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Die vorliegende Erfindung betrifft spezifische
monoclonale Antikörper, die den N-Terminus eines atrialen
natriuretischen Polypeptids (hier nachstehend als ANP
bezeichnet) erkennen, Hybridome, die solche monoclonalen Antikörper
produzieren, deren Herstellung und ein Verfahren für einen
ANP-Immuntest unter Verwendung dieser monoclonalen
Antikörper.
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ANP ist ein Polypeptid, das in durch atriale Myocyten
produzierten Granula enthalten ist, und weist eine
natriuretische sowie eine starke diuretische Wirkung auf.
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Seit de Bold, A. J. et al., eine starke
natriuretische, diuretische und blutdrucksenkende Aktivität in atrialen
Extrakten feststellten (Life Sci. 28 (1981), 89-94) sind
mehrere Polypeptide, die zusammen als atriale natriuretische
Polypeptide (ANP) bezeichnet werden, aus atrialen Geweben von
Menschen und Ratten isoliert worden, und es wird angenommen,
daß die Polypeptide mit der Homöostase der Körperflüssigkeit
und der Kontrolle des Blutdrucks zusammenhängen (Kangawa, K.
et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 118 (1984), 131-139).
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Solche Polypeptide werden nicht nur in Menschen,
sondern auch in Ratten gefunden, und werden als hANP bzw. rANP
bezeichnet. Das hANP und rANP wird jeweils in drei
Untergruppen mit den Bezeichnungen α, β und γ eingeteilt.
Hier nachstehend werden menschliches ANP vom α-Typ und
Ratten-ANP vom α-Typ mit α-hANP bzw. α-rANP abgekürzt. Wenn
es nicht erforderlich ist, die Quelle oder Untergruppe von
ANP genauer anzugeben, wird es einfach als "ANP" bezeichnet.
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α-hANP besteht aus 28 Aminosäureresten. Cys[7], d. h.
Cys an Position 7 vom N-Terminus, bildet mit Cys[23], d. h.
Cys an Position 23, eine Disulfidbindung, und dadurch wird
die Peptidsequenz zwischen Cys[7] und Cys[23] zu einer
Ringstruktur geformt (Biochem. Biophys. Res. Commun. 118
(1984), 131-139). α-hANP unterscheidet sich von α-rANP
dadurch, daß es an Position 12 vom N-Terminus den
Aminosäurerest Met anstelle von Ile enthält (Biochem. Biophys. Res.
Commun. 117 (1983) , 839-865)
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β-hANP ist ein antiparalleles α-hANP-Dimer (japanische
veröffentlichte, nicht-geprüfte Patentanmeldung Nr.
184098/1985). γ-hANP besteht aus 126 Aminosäureresten, und
seine aus den Aminosäuren 99 bis 126 bestehende Sequenz am
CTerminus entspricht genau der von α-hANP.
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Unter Verwendung von polyclonalem Kaninchen-Antiserum
gegen α-ANP [17-28] ist ein Radioimmuntest (RIA) zur Messung
von ANP etabliert worden, in dem sowohl α-hANP als auch α-
rANP nachweisbar sind (Nakao, K. et al., Biochem. Biophys.
Res. Commun. 124 (1984), 815-821), und es ist gezeigt worden,
daß α-ANP nach Sekretion durch das Herz als Hormon durch den
Körper zirkuliert (Sugawara, A. et al., Hypertension 8
(Ergänzungsband I) (1986) , 151-155).
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Andererseits zeigten Untersuchungen mit RIA und
chromatographischen Analysen, daß ANP auch im Zentralnervensystem
vorhanden ist (Morii, N. et al., Biochem. Biophys. Res.
Commun. 127 (1985), 413-419), und daß der größte Teil der
ANP-Moleküle im Gehirn und im Rückenmark von Ratten aus α-
rANP [4-28] und α-rANP [5-28] besteht (Shiono, S. et al.,
Biochem. Biophys. Res. Commun. 135 (1986), 728-734, und
Morii, N. et al., ebenda 145 (1987), 196-203). Es ist
außerdem gezeigt worden, daß ANP im Gehirn und im Rückenmark als
ein Neuropeptid wirkt, während ANP im Blutkreislauf als
Hormon wirkt (Nakao, N. et al., Can. J. Physiol. Pharmacol.
65 (1987), 1756-1761)
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Das vorstehend beschriebene polyclonale Kaninchen-
Antiserum gegen α-ANP kann ANP im Blutkreislauf nicht von ANP
im Gehirn und Rückenmark unterscheiden, es ist jedoch auf
unterschiedlichste Weise verwendet worden. Das Antiserum wurde
beispielsweise in immunhistochemischen Untersuchungen
verwendet (Kawata, M. et al., Neuroscience 16 (1985), 521-546).
Ferner wurde das Antiserum in den cerebralen Ventrikel von
Ratten injiziert, um im Gehirn die Wirkung von endogenem ANP
zu neutralisieren, wobei die Wasseraufnahme erhöht wurde
(Katsuura, G. et al., European J. Pharmacol. 121 (1986), 285-
287).
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Die im Antiserum enthaltenen polyclonalen Antikörper
gegen ANP sind somit unter verschiedenen Gesichtspunkten
nützlich. Das Antiserum weist jedoch unvermeidbare Nachteile
auf, weil es nur in geringen Mengen verfügbar ist, es
verschiedene, mehrere Epitope erkennende Antikörper enthält und
es nicht erforderliche Antikörper gegen nicht-ANP-Antigene
enthält.
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Aus den vor stehend beschriebenen Gründen bestand eine
große Nachfrage nach monoclonalen Antikörpern gegen ANP und
unlängst wurde von mehreren monoklonalen Antikörpern mit
unterschiedlichen Spezifitäten berichtet (John, A. et al., Life
Sci. 38 (1986), 1991-1997, Milne, R. et al., Mol. Immunol. 24
(1987), 127-132, Glembotski, C. C. et al., Endocrinology 121
(1987), 843-852, Naomi, S. et al., Hybridoma 6 (1987), 433-
440, und Stasch, J. P. et al., European J. Pharmacol. 129
(1986) , 165-168)
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Es ist dementsprechend beispielsweise ein als 11A-A11
bezeichneter, α-hANP erkennender, monoclonaler Antikörper
bekannt. Der monoclonale Antikörper wurde unter Verwendung von
Atriopeptin II, einer Art Ratten-ANP, als Immunogen erhalten,
und sein Epitop liegt zwischen Cys[7] und Ser[25], zwischen
denen eine Disulfidbindung besteht. Das heißt, es wird
angenommen, daß das Epitop in der Ringstruktur von ANP angeordnet
ist. Der monoclonale Antikörper weist die gleiche Affinität
für hANP (Met 12) und rANP (Ile 12) auf und erkennt sowohl
rANP als auch hANP (Life Science 38 (1986), 1991-1997).
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Andererseits sind bereits verschiedene, Antiserum
verwendende Radioimmuntests für ANP etabliert worden (Science
228 (1985), 323-325, Nature 314 (1985), 264-266, Biochem.
Biophys. Res. Commun. 124 (1984), 815-821, ebenda 124 (1984),
663-668, und ebenda 125 (1984), 315-323). Es wird in einer
dieser Veröffentlichungen beschrieben, daß festgestellt
wurde, daß das Antiserum CR-3 das C-terminale Fragment [17-
28] von ANP gemäß einem solchen Immuntest erkennt.
Immunhistochemische und neutralisierende Tests unter Verwendung
von monoclonalen Antikörpern gegen ANP sind ebenfalls
bekannt.
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Die vorliegende Erfindung stellt neue, die N-terminale
Sequenz von α-ANP erkennende, monoclonale Antikörper bereit,
die vom Maus-Hybridom (KY-ANP-II), das aus FERM BP-1695
erhältlich ist, produziert werden. Diese monoclonalen
Antikörper erkennen spezifisch das aus 28 Aminosäureresten
bestehende ANP im Blutkreislauf.
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Ein anderer Gesichtspunkt der Erfindung ist ein
Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Hybridoms oder
eines erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörpers, das die
Konjugation von α-hANP mit einem Protein zur Erhöhung seiner
Immunogenität umfaßt, wobei das erhaltene Konjugat zur
Immunisierung eines Tieres verwendet wird, so daß Antikörper
produzierende Zellen zur Verfügung gestellt werden, Fusion
dieser Zellen mit Myelomzellen, die Auswahl eines
Fusionsprodukts, das einen monoclonalen Antikörper, wie in Anspruch
1 definiert, produzieren kann, und gegebenenfalls die
Züchtung des ausgewählten Fusionsprodukts, um diesen
monoclonalen Antikörper zu produzieren.
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Der erfindungsgemäße monoclonale Antikörper erkennt
bevorzugt 2 bis 3 Aminosäurereste am N-Terminus von α-ANP und
außerdem besteht die Möglichkeit, daß ein Teil der
Ringstruktur von α-ANP in sein Epitop eingeschlossen ist. Der
erfindungsgemäße monoclonale Antikörper erkennt sowohl α-hANP
als auch α-rANP, da sich α-hANP und α-rANP nur im 12.
Aminosäurerest vom N-Terminus unterscheiden. Der erfindungsgemäße
Antikörper ermöglicht die Messung von α-ANP, das nur im
Blutkreislauf vorkommt, da dem α-ANP des Zentralnervensystems
die N-terminale Sequenz fehlt.
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Der erfindungsgemäße monoclonale Antikörper weist die
stärkste Affinität zu Liganden und eine sich von anderen
bekannten Antikörpern unterscheidende Bindungsspezifität auf.
Der erfindungsgemäße monoclonale Antikörper kann ferner auch
für immunhistochemische und neutralisierende Tests in Ratten
verwendet werden. Der erfindungsgemäße Antikörper ermöglicht
außerdem eine sehr empfindliche Messung von α-ANP im RIA.
Wenn der erfindungsgemäße Antikörper in Kombination mit einem
den C-Terminus von α-ANP erkennenden Antikörper,
beispielsweise in Form eines polyclonalen Antiserums gegen α-ANP[17-
28], verwendet wird, ist es ferner möglich, einen Sandwich-
Enzym-Immuntest (EIA) mit einer sehr hohen Empfindlichkeit
durchzuführen, und insbesondere ist es möglich, nur im Blut
zirkulierendes α-ANP zu messen. In üblichen Verfahren zur
Messung von α-ANP war es erforderlich, α-ANP aus einer Probe
von Plasma, etc. zu reinigen. Im erfindungsgemäßen Verfahren
ist jedoch aufgrund seiner großen Empfindlichkeit eine solche
Reinigung nicht erforderlich.
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Wie vorstehend beschrieben ist der erfindungsgemäße,
die N-terminale Sequenz von α-ANP erkennende, monoclonale
Antikörper bei der Untersuchung der physiologischen oder
pathophysiologischen Bedeutung von ANP als Hormon sehr
nützlich.
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Nach langwierigen Untersuchungen zum Zweck der
Erzeugung von monoclonalen Antikörpern, die eine hohe
Affinität für hANP zeigen und insbesondere das N-terminale
Fragment von hANP spezifisch erkennen, gelang es den
Erfindern, einen den N-Terminus von α-hANP erkennenden,
monoclonalen Antikörper zu erhalten und unter Verwendung des
Antikörpers ein sehr empfindliches Verfahren zur Messung von
α-hANP zu etablieren. Ein bestimmtes Verfahren, das zur
Herstellung dieses monoclonalen Antikörpers verwendet werden
kann, und ein Verfahren, das zur Messung von α-hANP verwendet
werden kann, sind nachstehend genauer beschrieben. Die
erfindungsgemäßen Gesichtspunkte der Verfahren sind nicht auf die
hier nachstehend beschriebenen Einzelheiten beschränkt.
(1) Herstellung eines einen monoclonalen Antikörper
produzierenden Hybridoms
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α-hANP ist ein aus 28 Aminosäureresten bestehendes
Polypeptid und sein Molekulargewicht ist zu gering, um die
Antikörperproduktion ausreichend zu induzieren (geringe
Immunogenität). Aus diesem Grund wird α-hANP bei seiner
Verwendung als Immunogen mit einem beliebigen anderen Protein
von höherem Molekulargewicht konjugiert, beispielsweise mit
Rinderserumalbumin oder Rinder-Thyroglobulin. Das so
erhaltene Konjugat wird in einem geeigneten Adjuvans,
beispielsweise in komplettem Freundschem Adjuvans, emulgiert und
anschließend zur Immunisierung von Mäusen verwendet.
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Die Immunisierung wird in Abständen von mehreren
Wochen durch wiederholte intraperitoneale, subcutane oder
intravenöse Injektion der vorstehend beschriebenen Emulsion in
Mäuse durchgeführt. Drei bis fünf Tage nach der letzten
Immunisierung wird die Milz entfernt, die als Quelle zur
Lieferung von Antikörper produzierenden Zellen verwendet wird.
Myelomzellen, die einen geeigneten Marker, beispielsweise
eine Defizienz der
Hypoxanthinguaninphosphoribosyl-Transferase (HGPRT&supmin;) oder eine Defizienz der Thymidin-Kinase (TK&supmin;),
aufweisen, werden ebenfalls hergestellt. Anschließend werden
zur Herstellung eines Hybridoms die Antikörper produzierenden
Zellen und die Myelomzellen fusioniert.
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Als Kulturmedium zur Züchtung des Hybridoms können
solche Medien, wie Eagle-MEM, modifiziertes Dulbecco-Medium
oder RPMI-1640-Medium, unter Zusatz von etwa 15 % fötalem
Kälberserum (FCS) verwendet werden, obwohl die Wahl des
Mediums nicht darauf beschränkt ist.
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Zunächst werden die Myelomzellen und die Milzzellen in
Gegenwart eines Fusionsmittels in einem Verhältnis von etwa 1
: 6 vermischt. Als Fusionsmittel wird üblicherweise 50 %
Polyethylenglycol (PEG) verwendet, da es mit einer hohen
Effizienz fusioniert. Die fusionierten Zellen werden durch
das HAT-Selektionsverfahren selektiert. Die im
Kulturüberstand
enthaltenen Hybridome werden zur Selektion der
gewünschten, zur Sekretion des gesuchten Immunglobulins
befähigten Hybridome gemäß üblicher Verfahren abgesucht,
beispielsweise mit dem "membrane fluorescence
antibody"-Verfahren, dem Enzym-gebundenen Immunadsorptionstest (ELISA-
Verfahren), dem immunologischen Anfärbeverfahren von Gewebe
und dem RIA. Um die Homogenität der selektierten Hybridome
sicherzustellen, wird eine erneute Clonierung in der
nachstehend beschriebenen Weise durchgeführt: Normale Milzzellen
werden als Feeder-Zellen-Schicht in die 96 Vertiefungen einer
Mikrotiterplatte gegeben und die selektierten Hybridome in
einer Menge aufgebracht, die eine Zelle pro Vertiefung nicht
übersteigt, und es wird mit den gezüchteten Clonen erneut ein
Screening durchgeführt. Homogene Hybridome werden durch
Wiederholung eines solchen Subclonierungsverfahrens erhalten.
(2) Herstellung des monoclonalen Antikörpers
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Die vorstehend erhaltenen Hybridome werden zur
Herstellung eines erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörpers in
vitro oder in vivo gezüchtet. Bei der Durchführung der
Züchtung in vitro können übliche Medien, beispielsweise wie
vorstehend beschrieben, unter Zusatz von FCS verwendet
werden. Nach einer Züchtung von 3 bis 5 Tagen im Medium wird der
monoclonale Antikörper aus dem Kulturüberstand erhalten. Bei
der Durchführung der Züchtung in vivo wird das Hybridom in
die Bauchhöhle eines Säugers injiziert. Ein bis zwei Wochen
später wird die Ascitesflüssigkeit gesammelt, aus der der
monoclonale Antikörper erhalten wird. Im Vergleich zur Züchtung
in vitro produziert die Züchtung in vivo weitaus höhere
Mengen Antikörper und wird daher bevorzugt.
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Der vom Kulturüberstand oder der Ascitesflüssigkeit
erhaltene monoclonale Antikörper kann durch bekannte
Verfahren gereinigt werden, beispielsweise durch eine
Ammoniumsulfat-Fraktionierung, Adsorption an eine Protein A-Säule,
DEAE-Sepharose-Säulenchromatographie oder deren Kombination.
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Die Erfinder erhielten den bestimmten
erfindungsgemäßen monoclonalen α-ANP-Antikörper mit der Bezeichnung KY-ANP-
II gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren, und
untersuchten seine Eigenschaften. Der monoclonale Antikörper
zeigte eine hohe Affinität zu α-hANP und α-rANP (Ka = 6,6 x
10¹&sup0; M&supmin;¹). Es wurde auch eine schwache Kreuzreaktivität mit
α-rANP[3-28] beobachtet. Der Antikörper reagierte jedoch
weder mit α-rANP[4-28] noch mit α-rANP[5-28]. Dies zeigt, daß 2
bis 3 Aminosäurereste des N-Terminus von α-ANP für die
Erkennung durch den Antikörper am wichtigsten sind. Die
Kreuzreaktivität mit γ-hANP, das eine Struktur aufweist, die
der von α-hANP mit weiteren, an den N-Terminus des α-hANP
gebundenen Aminosäuren entspricht, war 50 %. Ferner erkennt
dieser Antikörper α-rANP sowie α-hANP, was zeigt, daß die 12.
Aminosäure auf α-ANP kein Teil des Epitops ist. Obwohl
festgestellt wurde, daß 2 bis 3 Aminosäuren des N-Terminus
wichtig sind, wurde α-ANP[1-11] durch diesen Antikörper nicht
ausreichend erkannt.
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Aus den experimentellen Ergebnissen, wie vorstehend
beschrieben, wird geschlossen, daß es möglich ist, daß der
Antikörper KY-ANP-II die durch eine Disulfidbindung zwischen
Cys&sup7; und Cys²³ gebildete Ringstruktur erkennen kann, obwohl
die Haupterkennungsstelle aus 2 bis 3 Aminosäurenresten des
N-Terminus von α-ANP besteht.
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Es wurde beschrieben, daß den ANPs im
Zentralnervensystem von Ratten meistens mehrere Aminosäuren am N-
Terminus von α-ANP fehlen, wie dies durch α-ANP[4-28] und α-
ANP[5-28] veranschaulicht ist. Dadurch unterscheiden sie sich
von im Kreislaufsystem vorhandenem α-ANP. Daher ist der
erfindungsgemäße monoclonale Antikörper für ANP im
Blutkreislauf sehr spezifisch, und er erkennt in gleicher Weise
sowohl α-ANPs vom Menschen als auch von der Ratte.
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Das Hybridom KY-ANP-II, das den erfindungsgemäßen
monoclonalen Antikörper KY-ANP-II produziert, ist am 2. Febr.
1988 unter dem Namen des Maus-Hybridoms KY-ANP-II, Bikoken
Joki Nr. 1695 (FERM BP-1695), in Übereinstimmung mit dem
Budapester Vertrag beim Fermentation Research Institute,
Agency of the Industrial Science & Technology, Higashi 1-1-3,
Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan, hinterlegt worden.
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Als Immuntest unter Verwendung des erfindungsgemäßen
monoclonalen Antikörpers KY-ANP-II kann der einen einzigen
Antikörper verwendende RIA oder der Sandwich-EIA erwähnt
werden. Hinsichtlich des RIA ist ein kompetitives Verfahren
erwähnenswert, in dem, wie in dem hier nachstehend
beschriebenen Beispiel gezeigt, eine zu testende Probe oder ein
Standard-α-ANP und eine bekannte Menge von Isotop-markiertem α-
ANP an den Antikörper kompetitiv binden können und in dem die
an den Antikörper gebundene Radioaktivität gemessen wird.
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Der Sandwich-EIA wird unter Verwendung des Antikörpers
KY-ANP-II in Kombination mit einem weiteren Antikörper,
beispielsweise dem vorstehend beschriebenen, den C-Terminus von
α-ANP erkennenden Antiserum CR-3, in der nachstehend
beschriebenen Weise durchgeführt.
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Als feste Phase zur Immobilisierung des Antikörpers
können Träger verwendet werden, wie Glas- oder Plastikperlen
oder Kugeln, Röhrchen und Platten, die im Handel erhältlich
sind und üblicherweise in Immuntests als Träger für eine
Antigen-Antikörper-Reaktion verwendet werden. Ein Antikörper,
der den N-Terminus oder C-Terminus von α-ANP erkennt, kann an
jeden beliebigen dieser Träger adsorbiert werden. Die
Adsorption wird üblicherweise durchgeführt, indem dem Antikörper
über Nacht bei Raumtemperatur in einem Phosphatpuffer bei
einem pH-Wert von 6 bis 10, vorzugsweise bei etwa neutralem
pH-Wert, ein Kontakt mit dem Träger ermöglicht wird. Der
Träger, auf dem der Antikörper adsorbiert ist, wird in einer
kalten Umgebung in Gegenwart eines antiseptischen Wirkstoffs,
beispielsweise Natriumazid, gelagert.
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Im vorstehend beschriebenen Verfahren können sowohl
ein monoclonaler Antikörper als auch ein polyclonaler
Antikörper verwendet werden. Die Trennung und Reinigung des im
vorstehend beschriebenen Verfahren zu verwendenden
Antikörpers können in der nachstehend beschriebenen Weise
durchgeführt werden.
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Ascitesflüssigkeit oder Antiserum, das den Antikörper
enthält, werden mit Natriumsulfat fraktioniert und
anschließend durch eine DEAE-Cellulosesäule geleitet, wodurch IgG
erhalten wird. Das so erhaltene IgG wird mit Pepsin gespalten,
um das F(ab')2-Fragment herzustellen, das anschließend mit 2-
Mercaptoethylamin reduziert wird, um das gewünschte anti-α-
hANP-Fab' zu erhalten. Die Herstellung von Fab' aus IgG ist
in J. Immunoassay 4 (1983), 209-327, genau beschrieben, und
das gleiche Verfahren kann bei der vorliegenden Erfindung
verwendet werden.
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Alkalische Phosphatase, β-D-Galactosidase, Peroxidase,
Glucose-Oxidase, etc. können als Enzyme zur Markierung des
Antikörpers verwendet werden. In der vorliegenden Erfindung
wird jedoch die Verwendung der Meerrettich-Peroxidase
besonders bevorzugt. Als Brücken-bildender Wirkstoff, der zur
Konjugation des Enzyms mit dem Antikörper verwendet wird,
können N,N'-o-Phenylendimaleimid,
N-Succinimid-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexanoat, N-Succinimid-6-maleimidohexanoat, N-
Succinimid-3-(2-pyridyldithio) -propionat, 4,4'-Dithiopyridin
und weitere bekannte Wirkstoffe verwendet werden. Die
Umsetzung des Brücken-bildenden Wirkstoffs mit dem Enzym und
dem Antikörper kann gemäß üblicher Verfahren mit einer je
nach der Natur des bestimmten Brücken-bildenden Wirkstoffs
erforderlichen Modifikation durchgeführt werden.
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Wie der vorstehenden Beschreibung entnommen werden
kann, können Fragmente eines geeigneten Antikörpers,
beispielsweise Fab', Fab und F(ab')2, anstelle des eigentlichen
Antikörpers verwendet werden. Ferner kann der Enzym-markierte
Antikörper polyclonal oder ein monoclonaler Antikörper sein.
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Die Reinigung des durch die Verwendung des vorstehend
beschriebenen Brücken-bildenden Wirkstoffs erhaltenen
Enzymmarkierten Antikörpers durch Affinitätschromatographie
liefert ein Immuntestsystem mit erhöhter Empfindlichkeit.
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Der gereinigte Enzym-markierte Antikörper wird unter
Zusatz eines Stabilisators, beispielsweise von Thimerosal
oder Glycerin, oder nach einer Lyophilisierung in einer
kalten und dunklen Umgebung aufbewahrt.
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Bei der Herstellung der vorstehend beschriebenen
Immuntest-Reagenzien wird entweder ein den N-Terminus von α-
hANP erkennender Antikörper immobilisiert, während ein den
CTerminus erkennender Antikörper mit einem Enzym markiert
wird, oder ein den C-Terminus erkennender Antikörper wird
immobilisiert, während ein den N-Terminus erkennender
Antikörper mit einem Enzym markiert wird. Da die Immobilisierung
eines Antikörpers üblicherweise eine große Menge Antikörper
erfordert, wird die Immobilisierung eines mono-clonalen
Antikörpers bevorzugt, beispielsweise des erfindungsgemäßen
KY-ANP-II, der ständig in großer Menge erhalten werden kann.
Ein aus Antiserum hergestellter polyclonaler Antikörper kann
jedoch ebenfalls problemlos verwendet werden.
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Der Antikörper, der mit dem Enzym markiert werden
soll, kann ebenfalls entweder ein monoclonaler Antikörper
oder ein polyclonaler Antikörper sein, vorausgesetzt, daß der
Antikörper eine andere Stelle als der immobilisierte
Antikörper erkennt. Beispielsweise kann der erfindungsgemäße KY-
ANP-II als immobilisierter Antikörper verwendet werden,
während das vorstehend beschriebene Antiserum CR-3 als
Enzymmarkierter Antikörper verwendet wird und umgekehrt. Es können
auch ein den C-Terminus von α-hANP erkennender monoclonaler
Antikörper und ein den N-Terminus erkennendes Antiserum
verwendet werden.
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Zu den beigefügten Figuren:
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Fig. 1 stellt ein Scatchard-Diagramm der Bindung
zwischen [¹²&sup5;I]α-hANP und dem monoclonalen Antikörper KY-ANP-II
dar. KY-ANP-II enthaltende Ascitesflüssigkeit wurde 48 Std.
bei 4ºC mit [¹²&sup5;I]α-hANP (2,7 - 140 pM, 500 ul/Röhrchen)
inkubiert, und die spezifische Bindung wurde nach der Trennung
mit Dextran-beschichteter Holzkohle gemessen.
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Fig. 2 stellt eine übliche Standardkurve von α-hANP im
RIA, in dem KY-ANP-II verwendet wird, und die graphische
Darstellung der Kreuzreaktion von verwandten Peptiden dar.
[¹²&sup5;I]α-hANP und Standard-α-hANP oder verwandte Peptide
wurden in unterschiedlichen Konzentrationen 24 Std. bei 4ºC mit
KY-ANP-II inkubiert. Die verwendeten Symbole haben die
nachstehend
angegebenen Bedeutungen: α-hANP, α-rANP, α-
rANP(3-28), α-hANP(4-28), α-rANP(4-28), α-hANP(5-28), α-
rANP(5-28), α-ANP(17-28), α-ANP(1-11) und α-ANP(1-6).
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Das nachstehend beschriebene Beispiel veranschaulicht
und beschreibt die hier beschriebene Erfindung genauer. Der
Schutzbereich der Erfindung wird durch das nachstehend
beschriebene Beispiel nicht eingeschränkt.
Beispiel
Herstellung des Hybridoms
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Synthetisches α-hANP (1,5 mg) und Rinder-Thyroglobulin
(5,4 mg) wurden in 2 ml destilliertem Wasser gelöst. Dieser
Lösung wurde über einen Zeitraum von 10 Min. bei
Raumtemperatur tropfenweise eine Lösung von 30 mg 1-Ethyl-3-(3-
dimethylaminopropyl)carbodiimid in 1 ml destilliertem Wasser
zugesetzt, wonach das Gemisch 24 Std. bei Raumtemperatur
gerührt wurde. Das Gemisch wurde anschließend über einen
Zeitraum von 3 Tagen sechsmal gegen 3 l destilliertes Wasser
dialysiert. Das Dialysat wurde in 5 Teile aufgeteilt, die bei
-20ºC aufbewahrt wurden (Vgl. Biochem. Biophys. Res. Commun.
124 (1984) , 815-821)
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Jeder der aufbewahrten Lösungen (die jeweils 300 ug α-
hANP enthielten) wurde destilliertes Wasser bis zu einem
Endvolumen von 1,2 ml zugesetzt, das anschließend in 1,2 ml
komplettem Freundschem Adjuvans suspendiert wurde. Eine Dosis
von etwa 2 ml wurde intraperitoneal und subcutan in 10
weibliche BALB/c-Mäuse (200 ul pro Tier) injiziert. Die Tiere
erhielten 3 Wochen später in der gleichen Weise eine
Auffrischungsimpfung. Anschließend wurden in Abständen von 4
Wochen 3 Mal 10 bis 30 ug in komplettem Freundschem Adjuvans
emulgiertes α-hANP subcutan injiziert. Vier Tage nach der
letzten Immunisierung mit einer intravenösen Injektion von 10
ug α-hANP wurden die Milzen der Mäuse entnommen, die
anschließend zur Zellfusion verwendet wurden.
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Die Milzzellen (6 x 10&sup7; Zellen) und Myelomzellen (X63-
Ag8.653, 10&sup7; Zellen) wurden in Dulbecco-Medium (DMEM)
vermischt und das Gemisch 5 Min. bei 4ºC mit 1500 Upm
zentrifugiert. Die erhaltenen Pellets wurden durch Erwärmung auf 37ºC
abgelöst und anschließend über einen Zeitraum von 1 Min. bei
37ºC 1 ml 50 % PEG 4000 (PEG 1g/DMEM 1 ml) tropfenweise
zugesetzt. Das Gemisch wurde 2 Min. bei 37ºC stehengelassen,
wonach es über einen Zeitraum von 5 Min. bei 37ºC durch Zusatz
von 10 ml DMEM tropfenweise verdünnt wurde. Das Gemisch wurde
anschließend bei 4ºC durch Zentrifugation mit 15 % FCS
enthaltendem DMEM gewaschen.
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Nach der vorstehend beschriebenen Zellfusion wurden
die erhaltenen Hybridome in 15 % fötales Kälberserum
enthaltendem HAT-Medium selektiert. Während der Züchtung der
Hybridome wurde durch RIA unter Verwendung von [¹²&sup5;I]α-hANP
periodisch die Antikörperproduktion im Kulturmedium
untersucht. Ein Wachstum von Hybridomen wurde in fast allen
Vertiefungen beobachtet, wovon 8 % (29 Vertiefungen)
Antikörper produzierten. Die Antikörper produzierenden Zellen
wurden zweimal unter Verwendung von Maus-Thymuszellen als
Feeder-Zellen-Schicht durch das Verfahren der Grenzverdünnung
cloniert. Ein Clon, der einen Antikörper mit der stärksten
Reaktivität produzierte KY-ANP-II, wurde etabliert. Zur
Untersuchung der Eigenschaften von KY-ANP-II wurde der Clon
weiter gezüchtet.
Herstellung des monoclonalen Antikörpers
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BALB/c-Mäuse wurden zweimal in Abständen von 1 bis 2
Wochen durch intraperitoneale Injektion von 0,5 ml
Pristan/Tier vorbehandelt. Jeder Maus wurden 5 x 10&sup6; in 200 ul
DMEM suspendierte Zellen des Hybridoms KY-ANP-II
intraperitoneal injiziert. Die Ascitesflüssigkeit der Mäuse wurde
durch eine Protein A-Sepharose-CL-4B-Säule gereinigt, um den
monoclonalen Antikörper KY-ANP-II zu erhalten.
Eigenschaften des monoclonalen Antikörpers
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Der Isotyp des vorstehend erhaltenen monoclonalen
Antikörpers wurde durch das Ouchterlony-Verfahren bestimmt
("Mouse Monoclonal Typing Kit", Miles). Die
Affinitätskonstante wurde durch das Scatchard-Verfahren unter
Verwendung des nachstehend beschriebenen RIA bestimmt. Die
Spezifität des Antikörpers wurde durch Ermittlung der
Kreuzreaktivität mit verschiedenen ANP-verwandten Peptiden durch einen
RIA analysiert.
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Es wurde durch das Ouchterlony-Verfahren festgestellt,
daß der erhaltene monoclonale Antikörper zur Unterklasse IgG&sub1;
gehört. Die durch das Scatchard-Verfahren gemessene
Affinitätskonstante zeigte eine hohe Affinität, wobei der Ka-Wert
gegen α-hANP 6,6 x 10¹&sup0; M&supmin;¹ war (Vgl. Fig. 1).
RIA
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Der RIA wurde unter Verwendung des monoclonalen
Antikörpers gemäß dem in Biochem. Biophys. Res. Commun. 124
(1984), 815-821, beschriebenen Verfahren durchgeführt, das
die Verwendung eines polyclonalen Antiserums einschließt.
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Die verwendeten Reagenzien wurden immer in 0,1 M
Phosphatpufferlösung (pH 7,0) gelöst, die 0,5 % Gelatine
(Merck), 1 mM Na&sub2;EDTA, 0,2 mM Cystin, 0,1 % Triton X-100 und
0,01 % Merthiolat enthielt.
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Ein Gemisch aus 100 ul verdünnter (1:107), KY-ANP-II
enthaltender Ascites-Lösung, 100 ul einer Probe oder
verdünnten Lösung von Standard-α-ANP, 200 ul des vorstehend
beschriebenen Puffers und 100 ul [¹²&sup5;I]α-hANP (etwa 8000 Cpm)
wurden 48 Std. bei 4ºC reagieren gelassen. Das
Reaktionsgemisch wurde anschließend zugesetzt, mit 1 ml
Dextran-beschichteter Holzkohle vermischt und 5 Min. bei 4ºC reagieren
gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend 30 Min. bei
4ºC mit 3000 Upm zentrifugiert und die Radioaktivität des
Überstands durch einen γ-Zähler gemessen, wodurch der
Antikörpertiter
der verdünnten Lösung der Probe erhalten wurde.
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Die spezifische Aktivität von [¹²&sup5;I]α-hANP war 400 bis 800
uCi/ug. Bei der Verwendung der Ascitesflüssigkeiten der Mäuse
nach einer Verdünnung auf 1:10&sup7; war die Bindungsrate mit
einem Tracer etwa 30 %.
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Das vorstehend beschriebene ¹²&sup5;I-α-hANP wurde durch
das Chloramin T-Verfahren hergestellt. Das heißt, α-hANP (1
ug) wurde mit Na¹²&sup5;I (1 mCi) vermischt, dem 10 ul Chloramin T
(5,25 mg/ml) zugesetzt wurden. Zehn Sekunden danach wurden 20
ul Natriumpyrosulfit (4,5 mg/ml) zugesetzt. Dem Gemisch wurde
außerdem 1 ml 2 % Gelatine zugesetzt und anschließend das
erhaltene ¹²&sup5;I-α-hANP mit Sep-Pak C18 (Waters Co., Ltd.)
gereinigt.
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Die Standardkurve von α-hANP, die unter Verwendung des
erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörpers im RIA bestimmt
wurde, und die Kreuzreaktivität mit verwandten Peptiden sind
in Fig. 2 dargestellt. Der RIA zeigte die Kreuzreaktivität
mit α-rANP bei einer äquimolaren Menge, während er nur eine
geringe Reaktivität mit α-rANP[3-28] und α-ANP[1-11] und
praktisch keine Kreuzreaktivität mit α-ANP[1-6], α-ANP[4-28],
α-ANP[5-28] und α-ANP[17-28] zeigte. Der RIA zeigte eine 50
%ige und 20 %ige Kreuzreaktivität mit menschlichem, vom
Vorhof stammendem γ-hANP bzw. synthetischem β-hANP (Vgl.
Tabelle 1).
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Die Nachweisgrenze für α-hANP in der in Fig. 2
dargestellten Standardkurve von α-hANP war 0,8 fmol (2,5
pg)/Röhrchen und IC&sub5;&sub0; 8 fmol (25 pg)/Röhrchen. Die
Abweichungen in den Tests und zwischen den Tests in diesem RIA
waren 10 % oder weniger.
Tabelle 1
Kreuzreaktivität von ANP-verwandten Peptiden mit KY-ANP-II im RIA
Peptid
Kreuzaktivität (%) *
α-hANP
α-rANP
β-hANP
γ-hANP
* Werte sind auf einer molekularen Basis angegeben
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Da der erfindungsgemäße KY-ANP-II sowohl α-rANP als
auch α-hANP erkennt, ist der Antikörper nicht zur Messung
von menslichem ANP sondern auch von ANP von verschiedenen
Versuchtieren, beispielsweise von Ratten und Mäusen,
geeignet. Da KY-ANP-II den N-Terminus von α-ANP erkennt, kann
mit dem Antikörper α-ANP in Blutkreislauf spezifisch gemessen
werden. Die Etablierung des Verfahrens zur Messung von α-hANP
unter Verwendung des erfindungsgemäßen monoclonalen
Antikörpers ermöglicht eine leichte und genaue Diagnose von
verschiedenen Krankheiten, die von einer Abnormalität im
Gleichgewicht der Körperflüssigkeit, beispielsweise durch
Herzerkrankungen, Nierenerkrankungen, Hypertonie (essentiell
uns sekundär), ödematöse Erkrankungen (Cirrrhosen, Nephrosen,
kataplektisches Ödem, etc.)) und Dehydratation, begleitet
sind, und ein Verfolgen der Behandlungsergebnisse.