DE69427876T2

DE69427876T2 - Methode zur detektion einer gezielten nukleinsäure

Info

Publication number: DE69427876T2
Application number: DE69427876T
Authority: DE
Inventors: Chang-Ning J. Wang; Kai-Yuan Wu
Original assignee: Biotronics Corp
Current assignee: Biotronics Corp
Priority date: 1994-05-23
Filing date: 1994-05-23
Publication date: 2002-04-11
Anticipated expiration: 2014-05-24
Also published as: EP0763133A4; AU706033B2; RU2158765C2; DK0763133T3; WO1995032306A1; EP0763133B1; JPH10500572A; EP0763133A1; BR9408578A; NZ266724A; ES2158895T3; DE69427876D1; AU6836494A; GR3037030T3; HK1001131A1; ATE203775T1

Description

Hintergrund der Erfindung

Die kürzliche Entwicklung der Polymerasekettenreaktion ("PCR") hat ein bedeutendes Werkzeug für die Detektion von Nukleinsäuresequenzen, die in geringen Konzentrationen vorliegen, zur Verfügung gestellt (Mullis, K. B. et al., US-Patent Nr. 4.683.195 und 4.683.202). Bei der PCR wird eine Zielsequenz mit Begrenzungen, die durch zwei Oligonukleotid-Verlängerungsprimer bestimmt werden, durch wiederholte enzymatische Zyklen amplifiziert, um zusätzliche Matrizen für weitere Amplifikationsreaktionen zu liefern. Dementsprechend kann eine kleine Zahl von Zielsequenzen exponentiell amplifiziert und leicht detektiert werden.
Eine Haupteinschränkung der PCR liegt in der umfangreichen Erzeugung von Nebenprodukten, die infolge der nicht-spezifischen Primeranlagerungsereignisse, beispielsweise zufälliger Primeranlagerung der Nukleinsäurematrix und/oder Primerselbstanlagerung der Verlängerungsprimer hergestellt werden. Folglich erschweren die Produkte der nichtspezifischen Primeranlagerungsereignisse die PCR-Empfindlichkeit signifikant, wenn eine hohe Zahl an Amplifikationszyklen erforderlich ist, um eine Zielsequenz, die in einer relativ geringen Konzentration vorliegt, zu amplifizieren.
Eine zusätzliche, damit zusammenhängende Einschränkung der PCR ist die Notwendigkeit eines Trennschrittes vor der Detektion des amplifizierten Ziels. Entsprechend den Standard- PCR-Bedingungen ist die Trennung der amplifizierten Zielsequenz von den Produkten der nicht-spezifischen Primeranlagerungsereignisse eine Voraussetzung für die Detektion der amplifizierten Zielsequenz. Das Fehlen einer homogenen Amplifikationsreaktion, das heißt einer Reaktion, bei der Amplifikation und Detektion in demselben Reaktionsgefäß erfolgen, ist ein Hindernis bei der Automatisierung des PCR-Verfahrens. Außerdem unterwirft die Notwendigkeit eines Trennschrittes das PCR-Gemisch auch einer potentiellen Kontamination infolge des Trennverfahrens. Die Kontaminationswahrscheinlichkeit beschränkt die mögliche Anwendung der PCR in der klinischen Routine-Diagnostik stark.
Es ist von Versuchen berichtet worden, um ein homogenes Assay zur Amplifikation und Detektion zu entwickeln. Ein derartiger Versuch wird von Holland et al. (1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7276) bei einem Assay beschrieben, der die 5' → 3'-Exonucleaseaktivität von Taq-Polymerase verwendet, um ein Detektionssignal gleichzeitig mit der PCR- Amplifikation zu erzeugen. Ein anschließender Trennungsschritt ist jedoch erforderlich, um das Exonuclease-erzeugte Signal zu detektieren. Higuchi et al. (1992, Bio/Technology 10: 413) beschreiben ein homogenes Detektionsverfahren, das auf der Überwachung erhöhter Fluoreszenz von Ethidiumbromid basiert, wenn es in das doppelsträngige Amplifikationsprodukt eingelagert wird. Ein derartiges Detektionsverfahren ist nicht für die Zielsequenz spezifisch, so daß es anfällig für Störungen durch die Anwesenheit irgendeiner Doppelstrang-DNA ist. Ein anderer Versuch besteht darin, Fluoreszenzpolarisation zu verwenden, um die Hybridisierung einer fluoreszierenden Nukleinsäuresonde oder fluoreszierender Primerverlängerungsprodukte zu detektieren (Garmen, A. J., et al., Veröffentlichung des Europäischen Patentamtes Nr. 382.433). Dieses Detektionsverfahren kann die hybridisierte oder verlängerte Sonde, die ein höheres Molekulargewicht besitzt (und folglich verringerte Fluoreszenzpolarisation), von der nicht-reagierten Sonde unterscheiden. Jedoch beeinflußt das Vorhandensein der unhybridiserten Sonde mit höherer Polarisation die beobachtete Polarisation stark, so daß sich ein hohes Hintergrundrauschen ergibt.
Ein nicht-strahlender Energieübergang bei nächster Nähe von fluoreszierenden Komponenten kann als ein wirksamer Signaldetektionsmodus verwendet werden. Es sind homogene Immunoassays, die auf Fluoreszenz-Energieübergang basieren, beschrieben worden (Patel et al., Europäische Patentanmeldung Nr. 137.515). Ein Fluoreszenz-Energieübergang ist ebenfalls zur Detektion der Nukleinsäurehybridisierung vorgesehen (Heller et al., Europäische Patentanmeldung Nr. 070.685 und US-Patent Nr. 4.996.143). Bei derartigen Anwendungen wird ein Fluoreszenz-Energieübergangs-Signal erzeugt, wenn Sonden, die unterschiedliche Komponenten tragen, in enge physische Nachbarschaft infolge der Hybridisierung zu einem Strang der Zielnukleinsäure gebracht werden.

Zusammenfassung der Erfindung

Ein Aspekt dieser Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Detektion einer Zielnukleinsäure, das die folgenden Schritte enthält: (i) Amplifizieren der Zielnukleinsäure, um ein Amplifikations-Produkt zu erhalten, unter Verwendung einer Polymerase, eines ersten Primers mit oder ohne einem nicht benachbarten Segment zu einer ersten Anfangssequenz, und eines zweiten Primers mit oder ohne einem nicht benachbarten Segment zu einer zweiten Anfangssequenz in Gegenwart eines Oligonucleotides, welches nicht in der Lage ist, als Primer für die Polymerase zu agieren, wobei das Oligonucleotid mindestens 5 (vorzugsweise mindestens 8) aufeinanderfolgende Nucleotide hat, die vollständig komplementär zu mindestens 5 (vorzugsweise mindestens 8) aufeinanderfolgenden Nucleotiden des ersten Primers sind; und (ii) Detektieren des Vorhandenseins der Zielnukleinsäure durch das Überwachen der Amplifikation.
Der erste und zweite Primer, die einem in dem PCR-Verfahren verwendeten Primerpaar entsprechen, hybridisieren mit der ersten bzw. zweiten Anfangssequenz in der Zielnukleinsäure, bevor sie durch die Polymerase verlängert werden. Der in dieser Anmeldung verwendete Ausdruck "Polymerase" bezieht sich auf einen Katalysator, der in der Lage ist, sowohl die DNA-Polymeraseaktivität zu erfüllen als auch ein "stromabwärtiges" einzelsträngiges Oligonucleotid zu verdrängen.
Das obenbeschriebene Oligonucleotid ist ein "Blockierungs-Oligonucleotid" dieser Erfindung. Zweckmäßigerweise wird jedes Oligonucleotid, das (a) nicht als PCR-Primer verwendet werden kann und (b) mindestens 5 aufeinanderfolgende Nucleotide aufweist, die vollständig komplementär zu mindestens 5 aufeinanderfolgenden Nucleotiden eines Primers (mit oder ohne einem benachbarten Segment) sind, als "Blockierungs-Oligonucleotid" in dieser Erfindung bezeichnet. Ein Blockierungs-Oligonucleotid blockiert einen Primer in dem Sinne, daß es mit ihm hybridisiert und es wenig wahrscheinlich macht, daß er an seine Anfangssequenz in der Zielnukleinsäure bindet. In einer bevorzugten Ausführung dieses Verfahrens wird der Amplifikationsschritt in der Gegenwart eines zusätzlichen Blockierungs-Oligonucleotids für den zweiten Primer durchgeführt.
Die fünfbasige, vollständige Komplementarität kann zwischen einem Blockierungs- Oligonucleotid und entweder dem benachbarten Segment oder einem nicht benachbarten Segment eines Primers gebildet werden. Das benachbarte Segment eines Primers ist die Sequenz, die komplementär zu der Anfangssequenz in der Zielnukleinsäure ist. Andererseits ist das nicht-benachbarte Segment eines Primers die Sequenz, die nicht komplementär zu der Apfangssequenz in der Zielnukleinsäure ist.
Bevorzugte Längen eines Primers und eines Blockierungs-Oligonucleotids dieser Erfindung liegen jeweils zwischen 10 und 50 Nucleotiden (besonders bevorzugt zwischen 15 und 40 Nucleotiden). Die wirksame Konzentration eines Blockierungs-Oligonucleotids variiert in Abhängigkeit von mehreren Faktoren stark, beispielsweise vom Grad der Komplementarität zwischen dem Blockierungs-Oligonucleotid und dem korrespondierenden Primer, von der Assay-Temperatur und ähnlichem, und kann bei jedem Ereignis leicht durch einen Fachmann ohne übermäßiges Experimentieren bestimmt werden. In bezug auf das Molverhältnis ist ein Bereich von 0,3 bis 5,0 (oder 0,5 bis 2,5) im allgemeinen akzeptabel.
Der Detektionsschritt kann durch Überwachen des Amplifikationsproduktes der Zielnukleinsäure auf einem Gel nach der Elektrophorese durchgeführt werden. Alternativ können zwei Fluorophore an dem ersten (oder zweiten) Primer bzw. seinem korrespondierenden Blockierungs-Oligonucleotid, wobei eines der beiden Fluorophore ein Donorfluorophor und das andere ein Akzeptorfluorophor ist, kovalent befestigt werden, so daß, wenn der erste Primer und das Blockierungs-Oligonucleotid hybridisiert werden, das Blockierungs- Oligonucleotid in nächster Nähe ist, um den Resonanzenergieübergang dazwischen zu ermöglichen. Wenn ein Blockierungs-Oligonucleotid und sein korrespondierender Primer auf diese Weise Fluorophor-markiert sind, kann man die Fluoreszenzemissionänderung des Akzeptorfluorophors bei der Bestrahlung des Donorfluorophors mit Anregungslicht überwachen, um die Amplifikation der Zielnukleinsäure zu quantifizieren, da die Änderung eine Funktion des Grades des blockierten Primers, der von dem Blockierungs-Oligonucleotid dissozüert und anschließend in das Amplifikationsprodukt der Zielnukleinsäure eingebaut wird, ist.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Kit zum Detektieren einer Zielnukleinsäure. Beispielsweise kann ein Detektionskit dieser Erfindung (i) ein Primerpaar (10 bis 50 Basen oder 15 bis 40 Basen), das mit einer Polymerase für die Amplifikation der gezielten Nukleinsäure verwendet wird, wobei jeder Primer mit oder ohne einem nicht benachbarten Segment zu seiner Anfangssequenz versehen ist; und (ii) ein Blockierungs-Oligonucleotid (10 bis 50 Basen oder 15 bis 40 Basen) enthalten, das einen der beiden Primer blockieren kann. Vorzugsweise sind das (die) Blockierungs-Oligonucleotid(e) und der/die dazu korrespondierende(n) Primer in der oben beschriebenen Weise Fluorophormarkiert. Das Blockierungs-Oligonucleotid und sein korrespondierender Primer können als Doppelstrang (das heißt "spezifischer Detektionsdoppelstrang", wenn Fluorophor-markiert, siehe Fig. 1, Mitte, und Fig. 2, oben, sowie Diskussion unten) bereitgestellt werden. Es ist auch bevorzugt, daß das Kit weiterhin eine oder beide der folgenden Reagenzien enthält: eine Polymerase und ein zusätzliches Blockierungs-Oligonucleotid zum Blockieren des anderen Primers.
Als weiteres Beispiel kann ein Kit dieser Erfindung (i) ein erstes Fluorophor-markiertes Oligonucleotid (10 bis 50 Basen oder 15 bis 40 Basen), das nicht in der Lage ist, als Primer in der Amplifikation durch eine Polymerase verwendet zu werden, und (ii) ein zweites Fluorophor-markiertes Oligonucleotid (5 bis 30 Basen oder 7 bis 15 Basen), das ein freies 3'-OH aufweist, enthalten. Beide Oligonucleotide werden über mindestens 5 (vorzugsweise mindestens 8) aufeinanderfolgende, vollständig komplementäre Nucleotidpaarungen miteinander hybridisiert, und das erste Oligonucleotid überragt das 3'-Ende des zweiten Oligonucleotids um 1 bis 12 Basen (vorzugsweise 4 bis 8 Basen), und weiterhin sind das erste und zweite Fluorophor, wobei eines von denen ein Donorfluorophor und das andere ein Akzeptorfluorophor ist, in nächster Nähe, um den Resonanzenergieübergang dazwischen zu ermöglichen. Das erste und zweite Oligonucleotid kann als Doppelstrang, das heißt als "universeller Detektionsdoppelstrang" (siehe nachstehende Diskussion) bereitgestellt werden. Vorzugsweise können weitere Reagenzien wie eine Ligase, eine Kinase und eine Polymerase mit oder ohne 5' → 3'-Exonucleaseaktivität verwendet werden. Ligase und Kinase (oder Polymerase mit oder ohne 5' → 3'-Exonucleaseaktivität) können verwendet werden, um einen gewählten Primer mit einem universellen Detektionsdoppelstrang zu verbinden, wodurch letzter in einen spezifischen Detektionsdoppelstrang überführt wird.
Sowohl der obenbeschriebene spezifische als auch der universelle Detektionsdoppelstrang liegen ebenso wie das "unfähige" Oligonucleotid, das einen Strang eines dieser Doppelstränge bildet, im Umfang der vorliegenden Erfindung.
Weitere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung sind aus den folgenden Zeichnungen und der Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen und auch aus den anhängenden Ansprüchen ersichtlich.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Zeichnungen werden zuerst beschrieben.
Fig. 1, ist eine Ausführungsform des Verfahrens dieser Erfindung.
Fig. 2 ist eine weitere Ausführungsform des Verfahrens dieser Erfindung.
Fig. 3 ist eine Photographie eines Gels, das die Wirkung eines Blockierungs- Oligonucleotids bei der Reduzierung nicht-spezifischer Primeranlagerungsereignisse zeigt.
Fig. 4 ist ein Diagramm, das die Verwendung eines Fluorophor-markierten Blockierungs- Oligonucleotids zur Überwachung spezifischer Primeranlagerungsereignisse zeigt.
Fig. 5 ist ein Diagramm, das die Auflösung und Empfindlichkeit bei der Detektion von zwei verschiedenen Zielsequenzen unter Verwendung von zwei, in dieser Erfindung ausgeführten Sonden zeigt.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Wie hierin benutzt bezieht sich "Amplifikation" allgemein auf ein Verfahren unter Verwendung eines Polymerase und eines Primerpaars zur Herstellung einer speziellen Nukleinsäuresequenz, das heißt der "Zielnukleinsäureseqeunz" oder "Zielnukleinsäure", in einer Menge, die größer als die anfänglich vorliegende ist.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Detektion des Vorhandenseins einer spezifischen Zielnukleinsäuresequenz durch Überwachen des Einbaus des/der Primer(s) in das Amplifikationsprodukt der spezifischen Nukleinsäure. In der vorliegenden Erfindung wird ein Blockierungs-Oligonucleotid verwendet, um nicht-spezifische Primeranlagerungsereignisse während des Amplifikationsverfahrens zu verhindern. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die amplifizierte Zielsequenz durch Fluoreszenzüberwachung der Dissoziation des Blockierungs-Oligonucleotids von seinem Komplementärprimer detektiert.
Die Amplifikation ist auf die Hybridisierung jedes Primerpaars mit einer spezifischen Anfangssequenz, das heißt, einer Sequenz der Ausgangsnukleinsäurematrix, an der ein Primer den höchsten Komplementaritätsgrad hat und äußerst bevorzugt hybridisiert, angewiesen. Zusätzlich zu den spezifischen Ausgangssequenzen kann die Ausgangsnukleinsäurematrix nicht-spezifische Anfangssequenzen enthalten, an denen ein Primer auch zum Hybridisieren in der Lage sein kann. Nicht-spezifische Anfangssequenzen, das heißt Ereignisse, die zur Amplifikation einer anderen Sequenz der Matrix als der spezifischen Nukleinsäuresequenz führep, umfassen Reaktionen wie die Hybridisierung eines Primers mit einer anderen Sequenz der Matrix als seiner Ausgangssequenz und Selbstanlagerung wie Dimerisierung infolge intermolekularer Wechselwirkungen zwischen den Primern (Chou et al. in Nucleic Acid Research (1992) 20: 1717).
Ein Primer ist ein Oligonucleotid, egal ob aus einem Restriktionsabbauprodukt gereinigt oder durch ein organisches Verfahren hergestellt, das als Ausgangspunkt der Synthese eines Primerverlängersproduktes agieren kann, das komplementär zu einer Zielsequenz ist, wenn es unter geeigneten Bedingungen verwendet wird. Zusätzlich zu der Sequenz, die komplementär zu der spezifischen Ausgangssequenz in der Ausgangsnukleinsäurematrix ist, kann ein Primer dieser Erfindung weiterhin an seinem 5'-Bereich eine zu der Anfangsequenz der Ausgangsmatrix nicht-benachbarte Sequenz umfassen. Andersgesagt ist ein benachbartes Segment eine Sequenzstrecke am 3'-Bereich eines Primers, wobei die Sequenz komplementär zu der spezifischen Anfangssequenz in der Ausgangsnukleinsäurematrix ist, während ein nicht-benachbartes Segment eine Sequenzstrecke am 5'-Bereich eines Primers ist, wobei die Sequenz nicht komplementär zu der Anfangssequenz der Ausgangsnukleinsäurematrix ist.
Wie hier verwendet bezieht sich eine Ausgangsnukleinsäurematrix auf eine gereinigte oder nicht-gereinigte Nukleinsäure in einer Probe, die eine Zielsequenz enthält oder möglicherweise enthält. Folglich kann das Verfahren beispielsweise DNA, RNA oder ein DNA:RNA- Hybrid verwenden. Die Ausgangsnukleinsäurematrix ist nicht auf eine DNA oder RNA, die schließlich in ein Proteinprodukt translatiert wurde, beschränkt, sondern kann auch eine nicht-kodierende Nukleinsäure oder nicht-kodierende Nukleinsäuresequenzen, die sich zwischen kodierenden Sequenzen befinden, umfassen.
Um die Möglichkeit nicht-spezifischer Primeranlagerungsereignisse zu verringern, gibt die Erfindung ein Blockierungs-Oligonucleotid an, das mit den nicht-spezifischen Ausgangssequenzen um die Hybridisierung mit dem Primer konkurriert. Ein Blockierungs- Oligonucleotid dieser Erfindung ist "nicht in der Lage, als Primer für die Polymerase zu agieren", das heißt, es kann nicht als Startpunkt für die Verlängerungsproduktsynthese agieren. Ein Blockierungs-Oligonucleotid kann unfähig zum Agieren als Primer für eine Verlängerungsproduktsynthese durch Entfernen oder Modifizieren der 3'-terminalen Hydroxylgruppe gemacht werden, beispielsweise durch Zugabe eines terminalen 3'-Dideoxynucleotids, 3'-Phosphorylierung, 3'-Aminoterminierung und der Konjugation einer voluminösen Molekülkomponente wie Rhodamin in der Umgebung des 3'-Endes, um die Polymerase an der Katalyse der Verlängerungsreaktion sterisch zu hindern. Typische Bedingungen für die Verlängerungsproduktsynthese sind in den Beispielen angegeben.
Es ist in den meisten Situationen, in denen das 3'-terminale Ende eines Primers hervorragt oder sich über sein Blockierungs-Oligonucleotid hinaus erstreckt, erwünscht, jede unbeabsichtigte Verlängerung des Primers in 5' → 3'-Richtung auszuschließen, wenn er mit seinem Blockierungs-Oligonucleotid in einem "Primer:Oligonucleotid-Doppelstrang" hybridisiert wird. In diesem Zusammenhang sollte betont werden, daß die Bildung eines Primer:Oligonucleotid-Doppelstrangs ein reversibler Prozeß ist. Folglich kann unter geeigneten Bedingungen (zum Beispiel eine Erhöhung der Temperatur, gefolgt durch ein Verringerung der Temperatur) der Doppelstrang mehrmalig dissoziieren und re-assoziieren.
Der Ausdruck "Blockierungs-Oligonucleotid" bezieht sich allgemein auf ein Oligonucleotid, das mit einem Primer hybridisieren kann, um nicht-spezifische Primeranlagerungsereignise zu verhindern. Da ein Blockierungs-Oligonucleotid eine ausreichende Komplementarität zu seinem korrespondierenden Primer aufweist, kann er bei einer geeigneten Konzentration den Primer, der an dem spezifischen Primeranlagerungsereignis nicht beteiligt ist, stabilisieren. Mit "ausreichender Komplementarität" ist gemeint, daß die beiden Sequenzen einen Grad an Nucleotidkomplementarität aufweisen müssen, der für das Stattfinden der Hybridisierung ausreichend ist. Vorzugsweise gibt es ein Blockierungs- Oligonucleotid für jeden Primer am Anfang der Amplifikationreaktion.
Es ist für einen Fachmann verständlich, daß für das Stattfinden der Hybridisierung zwischen zwei Strängen der Komplementaritätsgrad und die Konzentration voneinander abhängige Variablen sind. Folglich kann ein Blockierungs-Oligonucleotid vollständig komplementär zu seinem korrespondieren Primer oder alternativ unvollständig komplementär zu dem Primer sein, vorausgesetzt, daß das Blockierungs-Oligonucleotid in einer ausreichenden Konzentration vorliegt, um das Binden des Primers an die nicht-spezifischen Sequenzen zu verhindern. Im allgemeinen ist eine Nukleinsäureprobe doppelsträngig. Es ist deshalb notwendig, die Stränge vor der Verlängerungsproduktsynthese zu trennen. In den unten angegebenen Beispielen wurde Wärmedenaturierung verwendet, um die Stränge der Nukleinsäureprobe zu trennen. Es sind jedoch alternative Mittel in der Technik zum Trennen von Nukleinsäuresträngen bekannt, die enzymatische Mittel wie RecBCD-Helicase einschließen. Siehe Muskavitch et al. (1981, Enzyme 14: 233). Der Primer und sein Blockierungs- Oligonucleotid können als Doppelstrang oder als zwei getrennte Dinge zu der Nukleinsäureprobe gegeben werden. Wenn ein Primer und sein Blockierungs-Oligonucleotid als Doppelstrang zugegeben werden, werden die Schritte, die unternommen werden, um die Denaturierung der Nukleinsäureprobe zu bewirken, den Primer:Blockierungs-Oligonucleotid- Doppelstrang gleichfalls in seine jeweiligen Stränge trennen.
Im Anschluß an die Strangtrennung wird das Reaktionsgemisch geeigneten Hybridisierungsbedingungen unterworfen, um die Hybridisierung jedes Primers mit seiner Anfangssequenz der Matrix, um einen Primer:Matrix-Komplex zu bilden, oder mit einem Blockierungs-Oligonucleotid, um einen Primer:Blockierungs-Oligonucleotid-Doppelstrang zu bilden, zu erhöhen. Geeignete Hybridisierungsbedingungen sind in der Technik allgemein bekannt, wobei einige von ihnen in den nachstehenden Beispielen gefunden werden können. Wenn die Primer mit den Anfangssequenzen der Matrix hybridisiert sind, wird das Reaktionsgemisch geeigneten Verlängerungsreaktionsbedingungen unterworfen, damit die Primer als Startpunkte einer Wachstumsreaktion, das heißt einer Polymerisierungsreaktion agieren können. Es ist nicht erforderlich, daß die Hybridisierung der Primer mit der Matrix und die Verlängerung der Primer in zwei getrennten Reaktionen vonstatten geht. Folglich können Hybridisierung und Verlängerung gleichzeitig durch Kombinieren der Bedingungen, die für die Hybridisierung erforderlich sind, mit denen, die für die Verlängerung erforderlich sind, durchgeführt werden. Geeignete Verlängerungsreaktionsbedingungen, die in der Technik allgemein bekannt sind, sind Kontrollbedingungen (zum Beispiel Temperatur, pH oder lonenstärke) zum Einleiten der Synthese eines Verlängerungsproduktes am 3'-Ende eines Primers, der mit einer Nukleinsäurematrix nach Zugabe von Nucleotiden in der Gegenwart eines Katalysators, zum Beispiel DNA-Polymerase, hybridisierte. Typische Bedingungen für die Verlängerungsreaktion sind ebenfalls in den nachstehenden Beispielen angegeben. Der Katalysator für die Verlängerungsreaktion ist im allgemeinen eine DNA-Polymerase, zum Beispiel eine thermostabile Polymerase wie Thermus aquaticus oder Thermus thermophilus (Kong et al., J. Biol. Chem. (1993) 268: 1965). Für die Praxis dieser Erfindung ist es kritisch, daß die Polymerase in der Lage ist, die Aktivität des Verdrängens eines Oligonucleotids, das mit der Matrix "stromabwärts" von der Sequenz hybridisiert, an der ein Primer hybridisiert wird, zu erfüllen. Unter geeigneten Bedingungen für die Verlängerungsreaktion fährt die Polymerase fort, nach und nach an den 3'-Terminus eines Verlängerungsprimers Nucleotide zu addieren, und verdrängt ein Blockierungs-Oligonucleotid, das, wenn überhaupt, "stromabwärts" zu dem Primer hybridisierte, wodurch ein Verlängerungsprodukt mit einer Sequenz synthetisiert wird, die komplementär zu der Zielsequenz der Matrix ist und die Sequenz des Oligonucleotids umfaßt.
Im Falle einer doppelsträngigen Nukleinsäurematrix werden anfänglich zwei Verlängerungsprodukte synthetisiert, wobei jedes Verlängerungsprodukt mit einem Strang der Zielsequenz korrespondiert. Das neu synthetisierte Verlängerungsprodukt stellt nicht nur ein Duplikat der Zielsequenz dar, sondern enthält auch die Primersequenz, die eine Strecke einer nicht benachbarten Sequenz enthalten kann oder nicht. Die neu synthetisierten Verlängerungsprodukte werden dann von dem Ausgangsmatrixstrang getrennt und als folgende Matrizen für die Synthese zusätzlicher Verlängerungsprodukte verwendet. Danach wird das Segment eines Primers, das nicht benachbart zu der Anfangssequenz der Ausgangsmatrix ist, wenn überhaupt, dupliziert und in das Verlängerungsprodukt integriert. Es ist zu beachten, daß jedes Verlängerungsprodukt, das dann als Matrix in der folgenden Verlängerungsreaktion verwendet werden kann, aus zwei kovalent gebundenen Teilen besteht: (i) dem gesamten Primer, einschließlich eines nicht benachbarten Segmentes, wenn überhaupt, und (ii) der amplifizierten Nukleinsäuresequenz, die komplementär zu einem Strang der Zielsequenz ist. Die Vollendung der Strangtrennung, Hybridisierung und Verlängerung/Verdrängung bildet einen Zyklus einer Amplifikationsreaktion. Folglich erhöht sich die Konzentration des Verlängerungsproduktes mit exponentieller Größenordnung mit der Vollendung der wachsenden Amplifikationszyklen.
In einer bevorzugten Ausführung werden sowohl ein Primer als auch sein Blockierungs- Oligonucleotid jeweils mit beispielsweise einem Donorfluorophor bzw. einem Akzeptorfluorophor markiert, die in nächste Nähe durch Hybridisierung gebrachten wurden, um einen Resonanzenergieübergang zu ermöglichen. Wenn die Verlängerung fortschreitet, verringert sich das Verfügbarkeit des markierten Primers aufgrund seines Einbaus in das Verlängerungsprodukt. Diese verringert die Menge des markierten Primers, der für die Hybridisierung mit dem markierten Oligonucleotid verfügbar ist. Wenn die Verlängerung in sich wiederholenden Zyklen fortschreitet, werden nicht-markierte Verlängerungsprodukte hergestellt, die in der Lage sind, an den Primer zu binden, und mit dem markierten Blockierungs- Oligonucleotid um die Hybridisierung mit dem markierten Primer konkurrieren. Folglich spielen die Blockierungs-Oligonucleotide eine doppelte Rolle: (1) als Blockierungsmoleküle zum Beseitigung oder Verringerung nicht-spezifischer Primeranlagerungsereignisse und (2) als Signalsonden, die am Detektionsverfahren beteiligt sind.
Wenn Fluorophore in der Praxis dieser Erfindung verwendet werden, werden zwei Fluorophore, ein Donor und ein Akzeptor, an dem Blockierungs-Oligonucleotid und seinem korrespondieren Primer befestigt, so daß sie in einem resonanten Energieübergangsabstand voneinander sind, wenn das Blockierungs-Oligonucleotid und der Primer aneinander in Form eines Doppelstrangs hybridisiert werden. Die Fluorophore sind vorzugsweise um mindestens ein Nukleotid voneinander getrennt, aber nicht mehr als 100 Å (Clegg, Methods in Enzymology 211: 353). Es ist auch bevorzugt, daß die Fluorophore an inneren Nucleotiden befestigt werden. Wenn gewünscht, können mehr als zwei Fluorophore verwendet werden. Es ist anzumerken, daß die Fluorophore dieselben oder unterschiedlich sein können. Die Überlagerung des Emissionsspektrums des Donorfluorophors und des Anregungsspektrums des Akzeptorfluorophors ermöglichen den Energieübergang zwischen diesen. Dementsprechend wird eine Änderung des Signals aufgrund der Zerstörung des Energieübergangs erzeugt, wenn ein Primer:Oligonucleotid-Doppelstrang beispielsweise während der Verlängerungsreaktion, denaturiert oder dissoziiert.
Wenn gewünscht kann eine Fluorophor-markiertes Blockierungs-Oligonucleotid, das weder im wesentlichen komplementär (das heißt eine Komplementarität von mindestens 5 Basenpaarungen) zu einem Primer noch zu der Zielsequenz ist, zuerst hergestellt werden. Ein "universeller Detektionsdoppelstrang" wird aus dem Blockierungs-Oligonucleotid und einem zweiten Fluorophor-markierten Oligonucleotid hergestellt, in dem das Blockierungs- Oligonucleotid komplementär zu dem zweiten Oligonucleotid ist und dessen 3'-Ende überragt. Vor dem Hinzufügen eines spezifischen Primers zu der Ausgangsmatrix für die Verlängerungsreaktion wird das Blockierungs-Oligonucleotid zu der Primer-Komplementarität durch ein Ligationsverfahren gebracht, worin das 3'-Ende des zweiten Oligonucleotids kovalent an dem 5'-Ende des Primers befestigt wird. Andersgesagt wird der Ausdruck "universeller Detektionsdoppelstrang" verwendet, um ein Oligonucleotid zu beschreiben, das zwischen einem Blockierungs-Oligonucleotid und seinem komplementären Oligonucleotid gebildet ist, und das nicht als Primer dient. Aus naheliegenden Gründen müssen die beiden (oder mehr) Fluorophore des universellen Detektionsdoppelstrangs in nächster Nähe sein. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind ein Donorfluorophor und Akzeptorfluorophor an den jeweiligen Oligonucleotiden eines universellen Detektionsdoppelstrangs mit schwacher Stabilität befestigt, und folglich ergibt die Ligation des Primers an dem Doppelstrang einen stabileren Doppelstrang-Primer. Im Ergebnis wird die Energieübergangseffizienz zwischen den beiden Fluorophoren verbessert.
Im Gegensatz zum universellen Detektionsdoppelstrang ist ein "spezifischer Detektionsdoppelstrang" bereit zur Verwendung bei der Amplifikation/Detektion einer Zielnukleinsäure. Siehe Fig. 1. Der volle Kreis und das volle Quadrat stehen für zwei Fluorophore, und der hohle Kreis steht für ein gehindertes 3'-Ende des Blockierungs-Oligonucleotids. Es ist zu beachten, daß bei der in Fig. 1 gezeigten Ausführungsform der markierte Primer ein nichtbenachbartes Segment zu seiner Anfangssequenz enthält. Weiterhin wird eine präasymmetrische Amplifikation, die vorzugsweise den Strang amplifiziert, an den der markierte Primer bindet, durchgeführt, um die Empfindlichkeit zu verbessern. Eine asymmetrische Reaktion kann durch Bereitstellen einer ungleichen Menge der Primer, das heißt eines überschüssigen und eines begrenzenden, oder durch Bereitstellen von Primern mit ungleicher Länge in der Komplementarität zu der spezifischen Anfangssequenz eingeleitet werden. Weitere Faktoren können zu der asymmetrischen Natur der Amplifikation beitragen, wie beispielsweise der Unterschied im Verhältnis bei der Synthese jedes Matrixstrangs. Das optimale Primerverhältnis für die asymmetrische Amplifikation ist ein empirisch zu bestimmender Faktor (Shyamala et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 1602).
Eine andere Art eines "spezifischen Detektionsdoppelstrangs" wird in dem in Fig. 2 gezeigten Verfahren verwendet. In dieser Ausführungsform werden zwei unmarkierte spezifische Detektionsdoppelstränge (das heißt zwei Blockierungs-Oligonucleotid:Primer-Paare) verwendet. Kein Primer besitzt ein nicht-benachbartes Segment zu seiner Anfangssequenz. Wiederum steht jeder hohle Kreis für ein gehindertes 3'-Ende eines Blockierungs- Oligonucleotids. Von Bedeutung ist, daß das wichtige Verfahren des Verdrängens stromabwärtiger Blockierungs-Oligonucleotide in dieser Figur dargestellt wird, was nicht in Fig. 1 gezeigt ist.
Das Verfahren dieser Erfindung kann in einer Vorrichtung zum gleichzeitigen Ausführen der Amplifikation einer Nukleinsäurematrix und Detektieren des Vorhandenseins des amplifizierten Ziels ohne Durchführen eines Trennungsschrittes durchgeführt werden. Die Vorrichtung umfaßt (1) einen Oligonucleotid-Behälter zur Aufnahme der Oligonucleotide, (2) ein Reaktionsgefäß zur Aufnahme einer Nukleinsäureprobe, wobei das Gefäß bei Betrieb mit dem Oligonucleotid-Behälter verbunden wird, um den automatisierten Transport der Inhalte des Oligonucleotid-Behälters in das Reaktionsgefäß zuzulassen; (3) eine Steuereinheit zum Mischen der Oligonucleotide und der Probe; (4) einen Temperaturregler zur Regelung der Temperatur des Reaktionsgefäßes; (5) eine Strahlungsquelle und (6) einen Detektor zum Detektieren von Strahlung, die von dem Reaktionsgefäß emittiert wird. Vorzugsweise ist das Reaktionsgefäß ein Loch in einer Mikrotiterplate mit mehreren Löchern. Im allgemeinen ist die Strahlungsquelle ein Gerät, das Photonen mit einer gewünschten Wellenlänge erzeugen kann. Ein derartiges Gerät ist dem Fachmann allgemein bekannt und sogar kommerziell erhältlich (zum Beispiel Wolframlampen oder Ionisierungslaserlampen). Der Detektor ist ein Gerät, das Photonenenergie in ein elektrisches Signal umwandeln kann. Ein derartiges Gerät ist wiederum dem Fachmann allgemein bekannt und kann von zahlreichen Lieferfirmen erhalten werden. Beispiele schließen Photomultiplier und Photonendetektoren auf Halbleiterbasis ein.
Es ist besonders bevorzugt, daß die Vorrichtung weiterhin einen Datenprozessor aufweist, um die von dem Detektor empfangenen Signaldaten zu verarbeiten. Die Vorrichtung kann einen Kontrollmechanismus einschließen, der die Amplifikationsreaktion beendet, wenn ein vorherbestimmtes Strahlungsniveau, das einem vorher gewählten Amplifizierungsgrad entspricht, durch den Detektor detektiert wird. Auf diese Weise kann eine Vorrichtung für die "Online"-Überwachung der Amplifikationsreaktion in einer Weise sorgen, die anlog zu der Online-Überwachung von Fermentationsprodukten ist, die für großtechnische Rekombinationsproteinsynthesen verwendet wird. Dementsprechend beseitigt die Verwendung des homogenen Amplifikations- und Detektionsverfahrens in Verbindung mit der hierin offenbarten Vorrichtung Kontaminationen des Reaktionsgefäßes, indem die Notwendigkeit, aus dem Gemisch Proben zu entnehmen, um den Grad zu bestimmen, mit der die Zielsequenzamplifikation erfolgt ist, beseitigt wird.
Ohne weitere Entwicklung wird angenommen, daß ein Fachmann, basierend auf dieser Beschreibung, die vorliegenden Erfindung in ihren weitesten Umfang verwenden kann. Die folgenden speziellen Beispiele sind deshalb nur zur Veranschaulichung und nicht zur Beschränkung des Restes der Offenbarung in irgendeiner Weise angegeben.

Beispiel I: Wirkung eines Blockierungs-Oligonucleotids auf die Verringerung nichtspezifischer Primeranlagerungsereignisse

Um die Wirkung eines Blockierungs-Oligonucleotids auf die Primeranlagerungseffizienz zu veranschaulichen, wurde ein 127 Basenpaare umfassendes Segment des menschlichen SRY- Gens (Sinclair et al., 1990, Nature 346: 240) in der Gegenwart oder in der Abwesenheit eines Blockierungs-Oligonucleotids amplifiziert. Die Sequenz der das Ziel bestimmenden Primer sind Primer (A) 5'-AACTC AGAGA TCAGC AAGCA GCTGG GATAC-3' und Primer (B) 5'-ACTTA TAATTTR CGGGT ATTTC TTRCTCT GTGCA-3'. Jedes TTR steht für einen Texas Red-konjugierten Amino-C6-dT-Rest (Glenn Research, Sterling, VA) und wurde mit Primer (B) konjugiert, wobei den von der Lieferfirma (Molecular Probes, Inc. Eugene, Or. USA) gefolgt wurde. Das verwendete Blockierungs-Oligonucleotid ist komplementär zu 24 Basen des Primers (A) und hat eine Sequenz von 5'-CAGCT GCTTG CTGAT CTCTG AGTTL-3', in der "L" eine 3'-Amintermination ist (3'-Amine-ON CPG, Clontech, Palo Alto, CA).
Alle Oligonucleotide wurden durch Operon Technologies, Inc. (Alameda, CA) synthetisiert und anschließend durch Elektrophorese auf einem 8 M Harnstoff/15% Acrylamid-Gel gereinigt. Die spezifischen Banden der Oligonucleotide wurden elektrophoretisch eluiert und durch die UV-Extinktion bei 260 nm quantifiziert.
Männliche, menschliche genomische DNA, die als Ziel-DNA verwendet wurde, wurde aus Vollblut durch das DTAB/CTAB-Verfahren (Gustinicich et al., 1991, Biotechniques 11: 298) extrahiert, durch die 260 nm-UV-Extinktion quantifiziert und nacheinander in TE- Puffer (10 mM Tris-HCl und 1 mM EDTA, pH 8,0) mit 50 ng/ul Hefe-tRNA als Träger verdünnt.
Die Amplifikation wurde in einer Polycarbonat-Mikrotiterplatte mit 96 Löchern (Costar, Cambridge, MA) unter Verwendung einer AG-9600 Thermal Station (MJ Research, Watertown, MA) durchgeführt. Zu einer 10 ul Reaktion von 50 mM Tris-HCl, pH 8,7, 40 mM KCl, 5 mM NH&sub4;Cl, 2 mM DTT, 0,1% Triton X-100, 100 uM dNTP mit 0,3 Einheiten von Tth-DNA-Polymerase (Carballeira et al., 1990, Biotechniques 9: 276-281) und unterschiedlichen Mengen der Ziel-DNA (10², 10³ und 10&sup4;) wurden 30 ng von jedem der Primer mit oder ohne eine entsprechende Menge an Blockierungs-Oligonucleotid zugegeben. Sowohl Hefe-tRNA als auch Lachssperma-DNA wurden als negative Kontrollen verwendet. Insgesamt 35 Wärmezyklen (94ºC für 25 Sekunden, 60ºC für 20 Sekunden und 72ºC für 40 Sekunden) wurden durchgeführt, bevor die Proben auf einem 9% Acrylamid-Gel, das in TBE-Puffer bei 10 V/cm elektrophoresziert wurde, analysierte wurden. Die für die Gelelektrophorese verwendeten Molekülmarkierungssubstanz war der HpaII-Abbau von pBR322-DNA. Das Gel wurde dann kurz mit Ethidiumbromid gefärbt und unter UV- Beleuchtung photographiert. Die Photographie ist in Fig. 3 gezeigt.
Mit bezug auf Fig. 3 wird der Inhalt jeder Bahn des Gels gezeigt, wobei tRNA für Hefe- Transfer-RNA, SS für Lachssperma-DNA, M für die Molekulargrößen- Markierungssusbstanz und die Zahlen für die Menge der Zielmoleküle stehen. Das Symbol "-" oder "+" stellt die Abwesenheit oder Gegenwart des Blockierungs-Oligonucleotids dar. Die Intensität der spezifischen SRY-Sequenz mit 127 Basenpaaren war markanter bei Reaktionen in Gegenwart des Blockierungs-Oligonucleotids, um so mehr bei geringeren Zieldosierungen. Im Gegensatz dazu war die Intensität des Primerdimers weniger sichtbar bei Reaktionen in der Abwesenheit des Blockierungs-Oligonucleotids. Die Amplifikationseffizienz einer spezifischen Zielsequenz wurde deshalb direkt durch den Umfang der Wechselwirkung von nicht-spezifischen Primeranlagerungsereignissen wie Primerdimer-Bildung, die signifikant in Reaktionen ohne Blockierungs-Oligonucleotide reichlicher war, beeinflußt.

Beispiel 11: Verwendung eines Fluorophor-markierten Blockierungs-Oligonucleotids, um die Amplifikation einer Zielnukleinsäure zu überwachen

Diese Beispiel veranschaulicht, daß ein Blockierungs-Oligonucleotid nicht nur die nichtspezifische Primeranlagerung reduzieren kann, sondern, wenn es mit einem Fluorophor markiert ist, auch verwendet werden kann, um den Amplifikationsprozeß zu überwachen. Die Ziel-DNA, das Blockierungs-Oligonucleotid und die Primer, die in diesem Beispiel verwendet werden, sind im wesentlichen dieselben wie die Beispiel I verwendeten, außer daß eine Indikatorsonde, die zu 20 Basen des Primers (B) komplementär ist und die Sequenz 5'-AGAGA GAAAT ACCCG AATTAL-3' hat, enthalten war, um an dem Fluorszenzenergieübergang mit Primer (B) teilzunehmen. "L" bezeichnet eine 3'-Amintermination (3'- Amine-ON CPG, Clontech, Falo Alto, CA). Nach der Reinigung wurde die Indikatorsonde weiterhin mit Fluorescein konjugiert, wobei den von der Lieferfirma (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR. USA) vorgeschlagenen Verfahrensweisen gefolgt wurde.
Die Amplifikation wurde in einer Polycarbonat-Mikrotiterplatte mit 96 Löchern (Techne Inc., Cambridge, England) unter Verwendung eines MW-1-Thermocyclers (Techne Inc., Cambridge, England) durchgeführt. Zu einer 20 ul Reaktion von 50 mM Tris-HCl, pH 8,7, 40 mM KCl, 5 mM NH&sub4;Cl, 2 mM DTT, 0,1% Triton X-100, 100 uM dNTP mit 0,6 Einheiten von Tth-DNA-Polymerase und 10² Kopien der Ziel-DNA wurden 20 ng von jedem der Primer mit oder ohne eine entsprechende Menge an Blockierungs-Oligonucleotid zugegeben. Lachssperma-DNA wurde als negative Kontrollen verwendet. Insgesamt 24 Wärmezyklen (96ºC für 42 Sekunden, 53ºC für 42 Sekunden und 72ºC für 60 Sekunden) wurden durchgeführt, bevor die Indikatorsonde zu jeder Reaktion gegeben wurde. Der 630 nm- Ausgangsfluoreszenzwert für jede Reaktion wurde bei Zyklus 25 unter Verwendung eines Mikroplatten-Fluorimeters (Modell 7600, Cambridge Technologies, Inc., Watertown, MA, USA) genommen. Folgende Werte wurden bei Zyklus 30 und Zyklus 35 genommen. Die Fluoreszenz-Anzeigen wurden aufgezeichnet und sind in Fig. 4 dargestellt.
Das Balkendiagramm in Fig. 4 veranschaulicht den Umfang der Fluoreszenzsignaländerung bei zwei verschiedenen Zyklen der Amplifikation, die mit oder ohne die anfängliche Zugabe des Blockierungs-Oligonucleotids durchgeführt wurde. Die Abnahme des Fluoreszenzsignals ist ein Anzeichen der Dissoziation des Primer:Blockierungs-Oligonucleotid- Doppelstrangs, der, beim Fehlen nicht-spezifischer Primeranlagerungsereignisse, proportional zum Umfang des Primereinbaus in die amplifizierte Zielsequenz ist. Eine Reaktion ohne Tth-DNA-Polymerase wurde als Kontrolle des Fluoreszenzsignals verwendet (als "keine Amp." gekennzeichnet). Proben, die 10² Kopien SRY-Sequenz und Lachssperma-DNA enthielten, wurden parallel zum Beobachten der Ziel-spezifischen und -nicht-spezifischen Signale untersucht. Wie in der Figur gezeigt, verringerte in der letzen Amplifikationsphase (Zyklus 35) die Gegenwart des Blockierungs-Oligonucleotids nicht-spezifische Primeranlagerungsereignisse, wie durch die Differenz bei der Fluoreszenzänderung zwischen den beiden Lachssperma-DNA-Kontrollen, in den das Blockierungs-Oligonucleotid fehlte bzw. vorhanden war, offensichtlich ist.

Beispiel III: Erhöhung des Energieübergangs durch Ligation eines universellen Detektionsdoppelstrangs mit einem Primer

In diesem Beispiel wurden zwei Gruppen von universellen Oligonucleotiden verwendet, um die Energieübergangserhöhung zu veranschaulichen, die durch einen Ligationsprozeß induziert wird, in dem das komplementäre Oligonucleotid an einen Primer mit seinem Blockierungs; Oligonucleotid als Matrix ligiert wird
Alle Oligonucleotide wurden nach dem in den vorherigen Beispielen beschriebenen Verfahrensweisen synthetisiert, gereinigt und mit Fluorophoren konjugiert. Für die Ligationsreaktion wurden 200 ng des Blockierungs-Oligonucleotids zusammen mit gleichen molaren Mengen seines komplementären Oligonucleotids und eines Primers zu 20 ul Reaktionsgemisch, das 0,15 Einheiten T4-DNA-Ligase (New England Biolab, Beverly, MA), 0,5 Einheiten T4-Polynucleotid-Kinase (New England Biolab, Beverly, MA), 1 mM ATP und Puffer (70 mM Tris-HCL, pH = 7,6, 10 mM MgCl&sub2; und 5 mM DTT) enthielt, gegeben. Die Ligationsreaktionen wurden doppelt durch Inkubieren bei 40ºC für eine Stunde und 30 Minuten durchgeführt, und die Reaktion wurde durch 10 Minuten Erwärmen auf 95ºC beendet. Sowohl vor als auch nach jeder Reaktion wurde ein Aliquot des Reaktionsgemisches hinsichtlich seiner Fluoreszenzintensität bei Emissionen von 630 nm mit 495 nm Anregung gemessen.
Gruppe A: Das Blockierungs-Oligonucleotid hat eine Sequenz von 5'-TTRTTTT GAACA GGCCT TGTTRG-3', sein komplementäres Oligonucleotid eine Sequenz von 5'-GAAGG CCTFG-3' und der Primer eine Sequenz von 5'-TTCAA ACCTG TGCTT AGGGC ACTG-3', wobei die zu der Anfangssequenz komplementären Basen unterstrichen sind. TTR steht für einen Texas Red-konjugierten Amino-C6-dT-Rest und TF für einen Fluoresceinkonjugierten Amino-C6-dT-Rest. Zu deren Befestigung an der Oligonucleotiden siehe Beispiele I und II oben.
Der Fluoreszenzwert des Reaktionsgemisches vor der Ligation war 900 ± 23 und der Wert nach der Ligation 1336 + 211. Folglich war der Ligations-induzierte Energieübergang in Gruppe A das 1,48-fache.
Gruppe B: Das Blockierungs-Oligonucleotid hat eine Sequenz von 5'-TTRTGGT CTCGA CCTCC TTGTTRG-3'; sein komplementäres Oligonucleotid eine Sequenz von 5'-CAAGG AGGTFC G-3' und der Primer eine Sequenz von 5'-AGACC ACCTG TGCTT AGGGC ACTG-3', wobei die zu der Anfangssequenz komplementären Basen unterstrichen sind.
Der Fluoreszenzwert des Reaktionsgemisches vor der Ligation war 1489 + 58 und der Wert nach der Ligation 3019 ± 94. Folglich war der Ligations-induzierte Energieübergang in Gruppe B das 2,03-fache.

Beispiel IV: Anwendung eines Detektionsdoppelstrangs, um die asymmetrische Amplifikation einer Zielnukleinsäure zu überwachen.

Um die Anwendung eines Detektionsdoppelstrangs zu demonstrieren, verwendeten wir entweder (A) einen Primer:Blockierungs-Oligonucleotid-Doppelstrang oder (B) einen universellen Detektionsdoppelstrang, der an einen Primer gekoppelt ist, um den Amplifiaktionsprozeß zu überwachen. Bei Doppelstrang (A) ist das Blockierungs-Oligonucleotid komplementär sowohl zu dem Primer aus auch der Ausgangszielsequenz. Bei Doppelstrang (B) wurde der Primer an das komplementäre Oligonucleotid des Blockierungs-Oligonucleotids ligiert, um die Herstellung der Komplementarität zwischen dem Primer und dem Blockierungs-Oligonucleotid zu ermöglichen. Sowohl Doppelstrang (A) als auch (B) wurden bei den gleichen Amplifikationsreaktionen verwendet. Segmente einer dem Bruchpunkt menschlicher akuter myeloischer Leukemie verwandte Sequenz (AML-1) und für menschliche X-Chromosomen spezifisches Ameloginen (AMG-X) wurden als Amplifikationsziele verwendet, um die Anwendung zu veranschaulichen.

Herstellung des Primer:Blockierungs-Oligonucleotid-Doppelstrangs

Doppelstrang (A): Die Sequenzen des für AML-1 verwendeten Primers und Blockierungs- Oligonucleotids sind 5'-ACGGG GATAC GCATC ACAAC AA-3' bzw. 5'-TTGAT GCGTA TCCCC GTTT-3' und die für AMG-X verwendeten 5'-AGACT GAGTC AGAGT GGCCA GGC-3' bzw. 5'-TCCAC TCTGA CTCAG TCTTA-3'. Die Primer und Blockierungs-Oligonucleotide waren mit Florescein bzw. Texas Red an den unterstrichenen Positionen konjugiert. Die 3'-Termini der Blockierungs-Oligonucleotide waren unfähig zur Verlängerung durch 3'-Dideoxy-Termination.
Doppelstrang (B): Der Primer für AML-1 hat eine Sequenz von 5'-GGGAC GCACG GGGAA ACGCA TCACA ACAA-3' und der Primer für AMG-X eine Sequenz von 5'-GGGAC GCAGA CTGAG TCAGA GTGGC CAGGC-3'. Jeder Primer wurde mit einem Detektionsdoppelstrang, ähnlich dem in Beispiel III gezeigten, ligiert. Die Erhöhung des Energieübergangs für den AML-1-Primer und den AMG-X-Primer war das 2,62 bzw. 2,42-fache nach der Ligation.

Asymmetrische Amplifikation und Detektion

Für das AML-1-Ziel ist der überschüssige Primer 5'-TGTTT GCAGG GTCCT AACTC AATCG-3', der begrenzende Primer ist 5'-GCGGC GTGAA GCGGC GGCTC G-3'; und für das AMG-X-Ziel ist der überschüssige Primer 5'-TGATG GTTGG CCTCA AGCCT GTG-3', der begrenzende Primer ist S'-TGGGA TAGAA CCAAG CTGGT CAG-3'.
Männliche menschliche genomische DNA wurde als Ziel aus Vollblut mittels Verfahren gemäß Beispiel I extrahiert.
Die Zielsequenzen wurden für 20 Zyklen asymmetrisch amplifiziert, bevor der Primerdoppelstrang zugegeben wurde. Die asymmetrische Amplifikation wurde mit einem Verhältnis überschüssiger Primer zu begrenzenden Primer von 7,5 (1,2 uM gegenüber 0,16 uM) in einer 10 ul Reaktion durchgeführt, die 1 Einheit Tth-DNA-Polymerase, 50 mM Tris-HCl, 40 mM KCl, 5 mM NH&sub4;Cl, 100 uM dNTP, 5 mM MgCl&sub2;, 0,1% Triton X-100 enthielt. Die Zyklusbedingungen waren dieselben wie die in Beispiel I verwendeten. Die Reaktionen wurden in einer Polycarbonat-Mikrotiterplatte mit 96 Löchern (Costar, Cambridge, MA) an einer AG-9600 Silver Block Thermal Station (MJ Research, Watertown, MA) durchgeführt. 4 ng von jedem der Primerdoppelstränge wurden in die Reaktionslöcher bei Raumtemperatur gegeben, um gleichzeitig Amplifikation und Signaldetektion zu initiieren. Als Kalibrierungsgrundlinie wurde die 630 nm-Anfangsfluoreszenzemission bei Zyklus 21 unter Verwendung einer Anregung von 485 nm gemessen. Folgende Signalmessungen wurden bei Zyklus 26 und jedem weiteren Zyklus danach durchgeführt.
Die aus der Detektion bei Zyklus 30 gewonnen Ergebnisse sind in Fig. 5 veranschaulicht, die die quantitative Auflösung und Detektionsempfindlichkeit durch Doppelstrang (A) und (B) zeigt. Wie in der Figur gezeigt spiegelt die Abnahme der Fluoreszenzintensität die Ausgangszieldosen wider.

Claims

1. Ein Verfahren zur Detektion einer gezielten Nukleinsäure, welches die folgenden Schritte enthält:

Amplifizieren der gezielten Nukleinsäure, um ein Amplifikations-Produkt zu erhalten unter Verwendung einer Polymerase, eines ersten Primers mit oder ohne einem nicht benachbarten Segment zu einer ersten Anfangssequenz, und eines zweiten Primers mit oder ohne einem nicht benachbarten Segment zu einer zweiten Anfangssequenz in Gegenwart eines Oligonucleotides, welches nicht in der Lage ist, als Primer für die Polymerase zu agieren, wobei das Oligonucleotid mindestens 5 aufeinanderfolgende Nucleotide hat, die vollständig komplementär zu mindestens 5 aufeinanderfolgenden Nucleotiden des ersten Primers sind; und

die Detektion des Vorhandenseins der gezielten Nukleinsäure durch das Überwachen der Amplifikation.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Primer ein nicht benachbartes Segment zu der ersten Anfangssequenz enthält.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligonucleotid mindestens 5 aufeinanderfolgende Nucleotide enthält, die vollständig komplementär zu mindestens 5 aufeinanderfolgenden Nucleotiden in dem nicht benachbarten Segment des ersten Primers sind.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Primer kein Segment enthält, das nicht benachbart zu der ersten Anfangssequenz ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der amplifizierende Schritt in Anwesenheit eines zusätzlichen Oligonucleotides ausgeführt wird, welches nicht in der Lage ist, als Primer für die Polymerase zu agieren, wobei das zusätzliche Oligonucleotid mindestens 5 aufeinanderfolgende Nucleotide hat, die vollständig komplementär zu mindestens 5 aufeinanderfolgenden Nucleotiden des zweiten Primers sind.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Primer, der zweite Primer und das Oligonucleotid jeweils 10 bis 50 Nucleotide enthalten.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Primer, der zweite Primer und das Oligonucleotid jeweils 15 bis 40 Nucleotide enthalten.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligonucleotid mindestens acht aufeinanderfolgende Nucleotide hat, die vollständig komplementär zu mindestens acht aufeinanderfolgenden Nucleotiden des ersten Primers sind.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Oligonucleotides 0,3 bis 5,0 mal der des entsprechenden Primers entspricht.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Oligonucleotides 0,5 bis 2,5 mal der des entsprechenden Primers entspricht.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektionsschritt mittels Überwachung des Amplifikationsproduktes der gezielten Nukleinsäure auf einem Gel nach der Elektrophorese ausgeführt wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass ein erster Fluorophor kovalent an den ersten Primer gebunden ist, und ein zweiter Fluorophor kovalent an das Oligonucleotid gebunden ist, wobei der eine der beiden Fluorophore ein Donorfluorophor und der andere ein Acceptorfluorophor ist, so dass, wenn der erste Primer und das Oligonucleotid hybridisiert werden, der Donorfluorophor und der Acceptorfluorophor in unmittelbarer Nähe zueinander angeordnet sind, um einen Resonanzenergieübergang zwischen den beiden zu ermöglichen; und daß ferner der Detektionsschritt durch Überwachung des Fluoreszens-Emissions- Wechsels des Acceptorfluorophors bei der Abstrahlung an den Donorfluorophor mit einem Anregungslicht ausgeführt wird, wobei dieser Wechsel eine Funktion des Umfangs des ersten Primers ist, von dem das Oligonucleotid dissoziert ist und in dem Amplifikationsprodukt an der gezielten Nukleinsäure eingelagert ist.

13. Kit für die Detektion einer gezielten Nukleinsäure, worin das Kit umfasst:

Einen ersten Primer mit oder ohne einem nicht benachbarten Segment zu einer ersten Anfangssequenz, und einen zweiten Primer mit oder ohne einem nicht benachbarten Segment zu einer zweiten Anfangssequenz, wobei der erste und zweite Primer mit einer Polymerase für die Amplifikation der gezielten Nukleinsäure verwendet werden; und ein Oligonucleotid, welches nicht in der Lage ist, als Primer für die Polymerase zu agieren und mindestens 5 aufeinanderfolgende Nucleotide hat, die vollständig komplementär zu mindestens 5 aufeinanderfolgenden Nucleotiden des ersten Primers sind;

wobei der erste Primer, der zweite Primer und das Oligonucleotid jeweils 10 bis 50 Nucleotide enthalten.

14. Kit gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Primer und das Oligonucleotid als Duplex vorhanden sind.

15. Kit nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligonucleotid mindestens acht aufeinanderfolgende Nucleotide hat, die vollständig komplementär zu mindestens acht aufeinanderfolgenden Nucleotiden des ersten Primers sind.

16. Kit nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Primer, der zweite Primer und das Oligonucleotid jeweils 15 bis 40 Nucleotide enthalten.

17. Kit nach einem der Ansprüche 13 bis 16 dadurch gekennzeichnet, dass weiterhin eine Polymerase enthalten ist.

18. Kit nach einem der Ansprüche 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass weiterhin ein zusätzliches Oligonucleotid vorgesehen ist, welches unfähig ist als Primer für die Polymerase zu agieren, 10 bis 50 Nucleotide enthält und mindestens acht aufeinanderfolgende Nucleotide hat, die zu mindestens acht aufeinanderfolgenden Nucleotiden des zweiten Primers vollständig komplementär sind.

19. Kit nach einem der Ansprüche 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass ein erster Fluorophor kovalent an den ersten Primer gebunden ist und ein zweiter Fluorophor kovalent an das Oligonucleotid gebunden ist, wobei einer der beiden Fluorophore ein Donorfluorophor und der andere ein Acceptorfluorophor ist, so dass, wenn der erste Primer und das Oligonucleotid hybridisiert werden, der Donorfluorophor und der Acceptorfluorophor in unmittelbarer Nähe zueinander angeordnet sind, um einen Resonanzenergieübergang zwischen beiden zu ermöglichen.

20. Kit für die Detektion einer gezielten Nukleinsäure, umfassend:

ein erstes Oligonucleotid, enthaltend 10 bis 50 Nucleotide mit einem ersten kovalent gebundenen Fluorophor, wobei das erste Oligonucleotid nicht in der Lage ist, als Primer zur Verwendung mit einer Polymerase bei der Amplifikation für die gezielte Nukleinsäure zu agieren;

und ein zweites Oligonucleotid, enthaltend 5 bis 30 Nucleotide mit einem zweiten Fluorophor, der daran kovalent gebunden ist, wobei das zweite Oligonucleotid ein freies 3'OH hat und zur Hybridisierung in der Lage ist, über mindestens 5 aufeinanderfolgende vollständig komplementäre Nukleotidpaarbildungen mit dem ersten Oligonucleotid, wobei das erste Oligonucleotid einen Überhang an dem 3'- Ende des zweiten Oligonucleotides von 1 bis 12 Nucleotiden hat, und dass ferner der erste und zweite Fluorophor, von denen einer ein Donorfluorophor und der andere ein Acceptorfluorophor ist, in unmittelbarer Nähe zueinander gebracht werden, wenn das erste Oligonucleotid mit dem zweiten Oligonucleotid hybridisiert, um einen Resonanzenergieübergang zwischen ihnen zu ermöglichen.

21. Kit nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Oligonukleotid 15 bis 40 Nucleotide enthält und einen Überhang an dem 3'-Ende des zweiten Oligonucleotides von 4 bis 8 Nucleotiden hat, und das zweite Oligonucleotid 7 bis 15 Nucleotide enthält und zur Hybridisierung über mindestens 5 aufeinanderfolgende vollständig komplementäre Nucleotidpaare mit dem ersten Oligonucleotid in der Lage ist.

22. Kit nach Anspruch 20 oder Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass das erste und zweite Oligonucleotid als Duplex vorhanden sind.

23. Kit nach einem der Ansprüche 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass weiterhin eine Ligase umfasst ist.

24 Kit nach einem der Ansprüche 20 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass weiterhin eine Kinase oder eine Polymerase mit oder ohne einer 5' - 3' Exonuklease-Aktivität umfasst ist.

25. Kit nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass ferner eine Kinase oder eine Polymerase mit einer 5' - 3' Exonuklease-Aktivität umfasst ist.

26. Ein DNA-Duplex, enthaltend:

ein erstes Oligonucleotid, welches in der Lage ist, als Primer zu agieren, mit oder ohne einem nicht benachbarten Segment zu seiner Anfangssequenz, zur Verwendung mit einer Polymerase in der Amplifikation für eine gezielte Nukleinsäure;

ein zweites Oligonucleotid, welches hybridisiert ist, über mindestens 5 aufeinanderfolgende vollständig komplementäre Nukleotidpaare, wobei das erste Oligonucleotid und das zweite Oligonucleotid nicht in der Lage sind, als Primer für die Polymerase zu agieren; und

einen ersten Fluorophor, der kovalent an das erste Oligonucleotid gebunden ist, und einen zweiten Fluorophor, der kovalent an das zweite Oligonucleotid gebunden ist, wobei der eine der beiden Fluorophore ein Donorfluorophor und der andere ein Acceptorfluorophor ist, so dass, wenn die beiden Fluorophore in unmittelbarer Nähe zueinander angeordnet sind, ein Resonanzenergieübergang zwischen den beiden möglich ist; und wobei das erste Oligonucleotid und das zweite Oligonucleotid jeweils 10 bis 50 Nucleotide enthalten.

27. DNA-Duplex gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Oligonucleotid und das zweite Oligonucleotid jeweils 15 bis 40 Nucleotide enthalten, und dass das zweite Oligonucleotid über mindestens 8 aufeinanderfolgende vollständig komplementäre Nukleotidpaare mit dem ersten Oligonucleotid hybridisiert ist.

28. Zusammensetzung, umfassend ein erstes und zweites Oligonucleotid wie in den Ansprüchen 20 oder 21 definiert;

ein erstes Oligonucleotid, welches nicht in der Lage ist, als Primer für die Verwendung mit einer Polymerase in der Amplifikation für eine gezielte Nukleinsäure zu agieren;

das erste Oligonucleotid ist kovalent an einen Fluorophor gebunden; und

das zweite Oligonucleotid ist an einen zweiten Fluorophor kovalent gebunden, wobei der erste und der zweite Fluorophor, von denen der eine ein Donorfluorophor und der andere ein Acceptorfluorophor ist, in unmittelbarer Nähe zueinander angeordnet sind, um einen Resonanzenergieübergang zwischen ihnen zu ermöglichen.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:

(i) ANMELDER: Wang et al.

(ii) TITEL DER ERFINDUNG: METHODE ZUR DETEKTION EINER GEZIELTEN NUKLEINSÄURE

(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 21

(iv) KORRESPONDENZANSCHRIFT:

(A) ADRESSAT: Fish & Richardson

(B) STRASSE: 225 Franklin Street

(C) STADT: Boston

(D) STAAT: Massachusetts

(E) LAND- U.S.A.

(F) POSTLEITZAHL: 02110-2804

(v) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:

(A) MEDIENTYP: 3,5" Diskette, 1,44 Mb

(B) COMPUTER: IBM PS/2 Modell 50Z oder 55SX

(C) BETRIEBSSYSTEM: MS-DOS (Version 5.0)

(D) SOFTWARE: WordPerfect (Version 5.1)

(vi) AKTUELLE ANMELDUNGSDATEN:

(A) ANMELDUNGSNUMMER:

(B) ANMELDEFATUM: 26.05.94

(C) KLASSIFIKATION:

(vii) FRÜHERE ANMELDUNGSDATEN:

(A) ANMELDUNGSNUMMER: 07/808,463

(B) ANMELDEDATUM: 16. Dezember 1991

(vii) ANWALT/VERTRETER-INFORMATION:

(A) NAME: Y. Rocky Tsao

(B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 34,053

(C) REFERENZ/LISTEN-NUMMER: 06498/002001

(ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION:

(A) TELEFON: (617) 542-5070

(B) TELEFAX: (617) 542-8906

(C) TELEX: 200154

(2) INFORMATION FÜR SEQUENZ-IDENTIFIZIERUNGSNUMMER: 1:

(i) SEQUENZMERKMALE:

(A) LÄNGE: 30

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln

(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:

AACTCAGAGA TCAGCAAGCA GCTGGGATAC 30

(2) INFORMATION FÜR SEQUENZ-IDENTIFIZIERUNGSNUMMER: 2:

(i) SEQUENZMERKMALE:

(A) LÄNGE: 30

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln

(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:

ACTTATAATT CGGGTATTTC TCTCTGTGCA 30

(2) INFORMATION FÜR SEQUENZ-IDENTIFIZIERUNGSNUMMER: 3:

(i) SEQUENZMERKMALE:

(A) LÄNGE: 24

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln

(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:

CAGCTGCTTG CTGATCTCTG AGTT 24

(2) INFORMATION FÜR SEQUENZ-IDENTIFIZIERUNGSNUMMER: 4:

(i) SEQUENZMERKMALE:

(A) LÄNGE: 20

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln

(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:

AGAGAGAAAT ACCCGAATTA 20

(2) INFORMATION FÜR SEQUENZ-IDENTIFIZIERUNGSNUMMER: 5:

(i) SEQUENZMERKMALE:

(A) LÄNGE: 19

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln

(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:

TTTTTGAACA GGCCTTGTG

(2) INFORMATION FÜR SEQUENZ-IDENTIFIZIERUNGSNUMMER: 6:

(i) SEQUENZMERKMALE:

(A) LÄNGE: 24

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln

(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:

TTCAAACCTG TGCTTAGGGC ACTG 24

(2) INFORMATION FÜR SEQUENZ-IDENTIFIZIERUNGSNUMMER: 7:

(i) SEQUENZMERKMALE:

(A) LÄNGE: 20

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln

(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:

TTGGTCTCGA CCTCCTTGTG 20

(2) INFORMATION FÜR SEQUENZ-IDENTIFIZIERUNGSNUMMER: 8:

(i) SEQUENZMERKMALE:

(A) LÄNGE: 11

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln

(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:

CAAGGAGGTC G 11

(2) INFORMATION FÜR SEQUENZ-IDENTIFIZIERUNGSNUMMER: 9:

(i) SEQUENZMERKMALE:

(A) LÄNGE: 24

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln

(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:

GANCCACCTG TGCTTAGGGC ACTG 24

(2) INFORMATION FÜR SEQUENZ-IDENTIFIZIERUNGSNUMMER: 10:

(i) SEQUENZMERKMALE:

(A) LÄNGE: 22

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln

(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:

ACGGGGATAC GCATCACAAC AA 22

(2) INFORMATION FÜR SEQUENZ-IDENTIFIZIERUNGSNUMMER: 11:

(i) SEQUENZMERKMALE:

(A) LÄNGE: 19

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln

(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:

TTGATGCGTA TCCCCGTTT 19

(2) INFORMATION FÜR SEQUENZ-IDENTIFIZIERUNGSNUMMER: 12:

(i) SEQUENZMERKMALE:

(A) LÄNGE: 23

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln

(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:

AGACTGAGTC AGAGTGGCCA GGC 23

(2) NORMATION FÜR FÜR SEQUENZ-IDENTIFIZIERUNGSNUMMER: 13:

(i) SEQUENZMERKMALE:

(A) LÄNGE: 20

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln

(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:

TCCACTCTGA CTCAGTCTTA 20

(2) INFORMATION FÜR SEQUENZ-IDENTIFIZIERUNGSNUMMER: 14:

(i) SEQUENZMERKMALE:

(A) LÄNGE: 29

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln

(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:

GGGACGCACG GGGAAACGCA TCACAACAA 29

(2) INFORMATION FÜR SEQUENZ-IDENTIFIZIERUNGSNUMMER: 15:

(i) SEQUENZMERKMALE:

(A) LÄNGE: 30

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln

(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:

GGGACGCAGA CTGAGTCAGA GTGGCCAGGC 30

(2) INFORMATION FÜR SEQUENZ-IDENTIFIZIERUNGSNUMMER: 16:

(i) SEQUENZMERKMALE:

(A) LÄNGE: 19

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln

(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:

GCGTCCCATC TAGATGGCC 19

(2) INFORMATION FÜR SEQUENZ-IDENTIFIZIERUNGSNUMMER: 17:

(i) SEQUENZMERKMALE:

(A) LÄNGE: 12

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln

(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:

GGCCATCTAG AT 12

(2) INFORMATION FÜR SEQUENZ-IDENTIFIZIERUNGSNUMMER: 18:

(i) SEQUENZMERKMALE:

(A) LÄNGE: 25

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln

(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18:

TGTTTGCAGG GTCCTAACTC AATCG 25

(2) INFORMATION FÜR SEQUENZ-IDENTIFIZIERUNGSNUMMER: 19:

(i) SEQUENZMERKMALE:

(A) LÄNGE: 21

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln

(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 19:

GCGGCGTGAA GCGGCGGCTC G 21

(2) INFORMATION FÜR SEQUENZ-IDENTIFIZIERUNGSNUMMER: 20:

(i) SEQUENZMERKMALE:

(A) LÄNGE: 23

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln

(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 20:

TGATGGTTGG CCTCAAGCCT GTG 23

(2) INFORMATION FÜR SEQUENZ-IDENTIFIZIERUNGSNUMMER: 21:

(i) SEQUENZMERKMALE:

(A) LÄNGE: 23

(B) ART: Nukleinsäure

(C) STRÄNGIGKEIT: einzeln

(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 21:

TGGGATAGAA CCAAGCTGGT CAG 23