DE68914620T2

DE68914620T2 - Verfahren zur Herstellung der Restriktionsendonucklease PvuI.

Info

Publication number: DE68914620T2
Application number: DE68914620T
Authority: DE
Inventors: Nobuhiro Toyo Boseki Katsuragi; Bunsei Toyo Boseki K Kawakami; Yoshihiko Toyo Boseki Maekawa
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1988-12-19
Filing date: 1989-12-15
Publication date: 1994-10-06
Anticipated expiration: 2009-12-16
Also published as: JPH0822223B2; EP0374771A1; US5049501A; EP0374771B1; JPH02167084A; DE68914620D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Erfindung bezieht sich auf ein neues rekombinantes Plasmid, welches ein eingebautes Chromosomen-DNA-Fragment umfaßt, das ein PvuI-Restriktionsendonuklease-Gen enthält, einen Wirt, welcher durch Einführen des Plasmids transformiert wurde, und auf ein Verfahren zum Herstellen von PvuI-Restriktionsendonuklease aus dem Wirt.
Restriktionsenzyme des Typs II sind Enzyme mit einer äußerst hohen Spezifität, welche eine besondere Basensequenz in einer Deoxyribonukleinsäurekette (DNA) erkennen und spalten. Mit dieser ausgezeichneten Spezifität werden sie auf dem Gebiet der Gentechnologie weitverbreitet verwendet.
Etwa 100 verschiedene Restriktionsenzyme des Typ II sind bis jetzt in Bakterien usw. exprimiert und kommerzialisiert worden. Unter diesen Restriktionsenzymen vom Typ II befindet sich PvuI- Restriktionsendonuklease (nachstehend als PvuI abgekürzt), welche CGATCG in einer DNA-Basensequenz erkennt und spaltet, und von welcher bekannt ist, daß sie in Proteus vulgaris ATCC 13315 produziert wird [Nucleic Acids Research 9, 4525 (1981)].
Um ein Restriktionsenzym des Typs II auf dem Gebiet der Gentechnologie zu verwenden, müssen die folgenden vier Erfordernisse erfüllt sein:
1) Es ist kein anderes Restriktionsenzym enthalten.
2) Phosphatase ist nicht enthalten.
3) Es ist keine unspezifische DNase enthalten.
4) Weder 3'- noch 5'-Exonuklease ist enthalten.
Aus diesem Grund werden im Handel erhältliche Restriktionsenzyme durch kombiniertes Verwenden von Nukleinsäureentfernung, Aussalzen, Affinitätschromatographie, Ionenaustausohchromatographie, Gelfiltration und anderer Mittel zu einer hohen Reinheit gereinigt. Die Erfinder versuchten, dasselbe Verfahren wie bei anderen Restriktionsenzymen auf PvuI anzuwenden und fanden, daß Proteus vulgaris ATCC 13315 sowohl PvuII-Restriktionsendonuklease, welche CAGCTG erkennt und spaltet, als auch PvuI produziert, und seine Produktivität für nichtspezifische DNase höher ist, als diejenige anderer, Restriktionsenzyme produzierender Bakterien, und daß es sehr schwierig ist, diese Substanzen bei der Reinigung von PvuI zu entfernen.
Die Erfinder führten eingehende Untersuchungen mit dem Ziel - durch, die beiden Nachteile des vorgenannten Verfahrens, nämlich die gleichzeitige Produktion von PvuI und PvuII und Produktion unspezifischer DNase in hoher Ausbeute, zu überwinden und einen Stamm aufzubauen, der allein PvuI produziert. Als Ergebnis waren die Erfinder bei Erhalten eines Wirts erfolgreich, der durch Einführen eines rekombinanten Plasmids transformiert war, das durch Inserieren eines ein PvuI-Gen enthaltenden, aus dem vorgenannten Proteus vulgaris ATCC 13315 extrahierten Chromosomen- DNA-Fragments in einen Vektor hergestellt wurde, und fanden, daß dieser Wirt nur PvuI produziert.
Die vorliegende Erfindung ist auf der Grundlage dieses neuen Befundes entwickelt worden.

KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Demgemäß umfaßt die vorliegende Erfindung ein rekombinantes Plasmid, welches ein eingebautes Chromosomen-DNA-Fragment umfaßt, das ein aus Proteus vulgaris stammendes PvuI-Restriktionsendonuklease-Gen enthält, einen mit dem Plasmid transformierten Wirt und ein Verfahren zum Herstellen von PvuI-Restriktionsendonuklease, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß der transformierte Wirt kultiviert wird und PvuI-Restriktionsendonuklease aus der sich ergebenden Kultur geerntet wird.
Da das rekombinante Plasmid der vorliegenden Erfindung und der transformierte, dieses Plasmid einbauende Wirt nur PvuI produziert, ist es unnötig, PvuII bei dem Reinigungsverfahren für PvuI zu entfernen, und es wird weniger unspezifische DNase produziert. Auf diese Weise ist es möglich geworden, leicht eine große Menge PvuI zu herzustellen.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG

Fig. 1 zeigt die Restriktionsenzymkarte des rekombinanten Plasmids pPvuIRM7 der vorliegenden Erfindung.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung wird nachstehend im einzelnen beschrieben.

(a) Das Plasmid und seine Herstellung

Das neue Plasmid der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Plasmid, das zum Vermehren in kultivierten Zellen, wie etwa der als ein extrachromosomales Gen (Plasmid) bekannte Colicin El-Faktor eines der Gattung Escherichia angehörenden Mikroorganismus, fähig ist, und ein DNA-Fragment darin, das ein von Proteus vulgaris stammendes PvuI-Gen enthält, wie etwa ein aus Proteus vulgaris ATCC 13315 stammendes PvuI-Restriktionsendonuklease-Gen. Beispiele der Vektor-DNA schließen Extraktionen aus natürlich vorkommenden Vektoren ein. Ebenfalls eingeschlossen sind Vektor- DNA-Arten, denen ein anderer DNA-Teilbereich als der für die Vermehrung wesentliche fehlt. Beispiele derartiger Vektor-DNA- Arten schließen Col El-Stämme, pMB1-Stämme, pSC101-Stämme, R6K- Stämme und Lambda-Phagen-Stämme ein.
Zum Inserieren des vorgenannten Chromosomen-DNA-Fragments in den vorgenannten DNA-Vektor kann jedes bekannte Verfahren verwendet werden. Es ist zum Beispiel möglich, das Verfahren zu verwenden, bei welchem Chromosomen-DNA an einer bestimmten Stelle durch Behandlung mit einer geeigneten Restriktionsendonuklease gespalten wird, das Fragment anschließend mit einer auf dieselbe Weise wie vorstehend behandelten Vektor-DNA gemischt wird und sie mittels Ligase erneut ligiert werden.
Beispiele der Vektor-DNA schließen das pUC19-Plasmid ein. Ein neues Plasmid pPuvIRM7 kann durch inserieren eines aus Proteus vulgaris ATCC 13315 hergestellten Chromosomen-DNA-Fragments in dieses Plasmid hergestellt werden. Die Restriktionsenzyirtkarte von pPvuIRM7 wird in Fig. 1 dargestellt. Wie aus Fig. 1 offensichtlich ist, ist dieses Plasmid ein kreisförmiges Molekül mit 6.6 Kb-Basenpaaren, worin ein DNA-Fragment, das ein PvuI-Restriktionsendonuklease-Gen aus Proteus vulgaris ATCC 13315 enthält, in die BamHI-Stelle unter den Multiklonierungsstellen des pUC19-Plasmids inseriert ist.

(b) Herstellung des Mikroorganismus

Wenn das auf diese Weise erhaltene Ligationsprodukt des vorgenannten Chromosomen-DNA-Fragments und der Vektor-DNA durch ein bekanntes Transformationsmittel, wie etwa eine Bakterienzellen- Oberflächenbehandlung mit Metallionen, in eine Empfängerzelle eines Mikroorganismus eingeführt wird, kann ein Transformantenstamm erhalten werden, der sowohl die erwünschten genetischen Eigenschaften als auch die Eigenschaften der Vektor-DNA enthält.
Beispiele von Empfängern, die gut zu diesen Zweck dienen, schließen Mikroorganismen ein, die normalerweise auf diesem technischen Gebiet verwendet werden, wie etwa die Escherichia coli-Stämme HB101, AG-1, SCS-1, JM109.XL-1 Blie und NM522. Als repräsentatives Beispiel dafür, kann der Escherichia coli-Stamm HB101 erwähnt werde [siehe bei T. Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, S. 504 (1982); genetische Kennzeichen F&supmin;, hsdS 20, recA13, ara-14, proA2, lacY1, galK2, rpsL 20 (Smr), xyl-5, mt1-1, sup E44, λ&supmin;)].
Der durch das Transformationsverfahren durch Einführen des vorgenannten Plasmids pPvuIRM7 in diesen Escherichia coli-Stamm HB101 erhaltene Mikroorganismus ist ein neuer Mikroorganismus, der als Escherichia coli HB101 (pPvuIRM7) bezeichnet wurde und der seit dem 8. November 1989 unter der Nummer FERM BP-2645 auf der Grundlage des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen am Fermentationsforschungsinstitut, Amt für industrielle Forschung und Technologie, Ministerium für internationalen Handel und Industrie, Japan, wie er aus der ursprünglichen, am 29. November 1988 am selben Institut unter der Hinterlegungsnummer 10420 durchgeführten Hinterlegung überführt wurde, hinterlegt worden ist. Der Vergleich der bakteriologischen Natur zwischen auf diese Weise erhaltener Escherichia coli HB101 (pPvuIRM7) und dem DNA-Empfängerstamm Escherichia coli HB101 zeigt, daß sie miteinander genau identisch sind, außer daß erstere die Fähigkeit zum Produzieren von PvuI und eine Ampicillinresistenz besitzt, während letztere keine davon besitzt.

(c) Herstellung von Restriktionsendonuklease

Zum Kultivieren des im Verfahren (b) erhaltenen Transformantenstamms ist es möglich, jedes Kulturmedium zu verwenden, so lange es sowohl zur Herstellung einer Substanz, die auf der Grundlage einer besonderen genetischen Information hergestellt wird, als auch für das Wachstum des Wirtsmikroorganismus geeignet ist. Bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ist es annehmbar, ein Kulturmedium zu verwenden, das dadurch hergestellt wird, daß ein Basalmedium als Kulturmedium verwendet wird, welches normalerweise als Wachstumsmedium für Escherichia coli verwendet wird, wie etwa LB-Medium (Trypton, Hefeextrakt, Natriumchlorid) oder Trypton-Natriumchlorid-Medium.
Es ist ebenfalls möglich, außer Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen nach Bedarf Aminosäuren, Vitamine und andere Nährstoffe zuzusetzen.
Jedes Kulturverfahren kann verwendet werden solange der pH, Temperatur, Sauerstoffbedarf und andere Bedingungen für das Wachstum von Mikroorganismen der Gattung Escherichia geeignet sind, es ist aber bevorzugt, den Mikroorganismus nach seinem Einimpfen in das Medium zu vermehren bis die Bakterien-Zellmenge den Höchstwert erreicht, das heißt bis zur logarithmischen Wachstumsphase. Die Kultivierungstemperatur beträgt normalerweise 30 bis 37ºC; der pH liegt normalerweise zwischen 5 und 8, vorzugsweise nahe 7.
Die auf diese Weise erhaltenen Bakterienzellen werden gesammelt und anschließend über Zentrifugation, Aufbrechen mit Ultraschall und andere Verfahren extrahiert, wonach sie einer Kombination von Nukleinsäureentfernung, Aussalzen, Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration und anderen Mitteln unterzogen werden, wodurch PvuI erhalten wird.
Da das Plasmid der vorliegenden Erfindung und der dieses Plasmid einbauende, transformierte Wirt nur PvuI produzieren, ist es unnötig, bei dem Reinigungsverfahren für PvuI PvuII zu entfernen. Da ferner ihre Produktivität für unspezifische DNase im Vergleich mit herkömmlichen Produktionsbakterien niedriger ist, kann DNase leicht entfernt werden. Es ist daher möglich geworden, PvuI leicht herzustellen.
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend mittels der folgenden Beispiele in größerer Einzelheit beschrieben, aber die Erfindung ist keinesfalls auf sie beschränkt.

Beispiel 1

(1) Herstellung PvuI-Gen enthaltender Chromosomen-DNA

Proteus vulgaris ATCC 13315 wurde in 50 ml L-Brühe-Medium [hergestellt mit 10 g Polypepton, 5 g Hefeextrakt und 5 g NaCl, alle je Liter Wasser, auf pH 7,2 eingestellt] eingeimpft und dies wurde vom Schütteln bei 37ºC gefolgt. Die Bakterienzellen wurden 16 Stunden später gesammelt. Nachdem die gesammelten Zellen mit 10 ml TEN-Puffer [10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 1 mM EDTA, 10 mM NaCl] gewaschen worden waren, wurden sie in 5 ml SET-Puffer [20% Sucrose, 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 50 mM EDTA] suspendiert. Dieser Suspension wurden 0,5 ml einer Lösung [5 mg/ml TEN-Puffer] von Lysozym [hergestellt von Taiyo Kagaku K.K.] zugesetzt und man ließ dieses Gemisch 30 Minuten bei 37ºC stehen.
Dieses Gemisch wurde anschließend langsam mit 5 ml TEN-Puffer und 5 ml einer 25%igen SDS-Lösung gemischt. Anschließend wurden 1 ml 5 M NaCl-Lösung und 10 ml puffergesättigtes Phenol zugesetzt und dies wurde von 5 Minuten Rühren und anschließend 5 Minuten Zentrifugieren bei 6500 Upm und 4ºC gefolgt. Dem Überstand wurden 10 ml einer Lösung von Chloroform-n-Amylalkohol [24:1] zugesetzt und dies wurde von 5 Minuten Zentrifugation gefolgt. Anschließend wurde dem Überstand die zweifache Menge 95%iges Ethanol zugesetzt und die ausgefallene Chromosomen-DNA wurde aufgewickelt, während das Gemisch mit einem Glasstab gerührt wurde, wonach es erneut in 10 ml TEN-Puffer gelöst wurde. Eine Lösung (0,05 ml) von RNase [10 mg/ml 0,1 M Natriumacetat, 0,3 mM EDTA (pH 4,8): 10 Minuten bei 80ºC wärmebehandelt] wurde dazugesetzt und man ließ dieses Gemisch zum vollständigen Zersetzen der RNA 2 Stunden bei 37 ºC stehen. Anschließend wurden 0,5 ml einer Pronaselösung [2 mg/ml TEN-Puffer: 15 Minuten bei 37ºC behandelt] zugesetzt und man ließ dieses Gemisch zum vollständigen Zersetzen der restlichen Peptidverunreinigung 1 Stunde bei 37ºC stehen. Danach wurden 10 ml einer Chloroform-n-Amylalkohollösung zugesetzt und dies wurde 5 Minuten gerührt, gefolgt von 5 Minuten Zentrifugieren bei 6500 Upm und 4ºC. Dem Überstand wurde die zweifache Menge 95%iges Ethanol zugesetzt und die ausgefallene Chromosomen-DNA wurde aufgewickelt, während das Gemisch mit einem Glasstab gerührt wurde, wonach es in 2 ml TEN-Puffer erneut gelöst wurde, wodurch etwa 100 ug Chromosomen-DNA-erhalten wurden.
(2) Inserierung des Chromosomen-DNA-Fragments in den Vektor 100 ug der in (1) erhaltenen Chromosomen-DNA wurden 0,01 Einheiten Sau3AI-Restriktionsendonukleäse zugesetzt und dies wurde von 1 Stunde Reaktion bei 37ºC gefolgt, um die Chromosomen-DNA teilweise zu zersetzen. Dieses teilweise Zersetzungsprodukt wurde einer Sucroselösung zugesetzt, welche mit einem Dichtegradienten von 20%, 15%, 10% und 5% in dieser Reihenfolge geschichtet war, und dies wurde von 17 Stunden Ultrazentrifugation bei 23000 Upm und 4 ºC gefolgt. Die Lösung wurde auf der Grundlage der Dichtereihenfolge fraktioniert, um die Chromosomen-DNA nach der Größe zu sortieren. Anschließend wurden 8 Einheiten BamHI- Restriktionsendonuklease 1 ug Vektorplasmid pUC19 zugesetzt [hergestellt von Toyo Boseki Kabushiki Kaisha] und dies wurde von 1 Stunde Reaktion bei 37 ºC gefolgt, um das Vektorplasmid vollständig zu zerstören. Weiter wurde 1 Einheit Alkaliphosphatase zugesetzt und dies wurde von 1 Stunde Reaktion bei 37ºC gefolgt, um die 5'-terminale Phosphorsäure zu entfernen. Das der 3-5 Kb-Fraktion entsprechende Chromosomen-DNA-Fragment (3 ug) und 1 ug des pUC19-DNA-Fragments, die beide wie vorstehend erhalten wurden, wurden zusammengemischt und dies wurde von der Ligationsreaktion bei 15ºC während 16 Stunden unter Verwenden von 5 Einheiten von T4-Phagen stammender DNA-Ligase in Anwesenheit von 1 mM ATP und 5 mM Dithiothreit gefolgt, wodurch eine die Chromosomen-DNA einbauende Plasmid-DNA erhalten wurde.

(3) Transformation mit rekombinantem Plasmid, welches ein PvuI- Restriktionsendonuklease-Gen enthält

Der Escherichia coli-Stamm HB101, der zwischen dem Escherichia coli-Stamm K-12 und dem Escherichia coli-Stamm B gebildete Hybridstamm, wurde in 40 ml LB-Medium [hergestellt mit 10 g Trypton (Difco), 5 g Hefeextrakt und 10 g NaCl, alles je Liter reinen Wassers, auf pH 7,0 eingestellt] eingeimpft und dies wurde von der Schüttelkultur bei 37ºC gefolgt, bis er zur logarithmischen Wachstumsphase heranwuchs. Anschließend wurden die Zellen gesammelt. Die gesammelten Zellen wurden zum Herstellen kompetenter Zellen in einer Lösung von CaCl&sub2; mit einer Endkonzentration von 0,05 M gelöst. Dieser Zellsuspension wurde eine Lösung der in (2) erhaltenen Plasmid-DNA zugesetzt und dies wurde von 60 Minuten Reaktion unter Eiskühlung und anschließend 1 bis 2 Minuten Wärmeschock bei 42ºC gefolgt, um die vorstehend in (2) erhaltene Plasmid-DNA in die Zellen eingebaut werden zu lassen. Diese Zellsuspension wurde anschließend getrennt in das vorgenannte LB-Medium eingeimpft und dies wurde zum Bewirken der Transformationsreaktion von 3 bis 5 Stunden Schüttelkultur bei 37 ºC gefolgt. Anschließend wurde der Stamm, der eine Ampicillinresistenz besitzt und der PvuI produziert, isoliert und Escherichia coli HB101 (pPvuIRM7) genannt (FRI-Hinterlegungsnummer FERM BP-2645)

(4) Herstellung von PvuI-Restriktionsendonuklease durch Escherichia coli HB101 (pPvuIRM7)

Die in (3) erhaltene Transformante Escherichia coli HB101 (pPvuIRM7) (FRI-Hinterlegungsnummer FERM BP-2645) wurde in einem 2 l-Kolben, der 500 ml des vorgenannten LB-Mediums enthielt, 16 Stunden der Schüttelkultur bei 37ºC unterzogen. Die sich daraus ergebende Kultur wurde zentrifugiert und die Zellen wurden gesammelt. Die gesammelten Zellen wurden gewaschen und anschließend in 25 ml eines 20 mM Tris-HCl-Puffers (pH 7,5), der 10 mM MgCl&sub2; und 7 mM 2-Mercaptoethanol enthielt, suspendiert und dies wurde von 10 Minuten Aufbrechen durch Ultraschall bei 0 ºC und anschließend 10 Minuten Zentrifugation bei 12000 Upm gefolgt, wodurch ein Enzymextrakt erhalten wurde. Diesem Enzymextrakt wurde unter Eiskühlen Ammoniumsulfatpulver zugesetzt und es wurde darin gelöst. Die zu 30-80% gesättigte Fraktion (der Sättigungsgrad wird durch das Osbornsche Verfahren ausgedrückt) wurde durch Zentrifugation gewonnen.
Diese gewonnene Fällung wurde in 2 ml eines 10 mM Phosphatpuffers (pH 7,5), der 2 mM Mercaptoethanol und 5% Glycerin enthielt, gelöst und diese Lösung wurde in einen Dialyseschlauch verbracht und über Nacht gegen die 100fache Menge desselben Puffers dialysiert. Danach wurde das Dialysat auf einer Säule (20 ml Fassungsvermögen) aus Phosphocellulose (hergestellt von Whatman Co.), die mit demselben Puffer äquilibriert war, absorbiert. Nach dem Waschen der Spule mit der 5fachen Menge desselben Puffers wurde die Elution mit einem Gradienten von 0 bis 1,0 M KCl ausgeführt. Die PvuI-Restriktionsendonuklease wurde nahe der Position eluiert, die einer Konzentration von 0,5 M KCl entsprach. Die eluierte Enzymlösung wurde in einen Dialyseschlauch verbracht und gegen einen Phosphatpuffer, der 2 mM Mercaptoethanol und 50% Glycerin enthielt, dialysiert, um 0,2 ml Enzymlösung zu liefern. Von der erhaltenen Enzymlösung wurde gefunden, daß sie eine Enzymaktivität von 10000 Einheiten besaß.
Die auf diese Weise erhaltene Enzymlösung enthielt keine anderen Typen Restriktionsendonuklease, Phosphatase, nichtspezifische DNase usw. und war somit auf dem Gebiet der Gentechnologie verwendbar. Die PvuI-Aktivität wurde durch Lösen von 1 ug λ-DNA in 45 ul einer Reaktionsbrühe, die 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), 7 mM Magnesiumchlorid, 150 mM Natriumchlorid, 7 mM 2- Mercaptoethanol und 100 ug/ml Rinderserumalbumin enthielt, Zusetzen von 5 ul der Enzymlösung zu der gemischten Lösung, 1 Stunde Durchführen der Reaktion bei 37ºC und danach Ausführen einer Agarose-Gelelektrophorese bestimmt. Eine Einheit der Enzymaktivität ist als die Enzymaktivität definiert, durch welche 1 ug λ-DNA bei 37ºC und pH 7,5 in 1 Stunde vollständig zersetzt ist.

Claims

1. Rekombinantes Plasmid, welches ein Chromosomen-DNA-Fragment einbaut, das ein aus Proteus vulgaris stammendes PvuI-Restriktionsendonuklease-Gen enthält.

2. Rekombinantes Plasmid wie in Anspruch 1 beansprucht, bei welchem das Plasmid aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Col El-Stämmen, pMB1-Stämmen, pSC101-Stämmen, R6K-Stämmen und Lambda-Phagenstämmen besteht.

3. Rekombinantes Plasmid wie in Anspruch 1 beansprucht, in welchem das Plasmid pPvuIRM7 (FERM BP-2645) ist.

4. Wirt, welcher mit einem rekombinanten Plasmid transformiert ist, das ein Chromosomen-DNA-Fragment einbaut, das ein aus Proteus vulgaris stammendes PvuI-Restriktionsendonuklease-Gen enthält.

5. Wirt wie in Anspruch 4 beansprucht, bei welchem das Plasmid aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Col El-Stämmen, pMB1- Stämmen, pSC101-Stämmen, R6K-Stämmen und Lambda-Phagenstämmen besteht.

6. Transformierter Wirt wie in Anspruch 4 beansprucht, worin der Wirt Escherichia coli ist.

7. Herstellungsverfahren für eine PvuI-Restriktionsendonuklease, dadurch gekennzeichnet, daß ein Wirt mit einem rekombinanten Plasmid transformiert wird, das ein Chromosomen-DNA- Fragment einbaut, das ein aus Proteus vulgaris stammendes PvuI- Restriktionsendonuklease-Gen enthält, und dadurch, daß die PvuI- Restriktionsendonuklease aus der sich daraus ergebenden Kultur geerntet wird.