DE69427546T2

DE69427546T2 - Biologisch aktive peptide aus funktionellen domänen des baktericiden/die permeabilität erhöhenden proteins und ihre verwendung

Info

Publication number: DE69427546T2
Application number: DE69427546T
Authority: DE
Inventors: G. Little
Original assignee: Xoma Technology Ltd USA
Current assignee: Xoma Technology Ltd USA
Priority date: 1994-01-14
Filing date: 1994-09-15
Publication date: 2002-04-25
Anticipated expiration: 2014-09-16
Also published as: EP0754194B1; EP0754194A1; DE69427546D1; ATE202362T1

Description

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Peptide, die von bakteriziden, die Permeabilität erhöhendem Protein gewonnen sind oder darauf basieren, und therapeutische Verwendung derartige Peptide.
Bakterizides, die Permeabilität erhöhendes Protein (PBI) ist ein Protein, das aus den Granula von polymorphonukleären Neutrophilen von Säugern (PMNs) isoliert ist, welches Blutzellen sind, die für die Verteidigung eines Säugetiers gegen eindringende Mikroorganismen wesentlich sind. Menschliches BPI ist isoliert worden aus PMNs durch Säureextraktion in Verbindung mit entweder Ionenaustauschchromatographie (Elsbach, 1979, J. Biol. Chem. 254; 11000) oder E. coli-Affinitätschromatographie (Weiss et al., 1987, Blood 69: 652) und weist eine potente bakterizide Aktivität gegen ein breites Spektrum von Gram-negativen Bakterien auf. Das Molekulargewicht von menschlichem PBI beträgt etwa 55.000 Dalton (55 kD). Die vollständige Aminosäuresequenz von menschlichem BPI, ebenso wie die Nukleotidsequenz von DNA, die für BPI codiert, ist aufgeklärt worden von Gray et al., 1989. J. Biol. Chem. 264: 9505, welche hierin durch Bezugnahme aufgenommen werden (siehe Fig. 1 in Gray et al.)
Man hat gezeigt, daß die bakterizide Wirkung von BPI hochspezifisch für empfindlich Gramnegative Spezies ist. Der genaue Mechanismus, durch den BPI Gram-negative Bakterien tötet, ist noch nicht bekannt, aber es ist bekannt, daß BPI zuerst an die Oberfläche von empfindlichen Gram-negativen Bakterien binden muß. Das anfängliche Binden von BPI an die Bakterien umfaßt elektrostatische Wechselwirkung zwischen BPI, das ein basisches (d. h. positiv geladenes) Protein ist, und negativ geladenen Stellen auf Lipopolysacchariden (LPS) LPS ist auch als "Endotoxin" bekannt aufgrund der potenten entzündlichen Reaktion, die es stimuliert. LPS induziert die Freisetzung von Mediatoren durch Wirtsentzündungszellen, was letztendlich zu irreversiblem endotoxischen Schock führen kann. BPI bindet an Lipid A, die toxischste und biologisch aktivste Komponenten von LPS.
PBI ist auch in der Lage, endotoxische Eigenschaften von LPS, an das es bindet zu neutralisieren. Aufgrund seiner bakteriziden Eigenschaften für Gram-negative und seiner Fähigkeit, an LPS zu binden und es zu neutralisieren, kann BPI für die Behandlung von Säugetieren verwendet w erden, die unter diesen von Gram-negativen Bakterien verursachten Erkrankungen leiden, einschließlich Bakteriämie, Endotoxinämie und Sepsis. Diese beiden Eigenschaften von BPI machen BPI besonders nützlich und vorteilhaft für eine derartige therapeutische Verabreichung.
Ein proteolytisches Fragment entsprechend dem aminoterminalen Teil von menschlichem BPI besitzt die LPS-Bindungs- und -Neutralisierungsaktivitäten und antibakterielle Aktivität des natürlich gewonnenen menschlichen 55 kD Holoproteins. Im Gegensatz zum aminoterminalen Teil zeigt die carboxy-terminale Region von isoliertem BPI eine nur schwach nachweisbare antibakterielle Wirkung (Oi et al., 1991, J. Exp. Med. 174: 649). Ein BPIamino-terminales Fragment, umfassend etwa die ersten 199 Aminosäurereste des menschlichen BPI-Holoproteins, und als "rBPI&sub2;&sub3;" (siehe Gazzano-Samoro et al., 1992, Infect, Immun. 60: 4745-4761) bezeichnet ist, hergestellt worden als ein 23 kD-Protein durch rekombinante Mittel. rBPI&sub2;&sub3; ist in klinischen Studien am Menschen eingeführt worden. Proentzündliche Antworten gegen Endotoxin waren wesentlich verbessert, wenn rBPI&sub2;&sub3; mit LPS zusammen verabreicht wurde.
Andere Endotoxin-Bindungs- und -Neutralisierungspeptide sind in der Technik bekannt. Ein Beispiel ist der anti-Lipopolysaccharid-Faktor von Limulus (LALF) von Hufeneisenkrabben- Amoebocyten (Warten et al., 1992, Infect. Immunol. 60: 2506-2513). Ein weiteres Beispiel ist ein zyklisches oder kationisches Lipopeptid von Bacillus polymyxa, bezeichnet als Polymyxin B&sub1;. Polymyxin B&sub1; ist zusammengesetzt aus sechs α,γ-Diaminobuttersäureresten, einem D- Phenylalanin, einem Leucin, einem Threonin und einem 6Methyloctanoylanteil (Morrison und Jacobs, 1976, Immunochem. 13: 813-818) und ist auch bakterizid. Polymyxinanaloge. denen der Fettsäureanteil fehlt, sind auch bekannt, wobei die Analogen die LPSBindungskapazität beibehalten, ihnen jedoch eine nennenswerte bakterizide Wirkung fehlt (Danner et al., 1989, Antimicrob. Agents Chemother. 33: 1428-1434). Man hat ähnliche Eigenschaften auch bei synthetischen zyklisierten Polymyxinanalogen gefunden (Rustici et al., 1993, Science 259: 361-365).
Bekannte antibakterielle Peptide schließen Cecropine und Magainine ein. Die Cecropine sind eine Familie von antibakteriellen Peptiden, die in der Hämolymphe von zu den Lepidopteren gehörenden Insekten gefunden werden (Wade et al., 1990; Proc. Natl, Acad. Sci. USA 87: 4761-4765) und die Magainine sind eine Familie von antibakteriellen Peptiden, die in der Haut von Xenopus und gastrischer Mucosa gefunden werden (Zasloff et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 910-913). Diese Peptide sind linear und sind von etwa 20 bis etwa 40 Aminosäuren lang. Man hat von einem weniger aktiven Säugetier-Cecropin aus Schweindarmmucosa, Cecropin P1 (Boman et al., 1993, Infect. Immun. 61: 2978-2984) berichtet. Man berichtet allgemein, daß die Cecropine hinsichtlich bakterizider Aktivität potenter sind als die Magainine, sie aber weniger cytotoxisch für Säugetierzellen sind. Die Cecropine und Magainine sind gekennzeichnet durch eine kontinuierliche, amphiphatische α-helikale Region, die erforderlich ist JUr die bakterizide Aktivität. Das bis heute potenteste identifizierte Cecropin ist Cecropin A. Die Sequenz der ersten zehn Aminosäuren von Cecropin A weist eine gewisse etwas Homologie auf mit der BPI-Aminosäuresequenz 90-99. Die anderen 27 Aminosäuren von Cecropin A sind jedoch eindeutig für seine bakterizide Aktivität erforderlich und es gibt geringe Homologie mit BPI für diese 27 Aminosäuren. Die Magainine weisen sogar noch weniger Homologie mit der BPI-Sequenz auf.
Für die vorliegende Anmeldung sind die Offenbarungen in WO 92103535 (PCT/US91/05758) von Interesse, die Zusammensetzungen betreffen, die BPI und eine anionische Verbindung umfassen, wobei die Zusammensetzungen (1) keine bakterizide Aktivität und (2) Endotoxinneutralisierende Aktivität aufweisen sollen. Anionische Verbindungen sind bevorzugterweise ein Protein, wie Serumalbumin, können aber auch Polysaccharide sein, wie Heparin. Zusätzlich offenbart Weiss et al. (1975, J. Clin. Invest. 55: 33-42), daß Heparinsulfat und LPS die Expression der Permeabilität erhöhenden Wirkung von BPI blockiert. Keine der Literaturstellen offenbart jedoch. daß BPI tatsächlich die biologischen Aktivitäten von Heparin neutralisiert. Heparin-Bindung bedeutet nicht notwendigerweise HeparinNeutralisation. Zum Beispiel erfordert eine Familie von Heparin-bindenden Wachstumsfaktoren (HBGF) Heparin als einen Cofaktor, um eine biologische Antwort hervorzurufen. Beispiele von HBGFs schließen ein: Fibroblastenwachstumsfaktoren (FGF-1, FGF-2) und Endothelzellenwachstumsfaktoren (ECGF-1, ECGF-2). Antithrombin-IIIInhibierung von Gerinnungskaskadenproteasen ist ein weiteres Betspiel für ein Heparinbindendes Protein, das Heparin JUr seine Aktivität benötigt und Heparin eindeutig nicht neutralisiert. Heparin-bindende Proteine, die Heparin nicht neutralisieren (z. B. Plättchenfaktor IV, Protamin und Thrombospondin) sind allgemein inhibitorisch für die durch Heparinbindungsproteine induzierten Aktivitäten, die Heparin als einen Cofaktor verwenden.
BPI (einschließlich aminoterminaler Fragmente davon) weist eine Anzahl von anderen Eigenschaften auf. Zum Beispiel hat man gezeigt, in US-Patentanmeldungsnummer 08/030,644, eingereicht am 12. März 1993 (die erste Prioritätsanmeldung hiervon) und der Continuation- in-part US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/093,202, eingereicht am 15. Juli 1993 (die zweite Prioritätsanmeldung hiervon), daß BPI Heparin-Bindungsaktivitäten und Heparin- Neutralisierungsaktivitäten aufweist. Diese Heparin-Bindungs- und Neutralisierungsaktivitäten von BPI sind wesentlich aufgrund der Bedeutung derzeitiger klinischer Anwendungen von Heparin. Heparin wird im allgemeinen verabreicht in Dosen bis zu 400 Einheiten/kg während Operationen, wie cardiopulmonarem Bypass, Herzkatheterisierung und Hämodialyseverfahren, um Blutkoagulation während derartiger Prozeduren zu vermeiden. Wenn Heparin wegen seiner Antikoagulanswirkungen während der Operation verabreicht wird, ist es ein wichtiger Aspekt der postoperativen Therapie, daß die Wirkungen des Heparins prompt neutralisiert werden, so daß die normale Koagulationsfunktion wiederhergestellt werden kann. Derzeit wird Protamin verwendet, um Heparin zu neutralisieren. Protamine sind eine Klasse von einfachen, Arginin-reichen, stark basischen Proteinen mit geringem Molekulargewicht. Wenn alleine verabreicht weisen Protamine (gewöhnlich in der Form von Protamin-Sulfat) anti- Koagulationswirkungen auf. Wenn in Gegenwart von Heparin verabreicht, wird ein stabiler Komplex gebildet und die anti-koagulierende Wirkung beider Wirkstoffe geht verloren. Signifikante hypotensive und anaphylaktische Wirkungen von Protamin haben seine klinische Nützlichkeit beschränkt. Somit weist BPI aufgrund seiner Heparin-Bindungs- und - Neutralisierungswirkungen eine potentielle Nützlichkeit als ein Ersatzmittel für Protamin bei Heparin-Neutralisation in einem klinischen Kontext auf, ohne schädliche Nebenwirkungen, die die Nützlichkeit der Protamine beschränkt haben Die zusätzlichen antibakteriellen und anti-Endotoxinwirkungen von BPI wären verglichen mit Protamin auch nützlich und vorteilhaft bei post-chirurgischer 1-Heparin-Neutralisation.
Zusätzliches ist BPI nützlich beim Inhibieren von Angiogenese teilweise infolge seiner Heparin-Bindungs- und -Neutralisationsaktivitäten. Bei Erwachsenen werden angiogene Wachstumsfaktoren als ein Ergebnis von vaskulärem Trauma (Wundheilung), Immunreizen (Autoimmunerkrankungen), entzündlichen Mediatoren (Prostaglandine) oder von Tumorzellen freigesetzt. Diese Faktoren induzieren die Proliferation von Endothelzellen (was erforderlich ist für Angiogenese) vermittels eines Heparin-abhängigen RezeptorBindrtngsmechanismus (siehe Yayon et al., 1991, Cell 64: 841-848). Angiogenese ist auch mit einer Anzahl von anderen pathologischen Zuständen verbunden, einschließlich dem Wachstum, der Proliferation und der Metastase verschiedener Tumoren; diabetischer Retinopathie, retrolentaler Fibroplasie, neovaskulärem Glaukom, Psoriasis, Angiofibrome, immune und nicht-immune Entzündung, einschließlich rheumatoider Arthritis, Kapillarproliferation innerhalb atherosklerotischer Plaques, Hämangiome, Endometriose und Kaposi Sarkom. Somit wäre es wünschenswert, die Angiogenese bei diesen und anderen Fällen zu inhibieren, und die Heparin- Bindungs- und -Neutralisierungswirkungen von BPI sind zu diesem Zwecke nützlich.
Mehrere andere Heparin-neutralisierende Protcinc sind auch dafür bekannt, Angiogenese zu inhibieren. Zum Beispiel ist bekannt, daß Protamin Tumorassoziierte Angiogenese und nachfolgendes Tumorwachstunt inhibiert [siehe Folkman et al., 1992, Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates, 2d ed., (Galin et al., eds., Review Press, NX.) Ch. 40, S. 821- 839]. Ein zweites Heparin-neutralisierendes Protein, Plättchenfaktor IV, inhibiert auch die Angiogenese (d. h. ist angiostatisch). Kollagenase-Inhibitoren sind auch dafür bekannt, die Angiogenese zu inhibieren (siehe Folkman et al., 1992, aa0). Ein weiterer bekannter Angiogense-Inhibitor, Thrombospondin, bindet an Heparin mit einem wiederholenden Serin/Tryptophanmotiv anstelle eines Motivs aus basischen Aminosäuren (siehe Guo et al.. 1992, J. Biol. Chem. 267: 19349-19355).
Eine weitere Nützlichkeit von BPI umfaßt pathologische Zustände, die mit chronischer Entzündung verbunden sind, die gewöhnlicherweise von Angiogenese begleitet wird. Ein Beispiel einer menschlichen Krankheit, die mit chronischer Entzündung verbunden ist, ist Arthritis, die Entzündung von peripheren Gelenken umfaßt, Bei rheumatoider Arthritis ist die Entzündung immunbedingt, wohingegen bei reaktiver Arthritis Entzündung mit Infektion des Synovialgewebes mit pyogenen Bakterien oder anderen infektiösen Agenzien verbunden ist. Folkman et al., 1992, sielte oben, haben auch festgestellt, daß viele Formen von Arthritis von einem Stadium, welches durch ein entzündliches Infiltrat in die Gelenke beherrscht wird, zu einem späteren Stadium fortschreitet, in dem ein neovaskularer Pannus in das Gelenk eindringt und beginnt, den Knorpel zu zerstören. Während es unklar ist, ob Angiogenese bei Arthritis eine verursachende Komponente der Krankheit oder ein Epiphänomen ist, gibt es Belege dafür, daß Angiogenese notwendig ist für die Aufrechterhaltung von Synoviitis bei rheumatoider Arthritis. Man hat gezeigt, daß ein bekannter Angiogenese-Inhibitor AGSII-570, den Beginn von Arthritis verhindert und etablierte Arthritis in Collagen-induzierten Arthritismodellen inhibiert (Pcacock et al., 1992, J. Exp. Med. 175: 1135-1138). Während antientzündliche nicht-Steroid-Wirkstoffe, Corticosteroide und andere Therapien Verbesserungen hinsichtlich Befreiung von Arthritis vorgesehen haben, bestellt nach wie vor ein Bedarf in der Technik für wirksamere Therapien von Arthritis und anderen entzündlichen Erkrankungen.
Es herrscht weiterhin ein Bedarf in der Technik für neue Produkte und Verfahren zur Verwendung als bakterizide Agenzien und Endotoxinneutralisierende Mittel und für Heparin- Neutralisation und Inhibierung von Angiogenese (normale und pathologische). Eine Forschungsrichtung für die Befriedigung dieses Bedarfs ist die Bestimmung der funktionellen Domänen des BPI-Proteins, die eine jede dieser biologischen Aktivitäten spezifiziert. Vorteilhafte therapeutische Ausführungsformen würden deshalb BPIFunktionsdomänenpeptide mit einer oder mehreren der Aktivität von BPI umfassen.

Zusammenfassung der Erfindung

Diese Erfindung betrifft kleine, leicht herzustellende Peptide mit einer Aminosäuresequenz, die eine Aminosäuresequenz von einer funktionellen BPI-Domäne oder Untersequenz davon ist oder im wesentlichen ist, und Varianten der Sequenz oder im wesentlichen Ist und Varianten der Sequenz oder Untersequenzen mit wenigstens einer der biologischen Aktivitäten von BPI, wie Heparin-Bindung, Heparin-Neutralisation, LPS-Bindung, LPSNeutralisation oder bakterizide Aktivität. Die funktionellen Domänen von BPI, die entdeckt und hierin beschrieben sind, umfassen: Domäne I umfassend die Aminosäuresequenz von BPI von etwa Aminosäure 17 bis etwa Aminosäure 45; Domäne 11 umfassend die Aminosäuresequenz von BPI von etwa Aminosäure 65 bis etwa Aminosäure 99; Domäne III umfassend die Aminosäuresequenz von BPI von etwa Aminosäure 143 bis etwa Aminosäure 169. Somit basieren die BPI-Funktionsdomänenpeptide auf dem aminoterminalen Teil von menschlichem BPI.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung wird ein Peptid vorgesehen, das im wesentlichen eine Aminosäuresequenz ist von menschlichem bakteriziden Permeabilität erhöhendem Protein (BPI) von Position 17 bis Position 45, eine Untersequenz davon oder eine Substitutions- oder Additions- oder Deletionsvariante der Sequenz oder der Untersequenz davon, wobei das Poplid wenigstens eine der biologischen Aktivitäten von BPI aufweist, nämlich Heparin- Bindung, Heparin-Neutralisation, LPS-Bindung, LPS Neutralisation oder bakterizide Aktivität oder fungizide Aktivität aufweist.
Entsprechend einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Peptid vorgesehen, das eine Aminosäuresequenz von menschlichem bakterizidem Permeabilität erhöhendem Protein (BP1) von Position 65 bis Position 99, eine Untersequenz davon oder einer Substitutions- oder Additions- oder Deletionsvariante der Sequenz oder der Untersequenz davon ist oder im wesentlichen ist, wobei das Peptid wenigstens eine der biologischen Aktivitäten von BPI, nämlich Heparin-Bindung, Heparin-Neutralisation, LPS-Bindung, LPS-Neutralisation oder bakterizide Aktivität oder fungizide Wirkung aufweist ist.
Entsprechend einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Peptid vorgesehen, das eine Aminosäuresequenz von menschlichem bakterizidem Permeabilität erhöhendem Protein (BPI) von Position 142 bis Position 169, eine Untersequenz davon oder eine Substitutions- oder Additions- oder Deletionsvariante der Sequenz oder der Untersequenz davon ist oder im wesentlichen ist, wobei das Peptid wenigstens eine der biologischen Eigenschaften von BPI aufweist, nämlich Heparin-Bindung, Heparin-Neutralisation, LPSBindung, LPS- Neutralisation oder bakterizide Aktivität oder fungizide Aktivität aufweist.
Auch werden Peptide vorgesehen, bei denen zwei oder mehr der gleichen oder verschiedenen Poptide der Erfindung kovalent miteinander verbunden sind.
Die Peptide der Erfindung schließen lineare und zyklisierte Poptide ein und Peptide, die linear, zyklisiert oder verzweigkettige Kombinationen von bestimmten funktionellen BPI- Domänenaminosäuresequenzen oder Untersequenzen davon sind, und Substitutions- oder Additions- oder Deletionsvarianten der Sequenz oder Untersequenz. Kombinationspeptide schließen Peptide mit der Sequenz oder Untersequenz, oder Substitutions- oder Additions- oder Deletionsvarianten der Sequenz oder Untersequenz der gleichen oder verschiedenen funktionellen Domänen von BPI ein, die kovalent untereinander verbunden sind. Spezifisch werden Kombinationen offenbart von zwei bis etwa zehn Peptiden von irgendeiner speziellen Sequenz oder Untersequenz davon und Varianten der Sequenz oder Untersequenz. Die Erfindung sieht auch Peptide vor mit zusätzlichen biologischen Aktivitäten, die verschieden sind von den bekannten biologischen Aktivitäten von BPI, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, bakterizide Wirkung mit einer geänderten Zielzellenspezies-Spezifität. Peptide der Erfindung können spezielle biologische Eigenschaften von BPI aufweisen, die verglichen mit den biologischen Eigenschaften von BPI verstärkt oder vernngert sind.
Die Peptide der Erfindung schließen lineare und zyklisierte Peptide ein und Peptide, die lineare, zyklisierte und verzweigtkettige Aminosäuresubstitutions- und zusätzliche Varianten von besonderen BPI-Funktionsdomänenaminosäuresequenzen oder Untersequenzen davon sind. Für die Substitutionsvarianten werden Aminosäurereste an einer oder mehreren Positionen in einem jeden der Peptide durch einen verschiedenen Aminosäurerest (einschließlich atypische Aminosäurereste) ersetzt gegenüber demjenigen an der entsprechenden Position der BPI- Funktionsdomäne, von der das spezifische Peptid abgeleitet ist. Für die Additionsvarianten können Peptide bis zu etwa insgesamt 10 zusätzliche Aminosäuren umfassen, kovalent gebunden entweder an den Amino-terminalen oder Carboxy-terminalen Bereich, oder beide, der hierin beschriebenen funktionalen BPIFunktionsdomänenpeptide. Solche zusätzlichen Aminosäuren können Aminosäuren in BPI verdoppeln, die benachbart sind einer funktionellen Domäne oder können nicht verwandt sein zu BPI-Aminosäuresequenzen und können atypische Aminosäuren umfassen. Peptide der Erfindung schließen ein lineare, zyklisierte und verzweigtkettige Kombinationsausführungsformen der Aminosäuresubstitutions- und -Additionsvarianten-Peptide, ebenso wie zyklisierte Ausführungsformen eines jeden der vorerwähnten funktionalen BPIDomänenpeptide. Zusätzlich können Peptide der Erfindung vorgesehen sein als Fusionsproteine mit anderen funktionellen targetierende Agenzien, wie ImmunglobulinFragmenten. Zusätzliche Varianten schließen Derivate und Modifikationen von chemischen Aminosäureseitenkettengruppen ein, wie Amine, Carboxylsäuren, Alkyl- und Phenylgruppen.
Die Erfindung sieht pharmazeutische Zusammensetzungen vor, die hilfreich sind beim Behandeln von Säugetieren, zum Neutralisieren von Endotoxinen, Abtöten von Gramnegativen und Gram-positiven Bakterien und Pilzen, Neutralisieren der anti-KoagulansEigenschaften von Heparin, Inhibieren von Angiogenese, Inhibieren von Tumor- und Endothelzellenproliferation und Behandlung chronischer entzündlicher Erkrankungszustände. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können Einheitsdosierungen der BPI-Peptidc dieser Erfindung in festen, halbfesten und flüssigen Dosierungsformen umfassen, wie Tabletten, Pillen, Pulver, flüssige Lösung oder Suspension und injizierbare und infundierbare Lösungen.
Speziell werden Peptide offenbart mit einer Aminosäuresequenz, die die Aminosäuresequenz von menschlichem BPI von etwa Position 17 bis etwa Position 45 ist, umfassend die funktionelle Domäne I mit der Sequenz:
Domäne I ASQQGTAALQKELKRIKIPDYSDSFKIKH
(SEQ ID NO: 1)
und Untersequenzen davon, die biologische Aktivität aufweisen, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, eine oder mehrere der Aktivitäten von BPI, z. B., bakterizide Aktivität. LPS-Bindung, LPS-Neutralisation, Heparin-Bindung oder Heparin-Neutralisation. Auch werden Peptide offenbart mit im wesentlichen der gleichen Aminosäuresequenz der Funktionsdomäne I-Peptide mit der Aminosäuresequenz von BPI von etwa Position 17 bis etwa Position 45 oder Untersequenzen davon. Zusätzlich werden Peptide offenbart, die zwei oder mehr der gleichen oder verschiedenen Domäne I-Peptide oder Untersequenzpeptide, die kovalent miteinander verbunden sind, umfassen.
Spezifisch offenbart sind Peptide mit einer Aminosäuresequenz, die die Aminosäuresequenz von menschlichem BPI von etwa Position 65 bis etwa Position 99 ist, die die funktionelle Domäne II mit der Sequenz umfaßt:
Domäne II SSQISMVPNVGLKFSISNAMKISGKWKAQKRFLK
(SEQ ID NO: 6);
und Subsequenzen davon, die biologische Aktivität aufweisen, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, eine oder mehrere der Aktivitäten von BPI, z. B., bakterizide Aktivität, LPS- Bindung, LPS-Neutralisierung, Heparin-Bindung oder Heparin-Neutralisation. Auch werden Peptide offenbart mit im wesentlichen der gleichen Aminosäuresequenz der Funktionsdomäne II-Peptide mit der Aminosäuresequenz von BPI von etwa Position 65 bis etwa Position 99 oder Untersequenzen davon. Zusätzlich werden Peptide offenbart, die zwei oder mehrere der gleichen oder verschiedenen Domäne II-Peptide oder Untersequenz-Peptide enthalten, die kovalent miteinander verbunden sind.
Spezifisch offenbart sind Peptide mit einer Aminosäuresequenz, die die Aminosäurescquenz von menschlichem BPI von etwa Position 142 bis etwa Position 169 ist und die Funktionsdomäne III mit der Sequenz umfaßt:
Domäne III VHVHISKSKVGWLIQLFHKKISALRNK;
(SEQ ID NO: 12)
und Subsequenzen davon, die biologische Aktivität aufweisen. einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, eine oder mehrere der Aktivitäten von BPI, z. B., bakterizide Aktivität, LPS- Bindung, LPSNeutralisation, Heparin-Bindung oder Heparin-Neutralisation. Auch werden Peptide offenbart mit im wesentlichen der gleichen Aminosäuresequenz der Funktionsdomäne III-Peptide mit der Aminosäuresequenz von BPI von etwa Position 142 bis etwa Position 169 oder Untersequenzen davon. Zusätzlich sind Peptide offenbart, die zwei oder mehr der gleichen oder verschiedenen Domäne IIIPeptide oder Untersequenz Peptide enthalten, die kovalent untereinander verbunden sind.
Auch offenbart sind Interdomänen-Kombinations-Peptide, worin zwei oder mehrere Peptide von verschiedenen funktionellen Domänen oder Subsequenzen oder Varianten davon kovalent miteinander verbunden sind. Lineare, zyklisierte und verzweigtkettige Ausführungsformen dieser InterdomänenKombinations-Peptide sind eingeschlossen.
Die Peptide dieser Erfindung weisen als einen Aspekt ihrer Nützlichkeit wenigstens eine der bekannten Aktivitäten von BPI auf, einschließlich LPS-Bindung, LPS-Neutralisation, Heparin-Bindung, HeparinNeutralisation und bakterizide Aktivität gegen Gram-negative Bakterien. Zusätzlich und überraschender Weise weisen einige dieser Peptide der Erfindung eine Nützlichkeit auf als bakterizide Mittel gegen Gram-posititve Bakterien. Eine weitere überraschende und unerwartete Nützlichkeit einiger der Peptide dieser Erfindung besteht als fungizide Mittel. Peptide dieser Erfindung sehen eine neue Klasse von Antibiotika-Molekülen mit den beiden Eigenschaften Neutralisierung von Endotoxin und Abtöten von Endotoxinproduzierenden Bakterien vor, die nützlich bei der Behandlung von Säugern sind, die unter Erkrankungen oder Zuständen leiden, die von Gram-negativen Bakterien verursacht werden. Peptide dieser Erfindung, die diese zwei Aktivitäten beibehalten und zusätzlich ein erweitertes antibiotisches Spektrum aufweisen, stellen eine zusätzliche neue Klasse von antimikrobiellen Mitteln dar. Zusätzlich sehen Peptide der Erfindung eine Klasse von antimikrobiellen Agenzien vor, die bei der Behandlung von Infektionen durch Mikrobenstämme nützlich sind, die resistent sind gegenüber herkömmlichen Antibiotika, aber empfindlich gegen Permeabilität erhöhende antimikrobielle Aktivität von Peptiden der Erfindung.
Die Erfindung sieht auch pharmazeutische Zusammensetzungen der Peptide der Erfindung vor, die die Peptide oder Kombinationen der Peptide in einem pharmazeutisch akzeptablem Träger oder Verdünnungsmittel umfassen. Die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung kann bei Verfahren zur Behandlung von pathologischen oder Erkrankungszuständen in einem Säugetier, einschließlich dem Menschen, oder für andere geeignete therapeutische Verwendungen verwendet werden. Durch die Erfindung werden auch BPI-Funktionsdomänen-Peptide zur Verwendung als ein Medikament vorgesehen und Verwendungen von BPI-Funktionsdomänen-Peptiden für die Herstellung von Medikamenten für eine Vielzahl therapeutischer Anwendungen.
Spezifische bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung bestimmter bevorzugter Ausfürungsformen und den Ansprüche offensichtlich werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1a und 1b stellen HPLC-Absorbanz-Spektren für Cyanbromid- und proteolytische Fragmente von rBPI&sub2;&sub3; dar;
Fig. 2 ist ein Diagramm von LAL-Inhibitionstest-Ergebnissen für proteolytische Fragmente von rBPI&sub2;&sub3;;
Fig. 3 ist ein Diagramm von einem Heparin-Bindungstest, das aus der Verwendung eines 15-mer BPI-Peptides resultiert;
Fig. 4 ist ein Diagramm eines Limulus-Amoebocyten-Lysat (LAL)-Inhibitionstest, der aus der Verwendung von 15-mer BPI-Peptiden resultiert;
Fig. 5 ist ein Diagramm eines bakteriziden Radialdiffusions-Testes, das aus der Verwendung von 15-mer BPI-Peptiden resultiert;
Fig. 6 ist ein Diagramm, das die Wirkung von BPI-Funktionsdomänen-Peptiden in einem Heparin-Bindungstest zeigt.
Fig. 7a und 76 sind Diagramme, die die Wirkung von BPI-Funktionsdomänen-Peptiden auf ATIII/Heparin-Inhibition von Thrombin zeigen;
Fig. 8a und 8b sind Diagramme, die die Ergebnisse von BPI-Funktionsdomänen-Peptiden in einem LAL-Inhibitionstest zeigen;
Fig. 9a, 9b, 9c und 9d sind Diagramme, die die Ergebnisse von BPI-Funktionsdomänen- Peptiden in bakteriziden Radialdiffusions-Tests zeigen;
Fig. 9e und 9f sind Diagramme, die die Ergebnisse von BPI-Funktionsdomänen-Peptiden in E coli-Brühentests zeigen;
Fig. 10a, 10b, 10c, 10d und 10e sind Diagramme, die die Ergebnisse von BPI- Funktionsdomänen-Kombinations-Peptiden in einem bakteriziden Radialdiffusions-Tests zeigen.
Fig. 11a, 11b, 11c, 11d, 11e, 11f, 11g, 11h und 11i sind Diagramme, die die Ergebnisse von BPI-Funktionsdomänen-Peptiden in bakteriziden Radialdiffusion-Tests zeigen:
Fig. 11j und 11k sind Diagramme, die die Ergebnisse von BPI-Funktionsdomänen- Peptiden in bakteriziden Tests auf Bakterienzellen zeigen, die in Brühenmedium wachsen;
Fig. 111 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse von BPI-Funktionsdomänen-Peptid BPI.30 in bakteriziden Tests zeigt, die in menschlichem Serum vorgenommen werden;
Fig. 11m und 11n sind Diagramme, die die Ergebnisse von BPI-Funktionsdomänen- Peptiden in bakteriziden Radialdiffusions-Tests zeigen unter Verwendung von Grampositiven Bakterien;
Fig. 11o ist ein Diagramm, das die Ergebnisse von BPI-Funktionsdomänen-Peptiden in bakteriziden Radialdiffusions-Tests zeigt, verglichen mit Gentamicin und Vancomycin unter Verwendung von S. aureus-Zellen;
Fig. 11p und 11q sind Diagramme, die die Ergebnisse zeigen von BPI- Funktionsdomänen-Peptiden in Cytotoxizitäts-Tests unter Verwendung von C. albicans- Zellen, die in Brühemmedium wachsen;
Fig. 12a, 12b, 12c, 12d, 12e, 12f und 12g sind Diagramme, die die Ergebnisse eines Heparin-Neutralisationstests unter Verwendung von BPI-Funktionsdomänen-Peptiden zeigen;
Fig. 13 ist ein schematisches Diagramm der Struktur von BPI-Domäne II-Peptid BPI.2 (Aminosäuresequenz 85-99 der BPI-Sequenz, SEQ ID NO: 7);
Fig. 14 ist ein schematisches Diagramm der Struktur von BPI-Domäne-III-Peptid BPI.11 (Aminosäuresequenz 148-161 der BPI-Sequenz, SEQ ID NO: 13);
Fig. 15a, 15b, 15c, 15d und 15e sind Diagramme, die die Ergebnisse der Heparin- Bindungstests unter Verwendung von BPI-Funktionsdomänen-Substitutionspeptiden zeigen;
Fig. 16 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse von Heparin-Bindungstests unter Verwendung einer Vielzahl von BPI-Funktionsdomänen-Peptiden zeigt;
Fig. 17a und 17b sind Diagramme der Ergebnisse von Lipid A-Bindungskompetitionstests zwischen synthetischen BPI-Funktionsdomänen-Peptiden und radiomarkiertem rBPI&sub2;&sub3;;
Fig. 18 ist ein Diagramm der Ergebnisse von Lipid A-Bindungskompetitionstests zwischen synthetischem BPI.10-Peptid und radiomarkiertem rBPI&sub2;&sub3; in Blut oder Phosphat-gepufferter Saline;
Fig. 19 ist ein Diagramm der Ergebnisse von Lipid A-Bindungskompetitionstest zwischen synthetischen BPI-Peptiden BPI.7, BPI.29 und BP1.30 gegenüber radiomarkiertem rBPI&sub2;&sub3;;
Fig. 20a und 20b sind Diagramme der Ergebnisse von Lipid A-Bindungskompetitionstest zwischen BPI-Funktionsdomänen-Peptiden und radiomarkiertem rLBP&sub2;&sub3;;
Fig. 21 ist ein Diagramm der Ergebnisse von Bindungsexperimenten mit radiomarkierten RaLPS unter Verwendung von BPI-Funktionsdomänen-Peptiden, die vorab an HUVECZellen gebunden sind;
Fig. 22a, 22b, 22c, 22d, 22e, 22f, 22g, und 22h sind Diagramme, die die verschiedenen Parameter zeigen, die einen zellulären TNF-Cytotoxizitätstest beeinflussen, der die LPS- Neutralisationsaktivität von BPI mißt;
Fig. 23a, 23b und 23c sind Diagramme, die die Abhängigkeit von NO-Produktion von der Anwesenheit von γ-Interferon und LBP in LPS-stimulierten. RAW 264.7-Zellen und Inhibierung derartiger NO-Produktion unter Verwendung von rBPI&sub2;&sub3; zeigt;
Fig. 24a, 24b, 24c, 24d, 24e und 24f sind Diagramme, die LPS-Neutralisation durch BPI- Funktionsdomänen-Peptide zeigen, die in ihrer Fähigkeit wiedergegeben sind, NO-Produktion durch RAW 264.7-Zellen zu inhibieren, die durch Zymosan oder LPS stimuliert wurden;
Fig. 24g, ist ein Diagramm, das die 1C&sub5;&sub0;-Werte von synthetischen BPI-Peptiden für die Inhibierung von LPS- oder Zymosan-stimulierter NO-Produktion durch RAW 264.7-Zellen zeigt;
Fig. 25 ist eine schematische Darstellung von rBPI&sub2;&sub3;, das drei funktionelle Domänen zeigt;
Fig. 26a ist ein Diagramm, das die Abhängigkeit von LPS-vermittelter Inhibierung von RAW 264.7-Zellproliferation von der Anwesenheit von rLPB zeigt;
Fig. 26b und 26c sind Diagramme, die Muster von BPI-Funktionsdomänen-Peptiden zeigen unter Verwendung des Test von Beispiel 20D;
Fig. 27 ist ein Diagramm, das einen Vergleich von TNF-Inhibierung in Vollblut durch verschiedene BPI-Funktionsdomänen-Peptide unter Verwendung des Tests von Beispiel 20E zeigt; und
Fig. 28 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse des Thrombin-Gerinnungstests zeigt, der in Beispiel 20G beschrieben ist, unter Verwendung verschiedener BPI-Funktionsdomänen- Peptide.
Fig. 29(a-h) sind Graphen, die die Ergebnisse von BPI-Peptiden der funktionellen Domäne in den in Beispiel 27 beschriebenen Radialdiffusions-bakteriziden Tests zeigen.

Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Diese Erfindung sieht ein Peptid vor, welches ist oder im wesentlichen ist eine Aminosäuresequenz von wenigstens einer funktionelle Domäne von menschlichen BPI, eine Untersequenz davon oder eine Substitutions- oder Additions- oder Deletionsvariante der Sequenz oder Untersequenz davon ist oder im wesentlichen ist. Für die Zwecke dieser Erfindung soll die Bezeichnung "funktionelle Domäne" eine Region der Aminosäuresequenz von BPI bezeichnen, die zur biologischen Gesamtaktivität des Proteins beiträgt. Diese funktionelle Domänen von BPI werden definiert durch die Aktivität von proteolytischen Spaltungsfragmenten, überlappenden 15-mer Peptiden und anderen synthetischen Peptiden.
Domäne I ist definiert als die Aminosäuresequenz von BPI, die etwa Aminosäure 17 bis etwa Aminosäure 45 umfaßt. Peptide auf der Basis dieser Domäne sind moderat aktiv sowohl bei der Inhibierung von LPS-induzierter LAL-Aktivität als auch in Heparin-Bindungstests und weisen keine signifikante bakterizide Aktivität auf. Domäne II ist definiert als die Aminosäuresequenz von BPI, die etwa Aminosäure 65 bis etwa Aminosäure 99 umfaßt, Peptide auf der Basis dieser Domäne weisen hohe LPS- und Heparin-Bindungskapazität auf und sind bakterizid. Domäne III ist definiert als die Aminosäuresequenz von BPI, die etwa Aminosäure 142 bis etwa Aminosäure 169 umfaßt. Peptide auf der Basis dieser Domäne weisen hohe LPS- und Heparin-Bindungsaktivitäten auf und sind bakterizid.
Die funktionellen Domänen, wie hierin definiert, schließen die benachbarten Domänen I, II und III ein, d. h., Domänen, die aus einem kontinuierlichen Teil der BPI-Aminosäuresequenz zusammengesetzt sind. Die Erfindung schließt jedoch auch Peptide ein, die Teile von BPI umfassen, die nicht kontinuierlich sind, d. h. die in der BPI-Sequenz getrennt sind. Es ist anerkannt, daß einige nicht-kontinuierliche Abschnitte einer Aminosäuresequenz im nativen Protein gefaltet sein können, um derartige Aminosäureregionen benachbart zu machen oder in die Nachbarschaft zu bringen, wobei die Struktur in den Peptiden der Erfindung nachgemacht werden kann durch kovalentes Zusammenbinden von Peptiden von nicht-kontinuierlichen Regionen.
Peptide, die nicht-kontinuierliche Regionen von BPI-Aminosäuresequenz enthalten, sind ein Beispiel von Kombinationspeptiden, die durch die Erfindung vorgesehen werden. Für die Zwecke dieser Erfindung sollen Kombinationspeptide lineare, zyklisierte oder verzweigtkettige Peptide umfassen, die ans zwei oder drei Peptiden mit einer Aminosäuresequenz zusammengesetzt sind, die die gleichen oder verschiedenen funktionellen Domänen von BPI und Untersequenzen davon aufweisen. Spezifisch sind Kombinationen offenbart, die zwei oder mehr, z. B. von zwei bis etwa 10 Funktionsdomänen-Peptide oder Untersequenzen davon umfassen und, bevorzugterweise, Kombinationen von zwei oder drei Funktionsdomänen- Peptiden (z. B. Homodimere, Homotrimere, Heterodimere und Heterotrimere). Ein jedes der Komponentenpeptide, das derartige Kombinationen umfaßt, kann eine Aminosäuresequenz von irgendeiner besonderen BPI-Funktionsdomänen-Aminosäuresequenz oder Untersequenz davon aufweisen.
Zu Zwecken dieser Erfindung soll der Begriff "eine biologische Aktivität von BPI" einschließen, ist aber nicht darauf beschränkt, die biologischen Aktivitäten von einem menschlichen bakteriziden/Permeabilität erhöhenden Protein (BPI), einschließlich, z. B., eines rekombinanten BPI-Holoproteins, wie rBPI (SEQ ID NO: 69), ein Amino-terminales Fragment von BPI wie rBPI&sub2;&sub3;, und mutierte Amino-terminale Fragmente von BPI, wie rBPI&sub2;&sub1;Δcys (bezeichnet als rBPI (1-193) ala¹³² in der gleichfalls anhängigen und ebenfalls übertragenen US- Patentanmeldung mit der Nummer 08/013,801, angemeldet am 2. Februar 1993 und der entsprechenden PCT-Anmeldung Nr. US 94/01235, angemeldet am 2. Februar 1994, hierdurch durch Bezugnahme aufgenommen). Wie offenbart in der gleichfalls anhängigen und ebenfalls übertragenen US-Patentanmeldung mit der Nr. 08/093,202, hierdurch durch Bezugnahme aufgenommen, ist rBPI hergestellt worden mit der Sequenz, wie sie als SEQ ID NO: 69 angegeben ist, wie gezeigt bei Gray et al (aa0), mit der Ausnahme, daß Valin an Position 151 statt durch GTC durch GTG spezifiziert ist und der Rest 185 Glutaminsäure (angegeben durch GAG) ist anstelle von Lysin (angegeben als AAG). Zusätzlich ist rBPI&sub2;&sub3; (siehe auch, Gazzano-Santoro et al., 1992, Infect. Immun. 60: 4754-4761) hergestellt worden unter Verwendung eines Expressionsvektors, der die Signalsequenz aus 31-Resten und die ersten 199 Aminosäuren der Sequenz von rBPI umfaßt mit den Ausnahmen von der Gray et al. (aa0) Sequenz, wie oben festgehalten. Derartige biologische Aktivitäten schließen LPS-Bindung, LPS- Neutralisation. Heparin-Bindung und Heparin-Neutralisation und bakterizide Aktivität ein. Speziell eingeschlossen ist eine biologische Aktivität von irgendeinem Peptid dieser Erfindung, die zwischen dem 0,1- und 10-fachen der Aktivität von BPI liegt, oder von einem korrespondierenden Peptid, das eine korrespondierende funktionelle Domäne von BPI umfaßt. In dieser Definition der "biologischen Aktivität von BPI" ist auch ausdrücklich eingeschlossen eine biologischen Aktivität, zum Beispiel bakterizide Aktivität, die qualitativ verschieden ist von der Aktivität von BPI oder dem entsprechenden Peptid, das die ganze entsprechende Domäne von BPI umfaßt. Zum Beispiel schließen solche qualitativen Unterschiede Unterschiede im Spektrum der Bakterien oder anderen Mikroorganismen ein, gegen die das Peptid wirksam ist, relativ zur Aminosäuresequenz der entsprechenden funktionellen Domäne von BPI. Diese Definition umfaßt somit Peptid-Aktivitäten, wie bakterizide Aktivitäten gegen Gram-positive Bakterien und fungizide Aktivität, die früher für BPI nicht berichtet wurde.
Die Erfindung sieht Peptide vor, von denen ein jedes eine Aminosäuresequenz aufweist, die die Aminosäuresequenz von einer der funktionellen Domänen von menschlichem BPI oder einer Untersequenz davon ist oder im wesentlichen ist. Ausführungsformen derartiger Peptide schließen die folgenden beispielhaften Domäne I-Peptide ein (Buchstabenabkürzungen für Aminosäuren können gefunden werden in G. Zubay, Biochcnnistry (2d. Aufl.), 1988 (MacMillen Publishing: NY), S. 33:
die folgenden beispielhaften Domäne II-Peptide:
und die folgenden beispielhaften Domäne III-Peptide:
und
Es wird erkannt werden, daß BPI.14, BPI.12 und BPI.55 Beispiele für Additionsvarianten sind.
Die Erfindung sieht auch Kombinationen vor (die linear oder verzweigtkettige Kombinationen sein können) von den gleichen oder verschiedenen Peptiden, wobei ein jedes der Peptide der Kombination eine Aminosäuresequenz aufweist, die die Aminosäuresequenz von einer der funktionellen Domänen von menschlichem BPI oder einer Untersequenz davon im oder im wesentlichen ist. Ausführungsformen derartiger Peptide schließen die folgenden beispielhaften Kombinationsdomäne II-Peptide ein
und die folgenden beispielhaften verzweigtkettigen Domäne II-Peptide:
MAP.1 (β-Alanyl-Nα, N&epsi;-substituiertes-[Nα, N&epsi;(BPI.2)lysyl]lysin)
und die folgenden beispielhaften Kombinationen von Domäne III-Peptid:
und die folgenden beispielhaften verzweigtkettigen Domäne-III-Peptide:
MAP.2 (β-Alanyl-Nα, N&epsi;-substituiertes-[Nα, N&epsi;(BPI.13)lysyl)lysin);
und die folgenden beispielhaften Domäne II-Domäne
III-Interdomänen-Kombinationspeptide:
Aminosäuresubstitutionsvarianten sind auch vorgesehen, wobei der Aminosäurerest an einer oder mehreren Positionen eines jeden der Peptide ein Rest ist, der verschieden ist von der Aminosäure, die an der entsprechenden Position der BPI-Funktionsdomäne gefunden wird. von der das spezifische Peptid abgeleitet ist. Zum Beispiel ist in einer Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung eine Position im Peptid substituiert durch einen Alaninrest für die Aminosäure, die an der entsprechenden Position in der BPI-Aminosäuresequenz gefunden wird. In anderen Ausführungsformen ist eine Position in dem Peptid substituierten mit, z. B., einem Phenylalanin-, Leucin-, Lysin- oder Tryptophanrest für die an der entsprechenden Stelle in der BPI-Aminosäuresequenz gefundenen Aminosäure. Ausführungsformen dieser Peptide schließen die folgenden beispielhaften Substitutionsdomäne II-Peptide ein:
und die folgenden beispielhaften Substitutionsdomäne III-Peptide:
Eine besondere Nützlichkeit derartiger mit einer einzelnen Aminosäure substituierter BPI- Funktionsdomänen-Peptide, die von der Erfindung vorgesehen sind, besteht darin, kritische Reste in der Peptidsequenz zu identifizieren, wodurch Substitution des Rests an einer speziellen Position in der Aminosäuresequenz eine nachweisbare Wirkung auf wenigstens eine der biologischen Aktivitäten des Peptids aufweist. Ausdrücklich umfaßt vom Schutzumfang der Erfindung sind Ausführungsformen der Poptide der Erfindung mit Substitutionen an solch kritischen Resten, die so identifiziert wurden, daß irgendeine Aminosäure verwendet wurde, ob natürlicherweise vorkommend oder atypisch, wobei das resultierende substituierte Peptid eine biologische Aktivität wie hierin definiert aufweist. Substituierte Peptide sind auch vorgesehen, die Mehrfach-Substitutionen sind, d. h. wo zwei oder mehrere verschiedene Aminosäurereste in der Funktionsdomänen-Aminosäuresequenz jeweils durch eine andere Aminosäure substituiert sind. Zum Beispiel sind in Ausführungsformen derartiger doppelt substituierter Peptide beide Positionen im Peptid substituiert, z. B. mit Alanin-, Phenylalanin- oder Lysinresten für die Aminosäure, die an den entsprechenden Stellen in der BPI-Aminosäuresequenz gefunden werden. Beispiel für Ausführungsformen dieser Peptide schließen die mehrfach substituierten Domäne II-Peptide ein:
und das beispielhafte mehrfach substituierte Domäne III-Peptid:
und das folgende beispielhafte mehrfach substituierte Domäne II-Substitutionskombinations- Peptid:
und das folgende beispielhafte mehrfach substituierte Domän II-Domän III-Interdomänen- Substitutionskombinations-Peptid:
Ein weiterer Aspekt von derartigen Aminosäure-Substitutionsvarianten sind jene, bei denen der substituierte Aminorest eine atypische Aminosäure ist. Speziell umfaßt bei diesem Aspekt von Peptiden der Erfindung sind Peptide, die D-Aminosäuren, modifizierte oder nicht- natürlicherweise vorkommende Aminosäuren und geänderte Aminosäuren enthalten, um Peptide mit erhöhter Stabilität, Potenz oder Bioverfügbarkeit vorzusehen. Ausführungsformen dieser Peptide schließen die folgenden beispielhaften Domäne II-Peptide mit atypischen Aminosäuren ein:
das beispielhafte Domäne III-Peptid mit atypischen Aminosäuren:
und die beispielhaften Domäne II-Domäne III-Interdomänen Kombinations-Peptide mit atypischen Aminosäuren:
Lineare und verzweigtkettige Kombinationsausführungsformen der Aminosäuresubstitutionsvarianten-Peptide, die mehrfache Substitutionen in mehrfachen Domänen erzeugen, sind auch ein Aspekt dieser Erfindung. Ausführungsformen dieser Peptide schließen die folgenden beispielhaften Kombinations/Substitutionsdomäne II-Peptide ein:
Die Erfindung schließt auch dimerisierte und zyklisierte Ausführungsformen von einem jeden der vorerwähnten BPI-Funktionsdomänen-Peptide ein. Ausführungsformen dieser Peptide schließen die folgenden beispielhaften Cystein-modifizierten Domäne II-Peptide ein:
Daher schließt die Erfindung neue chemische Verbindungen ein, die Peptide, basierend auf oder verwandt mit Domänen I, II und III von BPI sind, die jeweils als Gruppe I, Gruppe II und Gruppe III identifiziert sind:

Gruppe I:

ASQQGTAALQKELKRIKIPDYSDSFKIKH (SEQ ID NO: 1);
GTAALQKELKRIKIPDYSDSFKIKHLGKGH (SEQ ID NO: 2);
LQKELKRIKIPDYSDSFKIKHL (SEQ ID NO: 3);
QQGTAALQKELKRIK (SEQ ID NO: 4);
GTAALQKELKRIKIP (SEQ ID NO: 5);

Gruppe II:

SSQISMVPNVGLKFSISNAKIKISGKWKAQKRFLK (SEQ ID NO: 6);
IKISGKWKAQKRFLK (SEQ ID NO: 7);
KWKAQKRFLK (SEQ ID NO: 8);
CIIüSGKWKAQKRFLK (SEQ ID NO: 9);
CIKISGKWKAQKRFLKC (SEQ ID NO: 10);
NVGLKFSISNANIKISGKWKAQKRFLK (SEQ ID NO: 11);
AKISGKWKAQKRFLK (SEQ ID NO: 16);
IAISGKWKAQKRFLK (SEQ ID NO: 17);
IKASGKWKAQKRFLK (SEQ ID NO: 18);
IKIAGKWKAQKRFLK (SEQ ID NO: 19);
IKISAKWKAQKRFLK (SEQ ID NO: 20);
IKISGAWKAQKRFLK (SEQ ID NO: 21);
IKISGKAKAQKRFLK (SEQ ID NO: 22);
IKISGKWAAQKRFLK (SEQ ID NO: 23);
IKISGKWKAAKRFLK (SEQ ID NO: 24);
IKISGKWKAQARFLK (SEQ ID NO: 25);
IKISGKWKAQKAFLK (SEQ ID NO: 26);
IKISGKWKAQKRALK (SEQ ID NO: 27);
IKISGKWKAQKRFAK (SEQ ID NO: 28);
IKJSGKWKAQKRFLA (SEQ ID NO: 29);
IKISGAWAAQKRFLK (SEQ ID NO: 30);
IKISGKWKAAARFLK (SEQ ID NO: 31);
IAISGKWKAQKRFLA (SEQ ID NO: 32);
IKISGKWKAKQRFLK (SEQ ID NO: 47);
IKISGKFKAQKRFLK (SEQ ID NO: 48);
IKISGKWDKAQKRFLK (SEQ ID NO: 49);
IKISGKAβ-(1-naphthyl)KAQKRFLK (SEQ ID NO: 50);
KRFLKKWKAQKRFLK (SEQ ID NO: 51);
KWKAQKRFLKKWKAQKRFLK (SEQ ID NO: 54);
KRFLKKWKAQKRFLKKWKAQKRFLK (SEQ ID NO: 55);
KWKAAARFLKKWKAQKRFLK (SEQ ID NO: 57);
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KWKAAARFLKKWKAAARFLK (SEQ ID NO: 59);
KWKAAARFLKKWKAAARFLKKWKAAARFLK (SEQ ID NO: 60);
IKISGKWKAQFRFLK (SEQ ID NO: 62);
IKISGKAβ-(1-naphthyl)KAQKRFLK (SEQ ID NO: 63);
IKISGKWKAQKRAβ-(3-pyridyl)LK (SEQ ID NO: 64);
QKRFLKKWKAQKRFLKKWKAQKRFLK (SEQ ID NO: 65);
ADADIKISGKWKAQKRFLK (SEQ ID NO: 66);
IKISGKWKAQFDRFLK (SEQ ID NO: 71);
IKISGKWKAQWRFLK (SEQ ID NO: 72);
IKISGKWKAKKRFLK (SEQ ID NO: 73);
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IKISGKWKAFKRFLK (SEQ ID NO: 75);
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IKISGKWKAFFRFLK (SEQ ID NO: 82);
IKISGKAβ-(1-naphthyl)KAFKRFLK (SEQ ID NO: 84);
IKISGKAβ-(1-naphthyl)KAFFRFLK (SEQ ID NO: 85);
KWKAQWRFLKKWKAQWRFLKKWKAQWRFLK (SEQ ID NO: 93);
CIKISGKWKAQKRPLC (SEQ ID NO: 99);
IKKRAISFLGKKWQK (SEQ ID NO: 100);
IKISGKWKAWKRFLKK (SEQ ID NO: 102);
IKISGKWKAWKRAβ-(1-naphthyl)LKK (SEQ ID NO: 104);
IKJSGKAβ-(1-naphthyl)KAQAβ-(1-naphthyl)RFLK (SEQ ID NO: 111);
KWQLRSKGKIKIFKA (SEQ ID NO: 113);
IKISGKAβ-(1-naphthyl)KAAβ-(1-naphthyl)KRFLK (SEQ ID NO: 115);
IKISGKWKAQKRKLK (SEQ ID NO: 116);
IKISGKWKAAβ-(1-naphthyl)Aβ-(1-naphthyl)RFLK (SEQ ID NO: 117);
IKISGKAβ-(1-naphthyl)KAAβ-(1-naphthyl)Aβ-(1-naphthyl)RFLK (SEQ ID NO: 118);
IKISGKWKAQERFLK (SEQ ID NO: 132);
IKISGKWKAQKRWLK (SEQ ID NO: 137);
IKISGKWKAEKKFLK (SEQ ID NO: 143);
KWAFAKKQKKRLKRQWLKKF (SEQ ID NO: 148);
KWKAQKRFLKKWKAQKRFLKKWKAQKRFLK (SEQ ID NO: 149);
KWKAAβ-(1-naphthyl)Aβ-(1-naphthyl)RFLKKWKAQKRFLK (SEQ ID NO: 150);
KWKAQKRFLKKWKAAβ-(1-naphthyl)Aβ-(1-naphthyl)RFLK (SEQ ID NO: 151);
KWKAAβ-(1-naphthyl)Aβ-(1-naphthyl)RFLKKWKAAβ-(1-naphthyl)Aβ-(1-naphthyl)RFLK (SEQ ID NO: 152);
KWKAAβ-(1-naphthyl)Aβ-(1-naphthyl)RFLKKWKAAβ-(1-naphthyl)Aβ-(1-naphthyl)- RFLKKWKAAβ-(1-naphthyl)Aβ-(1-naphthyl)RFLK (SEQ ID NO: 153);
KAβ-(1-naphthyl)KAQAβ-(1-naphthyl)RFLKKAβ-(1-naphthyl)KAQAβ-(1-naphthyl)RFLK (SEQ ID NO: 156);
KWKAQWRFLKKWKAQWRFLK (SEQ ID NO: 159);
KWKAAβ-(1-naphthyl)KRFLKKWKAAβ-(1-naphthyl)KRFLK (SEQ ID NO: 160);
KAβ-(1-naphthyl)KAQFRFLKKAβ-(1-naphthyl)KAQFRFLK (SEQ ID NO: 161);
KWKAQKRF (SEQ ID NO: 163);
CKWKAQKRFLKMSC (SEQ ID NO: 164);
CKWKAQKRFC (SEQ ID NO: 165);
IKISGKWKAQKRAβ-(1-naphthyl)LK (SEQ ID NO: 166);
KWKAFFRFLKKWKAFFRFLK (SEQ ID NO: 101);
IKJSGKWKAAWRFLK (SEQ ID NO: 223);
IKISGKWKAAβ-(1-naphthyl)FRFLK (SEQ ID NO: 224);
IKISGKWKAAFRFLK (SEQ ID NO: 225);
IKISGKWKAAβ-(1-naphthyl)ARFLK (SEQ ID NO: 226);

Gruppe III:

VHVHISKSKVGWLIQLFHKKIESALRNK (SEQ ID NO: 12);
KSKVWLIQLFHKK (SEQ ID NO: 13);
SVHVHISKSKVGWLIQLFHKKIESALRNK (SEQ ID NO: 14);
KSKVGWLIQLFHKK (SEQ ID NO: 15);
ASKVGWLIQLFHKK (SEQ ID NO: 33);
KAKVGWLIQLFHKK (SEQ ID NO: 34);
KSAVGWLIQLFHKK (SEQ ID NO: 35);
KSKAGWLIQLFHKK (SEQ ID NO: 36);
KSKVAWLIQLFHKK (SEQ ID NO: 37);
KSKVGALIQLFHKK (SEQ ID NO: 38);
KSKVGWAIQLFHKK (SEQ ID NO: 39);
KSKVGWLAQLFHKK (SEQ ID NO: 40);
KSKVGWLIALFHKK (SEQ ID NO: 41);
KSKVGWLIQAFHKK (SEQ ID NO: 42);
KSKVGWLIQLAHKK (SEQ ID NO: 43);
KSKVGWLIQLFAKK (SEQ ID NO: 44);
KSKVGWLIQLFHAK (SEQ ID NO: 45);
KSKVGWLIQLFHKA (SEQ ID NO: 46);
KSKVGWLIQLFHKKKSKVGWLIQLFHKK (SEQ ID NO: 56);
GWLIQLFHKKIESALRNKMNS (SEQ ID NO: 61);
VHVHISKSKVGWLIQLFHKKIE (SEQ ID NO: 67);
KSKVGWLIQLWHKK (SEQ ID NO: 76);
KSKVGAβ-(1-naphthyl)LIQLFHKK (SEQ ID NO: 77);
KSKVLWLIQLFHKK (SEQ ID NO: 79);
KSKVGWLILLFHKK (SEQ ID NO: 80);
KSKVGWLIQLFLKK (SEQ ID NO: 81);
KSKVGWLIFLFHKK (SEQ ID NO: 86);
KSKVGWLIKLFHKK (SEQ ID NO: 87);
KSKVGWLIQLFFKK (SEQ ID NO: 89);
KSKVFWLIQLFHKK (SEQ ID NO: 90);
KSKVGWLIQLFHKF (SEQ ID NO: 91);
KSKVKWLIQLFHKK (SEQ ID NO: 92);
KSKVKWLIKLFHKK (SEQ ID NO: 94);
KSKVKWLIKLFFKFKSKVKWLIKLFFKF (SEQ ID NO: 95);
KSKVGWLISLFHKK (SEQ ID NO: 103);
KSKVGWLITLFHKK (SEQ ID NO: 105);
KSKVGWLIQLFWKK (SEQ ID NO: 106);
KSKVGWLIQLFHKW (SEQ ID NO: 107);
KSKVGWLIQLAβ-(1-naphthyl)HKK (SEQ ID NO: 108);
KSKVGWLIQLFAβ-(1-naphthyl)KK (SEQ ID NO: 109);
KSKVGWLIQLFHKAβ-(1-naphthyl) (SEQ ID NO: 110);
KSKVGWLIQFFHKK (SEQ ID NO: 112);
KSKVKAβ-(1-naphthyl)LIQLFHKK (SEQ ID NO: 114);
KSKVGW(p-amino)LIFLFHKK (SEQ ID NO: 119);
KSKVKWLIQLWHKK (SEQ ID NO: 120);
KSKVGWLIYLFHKK (SEQ ID NO: 121);
KSKVGWDLIQLFHKK (SEQ ID NO: 122);
KSKVGFLIQLFHKK (SEQ ID NO: 123);
KSKVGFDLIQLPHKK (SEQ ID NO: 124);
KSKVGAD-1-β-(1-naphthyl)LIQLFHKK (SEQ ID NO: 125);
KSKVGA2-β-(1-naphthyl)LIQLFHKK (SEQ ID NO: 126);
KSKVGAD-2-β-(1-naphthyl)LIQLFHKK (SEQ ID NO: 127);
KSKVGA(pyridyl)LIQLFHKK (SEQ ID NO: 128);
KSKVGF(p-amino)LIQLFHKK (SEQ ID NO: 129);
KSKVF(p-amino)WLIQLFHKK (SEQ ID NO: 130);
KSKVGKLIQLPHKK (SEQ ID NO: 131);
CKSKVGWLIQLFHKKC (SEQ ID NO: 133);
KSKVKFLIQLFHKK (SEQ ID NO: 134);
KSKVGYLIQLFHKK (SEQ ID NO: 135);
KSKVGWLIQWFHKK (SEQ ID NO: 138);
KSKVGWLIQAβ-(1-naphthyl)FHKK (SEQ ID NO: 139);
KSKVGA(cyclohexyl)LIQLFHKK (SEQ ID NO: 140);
KSKVGWLIQLFAβ-(1-naphthyl)KAβ-(1-naphthyl) (SEQ ID NO: 142);
KSKVGAβ-(1-naphthyl)LIQLFAβ-(1-naphthyl)KK (SEQ ID NO: 144);
KSKVKALIQLFHKK (SEQ ID NO: 157);
KSKVGVLIQLFHKK (SEQ ID NO: 162);
KSKVGAβ-(1-naphthyl)LIQLFHKKAβ-(1-naphthyl) (SEQ ID NO: 167);
KSKVGAβ-(1-naphthyl)LIQAβ-(1-naphthyl)FHKK (SEQ ID NO: 168);
KSKVGAβ-(1-naphthyl)LIF(p-amino)LFHKK (SEQ ID NO: 169);
KSKVF(p-amino)Aβ-(1-naphthyl)LIQLFHKK (SEQ ID NO: 170);
KSKVGAβ-(1-naphthyl)LIQLWHKK (SEQ ID NO: 171);
KSKVGVLIQAβ-(1-naphthyl)FHKAβ-(1-naphthyl) (SEQ ID NO: 172);
KSKVGWLIF(p-amino)LFHKAβ-(1-naphthyl) (SEQ ID NO: 173);
KSKVF(p-amino)WLIQLFHKAβ-(1-naphthyl) (SEQ ID NO: 174);
KSKVGWLIQLWHKAβ-(1-naphthtyl) (SEQ ID NO: 175);
KSKVGWLIQAβ-(1-naphthyl)FAβ-(1-naphthyl)KK (SEQ ID NO: 176);
KSKVGWLIF(p-amino)LFAβ-(1-naphthyl)KK (SEQ ID NO: 177);
KSKVF(p-amino)WLIQLFAβ-(1-naphthyl)KK (SEQ ID NO: 178);
KSKVGWLIQLWAβ-(1-naphthyl)KK (SEQ ID NO: 179);
KSKVGWLIF(p-amino)Aβ-(1-naphthyl)FHKK (SEQ ID NO: 180);
KSKVF(p-amino)WLIQAβ-(1-naphthyl)FHKK (SEQ ID NO: 181);
KSKVGWLIQAβ-(1-naphthyl)WHKK (SEQ ID NO: 182);
KSKVF(p-amino)WLIF(p-amino)LFHKK (SEQ ID NO: 183);
KSKVGWLIF(p-amino)LWHKK (SEQ ID NO: 184);
KSKVF(P-amino)WLIQLWHKK (SEQ ID NO: 185);
KSKVGAD-β-(2-naphthyl)LILLFHKK (SEQ ID NO: 190);
KSKVGWLILLFHKKKSKVGWLILLFHKK (SEQ ID NO: 191);
KSKVGWLIFLFHKKKSKVGWLIFLFHKK (SEQ ID NO: 192);
KSKVGWLILLFHKKKSKVGWLIQLFHKK (SEQ ID NO: 193);
KSKVGWLIQLFHKKKSKVGWLILLFHKK (SEQ ID NO: 194);
KSKVGWLIFLFHKKKSKVGWLIQLFHKK (SEQ ID NO: 195);
KSKVGWLIQLFHKKKSKVGWLIFLFHKK (SEQ ID NO: 196);
KSKVGWLILLWHKK (SEQ ID NO: 198);
KSKVGAD-β-(2-naphthyl)LIQLWHKK (SEQ ID NO: 199);
KSKVGAD-β-(2-naphthyl)LILLWHKK (SEQ ID NO: 200);
KSKVGGLIQLFHKK (SEQ ID NO: 201);
KSKVGLLIQLFHKK (SEQ ID NO: 202);
KSKVGILIQLFHKK (SEQ ID NO: 203);
KSKVGADLIQLFHKK (SEQ ID NO: 204);
KSKVGVDLIQLFHKK (SEQ ID NO: 205);
KSKVGAβLIQLFHKK (SEQ ID NO: 206);
KSKVG(delta-aminobuttersäure)LIQLFHKK (SEQ ID NO: 207);
KSKVG(gamma-aminobuttersäure)LIQLFHKK (SEQ ID NO: 208);
KSKVGA(detta-Methy)LIQLFHKK (SEQ ID NO: 209);
KSKVGG(t-butyl)LIQLFHKK (SEQ ID NO: 210);
KSKVGG(N-Methyl)LIQLFHKK (SEQ ID NO: 211);
KSKVGV(N-Methyl)LIQLFHKK (SEQ ID NO: 212);
KSKVGL(N-Methyl)LIQLFHKK (SEQ ID NO: 213);
KSKVGWLINLFHKK (SEQ ID NO: 214);
KSKVGWLIELFHKK (SEQ ID NO: 215);
KSKVGWLIDLFHKK (SEQ ID NO: 216);
KSKVGWLIKLFHKK (SEQ ID NO: 217);
KSKVKVLIQLFHKK (SEQ ID NO: 218);
KSKVKWAIQLFHKK (SEQ ID NO: 219);
KSKVGVAIQLFHKK (SEQ ID NO: 220);
KSKVKVAIQLFHKK (SEQ ID NO: 221);
Die Erfindung schließt Peptide ein, die einen Teil von verschiedenen Domänen aufweisen und als Gruppe IV bezeichnet werden:

Gruppe IV:

KWKAQKRFLKKSKVGWLIQLFHKK (SEQ ID NO: 52);
IKISGKWKAQKRFLKKSKVGWLIQLFHKK (SEQ ID NO: 53);
KSKVGWLIQLFHKKKWKAQKRFLK (SEQ ID NO: 70);
IKISGKAβ-(1-naphthyl)KAQFRFLKKSKVGWLIFLFHKK (SEQ ID NO: 83);
IKISGKAβ-(1-naphthyl)KAQFRFLKKSKVGWLIQLFHKK (SEQ ID NO: 88);
KWKAQFRFLKKSKVGWLILLFHKK (SEQ ID NO: 96);
Aβ-(1-naphthyl)Aβ-(1-naphthyl)RFLKF (SEQ ID NO: 136);
KWKAAARFLKKSKVGWLIQLFHKK (SEQ ID NO: 141);
KWKVFKKIEKKSKVGWLIQLFHKK (SEQ ID NO: 147);
IKISGKWKAAβ-(1-naphthyl)Aβ-(1-naphthyl)RFLKKSKVGWLIQLFHKK (SEQ ID NO: 154);
KAβ-(1-naphthyl)KAQAβ-(1-naphthyl)RFLKKSKVGWLIQLWHKK (SEQ ID NO: 155);
KWKAQWRFLKKSKVGWLIQLFHKK (SEQ ID NO: 158);
KAβ-(1-naphthyl)KAQAβ-(1-naphthyl)FLKKSKVGWLILLFHKK (SEQ ID NO: 186);
KWKAQFRFLKKSKVGWLIQLWHKK (SEQ ID NO: 187);
KWKAQFRFLKKSKVGAD-β-(2-naphthyl)LIQLFHKK (SEQ ID NO: 188);
KAβ-(1-naphthyl)KAQAβ-(1-naphthyl)KRFLKKSKVGAD-β-(1-naphthyl)LIQLFHKK (SEQ ID NO: 189);
KWKAQFRFLKKSKVGWLIFLFHKK (SEQ ID NO: 197);
KAβ-(1-naphthyl)KAQFRFLKKSKVGWLILLFHKK (SEQ ID NO: 222).
BPI-Funktionsdomänen-Peptide, die hierin beschrieben sind, sind nützlich als potentielle antibakterielle Mittel für Gram-negative Bakterien und zum Neutralisieren der nachteiligen Wirkungen von LPS, die mit den Zellmembranen von Gram-negativen Bakterien assoziiert sind. Die Peptide der Erfindung weisen, in unterschiedlichen Mengen, zusätzliche Aktivitäten von BPI auf, einschließlich Aktivitäten, die nicht direkt mit der Gram-negativen bakteriellen Infektion verbunden sind, wie Heparin-Bindung und Neutralisation. Peptide, die durch diese Erfindung vorgesehen sind, können auch biologische Aktivitäten aufweisen, die verschieden sind von den bekannten biologischen Aktivitäten von BPI. Zum Beispiel hat man überraschenderweise gefunden, daß einige Ausführungsformen der Peptide der Erfindung einen biologischen Zielbereich für bakterizide Aktivität aufweisen, der breiter ist als BPI und eine bakterizide Aktivität gegen Gram-positive ebenso wie gegen Gram-negative Bakterien aufweist. Man hat überraschenderweise einige Ausführungsformen der Erfindung gefunden, die fungizide Aktivität aufweisen. Somit sieht die Erfindung in vorteilhafter Weise Peptide mit Aminosäuresequenzen der biologisch funktionellen Domänen von BPI vor mit distinkten antimikrobiellen Aktivitäten. Peptide dieser Erfindung, die die Doppeleigenschaft von BPI antibakteriell und anti-endotoxisch besitzen, schließen jene mit einem erweiterten antibiotischen Spektrum ein, die eine neue Klasse von antibiotischen Molekülen darstellen.
BPI-Funktionsdomänen-Peptide der Erfindung werden biologische therapeutische Nützlichkeiten aufweisen, die für BPI-Protein-Produkte erkannt sind. Zum Beispiel wendet sich WO 95/19784 (PCT/U595/01151) der Verwendung von BPI-Proteinprodukten bei der Behandlung von Menschen zu, die Gram-negeativem bakteriellem Endotoxin im Kreislauf ausgesetzt sind. Zum Beispiel betrifft die ebenfalls eigene, ebenfalls anhängige US-Patentanmeldung Nr. 08/031,145, angemeldet am 12. März 1993 und PCT/US94/02463, angemeldet am 11. März 1994 die Verabreichung von BPIProteinprodukten zur Behandlung von mycobakteriellen Erkrankungen. Die ebenfalls eigene, ebenfalls anhängige US-Patentanmeldung Nr. 08/132,510, angemeldet am 5. Oktober 1993, betrifft die Verwendung von BPI-Protein-Produkten bei der Behandlung von Zuständen, die eine abgesenkte Funktion des Reticulo endothelialen Systems umfassen. Zum Beispiel betrifft die ebenfalls eigene, ebenfalls anhängige US- Patentanmeldung Nr. 08/125,651, angemeldet 22. September 1993, synergistische Kombinationen aus BPI-Proteinprodukten und Antibiotika. Zum Beispiel betrifft die ebenfalls eigene, ebenfalls anhängige US-Patentanmeldung 08/093,201, angemeldet am 14. Juli 1993 und PCT/US94/07834, angemeldet am 14. Juli 1994 ein Verfahren zum Potentieren von bakterizider BPIProteinprodukt-Aktivität durch Verabreichen von LBP-Protein-Produkten. Die Offenbarungen der obigen Anmeldungen werden hierduch durch Bezugnahme spezifisch aufgenommen, zur Veranschaulichung der therapeutischen Verwendungen von BPI- Funktionsdomänen-Peptiden der Erfindung. Die BPI-Funktionsdomänen-Peptide der Erfindung weisen auch eine therapeutische Nützlichkeit für die Behandlung von pathologischen Zuständen und Erkrankungszuständen auf, wie offenbart in den oben angegebenen US- Patentanmeldungen mit den Seriennummern 08/030,644, 08/093,202, 08/183,222 und 08/209,762 Stammanmeldungen und der entsprechenden PCT/US94/02465, angemeldet am 11. März 1994.
BPI-Funktionsdomänen-Peptide der Erfindung sind somit nützlich bei Verfahren zum: Neutralisieren der anti-koagulativen Wirkungen von Heparin; Inhibieren von Angiogenese (insbesondere Angiogenese, die mit ocularer Retinopathie verbunden ist); Inhibieren von Endothelzellen-Proliferation (insbesondere Endometriose und Proliferation, die mit Implantation von befruchteten Eiern verbunden ist; Inhibierung von malignem Tumorzellwachstum (insbesondere Kaposi Sarcom-Proliferation); Behandeln chronischer entzündlicher Erkrankungszustände (wie Arthritis und insbesondere reaktive und rheumatoide Arthritis); Behandeln von bakteriellen Gram-negativen Infektionen und Folgeerscheinungen davon; Behandeln der nachteiligen Wirkungen (wie erhöhte Cytokin-Produktion) von Gramnegativem Endotoxin im Blutkreislauf, Abtöten von Gram-negativen Bakterien; Behandeln nachteiliger physiologischer Wirkungen, die mit verminderter Funktion des reticuloendothelialen Systems verbunden sind (insbesondere umfassend herabgesetzte Funktion von Kupfferzellen der Leber, wie sie als Ergebnis von physikalischem, chemischem und biologischem Insult der Leber herrührt); Behandeln, in synergistischer Kombination mit Antibiotika (wie Gentamicin, Polymyxin B und Cefamandole Nafate) Gram-negativer Bakterieninfektion und die Folgeerscheinung davon; Abtöten von Gram-negativen Bakterien in synergistischer Kombination mit Antibiotika; Behandeln, in Kombination mit LBP-Proteinprodukten, von Gram-negativen Bakterieninfektion und den Folgeerscheinungen davon; Abtöten von Gram-negativen Bakterien in Kombination mit LBP-Proteinprodukten; Behandeln, alleine oder in Kombination mit Antibiotika und/oder Wismuth, von Mycobakterien-Infektion (insbesondere Infektion durch M. tubercolösis, M. leprae und M. avium); Behandeln nachteiliger physiologischer Wirkungen (wie erhöhte Cytokinproduktion) von Lipoarabinomannan im Blutkreislauf; Dekontaminieren von Flüssigkeiten (wie Blut, Plasma, Serum und Knochenmark), die Lipoarabinomannan enthalten; und Behandeln von Erkrankungszuständen (wie Gastritis und peptidischer, gastrischer und duodenaler Ulcera), die mit Infektion durch Bakterien des Genus Helicobacter verbunden sind. Die vorliegende Erfindung sieht auch pharmazeutische Zusammensetzungen vor, die für orale, parenterale, topische und Aerosol-Verabreichung sein können und die BPI-Funktionsdomänen- Peptide umfassen, die in Mengen vorliegen können, die wirksam sind für die oben angegebenen Verwendungen, und insbesondere Zusammensetzung, die zusätzlich pharmazeutisch akzeptable Verdünnungsmittel, Adjuvanzien oder Träger umfassen.
Hinsichtlich der Verwendungen von BPI-Funktionsdomänen-Peptiden in Kombination mit LBP-Proteinprodukten schließt "LPB-Protein-Produkt", wie hierin verwendet, natürliches und rekombinantes Produkt Lipopolysaccharid-Bindungsprotein ein; natürliche, synthetische und rekombinante biologisch aktive Polypeptidfragmente und Derivate von Lipopolysaccharid- Bindungsprotein; und biologisch aktive Peptidanaloge, einschließlich Hybridfusions-Proteine, von entweder LBP oder biologisch aktiven Fragmenten davon. LBP-Proteinprodukte, die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung nützlich sind, schließen LBP-Holoprotein ein, welches durch Expression von rekombinanten Genen in transformierten eukaryontischen Wirtszellen produziert werden kam, wie in der ebenfalls eigenen und ebenfalls anhängigen US- Patentanmeldung Nr. 08/079,510, angemeldet am 17. Juni 1993, US-Patentanmeldung 08/261,660 und der entsprechenden PCT/US94/06931, beide angemeldet am 17. Juni 1994, beschrieben, und als rLBP bezeichnet wird. In der Anmeldung sind auch bevorzugte LBP- Proteinderivate beschrieben, denen CD14-vermittelte Entzündungseigenschaften fehlen und insbesondere die Fähigkeit, LPS-Aktivität durch den CD14-Rezeptor zu vermitteln. Derartige LBPProteinprodukte sind für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bevorzugt, da exzessive CD14-vermittelte Immunstimulierung allgemein als unerwünscht betrachtet wird und ist insbesondere bei Patienten so, die unter Infektion leiden.
Bevorzugte LBP-Proteinderivate sind gekennzeichnet als aminoterminale Fragmente mit einem Molekulargewicht von etwa 25 kD. Am meisten bevorzugt sind LBP-aminoterminale Fragmente, die durch die Aminosäuresequenz der ersten 197 Aminosäuren des Amino- Terminus von LBP gekennzeichnet sind, wie angegeben in SEQ ID Nos: 97 und 98, bezeichnet als rLBP25, dessen Herstellung beschrieben ist in den vorher angegebenen und ebenfalls eigenen und ebenfalls anhängigen US-Patentanmeldungen Nr 08/079,510, 08/261,660 und der entsprechenden PCT/US94/06931. Es wird ins Auge gefaßt, daß LBP-Proteinderivate, die wesentlich kleiner als 15 kD sind und im wesentlichen weniger als die ersten 197 Aminosäuren des Aminoterminus des Holo-LPB-Moleküls umfassen, geeignet sind für die Zwecke der Erfindung, vorausgesetzt, daß sie die Fähigkeit beibehalten, an LPS zu binden. Darüber hinaus wird ins Auge gefaßt, daß LBP-Proteinderivate, die mehr als die ersten 197 Aminosäurereste des HoloLBP-Moleküls umfassen, einschließlich Aminosäuren auf der carboxyterminalen Seite der ersten 197 Aminosäuren des rLBP, wie offenbart in SEQ ID NOs: 97 und 98, sich in gleicher Weise als nützlich für die Zwecke der Erfindung erweisen werden, vorausgesetzt, daß ihnen ein Element fehlt, das die CD14vermittelte immunstimulatorische Aktivität fördert. Es wird weiter erwogen, daß die Fachleute in der Lage sind, Additionen, Deletionen und Substitutionen der Aminosäurereste von SEQ ID NOs: 97 und 98 machen zu können, ohne Verlust der erwünschten biologischen Aktivitäten des Moleküls. Weiterhin können noch weiter LBP-Proteinprodukte erhalten werden durch Deletion, Substitution, Addition oder Mutation, einschließlich Mutation durch ortsspezifische Mutagenese der DNA-Sequenz, die für das LBP-Holoprotein kodiert, wobei das LBP-Proteinprodukt LPS-Bindungsaktivität beibehält und der CD14-vermittelten immunstimulatorischen Aktivität ermangelt. Spezifischerweise werden erwogen LBP-Hybridmoleküle und dimere Formen, die zu verbesserter Affinität von LBP für Bakterien und/oder erhöhter Stabilität in vivo führen können. Diese schließen ein LBP/BPI-Hybridproteine und LBP-Ig-Fusionsproteine. Solche Hybridproteine schließen weiter jene ein, die menschliche Gamma-1 oder Gamma-3-Gelenksregionen verwenden, um Dimer-Bildung zu erlauben. Andere Formen von Dimeren, von denen erwogen wird, daß sie erhöhte Serumstabilität und Bindungsaffinität aufweisen, schließen Fusionen mit Fc ein, dem die CH&sub2;-Domäne fehlt, oder Hybride, die Leucin oder Helix-Bündeln verwenden.
BPI-Funktionsdomänen-Peptide der Erfindung können erzeugt und/oder isoliert werden durch ein jegliches Mittel, das in der Technik bekannt ist, einschließlich vermittels rekombinanter Produktion; zum Beispiel offenbaren US-Patent Nr. 5,028,530 und US-Patent Nr. 5,206,154 neue Verfahren für die rekombinanten Herstellung von Polypeptiden, einschließlich antimikrobieller Peptide. Zusätzliche Verfahrensweisen für die rekombinante Produktion von antimikrobiellen Peptiden in Bakterien sind beschrieben worden von Piers et al., 1993, Gene 134: 7-13. Die ebenfalls eigene ebenfalls anhängige US-Patentanmeldung Nr. 07/885,501, angemeldet am 19. Mai 1992, eine Continuation-in-Part davon, US-Patentanmeldung 08/072,063, angemeldet am 19. Mai 1993 und die entsprechende PCT/US93/04752, die hier durch Bezugnahme aufgenommen sind, offenbaren neue Verfahren für die Reinigung von rekombinantem BPI, das exprimiert wird in und sekretiert wird von genetisch transformierten Säugerwirtszellen in Kultur und offenbart, wie man große Mengen an rekombinantem BPI produzieren kann, das geeignet ist für den Einbau in stabile, homogene pharmazeutische Präparate.
BPI-Funktionsdomänen-Peptide können auch in vorteilhafter Weise hergestellt werden unter Verwendung eines jeglichen derartigen Verfahrens. Die Fachleute sind in der Lage, eine Nukleinsäure zu isolieren oder chemisch zu synthetisieren, die ein jedes der Peptide der Erfindung kodiert. Derartige Nukleinsäuren werden in vorteilhafter Weise verwendet als Komponenten für rekombinante Expressionskonstrukte, wobei die Nukleinsäuren in operativer Weise mit Transkriptions- und/oder Translationskontrollelementen verbunden sind, wobei derartige rekombinante Expressionskonstrukte in der Lage sind, die Peptide der Erfindung in Kulturen von prokaryontischen, oder bevorzugterweise eukaryontischen Zellen, am bevorzugtesten Säugetierzellen, zu exprimieren, die mit derartigen rekombinanten Expressionskonstrukten transformiert sind.
Peptide der Erfindung können in vorteilhafter Weise synthetisiert werden mittels einer jeglichen chemischen Synthesetechnik, die in der Technik bekannt ist, insbesondere Festphasen- Synthesetechniken, z. B., unter Verwendung kommerziell erhältlicher automatischer Peptidsynthese-Apparate. Derartige Peptide können auch vorgesehen werden in der Form von Kombinationspeptiden, wobei die Peptide, die die Kombination umfassen, in linearer Weise aneinander gebunden sind und worin eine BPI-Sequenz wiederholt im Peptid vorhanden ist, mit oder ohne Trennung durch "Spacer"-Aminosäuren, was eine ausgewählte Konformationspräsentation erlaubt. Es sind auch verzweigtkettige Kombinationen vorgesehen, wobei die Komponenten-Peptide kovalent vermittels Funktionalitäten in Aminosäureseitenketten der Aminosäuren, die die Peptide umfassen, kovalent verknüpft sind.
Funktionsdomänen-Peptide dieser Erfindung können vorgesehen werden als rekombinante Hybridfusionsproteine, die BPI-Funktionsdomänen-Peptide und wenigstens einen Teil von wenigstens einem anderen Polypeptid umfassen. Derartige Proteine sind beschrieben, zum Beispiel, in Theofan et al. in der gleichfalls eigenen, ebenfalls anhängigen US- Patentanmeldung 07/885,911, angemeldet am 19. Mai 1992, eine Continuation-in-part- Anmeldung davon, US-Patentanmeldung Nr. 08/064,693 angemeldet am 19. Mai 1993 und der entsprechenden PCT/US93/04754 die in ihrer Gesamtheit hier durch Bezugnahme aufgenommen sind, beschrieben.
Im allgemeinen werden die Fachleute erkennen, daß Peptide, wie hierin beschrieben, durch eine Vielzahl chemischer Techniken modifiziert werden können, um Verbindungen herzustellen mit im wesentlichen derselben Aktivität wie die unmodifizierten Peptide und optional mit anderen erwünschten Eigenschaften. Zum Beispiel können CarboxylsäureGruppen des Peptids, egal ob Carboxyl-terminal oder in der Seitenkette, vorgesehen werden in der Form eines Salzes eines pharmazeutisch akzeptablen Kations oder verestert sein, um einen C&sub1;&submin;C&sub1;&sub6;&submin; Ester zu bilden, oder in ein Amid der Formel NR&sub1;R&sub2; umgewandelt werden, wobei R&sub1; und R&sub2; jeweils unabhängig H oder C&sub1;&submin;C&sub1;&sub6;&submin;Alkyl ist, oder kombiniert werden, um einen heterozyklischen Ring, wie einen 5- oder 6-gliedrigen Ring zu bilden. Aminogruppen des Peptids, unabhängig davon, ob aminoterminal oder in der Seitenkette, können in der Form von pharmazeutisch akzeptablen Säureadditionssalzen vorliegen, wie HCI, HBr, Essigsäure, Benzoe-, Toluolsulfon-, Malein-, Wein- und anderen organischen Salzen, oder können modifiziert sein zu C&sub1;&submin;C&sub1;&sub6;&submin;Alkyl oder Dialkylamino oder weiter umgewandelt sein zu einem Amid. Hydroxylgruppen der Peptidseitenkette können zu C&sub1;-C&sub1;&sub6;-Alkoxy oder zu einem C&sub1;C&sub1;&sub6;-Ester unter Verwendung gut bekannter Techniken umgewandelt werden. Phenyl- und Phenolringe der Peptidseitenkette können substituiert werden mit einem oder mehreren Halogen-Atomen, wie Fluor, Chlor, Brom oder Jod, oder mit C&sub1;-C&sub1;&sub6;-Alkyl, C&sub1;-C&sub1;&sub6;-Alkoxy, Carboxylsäuren und Estern davon, oder Amiden derartiger Carboxylsäuren. Methylengruppen der Peptidseitenketten können verlängert werden zu homologen C&sub2;-C&sub4;-Alkylenen. Thiole können mit irgendeiner von einer Anzahl gut bekannter Schutzgruppen geschützt werden, wie Acetaminogruppen. Die Fachleuten werden auch Verfahren erkennen zum Einführen von zyklischen Strukturen in die Peptide der Erfindung, um Konformationsbeschränkungen für die Struktur auszuwählen und vorzusehen, was zu verstärkter Bindung und/oder Stabilität führt. Zum Beispiel kann ein carboxylterminaler oder aminoterminaler Cysteinrest an das Peptid hinzugefügt werden, so daß, wenn oxidiert, das Peptid eine Disulfid-Brücke enthalten wird und dadurch ein zyklisches Peptid erzeugen wird. Andere Peptid-Zyklisierungsverfahren schließen die Bildung von Thioethern und carboxy- und aminoterminalen Amiden und Estern ein.
Peptidomimetische und organomimetische Ausführungsformen werden hiermit auch explizit als innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung liegend erklärt, wobei die dreidimensionale Anordnung der chemischen Bestandteile derartiger Peptido- und Organomimetika die dreidimensionale Anordnung des Peptidrückgrats und der Komponentenaminosäureseitenketten im Peptid nachahmt, was zu solchen Peptido- und Organomimetika der Peptide dieser Erfindung mit wesentlicher biologischer Aktivität führt. Es wird impliziert, daß eine pharmakologische Wirkgruppe existiert für eine jede der für BPI beschriebenen Aktivitäten. Eine pharmakologische Wirkgruppe ist eine idealisierte, dreidimensionale Definition der Strukturanforderung für biologische Aktivität. Peptido- und Organomimetika können so mit derzeitiger Computermodellierungs-Software (computerunterstütztes Wirkstoff-Design) konstruiert werden, daß sie zu einer jeglichen pharmakologischen Wirkgruppe passen. Der Umfang der Überlappung zwischen den spezifischen Aktivitäten von pharmakologischen Wirkgrippen bleibt zu bestimmen.
Die Verabreichung von BPI-Funktionsdomänen-Peptiden wird bevorzugterweise vorgenommen mit einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die ein BPIFunktionsdomänen-Peptid und ein pharmazeutisch akzeptables Verdünnungsmittel, Adjuvans oder Träger umfaßt. Die BPI-Funktionsdomänen-Peptidzusammensetzung kann verabreicht werden ohne oder in Verbindung mit bekannten Antibiotika, oberflächenaktiven Mitteln oder anderen chemotherapeutischen Mitteln. Beispiele derartiger Kombinationen sind beschrieben in der ebenfalls eigenen, ebenfalls anhängigen US-Patentanmeldung Nr. 08/012,360, angemeldet am 2. Februar 1993, der Continuation-in-part US-Patentanmeldung Nr. 08/190,869, angemeldet am 2. Februar 1994 und der entsprechenden PCT/US94/01239, angemeldet am 2. Februar 1994, deren Offenbarungen hier durch Bezugnahme aufgenommen sind.
Wirksame Dosen von BPI-Funktionsdomänen-Peptiden für bakterizide Aktivität, teilweise oder vollständige Neutralisation der Anti-Koagulationswirkung von Heparin, teilweise oder vollständige Neutralisierung von LPS und andere Wirkungen, die hierin beschrieben sind, können leicht bestimmt werden von den Fachleuten entsprechend den herkömmlichen Parametern, jeweils mit der entsprechenden biologischen Aktivität verbunden einschließlich, z. B., der Größe des Patienten, des Umfangs und der Art der bakteriellen Infektion, des Umfangs und der Art des endotoxischen Schocks und der Menge des dem Patienten verabreichten Heparins und der Zeit seit Verabreichung des Heparins. Ähnliche Bestimmungen werden vorgenommen werden von den Fachleuten auf diesem Gebiet zur Verwendung der Peptidausführungsformen dieser Erfindung für therapeutische Verwendungen, die hierin ins Auge gefaßt und beschrieben sind.
Ausführungsformen der Erfindung, die Medikamente umfassen, können hergestellt werden für orale Verabreichung, Injektion oder andere parenterale Verfahren und schließen bevorzugterweise herkömmliche pharmazeutisch akzeptable Träger, Adjuvanzien und Gegenionen ein, wie den Fachleuten bekannt wäre. Die Medikamente liegen bevorzugterweise in der Form einer Einheitsdosis in festen, halbfesten und flüssigen Dosierungsformen vor, wie Tabletten, Pillen, Puder, flüssige Lösungen oder Suspensionen und injizierbare und infundierbare Lösungen. Wirksame Dosierungsbereiche von etwa 100 ug/kg bis etwa 100 mg/kg Körpergewicht werden ins Auge gefaßt.
Die folgenden Beispiele sollen spezifische Ausführungsformen dieser Erfindung und verschiedene Verwendungen davon veranschaulichen. Beispiel 1 beschreibt die Herstellung von proteolytischen Fragmenten von BPI; Beispiel 2 beschreibt die Ergebnisse von bakteriziden Tests der proteolytischen Fragmente von Beispiel 1; Beispiel 3 beschreibt die Ergebnisse von Heparin-Bindungstests unter Verwendung der proteolytischen Fragmente von Beispiel 1; Beispiel 4 beschreibt die Ergebnisse von Experimenten unter Verwendung von Limulus- Amoebocytenlysaten, um die LPS-Bindungsaktivität der proteolytischen Fragmente von Beispiel 1 zu testen; Beispiel 5 beschreibt die Herstellung von 15mer Peptiden von BPI; Beispiel 6 beschreibt die Ergebnisse von Heparin-Bindungstests unter Verwendung der 15mer Peptide von Beispiel 5; Beispiel 7 beschreibt die Ergebnisse von Limulus-Amoebocytenlysat-Tests unter Verwendung der 15-mer Peptide von Beispiel 5; Beispiel 8 beschreibt die Ergebnisse von bakteriziden Tests der 15-mer Peptide von Beispiel 5; Beispiel 9 beschreibt die Herstellung von einzelnen BPI-Funktionsdomänen-Peptiden; Beispiel 10 beschreibt die Ergebnisse von Heparin-Bindungstests unter Verwendung der einzelnen Funktionsdomänen-Peptide von Beispiel 9; Beispiel 11 beschreibt die Ergebnisse von Heparin-Neutralisationstests unter Verwendung der einzelnen BPI-FunktionsdomänenPeptide von Beispiel 9; Beispiel 12 beschreibt die Ergebnisse von Limulus-Amoebocytenlysat-Tests von LPS-Neutralisationswirkung unter Verwendung der einzelnen BPI-Funktionsdomänen-Peptide von Beispiel 9; Beispiel 13 beschreibt die Ergebnisse von bakteriziden Tests der einzelnen BPI-Funktionsdomänen-Peptide von Beispiel 9; Beispiel 14 beschreibt die Herstellung von BPI-Kombinations- Funktionsdomänen-Peptiden; Beispiel 15 beschreibt die Ergebnisse von Tests auf bakterizide Aktivität der BPIKombinations-Funktionsdomänen-Peptide von Beispiel 14; Beispiel 16 beschreibt die Ergebnisse von zusätzlichen Tests auf bakterizide Aktivität der BPI- Kombinations-Funktionsdomänen-Peptide von Beispiel 14; Beispiel 17 beschreibt die Ergebnisse von in vivo und in vitro Heparin-Neutralisationstests unter Verwendung der BPI- Kombinations-FunktionsdomänenPeptide von Beispiel 14; Beispiel 18 beschreibt die Herstellung und Funktionsaktivitätsanalyse von bakterizider Aktivität, HeparinBindungsaktiviät und LPSNeutralisations-Aktivitätstests von BPI-SubstitutionsvariantenFunktionsdomän- Peptiden; Beispiel 19 sieht eine Zusammenfassung der Ergebnisse von bakteriziden und Heparin-Bindungstests vor unter Verwendung repräsentativer BPI-Funktionsdomänen-Peptide; Beispiel 20 beschreibt die Analyse von BPI-Funktionsdomänen-Peptide in einer Vielzahl von Bindungs- und Neutralisationstests; Beispiel 21 wendet sich einem HeparinNeutralisationstest zu; Beispiel 22 beschreibt Verabreichung von BPI-FunktionsdomänenPeptiden in Modellsystemen aus Collagen- und Bakterieninduzierten ArthritisTiermodellsystemen, die die Behandlung chronischer entzündlicher Erkrankungszustände beispielhaft darstellen; Beispiel 23 veranschaulicht das Testen von BPI-FunktionsdomänenPeptiden für angiostatische Wirkungen in einem Maus-Modellsystem für maligne MelanomMetastase; Beispiel 24 betrifft Wirkungen von BPI-Funktionsdomänen-Peptiden auf Endothelzellproliferation; Beispiel 25 beschreibt die Analyse von BPI-FunktionsdomänenPeptiden in Tiermodell-Systemen; und Beispiel 26 beschreibt ein Protokoll zum Testen der anti-Endotoxin-Wirkungen von BPI- Funktionsdomänen-Peptiden der Erfindung in vivo beim Menschen. Beispiel 27 beschreibt die Verabreichung von BPI-Funktionsdomänen-Peptiden, um sie auf ihre antibakteriellen Effekte gegen Antibiotika-resistente Stämme zu testen.

Beispiel 1

Herstellung von BPI-Proteolysefragmenten

Chemische Spaltung und enzymatische Verdauungsverfahren wurden auf rBPI&sub2;&sub3;, um verschieden große proteolytische Fragmente des rekombinanten BPI-Proteins herzustellen.
rBPI&sub2;&sub3;-Protein wurde reduziert und alkyliert vor Proteolyse durch Cyanbromid (CNBr) oder Endoproteinase Asp-N. Das Protein wurde durch Präzipitation über Nacht nach dem Hinzufilgen von kaltem (4ºC) Aceton (1 : 1 v/v) entsalzt und das präzipitierte Protein wiedergewonnen durch Pelletieren unter Zentrifugation (5000 · g) für 10 Minuten. Das pBPI&sub2;&sub3;-Protein-Pellet wurde zweimal mit kaltem Azeton gewaschen und unter einem Stickstoffstrom getrocknet. Eine rBP&sub2;&sub3;-Lösung wurde dann auf eine Endkonzentration von 1 mg Protein/mL in 8 M Harnstoff/0,1 M Tris-HCl (pH 8,1) rekonstituiert und reduziert unter Hinzufügen von 3, 4 mM Dithiothreitol (Calbiochem, San Diego, CA) für 90 Minuten bei 37ºC. Alkylierung wurde vorgenommen durch das Hinzufügen von Jodacetamid (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) auf eine Endkonzentration von 5,3 Millimolar und Inkubation für 30 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur. Das reduzierte und alkylierte Protein wurde mit Aceton präzipitiert, zentrifugiert und gewaschen, wie oben beschrieben, und das Pellet wurde wieder gelöst, wie oben beschrieben, für entweder CNBr- oder Asp-N-Verdauung.
Für CNBr-katalysierte Proteinfragmentierung wurde das gewaschene Pellet zuerst in 70% Trifluoressigsäure (TFA) (Proteinsequenzierungsgrad, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) auf eine Endproteinkonzentration von 500 mg/ml gelöst. Cyanbromid (Baker Analyzed Reagent, VWR Scientific, San Francisco, CA), gelöst in 70% TFA, wurde hinzugegeben, um ein Endverhältnis von 2 : 1 von CNBr zu Protein zu ergeben (w/w). Dieses Verhältnis führte zu einem etwa 75-fachem molaren Überschuß an CNBr relativ zur Anzahl der Methionin-Reste im rBPI&sub2;&sub3;-Protein. Die Reaktion wurde mit Stickstoff begast und für 24 Stunden im Dunkeln bei Raumtemperaturen fortzuschreiten erlaubt. Die Reaktion wurde beendet durch Hinzufügen von 9 Volumina destilliertem Wasser und von Einfrieren (-70ºC) und Lyophilisierung gefolgt.
Für Endoproteinase-Verdauung wurde das reduzierte und alkylierte rBPI&sub2;&sub3; bei einer Konzentration von 5,0 mg/ml in 8 M Harnstoff/0,1 M Tris-HCl (pH 8,1) solubilisiert. Ein gleiches Volumen von 0,1 M Tris-HCl (pH 8,1) wurde dann hinzugesetzt, so daß die Endkonzentrationen 2,5 mg/ml Protein in 5 M Harnstoft/0,1 M Tris-HCl (pH 8,1) betrugen. Endoproteinase Asp-N von Pseudomonas fragi (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) wurde in einem Verhältnis von 1 : 1000 (w/w, Enzym : Substrat) zugesetzt und man lies die Verdauung für 6 Stunden bei 37ºC voranschreiten. Die Reaktion wurde beendet durch Hinzufügen von TFA zu einer Endkonzentration von 0,1% und die Proben wurden dann durch Umkehrphasen-HPLC fraktioniert.
Die CNBr- und Asp-N-Fragmentmischungen wurden auf einer Zorbax Protein Plus C3-Säule (4,6 · 250 mm, 300 Å Porengröße, MACMOD Analytical Inc. Chadsford, PA) gereinigt. Ein Gradient, der von 5% Acetonitril in 0,1% TFA bis 80% Acetonitril in 0,1% TFA reichte, wurde über diese Säule über eine zweistündige Elutionsperiode bei einer Flußrate von 1,0 ml/min. laufen gelassen. Die Fragmentelution wurde überwacht bei 220 nm unter Verwendung einer Beckman System Gold HPLC (Beckman Scientific Instruments, San Ramon, CA). Das Säulenheizungskompartiment wurde bei 35ºC gehalten und die Fraktionen wurden manuell gesammelt, bei -70ºC eingefroren und in einem Speed Vac-Konzentrator getrocknet. Die Fragmente wurden dann in einer Lösung aus 20 mM Natriumacetat (pH 4,0)/0,5 M NaCl vor der Verwendung solubilisiert.
Elektrosprühionisations-Massenspektrometrie (ESI-MS) wurde an einem VG Bio-Q Massenspektrometer von Dr. Francis Bitsch und Mr. John Kim im Labor von Dr. Cedric Shackleton, Children's Hospital-Oakland Research Institute, durchgeführt. Molekülmassen wurden durch mathematische Transformation der Daten erhalten.
Obwohl die DNA-Sequenz für rBPI&sub2;&sub3; die Aminosäurereste 1-199 des reifen Proteins codiert, ist ein wesentlicher Anteil des produzierten Proteins bei Leu-193 und Val-195 verkürzt, wie bestimmt durch ESI-MS. Die Existenz dieser carboxylterminalen Verkürzungen wurde verifiziert durch Isolieren der carboxylterminalen tryptischen Peptide, die sequenziert und mittels ESI-MS analysiert wurden.
Es gibt sechs Methionin-Reste in rBPI&sub2;&sub3;-Protein, an Positionen 56, 70, 100, 111, 170 und 196 und die chemische Spaltung mittels Cyanbromid lieferte sechs Hauptpeptid-Fragmente, wie vorhergesagt. Die Ergebnisse der CNBr-Spaltungsexperimente sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Die Fragmente wurden isoliert durch Umkehrphasen (C&sub3;)-HPLC (Fig. 1a) und ihre aminoterminalen Sequenzen durch Edman-Abbau bestimmt. Die zwei größten Fragmente (C1 und C5) wurden nicht durch die C&sub3; HPLC-Säule aufgelöst und weitere Bemühungen, sie durch Ionenaustauschchromatographie aufzulösen, waren nicht erfolgreich, mutmaßlich deshalb, weil sie hinsichtlich Länge und isoelektrischem Punkt ähnlich sind. Die Identitäten der C1, C5-Fragmente innerhalb der Mischung wurden bestimmt durch ESI-MS. Die vorhergesagte Masse von C1 beträgt 6269 (Tabelle I), was den Verlust von 30 a.m.u. berücksichtigt, der aus der Umwandlung des carboxyterminalen Methionins in Homoserin während der CNBr-Spaltungsreaktion resultiert. Die beobachtete Masse von 6251,51 ± 0,34 ist in Übereinstimmung mit dem Verlust eines Wassermoleküls (18 a.m.u.) in einem Homoserinlacton- Zwischenprodukt, welches über die Bildung des Homoserins bevorzugt sein kann infolge der Hydrophobizität der C-terminalen Aminosäuren des C1-Fragmentes. Die vorhergesagte Masse des C5-Fragmentes beträgt 6487 und die beobachtete Masse beträgt 6385,84 ± 0,39 (Tabelle I). Für das C5-Fragment sind die C-terminalen Aminosäuren hydrophil, so daß die Hydrolyse des Homoserinlacton-Zwischenproduktes wahrscheinlich bevorzugt ist. Sowohl aus dem aminoterminalen Sequenzieren als auch den Massenspektrumdaten stellt die C5- Komponente etwa 10-25% des Materials in der C1/C5 Mischung dar.
Proteolytische Spaltung mit Endoproteinase Asp-N wurde durchgeführt, um zusätzliche Fragmente für die Regionen vorzusehen, die innerhalb der CNBr-C1/C5-Mischung enthalten sind. Es gibt sechs Asparaginsäure-Reste innerhalb der rBP&sub2;&sub3;-Sequenz an Positionen 15, 36, 39, 57, 105 und 116. Die sechs Haupt-Asp-N-Fragmente, die durch C&sub3;-HPLC isoliert wurden (Fig. 1b), wurden sequenziert und die Massen bestimmt durch ESI-MS (Tabelle I). Eine kurze Verdauung bei einem 1 : 1000 (w/w, Enzym : Substrat)-Verhältnis wurde verwendet, um potentielle nicht-spezifische Spaltungen zu eliminieren, insbesondere bei Glutaminsäureresten. Es ist offensichtlich, daß sich diese Verdauung nicht bis zur Vollständigkeit fortsetzt, da ein Fragment (1-38) isoliert wurde, wo Asp-Reste (Aminosäuren 15 und 35) nicht gespalten waren. Die Massenspektren der Asp-N-Fragmente waren konsistent mit den vorhergesagten Massen für ein jedes einzelne Fragment. Im Unterschied zur CNBr-Spaltung, wo das carboxylterminale Fragment schwach aufgelöst war, war das Asp-N-Fragment von Aminosäure 116 bis zum Carboxyl-Terminus von all den anderen AspN-Fragmenten gut getrennt. Tabelle 1 Zusammenfassung von rBPI&sub2;&sub3;-Spaltungsfragmentanalyse CNBr -Spaltungsfragmente Asp-N-proteolytische Fragmente

Beispiel 2

Bakterizide Wirkungen von BPI-Proteolysefragmenten

BPT-Proteolysefragmente, die gemäß Beispiel 1 hergestellt wurden, wurden auf bakterizide Wirkungen gescreent unter Verwendung rauher mutierter E. coli J5-Bakterien in einem Radialdiffusionstest. Speziell wurde eine Übernacht-Kultur von E. coli J5 1 : 50 in frischer tryptonischer Sojabrühe verdünnt und für 3 Stunden bei 37ºC inkubiert, um log = PhasenWachstum der Kultur zu erreichen. Die Bakterien wurden dann pelletiert bei 3000 Upm für 5 Minuten in einer Sorvall RT6000B-Zentrifuge (Sorvall Instruments, Newton, CT). 5 ml 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,4) wurden hinzugesetzt und das Präparat wurde erneut pelletiert. Der Überstand wurde dekantiert und 5 ml frischer Puffer wurden hinzugesetzt, die Bakterien resuspendiert und ihre Konzentration bestimmt durch Messen der Absorbanz bei 590 mm (ein Absorbanz-Wert von 1,00 bei dieser Wellenlänge entspricht einer Konzentration von 1,25 · 10&sup9; CFU/ml in Suspension). Die Bakterien wurden auf 4 · 10&sup6; CFU/ml in 10 ml geschmolzener Unterschicht-Agarose (bei etwa 45ºC) verdünnt und wiederholt umgedreht, um in 15 ml Polypropylen-Röhrchen gemischt zu werden, die für diesen Zweck gewöhnlicherweise verwendet werden.
Der gesamte Inhalt dieser Röhrchen wurde dann in eine Petrischale mit quadratischem Boden gegossen und gleichmäßig verteilt durch Schwenken von einer Seite auf die andere. Die Agarose härtete in weniger als 30 Sekunden aus und wies eine einheitliche Dicke von etwa 1 mm auf. Eine Reihe von Näpfen wurde dann in die ausgehärtete Agarose gestochen unter Verwendung eines sterilen 3 mm Stanzwerkzeuges, das an eine Vakuumvorrichtung angeschlossen war. Das Stanzwerkzeug wurde vor Verwendung sterilisiert mit 100% Alkohol und erlaubt, an der Luft zu trocknen, um Kontaminieren der Bakterienkultur zu vermeiden.
5 oder 10 ul von einem jeden der BPI-Fragmente wurden vorsichtig in jeden Napf pipettiert. Als eine Negativ-Kontrolle wurde Verdünnungspuffer (pH 8,3) in einen getrennten Napf hinzugegeben und rBPI&sub2;&sub3; bei Konzentrationen von 5 ug/ml und 1 ug/ml wurde auch als Positiv- Kontrollen hinzugegeben. Eine jede Platte wurde bei 37ºC für 3 Stunden inkubiert und dann wurden 10 ml geschmolzene Überschichtungsagarose (bei etwa 45ºC) auf die waagrechte Petri-Schalen hinzugegeben, auszuhärten erlaubt und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Am nächsten Tag wurde eine klare Zone gegen den Bakerienrasen in jenen Näpfen mit bakterizider Aktivität festgestellt. Um diese Zone visuell zu verstärken, wurde eine verdünnte Coomassie-Lösung (bestehend aus 0,002% Coomassie Brilliant Blau, 27% Methanol, 15% Formaldehyd (37% Stammlösung) und Wasser) über den Agar gegossen und für 24 Stunden zu färben erlaubt. Die Bakterienzonen wurden mit einem Mikrometer gemessen.
Es wurde keine bakterizide Aktivität für die rBPI&sub2;&sub3;-Fragmente festgestellt, die durch CNBr- oder Asp-N-Verdauung herstellt wurden, wenn sie bei Mengen von bis zu 25 pMol/Napf getestet wurden. Im Gegensatz dazu wies dieser Test nachweisbare bakterizide Aktivität auf bei Verwendung von rBPI&sub2;&sub3; in Mengen von sowenig wie 0,75 pMol/Nap£ Reduziertes und alkyliertes rBPI&sub2;&sub3; andererseits war auch nicht bakterizid bei Mengen bis zu 100 pMol/Napf, wohingegen alkyliertes rBPI&sub2;&sub3; bakterizide Aktivität entsprechend rBPI&sub2;&sub3; beibehielt.

Beispiel 3

Heparin-Bindung durch BPI-Proteolysefragmente

rBPI&sub2;&sub3; und die BPI-Proteolysefragmente, die gemäß Beispiel 1 hergestellt wurden, wurden in Heparin-Bindungstests bewertet, entsprechend den in Beispiel 1 in der US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/093,202, eingereicht am 15. Juli 1993 (die zweite Prioritätsanmeldung hiervon) beschriebenen Verfahren. Kurz gesagt, wurde ein jegliches Fragment zu Näpfen einer Mikrotiterplatte mit 96 Näpfen mit einer PolyvinylidendifluoridMembran (Immobilon-P, Millipore, Bedford, MA) hinzugegeben, die am Boden der Näpfe abgelegt war. Heparin-Bindung von CNBr-Fragmenten wurde abgeschätzt unter Verwendung von 100 Picomol eines jeden Fragmentes pro Napf mit einer Sättigungskonzentration von ³HHeparin (20 ug/ml). Positive Kontrollnäpfe enthielten verschiedene Mengen an rBPI&sub2;&sub3;. Die Näpfe wurden getrocknet und nachfolgend mit 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) in Phosphat-gepufferter Säline, pH 7,4 (Blockierungspuffer) geblockt. Verdünnungen von ³HHeparin (0,03-20 uCi/ml, durchschnittliches Molekulargewicht = 15.000; DuPont-NEN, Wilmington, DE) wurden in dem Blockierungspuffer hergestellt und in den BPI-Peptid enthaltenden Näpfen für eine Stunde bei 4ºC inkubiert. Das ungebundene Heparin wurde abgesaugt und die Näpfe dreimal mit Blockierungspuffer gewaschen, getrocknet und für Quantifizierung in einem Flüssigscintillationszähler (Modell 1217, LKB, Gaithersburg, MD) entfernt. Obwohl BSA im Blockierungspuffer eine geringe Affinität und Kapazität aufwies, Heparin zu binden, wurde dies als physiologisch irrelevant betrachtet und der Hintergrund routinemäßig vom Signal der Testverbindung abgezogen. Die Spezifität von FragmentHeparin-Bindung wurde bestimmt, indem gezeigt wurde, daß das Binden von radiomarkiertem Heparin vollständig durch einen hundertfachen Überschuß an unmarkiertem Heparin inhibiert wurde (Daten nicht gezeigt).
Die Ergebnisse, dargestellt in Tabelle II (als die Mittelwerte von Doppelnäpfen ± dem Bereich zwischen den beiden Werten), zeigten, daß die CMBr-Fragmente, die die Aminosäuren 71-100 (C3) und 1-56 und 112-170 (C1,5) Heparin in einem ähnlichen Umfang banden. Das CNBr-Fragment 171-196 band auch mehr Heparin als das Kontroll-Protein (Thaumatin, ein Protein mit ähnlichem Molekulargewicht und ähnlicher Ladung wie rBPI&sub2;&sub3;).
Die Asp-N-Fragmente zeigten auch mehrfache Heparin-Bindungsregionen in rBPI&sub2;&sub3;. Wie aus Tabelle II ersichtlich, band das 57-104 Asp-N-Fragment die größte Menge an Heparin, gefolgt von den 1-38- und 116-193-Fragmenten. Diese Daten, in Verbindung mit den CNBr- Fragment-Daten zeigten an, daß es innerhalb des rBPI&sub2;&sub3; mindestens drei Heparin- Bindungsregionen gibt, wie gezeigt durch chemisch oder enzymatisch erzeugte Fragmente von rBPIz3, wobei die höchste Heparin-Bindungskapazität innerhalb der Reste 71-100 liegt. Tabelle II Heparin-Bindung von rBPI&sub2;&sub3;-Fragmenten

Beispiel 4

Wirkung von BPI-Proteolysefragmenten auf einen LAL-Test

BPI-Proteolysefragmente, die entsprechend Beispiel 1 hergestellt wurden, wurden einem Limulus-Amoebocyten-Lysat (LAL)-Inhibitionstest unterworfen, um LPS - Bindungseigenschafien dieser Fragmente zu bestimmen. Speziell wurde ein jedes der Fragmente in Eppendorf-Röhrchen gemischt mit einer bestimmten Konzentration an E. coli 0113 LPS (Endkonzentration 4 ng/ml) und bei 37ºC für 3 Stunden unter gelegentlichem Schütteln inkubiert. Zusätzliche Kontrollen, die rBPI&sub2;&sub3; bei 0,05 ug/ml umfaßten, wurden auch getestet. Nach der Inkubation wurden 360 pl Dulbecco's Phosphat-gepufferte Saline (D-PBS; Grand Island Biological Co. (GIBCO), Long Island, NY) zu jedem Röhrchen hinzugesetzt, um eine LPS-Konzentration von 200 pg/ml für den LAL-Test zu erhalten. Jede Probe wurde dann in Immulon II-Streifen (Dynatech, Chantilly, VA) in Volumina von 50 ul/Napf überführt.
Limulus-Amoebocytenlysat (Quantitative Chromogenic LAL-Kit, Whitaker Bioproducts, Inc., Walkersville, MD) wurde hinzugesetzt mit 50 ul/Napf und die Näpfe bei Raumtemperatur für 25 Minuten inkubiert. Homogenes Substrat wurde dann mit einem Volumen von 100 ul/Napf hinzugegeben und gut gemischt. Nach Inkubation für 10-30 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Reaktion durch Hinzufügen von 100 ul 25% (v/v) Essigsäure gestoppt. Die optische Dichte bei 405 nm wurde dann in einem Mehrfachlesegerät (Modell Vmax, Molecular Dynamics, Menlo Park, CA) gemessen und die Ergebnisse in Fig. 2 als Prozent Inhibierung von LPS dargestellt. In dieser Figur stellen die vollen Kreise pBPI&sub2;&sub3; dar, die offenen Kreise stellen Asp-N-Fragmente A3 dar; das x stellt Asp-N-Fragment A2 dar; die ausgefüllten Quadrate stellen ASP-N-Fragmente A4 dar; die ausgefüllten Dreiecke stellen Asp-N-Fragmente A1A2 dar; die offenen Quadrate stellen Asp-N-Fragment A6a dar; die kleinen offenen Dreiecke stellen CNBr-Fragment C3 dar; und die kleinen ausgefüllten Quadrate stellen CNBr- Fragment C1/C5 dar.
Die CNBr-Verdaufraktion, die Aminosäurefragmente 1-56 und 112-170 enthielt, inhibierte die LPS-induzierte LAL-Reaktion bei einer IC&sub5;&sub0; von etwa 100 nM. Diese IC&sub5;&sub0; ist etwa 10- fach höher als die IC-50 für intaktes rBPIz3 (9 nM) im gleichen Test. Die anderen CNBr- Verdaufragmente wurden als nicht inhibitorisch festgestellt.
Ein geringfügig verschiedenes Ergebnis wurde beobachtet mit Fragmenten, die durch Asp-N- Verdau erzeugt wurden, wo man feststellte, daß drei Fragmente im LAL-Test inhibitorisch waren. Das Fragment entsprechend Aminosäuren 116-193 wies eine LAL-inhibitorische Aktivität ähnlich der von intaktem rBPI&sub2;&sub3; auf mit vollständiger Inhibierung der LPS-induzierten LAL-Reaktion bei 15 nM. Die Fragmente entsprechend Aminosäuren 57-104 und 1-38 inhibierten auch den LAL-Test, benötigen aber 10-fach höhere Mengen. Diese Ergebnisse, zusammen mit den CNBr-Verdau-Ergebnissen, stützen weiter die Schlußfolgerung von kürzlich beschriebenen experimentellen Ergebnissen, daß wenigstens drei Regionen des rBPI&sub2;&sub3;- Moleküls die Fähigkeit aufweisen, LBS-Aktivierung der LAL-Reaktion zu neutralisieren, wobei die potenteste Region innerhalb des 116-193 Aminosäurefragmentes zu existieren scheint.
Immunreaktivitätsstudien der Proteolysefragmente von rBPI&sub2;&sub3;, wie beschrieben in Beispiel 1, wurden durchgeführt unter Verwendung von ELISA-Tests. In solchen Tests wurden ein polyklonaler Kaninchen-anti-rBPI&sub2;&sub3;-Antikörper, der in der Lage ist, bakterizide rBPI&sub2;&sub3;- und LAL- Inhibitionseigenschaften zu blockieren, und zwei verschiedene, nicht blockierende monoklonale anti-rBPI&sub2;&sub3;-Maus-Antikörper verwendet, um die rBPI&sub2;&sub3;-Proteolysefragmente zu untersu,chen. Man fand, daß der polyklonale Antikörper immunreaktiv mit den 116-193- und 57-104- Asp-N-Fragmenten und mit den 1-56- und 112-170-CNBr-Fragmenten ist, wohingegen die murinen monoklonalen Antikörper nur mit einem Asp-N-Fragment reagierten, das Reste 1-14 von rBPI&sub2;&sub3; darstellte.

Beispiel 5

Herstellung von 15-mer Peptiden von BPI

Um weiter die Domänen biologischer Aktivität zu bewerten; die in BPI-Fragmenten-Tests, beschrieben in den Beispielen 1-14, nachgewiesen wurden, wurden synthetische 15-mer Peptide hergestellt, die 15 Aminosäuren umfassen, die von der Aminosäuresequenz des 23 kD aminoterminalen Fragments von BPI abgeleitet wurden, und hinsichtlich Heparin- Bindungsaktivität, Aktivität in einem Limiulus-Amoebocytenlysat-Inhibitions (LAL)-Test und die bakterizide Aktivität bewertet. Speziell wurde eine Serie von 47 synthetischen Peptiden hergestellt, doppelt, jeweils umfassend 15 Aminosäuren und so synthetisiert, daß ein jedes Peptid eine überlappende Aminosäuresequenz von 11 Aminosäuren mit den benachbarten Peptiden der Serie teilte, auf der Basis der Sequenz von rBPI&sub2;&sub3;, wie beschrieben in der US- Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/093,202, eingereicht am 15. Juli 1993 (die zweite Prioritätsanmeldung hiervon).
Peptide wurden gleichzeitig synthetisiert gemäß dem Verfahren von Maeji et al., (1990, Immunol. Methods 134: 23-33) und Gammon et al. (1991, J. Exp. Med. 173: 609-617) unter Verwendung der Festphasentechnologie von Cambridge Research Biochemicals Ltd. unter der Lizenz von Coselco Mimotopes Pty. Ltd. Kurz gesagt wurde die Sequenz von rBPI23 (1199) in 47 verschiedene 15-mer Peptide aufgeteilt, die entlang der linearen Sequenz von rBPI&sub2;&sub3; fortschritten, indem ein nachfolgendes Peptid alle fünf Aminosäuren begann. Diese Peptidsynthese-Technologie erlaubt die gleichzeitige Synthese von mehreren Peptiden im kleinen Maßstab auf getrennten Nadeln in einem 96-Napf-Platten-Format. Somit wurden 94 einzelne Nadeln für diese Synthese verwendet und die verbleibenden zwei Nadeln (B,B) wurden denselben Schritten wie die anderen Nadeln unterworfen, jedoch ohne das Hinzufügen von aktivierten FMOC-Aminosäuren. Die letztendliche Abspaltung der 15-mer Peptide von dem FestphasenNadelträger verwendete einen wässrigen basischen Puffer (Natriumcarbonat, pH 8,3). Die einzige Verbindung zur Nadel durchläuft eine quantitative Diketopiperazin- Zyklisierung unter diesen Bedingungen, was zu einem gespaltenen Peptid mit einem Cyclo(lysylprolyl)-Anteil am carboxyltenninalen Ende eines jeden Peptids führt. Die Amino- Termini wurden nicht acetyliert, so daß die freie Aminogruppe potentiell zu Anionen- Bindungsreaktionen beitragen konnte. Durchschnittlich wurden etwa 15 ug von jedem 15-mer Peptid pro Napf wiedergewonnen.

Beispiel 6

Heparin-Bindung durch 15-mer Peptide von BPI

Die BPI-15-mer Peptide, die in Beispiel 5 beschrieben sind, wurden einem Heparin- Bindungstest entsprechend den in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren unterzogen. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Fig. 3 gezeigt, ausgedrückt als Gesamtzahl an gebundenen cpm minus der durch Kontroll-Näpfe gebundenen cpm, die nur Blockierungspuffer erhielten. Diese Ergebnisse zeigen die Existenz von drei distinkten Untergruppen von Heparinbindungspeptiden an, die getrennte HeparinbindungsFunktionsdomänen in der rBPI&sub2;&sub3;- Sequenz darstellen. In der BPI-Sequenz fand man, daß sich die erste Domäne von etwa Aminosäure 21 bis etwa Aminosäure 55 erstreckte; man fand, daß sich die zweite Domäne von etwa Aminosäure 65 bis etwa Aminosäure 107 erstreckt und man fand, daß sich die dritte Domäne von etwa Aminosäure 137 bis etwa Aminosäure 171 erstreckt. Material von den Leerkontrollen-Nadeln zeigte keine Heparinbindungswirkungen.

Beispiel 7

Wirkung von 15-mer Peptiden von BPI auf einen Limulus-Amoebocytenlysat (LAL) Test

Die in Beispiel 5 beschriebenen 15-mer Peptide wurden getestet auf LPS-Bindungsaktivität unter Verwendung des LAL-Tests, der in Beispiel 4 beschrieben ist.
Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Fig. 4 dargestellt. Die Daten in Fig. 4 zeigen an, daß wenigstens drei Untergruppen von Peptiden existieren, die drei distinkte Domänen des rBPI&sub2;&sub3;-Proteins mit LPS-Bindungsaktivität darstellen, die zu signifikanter LAL-Inhibierung führen. Man fand, daß die erste Domäne sich von etwa Aminosäure 17 bis etwa Aminosäure 55 erstreckt; die zweite Aminosäure von etwa Aminosäure 73 bis etwa Aminosäure 99; und die dritte Domäne von etwa Aminosäure 137 bis etwa Aminosäure 163. Zusätzlich wiesen andere einzelne Peptide auch LAL-Inhibierung auf, wie in der Figur gezeigt. Im Gegensatz dazu wies Material von Leerkontrollen-Nadeln keine LPS-neutralisierenden Wirkungen auf, wie durch den LAL-Test gemessen.

Beispiel 8

Bakterizide Wirkungen von 15-mer Peptiden von BPI

Die in Beispiel 5 beschriebene 15-mer Peptide wurden auf bakterizide Wirkungen gegen den mutierten rauhen Stamm von E. coli-Bakterium (J5) in einem Radialdiffusionstest getestet, wie beschrieben in Beispiel z. Produkte von Leernadeln (B,B) wurden als Negativ-Kontrollen getestet.
Die Ergebnisse des Tests sind dargestellt in Fig. 5. Das einzige 15-mer Peptid, von dem man gefunden hat, daß es bakterizide Aktivität aufweist, war ein Peptid entsprechend den Aminosäuren 85-99 des BPI-Proteins. Wie aus Fig. 5 ersichtlich, zeigten die positiven Kontrollnäpfe mit verschiedenen Mengen an rBPI&sub2;&sub3; bakterizide Aktivität, wohingegen der Puffer und die Leernadel-Kontrollen keine aufwiesen.
Die Ergebnisse dieser bakteriziden Tests, zusammen mit den in den obigen Beispielen beschriebenen Heparin-Bindungs- und LAL-Tests, zeigen an, daß diskrete funktionelle Domänen im BPI-Protein existieren.
Die in Beispielen 1-8 oben dargestellten Ergebnisse zeigen an, daß rBPI&sub2;&sub3; wenigstens drei funktionelle Domänen enthält, die zu der gesamten biologischen Aktivität des Moleküls beitragen. Die erste Domäne scheint in der Sequenz von Aminosäuren zwischen etwa 17 und 45 zu liegen und wird durch Asp-N-Spaltung bei Rest 38 zerstört. Diese Domäne ist moderat aktiv sowohl bei der Inhibierung von LPS-induzierter LAL-Aktivität als auch in Heparin- Bindungstests. Die zweite funktionelle Domäne erscheint in der Region von Aminosäuren zwischen etwa 65 und 99 und ihre Inhibierung von LPS-induzierter LAL-Aktivität wird durch CNBr-Spaltung bei Rest 70 vermindert. Diese Domäne weist auch die höchste Heparin- Bindungskapazität auf und enthält das bakterizide Peptid, 85-99. Die dritte funktionelle Domäne, zwischen etwa Aminosäuren 142 und 169, ist aktiv bei der Inhibierung von LPSinduziertem LAL-Stimulationstest und weist die geringste Heparin-Bindungskapazität der drei Regionen auf.

Beispiel 9

Herstellung von einzelnen BPI-Funktionsdomänen-Peptiden

Auf der Grundlage der Ergebnisse des Testens der Serie von überlappenden Peptiden, wie in Beispielen 5 bis 8 beschrieben, wurden BPI-Funktionsdomänen-Peptide von einer jeden der funktionell definierten Domänen des BPI-Proteins durch Festphasenpeptid-Synthese gemäß dem Verfahren von Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 und Merrifield et al., 1966, Anal. Chem 38: 1905-1914 hergestellt unter Verwendung eines Applied Biosystems, Inc. Model 432 Peptidsynthese-Apparates. BPI-Funktionsdomänen-Peptide wurden hergestellt mit der Aminosäuresequenz von Teilen von Aminosäureresten 1-199 von BPI, wie angegeben in Tabelle III unten und als BPI.2 bis BPI.5 und BPI.8 bezeichnet. Tabelle III Einzelne BPI-Funktionsdomänen-Peptide

Beispiel 10

Heparin-Bindungsaktivität durch einzelne BPI-Funktionsdomänen-Peptide

Einzelne BPI-Funktionsdomänen-Peptide BPI.2, BPI.3 und BPI.8, zusammen mit mit rBPI&sub2;&sub3;Δcys wurden auf Heparin-Bindungsaktivität entsprechend den in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren getestet. Die Ergebnisse sind in Fig. 6 dargestellt und zeigen, daß BPI.3 und rBPI&sub2;&sub3;Δcys moderate Heparin-Bindungseigenschaften aufweisen und BPI.2 und BPI.8 geringe oder keine Heparin-Bindungsaktivität aufweisen.

Beispiel 11

Heparin-Neutralisations-Aktivität von einzelnen BPI-Funktionsdomänen-Peptiden

BPI-Funktionsdomän-Peptide BPI.2, BPI.3, BPI.4, BPI.5, BPI.6 und BPI.8, zusammen mit rBPI&sub2;&sub3; als eine Positiv-Kontrolle, wurden auf ihre Wirkung auf Thrombin-Inaktivierung durch ATIII/Heparin-Komplexe gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 in der anhängigen und mit übertragenen US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/093,202, eingereicht am 15. Juli 1993 (die zweite Prioritätsanmeldung hiervon), getestet. Speziell wurde ein ChromostrateTM anti-Thrombin-Testkit (Organon Teknika Corp., Durham NC) verwendet, um die Inhibierung von gereinigtem Thrombin durch vorabgebildete ATIII/Heparin-Komplexe in Plasma zu untersuchen.
Kurz gesagt wurde der Test in Mikrotiterplatten mit 96 Näpfen dreifach mit einem Endvolumen pro Napf von 200 ul durchgeführt. Verschiedene Konzentrationen an BPI- Funktionsdomänen-Peptiden, die von 1,0 ul/ml bis 100 ul/ml reichten, wurden getestet, um ihre Wirkung auf Thrombin-Inhibierung in Gegenwart von vorabgebildeten ATIII/Heparin- Komplexen zu bestimmen. Die Reihenfolge des Hinzufügens von Testkomponenten war wie folgt: 1) eine Verdünnungsserie von rBPI&sub2;&sub3; oder BPI-Funktionsdomänen-Peptiden oder Thaumatin als ein Kontroll-Protein mit Endkonzentration von 100, 50, 25, 10 und 1 qg/Napf, verdünnt in PBS in einem Endvolumen von 50 ul; 2) 50 ul Plasma verdünnt 1 : 100 in einem Puffer, der durch die Hersteller bereitgestellt wird; 3) 50 ul Thrombin bei 1 nKat/ml in einem vom Hersteller bereitgestellten Puffer; und 4) 50 ul chromogenes Substrat bei einer Konzentration von 1 umol/ml in Wasser. Man erlaubte der Reaktion für 10 Minuten bei 37ºC voranzuschreiten und stoppte sie durch Hinzufügen von 50 ul 0,1 M Zitronensäure. Die colorimetrische Reaktion wurde quantifiziert auf einem Mikroplattenlesegerät, wie in Beispiel 3 beschrieben.
Die Ergebnisse dieser Tests sind in Fig. 7a und 7b dargestellt, die die Probenkonzentrationen als Gewicht bzw. molare Konzentrationen darstellen. BPIFunktionsdomänen-Peptide BPI.3 und BPI.5 hatten jeweils die signifikantesten HeparinNeutralisierungswirkungen. Bei diesen Tests zeigte das Kontrollprotein, Thaumatin, keine neutralisierende Wirkung und war im wesentlichen gleich der Pufferkontrolle bei allen Proteinkonzentrationen.

Beispiel 12

LPS-Neutralisierungsaktivität durch LAL-Test von einzelnen BPI-Funktionsdomänen Peptiden

BPI-Funktionsdomänen-Peptide BPI.2, BPI.3 und BPI.8, zusammen mit rBPI&sub2;&sub3; als eine Positiv-Kontrolle, wurden in dem LAL-Test bewertet entsprechend dem Verfahren von Beispiel 4 hierin, um LPS-Bindungs- und Inhibitions-Eigenschaften dieser Peptide zu bestimmen. Die Experimente wurden im wesentlichen wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt und die Ergebnisse sind dargestellt in den Fig. 8a und 8b, die die Probenkonzentrationen als Gewichts- bzw. molare Konzentrationen darstellen. Die Ergebnisse zeigten, daß BPI.3 eine moderate LPS-Inhibitionsaktivität aufwies und BPI.2 und BPI.8 keine wesentliche LPS- Inhibitionsaktivität aufwies.

Beispiel 13

Test auf bakterizide Aktivität von einzelnen BPI-Funktionsdomänen-Peptide

BPI-Funktionsdomänen-Peptide BPI.2, BPI.3 und BPI.8, zusammen mit rBPI&sub2;&sub3; als eine Positiv-Kontrolle, wurden auf bakterizide Wirkungen gegen Bakterien E. coli J5 (rauh) und E. coli 0111 : B4 (glatt) in einem Radialdiffusionstest gemäß dem Verfahren von Beispiel 2 getestet. Die Ergebnisse dieser Tests sind in Fig. 9a bis 9d dargestellt. Die Ergebnisse zeigten, daß ein jedes der BPI-Funktionsdomänen-Peptide BPI.2 und BPI.3 bakterizide Aktivität aufwies, wohingegen BPI.8 nur eine geringe oder keine bakterizide Aktivität aufweist. Ein jedes der bakteriziden Peptide, das bakterizide Aktivität zeigte, neigte dazu, wirksamer gegen den rauhen als gegen den glatten E. coli-Stamm zu sein.
In zusätzlichen Experimenten wurden antibakterielle Brühentests durchgeführt, um weiter die bakterizide Aktivität von bestimmten der BPI-Peptide zu bestimmen. Speziell wurden entweder E. coli J5 (rauh)- oder E. coli 0111 : 134 (glatte)-Bakterien von Einzelkolonien auf Agarplatten ausgewählt und verwendet, um 4 ml Müller Hinton-Brühe zu inokulieren und über Nacht bei 37ºC unter Schütteln inkubiert. Die Übernacht-Kultur wurde verdünnt (~ 1 : 50) in 5 ml frische Brühe und bei 37ºC bis zur log-Phase (~ 3 Stunden) inkubiert. Bakterien wurden für 5 Minuten bei 3000 U/min (1500 · g) pelletiert. Bakterien-Pellets wurden in 5 ml PBS resuspendiert und auf 2 · 10&sup6; ml in der Mueller Hinton-Brühe verdünnt (wobei 1 OD&sub5;&sub7;&sub0; Einheit 1,25 · 10&sup9; CFU/ml entspricht). Die BPI-Funktionsdomänen-Peptide, die getestet werden sollten, wurden auf 200 ug/ml in Brühe verdünnt und seriell zweifach in Kulturplatten mit 96 Näpfen (Volumen 100 ul) verdünnt. Alle Stücke waren bei zweifacher Endkonzentration und die Experimente wurden dreifach ausgeführt. Bakterien wurden hinzugesetzt zu 100 ul pro Napf und die Platten wurden auf einem Schüttler bei 37ºC für die Dauer von 20 Stunden inkubiert. Die Platten wurden dann auf einem Mehrfach-Lesegerät für Elisa-Platten bei 590 nm abgelesen. Einer der Dreifach-Näpfe von jeder Peptid-Konzentration wurde ausgewählt für die Bestimmung der Kolonie-bildenden Einheiten (CFU). Ein Aliquot von 30 ul wurde zu 270 ul PBS zugegeben und weiter zehnfache serielle Verdünnungen durchgeführt. Dann wurde ein Aliquot von 50 ul auf tryptischem Soja-Agar ausplattiert und über Nacht inkubiert. Die Kolonien wurden gezählt und die Endbakterienkonzentrationen bestimmt. Die Ergebnisse dieser Tests sind in Fig. 9e (für E. coli J5) und 9f (für E, coli 0111 : B4) dargestellt. Wie in diesen Figuren gezeigt, hatte BPI-Funktionsdomänen-Peptid BPI.3 eine wesentliche antibakterielle Wirkung gegen E. coli J5-Bakterien und weniger Aktivität gegen E. coli 0111 : B4- Bakterien.

Beispiel 14

Herstellung von BPI-Kombinations-Funktionsdomänen-Peptiden

Kombinationspeptide wurden hergestellt unter Verwendung von Festphasen-Chemie, wie in Beispiel 9 beschrieben. Die Sequenzen dieser Peptide sind in Tabelle IV gezeigt. Es wird festgehalten werden, daß die als BPI.7, BPI.9 und BPI.10 bezeichneten Peptide teilweise oder sogar mehrfache Wiederholungen bestimmter BPI-Sequenzen darstellen. Speziell umfaßt BPI.7 ein 20-mer, das aus Aminosäureresten 90-99, die zweifach in einer einzelnen linearen Peptidkette wiederholt sind, besteht. BPI.10 umfaßt eine etwa 50 : 50-Mischung von einem 25- mer (bezeichnet als BPI.10.1; SEQ ID NO: 55) und einem 26-mer (bezeichnet BPI.10.2; SEQ ID NO: 65), die aus Aminosäureresten 94-99, 90-99, 90-99 bzw. 93-99, 90-99, 90-99 in einer einzelnen linearen Peptidkette bestehen. BPI.9 umfaßt ein 16-mer umfassend Aminosäurereste 94-99 gefolgt von Resten 90-99 in einer einzelnen linearen Peptidkette.
Diese Peptide wurden in einem jeden der in den Beispielen 10-13 oben beschriebenen BPI- Aktivitätstests verwendet. In dem in Beispiel 10 beschriebenen und in Fig. 6 gezeigten Heparin-Bindungstest wies BPI.7 eine extrem hohe Heparin-Bindungskapazität auf. In dem in Beispiel 11 beschriebenen und in Fig. 7a und 7b gezeigten Heparin-Neutralisationstests wies BPI.7 wesentliche Heparin-Neutralisationswirkungen auf, verglichen mit rBPI&sub2;&sub3;. In dem in Beispiel 12 beschriebenen und in Fig. 8a und 8b gezeigtem LAL-Test wies BPI.7 wesentliche LPS-Inhibitionseigenschaften auf. In bakteriziden Tests unter Verwendung von Radialdiffusionsplatten, wie beschrieben in Beispiel 13 und gezeigt in Fig. 9a bis 9d, wies ein jedes der BPI-Funktionsdomänen-Peptide BPI.7, BPI.9 und BPI. 10.1 und BPI.10.2 bakterizide Aktivität auf und wesentliche bakterizide Aktivität wurde auch für BPI.7, BPI.8 und BPI.10.1 und BPI.10.2 gegen sowohl rauhe als auch glatte Variantenstämme von E. coli in Brühentests gefunden. Die BPI.10-Peptide wiesen die höchste gegen einen jeglichen Bakterienstamm beobachtete bakterizide Aktivität auf.
Diese bakterizide Aktivitätsergebnisse, die mit BPI.7 und BPI.10 erhalten wurden, zeigten, daß ein lineares Dimer (BPI.7) und eine Mischung von linearen Multimeren (BPI.10.1 und BPL 10.2) des BPI-Domäne II-Peptides KWKAQKRFLK (d. h., BPLB, SEQ ID NO: 8) bakterizide Aktivität gegen E. coli-Stamm J5 aufwies, und daß das Monomer (BPI.8) im wesentlichen keine bakterizide Aktivität zeigte. Darüber hinaus wiesen sowohl die Dimer- als auch die Multimer-Peptide höhere bakterizide Aktivität als BPI.9 auf, umfassend Aminosäuren 94- 99, 90-99. Auf der Basis dieser Ergebnisse wurden die zusätzlichen in Tabelle IV gezeigten Peptide synthetisiert unter Verwendung der in Beispiel 9 beschrieben Verfahren. Tabelle IV BPI-Kombinations-Funktionsdomänen-Peptide

Beispiel 15

Bakterizide Aktivität von Kombinations-Funktionsdomänen-Peptiden

Die in Beispiel 14 beschriebenen BPI-Kombinations-Funktionsdomänen-Peptide wurden in bakteriziden Radialdiffusionstests verwendet, im wesentlichen, wie in den Beispielen 2 und 13 oben beschrieben. Diese Ergebnisse sind in Fig. 10a bis 10e gezeigt. Die in Fig. 10a gezeigten Ergebnissen belegen, daß BPI.8, das eine Kopie eines Domäne II-Peptids (Aminosäure 90-99) umfaßt, keine nachweisbare bakterizide Aktivität gegen E. coli J5-Zellen bei Konzentrationen von 1000 ug/ml aufwies. Im Gegensatz dazu zeigte BPI.13, das eine Kopie eines Domäne III-Monomers (Aminosäuren 148-161) umfaßt, merkliche bakterizide Aktivität bei Konzentrationen größer als 30 ug/ml BPI.29, das zwei Kopien eines Domäne III- Monomers BPI.13 umfaßt, wies eine größere bakterizide Aktivität auf und BPI.30, das eine lineare Kombination des Domäne II-Peptids BPI.8 und des Domäne III-Peptids BPI.13 aufwies, zeigte die höchste bakterizide Aktivität gegen J5-Zellen, die sich der von BPI annäherte.
Fig. 10b zeigt die Ergebnisse von Experimenten mit Domäne II-Peptiden, die BPI.8, BPI.7 und BPI.10 umfassen. (siehe auch Zusammenfassung Tabelle VIII). Obwohl BPI.8 keine bakterizide Aktivität gegen E. coli J5-Zellen bei Konzentrationen von 1000 ug/ml aufwies, zeigten die Kombinationspeptide BPI.7 und BPI.10 ein hohes Maß an bakterizider Aktivität.
Zusätzliche Experimente wurden durchgeführt unter Verwendung verschiedener anderer Bakterien als Zielzellen, um den Bereich von bakterizidem Abtöten dieser BPI- Funktionsdomänen-Peptide zu untersuchen. Fig. 10c zeigt die Ergebnisse von Radialdiffusionsexperimenten unter Verwendung von E. coli-Stamm O7-K1. Bei diesen Experimenten zeigte rBPI&sub2;&sub3; keine bakterizide Aktivität bei Konzentrationen von 100 ug/ml und geringe bakterizide Aktivität selbst bei Konzentrationen von 1000 ug/ml. Ein ähnlich geringes Maß an bakterizider Aktivität wurden bei den Peptiden BPI.8, das das Domäne II (DII)-Monomer umfaßt, und BPI.13 gefunden, das das Domäne III (DIII)-Monomer umfaßt, obwohl man feststellte, daß die Menge an Aktivität von BPI.13 höher ist als jene von rBPI&sub2;&sub3;. Überraschenderweise zeigten das Domäne II-Dimer BPI.7 und das Domäne II-Domäne III (DII-DIII)- Heterodimer BPI.30 ein hohes Maß an bakterizider Aktivität und das Domäne IIIIDimer BPI.29 zeigte moderate bakterizide Aktivität. Diese Ergebnisse zeigten, daß die Peptide der funktionellen BPI-Funktionsdomänen, die hierin identifiziert wurden, bakterizide Aktivität besitzen, die qualitativ verschieden ist von der bakteriziden Aktivität des BPIMoleküls selbst.
Die Fig. 10d und 10e zeigen Ergebnisse, die weiterhin belegen, daß die hierin beschriebenen Homo- und Heterodimeren qualitativ und quantitativ verschiedene bakterizide Aktivitätsspektren von empfindlichen Bakterien aufweisen. Fig. 10d zeigt die Ergebnisse von Radialdiffusionstests unter Verwendung von Klebstella pneumoniae-Bakterien. Das DIIDIII- Heterodimer BPI.30 zeigte die größte Menge an bakterizider Aktivität gegen dieses Bakterium, das DIII-Homodimer BPI.29 zeigte ein moderates Maß an Aktivität und das DIIDimer (BPI.7) und DIII-Monomer (BPI.13) zeigten ein geringeres Maß an Aktivität. BPI.8 umfassend das DII-Monomer, zeigte keine bakterizide Aktivität bei Konzentrationen von 800 ug/ml, was übereinstimmt mit dem Mangel an bakterizider Aktivität dieses Peptids, wie es mit getesteten E. coli-Stämmen gesehen wurde.
Fig. 10e zeigt das Maß an bakterizider Aktivität, das bei Radialdiffusionsexperimenten unter Verwendung des Gram-positiven Bakteriums Staphylococcus aureus gefunden wurden. Das DII-DIII-Heterodimer BPI.30 zeigte das größte Maß an bakterizider Aktivität gegen dieses Bakterium, das DIII-Homodimer BPI.29 zeigte ein mittleres Aktivitätsmaß und das DIIDimer (BPI.7) und das DIII-Monomer (BPI.13) zeigten ein geringes Aktivitätsmaß. BPI.8, umfassend das DII-Monomer, zeigte keine bakterizide Aktivität bei Konzentrationen von 800 ug/ml, was übereinstimmt mit dem Mangel an bakterizider Aktivität dieses Peptids, der mit anderen Bakterien gesehen wurde.
Diese Ergebnisse zeigten, daß die hierin offenbarten Homo- und Heterodimere verschiedene Mengen an bakterizider Aktivität aufwiesen, die sowohl hinsichtlich der Menge dieser Aktivität als auch der minimalen wirksamen Konzentration des Peptids, die für eine nachzuweisende bakterizide Aktivität notwendig war, schwankte. Diese Ergebnisse zeigten auch, daß diese Peptide quantitativ und, noch überraschender, qualitativ verschiedene bakterizide Aktivitäten aufwiesen als das BPI selbst.

Beispiel 16

Zusätzliche bakterizide Aktivität von BPI-Kombinations-Funktionsdomänen-Peptiden

Im Lichte der Ergebnisse der Experimente, die in Beispiel 15 offenbart sind, wurde die bakterizide Aktivität von Domäne II-Domäne III-Kombinationspeptiden verglichen mit der bakteriziden Aktivität von einer jeden der Komponenten BPI-Domäne II- und -Domäne III-Peptide, gegenüber einer Anzahl verschiedener Bakterien und anderer Mikroorganismen. Die folgenden BPI-Funktionsdomänen-Peptide, wie oben beschrieben, wurden in bakteriziden Radialdiffusions-Tests (Beispiel 2) und bakteriziden Brühentests (Beispiel 13) verwendet, im wesentlichen, wie in Beispiel 15 oben beschrieben. Die Ergebnisse sind in Fig. 11a bis 11q gezeigt. Diese Figuren zeigen Ergebnisse von bakteriziden Tests unter Verwendung der folgenden Bakterienstämme:

Gram-negative Bakterien Getestete BPI-Peptide

Pseudomonas aeruginosa BPI.8, BPI.13, BPI.30
E. coli O18 : K1 : H7 BPI.8, BPI.13, BPI.30
Klebstella pneumoniae BPI.8, BPI.13, BPI.30
E. coli O75 BPI.8, BPI.13, BPI.30
Serratia marcescens BPI.8, BPI.13, BPI.30
Proteus mirabilis BPI.2, BPI.13, BPI.30
Salmonella typhurium BPI.23, BPI.30
E. coli O86a : K61 BPI.23, BPI.30
E. coli O4 : K12 BPI.30

Gram-positive Bakterien

Streptococcus pneumoniae BPI.29, BPI.30., BPI.48, BPI.55, BPI.13, BPI.69
Bacillus megaterium BPI.2, BPI.7, BPI.45, BPI.46, BPI.47, BPI.48
Staphylococcus aureus BPI.7, BPI.8, BPI.10, BPI.13, BPI.30

Pilze

Candida albicans BPI.30, BPI.13, BPI.29, BPI.48, BPI.2
Die Ergebnisse dieser Experimente werden wie folgt zusammengefaßt. Keines der getesteten BPI-Peptide zeigte irgendeine bakterizide Aktivität gegen S marcescens (Fig. 11f) oder P. mirabilis (Fig. 11g). BPI.8 zeigte keine bakterizide Aktivität gegen irgendeinen getesteten Organismus bei Konzentrationen bis zu etwa 2000 pMol. BPI.13 und BPI.30 zeigten bakterizide Aktivität gegen P. aeruginosa (Fig. 11a), E. coli O18 : K1 : H7 (Fig. 11b), K. pneumoniae (Fig. 11c) und E. coli 075 (Fig. 11d). Zusätzlich zeigte BPI.30 bakterizide Aktivität gegen S. typhurium (Fig. 11h) und, in Brühentests, E. coli O86a : K51 (Fig. 11j) und E. coli 04 : K12 (Fig. 11k). BPI.23 zeigte bakterizide Aktivität in einem Radialdiffusionstest gegen E. coli O86a : K61 (Fig. 11i). Zusätzlich zeigte BPI.30 bakterizide Aktivität gegen E. coli O86a : K61 in menschlichem Serum (Fig. 11l).
Die bakterizide Kapazität von BPI-Peptiden, die von der Erfindung vorgesehen werden, wurde auch gegen Gram-positive Bakterien getestet (siehe Tabelle VIII A). Überraschenderweise zeigte jedes getestete BPI-Peptid einige bakterizide Aktivität in Radialdiffusionstests bei Verwendung von S. aureus (Fig. 11e), S pneumoniae (Fig. 11m) und B. megaterium ( Fig. 11n) bei Mengen, die zwischen etwa 20 und etwa 2000 pMol lagen. Diese Ergebnisse verglichen sich vorteilhaft mit bakterizider Aktivität der Antiobiotika Gentamicin und Vancomycin (Fig. 11o). Zusätzlich wurden Peptide auf ihre Aktivität gegen L-Formen von Gram-positiven Bakterien, wie z. B. die L-Form von S. aureus ATCC 19640 getestet. BPI.13, BPI.10, BPI.48 und BPI.120 sind beispielhafte Verbindungen, die gegen diese L-Form Bakterien aktiv sind.
Am überraschensten war, daß ein Peptid, BPI.13, gefunden wurde mit fungizider Aktivität in einem Brühentest unter Verwendung von C. albicans (Fig. 11p und 11q). Wie in diesen Figuren gezeigt, ist die Aktivität von BPI.13 klar unterscheidbar von den viel geringeren Aktivitätsmaßen von BPI.2, BPI.29, BPI.30 und BPI.48. Wie in Tabelle VIII B gezeigt, konnte für andere beispielhafte Verbindungen gezeigt werden, daß sie gegen C. albicans aktiv waren. Diese Ergebnisse zeigen, daß die BPI-Funktionsdomänen-Peptide der Erfindung antimikrobielle Aktivität aufweisen, die qualitativ verschieden ist von der bisher für natives BPI berichteten Aktivität.

Beispiel 17

Heparin-Neutralisationsaktivität von BPI-Kombinations-Funktionsdomänen-Peptiden

Die in vitro und in vivo Heparin-Neutralisationskapazität der BPI- KombinationsFunktionsdomänenPeptide, die in Beispiel 14 hergestellt wurden, wurde bestimmt durch Testen der Fähigkeit dieser Peptide, der inhibitorischen Wirkung von Heparin auf die Gerinnungszeit von heparinisiertem Blut und Plasma entgegenzuwirken.
In vitro wurde die Wirkung von BPI-Kombinations-Funktionsdomänen-Peptiden auf Heparinvermittelte Verlängerung der aktivierten partiellen Thrombin-Zeit (APTT) bestimmt. Die APTT wird durch die Anwesenheit von endogenen oder exogenen Inhibitoren der Thrombin- Bildung, wie therapeutisch verabreichtes Heparin, verlängert. Somit werden Agenzien, die die anti-koagulierende Wirkung von Heparin neutralisieren, die durch den Test gemessene APTT verringern. Zitratisiertes menschliches Plasma (200f) wurde für eine Minute bei 37ºC mit entweder 15 ul Verdünnungsmittel (0,15 M NaCl, 0,1 M Tris-HCl, pH 7,4) oder 15 ul des Verdünnung mittels, das auch 25 ug/ml Heparin (187 Einheiten/mg) enthielt, inkubiert. Verschiedene Konzentrationen (von 0,0 bis 56 ug/ml) von rBPI&sub2;&sub3;, rBPI&sub2;&sub1;Δcys, oder BPI- Kombinationspeptiden BPI.29 (das DIII-Homodimer) und BPI.30 (Heterodimer DII + DIII) in einem Volumen von 15 ul wurden hinzugesetzt, unmittelbar gefolgt von 100 ul Thrombin- Reagens (Katalog-Nr. 845-4, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Die Gerinnungszeit (Thrombin-Zeit) wurde gemessen unter Verwendung eines BBL-Fibrometers (Beeton Dickenson Microbiology Systems, Cockeysville, MD). Die Ergebnisse sind in Fig. 12a, 12b und 12e dargestellt. Fig. 12a zeigt die relative Verringerung, die durch Hinzufügen von verschiedenen Mengen an rBPI&sub2;&sub3; oder rBPI&sub2;&sub3;ΔCYS zu der Heparin-verlängerten APTT verursacht wird. Diese Ergebnisse begründen, daß ein jedes dieser BPIverwandten Proteine die Heparinvermittelte Verlängerung von APTT inhibiert. Fig. 12b zeigt, daß die BPIKombinationspeptide BPI.29 und BPI.30 auch die Heparin-vermittelte Verlängerung von APTT inhibieren. Fig. 12e veranschaulicht die Ergebnisse, die mit BPI.30 erhalten wurden, auf einer nichtlogarithmischen Skala. Fig. 12g zeigt, daß BPI.29, BPI.30 und BPI.7 die größte Wirkung auf die Gerinnungszeit von heparinisiertem Blut in diesem Test aufweisen. BPI.3 und rBPI&sub2;&sub3; zeigen eine geringere Wirkung und BPI.14, BPI.2, BPI.4, BPI.5, BPI.7 und rLBP&sub2;&sub5;, rBPI und rBPI&sub2;&sub1;ΔCYS zeigen alle eine geringere Verringerung der Gerinnungszeiten von heparinisiertem Blut in diesem Test.
Die in vivo Wirkung von beispielhaften BPI-Kombinations-Peptiden auf APTT in heparinisierten Ratten wurde bestimmt und verglichen mit der in vivo Wirkung von rBPI&sub2;&sub3;. APTT wird verlängert durch die Anwesenheit von endogenen oder exogenen Inhibitoren für die Thrombin-Bildung, wie therapeutisch verabreichtes Heparin. Agenzien, die die antikoagulierende Wirkungen von Heparin neutralisieren, werden die APTT, wie durch diesen Test gemessen, verringern. Man verabreichte Sprague-Dawley-Ratten, die unter NIH- Richtlinien gehalten wurden, 100 U/kg Heparin durch intravenöse Bolus-Injektionen vermittels der Schwanzvene des Tiers, gefolgt 5 Minuten später von Verabreichung verschiedener Mengen von Test- oder Kontroll-Protein, wie verglichen mit rBPI&sub2;&sub3;. Die APTT wurde dann bestimmt von Blutproben, die von der abdominalen Aorta 2 Minuten nach der Verabreichung des Tests- oder Kontrollproteins gesammelt wurden. Die APTT von unbehandelten Tieren, ebenso wie von Tieren, die nur mit eine BPI-Peptid behandelt wurden, wurde auch bestimmt.
Fig. 12c zeigt die Dosis-Abhängigkeit der rBPI&sub2;&sub3;-Inhibierung von Heparin-vermittelter Verlängerung der partiellen Thromboplastin-Zeit, und daß Verabreichen von etwa 5 mg/kg zu einer APTT des heparinisierten und mit BPI-behandelten Tieres führt, die fast dieselbe ist, wie bei den nicht-behandelten Kontrolltieren. Die Ergebnisse ähnlicher Experimente, die in Fig. 12d gezeigt sind, belegen, daß das nicht-verwandte Protein Thaumatin keine Wirkung auf APTT-Zeiten in heparinisierten Tieren hat. Die Verabreichung von BPI. 10-Peptid führt zu einer APTT in heparinisierten Tieren, die im wesentlichen dieselbe ist, wie die APTT in Kontrolltieren, die mit BPI. 10 alleine behandelt wurden. Ähnliche Ergebnisse wurden auch unter Verwendung von BPI.30 erhalten (Fig. 12f).
Diese Ergebnisse zeigen, daß die BPI-Funktionsdomänen-Kombinations-Peptide (z. B., BPI.10 und BPI..30) und rBPI&sub2;&sub3; wirksam die Heparin-Inhibierung von Koagulations- Proteasen neutralisieren. Auf der Grundlage dieser Eigenschaften nimmt man an, daß BPI- Kombinations-Funktionsdomänen-Peptide bei der klinischen Neutralisierung von antikoagulierenden Wirkungen von Heparin bei Dosierungen nützlich sind, die allgemein funktionell zu jenen korrespondieren, die für Protaminsulfat empfohlen werden, aber von denen man nicht annimmt, daß sie die schweren hypotensiven und anaphylactoiden Wirkungen von diesem Material haben.

Beispiel 18

Herstellung und Funktionsaktivitätsanalyse von BPI-Substitutionsvarianten Funktionsdomänen-Peptiden

Die oben mit den Peptiden von funktionellen Domänen II und III erhaltenen Ergebnisse hatten eine weitere Bemühung zur Folge, die funktionell wichtigen Aminosäurereste innerhalb dieser Peptide zu bestimmen. Entsprechend wurde eine Anzahl von Peptiden hergestellt, die die Aminosäuresequenz von Domänen II und III enthielten, bei denen eine der Aminosäuren in der Sequenz substituiert war durch einen Alanin-Rest. Diagramme der Domänen-Peptide, die in den Substitutionsexperimenten verwendet wurden, sind in Fig. 13 dargestellt (Domäne II; IKISGKWKAQKRFLK, SEQ ID NO: 7) und Fig. 14 (Domäne III; KSKVGWLIQLFHKK, SEQ ID NO: 13). Diese Peptidserien wurden dann auf Heparin- Bindungsaffinität (Kd), Heparin-Bindungskapazität (Hep-CAP), LPS-Neutralisation, wie bestimmt unter Verwendung des Limulus-Ameobocyten-Lysattests (LAL) und bakterizide Aktivität gegen E. coli J5 unter Verwendung des Radialdiffusionstest (RAD) getestet, wobei jeder Test durchgeführt wurde, wie in den Beispielen oben beschrieben.
Die Ergebnisse, gezeigt in Tabelle V (Domäne II) und Tabelle VI (Domäne III), sind ausgedrückt als die mehrfache Aktivitäts-Differenz in einem jeden dieser Tests (mit Ausnahme für den LAL-Test, wo relative Differenzen angegeben sind) zwischen den BPIIFunktionsdomänen II- und -Domänen II-Peptiden und jedem Alanin-substituierten VariantenPeptid davon.
Für Domäne II-Peptide zeigten die meisten Alanin-substituierten Peptide eine etwa 2- bis 10- fache Verringerung der bakteriziden Aktivität im Radialdiffusionstest. Ausnahmen zu diesem globalen Muster schließen ein BPI.19 (Gly&sub8;&sub9; → Ala&sub8;&sub9;), BPI.22 (Lys&sub9;&sub2; → Ala9z), BPI.23 (Gln&sub9;&sub4; → Ala&sub9;&sub4;) und BPI.24 (Lys&sub9;&sub5; → Ala&sub9;&sub5;). Im Gegensatz dazu zeigten die meisten Alaninsubstituierten Peptide keinen Unterschied im LAL-Test; BPI.17 (Ile&sub8;&sub7; → Ala&sub8;&sub7;) und BPI.21 (Trp&sub9;&sub1; → Ala&sub9;&sub1;) zeigten eine mäßige bzw. große Aktivitätsverringerung in diesem Test. Für BPI.21 waren diese Ergebnisse übereinstimmend mit der mehr als 10-fachen Verinngerung der bakteriziden Aktivität, die für dieses Peptid gefunden wurde, was anzeigt, daß Aminosäure 91 (ein Tryptophan-Rest in der nativen Sequenz) besonders wichtig ist bei der Verleihung von biologischer Aktivität an das Protein.
Die Wirkung von Alanin-Substitution auf Heparin-Bindung und -Kapazität war, in fast allen Fällen, nicht mehr als 2-fach mehr oder weniger als bei dem nicht-substituierten Peptid. Eine Ausnahme war die Heparin-Bindungskapazität von BPI.21, die vierfach geringer war als das unsubstituierte Peptid. Dies stützt weiter die früheren Ergebnisse betreffend die besondere Empfindlichkeit der verschiedenen Aktivitäten von diesen Peptiden gegenüber Substitution bei Trp91. In den meisten Fällen war die Wirkung auf sowohl den Kd von Heparin-Bindung als auch Heparin-Bindungskapazität konsistent und von etwa der gleichen Größenordnung. In einigen Fällen verringerte sich die Heparin-Bindungskapazität des substituierten Peptids, obwohl der Kd sich leicht erhöhte (BPI.18; Ser&sub8;&sub8; → Ala&sub8;&sub8;) oder verringerte sich leicht (BPI.24). Es gab auch Fälle, wo die Kapazität unverändert war, selbst wenn der Kd sich verringerte (BPI.20; Lys&sub9;&sub0; → Ala&sub9;&sub0;), oder sich verringerte (BPI.19). In einem Beispiel blieb die Affinität unbeeinflußt und die Kapazität verinngerte sich fast zweifach (BPI.25; Arg&sub9;&sub6; → ALa&sub9;&sub6;).
Diese Ergebnisse zeigten die Existenz von wenigstens einem kritischen Rest in der Domäne 11-Sequenz (Trp91) an, und daß die Aktivitäten der Domäne 11-Peptide für den größten Teil nur minimal durch Alanin-Substitution der anderen Domäne 11-Aminosäurereste beeinflußt werden.
Für Domäne III-Peptide zeigten die meisten Alanin-substituierten Peptide ein etwa 2- bis 5- fache Verringerung der bakteriziden Aktivität im Radialdiffusionstest. Ausnahmen zu diesem Gesamtmuster schließen ein BPI.35 (Gly&sub1;&sub5;&sub2; → Ala&sub1;&sub5;&sub2;), BPI.39 (Gln&sub1;&sub5;&sub6; → Ala&sub1;&sub5;&sub6;), BPI.42 (His&sub1;&sub5;&sub9; → Ala&sub1;&sub5;&sub9;) und BPI.44 (Lys&sub1;&sub6;&sub1; → Ala&sub1;&sub6;&sub1;). Die meisten Alanin-substituierten Peptide zeigten keinen Unterschied im LAL-Test. BPI.31 (Lys&sub1;&sub4;&sub8; → Ala&sub1;&sub4;&sub8;), BPI.32 (Ser&sub1;&sub4;&sub9; → Ala&sub1;&sub4;&sub9;), BPI.33 (Lys&sub1;&sub5;&sub0; → Ala&sub1;&sub5;&sub0;) und BPI.34 (Val&sub1;&sub5;&sub1; → Ala&sub1;&sub5;&sub1;) zeigten eine mäßige Verringerung der LPS-Bindungsaktivität und BPI.36 (Trp&sub1;&sub5;&sub3; → Ala&sub1;&sub5;&sub3;) und BPI. 40 (Leu&sub1;&sub5;&sub7; → Ala&sub1;&sub5;&sub7;) zeigten eine starke Verinngerung der LPS-Bindungsaktivität in diesem Test. Für beide BPI.36 und BPI.40 waren diese Ergebnisse konsistent mit der etwa 5-fachen Verringerung der bakteriziden Aktivität, die für diese Peptide gefunden wurde, was anzeigt, daß die hydrophoben Aminosäuren Trp&sub1;&sub5;&sub3; und Leu&sub1;&sub5;&sub7; in der nativen Sequenz besonders wichtig sein können beim Verleihen von biologischer Aktivität an das Peptid.
Wirkungen von Alanin-Substitution auf Heparin-Bindung und -Kapazität waren von ähnlicher Größenordnung und nicht mehr als etwa 5-fach mehr oder weniger als das unsubstituierte Peptid. In fast allen Fällen war der Typ der Wirkung der Alanin-Substitution auf sowohl den Kd der Heparin-Bindung als auch die Heparin-Bindungskapazität konsistent und von etwa der gleichen Größenordnung, im Unterschied zu den Ergebnissen bei den Domäne II-Alanin- Substitutionspeptiden. In einem Beispiel (BPI.42; His&sub1;&sub5;&sub9; → Ala&sub1;&sub5;&sub9;) war die Heparin- Bindungskapazität nicht beeinträchtigt, obwohl sich der Kd leicht verringerte (1,2-fach). In nur einem Beispiel war der Kd von Heparin-Bindung und Heparin-Kapazität leicht erhöht (BPI.35; Gly&sub1;&sub5;&sub2; → Ala&sub1;&sub5;&sub2;); es wurde ein Anstieg von nur 10% gefunden.
Wie die bei den Alanin-substituierten Domäne-II-Peptiden gefundenen Ergebnisse zeigen diese Ergebnisse die Existenz von wenigstens einem kritischen Rest in der Sequenz von Domäne III (Trp&sub1;&sub5;&sub3;) und möglicherweise wenigstens einen weiteren (Leu&sub1;&sub5;&sub7;) an. Die Ergebnisse zeigten auch, daß im Unterschied zu den Alanin-substituierten Domäne IIPeptiden fast die Hälfte der Substitutionen zu einer wenigstens zweifachen Differenz der getesteten Aktivitäten führte. In 6 Fällen verringerten sich alle vier der getesteten Aktivitäten und in 10 Fällen verringerte sich die bakterizide Aktivität, der Kd von Heparin-Bindung und Heparin-Kapazität. In nur einem Fall (BPI.35, Gly&sub1;&sub5;&sub2; → Ala&sub1;&sub5;&sub2;) fand man, daß sich die Aktivität der bakteriziden, Heparin-Bindungs-Kd- und Heparin-Kapazitätstests erhöht hatte, wenngleich nur leicht.
Die Ergebnisse zeigen, daß Alanin-Ersetzung der hydrophoben Aminosäurereste Trp&sub9;&sub1;, Trp&sub1;&sub5;&sub3;, und Leu&sub1;&sub5;&sub7; die größte Wirkung auf die Aktivitäten dieser BPI-Funktionsdomänen- Substitutions-Peptide aufweist. Das Ergebnis ist unerwartet im Lichte der kationischen Natur von rBPI&sub2;&sub3;. Tatsächlich zeigten Domäne II-Alanin-Substitutionspeptide, bei denen Lysin durch entweder Alanin oder Phenylalanin ersetzt ist, dramatische Aktivitätserhöhung. (z. B., BPI.24, BPI.73).
Wie Tabelle VI B zeigt, beeinträchtigte die Substitution des Tryptophans (Trp&sub1;&sub5;&sub3;) die fungizide Aktivität nicht, obwohl sie als wesentlich für die antibakterielle Aktivität erschien. Das Glutamin scheint eine wichtige Rolle in der fungiziden Aktivität zu spielen, wie durch eine mehr als 8-fache Abnahme in dem Radialdiffusionstest nach Austausch (BPI.39, Gln&sub1;&sub5;&sub6; → Ala&sub1;&sub5;&sub6;) gezeigt wurde. Tabelle V Alanin-substituierte BPI-Domäne II-Peptide Tabelle VI A Alanin-substituierte BPI-Domäne III-Peptide Tabelle VI B Alanin-substituierte BPI-Domäne III-Peptide

Beispiel 19

Zusammenfassung von biologischen Aktivitäten von BPI-Funktionsdomänen-Peptiden

Die Verteilung der Peptide in Konstruktkategorien ist in Tabelle VII unten gezeigt.
Die BPI-Funktionsdomänen-Peptide der Erfindung, oder repräsentative Untergruppen davon, sind für die folgenden biologischen Aktivitäten getestet worden: Bakterizide Aktivität gegen Gram-negative und Gram-positive Bakterien und gegen bestimmte andere Mikroorganismen; LPS-Bindungs- und Neutralisationsaktivitäten; und Heparin-Bindungs- und Heparin- Neutralisationsaktivitäten.
BPI-Funktionsdomänen-Peptide wurden auf bakterizide Aktivität auf E. coli J5-Bakterien und auf Heparin-Bindung, wie beschrieben in den Beispielen 8 bzw. 6, getestet. Die Testergebnisse für beispielhafte Peptide der vorliegenden Erfindung sind in Tabelle VIII A für das Gramnegative Bakterium E. coli J5 (rauh) und E. coli 0113 (glatt) und das Grampositive Bakterium S. aureus zusammengefaßt. Die bakteriziden Aktivitäten sind ausgedrückt als die Menge an Peptiden (pMol/Napf und ug/Napf), die erforderlich sind, um eine bakterizide Zone von 30 mm² zu erzeugen. Tabelle VII-BPI-Peptidkonstrukte 1. Direkt von BPI-Sequenz A. Domäne I Peptide B. Domäne II-Peptide C. Domäne III-Peptide 2. Lineare und verzweigtkettige Wiederholungen A. Domäne II-Peptide B. Domäne III Peptide C. Interdomänen-Kombinationspeptide 3. Einzel-Aminosäuresubstitutionen A. Domäne II-Peptide B. Domäne III-Peptide 4. Vielfache Aminosäuresubstitutionen A. Domäne II Peptide B. Domäne III-Peptide 5. Atypische Aminosäureaustausche A. Domäne II-Peptide B. Domäne III-Peptide 6. Aminosäure/atypische Aminosäure-Substitutionswiederholungen A. Domäne II-Peptide B. Domäne III-Peptide C. Interdomänen Kombinationspeptide 7. Cyclisierte Peptide A. Domäne I Peptide B. Domäne III Peptide Tabelle VIII A BPI-Peptide antimikrobielle Aktivität
a Zu einem Napf zugegebene Menge, um ein Loch von 30 mm² zu erreichen, wie bestimmt durch PROBIT-Analyse (Beispiel 19);
b Keine nachweisbare Aktivität bis zu 5 ug/Napf;
n = nicht getestet Tabelle VIII A (Fortsetzung) BPI-Peptide antimikrobielle Aktivität
a Zu einem Napf zugegebene Menge, um ein Loch von 30 mm² zu erreichen, wie bestimmt durch PROBIT-Analyse (Beispiel 19);
b Keine nachweisbare Aktivität bis zu 5 ug/Napf;
n = nicht getestet Tabelle VIII A (Fortsetzung) BPI-Peptide antimikrobielle Aktivität
a Zu einem Napf zugegebene Menge, um ein Loch von 30 mm² zu erreichen, wie bestimmt durch PROBIT-Analyse (Beispiel 19);
b Keine nachweisbare Aktivität bis zu 5 ug/Napf;
n = nicht getestet Tabelle VIII A (Fortsetzung) BPI-Peptide antimikrobielle Aktivität
a Zu einem Napf zugegebene Menge, um ein Loch von 30 mm² zu erreichen, wie bestimmt durch PROBIT-Analyse (Beispiel 19);
b Keine nachweisbare Aktivität bis zu 5 ug/Napf;
n = nicht getestet Tabelle VIII A (Fortsetzung) BPI-Peptide antimikrobielle Aktivität
a Zu einem Napf zugegebene Menge, um ein Loch von 30 mm² zu erreichen, wie bestimmt durch PROBIT-Analyse (Beispiel 19);
b Keine nachweisbare Aktivität bis zu 5 ug/Napf;
n = nicht getestet Tabelle VIII A (Fortsetzung) BPI-Peptide antimikrobielle Aktivität
a Zu einem Napf zugegebene Menge, um ein Loch von 30 mm² zu erreichen, wie bestimmt durch PROBIT-Analyse (Beispiel 19);
b Keine nachweisbare Aktivität bis zu 5 ug/Napf;
n = nicht getestet Tabelle VIII A (Fortsetzung) BPI-Peptide antimikrobielle Aktivität
a Zu einem Napf zugegebene Menge, um ein Loch von 30 mm² zu erreichen, wie bestimmt durch PROBIT-Analyse (Beispiel 19);
b Keine nachweisbare Aktivität bis zu 5 ug/Napf;
n = nicht getestet Tabelle VIII B BPI-Peptide fungizide Aktivität Tabelle VIII B BPI-Peptide fungizide Aktivität Tabelle VIII B BPI-Peptide fungizide Aktivität
apmol benötigt für 30 mm²-Zone Tabelle IX
Eine verblüffende Beziehung wurde zwischen repräsentativen BPI-Funktionsdomänen-Peptiden beobachtet, wenn eine mehrfache Regressionsanalyse durchgeführt wurde unter Verwendung der bakteriziden Aktivität als die vorhergesagte Variable und Heparin-Bindungskapazität und -affinität (Kd) als die Predictor-Variablen. Die Analyse enthüllte, daß nur die Heparin-Bindungskapazität signifikant mit bakterizider Aktivität in Beziehung stand (Heparin-Kapazität, p = 0,0001 und Heparinaffinität p = 0,6007). Mit anderen Worten, die Menge von Heparin, die eine gegebene Peptidausführungsform bei Sättigung binden kann (d. h. Kapazität), weist eine signifikante Beziehung zur bakteriziden Aktivität auf und nicht wie bald ein gegebenes Peptid 50% Sättigung in der Heparin-Titration erreicht (d. h. Affinität). Von den Daten betreffend LPS-Bindungskompetition und -Neutralisation scheint auch, daß die Kapazität am ehesten für bakterizide Aktivität vorhersagend ist. Zum Beispiel zeigen die Ergebnisse, daß BPI.7, BPI.29, BPI.30, BPI.46, BPI.47., BPI.48, BPI.63, BPI.65 (reduziert), BPI.69, BPI.73, BPI.58, MAP.1 und MAP.2 extreme Heparin-Bindungskapazitäten aufweisen und auch im höchsten Maße bakterizid sind. Mehrfach antigenische Peptide (MAP-Peptide) sind multimere Peptide an einem verzweigenden Lysin-Kern, wie beschrieben von Posnett und Tam, 1989, Methods in Enzymology 178: 739-746. Im Gegensatz dazu weisen BPI.2, BPI.4, BPI.8, BPI.14, BPI.53 und BPI.54 eine geringe Heparin-Bindungskapazität auf und entsprechend wenig oder keine bakterizide Aktivität.
BPI-Interdomänen-Kombinations-Peptide BPI.30 (umfassend Domäne II-Domäne III- Peptide) und BPI.74 (umfassend Domäne III-Domäne II-Peptide) "wurden hinsichtlich bakterizider Aktivität gegen Gram-negative und Gram-positive Bakterien und auf Heparin-Bindung und -Kapazität verglichen. Die Ergebnisse zeigten überraschenderweise, daß ein Umkehren der Reihenfolge der Peptide in der Kombination die beobachteten relativen Aktivitätsmaße änderte. Zum Beispiel fand man, daß BPI.74 stark reduzierte bakterizide Aktivität verglichen mit BPI.30 aufwies. Speziell wies BPI.74 eine 10-fach niedrigere bakterizide Aktivität gegen E. coli J5-Bakterien auf, eine 50-fach geringere bakterizide Aktivität gegen E. coli 011 1 : 134-Bakterien und eine 3,5-fache geringere bakterizide Aktivität gegen S. aureus. Eine zweifache Verinngerung der Heparin-Bindungskapazität und eine zweifache Erhöhung der Heparin-Affinität wurde auch beobachtet.
Andere bakterizide und Endotoxin-bindende Proteine wurden auf Heparin-Bindungsaktivität untersucht. Cecropin A, Magainin 11-Amid, Polymyxin B-Peptid und Limultts-anti-LPS- Faktor (LALF) wurden in dem in Beispiel 3 beschriebenen direkten Heparin-Bindungstest getestet. Das Magainin-II-Amid (Sigma, St. Louis, MO) wies die höchste Heparin- Bindungskapazität auf (437,7 ng Heparin/2 ug Peptid, Kd = 3.17 uM) relativ zu Cecropin A (Sigma, 242 ng/2 ug, Kd = 395 nM), LALF (Assoc. of Cape Cod, Woods Hole, MA, 195,3 ng/2 ug Peptid, Kd = 1,29 pM) und PMB-Peptid (Bachem Biosciences, Philadelphia, PA, 58,0 ng/ 2 ug Peptid, Kd = 309 mM). Das Magainin-II-Amid ist eine Substitutionsvarianten der natürlichen Magainin-Sequenz, wo 3 Alanine an Positionen 8, 13 und 15 ausgetauscht worden sind. Es ist berichtet worden, daß Magainin-II-Amid eine geringere hämolytische Aktivität als die natürliche Magainin-Sequenz aufweist.
Die obigen Ergebnisse unterstützen die Beziehung zwischen Heparin-Bindung, LPS-Bindung und bakteriziden Aktivitäten, die durch BPI-Daten gezeigt wurden und schlägt vor, daß andere LPS-Bindungsproteine auch an Heparin binden werden. Die aktiveren bakteriziden Proteine, Cecropin A und Magainin-II-Amid, weisen entsprechend die höchste Heparin- Bindungskapazität dieser Serie von anderen LPS-bindenden Proteinen auf.
Ein Typ von BPI-Funktionsdomänen-Peptidadditionsvarianten baut die Addition von D- Alanin-D-Alanin an entweder dem amino- oder carboxyterminalen Terminus eines BPI- Funktionsdomänen-Peptids ein. Der Grund für diesen Ansatz besteht darin, eine höhere Gram-positive bakterizide Aktivität durch die Hinzuftigung von D-Alanin zu verleihen. Die Zellwandbiosynthese von Gram-positiven Bakterien umfaßt eine Transpeptidase-Reaktion, die spezifisch D-Alanin-D-Alanin bindet und verwendet. Beta-Lactam-Antibiotika, wie die Penicilline, inhibieren genau diese Reaktion wirksam. Der Einbau von D-Alanin-D-Alanin in das aktive bakterizide Peptid sollte das Peptid zur aktiv wachsenden Zellwand von Grampositiven Bakterien targetieren.
In der Domäne 11-Substitutionssene von BPI-Funktionsdomänen-Peptiden wurde ein unerwarteter Anstieg beobachtet, wenn Lys&sub9;&sub5; durch Alanin substituiert wurde (BPI.24). Eine nachfolgende Phenylalanin-Substitution an Position 95 (BPI.73) führte zu verbesserter Aktivität verglichen mit der Alanin-Substitutions-Spezies. Überraschenderweise führte die Substitution an Position 95 mit D-Phe (BPI.76) zu dramatisch verringerter Aktivität, auf ein Maß unterhalb desjenigen des ursprünglichen Peptids (BPI.2). Dieser Isomer-Effekt zeigt, daß die Wechselwirkung dieses Peptids stereospezifisch ist und impliziert, daß BPI.73 eine aktivere Konformation verglichen mit BPI.76 einnehmen kann. Eine derartige Stereospezifität, insbesondere nachdem das Phänomen an anderen Resten untersucht worden ist, sieht eine wichtige Determinante für die Entwicklung von pharmakologischen Wirkgruppen vor.
Peptide, die von den Funktionsdomänen von BPI, wie hierin definiert abgeleitet wurden, sind verwendet worden, um zu bestimmen, daß die hydrophoben Aminosäuren (insbesondere Tryptophan) für die optimale Aktivität am kritischsten sind. Dieses Ergebnis war unerwartet infolge der kationischen Natur von BPI. Tatsächlich erhöht sich, für Domäne II, die Aktivität dramatisch, wenn ein Lysin durch Alanin oder Phenylalanin ersetzt wird (BPI.24, BPI.73).
Kombinationen von Funktionsdomänen-Peptide können auch die Potenz einzelner Peptidkonstrukte erhöhen, einschließlich Kombinationen der aktivsten Substitutionspeptide von den drei Domänen.
Die Reinheit eines jeden neu synthetisierten Peptids wurde bestimmt durch analytische Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer VYDAC C-18-Säule (25 cm · 4,5 mm, Partikelgröße 5 um, Porengröße 30 nm; Separation Group, Hesperia, CA). HPLC wurde vorgenommen unter Verwendung von 5% Acetonitril/0,1% Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser als mobile Phase A und 80% Acetonitril/0,065% TFA als mobile Phase B. Das Eluat wurde spektrophotometrisch bei 220 nm überwacht. Die Flußrate betrug 1,0 ml/Min. Gradientenelutionsbedingungen wurden ausgewählt, um optimale Auflösung für jedes Peptid zu ergeben. Die Reinheit wurde als der Prozentsatz ausgedrückt, den die Hauptpeak-Fläche zur Gesamtpeak-Fläche beitrug (siehe Tabelle X). Reinheit und Identität der neu synthetisierten Peptide wurde auch durch Elektrosprühionisationsmassenspektrometrie unter Verwendung eines VG Biotech Bio-Q Massenspektrometers bestimmt. Tabelle X stellt eine Zusammenfassung der Reinheitsanalysen von beispielhaften Peptiden der Erfindung durch Massenspektroskopie und HPLC dar.
BPI.13 wurde ebenso wie andere ausgewählte Peptide gereinigt unter Verwendung einer semi-präparativen Umkehrphasen-VYDAC C-18-Säule (25 cm · 10 mm, Partikelgröße 10 um, Porengröße 30 nm). Der folgende Gradient wurde verwendet, um BPI.13 zu reinigen: 26,7%B bis 33% B/30 min bei einer Flußrate von 2,0 ml/Min. BPI.13 wurde in mobiler Phase A bei einer Konzentration von 8,8 mg/ml gelöst und in ein Volumen von 0,5 ml injiziert. Drei getrennte Injektionen wurden vorgenommen und der Hauptpeak von einer jeden Injektion wurde gesammelt. Das gesammelte Material wurde vereinigt und zur Trockne verdampft unter Verwendung einer SpeedVac.
Die Reinheit des wiedergewonnen Materials (das als BPI.13P, für gereinigt, bezeichnet wird) wurde bestimmt mit dem oben beschriebenen analytischen Umkehrphasensystem und den Gradienten-Elutionsbedingungen. Auf der Grundlage dieser Analyse war BPI.13P zu 98% rein. Reinheit und Identität von BPI.13.P wurde auch bestimmt durch Elektrosprühionisationsmassenspektrometrie unter Verwendung eines VG Bio-Q Massenspektrometers. Das beobachtete Molekülgewicht betrug 1711,0 (die vorhergesagte Masse betrug 1711,1). Es wurden durch Massenspektrometrie keine Verunreinigungen nachgewiesen. Wiedergewinnung von BPI.13.P betrug 55% unter der Annahme, daß das erwünschte Peptid 69% des Ausgangsmaterial ausmachte.
Wenn Peptide der Erfindung weiter gereinigt wurden, wie oben beschrieben, stellte man fest, daß sich die Größenordnung der getesteten biologischen Aktivität der Peptide, d. h. BPI.13P und BPI.30P, weiter erhöhte, wenn die chemische Reinheit erhöht wurde. Dies zeigte an, daß die beobachtete biologische Aktivität auf dem Peptid selbst beruhte. Insbesondere wurde die vollständig neu und unerwartete anti-fungizide Aktivität von BPI. 13 gegen Candida albicans (siehe Beispiel 16) mit einer Reinheit von etwa 69%, weiter erhöht, wenn die Reinheit des Peptidpräparates auf 98% erhöht wurde. Tabelle X TABELLE X (FORTSETZUNG) TABELLE X (FORTSETZUNG) Tabelle X (Fortsetzung) Tabelle X (Fortsetzung) Tabelle X (Fortsetzung) Tabelle X (Fortsetzung)
- = nicht durchgeführt, m = gemischt, mp = Mehrfachpeaks, np = keine Peaks

Beispiel 20

Analyse von BPI-Funktionsdomänen-Peptiden unter Verwendung von Bindungs- und Neutralisationstests

A. LPS-Bindungstests

BPI-Funktionsdomänen-Peptide wurden LPS-Bindungstests unterzogen.
Der erste dieser Tests wurde durchgeführt, wie beschrieben in Gazzano-Santoro et al., supra. Kurz gesagt wurde eine Suspension von Lipid A von E. coli-Stamm J5, mit Ultraschall behandelt und in Methanol auf eine Konzentration von 0,2 ug/ml verdünnt und dann wurden 50 pl Aliquots an Näpfen (Immulon 2 Removawell Strips, Dynatech) adsorbiert. Nach Übernacht-Inkubation bei 37ºC wurden die Näpfe mit 215 ul einer Lösung von D-PBS/0,1% BSA für drei Stunden bei 37ºC blockiert. Danach wurde der Blockierungspuffer verworfen, die Zellen mit einer Lösung von 0,05% Tween-20 in D-PBS (D-PBS/T) gewaschen und über Nacht bei 4ºC mit 50 ul einer Lösung von [¹²&sup5;I]-rBPI&sub2;&sub3; in D-PBS/T (insgesamt 234.000 cpm bei einer spezifischen Aktivität von 9,9 uCi/ug) und zunehmenden Konzentrationen von BPI- Funktionsdomänen-Peptiden inkubiert. Nach dieser Inkubation wurden die Näpfe dreimal mit D-PBS/T gewaschen und die gebundene Radioaktivität unter Verwendung eines Gamma- Zählers gezählt. Binden an mit D-PBSBSA behandelte Näpfe wurde als nicht-spezifisches Hintergrund-Binden betrachtet und von der in jedem Napf gebundenen Gesamtradioaktivität subtrahiert, um die Menge an spezifisch gebundener Aktivität zu ergeben.
Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Fig. 17a (wo die Konzentration eines jeden Peptides in nM angegeben ist) und 17b (die identischen Ergebnisse, wobei die Konzentration an Peptid in ug/ml angegeben ist) gezeigt. Kompetitionsexperimente unter Verwendung von nicht-markiertem rBPI&sub2;&sub3; sind zu Vergleichszwecken gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen, daß alle der getesteten Peptide einige Kapazität aufweisen, mit rBPI&sub2;&sub3; um LPS-Bindung zu konkurrieren, in unterschiedlichen Maßen.
Das Ergebnis wurde wiederholt und die LPS-Bindungsaffinität von BPI.10 mit rBPI&sub2;&sub3;, unter Verwendung der doppelten Menge von [¹²&sup5;I]-rBPI&sub2;&sub3; (insgesamt 454.000 cpm, spezifische Aktivität 10 uCi/ug) und in Gegenwart oder Abwesenheit von Vollblut verglichen. Diese Ergebnisse sind in Fig. 18 dargestellt und zeigen, daß, auf einer molaren Basis, BPI innerhalb eines Faktor von 2 so potent ist wie rBPI&sub2;&sub3; beim Konkurrieren mit radiomarkiertem rBPI23 in diesem Test.
Das Experiment wurde wiederholt unter Verwendung der Peptide BPI.7, BPI.29 und BPI.30, wie in dem oben beschriebenen ersten Experiment, mit der Ausnahme, daß insgesamt 225.000 cpm [¹²&sup5;I]rBPI&sub2;&sub3; verwendet wurden und Lipid A mit einer Konzentration von 0,5 mg/ml ausplattiert wurde. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Fig. 19 dargestellt und zeigen, daß, auf einer molaren Basis, diese Peptide beim Binden von Lipid A 6- bis 10-fach weniger potent als unmakiertes rBPI&sub2;&sub3;.
Ein zweiter Bindungstest wurde entwickelt, wobei radiomarkiertes rekombinantes LPS-Bindungsprotein ([¹²&sup5;I]-rLBP) anstelle von radiomarkiertem rBPI&sub2;&sub3; in Kompetitionsexperimenten mit BPIFunktionsdomänen-Peptiden BPI.2, BPI.3, BPI.4, BPI.5, BPI.7, BPI. 13, BPI.14, BPI.29, BPI.30 und BPI.48 verwendet wurde. rBPI, rBPI&sub2;&sub1;Δcys und rLBP&sub2;&sub5; waren in diesen Tests als Kontrollen eingeschlossen. Bei diesen Experimenten wurde Lipid A an die Näpfe mit einer Konzentration von 0,7 ug/ml in Methanol adsorbiert. Inkubation von radiomarkiertem rLBP (insgesamt 650.000 cpm und eine spezifische Aktivität von 3,45 uCi/ug) wurde für 2,5 Stunden bei 37ºC in Gegenwart von BPI-Peptiden in einer Serie mit ansteigenden Konzentrationen durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Fig. 20a und 20b gezeigt. IC&sub5;&sub0;-Werte (d. h. die Konzentration, bei der Lipid A-Bindung von radiomarkierten rLPB&sub2;&sub5; auf die Hälfte des Wertes inhibiert ist, der in Abwesenheit des Peptids erreicht wird) sind in der beigefügten Tabelle XI gezeigt. Tabelle XI
Im einem dritten Bindungstest wurde eine Anzahl von BPI-Funktionsdomänen-Peptiden getestet auf ihre Fähigkeit, an radiomarkiertes LPS nach Inkubation mit menschlichen Endothelzellen (HUVEC) zu binden. Dieser Test mißt die Fähigkeit, LPS zu binden, nachdem BPI-Peptide an HUVEC-Zellen gebunden sind. HUVEC-Zellen wurden in Gegenwart verschiedener BPI-Peptide bei einer Konzentration von entweder 1 ug/ml oder 3 ug/ml für drei Stunden bei 4ºC in 500 ul einer Lösung von D-PBS-BSA inkubiert. Nach dieser Inkubation wurden die Zellen zweifach mit eiskaltem D-PBS-BSA gewaschen und dann für weitere 2,5 Stunden bei 4ºC in 500 ul einer Lösung von [¹²&sup5;I]-RaLPS (insgesamt 340.000 cpm bei einer spezifischen Aktivität von 4,6 · 10&sup6; cpm/ug) in D-PBS/BSA inkubiert. Die Näpfe wurden dreimal mit D-PBS-BSA gewaschen, in 500 ul 1 M NaOH solubilisiert und die Lysate unter Verwendung eines Gamma-Zählers gezählt. Die Ergebnisse, gezeigt in Fig. 21, zeigen an, daß BPI.29 und BPI.30 die Kapazität beibehalten, LPS zu binden, während sie an HUVEC-Zellen gebunden sind.

B. LPS-Neutralisations-Screenina-Tests von BPI-Funktionsdomänen-Peptiden unter Verwendung von TNF-Zelltoxizität

Ein Screening-Test für LPS-Neutralisation wurde entwickelt unter Verwendung eines Tumor- Necrose-Faktors (TNF)-Zelltoxizitätstests. Eine menschliche monozytische Zellinie (THP-1; Zugangsnummer TIB202, American Type Culture Collection, Rockville, MD), die in Medium angezogen war, das mit Vitamin D supplementiert war, produziert TNF nach Stimulation mit LPS in einer Dosis-abhängigen Weise. Mäuse-Fibroblasten (L929-Zellen; ATCC-Nr. CCL1) sind empfindlich für TNF-vermitteltes Zelltöten und dieses Zelltöten ist auch Dosis-abhängig. Somit sieht das Ausmaß des Zelltötens von L929-Zellen einen empfindlichen Test für das Ausmaß der TNF-Induktion in THP-1-Zellen vor, was wiederum ein empfindlicher Indikator für die Menge an freiem LPS in Kontakt mit den THP-1-Zellen ist. LPS-Bindung und -Neutralisation durch BPI-Funktionsdomänen-Peptide oder rBPI&sub2;&sub3; verringert die Menge an freiem LPS in Kontakt mit THP-1-Zellen, was die Menge an produziertem TNF verringert, was wiederum die Menge des Abtötens von L929-Zellen in einem standardisierten Test verringert. Somit sieht der folgende Test ein empfindliches Verfahren zum Bewerten der LPS- Bindungs- und -Neutralisationskapazität der BPI-Funktionsdomänen-Peptide dieser Erfindung vor.
THP-1-Zellen wurden in RPMI-Medium (GIBCO, Long Island, NY), supplementiert mit 10% FCS und Vitamin D, in Spinner-Kultur für drei Tage auf eine Dichte von etwa 150.000 Zellen/ml angezogen. Die Zellen wurden dann in Kultur-Platten mit 96 Näpfen und rundem Boden bei einer Dichte von 100.000 Zellen pro Napf ausplattiert und in RPMI-Medium ohne Vitamin D oder FCS in Gegenwart von 5 ng/ml LPS von E. coli 01113 für 6 Stunden bei 37ºC inkubiert. Die experimentellen Kontrollnäpfe enthielten auch verschiedene Mengen an rBPI23 oder BPI-Funktionsdomänen-Peptiden, bei Konzentrationen, die von etwa 0,1 fug/ml bis etwa 100 ug/ml schwankten. Nach dieser Inkubation wurden die Platten bei etwa 600 · g zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren und 50 ul des Überstands wurden hinzugefügt zu einer Kulturschale mit 96 Näpfen und flachem Boden, die parallel mit 50.000 L929-Zellen pro Napf in 50 ul RPMI/10% FCS vorbereitet war.
L929-Zellen wurden hergestellt durch Monolayer-Wachstum in RPMI/10% FCS-Medium bis zu einer Dichte von etwa 1 Millionen Zellen pro Schale, dann 1 : 2 am Tag vor dem Experiment aufgeteilt und über Nacht zu einer Konfluenz von 70% am Tag des Experiments zu wachsen erlaubt. Actinomycin D wurde zu der 70% konfluenten Kultur hinzugegeben zu einer Endkonzentration von 1 ug/ml 20 Minuten vor dem Ausplattieren in Platten mit 96 Näpfen. L929-Zellen wurden in Gegenwart von THP-1-Überstand für etwa 16 Stunden (über Nacht) bei 37ºC unter Standardbedingungen für Säugetier-Zellwachstum inkubiert. Zu jedem Napf wurden dann 20 ul einer Lösung hinzugegeben, die hergestellt wurde durch Verdünnen von 100 ul Phenazin-Methylsulfonat in 2 ml CellTitre 96TTM AQueous-Lösung (Promega, Madison, WI), das 3-[(4,5-Dimethyl)-thiozol-2-yl]-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4sulfonyl)- 2H-tetrazolium (inneres Salz) enthielt. Man erlaubte den Kulturen, für 2-4 Stunden bei 37ºC zu inkubieren und analysierte dann spektrophotometrisch, um die optische Absorbanz bei 490 nm (A490) zu bestimmen. Die experimentellen Ergebnisse wurden bewertet relativ zu einer halb-logarithmischen Standardkurve, die mit bekannten Mengen an TNF hergestellt wurde, die von etwa 10 ng/ml bis etwa 10 mg/ml variierte.
Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Fig. 22a-22h gezeigt. Fig. 22a zeigt die Beziehung zwischen A490 und TNF-Konzentration in Kulturen von L929-Zellen in Gegenwart und Abwesenheit von 5 ng/ml LPS. Diese Ergebnisse zeigen etwa die gleiche lineare Beziehung zwischen A490 und Konzentration von TNF egal, ob LPS im Testmedium vorhanden war oder nicht. Fig. 22b veranschaulicht ein Experiment, wo TNF mit L929Zellen in Gegenwart von zunehmenden Mengen an Heparin inkubiert war. Diese Ergebnisse zeigen eine konstante und charakteristische A490 für TNF bei Konzentrationen von 1 ng/ml und 0,1 ng/ml, was anzeigt, daß Heparin das Abtöten von L929-Zellen durch INF nicht beeinflußt. Fig. 22c veranschaulicht ein Kontrollexperiment, welches zeigt, daß rBPI&sub2;&sub1;Δcys den Umfang des TNF-vermittelten Abtötens von L929-Zellen verinngerte, wenn bei den angegebenen Konzentrationen in Kulturen von THP-1-Zellen in Gegenwart von 5 ng/ml LPS inkubiert. Fig. 22d zeigt, daß Heparin mit LPS für Binden mit rBPI2IOcys konkurrieren konnte durch Inhibieren der BPI-vermittelten Inhibierung von LPS-stimulierter TNFProduktion durch THP-1-Zellen, wie gemessen durch den L929-Zellabtötungstest.
Fig. 22e ist eine Standardkurve von A490 gegen TNF als ein Maß von TNF-vermitteltem Abtöten von L929-Zellen; Fig. 22g zeigt die Linearität der Standardkurve in einer halblogarithmischen Auftragung über einen TNF-Konzentrationsbereich von etwa drei Größenordnungen (etwa 1000-fach). Fig. 22f zeigt die THP-1-Zellabhängigkeit des Tests, wobei nachweisbare Mengen an TNF am leichtesten produziert wurden bei Verwendung von etwa 100.000 THP-1-Zellen und LPS bei einer Konzentration von wenigstens 5 ng/ml. Schließlich zeigt Fig. 22h, daß man gefunden hat, daß der Test von THP-1-Zellproduktion von TNF in Antwort auf LPS-Stimulierung abhängt; menschliche histiozytische LymphomaZellen (U937; ATCC No.: CRL1593) produzierten keinen nachweisbaren TNF, wenn im Test für die THP-1-Zellen substituiert.
Dieser Test wurde verwendet, um LPS-Bindungs- und Neutralisationskapazität von einer Anzahl von BPI-Funktionsdomänen-Peptiden der Erfindung zu analysieren. Diese Ergebnisse sind in Tabelle XII gezeigt und zeigen an, daß ein jedes der getesteten Peptide die Kapazität aufwies, LPS-stimulierte TNF-Produktion in THP-1-Zellen zu inhibieren, wie gemessen durch TNF-vermitteltes Abtöten von L929-Zellen.

Tabelle XII

Peptid IC&sub5;&sub0; (ug/ml)

rBPI&sub2;&sub3;Δcys 0,2
BPI.7 30
BPI.13 20
BPI.29 2-3
BPI.30 6-7
BPI.48 1

C. LPS-Neutralisations-Screening Test von BPI-Funktionsdomänen-Peptiden unter Verwendung eines zellulären NO-Produktions-Test

Ein zusätzlicher LPS-Neutralisations-Screening-Test für BPI-Funktionsdomänen-Peptide wurde entwickelt unter Verwendung eines Tests für NO-Produktion in Mäusenzeilen, die mit LPS behandelt waren (sich Lorsbach et al., 1993, J. Biol. Chem. 268: 1908-1913). In diesem Test wurden Maus-RAW 264.7-Zellen (ATCC Zugangsnummer No. T1B71) mit bakteriellem LPS behandelt. Die Zellen wurden in einer Platte mit 96 Näpfen inkubiert und für zwei Stunden mit E. coli 0113-LPS oder Zymosan, in Anwesenheit oder Abwesenheit von 7Interferon, rLPB; fötalem Rinderserum (FBS) oder normalem menschlichem Serum. (NHS) oder rBPI&sub2;&sub1;Δcys inkubiert. Nach dieser Inkubation wurden die Zellen mit frischem Medium gewaschen und über Nacht in Medium mit 10% FCS inkubiert. Das von den Zellen freigesetzte NO sammelte sich im Medium an und wandelte sich spontan in Nitrit um. Dieses Nitrit wurde in sitzt durch die Griess-Reaktion getestet; wie folgt. Das Nitrit wurde mit dem primären Amin eines hinzugegeben Sulfanilamides umgesetzt, um ein Diazonium-Salz zu bilden. Dieses Salz wurde dann umgesetzt mit hinzugefügtem Naphthylethylendiamin, um einen roten Azo-Farbstoff zu bilden. Die Griess-Reaktion wurde bei Raumtempetatur in etwa 10 Minuten durchgeführt. Die Menge an produziertem NO wurde aus einer Standardkurve von Griess-Reaktionsprodukten bestimmt, die spektrophotometrisch als Absorbanz bei einer Wellenlänge von 550 nm bestimmt wurden.
Die Ergebnisse dieses Tests sind in Fig. 23a bis 23c gezeigt. Fig. 23a zeigt die Abhängigkeit der NO-Produktion von der Anwesenheit von γ-Interferon. Man fand, daß eine Sättigung dieser Interferon-Wirkung bei einer Konzentration von 100 U/ml auftritt. Fig. 23b zeigt die Abhängigkeit von LPS-stimulierter NO-Produktion in Gegenwart von LBP, entweder hinzugefügt als gereinigtes rekombinantes Protein oder als eine Komponente von FBS- oder NHS-Supplementen des Zellinkubations-Mediums. Fig. 23c zeigt rBPI&sub2;&sub3;vermittelte Inhibierung von LPS-stimulierter NO-Produktion mit einer IC&sub5;&sub0; von 30-100 ng/ml. Diese Ergebnisse zeigen, daß dieser Test ein einfaches, kostengünstiges und physiologisch relevantes Testsystem zum Bewerten der LPS-Neutralisierungsaktivität von BPI und BPI-Funktionsdomänen-Peptiden, die hierin offenbart sind, ist.
Die Ergebnisse derartiger mit BPI-Funktionsdomänen-Peptiden vorgenommener Tests sind in Fig. 24a bis 24g gezeigt, wobei die Hintergrundproduktion von NO durch nichtstimulierte Zellen als "NO LPS" bezeichnet ist. Fig. 24a und 24b zeigen Inhibierung von NO-Produktion; die durch Zymosan bzw. LPS stimuliert ist, durch rBPI, rBPI&sub2;&sub1;Δcys und rLBP&sub2;&sub5;. Keine Inhibierung von Zymosan-stimulierter NO-Produktion wurde bei irgendeiner Konzentration an BPI-Protein gesehen (Fig. 24a). Im Gegensatz dazu wurde LPS-stimulierte NO-Produktion in einer Konzentrations-abhängigen Art und Weise durch Inkubation mit diesen rBPI-verwandten Proteinen inhibiert (Fig. 24b). Fig. 24c (Zymosan) und Fig. 24d (LPS) zeigt die Wirkung von Inkubation mit BPI.2, BPI.3, BPI.7 und BPI.14 auf NO- Produktion durch RAW 264.7-Zellen; rBPI&sub2;&sub1;Δcys ist auch zum Vergleich gezeigt. Wie mit nativem BPI gezeigt, wurde Zymosan-stimulierte N0-Produktion nicht durch Inkubation mit irgendeinem der BPI-Funktionsdomänen-Peptide inhibiert (mit der möglichen Ausnahme eines geringen Umfanges an Inhibition durch BPI.7 bei hohen Konzentrationen; Fig. 24c). LPS-stimulierte NO-Produktion war andererseits wirksam durch rBPI&sub2;&sub1;Δcys inhibiert und zu einem geringeren Umfang durch BPI.3 und BPI.7 (Fig. 24d).
Dieses Experiment wurde wiederholt unter Verwendung von BPI.5, BPI.13, BPI.29 und BPI.30, wobei rBPI&sub2;&sub1;Δcys parallel zum Vergleich analysiert wurde. Man fand, daß Zymosanstimulierte NO-Produktion durch RAW 264.7-Zellen durch BPI.30 bei hohen Konzentrationen (~ 100 ug/ml) inhibiert wurde; weder zeigte eines der anderen BPI- Funktionsdomänen-Peptide noch rBPI&sub2;&sub1;Δcys irgendeine Inhibierung von Zymosanstimulierter NO-Produktion (Fig. 24e). LPS-stimulierte NO-Produktion wurde wirksam inhibiert durch rBPI&sub2;&sub1;Δcys und in variiererden und geringerem Umfang durch alle in diesem Experiment getesteten BPI-Funktionsdomänen-Peptide (Fig. 24fJ.
Die IC&sub5;&sub0;-Werte (d. h. die Konzentration an Inhibitor, bei der Zymosan oder LPS-stimulierte NO-Produktion durch RAW 264.7-Zellen auf die Hälfte ihres Wertes in Abwesenheit des Inhibitors verringert ist) für die BPI-Proteine und -Peptide wurde von diesen Experimenten berechnet und sind in Fig. 24g gezeigt. Mit Ausnahme von BPI.30 wurde weder eine signifikante Inhibierung von Zymosan-vermittelter NO-Produktion für BPI- Funktionsdomänen-Peptide noch für rBPI&sub2;&sub1;Δcys, rBPI oder rLBP in diesen Experimenten gefunden; man fand, daß die IC&sub5;&sub0; von BPI.30 für Inhibierung von Zymosan-stimulierter NO- Produktion zwischen 10 und 100 ug/ml liegt. Man fand, daß BPI.3, BPI.5, BPI.13, BPI.29 und BPI.30 nachweisbare Umfänge an LPS-Neutralisierung in diesem Test aufwiesen und die relativen IC&sub5;&sub0;-Werte für diese Peptide sind in Fig. 24g gezeigt.

D. LPS-Neutralisations-Screening-Test auf BPI-Funktionsdomänen-Peptide unter Verwenduu eines zellulären Proliferations-Tests

Ein zusätzlicher LPS-Neutralisations-Screening-Test zur Bewertung von BPI- Funktionsdomänen-Peptiden wurde entwickelt. Dieser empfindliche Test für die Inhibierung von Zeltproliferation bei mit LPS behandelten Mauszellen kann auch verwendet werden für die Quantifizierung von LPS-Titern in menschlichem Plasma nach Entwicklung einer Standard-Kurve
In diesem Test wurden RWA 264.7 Mäusezellen (ATCC Zugangsnummer TIB71), die iri RPMI 1640-Medium gehalten wurden (GIBCO), supplementiert mit 10 mM HEPES-Puffer (pH 7,4), 2 mM L-Glutamin, Penicillin (100 U/ml) Streptomycin (100 ug/ml), 0,075% Natriumbicarbonat, 0,15 M 2-Mercaptoethanol und 10% fötalem Rinderserumalbumin (Hyclone, Inc., Logan, UT) zuerst durch Inkubation in Gegenwart von 50 U/ml rekombinantem Mäuse-γ-Interferon (Genzyme, Cambridge, MA) für 24 Stunden vor dem Test induziert. Die induzierten Zellen wurden dann mechanisch gesammelt und bei 500 g bei 4ºC zentrifugiert und dann in 50 ml RPMI 1640 Medium (ohne Supplemente) resuspendiert, erneut zentrifugiert und wieder in RPMI 1640 Medium (ohne Supplemente) resuspendiert. Die Zellen wurden gezählt und ihre Konzentration auf 2 · 10&sup5; Zellen/ml eingestellt und Aliquots von 10 ul wurden zu jedem Napf einer Mikrotiterplatte mit 96 Näpfen zugegeben. Die Zellen wurden dann für etwa 15 Stunden mit E. coli 0113-LPS (Control Standard, Assoc. of Cape Cod, Woods Hole, MA) inkubiert, das dann in Aliquots von 100 ul/pro Napf in einer Konzentration von 1 ng/ml in Serumfreiem RPMI 1640 Medium hinzugegeben wurde (diese Konzentration ist das Ergebnis vow Titrations-Experimenten, in denen die LPS-Konzentration zwischen 50 pg/ml und 100 ng/ml variiert wurde); Diese Inkubation wurde in Gegenwart oder Abwesenheit von BPI-Funktionsdomänen-Peptiden mit schwankenden Konzentration zwischen 25 ng/ml und 50 ug/ml durchgeführt. Rekombinantes menschliches BPI wurde als eine Positiv-Kontrolle bei einer Konzentration von 1 ug/ml verwendet. Zell-Proliferation wurde quantitativ durch Hinzufügen von 1 uCi/Napf [³H]-Thymidin 5 Stunden nach dem Beginn des Tests quantitativ gemessen. Nach der 15-stündigen Inkubation wurden markierte Zellen auf Glasfaser-Filter mit einem Zell-Ernter (Inotech Biosystems, INB-384, Sample Processing and Filter Counting System, Lansing, MI) geerntet.
Die Ergebnisse dieses Tests sind in Fig. 26a bis 26c gezeigt. Fig. 26a zeigt die Abhängigkeit von LPS-vermittelter Inhibierung von RAW 264.7-Zellproliferation von der Gegenwart von LPB, hinzugesetzt zur Reaktionsmischung entweder als eine Komponente des Serums oder als rekombinantes LBP (bei einer Konzentration von 1 ug/ml). Fig. 26b und 26c veranschaulichen Verhaltensmuster von BPI-Funktionsdomänen-Peptiden, die im obigen Test gefunden wurden. BPI.5 zeigt eine EC&sub5;&sub0; (d. h. die Peptidkonzentration, bei der der wachstumsinhibitorische Wirkung von. LPS um 50% umkehrt war) von 5,3 ± 0,6 ug/ml. BPI.81 war nicht in der Lage, die wachstumsinhibitorische Wirkung von LPS auf RAW 264.7-Zellen umzukehren, zeigte aber zusätzliche Wachstumsinhibierung mit einer IC&sub5;&sub0; (d. h. die Peptid-Konzentration, bei der RAW-Zellwachstum um 50% inhibiert war gegenüber dem Wert ohne hinzugesetztes Peptid) von 14 ± 0,2 ug/ml. BPI.98 zeigte ein EC&sub5;&sub0; von 0,16 ± 0,08 ug/ml und eine IC&sub5;&sub0; von 16,5 ± 1,9 ug/ml. Schließlich zeigte BPI.86 eine EC&sub5;&sub0; von 0,13 ± 0,04 ug/ml und eine IC&sub5;&sub0; von 37,5 ± 12,5 ug/ml. Ergebnisse von mit diesem Test getesteten repräsentativen Peptiden sind in Tabelle XIII gezeigt. Zusätzliche repräsentative Peptide, zum Beispiel BPI.99 bis BPI. 169 zeigten Aktivitäten in diesem Test. Ein solches Peptid, BPI.157, zeigte eine EC&sub5;&sub0; vergleichbar zu BPI.&sub2;&sub9;, jedoch eine niedrigere IC&sub5;&sub0;. Tabelle XIII
- = Keine Proliferationsabnahme bis zu 50 ug/ml; n = nicht getestet

E. LPS-Neutralisations-Tests auf der Basis von Inhibierung von LPS-induzierter TNF-Produktion in Vollblut

LPS-Neuträlisation durch BPI-Funktionsdomänen-Peptide der Erfindung wurde in Vollblut wie folgt getestet. Frisch abgenommenes Blut von gesunden menschlichen Spendern wurde in VacutainerRöhrcheri gesammelt (ACD, Rütherford, N. J.). Aliquots von Blut (170 ul) wurden mit 10 ulCa&spplus;&spplus;-, Mg&spplus;&spplus;freier PBS gemischt, die 2,5 ng/ml E. coli 0113-LPS enthielt und 20 ul variierende Konzentrationen der BPI-Peptide der Erfindung mit Konzentrationen von 0,5 bis 50 ug/ml. Diese Mischungen wurden dann für 4 Stunden bei 37ºC inkubiert und dann die Reaktion durch Hinzufügen von 55 ul eiskalter Ca&spplus;&spplus;-, Mg&spplus;&spplus;-freier PBS gestoppt, gefolgt von Zentrifugation bei 500 · g für 7 Minuten. Überstände wurden dann auf TNF-Titer getestet unter Verwendung eines kommerziellen ELISA-Kits (BiokineTN ELISA-Test, Tcell Sciences, Cambridge, MA).
Die Ergebnisse dieser Experimente mit repräsentativen Peptiden unter Verwendung von Vollblut-Proben von zwei verschiedenen Spendern sind in Fig. 27 und Tabelle XIV gezeigt. Fig. 27 zeigt einen Vergleich von TNF-Inhibierung durch BPI-Funktionsdomänen-Peptide BPI.7, BPI.13 und BPI.29; Ergebnisse, die unter Ver Vendung von rBPI&sub2;&sub1;Δcys erhalten wurden, sind zum Vergleich gezeigt. Diese Ergebnisse sind als IC&sub5;&sub0;-Werte in Tabelle XIV quantifiziert und werden mit LPS-Neutralisation, wie getestet unter Verwendung von NO- Produktion durch RAW 264.7-Zellen, wie in Abschnitt C oben beschrieben, verglichen. Tabelle XIV

F. LPS- und Heparin-Bindungstests unter Verwendung von Tryptophan-Fluoreszenzlöschung

Die natürlicherweise vorkommende Aminosäure Tryptophan kann Licht aussenden (d. h. sie fluoresziert) mit einer Wellenlänge zwischen 300 und 400 nm nach Anregung mit Licht mit einer Wellenlänge von zwischen etwa 280 nm und 290 nm, bevorzugterweise 285 nm. Die Menge an emittiertem Licht, die durch derartige Fluoreszenz hergestellt wird, ist dafür bekannt, daß sie durch die lokale Umgebung, einschließlich pH und Pufferkonditionen, ebenso wie Bindungswechselwirkungen zwischen Proteinen und anderen Molekülen beeinflußt wird. Einige BPI-Funktionsdomänen-Peptide, die von Domänen II und III abgeleitet sind, enthalten Tryptophan-Reste und Tryptophan-Fluoreszenz wurde verwendet, um Bindungswechselwirkungen zwischen den BPI-Funktiondomänen-Peptiden der Erfindung und LPS oder Heparin zu testen.
Tryptophan-Fluoreszenz der BPI-Funktionsdomänen-Peptide der Erfindung wurde bestimmt in Gegenwart oder Abwesenheit von LPS oder Heparin unter Verwendung eines SPEX FluorologFluorimeters. Beispiele wurden mit Licht von 285 nm angeregt unter Verwendung einer Spaltbreite von 0,25 nm. Emissionswellenlängen wurde gescannt zwischen 300 und 400 nm unter Verwendung einer Spaltbreite von 1,25 nm. Die Daten wurden als das Mittel von drei Bestimmungen akkumuliert, die über eine etwa 5 Minuten lange Zeitspanne vorgenommen wurden. Proben wurden bei 25ºC oder 37ºC während der Dauer der Experimente gehalten unter Verwendung eines zirkulierenden Wasserbads. KrabbenEndotoxin-Bindungs-Protein (CEBP), ein Protein, in dem intrinsische Fluoreszenz von Tryptophan-Resten durch Binden von LPS beeinflußt wird, wurde verwendet als eine PositivKontrolle. (Siehe Wainwright et al., 1990, Cellular and Molecular Aspects of Endotoxin Reactions, Nowotny et al., Hrsg., Elsevier Science Publishing B.V., The Netherlands, S. 315325).
Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Tabelle XV gezeigt. Kd-Werte wurden bestimmt durch Stern-Volmer-Auftragungen vom Scatchard-Typ, der Löschungsdaten als das Negativinverse der Steigung derartiger Diagramme. Beim Vergleich der Daten für BPI.10, BPI.46 und BPI.47 ist zu sehen, daß, wenn der Kd abnahm (was eine Erhöhung der Avidität von LPS anzeigt), die Prozent Fluoreszenz-Löschung sich erhöhte. Die Unterschiede zwischen diesen Peptiden schließen Ersetzen von basischen und polaren Aminosäureresten durch nicht-polare Resten in BPI.48 ein, wie verglichen mit BPI. 10.
Im Gegensatz dazu wurde, wenn sich der Kd von Heparinbindung verringerte, ein entsprechender Anstieg des Prozentsatzes an Fluoreszenzlöschung nicht beobachtet. Dieses Ergebnis kann grundsätzliche Unterschiede zwischen der Stelle oder Natur von Heparinbindung verglichen mit LPS-Bindung anzeigen. Tabelle XV
aCEBP (LALF)-Experimente wurden bei 25ºC durchgeführt.

G. Neutralisationstest von Heparin-vermittelter Verlängerung der Thrombin-Zeit

Die Wirkung von BPI-Funktionsdomänen-Peptiden auf Heparin-vermittelte Verlängerung der Thrombinzeit, d.h. die Zeit, die zum Gerinnen einer Mischung aus Thrombin und Plasma erforderlich ist, wurde untersucht. Die Thrombinzeit wird verlängert durch die Anwesenheit von endogenen oder exogenen Inhibitoren der Thrombinbildung, wie therapeutisch verabreichtes Heparin. Mittel, die die anti-koagulierende Wirkungen des Heparins neutralisieren, werden die durch den Test gemessene Thrombinzeit verringern.
In diesen Experimenten wurde die Thrombin-Gerinnungszeit bestimmt unter Verwendung eines MLA Electra 800-Coagulation Timer. Rekonstituiertes Plasma (200 uL, Sigma Chemical Co., No. 855-10) wurde bei 37ºC für zwei Minuten in einer Reaktionsküvette inkubiert. Thrombin-Gerinnungszeitmittel (100 pL, Baxter Diagnostics Inc., 134233-50) wurde zu der Reaktionsküvette nach Inkubation hinzugesetzt und die Gerinnungszeit dann gemessen. Heparin-Natrium (13 uL, 40 ug/mL in PBS, Sigma Chemical Co., H3393) und beispielhafte BPI-Funktionsdomänen-Peptide (10gL verschiedener Verdünnungen von etwa 0,05 ug/ml bis etwa 10 ug/ml) wurden zu der Reaktionsküvette vor dem Hinzufügen von Plasma zum Testen der Wirkungen dieser Peptide auf Thrombingerinnungszeit hinzugesetzt. TCT-Gerinnungszeit (Thrombinzeit) wurde gemessen unter Verwendung der BPI-Peptide und zeigt an und die Ergebnisse sind in Fig. 28 und Tabelle XVI gezeigt. Diese in Fig. 28 und Tabelle XVI unten gezeigten Ergebnisse zeigen, daß die getesteten BPI-FunktionsdomänenPeptide Heparin neutralisieren, wie gezeigt durch Inhibierung der Heparin-vermittelten Verlängerung der Thrombinzeit. Die 1C5o dieser Inhibierung wurde quantifiziert und sind in Tabelle XVI gezeigt.

Tabelle XVI

BPI-Peptid IC&sub5;&sub0; (ug/ml) ± SE

BPI.10 0.115 ± 0.014
BPI.47 0.347 ± 0.041
BPI.63 0.362 ± 0.034
BPI.69 0.200 ± 0.025
BPI.73 0.910 ± 0.821
BPI.82 0.200 ± 0.073
BPI.84 0.225 ± 0.029
BPI.87 0.262 ± 0.009
BPI.88 0.691 ± 0.180
BPI.90 0.753 ± 0.210
BPI.98 0.242 ± 0.038
BPI.99 0.273 ± 0.011
BPI.100 0.353 ± 0.050
BPI.101 0.285 ± 0.088
BPI.102 0.135 + 0.024

Beispiel 21

Heparin-Neutralisationstest auf der Grundlage von Inhibierung von Heparin/FGF- induzierter Angiogenese in Matrigel® Basalmembranen Matrix In Vivo

BPI-Funktionsdomänen-Peptide der Erfindung werden getestet auf ihre Fähigkeit, Heparininduzierte Angiogenese in vivo in Mäusen zu inhibieren. Flüssiges Matrigel® (Collaborative Biomedical Products, Inc., Bedford, MA) wird bei 4ºC gehalten und angiogene Faktoren werden zum Gel im flüssigen Zustand hinzugegeben, wie beschrieben in Passaniti et al. (1992, Lab. Invest. 67: 519-528). Heparin (Sigma, St. Louis, MO) wird in steriler PBS in verschiedenen Konzentrationen gelöst, die von 1.250-10.000 U/mL reichen. Rekombinanter Fibroblastenwachstumsfaktor (bhFGF; BACHEM Bioscience Inc., Philadelphia, PA) wird auf 200 ng/ml mit steriler PBS verdünnt. Ein Volumen von 2,5 ul Lösung gelösten Heparins und 2,5 ul rekombinanter bhFGF werden zu 0,5 ml Matrigel® pro Mäuseinjektion gegeben. BPI- Funktionsdomänen-Peptide werden zu dieser Matrigel®-Mischung mit variierenden Konzentrationen, die von 0,5 bis 50 ug/ml (Endkonzentration) in 10 p,1/0,5 ml Matrigel(g~-Aliquots pro Versuchstier hinzugefügt. Zehn ul steriles PBS werden anstelle der BPI- Funktionsdomän-Peptiden in Matrigel®-Aliquots eingesetzt, die in Kontrollmäuse injiziert werden.
Männlichen C57BL/6J-Mäuse (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) mit einem Alter von 6 bis 8 Wochen werden subkutan entlang der dorsalen Mittellinie 0,5 mL Aliquots von Matrigel®, wie oben hergestellt, injiziert. Sieben Tage nach Injektion werden die Matrigel®Gele herausgeschnitten und in 500 qL Drabkin's Reagens (Sigma) plaziert. Gesamtproteinund Hämoglobingehalt werden bestimmt für die in Drabkin's Reagens gelagerten Gelen nach mechanischer Homogenisierung der Gele. Gesamtproteintiter werden bestimmt unter Verwendung eines Mikroplattentests, der kommerziell in einem Kit ausgeführt ist (DC Protein Assay, Bio-Rad, Richmond, CA). Die Hämoglobinkonzentration wird gemessen unter Verwendung der Sigma-Verfahrensweise Nr. 525 und von Sigma (St. Louis, MO) zur Verfügung gestellten Reagenzien, die bei dieser Verfahrensweise verwendet werden sollen. Hämoglobintiter werden ausgedrückt relativ zur Gesamtproteinkonzentration.
Die Gele, die für histologisches Färben verwendet werden sollen, werden unmittelbar nach Exzision aus den Tieren formalinfixiert, statt in Drabkin's Reagens gegeben zu werden. Formalin-fixierte Gele werden in Tissue-Tek O.C.T.-Verbindung (Miles, Inc., Elkhart, IN) für Gefrierschneiden eingebettet. Scheiben von Gefrierschnitten werden mit Hämatoxylin und Eosin (wie beschrieben von Humason, 1979, Animal Tissue Technicues, 4'h Ed. W.H. feeman & Co., San Fransisco, CA, Kapitel 9. S. 111-131) gefärbt.
Die Wirkung von BPI-Funktionsdomänen-Peptiden der Erfindung wird nachgewiesen durch mikroskopische Untersuchungen von gefrorenen gefärbten Schnitten auf Inhibierung von Angiogenese relativ zu Matrigel®-Gelscheiben, die ohne hinzugefügte BPI-Peptide hergestellt wurden. Der Umfang an Angiogeneseinhibierung wird quantifiziert unter Verwendung der normalisierten Mengen an Hämoglobin, das in BPI-Peptid-enthaltenden Gelscheiben gefunden wird.

Beispiel 22

Analyse von BPI-Funktionsdomänenpeptiden bei chronischer entzündlicher Erkrankung: Modelle für Collagen-induxierte oder reaktive Arthritis

BPI-Funktionsdomänen-Peptide werden für ihre Wirkungen in einem Collagen-induzierten Arthritismodell Verabreicht. Speziell wird Arthritis in Mäusen durch intradermale Immunisierung mit Rindercollagen vom Typ II an der Basis des Schwanzes induziert gemäß dem Verfahren von Stuart et al. (1982, J. Clin. Invest. 69: 673-683). Im allgemeinen beginnen die Mäuse arthritische Symptome am Tag 21 nach Collagenimmunisierung zu entwickeln. Die arthritischen Punktezahlen der behandelten Mäuse werden dann über eine Periode von 120 Tagen für Mäuse blind bestimmt, die an einem jeden der Tage 21 bis 25 mit Dosen von entweder BPI-Funktionsdomänen-Peptiden, Kontroll-rBPI&sub2;&sub3; oder rBPI, oder Puffer behandelt wurden, die intravenös über die Schwanzvene injiziert-werden.
Genauer gesagt wird Rindercollagen vom Typ II (Southem Biotechnology Associates, Inc., Birmingham AL) über intradermale Injektion (0,1 mg/Maus) an der Basis des Schwanzes am Tag 0 Gruppen von männlichen Mäusen (Mäuse/DBA/1J) verabreicht, von denen jede etwa 20 bis 25 g wiegt. BPI-Funktionsdomänen-Peptide und rBPI&sub2;&sub3;, und rBPI werden in einem Puffer gelöst, der aus 0,5 M NaCl, 20 mM Natriumacetat (pH 6,0) zusammengesetzt ist und mit PBS-Puffer zur Verabreichung bei verschiedenen Konzentrationen verdünnt wird. PBS- Puffer alleine (0,1 mL) wird als Kontrolle verabreicht.
Das Modell für Collagen-induzierte Arthritis wird auch verwendet, um die Leistung von BPI- Funktionsdomänen-Peptiden verglichen mit Protaminsulfat zu bewerten. Speziell werden BPI-Peptide in PBS verdünnt, wie oben beschrieben und in verschiedenen Konzentrationen verabreicht. Die anderen Testmaterialien werden mit folgenden Dosierungen verabreicht: Protaminsulfat (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) (0,13 mg/Maus), Thaumatin (0,12 mg/Maus) und PBS-Puffer (0,1 mL). Gruppen von Mäusen erhalten Test- oder Kontrollmaterialien durch intravenöse Injektion über die Schwanzvene an einem jeden der Tage 28 bis 32 nach Injektion mit Collagen.
BPI-Funktionsdomänen-Peptide werden auch verabreicht, um reaktive Arthritis in einem Modell für Yersinia enterocolitiea- reaktive Arthritis zu behandeln gemäß dem Verfahren von Yang et al. (1988, Microbial Pathogenesis 4: 305-310). Es werden genauer gesagt BPI-Peptide an die DBA/2J-Mäuse verabreicht, denen man kürzlich intravenös Yersinia enterocolitica cWA 0 : 8 T2 (d. h. denen das Virulenzplasmid nach Yong et al., supra), fehlt, bei einer Dosierung von 4 · 10&sup8; Bakterien verabreicht hatte, von der man ausgerechnet hatte, daß sie Mäusen eine, nicht-septische Arthritis induziert. Gruppen von Mäusen erhielten jeweils Test- oder Kontrollmaterialien durch intravenöse Injektionen über die Schwanzvene.
Borrelia burgdorferi ist das für Lyme Disease verantwortliche Pathogen und damit einhergehende Arthritis und er besitzt einen LPS-ähnlichen Komplet auf seinen Zellwänden, der verschieden von, aber strukturell verwandt ist zu demjenigen von E. coli. Die Wirkung der Verabreichung von BPI-Funktionsdomänen-Peptiden auf Inhibierung von B. burgdorferi-LPS in einem Limulus-Amoebocytenlysat (LAL)-Inhibitionstest wird bestimmt. Speziell wird ein LAL-Test gemäß dem Verfahren von Beispiel 4 durchgeführt und die Wirkung von DPI- Peptiden auf B. burgdorferi-LPS bestimmt, das mit 2,5 ug/mL verabreicht wurde, und auf E. coli 0113-LPS, das mit 2 ng/mL verabreicht wurde.

Beispiel 23

Analyse von BPI-Funktionsdomänen-Peptiden in einem Mausmodell für maligne Melanomzellmetastase

BPI-Funktionsdomänen-Peptide, Protamin oder Pufferkontrollen werden verabreicht, um ihre Wirksamkeit in einem Mausmodell für maligne Melanommetastase zu testen. Speziell werden Gruppen von C57BL/6J-Mäusen mit 10&sup5; malignen B16.F10-Melanom-Zellen über intravenöse Injektion in die Schwanzvene am Tag 0 geimpft. BPI-Funktionsdomänen-Peptide werden in verschiedenen Konzentrationen in die Schwanzvene von Testmäusen an den Tagen 1, 3, 6, 8, 10, 13, 15, 17 und 19 verabreicht. Protamin-Sulfat (0,13 mg/Maus) als eine Positiv- Kontrolle, oder PBS-Puffer (0,1 ml/Maus) als eine Negativ-Kontrolle werden in ähnlicher Weise zusätzlichen Gruppen von Kontrollmäusen verabreicht. Die Tiere wurden durch cervikale Dislokation am Tag 20 getötet zur Beobachtung von Lungengeweben. Die Loben von jeder Lunge werden perfundiert und durch Injektion von 3 ml Wasser in die Lunge über die Trachea inflatiert. Oberflächliche Tumorknoten werden dann mit Hilfe eines Sektionsmikroskopes gezählt und die Anzahl von pro Gruppe gefundenen Tumoren auf statistisch signifikante Unterschiede analysiert.

Beispiel 24

Analyse von BPI-Funktionsdomänen-Pentiden in einem Maus Cerebralkapillarendothelzellen-Proliferations-Test

BPI-Funktionsdomänen-Peptide werden auf ihre Wirkungen in Ganz-Endothelzellen- Proliferations-Test getestet. Für diese Experimente werden murine Cerebralkapillarendothelzellen (EC), wie beschrieben in Bauer (1989, Microvascular Research 37: 148-161), in Medium 199 passagiert, das Earle's Salze, L-Glutamin und 20 g/l Natriumbicarbonat (GIBCO, Grand Island, NY) plus 10% hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (FCS; Irvine Scientific, Irvine, CA) und 1% Penicillin/Streptomycin (GIBCO) enthielt. Ernten der konfluenten Zellen wird vorgenommen durch Trypsinierung mit Trypsin-EDTA (GIBCO) Mir 3 Minuten. Die Trypsinierung wird durch Hinzufügen von 10 ml des Passage-Mediums zum Kolben gestoppt. Proliferations-Tests werden an frisch geernteten EC in Standard-Mikrotiter- Platten mit 96 Näpfen und flachem Boden durchgeführt. Ein Endvolumen von 200 ul/Napf wird für jeden Napf des Tests beibehalten. Insgesamt werden 4 · 10&sup4; EC-Zellen zu einem jeden Napf mit verschiedenen Konzentrationen an BPI-Peptiden oder Pufferkontrolle hinzugefügt. Nach 48-stündiger Kultur in einem 5% CO&sub2;-Inkubator wird 1 uCi von [³H]Thymidin in 10 ul Medium 199 zu jedem Napf zugegeben. Nach einem 24-stündigen Puls werden die EC-Zellen durch Trypsinierung auf Glasmikrofaserfilter geerntet und eingebautes [³H]-Thymidin wird mit einem Gas proportionalen Festphasen-Betazähler quantifiziert.
Direkte Bindungsstudien von BPI-Peptiden an EC-Zellen werden durchgeführt durch Ernten der 10-fach passagierten Zellen von einem konfluenten Kolben und Resuspendieren der trypsinierten Zellen in 12,5 ml Kulturmedium. Dann werden 0,5 ml der Zellsuspension zu jedem Napfeiner Standardgewebekulturplatte mit 24 Näpfen hinzugesetzt und über Nacht inkubiert. Die Platte wird mit 0,1% Rinderserumalbumin in Phosphat-gepufferter Saline gewaschen, die Calcium und Magnesium enthält (GIBCO). Nach Waschen werden 0,5 ml BSA/PBS pro Napf zugesetzt. Konzentrationsabhängige Inhibierung von EC-Zellproliferation wird gemessen, ausgedrückt als Abnahmen desr[³H]-Thymidin-Aufnahme.

Beispiel 25

Analyse von BPI-Funktionsdomänen-Peptiden in Tiermodellen

A. Analyse in einem Maus-Endotoxinämie-Modell

BPI-Funktionsdomänen-Peptide werden auf ihre Wirksamkeit in einem experimentellen Endotoxinämie-Mausmodell getestet. Man verabreicht Gruppen von wenigstens 15 Mäusen eine intravenöse Injektion von Endotoxin (z. B. E. coli 0111 : B4, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) bei einer LD&sub9;&sub0;-Dosierung (z. B. 40 mg/kg). Dem folgt eine zweite intravenöse Injektion des Testpeptids in verschiedenen Konzentrationen von etwa 0,1 mg/kg bis etwa 100 mg/kg, bevorzugterweise im Bereich von etwa 1 bis 50 mg/kg. Injektionen von Puffer ohne hinzugefügtes Peptid werden verwendet in Negativkontrollmäusen. Die Tiere werden für 7 Tage beobachtet und die Mortalität aufgezeichnet. Die Wirksamkeit der Peptide dieser Erfindung wird durch verglichen mit Kontroll-Mäusen eine Abnahme der Endotoxinämieverbundenen Mortalität bei Peptid-injizierten Mäusen gemessen verglichen mit KontrollMäusen.

B. Analyse in einem Maus-Peritonitis-Modell

BPI-Funktionsdomänen-Peptide werden auf Ihre Wirksamkeit in einem Mausmodell für akute Pentonitis getestet. Gruppen von wenigstens 15 Mäusen werden gereizt mit 10&sup7; lebenden E. coli Bakterien von Stamm 07 : K1 in 0,5 ml und dann mit 1,0 ml einer Lösung von BPI- Funktionsdomänen-Peptiden mit verschiedenen Konzentrationen von etwa 0,1 mg/kg bis 100 mg/kg behandelt. Injektionen von Puffer ohne hinzugefügtes Peptid werden bei Negativkontrollmäusen verwendet. Die Tiere werden für 7 Tage beobachtet und die Mortalität aufgezeichnet. Wirksame BPI-Funktionsdomänen-Peptide zeigen eine Abnahme der Mortalität der Testgruppen-Mäuse verglichen mit Kontrollgruppen-Mäusen.

C. Analyse in einem Maus-Candida-Albicans-Model

Ein Maus-Modell für systemische Candidiasis wurde verwendet, um die in-vivo-Effektivität von verschiedenen Therapien bei der Behandlung von Infektionen durch Candida albicans zu testen. Für TNF-α würde gezeigt, daß er eine protektive Rolle in diesem Maus-Modell aufweist (Louie, A., et. al., 1994, Infection and Immunity, 62(7): 2761-2772) und davor konnte für den löslichen rekombinanten IL-4-Rezeptor gezeigt werden, daß er die Infektion heilt (Puccetti, P., et al., 1993, J. Infec Diseases, 169: 1325-1331). Bestimmte Mäuse wurden identifiziert, die eine genetische Empfindlichkeit gegenüber C. albicans und der daraus resultierenden Candidiasis aufweisen und sind daher zur Verwendung als ein Modellsystem geeignet, um die Effizienz von Behandlungen zu testen, die solche Infektionen bekämpfen werden (Romani, L., et al., 1993, J Immunol. 150: 925-931).
Peptide der Erfindung werden auf Ihre Effizienz gegen systemische C. albicans-Infektionen in diesem Maus-Modell im wesentlichen gemäß der in Louie et al., supra.; Puccetti et al., supra. beschriebenen Verfahren getestet. Geeignete Mäuse können im wesentlichen wie durch Hector et al. (1982, Infection and Immunity, 38(3): 1020-1028) beschrieben entwickelt und identifiziert werden.
Gruppen von mindestens 15 Mäusen werden mit verschiedenen Dosen von ungefähr 10³ bis 10&sup8;, bevorzugterweise 10&sup6; bis 10&sup8; lebendigen C. albicans (Stamm CA-6, B311, 88-689-6, der Cändida-Stamm, der in Beispiel 18 verwendet wurde, oder ein anderer geeignet isolierter Stamm) in 0,5 mL konfrontiert werden und dann mit ungefähr 0,1 bis 1,0 mL einer Lösung von BPI-funktionellen Domänenpeptiden bei verschiedenen Konzentrationen von ungefähr 0,1 mg/kg bis ungefähr 100 mg/kg behandelt werden. Injektionen von Puffer ohne hinzugefügtes Peptid werden in negativen Kontrollmäusen verwendet. Der Test kann durch quantitative Kulturen von Organen von Mäusen (Louie et al., supra.) oder durch Bestimmung von Überlebenszeiten durchgeführt werden. Effektive Peptide der Erfindung sind bei der Modifikation der Effekte der durch C. albicans verursachten Erkrankungen aktiv.

Beispiel 26

Therapeutische Verwendung von BPI-Funktionsdomänen-Peptiden in einem menschlichen in vivo Endotoxin-Neutralisations-Modell

Eine kontrollierte, doppelblind-Überkreuzstudie ist konzipiert und wird, wie in der ebenfalls eigenen, zum Beispiel ebenfalls anhängigen US-Patentanmeldung Nr. 08/188,221, angemeldet am 24. Januar 1994, durchgeführt, um die Wirkungen von BPI-Funktionsdomänen-Peptiden beim Menschen zu untersuchen, die durch intravenöse Infusion von bakteriellem Endotoxin endotoxinämisch gemacht wurden.

Beispiel 27

Bakterizide Aktivität von BPI-Peptiden gegen Antibiotika-resistente Bakterien

Diese Untersuchungen wurden im wesentlichen unter Befolgung der in Beispiel 2 verwendeten Verfahren durchgeführt.

A. Polymyxin B-resistente Stämme von Salmonella typhimurium

Um jegliche Interaktion zwischen dem Mechanismus für Polymyxin B-Resistenz und Resistenz gegenüber der antibakteriellen Aktivität von Peptiden der vorliegenden Erfindung zu untersuchen, würde ein Polymyxin B-resistenter Stamm von Salmonella typhimurium durch Plazieren von 10&sup8; Wildtyp Salmonella typhimurium (SL3770, Genetic Stock Center, Calgary, Canada) auf eine Polymyxin-Gradientenplatte (siehe z. B. Roland et al., 1993; J. Bacteriology, 175: 4154.4164) isoliert. Eine Übernachtkultur des isolierten Polymyxin B-resistenten Salmonella typhimurium, der als LR-1 bezeichnet wurde, und dem Wildtypstamm wurden 1 : 50 in frischem tryptischem Sojamedium verdünnt und für 3 Stunden bei 37ºC inkubiert, um Logphase zu erreichen. Die Kultur von S. typhimurium LR-1 wurde mit 2,5 ug/mL Polymyxin B-Sulfat supplementiert. Die Bakterien wurden in frischem Puffer resuspendiert und die Konzentrationen durch Absorptionen bei 570 nm bestimmt. Die Bakterien wurden zu geschmolzener Agarose hinzugegeben, um eine finale Konzentration von 1 · 10&sup6;/mL zu erreichen. rBPI&sub2;&sub1; wurde seriell zweifach in D-PBS verdünnt, ausgehend von 2 mg/mL. Polymyxin B wurde auf dieselbe Weise verdünnt, ausgehend von 20 mg/mL. Die Testpeptide wurden zweifach in D-PBS seriell verdünnt, ausgehend von ungefähr 1 mg/mL. Wie beschrieben in Beispiel 2, wurden ungefähr 5 uL pro Napf hinzugefügt.
Fig. 29a und 29b zeigen die antibakterielle Aktivität von rBPI&sub2;&sub1; (geschlossene Kreise); Polymyxin B (offene Kreise); BPI.30 (geschlossene Dreiecke); BPI.48 (offene Dreiecke); BPI.69 (geschlossenen Quadrate); BPI.105 (offene Quadrate); gegen jeweils S. typhimurium und gegen einen Polymyxin B-resistenten Stamm von S. typhimurium, der als LR-1 bezeichnet wurde.

B. Antibiotika-resistenter Stamm von E.coli

Um die antibakterielle Aktivität von BPI-Peptiden gegen multi-Antibiotika-resistente E.coli zu testen, wurde ein multiresistenter Stamm E.coli 19536 (ampR 16 ug/mL; CeftazidimR > 16 ug/mL; CeftriazonR > 16 ug/mL) untersucht. Dieser Stamm ist ein klinisches Isolat, das von der Baxter Microscan® library (Sacramento, CA) erhalten wurde. Eine Übernachtkultur von E. coli 19536 wurde wie in Beispiel 2 und Teil A oben beschrieben getestet. Test BPI- Peptide wurden zweifach in D-PBS seriell verdünnt, angefangen bei ungefähr 1 mg/mL. BPI.48, BPI.63, BPI.69 und BPI.88 sind repräsentative Verbindungen mit Aktivität gegen mulit-Antibiotika-resistente E.coli.
Fig. 29c und 29d zeigen die antibakterielle Aktivität von rBPI.&sub2;&sub1; (geschlossenen Quadrate); Ceftriaxon (offene Quadrate); BPI.48 (geschlossene Kreise); BPI.63 (offene Kreise); BPI.69 (geschlossene Dreiecke) und BPI.88 (offene Dreiecke), gegen einen Antibiotika-resistenten Stamm von jeweils E.coli (19536) und E.coli 0111 : B4.

C. Antibakterielle Aktivität von BPI-Peptiden auf Pneumonie Antibiotika-resistenter Stamm von Klebstella pneumoniae

Um die antibakterielle Aktivität von BPI-Peptiden auf antibiotika-resistente Stämme von Klebstella pneumoniae zu testen, wurde der multi-resistente isolierte klinische Stamm 19645 wie in Beispiel 2 und oben getestet. (K pneumoniae 19654 weist eine MHK (ug/mL) von: am> 16; ti> 16; azt> 16; po> 64; ak> 16; crm> 16; caz> 16; cax> 16; cft> 32; a/s> 16; grn> 6; to> 6; cfz> 16 auf). Dieser Stamm wurde von der Baxter Microscan® library (Sacramento, CA) erhalten. Eine Übernachtkultur von Klebstella pneumoniae 19645 und einem nicht-resistenten Stamm (ATTC 29011) wurden 1 : 50 in frischem tryptischem Sojamedium verdünnt und für 3 Stunden bei 37ºC inkubiert, um Logphase zu erreichen. Die Übernachtkulturen wurden wie in Beispiel 2 und Teil A oben beschrieben getestet. BPI.7, BPI.48, BPI.63, BPI.69; BPI.103, BPI.105 und. BPI.119 sind repräsentativ für Verbindungen, die aktiv gegen antibiotikaresistente Klebstella sind.
Fig. 29e und 29f zeigen die antibakterielle Aktivität von repräsentativen Peptiden gegen einen antibiotika-resistenten Stamm von K. pneumoniae (19645). In Fig. 29e sind die Ergebnisse mit BPI.7 (offene Kreise); BPI.48 (geschlossene Kreise); BPI.63 (offene Dreiecke); BPI.69 (geschlossene Dreiecke); rBPI&sub2;&sub1; (offene Quadrate); Ceftazidim (geschlossene Quadrate) und Ceftriaxon (kleine Dreiecke) gezeigt. In Fig. 29f sind die Ergebnisse von BPI.88 (offene Kreise); BPI.103 (geschlossene Kreise); BPI.105 (offene Dreiecke); BPI.119 (geschlossene Dreiecke); rBPI&sub2;&sub1; (offene Quadrate); Ceftazidim (geschlossene Quadrate) und Ceftriaxon (kleine Kreise) gezeigt.
Fig. 29g und 29h zeigen die antibakterielle Aktivität von repräsentativen Peptiden gegen K. pneumoniae (ATTC 29011). In Fig. 29g sind die Ergebnisse mit. BPI.7 (offene Kreise); BPI.48 (geschlossene Kreise); BPI.63 (offene Quadrate); BPI.69 (geschlossene Quadrate); rBPI&sub2;&sub1; (offene Dreiecke); Ceftazidim (geschlossene Dreiecke) und Ceftriaxon (kleine Kreise) gezeigt. In Fig. 29h sind die Ergebnisse mit BPI.88 (offene Kreise); BPI.103 (geschlossene Kreise); BPI.105 (offene Quadrate); BPI.119 (geschlossene Quadrate); rBPI&sub2;&sub1; (offene Dreiecke); Ceftazidim (geschlossene Dreiecke) und Ceftriaxon (kleine Kreise) gezeigt.
Es sollte verstanden werden, daß die vorerwähnte Offenbarung bestimmte spezifische Ausführungsformen der Erfindung betont.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: Xoma Corporation
(B) STRAßE: 2910 Seventh Street
(C) STADT: Berkeley
(D) STAAT: Kalifornien
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL (PLZ): 94710
(G) TELEFON: (510)-644-1170
(H) TELEFAX: (510)-469-7571
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Biologisch aktive Peptide von Funktionsdomänen von bakterizidem/Permeabilität erhöhendem Protein und Verwendungen davon
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 226
(iv) KORRESPONDENZANSCHRIFT:
(A) EMPFÄNGER: Allegretti & Witcoff, Ltd.
(B) STRAßE: 10 South Wacker Drive, Suite 3000
(C) STADT: Chicago
(D) STAAT: Illinois
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 60606
(v) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy Diskette
(B) COMPUTER: IBM-PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release 1.0, Version 1.25
(vi) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER: US
(B) ANMELDETAG: 11. März 1994
(C) KLASSIFIKATION:
(viii) ANGABEN ZUM ANWALT/VERTRETER:
(A) NAME: Noonan, Kevin E.
(B) REGISTRIERNUMMER: 35,303
(C) REFERENZ/AKTENZEICHEN: 93,1133
(ix) ANGABEN ZUR TELEKOMMUNIKATION:
(A) TELEFON: 312-715-1000
(B) TELEFAX: 312-715-1234
(C) TELEX: 910-221-5317
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 29 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "Domäne I" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 1:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 30 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.14" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 2:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 22 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.4" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 3:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.I" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 4:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.54" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 5:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 35 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "Domäne 11" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 6:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.2" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 7:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.8" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 8:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 16 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.58 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 9:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 17 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.65 oxidiert" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 10:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 27 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.3" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 11:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 28 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "Domäne III" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 12:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 13 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.11" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 13:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 29 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.12" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 14:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 15:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.13" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 15:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.15" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 16:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 17:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.16" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 17:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 18:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.17" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 18:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 19:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.18" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 19:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 20:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.19" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 20:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 21:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.20" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 21:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 22:
(i) SEQIJENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.21" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 22:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 23:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.22" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 23:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 24:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.23" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 24:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 25:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.24" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 25:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 26:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.25" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 26:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 27:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.26" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 27:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 28:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.27" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 28:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 29:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.28" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 29:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 30:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.59" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 30:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 31:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.45" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 31:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 32:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.60" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 32:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 33:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.31" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 33:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 34:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.32" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 34:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 35:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.33" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 35:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 36:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.34" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 36:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 37:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.35" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 37:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 38:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.36" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 38:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 39:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLES: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.37" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 39:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 40:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.38" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 40:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 41:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.39" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 41:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 42:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.40" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 42:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 43:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.41" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 43:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 44:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.42" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 42:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 45:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.43" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 45:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 46:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.44" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 46:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 47:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.56" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 47:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 48:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.61" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 48:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 49:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.66"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) POSITION: 5..7
(D) WEITERE ANGABEN: /Markierung D-Trp /Beachte = "Die Aminosäure auf Position 7 ist D-Tryptophan (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 49:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 50:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.67"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) POSITION: 6..8
(D) WEITERE ANGABEN: /Markierung = Substituiertes Ala /Beachte = "Das Alanin auf Position 7 ist beta-1-Naphthyl-substituiert" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 50:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 51
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.9" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 51:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 52:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 24 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.30" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 52:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 53:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 29 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.63" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 53:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 54:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.7" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 54:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 55:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 25 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.10.1" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No; 55:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 56:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 28 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.29" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 56:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 57:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.46" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 57:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 58:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.47" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 58:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 59:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.48" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 59:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 60:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 30 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.69" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 60:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 61:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 21 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.55" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 61:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 62:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.73" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 62:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 63:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.71"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) Position: 8..10
(C) WEITERE ANGABEN: /Markierung = substituiertes Ala /Beachte: "Das Alanin an Position 7 ist beta-3-Pyridyl-substituiert
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 63:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 64:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.71"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) POSITION: 13..15
(D) WEITERE ANGABEN: /Markierung = substituiertes Ala /Beachte = "Das Alanin an Position 13 ist beta-3-Pyridyl-substituiert" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 66
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 65:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 26 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.10.2" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 65:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 66:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 17 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.72"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) POSITION: 1..3
(D) WEITERE ANGABEN: /Markierung = D-Alanin /Beachte = "Die Position 1- und die Position 2-Alanin-Reste sind beide D-Alanin (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 64:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 67:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 22 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.5" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 67:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 68:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 17 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.65 reduziert"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Disulifid-Bindung
(D) POSITION: 1..17 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 68:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 69:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 487 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "rBPI" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 69:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 70:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 24 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.74" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 70:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 71:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.76"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) POSITION: 10..12
(D) WEiTERE ANGABEN: /Markierung = D-Phe /Beachte = "Die Aminosäure an Position 11 ist D-Phenylalanin" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 71:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 72:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.77" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 72:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 73:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.79" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 73:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 74:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.80"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) POSITION: 10..12
(D) WEITERE ANGABEN: /Markierung = Subtituiertes Ala /Beachte = "Das Alanin an Position 11 ist beta-1-Naphtyl-substituiert (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 74:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 75:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.81" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 75:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 76:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.82" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 76:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 77:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.83"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) Position 10..12
(D) Weitere ANGABEN: /Markierung = substituiertes Ala /Beachte = "Das Alanin an Position 6 ist beta-1-Naphtyl-substituiert (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 77:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 78:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.84
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) POSITION: 6..8
(D) WEITERE ANGABEN: /Markierung = Substituiertes Ala /Beachte = "Das Alanin an Position 7 ist beta-1-Naphtyl-substituiert (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 78:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 79:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.85" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 79:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 80:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.86" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 80:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 81:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.87" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 81:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 82:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.88" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 82:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 83:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 24 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.98"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) POSITION 6..8
(D) WEITERE ANGABEN: /Markierung = Substituiertes Ala /Beachte = "Das Alanin an Position 7 ist beta-1-Naphtyl-substituiert (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 83:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 84:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.89"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) POSITION: 6..8
(D) WEITERE ANGABEN: /Markierung = Substituiertes Ala /Beachte = "Das Alanin an Position 7 ist beta-1-Naphtyl-substituiert (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 84:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 85:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.90"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) POSITION: 6..8
(D) WEITERE ANGABEN: /Markierung = Substituiertes Ala /Beachte = "Das Alanin an Position 7 ist beta-1-Naphthyl-substituiert" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 85:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 86:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.91" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 86:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 87:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.92" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 87:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 88:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 29 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.93"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) POSITION: 6.. 8
(D) WEITERE ANGABEN: / Markierung = Substituiertes Ala /Beachte = "Das Alanin an Position 7 ist beta-1-Naphtyl-substituiert (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 88:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 89:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.94" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 89:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 90:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.95" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 90:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 91:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.96" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 91:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 92:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.97" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 92:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 93:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 30 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.99" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 93:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 94:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.100" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 94:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 95:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 28 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.101" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 95:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 96:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 24 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Spezielles Merkmal
(D) WEITERE ANGABEN: "BPI.102" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No: 96:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 97:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1443 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1..1443
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: mat_peptide
(B) LAGE: 76..1443
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "rLBP" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 97:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 98:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 481 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "rLBP" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 98:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 99:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 16 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäuren
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.57" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 99:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 100:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäuren
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.75" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 100:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 101:
(1) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.282" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 101:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 102:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 16 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.103" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 102:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 103:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.104" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 103:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 104:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 16 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN. "BPI.105"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 13
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label = Substituiertes Ala /Anmerkung = "Das Alanin an Position 13 ist beta-1-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 104:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 105:
(1) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.106" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 105:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 106:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.107" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 106:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 107:
(1) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.108" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 107:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 108:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.109"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 11
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label = Substituiertes Ala /Anmerkung = "Das Alanin an Position 11 ist beta-1-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 108:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 109:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.110"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 12
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label = Substituiertes Ala /Anmerkung = "Das Alanin an Position 12 ist beta-1-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 109:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 110:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPT.111"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 14
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label = Substituiertes Ala /Anmerkung = "Das Alanin an Position 14 ist beta-1-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 110:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 111:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.112"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 7
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label = Substituiertes Ala /Anmerkung = "Das Alanin an Position 7 ist beta-1-Naphthyl-substituiert."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 11
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label = Substituiertes Ala /Anmerkung = "Das Alanin an Position 11 ist beta-1-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 111:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 112:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.113" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 112:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 113:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.114" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 113:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 114:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.116"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 6
(C) SONSTIGE ANGABEN; /label = Substituiertes Ala /Anmerkung = "Das Alanin an Position 6 ist beta-1-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 114:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 115:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.119"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 7
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label = Substituiertes Ala /Anmerkung = "Das Alanin an Position 7 ist beta-1-Naphthyl-substituiert."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 10
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label = Substituiertes Ala /Anmerkung = "Das Alanin an Position 10 ist beta-1-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 115:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 116:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.120" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 116:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 117:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.121"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 10
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label = Substituiertes Ala /Anmerkung = "Das Alanin an Position 10 ist beta-1-Naphthyl-substituiert."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 11
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label = Substituiertes Ala /Anmerkung = "Das Alanin an Position 11 ist beta-1-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 117:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 118:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.122"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 7
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label = Substituiertes Ala /Anmerkung = "Das Alanin an Position 7 ist beta-1-Naphthyl-substituiert."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 10
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label = Substituiertes Ala /Anmerkung = "Das Alanin an Position 10 ist beta-1-Naphthyl-substituiert."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 11
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label = Substituiertes Ala /Anmerkung = "Das Alanin an Position 11 ist beta-1-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 118:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 119:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.123"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 9
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label = Substituiertes Phe /Anmerkung = "Das Phenylalanin an Position 9 ist p-Amino-substituiert". (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 119:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 120:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.124" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 120:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 121:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.125" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 121:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 122:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL; misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.126"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 6
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label = D-Trp /Anmerkung = " Die Aminosäure an Position 6 ist D-Tryptophan." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 122:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 123:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.127" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 123:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 124:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.128"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 6
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label = D-Phe /Anmerkung = "Die Aminosäure an Position 6 ist D-Phenylalanin." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 124:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 125:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.129"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 6
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label = Substituiertes Ala /Anmerkung = "Das Alanin an Position 6 ist D-1-beta-1-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 125:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 126:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.130"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 6
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label = Substituiertes Ala /Anmerkung = "Das Alanin an Position 6 ist 2-beta-1-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZSESCHREIBUNG; SEQ ID NO: 126:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 127:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.131"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 6
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label = Substituiertes Ala /Anmerkung = "Das Alanin an Position 6 ist D-2-beta-1-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 127:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 128:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid.
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.132"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 6
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label = Substituiertes Ala /Anmerkung = "Das Alanin an Position 6 ist Pyridyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 128:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 129:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.133"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 6
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label = Substituiertes Phe /Anmerkung = "Das Phenylalanin an Position 6 ist para-Amino-substituiert. (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 129:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 130:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.134"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 5
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label = Substituiertes Phe /Anmerkung = "Das Phenylalanin an Position 5 ist para-Amino-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 130:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 131:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.135" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 131:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 132:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 132:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 133:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 16 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.137" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 133:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 134:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.138" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 134:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 135:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.139" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 135:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 136:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.140"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 1
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label = Substituiertes Ala /Anmerkung = "Das Alanin an Position 1 ist beta-1-Naphthyl-substituiert."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 2
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label = Substituiertes Ala /Anmerkung = "Das Alanin an Position 2 ist beta-1-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 136:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 137:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.141" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 137:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 138:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.142" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 138:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 139:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.143"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 10
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label = Substituiertes Ala /Anmerkung = "Das Alanin an Position 10 ist beta-1-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 139:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 140:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.144"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 6
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label = Substituiertes Ala /Anmerkung = "Das Alanin an Position 6 ist Cyclohexan-substituiert (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 140:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 141:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 24 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.145" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 141:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 142:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.146"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 12
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label = Substituiertes Ala /Anmerkung = " Das Alanin an Position 12 ist beta-1-Naphthyl-substituiert."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 14
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label = Substituiertes Ala /Anmerkung = "Das Alanin an Position 14 ist beta-1-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG; SEQ ID NO: 142:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 143:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: mise feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.147" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 143:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 144:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.148"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 6
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label = Substituiertes Ala /Anmerkung = "Das Alanin an Position 6 ist beta-1-Naphthyl-substituiert."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 12
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label = Substituiertes Ala /Anmerkung "Das Alanin an Position 12 ist beta-1-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 144:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 145:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 1813 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 31..1491
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: mat_peptida
(B) LAGE: 124..1491
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "rBPI" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 145:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 146:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANGE: 487 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 146:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 147:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 24 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.149" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 147:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 148:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LANGE: 20 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.150" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 148:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 149:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 30 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.153" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 149:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 150:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.154"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 5
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 5 ist beta-1-Naphthyl-substituiert."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 6
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 6 ist beta-1-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 150:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 151:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.155"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 15
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 15 ist beta-1-Naphthyl-substituiert."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 16
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 16 ist beta-1-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 151:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 152:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.156"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 5
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 5 ist beta-1-Naphthyl-substituiert."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE 6
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 6 ist beta-1-Naphthyl-substituiert."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 15
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 15 ist beta-1-Naphthyl-substituiert."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 16
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 16 ist beta-1-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 152:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 153:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE 30 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid.
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.157"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 5
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 5 ist beta-1-Naphthyl-substituiert."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 6
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 6 ist beta-1-Naphthyl-substituiert."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 15
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 15 ist beta-1-Naphthyl-substituiert."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 16
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 16 ist beta-1-Naphthyl-substituiert."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 25
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = " Position 25 ist beta-1-Naphthyl-substituiert."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 26
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = " Position 26 ist beta-1-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 153:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 154:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 29 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.158"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 10
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 10 ist beta-1-Naphthyl-substituiert."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 1
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 11 ist beta-1-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 154:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 155:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 24 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.159"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 2
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 2 ist beta-1-Naphthyl-substituiert."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 6
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 6 ist beta-1-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 155:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 156:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.160"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 2
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 2 ist beta-1-Naphthyl-substituiert."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 6
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 6 ist beta-1-Naphthyl-substituiert."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 12
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 12 ist beta-1-Naphthyl-substituiert."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 16
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 16 ist beta-1-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 156:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 157:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.161" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 157:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 158:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 24 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.162" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 158:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 159:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.163" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 159:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 160:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.164"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 5
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 5 ist beta-1-Naphthyl-substituiert."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 15
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 15 ist beta-1-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 160:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 161:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL;
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.165"
(ix) MERKMAL;
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 2
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 2 ist beta-1-Naphthyl-substituiert."
(ix) MERKMAL;
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 12
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 12 ist beta-1-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 161:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 162:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.166" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 162:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 163:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL;
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.167" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 163:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 164:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: zirkulär
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.168" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 164:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 165:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: zirkulär
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.169" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 165:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 166:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN;
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.221"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 13
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 13 ist beta-1-Naphthyl-substituiert. (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 166:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 167:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.222"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 6
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 6 ist beta-1-Naphthyl-substituiert."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 14
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 14 ist beta-1-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 167:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 168:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.223"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 6
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 6 ist beta-1-Naphthyl-substituiert."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 10
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 10 ist beta-1-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 168:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 169:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.224"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 6
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 6 ist beta-1-Naphthyl-substituiert.
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 9
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Phe /Anmerkung = "Position 9 ist para-Amino-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 169:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 170:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.225"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 6
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 6 ist beta-1-Naphthyl-substituiert."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 5
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Phe /Anmerkung = "Position 5 ist para-Amino-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 170:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 171:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.226"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 6
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 6 ist beta-1-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 171:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 172:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.227"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 10
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 10 ist beta-1-Naphthyl-substituiert."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 14
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 14 ist beta-1-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 172:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 173:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.228"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 9
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Phe /Anmerkung = "Position 9 ist para-Amino-substituiert.
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 14
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 14 ist beta-1-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 173:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 174:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.229"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 5
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 5 ist beta-1-Naphthyl-substituiert."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 14
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 14 ist beta-1-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 174:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 175:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.230"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 14
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 14 ist beta-1-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 175:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 176:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.231"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 10
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 10 ist beta-1-Naphthyl-substituiert."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 12
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 12 ist beta-1-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 176:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 177:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.232"
(ix) MERKMAL;
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 9
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Phe /Anmerkung = "Position 9 ist para-Amino-substituiert."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 12
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 12 ist beta-1-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 177:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 178:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.233"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 5
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Phe /Anmerkung = "Position 5 ist para-Amino-substituiert. "
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 12
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 12 ist beta-I-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 178:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 179:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.234"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 12
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 12 ist beta-1-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 179:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 180:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.235"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 9
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Phe /Anmerkung = "Position 9 ist para-Amino-substituiert."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 10
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 10 ist beta-1-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 180:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 181:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.236"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 5
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Phe /Anmerkung = "Position 5 ist para-Amino-substituiert."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 10
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 10 ist beta-1-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 181:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 182:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.237"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 10
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 10 ist beta-1-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 182:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 183:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.238"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 5
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Phe /Anmerkung = "Position 5 ist para-Amino-substituiert."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 9
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Phe /Anmerkung = "Position 9 ist para-Amino-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 183:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 184:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.239"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 9
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Phe /Anmerkung = "Position 9 ist para-Amino-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 184:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 185:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.240"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 5
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label; Substituiertes Phe /Anmerkung = "Position 5 ist para-Amino-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 185:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 186:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 24 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.247"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 2
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 2 ist beta-1-Naphthyl-substituiert."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 6
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 6 ist beta-1-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 186:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 187:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 24 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.245" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 187:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 188:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 24 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.246"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 16
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 16 ist D-beta-2-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 188:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 189:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 24 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.248"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 2
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 2 ist beta-1-Naphthyl-substituiert."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 6
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 6 ist beta-1-Naphthyl-substituiert."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 16
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 16 ist D-beta-2-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 189:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 190:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.242"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 6
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 6 ist D-beta-2-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 190:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 191:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 28 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.272" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 191:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 192:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 28 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.275" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 192:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 193:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 28 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.270" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 193:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 194:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 28 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.271" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 194:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 195:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 28 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.273" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 195:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 196:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 28 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.274" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 196:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 197:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 24 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.276" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 197:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 198:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN;
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.241" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 198:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 199:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.243"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 6
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 6 ist D-beta-2-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 199:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 200:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.244"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 6
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label: Substituiertes Ala /Anmerkung = "Position 6 ist D-beta-2-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 200:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 201:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.249" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 201:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 202:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.250" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 202:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 203:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.251" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 203:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 204:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.252"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 6
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label = D-Ala /Anmerkung = "Die Aminosäure an Position 6 ist D-alanin." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 204:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 205:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.253"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 6
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label = D-Val /Anmerkung = "Die Aminosäure an Position 6 ist D-Valin." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 205:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 206:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.254"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 6
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label = beta-Ala /Anmerkung = "Die Aminosäure an Position 6 ist beta-Alanin." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 206:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 207:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BFI.255"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 6
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label = delta-aba /Anmerkung = "Die Aminosäure an Position 6 ist delta-Aminobuttersäure (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 207:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 208:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL; misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.256"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 6
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label = gaba /Anmerkung = "Die Aminosäure an Position 6 ist gamma-Aminobuttersäure." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 208:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 209:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.257"
(ix) MERKMAL;
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 6
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label = d-methyl-A /Anmerkung = "Die Aminosäure an Position 6 ist delta-Methylalanin." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 209:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 210:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.258"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 6
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label = tbutyl-G /Anmerkung = "Die Aminosäure an Position 6 ist tert-Butylglycin." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 210:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 211:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.259"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 6
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label = M-methyl-G /Anmerkung = "Die Aminosäure an Position 6 ist N-Methylglycin." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 211:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 212:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.260"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 6
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label = N-methyl-V /Anmerkung = "Die Aminosäure an Position 6 ist N-Methylvalin." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 212:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 213:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.261"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 6
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label = N-methyl-L /Anmerkung = "Die Aminosäure an Position 6 ist N-Methylleucin." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 213:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 214:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.262" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 214:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 215:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.263" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 215:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 216:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.264" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 216:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 217:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.265" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 217:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 218:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.266" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 218:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 219:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.267" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 219:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 220:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.268" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 220:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 221:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.269" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 221:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 222:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 24 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.277"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 2
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label = Substituiertes Ala /Anmerkung = "Das Alanin an Position 2 ist beta-1-Naphthyl-substituiert. (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 222:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 223:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.278" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 223:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 224:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.279"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 10
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label = Substituiertes Ala /Anmerkung = "Das Alanin an Position 10 ist beta-1-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 224:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 225:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.280" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 225:
(2) Angaben zu SEQ ID NO: 226:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_feature
(D) SONSTIGE ANGABEN: "BPI.281"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte-Stelle
(B) LAGE: 10
(C) SONSTIGE ANGABEN: /label = Substituiertes Ala /Anmerkung = "Das Alanin an Position 10 ist beta-1-Naphthyl-substituiert." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 226:

Claims

1. Verbindung, die ein Peptid ist, welches ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:

ASQQGTAALQKELKRIKIPDYSDSFKIKH (SEQ ID NO: 1);

GTAALQKELKRIKIPDYSDSFKIKHLGKGH (SEQ ID NO: 2);

LQKELKRIKIPDYSDSFKIKHL (SEQ ID NO: 3);

QQGTAALQKELKRIK (SEQ ID NO: 4);

oder

GTAALQKELKRIKIP (SEQ ID NO: 5).

2. Verbindung, die ein Peptid ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:

SSQISMVPNVGLKFSISNANIKISGKWKAQKRFLK (SEQ ID NO: 6);

IKISGKWKAQKRFLK (SEQ ID NO: 7);

KWKAQKRFLK (SEQ ID NO: 8);

CIKISGKWKAQKRFLK (SEQ ID NO: 9);

CIKISGKWKAQKRFLKC (SEQ ID NO: 10);

NVGLKFSISNANIKISGKWKAQKRFLK (SEQ ID NO: 11);

AKISGKWKAQKRFLK (SEQ ID NO: 16):

IAISGKWKAQKRFLK (SEQ ID NO: 17);

IKASGKWKAQKRFLK (SEQ ID NO: 18);

IKIAGKWKAQKRFLK (SEQ ID NO: 19);

IKISAKWKAQKRFLK (SEQ ID NO: 20);

IKISGAWKAQKRFLK (SEQ ID NO: 21);

IKISGKAKAQKRFLK (SEQ ID NO: 22);

IKJSGKWAAQKRFLK (SEQ ID NO: 23);

IKISGKWKAAKRFLK (SEQ ID NO: 24);

IKISGKWKAQARFLK (SEQ ID NO: 25);

IKISGKWKAQKAFLK (SEQ ID NO: 26);

IKISGKWKAQKRALK (SEQ ID NO: 27);

IKISGKWKAQKRFAK (SEQ ID NO: 28);

IKISGKWKAQKRFLA (SEQ ID NO: 29);

IKISGAWAAQKRFLK (SEQ ID NO: 30);

IKISGKWKAAARFLK (SEQ ID NO: 31);

IAISGKWKAQKRFLA (SEQ ID NO: 32);

IKISGKWKAKQRFLK (SEQ ID NO: 47);

IKISGKFKAQKRFLK (SEQ ID NO: 48);

IKISGKWDKAQKRFLK (SEQ ID NO: 49);

IKISGKAβ-(1-naphthyl)KAQKRFLK (SEQ ID NO: 50);

KRFLKKWKAQKRFLK (SEQ ID NO: 51);

KWKAQKRFLKKWKAQKRFLK (SEQ ID NO: 54);

KRFLKKWKAQKRFLKKWKAQKRFLK (SEQ ID NO: 55);

KWKAAARFLKKWKAQKRFLK (SEQ ID NO: 57);

KWKAQKRFLKKWKAAARFLK (SEQ ID NO: 58);

KWKAAARFLKKWKAAARFLK (SEQ ID NO: 59);

KWKAAARFLKKWKAAARFLKKWKAAARFLK (SEQ ID NO: 60);

IKISGKWKAQFRFLK (SEQ ID NO: 62);

IKISGKAβ-(1-naphthyl)KAQKRFLK (SEQ ID NO: 63);

IKISGKWKAQKRAβ-(1-naphthyl)LK (SEQ ID NO: 64);

QKRFLKKWKAQKRFLKKWKAQKRFLK (SEQ ID NO: 65);

AÜADIKISGKWKAQKRFLK (SEQ ID NO: 66);

IKISGKWKAQFDRFLK (SEQ ID NO: 71);

IKISGKWKAQWRFLK (SEQ ID NO: 72);

IKISGKWKAKKRFLK (SEQ ID NO: 73);

IKISGKWKAQAβ-(1-naphthyl)RFLK (SEQ ID NO: 74);

IKISGKWKAFKRFLK. (SEQ ID NO: 75);

IKISGKAβ-(1-naphthyl)KAQFRFLK (SEQ ID NO: 78);

IKISGKWKAFFRFLK (SEQ ID NO: 82);

IKISGKAβ-(1-naphthyl)KAFKRFLK (SEQ ID NO: 84);

IKISGKAβ-(1-naphthyl)KAFFRFLK (SEQ ID NO: 85);

KWKAQWRFLKKWKAQWRFLKKWKAQWRFLK (SEQ ID NO: 93);

CIKISGKWKAQKRPLC (SEQ ID NO: 99);

IKKRAISFLGKKWQK (SEQ ID NO: 100);

IKISGKWKAWKRFLKK (SEQ ID NO: 102);

IKISGKWKAWKRAβ-(1-naphthyl)LKK (SEQ ID NO: 104);

IKISGKAβ-(1-naphthyl)KAQAβ-(1-naphthyl)RFLK (SEQ ID NO: 111);

KWQLRSKGKIKIFKA (SEQ ID NO: 113);

IKISGKAβ-(1-naphthyl)KAAβ-(1-naphthyl)KRFLK (SEQ ID NO: 115);

IKISGKWKAQKRKLK (SEQ ID NO: 116);

IKISGKWKAAβ-(1-naphthyl)Aβ-(1-naphthyl)RFLK (SEQ ID NO: 117);

IKISGKAβ-(1-naphthyl)KAAβ-(1-naphthyl)Aβ-(1-naphthyl)RFLK (SEQ ID NO: 118);

IKISGKWKAQERFLK (SEQ ID NO: 132);

IKISGKWKAQKRWLK (SEQ ID NO: 137);

IKISGKWKAEKKFLK (SEQ ID NO: 143);

KWAFAKKQKKRLKRQWLKKF (SEQ ID NO: 148);

KWKAQKRFLKKWKAQKAFLKKWKAQKRFLK (SEQ ID NO: 149);

KWKAAβ-(1-naphthyl)Aβ-(1-naphthyl)RFLKKWKAQKRFLK (SEQ ID NO: 150);

KWKAQKRFLKKWKAAβ-(1-naphthyl)Aβ-(1-naphthyl)RFLK (SEQ ID NO: 151);

KWKAAβ-(1-naphthyl)Aβ-(1-naphthyl)RFLKKWKAAβ-(1-naphthyl)Aβ-(1-naphthyl)RFLK (SEQ ID NO: 152);

KWKAAβ-(1-naphthyl)Aβ-(1-naphthyl)RFLKKWKAAβ-(1-naphthyl)Aβ-(1- naphthyl)RFLKKWKAAβ-(1-naphthyl)Aβ-(1-naphthyl)RFLK (SEQ ID NO: 153);

KAβ-(1-naphthyl)KAQAβ-(1-naphthyl)RFLKKAβ-(1-naphthyl)KAQAβ-(1-naphthyl)RFLK (SEQ ID NO: 156);

KWKAQWRFLKKWKAQWRFL (SEQ ID NO: 159);

KWKAAβ-(1-naphthyl)KRFLKKWKAAβ-(1-naphthyl)KRFLK (SEQ ID NO: 160);

KAβ-(1-naphthyl)KAQFRFLKKAβ-(1-naphthyl)KAQFRFLK (SEQ ID NO: 161);

KWKAQKRF (SEQ ID NO: 163);

CKWKAQKRFLKMSC (SEQ ID NO: 164);

CKWKAQKRFC (SEQ ID NO: 165);

IKISGKWKAQKRAβ-(1-naphthyl)LK (SEQ ID NO: 166);

KWKAFFRFLKKWKAFFRFLK (SEQ ID NO: 101);

IKISGKWKAAWRFLK (SEQ ID NO: 223);

IKISGKWKAAβ-(1-naphthyl)FRFLK (SEQ ID NO: 224);

IKISGKWKAAFRFLK (SEQ ID NO: 225);

oder

IKISGKWKAAβ-(1-naphthyl)ARFLK (SEQ ID NO: 226).

3. Verbindung, die ein Peptid ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:

VHVHISKSKVGWLIQLFHKKIESALRNK (SEQ ID NO: 12);

KSKVWLIQLFHKK (SEQ ID NO: 13);

SVHVHISKSKVGWLIQLFHKKIESALRNK (SEQ ID NO: 14);

KSKVGWLIQLFHKK (SEQ ID NO: 15);

ASKVGWLIQLFHKK (SEQ ID NO: 33);

KAKVGWLIQLFHKK (SEQ ID NO: 34);

KSAVGWLIQLFHKK (SEQ ID NO: 35);

KSKAGWLIQLFHKK (SEQ ID NO: 36);

KSKVAWLIQLFHKK (SEQ ID NO: 37);

KSKVGALIQLFHKK (SEQ ID NO: 38);

KSKVGWAIQLFHKK (SEQ ID NO: 39);

KSKVGWLAQLFHKK (SEQ ID NO: 40);

KSKVGWLIALFHKK (SEQ ID NO: 41);

KSKVGWLIQAFHKK (SEQ ID NO: 42);

KSKVGWLIQLAHKK (SEQ ID NO: 43);

KSKVGWLIQLFAKK (SEQ ID NO: 44);

KSKVGWLIQLFHAK (SEQ ID NO: 45);

KSKVGWLIQLFHKA (SEQ ID NO: 46);

KSKVGWLIQLFHKKKSKVGWLIQLFHKK (SEQ ID NO: 56);

GWLIQLFHKKIESALRNKMNS (SEQ ID NO: 61);

VHVHISKSKVGWLIQLFHKKIE (SEQ ID NO: 67);

KSKVGWLJQLWHKK (SEQ ID NO: 76);

KSKVGAβ-(1-naphthyl)LIQLFHKK (SEQ ID NO: 77);

KSKVLWLIQLFHKK (SEQ ID NO: 79);

KSKVGWLILLFHKK (SEQ ID NO: 80);

KSKVGWLIQLFLKK (SEQ ID NO: 81);

KSKVGWLIFLFHKK (SEQ ID NO: 86);

KSKVGWLIKLFHKK (SEQ ID NO: 87);

KSKVGWLIQLFFKK (SEQ ID NO: 89);

KSKVFWLIQLFHKK (SEQ ID NO: 90);

KSKVGWLIQLFHKF (SEQ ID NO: 91);

KSKVKWLIQLFHKK (SEQ ID NO: 92);

KSKVKWLIKLFHKK (SEQ ID NO: 94);

KSKVKWLIKLFFKFKSKVKWLIKLFFKF (SEQ ID NO: 95);

KSKVGWLISLFHKK (SEQ ID NO: 103);

KSKVGWLITLFHKK (SEQ ID NO: 105);

KSKVGWLIQLFWKK (SEQ ID NO: 106);

KSKVGWLIQLFWKK (SEQ ID NO: 107);

KSKVGWLIQLAβ-(1-naphthyl)HKK (SEQ ID NO: 108);

KSKVGWLIQLFAβ-(1-naphthyl)KK (SEQ ID NO: 109);

KSKVGWLIQLFHKAβ-(1-naphthyl) (SEQ ID NO: 110);

KSKVGWLIQFFHKK (SEQ ID NO: 112);

KSKVKAβ-(1-naphthyl)LIQLFHKK (SEQ ID NO: 114);

KSKVGW(p-amino)LIFLFHKK (SEQ ID NO: 119);

KSKVKWLIQLWHKK (SEQ ID NO: 120);

KSKVGWLIYLFHKK (SEQ ID NO: 121);

KSKVGWDLIQLFHKK (SEQ ID NO: 122);

KSKVGFLIQLFHKK (SEQ ID NO: 123);

KSKVGFDLIQLPHKK (SEQ ID NO: 124);

KSKVGAD-β-(1-naphthyl)LIQLFHKK (SEQ ID NO: 125);

KSKVGA2-β-(1-naphthyl)LIQLFHKK (SEQ ID NO: 126);

KSKVGAD-β-(1-naphthyl)LIQLFHKK (SEQ ID NO: 127);

KSKVGA(pyridyl)LIQLFHKK (SEQ ID NO: 128):

KSKVGF(p-amino)LIQLFHKK (SEQ ID NO: 129);

KSKVF(p-amino)WLIQLFHKK (SEQ ID NO: 130);

KSKVGKLIQLPHKK (SEQ ID NO: 131);

CKSKVGWLIQLFHKKC (SEQ ID NO: 133);

KSKVKFLIQLFHKK (SEQ ID NO: 134);

KSKVGYLIQLFHKK (SEQ ID NO: 135);

KSKVGWLIQWFHKK (SEQ ID NO: 138);

KSKVGWLIQAβ-(1-naphthyl)FHKK (SEQ ID NO: 139);

KSKVGA(cyclohexyl)LIQLFHKK (SEQ ID NO: 140);

KSKVGWLIQLFAβ-(1-naphthyl)KAβ-(1-naphthyl) (SEQ ID NO: 142);

KSKVGAβ-(1-naphthyl)LIQLFAβ-(1-naphthyl)KK (SEQ ID NO: 144);

KSKVKALIQLFHKK (SEQ ID NO: 157);

KSKVGVLIQLFHKK (SEQ ID NO: 162);

KSKVGAβ-(1-naphthyl)LIQLFHKK (SEQ ID NO: 167);

KSKVGAβ-(1-naphthyl)LIQAβ-(1-naphthyl)FHKK (SEQ ID NO: 168);

KSKVGAβ-(1-naphthyl)LIF(p-amino)LFHKK (SEQ ID NO: 169);

KSKVF(p-amino)Aβ-(1-naphthyl)LIQLFHKK (SEQ ID NO: 170);

KSKVGAβ-(1-naphthyl)LIQLWHKK (SEQ ID NO: 171);

KSKVGWLIQAβ-(1-naphthyl)FHKAβ-(1-naphthyl) (SEQ ID NO: 172);

KSKVGWLIAβ-(1-naphthyl)LFHKAβ-(1-naphthyl) (SEQ ID NO: 173);

KSKVAβ-(1-naphthyl)WLIQLFHKAβ-(1-naphthyl) (SEQ ID NO: 174);

KSKVGWLIQLWHKAβ-(1-naphthyl) (SEQ ID NO: 175);

KSKVGWLIQAβ-(1-naphthyl)FAβ-(1-naphthyl)KK (SEQ ID NO: 176);

KSKVGWLIF(p-amino)LFAβ-(1-naphthyl)KK (SEQ ID NO: 177);

KSKVF(p-amino)WLIQLFAβ-(1-naphthyl)KK (SEQ ID NO: 178);

KSKVGWLIQLWAβ-(1-naphthyl)KK (SEQ ID NO: 179);

KSKVGWLIFL(p-amino)Aβ-(1-naphthyl)HKK (SEQ ID NO: 180);

KSKVF(p-amino)WLIQAβ-(1-naphthyl)FHKK (SEQ ID NO: 181);

KSKVGWLIQAβ-(1-naphthyl)WHKK (SEQ ID NO: 182);

KSKVF(p-amino)WLIF(p-amino)LFHKK (SEQ ID NO: 183);

KSKVGWLIF(p-amino)LWHKK (SEQ ID NO: 184);

KSKVF(p-amino)WLIQLWHKK (SEQ ID NO: 185);

KSKVGAD-β-(2-naphthyl)LILLFHKK (SEQ ID NO: 190):

KSKVGWLILLFHKKKSKVGWLILLFHKK (SEQ ID NO: 191);

KSKVGWLIFLFHKKKSKVGWLIFLFHKK (SEQ ID NO: 192);

KSKVGWLILLFHKKKSKVGWLIQLFHKK (SEQ ID NO: 193);

KSKVGWLIQLFHKKKSKVGWLILLFHKK (SEQ ID NO: 194);

KSKVGWLIFLFHKKKSKVGWLIQLFHKK (SEQ ID NO: 195);

KSKVGWLIQLFHKKKSKVGWLIFLFHKK (SEQ ID NO: 196);

KSKVGWLILLWHKK (SEQ ID NO: 198);

KSKVGAD-β-(2-naphthyl)LIQLWHKK (SEQ ID NO: 199);

KSKVGAD-β-(2-naphthyl)LILLWHKK (SEQ ID NO: 200);

KSKVGGLIQLFHKK (SEQ ID NO: 201);

KSKVGLLIQLFHKK (SEQ ID NO: 202);

KSKVGWLIQLFHKK (SEQ ID NO: 203);

KSKVGADLIQLFHKK (SEQ ID NO: 204);

KSKVGVDLIQLFHKK (SEQ ID NO: 205);

KSKVGAβLIQLFHKK (SEQ ID NO: 206);

KSKVG (delta-aminobuttersäure) LIQLFHKK (SEQ ID NO: 207);

KSKVG (gamma-aminobuttersäure) LIQLFHKK (SEQ ID NO: 208);

KSKVGA(delta-Methyl)LIQLFHKK (SEQ ID NO: 209);

KSKVGG(t-butyl)LIQLFHKK (SEQ ID NO: 210);

KSKVGG(N-Methyl)LIQLFHKK (SEQ ID NO: 211);

KSKVGV(N-Methyl)LIQLFHKK (SEQ ID NO: 212);

KSKVGL(N-Methyl)LIQLFHKK (SEQ ID NO: 213);

KSKVGWLINLFHKK (SEQ ID NO: 214);

KSKVGWLIELFHKK (SEQ ID NO: 215);

KSKVGWLIDLFHKK (SEQ ID NO: 216);

KSKVGWLIKLFHKK (SEQ ID NO: 217);

KSKVKVLIQLFHKK (SEQ ID NO: 218);

KSKVKWAIQLFHKK (SEQ ID NO: 219);

KSKVGVAIQLFHKK (SEQ ID NO: 220);

oder

KSKVKVAIQLFHKK (SEQ ID NO: 221).

4. Verbindung, die ein Peptid ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:

KWKAQKRFLKKSKVGWLIQLFHKK (SEQ ID NO: 52);

IKISGKWKAQKRFLKKSKVGWLIQLFHKK (SEQ ID NO: 53);

KSKVGWLIQLFHKKKWKAQKRFLK (SEQ ID NO: 70);

IKISGKAβ-(1-naphthyl)KAQFRFLKKSKVGWLIFLFHKK (SEQ ID NO: 83);

IKISGKAβ-(1-naphthyl)KAQFRFLKKSKVGWLIQLFHKK (SEQ ID NO: 88);

KWKAQFRFLKKSKVGWLILLFHKK (SEQ ID NO: 96);

Aβ-(1-naphthyl)Aβ-(1-naphthyl)RFLKF (SEQ ID NO: 136);

KWKAAARFLKKSKVGWLIQLFHKK (SEQ ID NO: 141);

KWKVFKKIEKKSKVGWLIQLFHKK (SEQ ID NO: 147);

IKISGKWKAAβ-(1-naphthyl)Aβ-(1-naphthyl)RFLKKSKVGWLIQLFHKK (SEQ ID NO: 154);

KAβ-(1-naphthyl)KAQAβ-(1-naphthyl)RFLKKSKVGKWKAFKRFLK (SEQ ID NO: 155);

KWKAQWRFLKKSKVGWLIQLFHKK (SEQ ID NO: 158);

KAβ-(1-naphthyl)KAQAβ-(1-naphthyl)RFLKKSKVGWLILLFHKK (SEQ ID NO: 186);

KWKAQFRFLKKSKVGWLIQLWHKK (SEQ ID NO: 187);

KWKAQFRFLKKSKVGAD-β-(2-naphthyl)LIQLFHKK (SEQ ID NO: 188);

KAβ-(1-naphthyl)KAAβ-(1-naphthyl)KRFLKKSKVGAD-β-(1-naphthyl)LIQLFHKK (SEQ ID NO: 189);

KWKAQFRFLKKSKVGWLIFLFHKK (SEQ ID NO: 197);

oder

KAβ-(1-naphthyl)AQFRFLKKSKVGWLILLFHKK (SEQ ID NO: 222).

5. Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 umfaßt.