rührwerkgeschwindigkeit in der zweiten Emulsion leicht erhöht war. Verminderung der Rührwerkgeschvvindigkeit um 1000 U/min lieferte Mikrokügelchen, die für das niedermolekulare PLGA (18 kDa, MTI) um 50% größer waren. Die Mischungen gleicher Massenverhältnisse von nieder- und hochmolekularem PLGA lieferten Mikrokügelchen, die in ihrem Durchmesser etwa doppelt so groß waren wie jene, die unter denselben Prozessbedingungen aus niedermolekularem PLGA hergestellt wurden. Da Erhöhungen der Viskosität der ersten Phase, Herabsetzungen der Temperatur und Entfernung des überschüssigen Methylenchlorids notwendig sind, um die Einkapselungseffizienz zu verbessern, liegt die Rührwerksgeschwindigkeit in der zweiten Emulsion vorzugsweise beim Maximalwert (2.500 U/min), um kleine Mikrokügelchen (kleiner als 20 pm) zu erzeugen. Tabelle 4: Einfluss der Viskosität der ersten Phase auf die Mikrokügelchengrößea
a Die Mikrokügelchen wurden wie im Text beschrieben hergestellt.
b Konzentration des in Methylenchlorid in der ersten Phase gelösten PLGA.
c Temperatur beider Emulsionen während der Herstellung (RT bedeutet Raumtemperatur, etwa 25ºC).
d Volumen des Methylenchlorids in der zweiten Phase vor Zusatz der ersten Emulsion. 13,5 ml Methylenchlorid in 900 ml 10% PVA ergibt Sättigung.
e Rührwerksgeschwindigkeit
f Mittlerer Durchmesser (auf Volumenbasis), gemessen durch nach einem Photounterbrechungsverfahren (Materialien und Verfahren).
g Ein 50 : 50-Massenverhältnis von hoch- und niedermolekularem PLCA wurde zur Herstellung dieser Mikrokügelchen verwendet.

B. Einfluss der Trocknung auf den ersten Schub und die Qualität der Mikrokügelchen

Um Korrelationen zwischen erstem Schub, Polymer und Trocknungsverfahren zu untersuchen, wurden Trocknungsexperimente an mehreren Mikrokügelchen-Präparaten durchgeführt. Die in diesen Studien verwendeten Trocknungsverfahren waren Lyophilisierung, Vakuumtrocknung und Stickstofftrocknung. Die anfänglich aus mit jedem dieser Verfahren getrockneten Mikrokügelchen freigesetzte Proteinmenge (Inkubation für 1 Stunde) wurde mit dem ersten Schub aus unmittelbar nach der Herstellung (feucht) analysierten Mikrokügelchen verglichen. Die ohne Trocknung analysierten Mikrokügelchen wiesen einen ersten Schub auf, der immer schwächer war als derjenige von nach beliebigen Trocknungsverfahren getrockneten Mikrokügelchen. Wenn sie hydratisiert sind, hydrolysieren die Mikrokügelchen und setzen das eingekapselte Protein frei und folglich wird überschüssige Feuchte vorzugsweise am Ende des Mikrokügelchen-Prozesses entfernt. Vor der vollständigen Trocknung sind die Mikrokügelchen voll hydratisiert, was in der Hydrolyse des PLGA mit anschließender Proteinfreisetzung an oder nahe der Oberfläche resultiert. Die Bildung von Mikrokügelchen in der zweiten Emulsion beeinflusst die Proteinmenge an oder nahe der Oberfläche. In der zweiten Phase produzierte größere Mikrokügelchen sollten einen schwächeren ersten Schub aufweisen, da das Oberflächen-Volumen-Verhältnis vermindert ist. Das erste Verfahren, das verwendet wurde, um diese möglichen Effekte zu beurteilen, war die Vakuumtrocknung. Leider kann das Protein während des Trocknungsprozesses freigesetzt werden, wenn vakuumgetrocknete Mikrokügelchen für mehrere Tage voll hydratisiert bleiben (getrocknet bei 5ºC für 7 Tage). Daher wird die Trocknungszeit vorzugsweise minimiert, um den ersten Schub abzuschwächen.
Eines der Verfahren zur Herabsetzung der Mikrokügelchen-Trocknungszeit war die Lyophilisierung, die für gewöhnlich nur ein bis zwei Tage erfordert. Lyophilisierung oder Vakuumtrocknung von niedermolekularen PLGA-Formulierungen lieferten einen 1,5- bis Bfachen Anstieg des ersten Schubs (Tabelle 2 und 3). Wässrige, an oder nahe der Oberfläche der Mikrokügelchen eingekapselte Proteintropfen verursachen den ersten Schub aus diesen Mikrokügelchen. Wenn die Viskosität der ersten Emulsion erhöht wird, ist es weniger wahrscheinlich, dass die während der Homogenisierung gebildeten wässrigen Tropfen zusammenlaufen. Folglich werden kleine Tropfen an oder nahe der Oberfläche bei Mikrokügelchen, die dasselbe wässrige Volumen enthalten, weniger Gesamtprotein freisetzen. Um die Viskosität der ersten Emulsion zu erhöhen, kann die PLGA-Konzentration im Methylenchlorid erhöht werden. Durch Erhöhung der PLGA- (12 kDa) Konzentration von 0,3 auf 0,6 g/ml wurde der erste Schub aus lyophilisierten oder vakuumgetrockneten Mikrokügelchen von über 50% auf 30 bis 50% herabgesetzt. Anfangs mit 0,3 g/ml 12 kDa- (50 : 50 Lactid : Glykolid) PLGA in der ersten Emulsion hergestellte Mikrokügelchen waren nach Lyophilisierung auch geborsten oder zerbrochen (Fig. 5). Während der Lyophilisierung werden die Mikrokügelchen gefroren und überschüssiges Wasser durch Sublimation entfernt. Die Bildung von Eiskristallen innerhalb der Mikrokügelchen kann zum Bersten oder vollständigen Zerbrechen der Mikrokügelchen beitragen. Die Stabilität der wässrigen Tropfen kann durch Erhöhen der Viskosität der ersten Emulsion durch Herabsetzungen der Temperatur und durch Entfernen von überschüssigem Methylenchlorid aus der zweiten Emulsion, was eine schnellere Bildung von Mikrokügelchen verursacht, erhöht werden. Wenn die Prozessbedingungen modifiziert wurden und beide dieser Veränderungen umfassten, waren die Mikrokügelchen nach Lyophilisierung oder Vakuumtrocknung nicht zerbrochen oder geborsten (Fig. 6). Jedoch wiesen sowohl die vakuumgetrockneten, als auch die lyophilisierten, in Fig. 6 gezeigten Mikrokügelchen einen starken ersten Schub auf (über 65%). Der starke erste Schub ist wahrscheinlich das Ergebnis der Instabilität der in den Mikrokügelchen eingeschlossenen ersten Emulsion. Mehr wässrige Tropfen können an der Oberfläche akkumulieren, wenn das Polymer über 2 bis 8ºC hinaus erwärmt wird und ergeben folglich den starken ersten Schub, der bei intakten Mikrokügelchen beobachtet wurde.
Im Gegensatz dazu verursachte Lyophilisierung kein Bersten oder Brechen von Mikrokügelchen, die entweder mit Mischung von hoch- oder niedermolekularem PLGA (Fig. 7) im gleichen Massenverhältnis oder mit hochmolekularem PLGA alleine hergestellt waren, wenn sie bei niedriger Temperatur ohne überschüssiges Methylenchlorid in der zweiten Emulsion hergestellt wurden. Diese Mikrokügelchen-Präparate wiesen auch keinen starken ersten Schub auf (weniger als 30%, Tabelle 5). Zusätzlich besaßen die mit hochmolekularem PLGA hergestellten Mikrokügelchen einen viel schwächeren ersten Schub nach Lyophilisierung oder Vakuumtrocknung (Tabelle 3 und 5). Die Mischung aus hochmolekularem Polymer und niedermolekularem Polymer im gleichen Massenverhältnis sowie die hochmolekularen Polymerpräparate zeigten keine Korrelation zwischen Proteinbeladung und ersten Schub für Beladungen im Bereich von 1,8 bis 3,9 Gew.-%. jedoch wiesen bei sehr niedriger Proteinbeladung (0,5 Gew.-%) unter denselben Bedingungen hergestellte Mikrokügelchen einen stark erhöhten ersten Schub auf. Da der erste Schub von der Proteindiffusion aus den Mikrokügelchen hinaus kontrolliert wird, hängt die Freisetzungsgeschwindigkeit (erster Schub) von der Konzentrationsdifferenz zwischen der äußeren Lösung und dem hydratisierten, zugänglichem Protein (Oberflächenprotein) ab. Die Proteinmenge an der Oberfläche wird auch verringert sein, da die Proteinkonzentration in den wässrigen Tropfen herabgesetzt ist. Im Allgemeinen hängt die anfängliche Freisetzung von gp120 aus den Mikrokügelchen vom Molekulargewicht des Polymers, den Prozessbedingungen und dem Trocknungsverfahren ab. Um den ersten Schub und physikalischen Abbau (z. B. Bersten) abzuschwächen, werden gp120-Mikrokügelchen vorzugsweise entweder mit einer Mischung von hoch- und niedermolekularem PLGA, oder mit hochmolekularem PLGA bei niedriger Temperatur ohne überschüssiges Methylenchlorid in der zweiten Emulsion hergestellt. Diese Mikrokügelchen können dann lyophilisiert oder stickstoffgetrocknet werden, um ein frei fließendes Pulver herzustellen. Tabelle 5: Einfluss des Trocknungsverfahrens auf den ersten Schuba
a Mikrokügelchen wurden wie unter Materialien und Verfahren beschrieben hergestellt (0,3 g PLGA/ml Methylenchlorid, 0,1 ml Proteinlösung/ml Methylenchlorid, herabgesetzte Temperatur, kein überschüssiges Metlhylenchlorid in der zweiten Emulsion).
b Alle Präparate wiesen mehr als 95%ige Einkapselungseffizienz auf.
c Die Mikrokügelchen wurden auf Freisetzung von gp120 entweder noch feucht nach Herstellung; oder nach Trocknung durch Lyophilisierung oder Stickstofftrocknung, wie unter Materialien und Verfahren beschrieben analysiert.
d Ein 50 : 50-Massenverhältnis von nieder- und hochmolekularem PLGA wurde zur Herstellung dieser Mikrokügelchen verwendet.

C. Korrelation zwischen zweitem Schub und Polymereigenschaften

Mikrokügelchen wurden durch Verwendung von PLGA variierender Zusammensetzung (Lactid : Glykolid) und Molekulargewicht hergestellt, um die Unterschiede im Zeitpunkt des zweiten Schubs zu ermitteln. Um einen In-vivo-Autoboost von gp120 zur geeigneten Zeit (z. B. nach 1, 2, 3 oder 4 Monaten) zu erzielen, werden die Mikrokügelchen vorzugsweise so konstruiert, dass sie in vitro einen zweiten Schub zur selben Zeit hervorrufen (37ºC, physiologischer Puffer). Die Freisetzungseigenschaften jedes Präparats in vivo wurde untersucht, bis 80 bis 100% des Gesamtproteins aus den Mikrokügelchen freigesetzt waren. Alle Präparate zeigten ein charakteristisches Freisetzungsprofil: ersten Schub, minimale Freisetzung (weniger als 10%), und zweiten Schub. Ein typisches Freisetzungsprofil für MN rgp120-PLGA-Mikrokügelchen ist in Fig. 8 gezeigt. Das Freisetzungsprofil wurde mit Ausnahme des ersten Schubs durch die Prozessbedingungen oder die Trocknung nicht beeinflusst, jedoch hatten PLGA-Zusammensetzung und Molekulargewicht sehr wohl eine Wirkung. Bulkerosion der Mikrokügelchen hängt von der Polymerzusammensetzung (Lactid : Glykolid) und vom Molekulargewicht ab, und daher wird der aus der Bulkerosion resultierende Zeitpunkt des zweiten Schubs durch Auswählen der PLGA-Eigenschaften kontrolliert.
Die In-vitro-Freisetzung von MN rgp120 aus PLGA-Mikrokügelchen korreliert mit den Polymereigenschaften wie in Tabelle 6 angegeben. Die aus niedermolekularem (12 oder 18 kDa) PLGA mit einem 50 : 50-Verhältnis Lactid : Glykolid hergestellten Mikrokügelchen wiesen einen zweiten Schub nach 30 bis 40 Tagen auf, während Mikrokügelchen, die mit demselben Molekulargewicht mit einem 75 : 25-Verhältnis Lactid : Glykolid hergestellt wurden, keiner Bulkerosion unterlagen und Protein bis zu 60 bis 75 Tage freisetzten. Eine ähnliche Abhängigkeit zwischen Lactid-Gehalt und Zeitpunkt des zweiten Schubs wurde auch für Mikrokügelchen erhalten, die aus hochmolekularem (100 kDa) PLGA hergestellt waren. Die aus 100 kDa-PLGA hergestellten Mikrokügelchen wiesen einen zweiten Schub nach 60 bis 70 und 90 bis 100 Tagen für die 50 : 50- bzw. 75 : 25- Verhältnisse von Lactid : Glykolid auf. Die Mischungen gleicher Massenverhältnisse von hoch- und niedermolekularem PLGA erfuhren Bulkerosion und nachfolgende Proteinfreisetzung zur selben Zeit wie das entsprechende niedermolekulare Polymer alleine (Tabelle 6). Daher beeinflusst die Zugabe von hochmolekularem PLGA zum niedermolekularen PLGA bei gleichem Massenverhältnis nicht den Zeitpunkt des zweiten Schubs, jedoch verbessert sie sehr wohl die Einkapselungseffizienz und schwächt den ersten Schub wie oben gezeigt ab. Mit einem gleichen Massenverhältnis von hoch- und niedermolekularem PLGA hergestellte Mikrokügelchen sollten dann verwendet werden, wenn ein Ein- (50% Lactid) oder Zwei- (75% Lactid) Monate-Autoboost erforderlich ist. Alternativ dazu kann ein Zweimonate-Autoboost aus Mikrokügelchen erzielt werden, die mit hochmolekularem (100 kDa) PLGA mit einem 50 : 50-Massenverhältnis Lactid: Glykolid hergestellt sind. Wenn jedoch ein Dreimonate-Autoboost benötigt wird, könnten die Mikrokügelchen mit dem hochmolekularen (100 kDa) PLGA mit einem 75 : 25- Verhältnis von Lactid : Glykolid hergestellt werden. Diese Ergebnisse bestätigen die früher beobachtete Beziehung zwischen Abbau in vivo und Polymereigenschaften, wie sie in Fig. 2 dargestellt ist. Folglich wird, wenn ein späterer Autoboost (4 bis 6 Monate) gewünscht ist, Polymilchsäure (PLA), ein hochmolekulares PLGA mit einem hohen Lactidgehalt (höher als 50%) oder ein hochmolekulares PLGA mit 50% Lactid (mehr als 0,75 dl/g) bevorzugt verwendet. Tabelle 6: Korrelation zwischen PLGA-Eigenschaften und zweitem Schuba
a Die Mikrokügelchen wurden wie in Materialien und Verfahren beschrieben hergestellt (0,3 g PLGA/ml Methylenchlorid, 0,1 ml Proteinlösung/ml Methylenchlorid, herabgesetzte Temperatur, kein überschüssiges Methylenchlorid in der zweiten Emulsion).
b Der zweite Schub aus Mikrokügelchen wurde für gewöhnlich über einen Zeitraum von ein bis zwei Wochen beobachtet. Der aufgelistete Zeitbereich sind der erste und letzte Tag signifikanter Freisetzung (mehr als 10%/Woche). %freigesetzt ist die Summe des gesamten, während des zweiten Schubs freigesetzten Proteins.
c Diese Mikrokügelchen wiesen einen starken ersten Schub auf (mehr als 50%) und daher war die beim zweiten Schub verbleibende Proteinmenge herabgesetzt.
d Die Herstellung dieser Mikrokügelchen wurde bei Raumtemperatur durchgeführt, und es wurde überschüssiges Methylenchlorid (1,5%) in der zweiten Emulsion verwendet. Diese Verfahrensänderungen ergaben einen starken ersten Schub.
e Ein 50 : 50-Massenverhältnis von hoch- und niedermolekularem PLGA wurde zur Herstellung dieser Mikrokügelchen verwendet.
Eine weitere Erwägung bei der Auswahl des Zeitpunkts für den Autoboost ist die Stabilität des Proteins. Da die Mikrokügelchen nach kurzer Zeit (Minuten bis Stunden) vollständig hydratisiert sind, befindet sich das eingekapselte Protein bei 37ºC in einer wässrigen Umgebung. Proteinabbau (mit Ausnahme der Plasma-vermittelten Proteolyse) kann daraufhin in den Mikrokügelchen erfolgen. Frühere Studien haben gezeigt, dass MN rgp120 unter physiologischen Bedingungen zumindest vier Monate lang stabil ist. Daher ist ein innerhalb von vier Monaten nach Injektion auftretender Autoboost wünschenswert.

D. Qualität von aus PLGA-Mikrokügelchen freigesetztem MN rgp120

Frühere Studien haben gezeigt, dass es entscheidend sein kann, gp120 in nativer Konformation zu erhalten, um neutralisierende Antikörper zu erhalten (Steimer et al., Science 254, 105-108 (1991)). Folglich wurden mehrere Verfahren verwendet, um den Zustand des aus den Mikrokügelchen freigesetzten Proteins zu charakterisieren.
Wie in Tabelle 7 gezeigt zeigten alle Formulierungen bezüglich der Menge an aggregiertem MN rgp120 keine signifikanten Unterschiede. Die Menge an Aggregaten betrug für alle Formulierungen weniger als 7%. Polymertyp, Trocknungsverfahren und Prozessbedingungen (Temperatur und überschüssiges Methylenchlorid) beeinflussten nicht die Menge des aus den Mikrokügelchen im ersten Schub freigesetzten, monomeren Proteins. Ferner veränderte die Anwesenheit des Adjuvans QS21 nicht die aus den Mikrokügelchen freigesetzte Monomermenge. Die Verwendung von Tween 20 in der QS21- Phase (unten beschrieben) ergab denselben aus den Mikrokügelchen freigesetzten monomeren Proteinanteil. Die Untersuchungen der relativen Hydrophobie des freigesetzten Proteins durch Umkehrphasen-Chromatographie zeigten dieselbe Tendenz (Tabelle 8). Wiederum beeinflusste der Prozess bei Messung mithilfe dieser Technik nicht die Qualität des Proteins. Tabelle 7: Einfluss der Mikroeinkapselung auf den Aggregationszustand von MN rgp120a
a Mikrokügelchen wurden wie in Materialien und Verfahren beschrieben hergestellt (0,3 g PLGA/ml Methylenchlorid, 0,1 ml Proteinlösung/ml Methylenchlorid.
b Mikrokügelchen wurden entweder durch Vakuumtrocknung (Vak., 5ºC für 1 Woche), Lyophilisierung (Lyo.) oder Stickstofftrocknung (Stick.) wie in Materialien und Verfahren beschrieben getrocknet.
C Die Mikrokügelchen wurden entweder bei Raumtemperatur (RT) oder 0ºC hergestellt, und die Emulsion war entweder mit Methylenchlorid gesättigt (+MeCl&sub2;) oder enthielt kein überschüssiges Methylenchlorid (-MeCl&sub2;).
d Die ersten Schübe aus den Mikrokügelchen-Präparaten wurden mittels SEC-HPLC analysiert. Die Prozentsätze an Monomer und Aggregat waren als relative Peakflächen von Hauptpeak (Monomer) und früher eluierenden Peaks (Aggregate) definiert.
e Ein 50 : 50-Massenverhältnis von nieder- und hochmolekularem PLGA wurde zur Herstellung dieser Mikrokügelchen verwendet.
f Die Mikrokügelchen enthielten wie im Text beschrieben sowohl QS21 als auch gp120.
e Die Mikrokügelchen enthielten wie im Text diskutiert QS21, Tween® 20, Arginin und gp120. Tabelle 8: Einfluss der Mikroeinkapselung auf die Oberflächen-Hydrophobie von MN rgp120a
a Die Mikrokügelchen wurden wie in Materialien und Verfahren beschrieben hergestellt (0,3 g PLGA/ml Methylenchlorid, 0,1 ml Proteinlösung/ml Methylenchlorid, herabgesetzte Temperatur, kein überschüssiges Methylenchlorid in der zweiten Emulsion).
b Die Mikrokügelchen wurden entweder durch Vakuumtrocknung (Vak., 50C für 1 Woche) oder Lyophilisierung (Lyo.) getrocknet.
Umkehrphasen- (RP-) HPLC-Analyse wurde anhand des MN rgp120 durchgeführt, das im ersten Schub (1 Std. 37ºC) aus den Mikrokügelchen freigesetzt wurde. Das Protein eluierte zu zwei verschiedenen Zeitpunkten (Neben- und Hauptpeak) aus der Umkehrphasensäule.
d Ein 50 : 50-Massenverhältnis von nieder- und hochmolekularem PLGA wurde zur Herstellung dieser Mikrokügelchen verwendet.
e Die Mikrokügelchen enthielten wie im Text beschrieben sowohl QS21, als auch gp120.
f Die Mikrokügelchen enthielten wie im Text ausgeführt QS21, Tween 20, Arginin und gp120.
Die V3-Schleifenregion von MN rgp120 enthält eine proteolytische Stelle. Um sicherzustellen, dass die V3-Schleife intakt bleibt, wurde das Ausmaß der V3-Schleifen-Proteolyse für das aus Mikrokügelchen freigesetzte Protein gemessen. Wie in Tabelle 9 gezeigt wurde das im ersten Schub aus den Mikrokügelchen freigesetzte MN rgp120 stärker abgebaut als die Kontrolle, die auf 2 bis 8ºC und 2,3 mg/ml Protein gehalten wurde. Das für die Mikroeinkapselung verwendete Protein jedoch wurde aus dem Kontrollansatz konzentriert und bei mehr als 100 mg/ml für mehrere Monate gelagert, und dieses Ausgangsmaterial enthielt ebenfalls größere Mengen proteolytisch abgebauten Materials. Bei der Konzentrierung von MN rgp120 könnten kontaminierende Proteasen ebenfalls konzentriert worden sein. Lagerung von Ausgangsmaterial als lyophilisierte Formulierung würde diese Schwierigkeit vermeiden. Im Allgemeinen unterscheidet sich das aus den Mikrokügelchen im ersten Schub freigesetzte MN rgp120 nicht signifikant vom unbehandelten Anfangsprotein, wie durch mehrere chromatographische Verfahren gemessen wurde. Tabelle 9: Beurteilung der Proteolyse von aus PLGA-Mikrokügelchen freigesetztem MN rgp120a
a Die Mikrokügelchen wurden wie in Materialien und Verfahren beschrieben hergestellt (0,3 g PLGA/ml Methylenchlorid, 0,1 ml Proteinlösung/ml Methylenchlorid, herabgesetzte Temperatur, kein überschüssiges Methylenchlorid in der zweiten Emulsion).
b Die Mikrokügelchen wurden wie in Materialien und Verfahren beschrieben entweder durch Vakuumtrocknung (Vak., 5ºC für 1 Woche) oder Lyophilisierung (Lyo.) getrocknet.
c Die ersten Schübe aus dem Mikrokügelchen-Präparaten wurden mittels SEC-HPLC analysiert.
d Ein 50 : 50-Massenverhältnis von nieder- und hochmolekularem PLGA wurde zur Herstellung dieser Mikrokügelchen verwendet.
e Die Mikrokügelchen enthielten wie im Text diskutiert Q521, Tween 20, Arginin und gp120.
Um sicherzustellen, dass das aus den Mikrokügelchen freigesetzte Protein in dessen nativer Konformation erhalten war, wurden mehrere Konformationstests durchgeführt. Zuallererst wurde die Fähigkeit. des aus den Mikrokügeichen freigesetzten MN rgp120, Antikörper gegen das vollständige Protein und die V3-Schleife zu binden, mittels ELISAs beurteilt. Das anfänglich aus den Mikrokügelchen freigesetzte Protein hatte dieselbe Bindungsfähigkeit für Gesamtprotein- (Gesamt-MN-) und V3-Schleifen- (V3-) Antikörper (Tabelle 10, Testfehler +/-15%). Die Konformation des freigesetzten Proteins wurde ferner durch Zirkulardichroismus (CD) gemessen. Nahe sowie ferne Ultraviolett-CD-Spektren von aus den Mikrokügelchen freigesetztem MN rgp120 waren beim Startprotein identisch (Fig. 9), was darauf hinweist, dass das Protein seine Sekundär- sowie Tertiärstruktur beibehielt. Feine Konformationsunterschiede können durch diese Verfahren möglicherweise nicht beobachtet werden, und daher wurde eine CD4-Bindungsanalyse am freigesetzten Protein durchgeführt, um die intakte Konformation an dieser Bindungsstelle sicherzustellen. Wie in Tabelle 11 gezeigt wird die Fähigkeit von MN rgp120, CD4 zu binden, durch Mikroeinkapselung oder Lyophilisierung nicht verändert. Insgesamt wurde das aus den Mikrokügelchen im ersten Schub freigesetzte MN rgp120 in seiner Konformation nicht verändert und ruft voraussichtlich eine zum löslichem Protein äquivalente Immunantwort hervor. Tabelle 10: Analyse von intakten Epitopen für das aus PLGA-Mikrokügelchen freigesetzte MN rgp120a
a Die Mikrokügelchen würden wie in Materialien und Verfahren beschrieben hergestellt (0,3 g PLGA/ml Methylenchlorid, 0,1 ml Proteinlösung/ml Methylenchlorid, herabgesetzte Temperatur, kein überschüssiges Methylenchlorid in der zweiten Emulsion).
b Die Mikrokügelchen wurden wie in Materialien und Verfahren beschrieben entweder durch Vakuumtrocknung (Vak., 5ºC für 1 Woche) oder Lyophilisierung (Lyo.) getrocknet.
C Die ersten Schübe aus den Mikrokügelchen-Präparaten wurden durch ELISAs analysiert, und zwar unter Verwendung von entweder Gesamtprotein (Gesamt-MN rgp120) oder eines linearen Peptids der V3-Schleifenregion (V3). Die Daten wurden zur Kontrollprobe (wässrige Formulierung) normalisiert, und die Standardabweichung des Tests betrug +/-15%.
d Ein 50 : 50-Massenverhältnis von nieder- und hochmolekularem PLGA wurde zur Herstellung dieser Mikrokügelchen verwendet.
e Die Mikrokügelchen enthielten wie im Text beschrieben sowohl QS21 als auch gp120.
f Die Mikrokügelchen enthielten wie im Text ausgeführt QS21, Tween 20, Arginin und gp120. Tabelle 11: Fähigkeit von aus PLGA-Mikrokügelchen freigesetztem MN rgp120, CD4 zu bindena
a Die Mikrokügelchen wurden wie in Materialien und Verfahren beschrieben hergestellt (0,3 g PLGA/ml Methylenchlorid, 0,1 ml Proteinlösung/ml Methylenchlorid, herabgesetzte Temperatur, kein überschüssiges Methylenchlorid in der zweiten Emulsion).
b Die Mikrokügelchen wurden wie in Materialien und Verfahren beschrieben entweder durch Vakuumtrocknung (Vak., 5ºC für 1 Woche) oder Lyophilisierung (Lyo.) getrocknet.
C Die ersten Schübe aus den Mikrokügelchen-Präparaten wurden durch Kompetitionstest um gp120-Bindung an CD4- IgG analysiert. Die Daten wurden gegen Standards, die auf derselben Mikrotiterplatte mitgeführt wurden, normalisiert (%-Bindung = Probe/Standard*100%). Der mittlere Fehler dieser Daten betrug +/-23%.
d Die Herstellung dieser Mikrokügelchen wurde bei Raumtemperatur durchgeführt, und es wurde überschüssiges Methylenchlorid (1,5%) in der zweiten Emulsion verwendet.
e Ein 50 : 50-Massenverhältnis von nieder- und hochmolekularem PLGA wurde zur Herstellung dieser Mikrokügelchen verwendet.

E. Entwicklung von eingekapselten QS21-Formulierungen

Die Coeinkapselung von QS 21 und MN rgp120 erforderte Änderungen der Prozessparameter. Da das Volumenverhältnis wässrig : organisch die Einkapselungseffizienz und den ersten Schub beeinflusst (Gleichung 1), konnte das Verhältnis zur Kompensation für die zusätzliche QS21-Lösung nicht erhöht werden. Eine Formulierung von Q521 mit 200 mg/ml in 50% Ethanol in Kombination mit 114 mg/ml MN rgp120 (29 mM Tris, 120 mM NaCl, pH 7; 4) wurde für die innere wässrige Phase verwendet. Durch Verwendung dieser konzentrierten Lösungen konnte das Volumenverhältnis wässrig : organisch konstant gehalten (0,1 ml/ml) und mäßige theoretische Beladungen erzielt werden (2 bis 5 Gew.-%). Die QS21-Phase wurde in die Polymerphase injiziert und dann die Proteinlösung zugesetzt, um direkten Kontakt zwischen den QS21/Ethanol- und MN rgp120-Lösungen vor der Einkapselung zu vermeiden. Durch dieses Verfahren mit einem 50 : 50- Verhältnis von nieder- (12 kDa) und hochmolekularem (100 kDa) PLGA hergestellte Mikrokügelchen ergaben 100% Einkapselungseffizienz für das Protein und nur 61,3% Einkapselungseffizienz für QS21 (Tabelle 7). Ohne Einschränkung auf irgendeine Theorie wird angenommen, dass die niedrigere Einkapselungseffizienz für QS21 das Resultat von dessen Tensideigenschaften sein könnte. QS21 könnte an der wässrig/organischen Grenzfläche akkumulieren, was einen Verlust während der Bildung der zweiten Emulsion und in den letzten Prozessierungsschritten (Härtung und Waschung) ergibt. Um diese Möglichkeit zu verringern, wurde 1% Tween® 20 der QS21/Ethanol-Formulierung zugesetzt. Tween® 20 akkumuliert voraussichtlich ebenfalls an der wässrig/organischen Grenzfläche, und es ist wahrscheinlich, dass Tween® 20 die QS21-Mizellen stabilisiert. Die QS21-Einkapselungseffizienz für Mikrokügelchen, die durch dasselbe Verfahren mit QS21/ Tween /Ethanol hergestellt wurden, betrug 80,6%. Der Zusatz von Tween zur QS21-Phase ergab erhöhte Effizienz ohne nachteilige Beeinflussung der gp120-Beladungseffizienz (100%). Ein vollkommen effizienter Prozess für QS21- und gp120-Coeinkapselung wurde mit 20% Tween® in der QS21-Phase und 12 kDa- (75 : 25 Lactid : Glykolid) PLGA erzielt (Tabelle 12).
Um die Einkapselungseffizienz von QS21 alleine zu ermitteln, wurden Mikrokügelchen mit der wässrigen QS21/Ethanol-Phase und 12 kDa- (75 : 25 Lactid : Glykoltd) PLGA hergestellt. Das Volumenverhältnis von wässriger zu organischer Phase wurde um die Hälfte herabgesetzt, was dem:in der Coeinkapselung verwendeten QS21-/olumen entspricht. Die QS21-Einkapselungseffizienz unter diesen Bedingungen betrug 100% und folglich erzeugte ein niedrigeres Volumenverhältnis dieselbe erhöhte Effizienz wie der Zusatz von Tween®. Insgesamt kann QS21 mit hoher Effizienz (80 bis 100%) mit gp120 coeingekapselt oder für sich alleine eingekapselt werden. Tabelle 12: Effizienz des Mikroeinkapselungsprozesses für QS21-PLGA-Mikrokügelchena
a Mikrokügelchen wurden wie in Materialien und Verfahren beschrieben hergestellt (0,3 g PLGA/ml Methylenchlorid, 0,1 ml wässrige Lösung/ml Methylenchlorid, herabgesetzte Temperatur, kein überschüssiges Methylenchlorid in der zweiten Emulsion, lyophilisiert).
b Die massenanteilige Beladung von QS21 und MN rgp120 wurde durch Auflösen der Mikrokügelchen in 1 N NaOH bestimmt. Die Nachfolgende Analyse des behandelten Materials wird im Abschnitt Materialien und Verfahren beschrieben.
c Ein 50 : 50-Verhältnis von nieder- und hochmolekularem PLGA wurde zur Herstellung dieser Mikrokügelchen verwendet.
d Die QS21-Phase in dieser Formulierung enthielt 1% Tween 20.
e Diese Formulierung bestand aus Q521, 20% Tween 20 und 100 mM Arginin in der Wasserphaseninjektion von QS21 (500 ul, siehe Materialien und Verfahren).
f Mikrokügelchen wurden mit einem organischen Volumenverhältnis von 0,05 ml/ml hergestellt.
Die Mikrokügelchen wurden auf die Menge des ersten QS21-Schubs und auf den Einfluss von QS21 auf den ersten Schub von MN rgp120 hin analysiert. Wie in Tabelle 13 gezeigt betrug der erste Schub aus lyophilisierten Mikrokügelchen weniger als 30% für QS21 sowie für MN rgp120. Zusätzlich erhöhte die Coeinkapselung von QS21 mit rgp120 nicht den ersten Protein-Schub aus den Mikrokapseln (siehe Tabellen 2 und 13). Diese Studien weisen darauf hin, dass Mikrokügelchen mit QS21 oder Q521 und MN rgp120 ohne starken ersten Schub von entweder Antigen oder Adjuvans (weniger als 30%) hergestellt werden können und die Unversehrtheit von Antigen nicht gefährdet wird. Tabelle 8: Freisetzung von QS21 und MN rgp120 aus PLGA-Mikrokügelchena
a Die Mikrokügelchen wurden wie in Materialien und Verfahren beschrieben hergestellt (0,3 g PLGA/ml Methylenchlorid, 0,1 ml wässrige Lösung/ml Methylenchlorid, herabgesetzte Temperatur, kein überschüssiges Methylenchlorid in der zweiten Emulsion, lyophilisiert).
b Das im ersten Schub aus den Mikrokügelchen freigesetzte Material (1 Std., 37ºC) wurde durch RP-HPLC analysiert, um die Menge von QS21 und rgp120 zu bestimmen.
C Der zweite Schub trat über einen Zeitraum von 7 bis 14 Tagen auf, und die Kriterien für den zweiten Schub für Q521 waren mehr als 2% Freisetzung von intaktem QS21 (Einzelheiten siehe Text).
d Ein 50 : 50-Massenverhältnis von nieder- und hochmolekularem PLGA wurde zur Herstellung dieser Mikrokügelchen verwendet.
e Die QS21-Phase in dieser Formulierung enthielt 10/0 Tween 20.
f Diese Formulierung bestand aus Q521, 20% Tween 20 und 100 mM Arginin in der Wasserphaseninjektion von Q521 (500 pl, siehe Materialien und Verfahren).
g Die Mikrokügelchen wurden mit einem organischen Volumenverhältnis von 0,05 ml/ml hergestellt.
Eine weitere Erwägung für QS21-Mikrokügelchen-Formulierungen ist der Zeitpunkt des In-vivo-Autoboosts. QS21 oder QS21 mit MN rgp120 enthaltende Mikrokügelchen wurden im physiologischem Puffer bei 37ºC inkubiert, um die Zeit für Freisetzung des zweiten Schubs zu ermitteln. Wie in Tabelle 13 gezeigt, trat der zweite Schub für beide dieser Mikrokügelchen und Mikrokügelchen, die rgp120 alleine enthielten, im selben Zeitbereich auf (Tabelle 6). Zusätzlich war aus den Mikrokügelchen nach Inkubation in physiologischem Puffer bei 37ºC für 74 Tage freigesetztes QS21 zu 25% intakt. Die Menge von intaktem QS21 nach derselben Zeit und unter denselben Bedingungen in Lösung wäre weniger als 25%, da die Abbaugeschwindigkeit von QS21 bei pH 7,4 um das zwanzigfache höher ist als bei pH 5,5 (40ºC) und die Menge von nach 74 Tagen bei pH 5,5 und 40ºC verbleibendem, intaktem QS21 beträgt weniger als 50%. Folglich beeinflusst die Einkapselung von QS21 nicht den Zeitpunkt des zweiten Schubs und kann die Geschwindigkeit von QS21-Abbau und Clearance in vivo herabsetzen.

F. Immunogenität von MN rgp120-Mikrokügelchen

Um die Autoboost-Eigenschaften von MN rgp120-PLGA-Mikrokügelchen in vivo zu beurteilen, wurden Meerschweinchen einmal subkutan mit verschiedenen Dosen derselben Mikrokügelchen-Formulierungen immunisiert. Die Mikrokügelchen wurden aus 12 kDa- (75 : 25 Lactid : Glykolid) PLGA, geliefert von BI, hergestellt und hatten eine Proteinbeladung von 2,4 Gew.-% und einen ersten Schub von 61% (lyophilisierte Formulierung). Es wurde beobachtet, dass diese Formulierung in vitro einen Autoboost (zweiten Schub) zwischen 30 und 65 Tagen aufweist. Antigendosis und im ersten Schub freigesetzte Proteinmenge basierten für alle Experimente auf den In-vitro-Daten. Die Standard- Antigendosis (30 ug) wurde auch mit 60 ug Aluminiumhydroxid (RehydragelTM, hernach Alaun genannt) verabreicht.
Typischerweise erforderte Alaun-formuliertes MN rgp120 wiederholte Immunisierungen derselben Dosis (30 ug Antigen, 60 ug Alaun), um Anstiege im Antikörpertiter zu erzielen. Nach der anfänglichen Immunisierung mit Alaun-formuliertem MN rgp120 nahm der Antikörpertiter in Meerschweinchen nach 4 bis 5 Wochen ab. Die durch diese Formulierungen hervorgerufenen Antikörpertiter wurden in Seren gemessen, die zu verschiedenen Zeitpunkten nach Immunisierung (Woche 0) wie in den Fig. 10 und 11 gezeigt abgenommen worden waren. Tiere, denen die Niedrigdosis von Gesamtantigen (14 ug) mit PLGA verabreicht wurde, hatten niedrigere Anti-MN rgp120-Titer als die Alaun-Gruppe nach 4 und 6 Wochen, da die PLGA-Formulierung anfänglich nur 8,5 ug freisetzte (Fig. 10). Zwischen 6 und 8 Wochen erhöhte sich der Anti-MN rgp120-Titer der Niedrigdosis-PLGA-Gruppe (14 ug Antigen) auf Titer, die um das zweifache höher waren als die der Alaun-Gruppe. Die mäßige Dosis des eingekapselten Antigens (42 ug) rief einen ähnlichen Zeitverlauf von erhöhtem Titer hervor, und die Anti-MN rgp120-Titer waren um das drei- und sechsfache höher als die der Niedrigdosis-PLGA- (14 ug Antigen) bzw. Alaun-Gruppen. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass der In-vivo-Autoboost nach 30 bis 65 Tagen auftritt. Ein Vergleich von Alaun- und PLGA-Gruppen mit derselben Antigendosis zeigte, das der In-vivo-Autoboost eine höhere hurnorale Antwort (Anti-MN rgp120 und Anti-V3) liefert als eine einzelne Dosis von Alaun-Adjuvans, jedoch schien PLGA bessere Adjuvans-Eigenschaften aufzuweisen als Alaun (Fig. 10 und 11).
Zusätzlich zeigten die Unterschiede in Anti-MN rgp120-Titern zwischen den niedrig und mäßig dosierten PLGA-Gruppen nach 8 bis 20 Wochen, dass die Proteinmenge der anfänglichen Immunisierung (erster Schub, 8,5 ug bei niedriger Dosis, 25 ug bei mäßiger Dosis) eine geringere Auswirkung auf die Immunantwort gegen das Gesamtantigen (Anti-MN rgp120) hatte als der Autoboost (5,5 ug bei niedriger Dosis, 17 ug bei mäßiger Dosis), der einer zweiten Immunisierung gleichzusetzen ist (Fig. 10). Jedoch hatte die Antigen menge bei der anfänglichen Immunisierung sehr wohl eine Auswirkung auf die Anti-V3-Titer. Wie in Fig. 111 gezeigt waren die Anti-V3-Titer der Niedrigdosis-PLGA- Gruppe niedriger als die der anderen Formulierungen vor dem In-vivo-Autoboost.
Die Hochdosis-PLGA-Gruppe hatte um das siebenfache höhere Anti-MN rgp120-Titer und um das zweifache höhere Anti-V3-Titer als die Niedrigdosis-PLGA-Gruppe nach 8 bis 14 Wochen. Bei der Hochdosis-PLGA-Gruppe wurden hohe anfängliche Anti-MN rgp120-Titer beobachtet und der In-vivo-Autoboost, der zwischen 6 und 8 Wochen auftrat, lieferte keinen starken Titeranstieg. Dies steht im Einklang mit früheren Beobachtungen, die darauf hinweisen, dass man den anfänglichen Titer vor nachfolgender Immunisierung abfallen lassen sollte (Anderson et al., J. Infectious Diseases 160, 960-969 (1989)). Andernfalls wird die humorale Antwort durch vorhandene Antikörper effizient gedämpft. Die Hochdosis-PLGA-Formulierung rief jedoch sehr wohl einen Anstieg der Anti-V3-Titer zwischen 6 und 8 Wochen hervor.
Die Anti-V3-Antwort war auf die verabreichte Antigendosis weniger empfindlich als die Anti-MN rgp120-Antwort (Fig. 11). Der Anti-V3-Titer verringerte sich nach 4 Wochen in der Alaun-Gruppe, wogegen Anti-V3-Titer der PLGA-Gruppen nach 6 Wochen anstiegen. Die Anti-V3-Titer der F'LGA-Gruppen waren um das sechsfache höher als die Titer der Alaun-Gruppe nach 8 bis 14 Wochen. Der beobachtete Anstieg von Anti-MN rgp120- sowie Anti-V3-Titer in den PLGA-Gruppen weisen darauf hin, dass das im Invivo-Autoboost freigesetzte Antigen im Wesentlichen intakt ist (kein Clipping in der V3- Schleife).
Um die Wirkung der Einkapselung auf die humorale Antwort auf MN rgp120 näher zu bewerten, wurden Meerschweinchen mit derselben Menge Gesamtantigen und zwei verschiedenen Mengen eingekapselten Antigens immunisiert. Einer Gruppe wurden 15 pg lösliches MN rgp120 gemeinsam mit 15 ug eingekapseltem MN rgp120 verabreicht und die andere Gruppe wurde mit 30 ug eingekapseltem MN rgp120 immunisiert. Die für diese Experimente verwendeten Formulierungen wurden aus einem 50 : 50-Massenverhältnis von 12 kDa- (75 : 25 Lactid : Glykolid) und 100 kDa- (75 : 25 Lactid : Glykolid) PLGA hergestellt. Die endgültigen Mikrokügelchen hatten eine Proteinbeladung von 4,9 Gew.-% und einen ersten Schub von 32% (lyophilisierte Formulierung). Eine Kontrollgruppe wurde mit 30 ug Antigen mit 60 ug Alaun (RehydragelTM) immunisiert.
Wie in den Fig. 12 und 13 gezeigt hatte die mit je 15 ug löslichem und eingekapseltem MN rgp120 immunisierte Gruppe die niedrigste humorale Antwort (Wochen 4 bis 8). Diese Gruppe erhielt eine gesamte anfängliche Immunisierung (löslich und erster Schub) von 19,5 ug MN rgp120. Die Alaun-Kontrollgruppe hatte um das zweifache höhere Anti-MN rgp120- und Anti-V3-Titer als diese Gruppe nach 4 bis 8 Wochen. Zusätzlich hatte die mit derselben Antigendosis (30 ug) in der eingekapselten Formulierung immunisierte Gruppe um das fünffache höhere Anti-MN rgp120-Titer als die Gruppe mit der löslich/eingekapselt-gemischten Formulierung nach 4 bis 8 Wochen. Die eingekapselte MN rgp120-Formulierung setzte anfänglich nur 9 ug Antigen frei, was signifikant weniger ist als bei den Alaun- sowie löslich/eingekapselt-Formulierungen. Daher induzierte die Mikroeinkapselung von MN rgp120 eine stärkere Immunantwort als das lösliche Antigen.
Um die Fähigkeit von QS21 zu beurteilen, die beobachtete Immunantwort auf MN rgp120-PLGA zu verstärken, wurden zwei verschiedene Formulierungen getestet. Eine Gruppe von Tieren wurde mit 30 ug MN rgp120 in einer PLGA-Formulierung (12/100 kDa (75 : 25 Lactid : Glykolid), 4,9 Gew.-% Protein, 32% erster Schub) immunisiert, die mit 50 ug löslichem QS21 kombiniert war. Eine weitere Tiergruppe wurde mit einer Formulierung immunisiert, die aus MN rgp120 sowie QS21 bestand, die in denselben Mikrokügelchen eingekapselt waren. Die Mikrokügelchen mit MN rgp120 und QS21 wurden mit einem 50 : 50-Massenverhältnis von 12 kDa- (75 : 25 Lactid : Glykolid) und 100 kDa- (75 : 25 Lactid : Glykolid) PLGA hergestellt. Diese Mikrokügelchen hatten eine Proteinbeladung von 2,5 Gew.-% und eine QS21-Beladung von 1,9 Gew.-%. Der erste Schub aus diesen Mikrokügelchen für Protein und QS21 betrug 29% bzw. 19%. Die Antikörpertiter von mit löslichem QS21 und eingekapseltem MN rgp120 immunisierten Tieren waren um das vier- (Anti-V3) bis sechs- (Anti-MN rgp120) fache höher als die Titer von Tieren, die mit eingekapseltem MN rgp120 alleine immunisiert waren (Fig. 12 und 13). Die anfänglich freigesetzte Antigenmenge (9 ug) war für beide dieser Gruppen gleich, da dieselbe PLGA-Formulierung verwendet wurde. Daher verstärkte lösliches QS21 die Immunantwort auf eingekapseltes MN rgp120.
Da eingekapseltes MN rgp120 eine stärkere Immunantwort lieferte als lösliches MN rgp 120, wurde die durch QS21-Einkapselung verursachte, zusätzliche Verstärkung der Immunantwort untersucht. Tiere wurden mit der PLGA-Formulierung immunisiert, die sowohl MN rgp120, als auch QS21 enthielt. Das gesamte in der PLGA-Formulierung dosierte Antigen und QS21 betrug 25 ug bzw. 19 ug. Beide dieser Gesamtdosen waren niedriger als die löslichen und eingekapselten Kontrollen, da die Protein- und QS21-Beladungen in diesen Mikrokügelchen niedriger waren. Wie in den Fig. 12 und 13 gezeigt waren die Antikörpertiter der mit eingekapseltem MN rgp120/QS21 immunisierten Gruppe um eine Größenordnung höher als die der Kontrollgruppen mit eingekapseltem MN rgp120 (30 ug-Dosis) und Alaun (30 ug-Dosis). Zusätzlich setzte die eingekapselte MN rgp120/QS21-Formulierung nur 7,3 ug MN rgp120 und 3,6 ug QS21 im ersten Schub frei. Daher war eine niedrigere Dosis von Antigen sowie Adjuvans in der eingekapselten Form in der Lage, eine um eine Größenordnung stärkere Immunantwort hervorzubringen als das lösliche oder Alaun-formulierte Antigen.
Um zu ermitteln, ob die humorale Antwort auf MN rgp120 ausreichte, um das Virus bei Infektion zu neutralisieren, wurden Seren aus mit MN rgp120 immunisierten Meerschweinchen auf Virusneutralisation hin untersucht, und zwar unter Verwendung von MT4-T-Lymphzelfen, die sehr empfindlich gegenüber HIV-Infektion sind. Die Seren wurden fünf verschiedenen Gruppen von Meerschweinchen entnommen, wobei jede mit einer anderen Formulierung immunisiert war: 30 ug Antigen mit 60 ug Alaun, 30 ug Antigen mit 50 ug QS21 und 60 ug Alaun, und 30 ug eingekapseltes Antigen mit 50 ug lösliches QS21. Die PLGA-Formulierung wurde aus 12 kDa- (50 : 50) PLGA hergestellt. Die Mikrokügelchen hatten eine Proteinbeladung von 1 Gew.-% mit einem ersten Schub von 80% (lyophilisierte Formulierung). Die Tiere wurden nach 0, 1 und 2 Monaten mit dieser Formulierung immunisiert. CFA erhaltende Tiere wurden mit inkomplettem Freund'schem Adjuvans (IFA) gebooset. Die am Tag 70 abgenommenen Serumproben wurden auf Virusneutralisation hin untersucht.
Wie in Tabelle 14 gezeigt waren die MN-Virus-Neutralisationstiter der mit MN rgp120- PLGA-Formulierung und löslichem QS21 immunisierten Gruppe um 50% höher als Titer der QS21-/Alaun-Gruppe und waren um das 10fache höher als die Titer der Alaun- und CFA-Gruppen. Der ALA-1-Virus-Neutralisationstiter für die QS21/PLGA-Gruppe war um 60% niedriger als der der QS21/Alaun-Gruppe, jedoch war er um das 8fache höher als der der Alaun-Gruppe. Die mit der hohen Antigendosis (60 ug) und löslichem QS21 immunisierte Gruppe hatte die höchsten Neutralisationstiter für beide Stämme. Jedoch war der MN-Virus-Neutralisationstiter für die Hochdosis-Gruppe nur geringfügig höher als die Titer für die QS21/PLGA-Gruppe. Daher induzierte aus PLGA-Mikrokügelchen freigesetztes MN rgp120 die Bildung von neutralisierenden Antikörpern gegen MN- und ALA-1-Stämme von HIV-1. Tabelle 14: Virus-Neutransationstiter für Sera aus Meerschweinchen an Tag 70 nach Immunisierung mit verschiedenen MN rgp120-Formulierungen (30 ug MN rgp120/Dosis, Immunisierung nach 0, 1 und 2 Monaten).
a Komplettes Freund'sches Adjuvans wurde durch Emulgierung mit einer Spritze-zu-Spritze-Technik unmittelbar vor der Immunisierung hergestellt.
b Diese Gruppe wurde mit 60 ug MN rgp120 gemeinsam mit löslichem QS21 immunisiert.
C Eingekapseltes MN rgp120 (12 kDa- (50 : 50) PLGA, 1 Gew.-% MN rgp120) wurde mit löslichem QS21 vor der Immunisierung vermischt.

Claims

1. Zusammensetzung, die eine Population polymerer Mikrokügelchen umfasst, in denen ein Antigen eingekapselt ist, worin:

die Population aus einer Emulsion hergestellt ist, die wässriges Antigen und ein Polymer umfasst, worin:

das Polymer ein Milchsäure-Polymer oder ein Glykolsäure-Milchsäure-Copolymer umfasst;

die Mikrokügelchen einen mittleren Durchmesser von etwa 20 bis 100 um aufweisen; und

die Mikrokügelchen ein Antigen-Freisetzungsprofil haben, das durch drei Phasen gekennzeichnet ist:

eine erste Phase, worin 0,5 bis weniger als 30% des Antigen in einem ersten Burst über einen Zeitraum von etwa einem Tag freigesetzt werden;

eine zweite Phase nach der ersten Phase, worin 0 bis 10% des Antigens über einen Zeitraum von etwa 30 bis 200 Tagen freigesetzt werden; und

eine dritte Phase nach der zweiten Phase, worin zumindest 50% des Antigens in einem zweiten Burst über einen Zeitraum von etwa 10 bis 30 Tagen freigesetzt werden.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Polymer ein Verhältnis zwischen Lactid und Glykolid von etwa 100 : 0 bis 50 : 50 Gew.-% aufweist.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Polymer ein Copolymer aus Glykolsäure und Milchsäure umfasst.

4. Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin während der ersten Phase 5 bis weniger als 30% des Antigen freigesetzt werden.

5. Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin während der dritten Phase 50 bis 85% des Antigens im zweiten Burst freigesetzt werden.

6. Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der zweite Burst durch eine Antigen-Freisetzungsrate von zumindest 10% pro Woche gekennzeichnet ist.

7. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin die zweite Phase etwa 30 Tage andauert.

8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin die zweite Phase etwa 60 Tage andauert.

9. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin die zweite Phase etwa 90 Tage andauert.

10. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin die zweite Phase etwa 120 Tage andauert.

11. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin die zweite Phase etwa 180 Tage andauert.

12. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, worin das Antigen ein HIV-Polypeptid ist.

13. Zusammensetzung nach Anspruch 12, worin das HIV-Polypeptid gp120 ist.

14. Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der mittlere Durchmesser der Mikrokügelchen etwa 30 um beträgt.

15. Zusammensetzung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, die weiters ein Adjuvans und/oder ein lösliches Antigen umfasst.

16. Zusammensetzung nach Anspruch 15, worin das Adjuvans in polymeren Mikrokügelchen eingekapselt ist oder das Adjuvans zusammen mit dem Antigen in den Mikrokügelchen eingekapselt ist.

17. Zusammensetzung nach Anspruch 15 oder 16, worin das Adjuvans QS21 ist.

18. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Verwendung als Vakzine in einem Verfahren zur Behandlung eines menschlichen oder Tierkörpers.

19. Verfahren zum Einkapseln von Antigen in Mikrokügelchen, folgende Schritte umfassend:

(a) Lösen eines Polymers in einem organischen Lösungsmittel, um eine Lösung zu bilden,

worin das Polymer ein Milchsäure-Polymer oder ein Glykolsäure-Milchsäure-Copolymer umfasst;

(b) Zugabe eines Antigens zur Lösung aus (a), um ein Polymer-Antigen-Gemisch zu bilden, das eine erste Emulsion umfasst;

(c) Zugabe des Gemischs aus Schritt (b) zu einem Emulgierbad, um Mikrokügelchen zu erzeugen, die eine zweite Emulsion umfassen; und

(d) Härten der Mikrokügelchen aus Schritt (c), um gehärtete Mikrokügelchen nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zu erzeugen, die eingekapseltes Antigen umfassen.

20. Verfahren nach Anspruch 19, worin das Polymer ein Copolymer aus Glykolsäure und Milchsäure umfasst.

21. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, worin das organische Lösungsmittel ausgewählt ist aus: Methylenchlorid, Ethylenacetat, einem Gemisch aus Ethylenacetat und Benzylalkohol oder einem Gemisch aus Ethylacetat und Aceton.

22. Verfahren nach Anspruch 19, 20 oder 21, worin das Emulgierbad eine Polyvinylalkohollösung umfasst.

23. Verfahren nach Anspruch 22, worin die Polyvinylalkohollösung Ethylacetat enthält.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 23, worin das Antigen ein trockenes Polypeptid ist oder wässrig ist.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 23, das weiters die Trocknung der gehärteten Mikrokügelchen umfasst.

26. Verfahren nach Anspruch 25, worin die Trocknung aus der aus Lyophilisierung, Fließbetttrocknung und Vakuumtrocknung bestehenden Gruppe ausgewählt ist.