DE602004003798T2

DE602004003798T2 - Standard für immunhistochemie, immunzytologie und molekulare zytogenetika

Info

Publication number: DE602004003798T2
Application number: DE602004003798T
Authority: DE
Inventors: Lars Winther
Original assignee: Dako Denmark ApS
Current assignee: Dako Denmark ApS
Priority date: 2003-02-27
Filing date: 2004-02-27
Publication date: 2007-10-11
Anticipated expiration: 2024-02-28
Also published as: DE602004003798D1; WO2004077057A8; EP1597578A1; ATE349010T1; WO2004077057A1; EP1597578B1

Description

Gebiet
Diese Erfindung betrifft die Gebiete der Zytologie und Histologie. Insbesondere betrifft die Erfindung die Gebiete der Immunhistochemie und molekularen Zytogenetik, insbesondere die Bereitstellung von Standards für das Messen des Vorliegens oder der Menge von detektierbaren Einheiten in Zellen, Geweben und Organen.
Hintergrund
Histologische und zytologische Techniken sind verwendet worden, um Biopsien und andere Gewebeproben als ein Hilfsmittel für die medizinische Diagnose zu analysieren. Zytologie ist die Untersuchung der Struktur von allen normalen und abnormalen Bestandteilen von Zellen und der Veränderungen, Bewegungen und Umwandlungen von solchen Bestandteilen. Zellen werden direkt im lebenden Zustand untersucht oder werden getötet (fixiert) und durch beispielsweise Einbetten, Erstellen von Schnitten oder Färbung für eine Untersuchung in Hellfeld- oder in Elektronenmikroskopen präpariert.
Eine wohlbekannte Zytologieprozedur ist die medizinische Papanicolaou-Testprozedur, die verwendet wird, um eine Krebserkrankung des Gebärmutterhalses zu detektieren. Eine Ausschabung, ein Bürstenabstrich oder ein Schmierabstrich wird von der Oberfläche der Vagina oder der Gebärmutter gehommen und wird auf einem Objektträger präpariert und für eine mikroskopische Untersuchung und zytologische Analyse gefärbt. Das Erscheinungsbild der Zellen bestimmt, ob sie normal, verdächtig oder krebsartig sind.
Histologie ist die Untersuchung von Gruppen von spezialisierten Zellen, welche als Gewebe bezeichnet werden, die in den meisten vielzelligen Pflanzen und Tieren gefunden werden. Eine histologische Untersuchung umfasst die Untersuchung von Gewebetod und -regeneration und die Reaktion von Gewebe auf Schädigung oder eindringende Organismen. Da normales Gewebe ein charakteristisches Erscheinungsbild aufweist, wird eine histologische Untersuchung oftmals verwendet, um erkranktes Gewebe zu identifizieren. Immunhistochemie-, IHC, und in situ-Hybridisierungs-, ISH, -Analysen sind nützliche Werkzeuge bei einer histologischen Diagnose und der Untersuchung der Gewebemorphologie.
Sowohl Immunhistochemie (IHC) als auch in situ-Hybridisierung (ISH) trachten danach, eine detektierbare Einheit in einer Probe zu detektieren, indem spezifische Bindemittel, die in der Lage sind, an die detektierbare Einheit zu binden, verwendet werden. Bei der Immunhistochemie (IHC) umfasst das spezifische Bindemittel einen Antikörper und die detektierbare Einheit umfasst ein Polypeptid, Protein oder Epitop, welches darin enthalten ist. Bei der in situ-Hybridisierung (ISH) umfasst die detektierbare Einheit eine Nukleinsäure (einschließlich DNA und RNA) in der Probe und das spezifische Bindemittel umfasst eine Sonde, wie eine Nukleinsäuresonde. Die zunehmende Verfügbarkeit solcher Antikörper und Sonden könnte zu einer differenziellen Diagnose von erkranktem und normalem Gewebe beitragen. In situ-Hybridisierungs- und Immunhistochemie-Methoden werden detailliert in Harlow und Lane (Antibodies: A Laboratory Manual) beschrieben.
IHC- und ISH-Techniken erfordern eine Reihe von Behandlungsschritten, die an einem auf einen Glasobjektträger oder einen anderen ebenen Träger aufgebrachten Gewebeschnitt ausgeführt werden, um durch selektive Färbung bestimmte morphologische Indikatoren von Erkrankungszuständen hervorzuheben.
Dementsprechend wird beispielsweise bei IHC eine Probe von einem Individuum genommen, fixiert und Antikörpern gegen das Antigen von Interesse ausgesetzt. Es können weitere Verarbeitungsschritte, beispielsweise Antigengewinnung (Antigen-Retrieval), Aussetzen an bzw. Exponieren gegenüber sekundären Antikörpern (welche üblicherweise an ein geeignetes Enzym gekoppelt sind), Waschen und Aussetzen an bzw. Exponieren gegenüber chromogenen Enzymsubstraten u.s.w., erforderlich sein, um das Muster der Antigenbindung zu enthüllen. Es gibt im Allgemeinen zwei Kategorien von histologischen Materialien: (a) Präparate, welche frische Gewebe und/oder Zellen umfassen, welche im Allgemeinen nicht mit auf Aldehyd basierenden Fixiermitteln fixiert werden, und (b) fixierte und eingebettete Gewebeproben, oftmals Archivmaterial.
Bei ISH wird eine Probe von einem Individuum genommen, fixiert und gegenüber einer Sonde gegen die Nukleinsäure von Interesse exponiert. Die detektierbare Einheit umfasst typischerweise eine detektierbare Nukleinsäure, wie DNA und RNA, einschließlich mRNA. Die Detektion von DNA/RNA-Konzentrationen zeigt das Expressionsniveau eines bestimmten Gens an und kann daher verwendet werden, um einen Zustand (wie einen Erkrankungszustand) einer Zelle, eines Gewebes, eines Organs oder eines Organismus zu detektieren. Die detektierbare Einheit, die eine Nukleinsäure ist, wird typischerweise denaturiert, um Bindungsstellen zu exponieren. Die Sonde ist typischerweise eine doppel- oder einzelsträngige Nukleinsäure, wie DNA oder RNA, und wird unter Verwendung von radioaktiven Markierungen, wie ³¹P, ³³P oder ³²S, oder nicht-radioaktiv unter Verwendung von Markierungen, wie Digoxigenin, oder von fluoreszierenden Markierungen, von denen sehr viele in diesem Fachgebiet bekannt sind, markiert.
Es sind viele Verfahren zum Fixieren und Einbetten von Gewebeproben bekannt, beispielsweise eine Alkoholfixierung. Jedoch setzt die am weitesten verbreitet verwendete Fixier/Einbettungstechnik eine Formalin-Fixierung und nachfolgende Paraffin-Einbettung, FFPE, ein. Eine „typische" FFPE-IHC-Färbeprozedur kann die Schritte umfassen: Schneiden und Zuschneiden von Gewebe, Fixierung, Dehydratisierung, Paraffin-Infiltration, Schneiden in dünne Schnitte, Aufbringen auf Glas-Objektträger, Backen, Entparaffinierung, Rehydratisierung, Antigengewinnung (Antigen-Retrieval), Blockierschritte, Auftragen von primärem Antikörper, Waschen, Auftragen von sekundärer Antikörper-Enzymkonjugat, Waschen, Auftragen von Enzym-Chromogensubstrat, Waschen, Gegenfärbung (Kontrastfärbung), Abdecken mit Deckgläschen und Untersuchung unter dem Mikroskop. Ähnliche Schritte finden bei einer ISH statt. Die Menge des relevanten Antigens oder einer anderen detektierbaren Einheit, wie einer Nukleinsäure, die durch solche Techniken detektiert wird, wird dann bestimmt, um zu bestimmen, ob sie über einem bestimmten vorab festgelegten minimalen Schwellenwert liegt und dementsprechend diagnostisch relevant ist. Dann kann eine geeignete Behandlung für das Individuum geplant werden, sofern erforderlich.
Ein Beispiel für eine immunhistochemische Färbung für eine Diagnose ist in 1 gezeigt, wo Gewebe hinsichtlich des Brustkrebs-Antigens HER2 gefärbt sind. Gewebe, die das Antigen nicht exprimieren, werden durch einen anti-HER2-Antikörper nicht substantiell gefärbt (1A), während jene, die das Protein tatsächlich exprimieren, in einem substantiellen Ausmaß durch einen anti-HER2-Antikörper gefärbt werden (1D).
Jedoch entsteht ein Hauptproblem bei derartigen IHC- und ISH-Techniken aus der Notwendigkeit, eine genaue Bestimmung vorzunehmen, ob Zellen in einem Gewebe, welches untersucht wird, das Antigen oder eine detektierbare Einheit, wie eine Nukleinsäure, in einem diagnostisch signifikanten Ausmaß exprimieren oder nicht (d.h. ob die Zellen „positiv" oder „negativ" hinsichtlich einer Expression eines Antigens sind). Es gibt ein allgemeines Fehlen von Standardisierung von Labortechniken, was zu dem Erfordernis einer subjektiven Beurteilung der Ergebnisse führt. Sogar kleine verfahrensbezogene Unterschiede können das endgültige Färbungsergebnis beeinflussen und die abschließende Interpretation der Färbung der gleichen Zellpopulation ist möglicherweise von einem Labor zum nächsten nicht genau die gleiche. Sogar wenn interne Kontrollen (einschließlich positiver oder negativer Kontrollen oder beide) in die Prozeduren mit aufgenommen werden, werden Variationen bei den Vorbehandlungs- und Färbeprotokollen zwischen verschiedenen Personen, die die Arbeiten ausführen, Variationen bei der internen Kontrolle verursachen. Andere analytische Fehlerquellen umfassen die Qualität und Quantität der Reagenzien, Wirksamkeit der Antigengewinnung (Antigen-Retrieval) und Unterschiede bei der Instrumentierung.
Diese Probleme behindern die Bestimmung von neuen, alternativen, prognostischen Faktoren, was zu widersprüchlichen Ergebnissen für die meisten der Prognosefaktoren in Bezug auf deren prognostischen Wert führt.
Auf die Notwendigkeit einer qualitativen Einstufung und Standardisierung ist im Stand der Technik auf verschiedene Weisen reagiert worden. Beispielsweise kann ein diagnostischer Kit Mikrophotographien von verschiedenen Sätzen von Zellen bei verschiedenen Anfärbungsgraden enthalten. Der Kit enthält eine Angabe, dass ein bestimmter Satz von Zellen den Ausschluss- oder Schwellenwertpunkt darstellt, wobei Zellen, die mit jener Anfärbung übereinstimmen oder diese übertreffen, „positiv" sind, wobei jene Zellen, die weniger Anfärbung aufweisen, „negativ" sind. Raffiniertere Kits können aktuelle Proben von Geweben oder Zellen, die bereits gefärbt sind, auf Kontrollobjektträgern enthalten. Beispielsweise kann ein Kit mehrere Referenz-Objektträger mit Schnitten von FFPE-Brustkarzinom-Zelllinien, die unterschiedliche Niveaus einer Brust-spezifischen Proteinexpression repräsentieren, umfassen. Ein Beispiel für ein solches qualitatives Einstufungssystem für das HER2-Antigen ist in 1 gezeigt, wo die Referenzfärbungsniveaus von 0 oder 1+ als negativ angesehen werden (1A bzw. 1B), während jene von 2+ oder 3+ als positiv hinsichtlich jenem Antigen angesehen werden (1C bzw. 1D).
Schriftliche Beschreibungen, die das Muster oder die Verteilung einer Färbung betreffen, können mit aufgenommen werden, um die Analyse zu unterstützen. Beispielsweise: Score 0 (negativ): es wird keine Färbung beobachtet oder es wird eine Membranfärbung bei weniger als 10% der Tumorzellen beobachtet. Score 1+ (negativ): Es wird bei mehr als 10% der Tumorzellen eine schwache oder kaum wahrnehmbare Membranfärbung detektiert. Die Zellen werden nur in einem Teil der Membran gefärbt. Score 2+ (schwach positiv): es wird eine schwache bis moderate vollständige Membranfärbung bei mehr als 10% der Tumorzellen beobachtet. Score 3+ (stark positiv): es wird eine starke vollständige Membranfärbung bei mehr als 10% der Tumorzellen beobachtet.
Obwohl es jedoch mit solchen Kits möglich ist, die Referenzfärbungsniveaus zu ermitteln, besteht eine beträchtliche Schwierigkeit bei der Etablierung einer konsistenten Qualität der Färbung der Proben selbst. Dies resultiert aus verschiedenen Faktoren, welche inhomogenes Gewebematerial, die arbeitsaufwändige und komplexe Natur der Vorgehensweisen, die Variabilität der Reagenzienqualität (einschließlich Antikörper/Sonden-Affinität und -Spezifität) und die subjektive Natur der Interpretation, die durch die Person, die die Arbeiten ausführt, vorgenommen wird, umfassen. Darüber hinaus umfassen andere Variabilitätsquellen bei einer Probenfärbung die Bedingungen, unter welchen Gewebeproben gesammelt, verarbeitet und aufbewahrt werden, die Variabilität bei den Epitop-Retrieval-Prozeduren und der Enzym-katalysierten Chromogen-Präzipitaton.
Als ein Versuch, diese Probleme zu lösen, ist im Stand der Technik bekannt, Referenzsätze von ungefärbten Geweben oder Zellen mit unterschiedlichen Expressionsniveaus des relevanten Antigens (oder der relevanten Nukleinsäure) in einen diagnostische Kit mit aufzunehmen. Die Zellen, die die Referenzen bilden, können Biopsieproben (d.h. Gewebeproben) von bekanntermaßen erkrankten und nicht-erkrankten Personen oder Individuen, die Antigen oder relevante detektierbare Nukleinsäure in höheren Konzentrationen als normal exprimieren, aber nicht klinisch erkrankt sind, umfassen. Darüber hinaus können auch Gewebekulturzellen, die mit Expressionsvektoren transfiziert sein können, um es diesen zu ermöglichen, das Antigen oder die detektierbare Nukleinsäure in unterschiedlichen Konzentrationen zu exprimieren, als Referenzstandards verwendet werden. Die Referenzsätze umfassen Objektträger mit fixierten und in Formalin eingebetteten Zellen, sind aber ansonsten ungefärbt, und die in Paraffin eingebettet sind. Die Objektträger werden dann parallel mit der Probe verarbeitet, um das Niveau und Muster der Antigen- (oder detektierbare Nukleinsäure)-Färbung sichtbar zu machen. Schließlich wird die Probe mit dem Referenzsatz verglichen, um zu bestimmen, ob Protein- oder Nukleinsäure-Expressionsniveaus diagnostisch signifikant sind.
Beispiele von Zelllinien, die gegenwärtig als Referenzzellen in der Zytochemie verwendet werden, umfassen die HER2-positive Zelllinie SK-BR-3, die Östrogenrezeptor (ER)-positive und Progesteronrezeptor (PR)-negative und p53-positive Zelllinie HCC70, die PR-positive und ER-negative Zelllinie HCC2218, die Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR)-positive Zelllinie NCl-H23, die Prostataspezifisches Antigen (PSA)- und Androgenrezeptor-positive Zelllinie MDA PCA 2b und die Zytokeratin 19- und die p53-positive Zelllinie HCC38. Durch verschiedene Organisationen sind viele humane und nicht-humane Zelllinien erhältlich.
Bei solchen Referenzstandards gibt es jedoch ein Problem, indem es notwendig ist, spezifisch Gewebe und Zellen zu identifizieren, die Antigen oder detektierbare Nukleinsäure in den verschiedenen Klassifizierungsniveaus exprimieren, und diese zur Verwendung zu erhalten. Wenn Gewebekulturzellen verwendet werden, ist es erforderlich, das fragliche Gen zuerst zu klonieren, dann geeignete Expressionsvektoren zu gestalten und zu konstruieren. Diese Vektoren werden dann benötigt, um damit Zellen zu transfizieren, und die Expression des Gens muss in dem richtigen Ausmaß reguliert werden. Wenn die Zelllinien kontinuierlich und in vielen Laboratorien kultiviert werden, kann sich das Niveau der Proteinexpression mit der Zeit verändern und möglicherweise von Labor zu Labor nicht die gleiche Protein- oder mRNA-Expression aufweisen. Sowohl vorübergehend als auch stabile transfizierte Zelllinien sind während einer Vermehrung labil, was dazu führt, dass sich die Expression von Zielen verändert und sich folglich Anfärbungsniveaus und -muster verändern.
Darüber hinaus gibt es Probleme mit der Notwendigkeit, potentiell gefährliches biologisches Material in die diagnostischen Kits aufzunehmen. Behördliche und ethische Probleme sind mit der Verwendung von Materialien von humaner Herkunft verbunden; solches humanes Material ist nicht leicht in großen Mengen von einzelnen Quellen zu erhalten und müssen möglicherweise gepoolt werden, was zu weiterer Variabilität führt.
Andere bekannte Techniken umfassen die Verwendung von Referenz-Punkten bzw. kleinen Referenz-Flecken (Dots), hergestellt aus Polymergelen, die an Glas-Objektträger angeheftet sind. Das Polymermaterial enthält relevante Epitope, die angefärbt werden können. Die Qualitätskontrollvorrichtungen, die in WO 00/62064 und Sompuram et al., Clin. Chem., 48 (3), S. 410, 2002, beschrieben werden, setzen Surrogat-Analysenziele ein, welche synthetische Peptide umfassen, die der 3D-Konformation des Epitops, an welches ein Antikörper bindet, ähneln, die auf eine obere Oberfläche eines Glas-Objektträgers aufgebracht und daran gekoppelt sind.
EP1158047 beschreibt beschreibt eine DNA-Mikroarray (DNA-Mikroanordnung) oder einen DNA-Chip, welcher) eine Planare zweidimensionale fluchtende Anordnung von immobilisierten Nukleinsäuren von hoher Dichte umfasst. EP1158047 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung einer solchen Mikroarray, indem die Nukleinsäuren an Fasern immobilisiert werden, eine fluchtende Faser-Anordnung hergestellt wird und eine „Scheibe" ausgehend von der fluchtenden Faser-Anordnung hergestellt wird. Die Mikroarrays können für eine Hybridisierung verwendet werden, um Substanzen in Proben zu detektieren, und speziell für eine Genomanalyse. In anderen Worten werden die an den Fasern immobilisierten Nukleinsäuren als Sonden verwendet und EP 1158047 beschäftigt sich nicht mit den Mengen der an der Faser immobilisierten Nukleinsäuren. Speziell offenbart EP1158047 weder noch legt diese nahe, dass es möglich ist, die Mikroarrays zu verwenden, um fixierte oder vorab festgelegte Mengen der Nukleinsäuren, die an den Fasern immobilisiert sind, oder davon sich ableitende Signalniveaus zum Zweck einer Klassifizierung oder Standardisierung zu etablieren.
EP 0345953 offenbart eine Test/Kontrollprozedur und Material, um die Standardisierung von Immunfärbungstechniken und die Auswertung von deren Ergebnissen zu vereinfachen. An Pellets eines absorbierenden Gels, wie Agargel, lässt man individuelle spezifische Konzentrationen eines Antigens von Interesse adsorbieren. Die adsorbierten Antigene sind an die individuellen Pellets wie beispielsweise durch Fixierung oder durch Einschließen in eine diffusionshemmende Barriere gebunden und die Pellets werden in individuelle Vertiefungen in einem Block des Gels in einer Weise, damit sie darin integriert werden, eingebracht. Der Block kann dann den gleichen Vorbereitungsroutinen wie eine Gewebeprobe unterworfen, zu Schnitten geschnitten und wie die Probe auf Objektträger aufgebracht bzw. eingedeckt und dann einer Immunfärbung durch die gleiche Routine wie die Probenschnitte unterworfen werden, um eine gültige Basis für eine Auswertung der gefärbten Probenschnitte durch Vergleich mit den gefärbten Gelblockschnitten bereitzustellen. Diese Referenzproben ähneln jedoch nicht der Gestalt und Größe einer Zelle.
Zusammenfassung
Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung stellen wir ein Verfahren bereit, umfassend: (a) Bereitstellen eines Referenzstandards oder eines ebenen Schnitts davon, wobei der Referenzstandard umfasst: (i) ein Trägermedium; und (ii) eine Menge einer detektierbaren Einheit, die von dem Trägermedium getragen wird; wobei die detektierbare Einheit einen länglichen Pfad beschreibt, dessen Querschnittsprofil eine Größe zwischen 0,5 μm und 100 μm hat, wobei eine vorbestimmte Menge der detektierbaren Einheit in einem definierten Bereich in einem Querschnitt des Referenzstandards vorliegt; (b) Erhalten eines ersten Referenzsignals, welches das Vorliegen oder die Menge einer detektierbaren Einheit in dem Referenzstandard, dem ebenen Schnitt davon oder dem definierten Bereich anzeigt; (c) Bereitstellen einer biologischen Probe und Erhalten eines zweiten Signals, welches das Vorliegen oder die Menge der detektierbaren Einheit in der biologischen Probe oder einer Komponente davon anzeigt; und (d) Vergleichen des in (b) erhaltenen Referenzsignals mit dem in (c) erhaltenen zweiten Signal.
Es wird gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung ein Verfahren zum Erhalten einer Anzeige bezüglich des Vorliegens, der Menge oder der Konzentration einer detektierbaren Einheit in einer biologischen Probe gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung bereitgestellt, in welchem das Referenzsignal mit dem zweiten Signal verglichen wird, um das Vorliegen, die Menge oder die Konzentration der detektierbaren Einheit in der Probe zu bestimmen.
Der Referenzstandard oder der ebene Schnitt davon wird vorzugsweise dem oder den gleichen, vorzugsweise im Wesentlichen allen Stufe(n) bzw. Schritt(e) oder Bedingung(en) unterworfen wie die biologische Probe.
Der Referenzstandard oder der ebene Schnitt davon wird vorzugsweise durch eine oder mehrere, vorzugsweise alle der folgenden Stufen bzw. Schritte verarbeitet: Auflegen oder Aufbringen auf einen Objektträger, Backen, Entparaffinieren, Rehydratisieren, Antigengewinnung (Antigen-Retrieval), Blockieren, Aussetzen an oder gegenüber Antikörper, Aussetzen an oder gegenüber primären Antikörper, Aussetzen an oder gegenüber Nukleinsäuresonde, Waschen, Aussetzen an oder gegenüber sekundärem Antikörper-Enzym-Konjugat, Exposition an oder gegenüber Enzymsubstrat, Aussetzen an oder gegenüber Chromogensubstrat und Kontrast- oder Gegenfärbung.
Die detektierbare Einheit wird vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus: einem Hapten, einem biologisch aktiven Molekül, einem Antigen, einem Epitop, einem Protein, einem Polypeptid, einem Peptid, einem Antikörper, einer Nukleinsäure, einem Virus, einem virusartigen Partikel, einem Nukleotid, einem Ribonukleotid, einem Desoxyribonukleotid, einem modifizierten Desoxyribonukleotid, einem Heteroduplex, einem Nanopartikel, einem synthetischen Analogen eines Nukleotids, einem synthetischen Analogen eines Ribonukleotids, einem modifizierten Nukleotid, einem modifizierten Ribonukleotid, einer Aminosäure, einem Aminosäureanalogen, einer modifizierten Aminosäure, einem modifizierten Aminosäureanalogen, einem Steroid, einem Proteoglycan, einem Lipid, einem Kohlenhydrat, einem Farbstoff, einem diagnostisch relevanten Ziel, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: einem Antigen, einem Epitop, einem Peptid, einem Polypeptid, einem Protein, einer Nukleinsäure oder zwei oder mehreren oder (von) einer Mehrzahl von irgendwelchen der oben genannten oder Gemischen, Fusionen, Kombinationen oder Konjugate von zwei oder mehreren der oben genannten.
Die detektierbare Einheit umfasst vorzugsweise irgendeines oder mehrere von HER2-, ER-, PR-, p16-, Ki-67- und EGFR-Protein und diese kodierende Nukleinsäuren.
Das Verfahren umfasst vorzugsweise weiterhin die Bereitstellung eines zweiten Referenzstandards oder eines ebenen Schnitts davon, das Erhalten eines zweiten Referenzsignals, welches die Menge der detektierbaren Einheit in dem zweiten Referenzstandard, dem ebenen Schnitt davon oder dem definierten Bereich anzeigt; und das Vergleichen des in (c) erhaltenen zweiten Signals mit dem ersten Referenzsignal und dem zweiten Referenzsignal.
Das Vorliegen und/oder die Menge der detektierbaren Einheit kann vorzugsweise durch ein Bindemittel, vorzugsweise ein markiertes Bindemittel aufgedeckt bzw. nachgewiesen werden, welches vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: einem Antikörper, vorzugsweise einem Antikörper, der spezifisch an die detektierbare Einheit binden kann, einer Nukleinsäure, wie einer DNA oder einer RNA, vorzugsweise einer Nukleinsäure, die spezifisch an die detektierbare Einheit binden kann, einer Proteinnukleinsäure (PNA), einem Farbstoff, einem speziellen Färbemittel, Hämatoxylin-Eosin (N & E), Gomori-Methenaminsilber-Färbemittel (GMS), Periodic-Acid-Schift (PAS; Periodsäure-Schiff)-Färbemittel, Trichromblau (Trichrome Blue), Massons Trichrome, Preußischblau, Giemsa, Diff-Quik, Reticulum, Kongo-Rot (Congo Red), Alcian-Blau (Alcian Blue), Steiner, AFB, PAP, Gram, Mucikarmin, Verhoeff-van Gieson, Elastic, Carbol-Fuchsin und Golgi-Färbemitteln.
Das detektierbare Signal ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Strahlung, optischer Dichte, Reflexion, Radioaktivität, Fluoreszenz und enzymatischer Aktivität.
Vorzugsweise hat (a) der Referenzstandard die Form eines rechteckigen Kastens und hat die detektierbare Einheit die Form einer im Wesentlichen linearen Stange, die entlang oder im Wesentlichen parallel zu einer Längsachse des Referenzstandards angeordnet ist; oder liegt (b) der definierte Bereich in wenigstens einem anderen Querschnitt des Referenzstandards vor, welcher vorzugsweise eine ähnliche Menge der detektierbaren Einheit umfasst, oder ist (c) die detektierbare Einheit entlang des länglichen Pfads im Wesentlichen einheitlich verteilt oder liegt (d) die detektierbare Einheit in allen quer geführten ebenen Schnitten des Referenzstandards in im Wesentlichen demselben Bereich, derselben Menge oder Konzentration vor; oder irgendeine Kombination der obigen.
Das Trägermedium umfasst vorzugsweise ein Einbettungsmedium, in welches die detektierbare Einheit eingebettet ist, wobei das Einbettungsmedium vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: Eis, Wachs, Paraffin, Acrylharz, Methacrylharz, Epoxid, Epon, Araldit, Lowicryl, K4M und LR-Weiß (LR White) und Durcupan.
Die detektierbare Einheit ist vorzugsweise an eine längliche Faser, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: einer Polyamidfaser, einer Zellulosefaser, einer Polycarbamatfaser, einer Seidenfaser, einer Polyesterfaser, einer Nylonfaser, einer Rayonfaser und Gemischen davon, angefügt, vorzugsweise chemisch gekoppelt.
Die detektierbare Einheit ist sowohl in Kern- als auch Oberflächenabschnitten der Faser im Wesentlichen gleichmäßig verteilt. Alternativ oder zusätzlich liegt die detektierbare Einheit an Oberflächenabschnitten der Faser in größeren Mengen vor als in den Kernabschnitten, wobei vorzugsweise die Kernabschnitte der Faser im Wesentlichen keine detektierbare Einheit umfassen.
Die detektierbare Einheit ist vorzugsweise in einem länglichen Kanal in dem Einbettungsmedium gebildet. Vorzugsweise hat die Faser oder der Kanal im Wesentlichen über ihre bzw. seine gesamte Länge hinweg eine gleichmäßige Querschnittsfläche, wobei die Faser oder der Kanal vorzugsweise einen Durchmesser von zwischen etwa 0,5 μm bis 25 μm, bevorzugt zwischen 1,5 μm und 15 μm aufweist.
Der Referenzstandard umfasst vorzugsweise: (a) zwei oder mehr lineare Fasern oder Kanäle in im Wesentlichen paralleler Ausrichtung, vorzugsweise in einem Bündel; oder (b) zwei oder mehr verschiedene detektierbare Einheiten, von denen jede in oder auf einer einzelnen Faser oder einem einzelnen Kanal angeordnet ist; oder (c) zwei oder mehr Fasern oder Kanäle, die jeweils die gleiche detektierbare Einheit umfassen, die vorzugsweise verschiedene Mengen der detektierbaren Einheit auf jeder bzw. jedem aufweisen, oder irgendeine Kombination der obigen.
Vorzugsweise umfasst ein ebener Schnitt des Referenzstandards eine Mehrzahl von Bereichen, in welchen die detektierbare Einheit in unterschiedlicher Dichte präsentiert wird.
Vorzugsweise umfasst ein ebener Schnitt des Referenzstandards einen ersten Bereich, welcher die detektierbare Einheit im Wesentlichen in einer diagnostisch signifikanten Dichte umfasst, und umfasst vorzugsweise weiterhin eine Kontrolle, welche eine Faser oder einen Kanal umfasst, die bzw. der im Wesentlichen keine detektierbare Einheit umfasst.
Gemäß einem dritten Aspekt der Erfindung stellen wir ein Verfahren gemäß dem ersten oder zweiten Aspekt der Erfindung zum Erhalten einer Anzeige, die für die Bestimmung der Wahrscheinlichkeit einer Erkrankung oder eines Zustands in einem Individuum geeignet ist, bereit, wobei das Vorliegen der detektierbaren Einheit oder das Vorliegen einer vorbestimmten Menge der detektierbaren Einheit in der biologischen Probe die Wahrscheinlichkeit einer Erkrankung oder eines Zustands in der biologischen Probe oder in einem Individuum, von dem die Probe genommen wurde, anzeigt.
Die biologische Probe umfasst vorzugsweise eine Zelle, ein Gewebe oder ein Organ, vorzugsweise eine Zelle, ein Gewebe oder ein Organ eines Organismus, von dem vermutet wird, dass er an einer Erkrankung oder einem Zustand leidet.
Als ein vierter Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Bereitstellen einer Anzeige, die bei der Diagnose einer Erkrankung oder eines Zustands in einem Individuum nützlich ist, bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst, dass man die Menge einer detektierbaren Einheit in einer biologischen Probe von dem Individuum oder einer Komponente davon mit einem Referenzstandard in einem Verfahren, wie hier beschrieben, vergleicht, wobei angezeigt wird, dass das Individuum wahrscheinlich an der Erkrankung oder dem Zustand leidet oder dafür empfänglich ist, wenn die Menge der detektierbaren Einheit in der biologischen Probe oder der Komponente ähnlich derjenigen oder größer als diejenige in dem Referenzstandard ist.
Die Erfindung stellt unter einem fünften Aspekt ein Verfahren zum Bestimmen der Wirksamkeit oder des Erfolgs einer Maßnahme bereit, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst: (a) Bereitstellen eines Referenzstandards oder eines ebenen Schnitts davon, wobei der Referenzstandard umfasst: (i) ein Trägermedium; und (ii) eine Menge einer detektierbaren Einheit, die von dem Trägermedium getragen wird; wobei die detektierbare Einheit einen länglichen Pfad beschreibt, dessen Querschnittsprofil eine Größe von zwischen 0,5 μm und 100 μm hat, wobei eine vorbestimmte Menge der detektierbaren Einheit in einem definierten Bereich in einem Querschnitt des Referenzstandards vorliegt; und wobei eine detektierbare Eigenschaft der detektierbaren Einheit als Ergebnis der Maßnahme verändert wird; (b) Durchführen der Maßnahme an dem Referenzstandard; und (c) Detektieren einer Veränderung in der detektierbaren Eigenschaft der detektierbaren Einheit.
Ein solches Verfahren dient vorzugsweise zum Bestimmen der Wirksamkeit oder des Erfolgs einer Maßnahme, die an einer Probe ausgeführt wird, wobei die Maßnahme an dem Referenzstandard oder einem ebenen Schnitt, der im Wesentlichen parallel zu der Probe ist, durchgeführt wird.
Eine detektierbare Eigenschaft der detektierbaren Einheit wird vorzugsweise als Ergebnis einer erfolgreichen Maßnahme verändert, wobei die Veränderung in der detektierbaren Eigenschaft der detektierbaren Einheit erfasst wird, um festzustellen, dass die Maßnahme erfolgreich ist.
Alternativ oder zusätzlich wird eine detektierbare Eigenschaft der detektierbaren Einheit als Ergebnis einer nicht erfolgreichen Maßnahme verändert, wobei die Veränderung in der detektierbaren Eigenschaft der detektierbaren Einheit erfasst wird, um festzustellen, dass die Maßnahme nicht erfolgreich ist.
Die Maßnahme wird vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus: einer in situ-Hybridisierungsmaßnahme oder -prozedur, einer immunhistochemischen Maßnahme oder Prozedur, Entparaffinierung, Antigengewinnung (Antigen-Retrieval), Blockieren, endogener Biotin-Blockierung, endogener Enzymblockierung, einer Waschstufe, Inkubation mit einem Aufdeckungsmittel, wie einem primären Antikörper, Inkubation mit sekundären Visualisierungskomponenten, Chromogenfärbung, Gewinnung von Färbungsinformationen und Analyse.
Die Maßnahme kann eine Antigengewinnungsmaßnahme sein, und in welcher die detektierbare Eigenschaft der detektierbaren Einheit das Maskieren oder Demaskieren eines oder mehrerer Epitope umfasst. Die detektierbare Einheit in dem Referenzstandard wird vorzugsweise modifiziert, um ein oder mehrere Epitope zu maskieren, von denen einige oder alle im Rahmen einer erfolgreichen Antigengewinnungsmaßnahme demaskiert werden.
Die Maßnahme kann eine Entparaffinierungsmaßnahme sein, und in welcher die detektierbare Eigenschaft der detektierbaren Einheit das Vorliegen oder die Menge der detektierbaren Einheit in dem Referenzstandard nach der Entparaffinierungsmaßnahme umfasst. Die detektierbare Einheit in dem Referenzstandard ist vorzugsweise in dem Entparaffinierungsmedium löslich, und wobei wenigstens ein Teil, vorzugsweise die gesamte detektierbare Einheit im Anschluss an eine erfolgreiche Entparaffinierungsmaßnahme entfernt ist.
In bevorzugten Ausführungsformen wird die Wirksamkeit oder der Erfolg zweier oder mehrerer Maßnahmen vorzugsweise parallel bestimmt.
Unter einem sechsten Aspekt der Erfindung wird eine Verwendung eines Referenzstandards zur Validierung einer Maßnahme bereitgestellt, wobei der Referenzstandard umfasst: (i) ein Trägermedium; und (ii) eine Menge einer detektierbaren Einheit, die von dem Trägermedium getragen wird; wobei die detektierbare Einheit einen länglichen Pfad beschreibt, dessen Querschnittsprofil eine Größe von zwischen 0,5 μm und 100 μm hat, wobei eine vorbestimmte Menge der detektierbaren Einheit in einem definierten Bereich in einem Querschnitt des Referenzstandards vorliegt; und wobei eine detektierbare Eigenschaft der detektierbaren Einheit als Ergebnis der Maßnahme verändert wird.
Der Referenzstandard wird vorzugsweise als ein Validierungsstandard für die Antigengewinnung (Antigen-Retrieval), ein Entparaffinierungsstandard, ein Validierungsstandard für die Blockierung, ein Validierungsstandard für das Waschen, ein Validierungsstandard für primäre Antikörper, ein Validierungsstandard für sekundäre Antikörper, ein Kalibrierungsstandard oder ein diagnostischer Standard verwendet.
Gemäß einem siebten Aspekt der Erfindung stellen wir einen Kit bereit, welcher einen Referenzstandard oder einen ebenen Schnitt davon zusammen mit Anweisungen für die Verwendung in einem Verfahren, wie hier beschrieben, umfasst, wobei der Referenzstandard umfasst: (i) ein Trägermedium; und (ii) eine Menge einer detektierbaren Einheit, die von dem Trägermedium getragen wird; wobei die detektierbare Einheit einen länglichen Pfad beschreibt, dessen Querschnittsprofil eine Größe von zwischen 0,5 μm und 100 μm hat, wobei eine vorbestimmte Menge der detektierbaren Einheit in einem definierten Bereich in einem Querschnitt des Referenzstandards vorliegt.
Der Kit umfasst vorzugsweise weiterhin ein Bindemittel, welches spezifisch an die detektierbare Einheit binden kann, wobei das Bindemittel ein Signal erzeugt, welches das Vorliegen oder die Menge der detektierbaren Einheit in dem Referenzstandard, dem ebenen Schnitt davon oder dem definierten Bereich anzeigt.
Wir stellen gemäß einem achten Aspekt der Erfindung einen diagnostischen Kit zum Detektieren eines diagnostisch relevanten Vorliegens oder einer diagnostisch relevanten Menge einer detektierbaren Einheit in einer biologischen Probe bereit, wobei der diagnostische Kit einen Kit gemäß dem achten Aspekt der Erfindung umfasst.
Der Kit oder diagnostische Kit umfasst vorzugsweise ein therapeutisches Mittel, welches wenigstens eines der Symptome einer Erkrankung oder eines Zustands in einem Individuum behandeln oder lindern kann, welches vorzugsweise einen Antikörper gegen die detektierbare Einheit umfasst.
Es wird gemäß einem neunten Aspekt der Erfindung ein Satz von zwei oder mehreren ebenen Schnitten, die jeweils von einem Referenzstandard erhalten wurden, bereitgestellt, wobei der Referenzstandard umfasst: (i) ein Trägermedium; und (ii) eine Menge einer detektierbaren Einheit, die von dem Trägermedium getragen wird; wobei die detektierbare Einheit einen länglichen Pfad beschreibt, dessen Querschnittsprofil eine Größe von zwischen 0,5 μm und 100 μm hat, wobei eine vorbestimmte Menge der detektierbaren Einheit in einem definierten Bereich in einem Querschnitt des Referenzstandards vorliegt, wobei wenigstens zwei ebene Schnitte in dem Satz eine unterschiedliche Menge der detektierbaren Einheit umfassen.
Als ein zehnter Aspekt der Erfindung stellen wir einen Satz von zwei oder mehreren ebenen Schnitten bereit, welche jeweils einen definierten Bereich umfassen, der detektierbare Einheit aufweist, wobei die Menge der detektierbaren Einheit in dem definierten Bereich zwischen wenigstens zweien der ebenen Schnitte in dem Satz unterschiedlich ist, wobei jeder ebene Schnitt von einem Referenzstandard erhalten wurde, welcher umfasst: (i) ein Trägermedium; und (ii) eine Menge einer detektierbaren Einheit, die von dem Trägermedium getragen wird; wobei die detektierbare Einheit einen länglichen Pfad beschreibt.
Der hier beschriebene Referenzstandard kann aus Bequemlichkeitsgründen als „HistoFiber" bezeichnet werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
Jetzt werden Ausführungsformen der Erfindung detailliert unter beispielhafter Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben, in welchen:
1 ein typisches Klassifizierungs- oder Score-Ermittlungssystem der Antigenfärbung für die Bestimmung einer Proteinexpression zeigt. Humanes Brustgewebe wird auf HER2-Antigen mit anti-HER2-Antikörper unter Verwendung des HercepTest^TM, DakoCytomation, Code Nr. K5204, angefärbt. 1A: Score 0 (negativ). Es wird keine Färbung beobachtet oder eine Membranfärbung wird bei weniger als 10% der Tumorzellen beobachtet; 1B: Score 1+ (negativ). Es wird eine schwache oder kaum wahrnehmbare Membranfärbung bei mehr als 10% der Tumorzellen detektiert. Die Zellen werden nur in einem Teil der Membran angefärbt; 1C: Score 2+ (schwach positiv). Es wird bei mehr als 10% der Tumorzellen eine schwache bis moderate vollständige Membranfärbung beobachtet; 1D: Score 3+ (stark positiv). Es wird eine starke vollständige Membranfärbung bei mehr als 10% der Tumorzellen beobachtet.
2 zeigt eine Ausführungsform des hier beschriebenen Referenzstandards. In dieser Ausführungsform wird eine dünne und homogene Faser chemisch mit diagnostisch relevanten Zielen modifiziert und in Paraffinblöcke eingebettet. Eine Mehrzahl von Fasern ist in Bündeln rechtwinklig zu der Schnittrichtung angeordnet und in dünne Scheiben, welche gleichförmige Referenzpunkte oder -Dots enthalten, geschnitten. Die Schnitte können wie ein jegliches anderes „Gewebe" IHC- oder ISH-gefärbt werden.
2A zeigt einen Block, in welchem eine detektierbare Einheit, wie ein Protein, in einem länglichen Pfad (beispielsweise in Gestalt einer Stange) gehalten wird und in ein Einbettungsmedium eingebettet ist. 2B zeigt einen durch den Block verlaufenden Querschnitt. 2C zeigt eine Ausführungsform, welche eine Mehrzahl von Pfaden mit unterschiedlichen detektierbaren Einheiten aufweist oder unterschiedliche Mengen der gleichen detektierbaren Einheit umfasst. Von dem Block werden ebene Schnitte hergestellt und diese umfassen die detektierbare Einheit als „Dots" (Punkte oder kleine Flecken).
3 zeigt ein Beispiel, wie der Referenzstandard (beispielsweise die in 2 oben erzeugten ebenen Schnitte) vorzugsweise parallel mit einer biologischen Probe, die fixiert, eingebettet und zu Schnitten geschnitten worden ist, verarbeitet werden kann. Die ebenen Schnitte werden auf Glas-Mikroskop-Objektträger aufgebracht oder aufgelegt und das Paraffin-Einbettungsmedium wird entfernt. Der Objektträger mit einem darauf aufgelegten ebenen Schnitt wird dann rehydratisiert und kann Standard-Antigen-Retrieval-Techniken unterworfen werden. Der Objektträger wird dann unter Verwendung von spezifischen Antikörpern, um das Vorliegen und die Verteilung des Antigens aufzudecken, gefärbt. Es können auch eine Kontrast- oder Gegenfärbung und sekundäre Färbung, gegebenenfalls mit chromogenem Substrat, wenn das sekundäre Färbemittel mit einem Enzym verknüpft ist, ausgeführt werden.
4 zeigt mehrere Ausführungsformen des hier beschriebenen Referenzstandards. Der Referenzstandard kann verschiedene Formen annehmen und der längliche Pfad der detektierbaren Einheit kann verschiedene Formen annehmen (4A). Bündel von detektierbaren Einheiten, von denen wenigstens eine oder einige von länglicher Gestalt sind, von denen einige oder alle kürzer als das Trägermedium sein können, können in dem Trägermedium getragen werden (4B). Die detektierbare Einheit kann variierenden Durchmesser und variierende Gestalt aufweisen, zumindest Abschnitte, die gekräuselt, wellig sind oder nicht perfekt rechtwinklig zu der Schnittrichtung oder zueinander ausgerichtet sind, aufweisen.
5 zeigt eine Ausführungsform des hier beschriebenen Referenzstandards, in welcher eine Zellen, Gewebe u.s.w. umfassende Probe in dem Trägermedium zusammen mit der detektierbaren Einheit getragen wird. Beispielsweise können eine Gewebeprobe und die detektierbare Einheit in dasselbe Medium eingebettet sein. Scheiben oder Schnitte des Referenzstandards umfassen eine detektierbare Menge der detektierbaren Einheit zusammen mit dem Gewebe u.s.w.
6 zeigt mehrere Ausführungsformen des hier beschriebenen Referenzstandards, in welchen die detektierbare Einheit an eine Faser gekoppelt wird, die auf verschiedene Weisen behandelt wird, um verschiedene Ausmaße an Eindringen der Einheit in die Faser zu ermöglichen und folglich das Färbungsausmaß zu modulieren. Hellgraue Flächen repräsentieren Flächen, die gefärbt sind, während dunkelgraue Flächen Flächen repräsentieren, die nicht gefärbt sind oder die teilweise gefärbt sind.
6A zeigt eine Ausführungsform, in welcher man die Faser während oder vor der Kopplung hat quellen lassen, so dass die detektierbare Einheit an im Wesentlichen alle Abschnitte in einem Quer schnitt der Faser gekoppelt ist. Eine Exposition gegenüber einem relevanten Antikörper führt zu einer homogenen Färbung (d.h. Färbung sowohl in dem Kernbereich als auch in den peripheren Bereichen der Faser).
6B zeigt eine Ausführungsform, in welcher man die Faser während oder vor der Kopplung hat teilweise quellen lassen, indem beispielsweise die Menge oder Konzentration von Wasser bezogen auf organisches Lösemittel und/oder die Expositionszeit gegenüber dem Wasser gesteuert wurde. Die Antikörperfärbung ist nicht-homogen und ist auf die peripheren Bereiche oder Oberflächenbereiche der Faser konzentriert mit einer begrenzten Färbung im Inneren.
6C zeigt eine Ausführungsform, in welcher die Faser während der Kopplung nicht wesentlich gequollen ist. Die detektierbare Einheit ist nur in der Lage, Zugang zu den peripheren Bereiche oder Oberflächenbereichen der Faser zu erlangen und daran zu koppeln. Im inneren oder Kernabschnitt der Faser findet keine Kopplung statt, was zu einer Färbung führt, die im Wesentlichen auf die Oberfläche begrenzt ist (dichte Oberflächenfärbung, keine innerliche Färbung).
6D zeigt eine Ausführungsform, in welcher die Faser nicht gequollen wird, aber vor dem Koppeln vorbehandelt wird, um ein intermediäres Kopplungsmittel (in diesem Falle Polymerketten) einzuführen. Die Polymerketten sind aktiviert, so dass die detektierbare Einheit nur an die Polymerketten, nicht aber an die Faser selbst gekoppelt wird. Das resultierende Färbungsmuster umfasst eine lockere Oberflächenfärbung mit im Wesentlichen keiner Färbung in inneren oder Kernabschnitten der Faser.
7 zeigt ein Flussdiagramm eines Verfahrens zum Herstellen und Handhaben einer Ausführungsform der hier beschriebenen Referenz. „Faserhandhabung": Fasern werden aktiviert, Zielstrukturen, welche detektierbare Einheiten umfassen, werden an die Faser gekoppelt und die resultierende Faser wird in Agarose eingebettet und fixiert. „Standard -IHC-Einheits-Maßnahmen" („Standard IHC Unit Operations"): die Fasern werden in Paraffin eingebettet und in Scheiben geschnitten. Die Scheiben werden auf Glas-Mikroskop-Objektträger aufgelegt und immunhistochemischen (IHC) Standardfärbeprozeduren unterworfen.
8 zeigt ein Flussdiagramm eines Verfahrens zum Herstellen und Handhaben einer Ausführungsform des hier beschriebenen Referenzstandards. Fasern werden gewaschen, dann chemisch mit einer geeigneten detektierbaren Einheit, wie einem Peptid oder Farbstoff, modifiziert. Die modifizierten Fasern werden dann gegebenenfalls in ein Agarosegel eingebettet, dann mit Formalin fixiert. Die Agaroseblöcke werden dann in lange Zylinder geschnitten, dehydratisiert und in Paraffin eingebettet. Es werden Scheiben geschnitten und wie bei anderen FFPE-Proben behandelt.
9 sind Photographien der verschiedenen Schritte bei der Bildung einer Ausführungsform des hier beschriebenen Referenzstandards. In ein Gel eingebettete Fasern werden in Stäbe geschnitten und zurechtgeschnitten, bevor sie in Histo-Kapseln („histo capsules") für eine Fixierung gelegt werden – gefolgt von Dehydratisierung, Paraffin-Infiltration, Schneiden, Backen, Auflegen auf Objektträger, Antigengewinnung (Antigen-Retrieval), Blockierung, Färbung, Abdecken mit einem Deckgläschen u.s.w. „Histo-Kapseln" beziehen sich auf üblicherweise verwendete kleine Behälter aus Kunststoff, wie sie beispielsweise in Laboratorien verwendet und von Sekura (Japan) hergestellt werden.
9A: Fasern werden auf einen Rahmen gespannt und unter Zugspannung gesetzt. 9B: der Rahmen wird in einen Behälter gelegt und es wird geschmolzene Agarose über den Rahmen gegossen. 9C: man lässt die Agarose sich verfestigen. 9D: die verfestigte Agarose wird entfernt. 9E: Agarose-Streifen, welche individuelle Fasern enthalten, werden aus dem Agaroseblock geschnitten. 9F: die Agaroseblöcke, welche individuelle Fasern enthalten, werden in Paraffin eingebettet.
10 zeigt Ausführungsformen des hier beschriebenen, Fasern umfassenden Referenzstandards, welche verschiedene Formen und Strukturen der Fasern veranschaulichen. Beispielsweise kann die Faser interne Strukturen, die einfach oder komplex sein können, umfassen. 10A zeigt Mikrophotographien von mehreren kommerziell erhältlichen Fasern. 10B zeigt Beispiele von Fasern mit komplexen Strukturen, einschließlich Hohlfasern, in andere Fasern eingebetteten Fasern und Fasern, welche Material von anderer Natur enthalten. 10C ist eine schematische Veranschaulichung des Schneidens von eingebetteten Bündeln von verschiedenen Fasern und Kombinationen von Fasern, was zu einem Referenzsystem mit komplexer Morphologie und komplexen Mustern führt.
Die 11A bis 11E zeigen Ergebnisse aus Beispiel 2. 11A: Auf einen Rahmen gespannte Fasern mit Korbvorrichtung und Behälter im Hintergrund. 11B: Auf einen Rahmen gespannte und in einen Behälter gelegte Fasern mit einer Korbvorrichtung, um dabei zu helfen, die eingebetteten Fasern einem späteren Schritt herauszuheben. 11C: Warme Agarose wird in den Behälter, welcher auf den Rahmen gespannte Fasern enthält, gegossen. 11D: Die auf den Rahmen gespannten und in verfestigtes Gel eingebetteten Fasern werden vorsichtig aus dem Behälter herausgenommen. 12E: Die in ein Gel eingebetteten Fasern werden unter Verwendung eines Skalpells aus dem Stahlrahmen geschnitten und weiter in kleine rechteckige Stücke geschnitten. Die Fasern sind im Zentrum der Agarosegelstücke eingebettet.
12 zeigt einen Vergleich des hier beschriebenen Referenzsystems mit einer Kontrollzelllinie und einer positiv gefärbten Gewebeprobe. 12A: HER2-positives humanes Gewebe, gefärbt mit anit-HER2-Antikörper unter Verwendung des HercepTest^TM (DakoCytomation, Code-Nr. K5204). 12B: natürliche Lagertun-Seide, modifiziert mit 25 mM DNP und in wässrigem Lösemittel gekoppelt. 12C: HER2-Kontrollzelllinie, gefärbt mit anti-HER2-Antikörper unter Verwendung des HercepTest^TM (DakoCytomation, Code-Nr. K5204), welche einem 3+-Färbungs-Score entspricht. Die Figuren sind nicht in der gleichen optischen Vergrößerung dargestellt.
13 zeigt Ergebnisse aus Beispiel 3. 13A: Unifloss-, 13B: LP floss- und 13C: Lagertun-Fasern, gekoppelt mit 25 mM F-DNP in wässriger Lösung, und 13D: Unmodifizierte Unifloss-Fasern als negative Kontrolle. Alle behandelt als FFPE-Proben und gefärbt mit Kaninchen-F(ab')-anti-DNP-HRP/DAB+ (DakoCytomation, Code-Nr. P 5102 und K 3467/3468). 10-fache Vergrößerung, keine Gegenfärbung.
14 zeigt Ergebnisse aus Beispiel 3. 14A: Unifloss-, 14B: LP floss- und 14C: Lagertun-Fasern, gekoppelt mit 10 mM FITC in Toluol, und 14D: Unmodifizierte Unifloss-Fasern als negative Kontrolle. Alle behandelt als FFPE-Proben und gefärbt mit Kaninchen-F(ab')-anti-FITC-HRP/DAB+ (DakoCytomation, Code-Nr. P 5100 und K 3467/3468). 10-fache Vergrößerung, keine Gegenfärbung.
15 zeigt Ergebnisse aus Beispiel 4. 15A: Unifloss-, 15B: LP-floss- und 15C: Lagertun-Fasern, gekoppelt mit 10 mM FITC in Toluol, 15D: Ummodifizierter Unifloss als negative Kontrolle. Alle behandelt als FFPE-Proben und gefärbt mit Kaninchen-F(ab')anti-FITC- HRP/Envision+/DAB+ (DakoCytomation, Code-Nr. P 5100 und K 4010/4011). 10-fache Vergrößerung. Keine Gegenfärbung.
16 zeigt Ergebnisse aus Beispiel 4. Unifloss-Fasern werden mit Sanger's-Reagens (F-DNP) bei verschiedenen Bedingungen gekoppelt. 16A: Gekoppelt mit 5 mM F-DNP in wässrigem Lösemittel, 16B: Gekoppelt mit 25 mM F-DNP in wässrigem Lösemittel, 16C: Gekoppelt mit 5 mM F-DNP in Toluol, 16D: Gekoppelt mit 10 mM F-DNP in Toluol und 16E: unmodifizierte Fasern. Alle behandelt als FFPE-Proben und gefärbt mit Kaninchen-F(ab')-anti-DNP-HRP/EnVision+/DAB+ (DakoCytomation, Code-Nr. P 5102 und K 4010/4011). Die Bilder sind mit 10-facher Vergrößerung aufgenommen.
17 zeigt Ergebnisse aus Beispiel 4. Floss-Fasern werden mit Sanger's-Reagens (F-DNP) bei verschiedenen Bedingungen gekoppelt. 17A: Gekoppelt mit 5 mM F-DNP in wässrigem Lösemittel, 17B: Gekoppelt mit 25 mM F-DNP in wässrigem Lösemittel, 17C: Gekoppelt mit 5 mM F-DNP in Toluol, und 17D: Gekoppelt mit 10 mM F-DNP in Toluol. Alle behandelt als FFPE-Proben und gefärbt mit Kaninchen-F(ab')-anti-DNP-HRP/EnVision+/DAB+ (DakoCytomation Code-Nr. P 5102 und K 4010/4011). Die Bilder sind mit 10-facher Vergrößerung aufgenommen.
18 zeigt Ergebnisse aus Beispiel 4. Lagertun-Seidenfasern werden mit Sanger's-Reagens (F-DNP) bei verschiedenen Bedingungen gekoppelt. 18A: Gekoppelt mit 5 mM F-DNP in wässrigem Lösemittel, 18B: Gekoppelt mit 25 mM F-DNP in wässrigem Lösemittel, 18C: Gekoppelt mit 5 mM F-DNP in Toluol, und 18D: Gekoppelt mit 10 mM F-DNP in Toluol. Alle behandelt als FFPE-Proben und gefärbt mit Kaninchen-F(ab')-anti-DNP-HRP/Envision+/DAB+ (DakoCytomation Code-Nr. P 5102 und K 4010/4011). Die Bilder sind mit 10-facher Vergrößerung aufgenommen.
19 zeigt Ergebnisse aus Beispiel 5. Messung des durchschnittlichen Durchmessers von anti-DNP-HRP/EnVision+/DAB+ (DakoCytomation, Code-Nr. P 5102 und K 4010/4011)-Färbungen. 19A: Unifloss, 3,3 μm. 19B: LP-floss 3,5 μm, und 19C: Lagertun-Fasern 1,6 μm, unter Verwendung der Olympus DP-soft-Software. Es ist ein Skalenbalken in der unteren rechten Ecke gezeigt.
20 zeigt Ergebnisse aus Beispiel 5. Durch den HercepTest^TM gefärbte HER2-Referenzzellen (DakoCytomation, Code-Nr. K 5204, anti-HER2/Envision/HRP/DAB-Färbung gemäß den mit dem Kit gelieferten Anweisungen), aufgenommen mit 10-facher Vergrößerung. Die 3+-Zelllinie in 20A ergibt eine starke Membranfärbung (3+) und keine zytoplasmatische Anfärbung. Die Färbung ist homogen und die Präparation enthält einige wenige tote Zellen und etwas Zellrückstände. 20B: Die HER2-negative Kontrollzelllinie ohne sichtbare Färbung.
21 zeigt Ergebnisse aus Beispiel 5. EGFR-gefärbte und Hämatoxylin-gegengefärbte EGFR-Referenzzellen (DakoCytomation, Code-Nr. K 1492, gemäß den mit dem Kit gelieferten Anweisungen, unter Verwendung von anti-EGFR/Envision/HRP/DAB). Aufgenommen mit 20-facher Vergrößerung, was zu einer starken Membranfärbung (3+) und etwas schwacher zytoplasmatischer Anfärbung (1+) führt. Die Färbung ist homogen und das Präparat enthält einige wenige tote Zellen und etwas Zellrückstände.
22 zeigt Ergebnisse aus Beispiel 6. Bild von Procion Red-modifizierten LP-floss-Fasern, die auf Objektträger aufgebracht sind. 22A: Vor der Entparaffinierung, 22B: nach Entparaffinierung und vor dem Epitop-Retrieval-Schritt (DakoCytomation, Code-Nr. S 1700) und 22C: nach Entparaffinierung und Epitop-Retrieval, aufgenommen mit 10-facher Vergrößerung. Der Balken unten rechts gibt die Längenskala an. Das Epitop-Retrieval wurde unter Verwendung von Citrat, pH 6,0, ausgeführt.
23 zeigt Ergebnisse aus Beispiel 6. Bild von Procion Red-modifizierten Unifloss-Fasern, die auf Objektträger aufgebracht sind. 23A: Vor der Entparaffinierung, 23B: nach Entparaffinierung und vor dem Epitop-Retrieval-Schritt (DakoCytomation, Code-Nr. P 5102 und K 4010/4011) und 23C: nach Entparaffinierung und Epitop-Retrieval, aufgenommen mit 10-facher Vergrößerung. Der Balken unten rechts gibt die Längenskala an. Das Epitop-Retrieval wurde unter Verwendung von Citrat, pH 6,0, ausgeführt.
24 zeigt Ergebnisse aus Beispiel 7. Bilder von Unifloss-Fasern eingebettet in 2% Agarose mit 0,25% PEI (Polyethylenimin), aufgebracht auf ChemMate^TM Capillary Gap Microscope Slides (Dako-Cytomation, Code-Nr. S. 2024). 24A: vor und 24B: nach Entparaffinierung und Epitop-Retrieval (DakoCytomation, Code-Nr. S1700), aufgenommen mit 10-facher Vergrößerung.
25 zeigt Ergebnisse aus Beispiel 7. Bilder von LP-floss-Fasern eingebettet in 2% Agarose mit 25% PEI, aufgebracht auf Poly-L-Lysin-Objektträger. 25A: vor und 25B: nach Entparaffinierung und Epitop-Retrieval unter Verwendung von hohem pH-Puffer, pH 9,9 (DakoCytomation, Code-Nr. S 3308), aufgenommen mit 10-facher Vergrößerung.
26 zeigt Ergebnisse aus Beispiel 8, aufgenommen mit 40-facher Vergrößerung ohne Gegenfärbung, welche die DAB-Färbung der Lagertun-Fasern zeigen:
26A: Die CDI-aktivierten Fasern, gekoppelt mit Kaninchen-IgG und gefärbt mit Kaninchen-Envision HRP/DAB. 26B. Die CDI-aktivierten Fasern gekoppelt mit Kaninchen-IgG und einem Antigen-Retrieval unterzogen und gefärbt mit Kaninchen-Envision HRP/DAB. 26C: Die CDI-aktivierten Fasern, gekoppelt mit biotinyliertem Kaninchen-IgG und gefärbt mit Streptavidin-HRP/DAB. 26D: Native Fasern, behandelt ohne CDI, mit Kaninchen-IgG und gefärbt mit Envision HRP/DAB. 26E: Native Fasern, gefärbt mit Envision HRP/DAB. 26F: Die CDI-aktivierten Fasern gekoppelt mit Kaninchen-IgG, AR-behandelt und gefärbt mit Anti-Maus-Envision HRP/DAB.
27 zeigt Ergebnisse aus Beispiel 9, aufgenommen mit 40-facher Vergrößerung ohne Gegenfärbung, welche die DakoCytomation-HercepTest^TM-Färbung von verschiedenen Fasern zeigen:
27A: HER2-modifizierter LP-floss, 27B: HER2-modifizierter Unifloss, 27C: HER2-modifizierte Lagertun-Fasern, 27D: HER2-modifizierte Unifloss-Fasern, einschließlich Antigen-Retrieval und 27E: HER2-modifizierte Lagertun-Fasern, einschließlich Antigen-Retrieval. 27F: Negative Kopplungskontrolle unter Verwendung von nicht-aktivierten Lagertun-Fasern. 27G: Negative primärer Antikörper-Kontrolle von HER2-modifiziertem LP-floss. 27H: Negative primärer Antikörper-Kontrolle von HER-2-modifizierten Uni floss, und 27I: Negative primärer Antikörper-Kontrolle von HER2-modifizierten Lagertun-Fasern.
28 zeigt die HER2-Färbungsergebnisse aus Beispiel 10, aufgenommen mit 40-facher Vergrößerung ohne Gegenfärbung, welche die DakoCytomation-HercepTest^TM-Färbung von verschiedenen Fasern mit stufenweisen Modifizierungen zeigen:
28A, B, C, D, E und F sind Mikrophotographien der HER2-gefärbten Objektträger, hergestellt unter Verwendung von 0,20; 0,19; 0,15; 0,10; 0,05 bzw. 0,01 g/l HER2-Peptid. 28G ist die Kopplungskontrolle, d.h. der Objektträger ohne HER2-Peptid und nur 0,20 g/l p16. 28H ist die Kopplungskontrolle, die ohne Zugabe von GMBS oder Peptiden hergestellt worden ist. 28I ist die primärer Antikörper-negative Kontrolle unter Verwendung von Nonsense-Kaninchen-Antikörper (DakoCytomation K5205). 28 J ist die native unmodifizierte Faserkontrolle. 28K ist die hinsichtlich der sekundären Visualisierung negative Kontrolle unter Verwendung von Anti-Maus-IgG Envision HRP (DakoCytomation K4006). 28 L, M und N sind die gefärbten Referenzzellen, die in dem Herceptest^TM enthalten sind, mit 0+, 1+ bzw. 3+-Zellen.
29 zeigt die p16-Färbungsergebnisse aus Beispiel 10, aufgenommen mit 40-facher Vergrößerung ohne Gegenfärbung, welche die DakoCytomation CINtec^TM-p16-INK4-Histology Kit-Färbung von verschiedenen Fasern mit abgestuften Modifizierungen zeigen:
29A ist die Kopplungskontrolle ohne p16-Peptid und nur 0,20 g/l HER2. 29B, C, D, E, F und G sind Mikrophotographien der p16-gefärbten Objektträger, die unter Verwendung von 0,01; 0,05; 0,10; 0,15; 0,19 bzw. 0,20 g/l p16-Peptid hergestellt worden sind. 29H ist eine ohne Zugabe von GMBS hergestellte Kopplungskontrolle. 29I ist die primärer Antikörper-negative Kontrolle unter Verwendung von Nonsense-Kaninchen-Antikörper (Teil des CINtec^TM p16-INK4-Histology Kit). 29J ist die negative unmodifizierte Faserkontrolle. 29K ist die sekundäre Visualisierung-negative Kontrolle unter Verwendung von anti-Kaninchen-IgG Envision HRP (DakoCytomation 4003).
30 zeigt die HER2-Färbungsergebnisse aus Beispiel 11.
Beispiel 30A ist eine Mikrophotographie von gefärbten Objektträgern mit DAB-gefärbtem Brustgewebe auf dem unteren Abschnitt des Objektträgers. Das Faser-Referenzmaterial sieht man auf dem oberen Abschnitt des Objektträgers. 30B bis E sind Mikrophotographien der gleichen gefärbten Objektträger unter Verwendung der mit anti-DNP versetzten primären Reagenzienlösung in dem Herceptest^TM-Färbungsprotokoll. In 30B und C befinden sich die DAB-gefärbten DNP-Fasern links unten und die roten Lagertun-Fasern rechts oben, aufgenommen mit 4-facher bzw. 40-facher Vergrößerung. 30D und E ist das DAB-gefärbte Brustgewebe, aufgenommen mit 10-facher bzw. 40-facher Vergrößerung.
30F bis I sind Mikrophotographien der gleichen gefärbten Objektträger unter Verwendung des originalen Herceptest^TM-Färbungsprotokolls, ohne versetztes primäres Reagens. In 30F und G befinden sich die gefärbten DNP-Fasern links unten und die roten Lagertun-Fasern rechts oben, aufgenommen mit 4-facher bzw. 40-facher Vergrößerung. 30H ist das DAB-gefärbte Brustgewebe, aufgenommen mit 10-facher Vergrößerung.
30I bis L sind Mikrophotographien der gleichen gefärbten Objektträger unter Verwendung des negativen Kaninchen-IgG-Antikörper-Kontrollreagens aus dem Herceptest^TM-Färbungskit. In 30 I befinden sich die gefärbten DNP-Fasern links unten und die roten Lagertun-Fasern rechts oben, aufgenommen mit 40-facher Vergrößerung. 30J sind die roten Lagertun-Fasern, aufgenommen mit 10-facher Vergrößerung. 30K und L sind das DAB-gefärbte Brustgewebe, aufgenommen mit 10-facher bzw. 4-facher Vergrößerung.
30M bis N sind Mikrophotographien der gleichen gefärbten Objektträger unter Verwendung von Kaninchen-anti-DNP-HRP-Konjugat (DakoCytomation K5102), 100-fach verdünnt, anstelle des Antikörper-Reagens aus dem Herceptest^TM-Färbungsprotokoll. In 30M befinden sich die gefärbten DNP-Fasern links unten und die roten Lagertun-Fasern rechts oben, aufgenommen mit 40-facher Vergrößerung. 30N ist das gefärbte Brustgewebe, aufgenommen mit 4-facher Vergrößerung. 30O bis R sind Mikrophotographien der gleichen gefärbten Objektträger unter Verwendung von Maus-Envision HRP-Visualisierungskonjugat anstelle des anti-Kaninchen-Envision-Visualisierungsreagens in dem Herceptest^TM-Färbungsprotokoll. In 30O befinden sich die DAB-gefärbten DNP-Fasern links unten und die roten Lagertun-Fasern rechts oben, aufgenommen mit 40-fachen Vergrößerung. 30P ist das DAB-gefärbte Brustgewebe, aufgenommen mit 10-facher Vergrößerung. Figur Q sind die DAB-gefärbten roten Portion-Fasern, aufgenommen mit 10-facher Vergrößerung. 30R ist das gefärbte Brustgewebe, aufgenommen mit 4-facher Vergrößerung. 30S sind Mikrophotographien einer Herceptest^TM-gefärbten negativen Lagertun-Faser.
30T, U und V sind Mikrophotographien von Herceptest^TM-gefärbten 0+, 1+ bzw. 3+-Referenzzellen.
31 zeigt die Ergebnisse aus Beispiel 12: Mikrophotographien der Unifloss-, Lagertun- und LP-floss-Fasern mit roten und blauen Rändern.
31A: 5-fache Vergrößerung, 31B: 10-fache Vergrößerung und 31C: 40-fache Vergrößerung.
32 zeigt die Ergebnisse aus Beispiel 13: 32A und B sind Mikrophotographien von immungefärbten HER2-modifizierten Lagertun-Fasern, aufgenommen mit 4-facher Vergrößerung. 32C sind 4 Mikrophotographien der immungefärbten HER2-modifizierten Lagertun-Fasern, aufgenommen mit 20-facher Vergrößerung. 32D und E sind Mikrophotographien von Fast Red-immungefärbten, zufällig geschnittenen, HER2-modifizierten Unifloss-Fasern, aufgenommen im Hellfeld-Mikroskop bei 40-facher (D) bzw. 20-facher (E) Vergrößerung. 32F und G sind im Hellfeld-Mikroskop aufgenommene Mikrophotographien von Fast Red-immungefärbten, zufällig geschnittenen, HER2-modifizierten Lagertun-Fasern, aufgenommen mit 40-facher (F) und 20-facher (G) Vergrößerung. 32H und I sind im Hellfeld-Mikroskop aufgenommene Mikrophotographien von mit einem negativen Kontrollantikörper behandelten, Fast-Red-immungefärbten, zufällig geschnittenen, HER2-modifizierten Unifloss (H)- und Lagertun-(I)-Fasern, aufgenommen mit 20-facher Vergrößerung. 32J und K sind im Hellfeld-Mikroskop aufgenommene Mikrophotographien von Fast Red-immungefärbten, zufällig geschnittenen nativen Unifloss (J)- und Lagertun (K)-Fasern, aufgenommen mit 20-facher (G) Vergrößerung.
32L und M sind im Fluoreszenzmikroskop aufgenommene Mikrophotographien von Fast Red-immungefärbten, zufällig geschnittenen, HER2-modifizierten Unifloss (L)- und Lagertun (M)-Fasern, aufgenommen mit 40-facher Vergrößerung. 32N sind im Fluoreszenzmikroskop aufgenommene Mikrophotographien von mit negativem Kontrollantikörper behandelten, Fast Red-immungefärbten, zufällig geschnittenen, HER2-modifizierten Unifloss-Fasern, aufgenommen mit 40-facher Vergrößerung.
33 zeigt die Ergebnisse aus Beispiel 14: Mikrophotographien der Hämatoxylin- und Eosingefärbten Objektträger, aufgenommen mit 40-facher Vergrößerung, mit Ausnahme für 33S, die mit 20-facher Vergrößerung aufgenommen worden ist.
33A, B und C sind Hämatoxylin- und Eosin-gefärbte native LP-floss-, Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern. 33D, E und F sind Hämatoxylin- und Eosin-gefärbte, mit Hexandiisocyanat modifizierte und hydrolysierte LP-floss-, Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern. 33G, H und I sind mit Hämatoxylin und Eosin gefärbte, Kaninchen-IgG-modifizierte LP-floss-, Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern. 33J, K und L sind Hämatoxylin- und Eosin-gefärbte, Fluoreszein-modifizierte LP-floss-, Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern. 33M, N und O sind Hämatoxylin- und Eosin-gefärbte, DNP-modifizierte LP-floss-, Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern. 33P sind Procion Red-modifizierte Faserbündel mit DNP-modifizierten Fasern (rechts). 33Q, R und S sind HE-gefärbtes FFPE-Brustgewebe.
34 zeigt die Periodic Acid-Schift-Färbungsergebnisse aus Beispiel 15:
34A, B und C sind Periodic Acid-Schift-gefärbte native LP-floss-, Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern. 34D, E und F sind Periodic Acid-Schift-gefärbte, Fluorescein modifizierte LP-floss-, Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern. 34G, H und I sind Periodic Acid-Schift-gefärbte, DNP-modifizierte LP-floss-, Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern.
35 zeigt die Alcian Blau-Färbungsergebnisse aus Beispiel 15: 35A und B sind Alcian Blau-gefärbte native Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern. 35C, D und E sind Alcian Blau-gefärbte, Hexandiisocyanat-modifizierte und hydrolysierte LP-floss-, Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern. 35F, G und H sind Alcian Blau-gefärbte, Kaninchen-IgG-modifizierte LP-floss-, Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern. 35I, J und K sind Alcian Blau-gefärbte, Fluorescein-modifizierte LP-floss-, Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern. 35L, M und N sind Alcian Blau-gefärbte, DNP-modifizierte LP-floss-, Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern.
36 zeigt die Jones Basement membrane-Färbungsergebnisse aus Beispiel 15:
36A und B sind Jones Basement membrane-gefärbte native Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern. 36C, D und E sind Jones Basement membrane-gefärbte, Hexandiisocyanat-modifizierte und hydrolysierte LP-floss-, Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern. 36F und G sind Jones Basement membrane-gefärbte, Kaninchen-IgG-modifizierte LP-floss-, Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern. 36H, I und J sind Jones Basement membrane-gefärbte, Fluorescein-modifizierte LP-floss-, Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern. 36K, L und M sind Jones Basement membrane-gefärbte, DNP-modifizierte LP-floss-, Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern.
37 zeigt die Massons Trichrome-Färbungsergebnisse aus Beispiel 15: 37A, B und C sind Massons Trichrome-gefärbte native LP-floss-, Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern. 37D, E und F sind Massons Trichrome-gefärbte, Hexandiisocyanat-modifizierte und hydrolysierte LP-floss-, Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern.. 37G und H sind Massons Trichrome-gefärbte, Kaninchen-IgG-modifizierte LP-floss-, Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern. 37I, J und K sind Massons Trichrome-gefärbte, Fluorescein-modifizierte LP-floss-, Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern. 37L, M und N sind Massons Trichcrome-gefärbte, DNP-modifizierte LP-floss-, Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern.
38 zeigt Ergebnisse aus Beispiel 16: 38 sind Mikrophotographien von Procion Redmodifizierten Lagertun-Fasern, geschnitten zu 3 μm (A), 5 μm (B) und 7 μm (C). 38 sind Mikrophotographien von anti-DNP-Envision HRP/DAB-gefärbten, DNP-modifizierten Lagertun-Fasern, geschnitten zu 3 μm (D), 5 μm (E) und 7 μm (F). 38 sind Mikrophotographien von anti-DNP-Envision HRP/DAB-gefärbten, DNP-modifizierten Unifloss-Fasern, geschnitten zu 3 μm (G), 5 μm (H) und 7 μm (I). 38 sind Mikrophotographien von nativer Unifloss-Faser, geschnitten zu 5 μm Dicke (J), nativer Lagertun-Faser, geschnitten zu 5 μm Dicke (K), einer negativen primärer Antikörper-Färbung von DNP-modifizierter Lagertun-Faser, geschnitten zu 7 μm Dicke (L), und einer negativen Envision-Kontrollfärbung von DNP-modifizierter Lagertun-Faser, geschnitten zu 5 μm Dicke (M).
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Die praktische Ausführung der Erfindung wird, sofern nicht anders angegeben, herkömmliche Techniken der Chemie, Molekularbiologie, in vitro-DNA-Rekombination und Immunologie, die im Rahmen der Fähigkeiten eines Fachmanns auf diesem Gebiet liegen, einsetzen. Solche Techniken werden in der Literatur erläutert. Siehe beispielsweise J. Sambrook, E. F. Fritsch und T. Maniatis, 1989, Molecular Clo ning: A Laboratory Manual, zweite Auflage, Bücher 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel F.M., et al. (1995 und periodische Ergänzungsbände; Current Protocols in Molecular Biology, Kap. 9, 13 und 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree und A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J.M. Polak und James O'D. McGee, 1990, In situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press, M. J. Gait (Herausgeber), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; D.M.J. Lilley und J.E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol Nr. 1 von Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7); Antibodies: A Laboratory Manual, von Ed Harlow (Herausgeber), David Lane (Herausgeber) (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-314-2), 1855. Handbook of Drug Screening, herausgegeben von Ramakirshna Seethala, Prabhavathi B. Fernandes (2001, New York, NY, Marcel Dekker, ISBN 0-8247-0562-9); und Lab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents and Other Reference Tools for Use at the Bench, herausgegeben von Jane Roskams und Linda Rogers, 2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3.
REFERENZSTANDARD
Wir beschreiben neue Referenzstandards, die verwendet werden können, um Proben im Rahmen einer jeglichen Färbungsprozedur, einschließlich immunhistochemischer (IHC) oder in situ-Hybridisierungs (ISH)-Prozeduren, zu standardisieren und zu klassifizieren, wie auch Verfahren zur Verwendung und Herstellung der hier beschriebenen Referenzstandards. Unsere Referenzsysteme sind bevorzugt im Wesentlichen „zellfrei" und können unter Verwendung von relativ einfachen Maßnahmen hergestellt werden.
Die Referenzstandards, wie hier beschrieben, stellen einfache Mittel bereit, um einen „Standard" zu erstellen, in anderen Worten einen etablierten Wert einer messbaren Eigenschaft, durch welchen eine Probe oder eine Einzelheit eines Tests bewertet werden kann. Sie können als Farbstandards, Positionsstandards, Quantitätsstandards, Qualitätsstandards oder als diagnostische Standards verwendet werden.
Insbesondere erlauben die hier beschriebenen Referenzstandards, den Status oder den Zustand einer Probe oder von jeglichen Komponenten der Probe zu bestimmen. In einigen bevorzugten Ausführungsformen erlauben sie die Detektion, ob eine Probe diagnostisch relevante Spiegel, Mengen oder Konzentrationen eines bestimmten relevanten Antigens umfasst. Die Referenzstandards, wie hier beschrieben, werden vorzugsweise verwendet, um Spiegel oder Mengen einer detektierbaren Einheit in Geweben oder vorzugsweise Zellen, die in biologischen Proben enthalten sind, zu messen.
Dementsprechend wird in bevorzugten Ausführungsformen die Menge der detektierbaren Einheit in dem Referenzstandard oder ebenen Schnitt davon vorab festgelegt, so dass sie einer diagnostisch relevanten Menge oder Konzentration entspricht.
Mit „diagnostisch relevant" meinen wir einen Spiegel oder eine Menge der detektierbaren Einheit, der bzw. die, wenn sie in der biologischen Probe vorhanden sind, ein Indikator eines Zustands oder einer Erkrankung oder eines Symptoms ist, der, die bzw. das in der Probe oder dem Individuum, von welchem die Probe stammt, möglicherweise vorhanden ist. Darüber hinaus kann dies eine Anfälligkeit für die Erkrankung oder den Zustand u.s.w. anzeigen. Die Detektion eines „diagnostisch relevanten" Spiegels oder einer „diagnostisch relevanten" Menge kann ausreichend sein, um anzuzeigen, dass die Erkrankung wahrscheinlich vorliegt, obwohl andere Bestimmungen erforderlich sein können, um medizinisch die Schlussfolgerung zu treffen, dass die Person an der Erkrankung leidet. Dementsprechend sind unsere Verfahren im Allgemeinen in der Lage, eine Anzeige bezüglich des Vorliegens oder der Menge einer detektierbaren Einheit in einer Probe bereitzustellen, und dürfen nicht als Diagnoseverfahren per se behandelt werden.
Es versteht sich, dass die genaue Menge oder Konzentration der detektierbaren Einheit in dem Referenzstandard abhängig von dem betreffenden Zustand oder der betreffenden Erkrankung variieren kann. Im Allgemeinen wird die Menge oder Konzentration der detektierbaren Einheit in dem Referenzstandard im Wesentlichen dem Spiegel oder der Konzentration entsprechen, bei welchem oder welcher erwartet wird, dass die Erkrankung auftritt. Alternativ oder zusätzlich kann eine geringere Menge oder Konzentration der detektierbaren Einheit in dem Referenzstandard vorhanden sein und der Verwender angewiesen werden, dass eine jegliche in der biologischen Probe detektierte Menge oder Konzentration, die substantiell (oder quantitativ oberhalb dieses Spiegels) liegt, als eine Anzeige der Erkrankung u.s.w. aufgefasst werden sollte.
Der Spiegel, die Menge u.s.w, der detektierbaren Einheit in der Probe können in bevorzugten Ausführungsformen einen „Zustand" oder Status einer Zelle oder eines Gewebes, die darin enthalten sind, anzeigen. Ein solcher Spiegel, eine solche Menge u.s.w. zeigt dementsprechend bevorzugt den Zustand des Organismus, von welchem die Zelle oder das Gewebe erhalten worden sind, an. Der Zustand kann ein jeglicher Zustand der Zelle, des Gewebes, Organs oder Organismus sein, dessen Detektion wünschenswert sein kann. Umfasst werden Zustände, die die Zelle u.s.w. als Teil von normalen biologischen Prozessen, wie als Teil eines Entwicklungs- oder Differenzierungsprogramms, annehmen kann. Obwohl der Begriff „Zustand" physiologisch normale oder ungestörte Zustände umfasst, bezieht er sich vorzugsweise auf nicht-physiologische Standardzustände.
Bevorzugte nicht-physiologische Standardzustände umfassen Erkrankungszustände oder jegliche Zustände, die zu einer Erkrankung führen. Die Begriffe „diagnostisch relevanter Spiegel", „diagnostisch relevante Quantität" und „diagnostisch relevante Menge" sollten so aufgefasst werden, dass sie einen Spiegel, eine Quantität oder Menge einer detektierbaren Einheit in einer Probe bedeuten, welcher) einen Zustand oder eine Erkrankung in einem Individuum, von welchem die Probe erhalten worden ist, anzeigt.
Die diagnostisch relevante Menge einer detektierbaren Einheit wird von der jeweiligen fraglichen Erkrankung oder dem jeweiligen fraglichen Zustand abhängen und kann als Standards etabliert werden. Es versteht sich, dass der Fachmann auf diesem Gebiet sich solcher Standards bewusst sein wird und in der Lage sein wird, die relevante diagnostisch relevante Menge abhängig von der Erkrankung oder dem Zustand zu bestimmen.
Ein Referenzstandard, wie hier beschrieben, umfasst wenigstens zwei Komponenten: (i) eine Menge einer relevanten detektierbaren Einheit und (ii) ein Trägermedium, welches die detektierbare Einheit trägt. Die detektierbare Einheit beschreibt einen länglichen Pfad und beschreibt vorzugsweise einen im Allgemeinen länglichen Pfad in dem Einbettungsmedium. Wie hier beschrieben, liegt der Referenzstandard vorzugsweise in Form eines Blocks vor.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der Referenzstandard derart, dass eine detektierbare Menge der detektierbaren Einheit in einem definierten Bereich, vorzugsweise einem Referenzbereich, in einem Querschnitt des Referenzstandards vorhanden ist.
In hochgradig bevorzugten Ausführungsformen weist der Referenzbereich, der in dem Querschnitt des Referenzstandards vorhanden ist, ähnliche Abmessungen wie eine Zelle, beispielsweise eine prokaryotische Zelle oder eine eukaryotische Zellen, vorzugsweise eine tierische Zelle und am meisten bevorzugt eine humane Zelle, auf. D.h. der Referenzbereich weist in solchen Ausführungsformen ungefähr die gleiche Größe oder Gestalt bzw. Form wie eine Zelle oder beides auf, so dass der Referenzbereich eine Gestalt aufweist, die eine wirkliche Zelle in der Probe nachahmt. Dies ermöglicht, dass ein direkter Vergleich zwischen einer Zelle in einer Probe und dem in der Scheibe oder dem Querschnitt vorhandenen Referenzbereich leicht vorgenommen werden kann. Ein Verwender kann dann beispielsweise leicht (mit dem Auge) das Ausmaß einer Färbung einer Zelle und das Ausmaß einer Färbung des Querschnittsprofils vergleichen, um ein Urteil darüber zu treffen, ob jene Zelle „positiv" ist oder nicht.
Der Referenzbereich hat vorzugsweise einen Durchmesser (oder eine größte oder maximale Abmessung) zwischen ungefähr 0,5 μm und 25 μm, mehr bevorzugt zwischen 1 μm und 20 μm, sogar noch mehr bevorzugt zwischen 1,5 μm und 15 μm. Die Abmessung kann bis zu, aber vorzugsweise geringer als 30 μm, mehr bevorzugt 29 μm oder weniger, viel mehr bevorzugt 28 μm oder weniger, sogar noch mehr bevorzugt 27 μm oder weniger, mehr bevorzugt 26 μm oder weniger oder mehr bevorzugt 25 μm oder weniger sein. Besonders bevorzugte Ausführungsformen sind jene mit Durchmessern oder größten Abmessungen von oder im Wesentlichen von 0,5 μm, 1 μm, 2 μm, 3 μm, 4 μm, 5 μm, 6 μm, 7 μm, 8 μm, 9 μm, 10 μm, 11 μm, 12 μm, 13 μm, 14 μm, 15 μm, 16 μm, 17 μm, 18 μm, 19 μm, 20 μm, 21 μm, 22 μm, 23 μm, 24 μm, 25 μm.
In hochgradig bevorzugten Ausführungsformen beschreibt die detektierbare Einheit einen länglichen Pfad, welcher längs in Bezug auf den Referenzstandard verläuft. Der Begriff „längs" wird so verstanden, dass er entlang oder in Bezug auf die Längsrichtung bedeutet. Der längliche Pfad verläuft oder erstreckt sich dementsprechend bevorzugt in der Richtung der Länge des Referenzstandards.
Eine bevorzuge Konfiguration, in welcher die detektierbare Einheit längs in Bezug auf den Referenzstandard angeordnet ist, ist in 2A gezeigt. Andere Konfigurationen sind möglich und werden nachfolgend detaillierter beschrieben.
Die detektierbare Einheit ist eine, deren Vorliegen und vorzugsweise Menge detektierbar/aufdeckbar ist, d.h. deren Vorliegen demonstrierbar oder deren Menge messbar, entweder direkt oder indirekt, ist. Sie kann für das bloße Auge sichtbar oder mit Hilfe von Vergrößerung, wie der Verwendung eines Mikroskops, sichtbar sein. Die detektierbare Einheit ist möglicherweise nur dann sichtbar, wenn sie mit einem Farbstoff gefärbt wird. Die detektierbare Einheit, die eingebettet ist oder getragen wird, kann verschiedene Formen annehmen, wie weiter unten detaillierter beschrieben wird. Die detektierbare Einheit ist vorzugsweise eine, die durch Verwendung eines Bindemittels, das in der Lage ist, an die detektierbare Einheit zu binden und deren Vorliegen aufzudecken, detektierbar ist. Die detektierbare Einheit kann insbesondere Protein, Peptid oder Polypeptid oder Nukleotid, Nukleinsäuren, insbesondere DNA und RNA, umfassen.
Weitere Einzelheiten über detektierbare Einheiten, die für eine Verwendung in dem hier beschriebenen Referenzstandard geeignet sind, werden später in diesem Dokument bereitgestellt.
Der Referenzstandard ist vorzugsweise derart, das ein Querschnitt davon einen definierten Bereich umfasst, welcher eine bekannte oder vorab definierte Menge einer detektierbaren Einheit umfasst. Wenn die Menge der detektierbaren Einheit in dem Referenzstandard bekannt ist, kann sie mit jener in der Probe verglichen werden, um die Menge oder Qualität der detektierbaren Einheit in jener Probe oder vorzugsweise Zellen, die in der Probe enthalten sind, zu ermitteln.
In hochgradig bevorzugten Ausführungsformen werden Scheiben oder Schnitte des Referenzstandards herangezogen. Diese Scheiben oder Schnitte sollten als Teil der Erfindung, die hier beschrieben wird, behandelt werden.
Solche Scheiben oder Schnitte umfassen definierte Bereiche, welche die detektierbare Einheit umfassen, wie in 2C gezeigt. Aus einem Referenzstandard kann eine Mehrzahl von Scheiben oder Schnitten hergestellt werden Die Scheiben oder Schnitte können wie ein jeglicher Schnitt ausgehend von einem FFPE-Material behandelt werden, um die detektierbare Einheit aufzudecken. Eine Behandlung der Scheiben oder Schnitte des Referenzstandards zusammen (vorzugsweise parallel mit) der Probe stellt Gleichförmigkeit sicher und verringert oder beseitigt Variationen aufgrund von Unterschieden in Protokollen, Materialien u.s.w., wie früher in diesem Dokument diskutiert worden ist.
In bevorzugten Ausführungsformen werden die Schnitte oder Scheiben einem oder mehreren, vorzugsweise allen diesen Schritten, vorzugsweise parallel mit dem relevanten FFPE-Schnitt unterworfen. Dies wird in 3 veranschaulicht.
Die Scheiben oder Schnitte müssen nicht von gleichförmiger Dicke sein, können dies aber sein. Es wird sich auch verstehen, dass die Färbungsintensität durch die Dicke der Scheibe verändert werden kann. Beispielsweise könnten verschiedene Färbungsintensitäten erhalten werden, indem Scheiben von unterschiedlicher Dicke verwendet werden. Dementsprechend kann das Färbungsausmaß oder -niveau variiert werden, indem die Dicke des Schnitts und dementsprechend die Menge von Fasermaterial pro Fläche variiert wird. Da die Fasern in der Länge homogen sind, ist dies eine sehr einfache Methode zum Kontrollieren der Färbungsintensität.
VERWENDUNGEN FÜR DEN REFERENZSTANDARD
Wie oben beschrieben, stellen die Referenzstandards, wie hier beschrieben, einfache Mittel bereit, um einen Standard" zu etablieren, in anderen Worten einen etablierten Wert einer messbaren Eigenschaft einer detektierbaren Einheit. Es kann auch die gleiche oder eine andere Eigenschaft der gleichen, einer ähnlichen oder unterschiedlichen Einheit in einer Probe oder einem Prüfgegenstand gemessen werden und die Werte können verglichen werden.
Im allgemeinsten Sinne ermöglicht der Referenzstandard, das Vorliegen der detektierbaren Einheit nachzuweisen. Dementsprechend ist es für einige Zwecke oftmals genug, einfach Informationen über das Vorliegen der detektierbaren Einheit in dem Referenzstandard zu erhalten. Jedoch können für andere Zwecke Informationen über ein oder mehrere Merkmale der detektierbaren Einheit gewünscht werden. Dementsprechend können beispielsweise Merkmale, wie Abmessungen, Menge, Qualität, Farbe, Orientierung, Position, Reaktivität (oder eine jegliche Kombination von zwei oder mehreren von diesen) u.s.w., bestimmt werden. Die Referenzstandards können auch verwendet werden, um eine oder mehrere Maßnahmen in einem Verfahren zu validieren.
Farbstandard
In einer Ausführungsform wird die Farbe der detektierbaren Einheit detektiert oder bestimmt. So kann es dementsprechend beispielsweise wünschenswert sein, einen Farbstandard in einer Reihe von Färbungsexperimenten zu haben. In diesem Falle kann der hier beschriebene Referenzstandard verwendet werden, um eine „Standard"farbe bereitzustellen durch Aufnahme einer detektierbaren Einheit, die eine vorab festgelegte Farbe aufweist oder gefärbt worden ist, um eine vorab festgelegte Farbe bereitzustellen.
Die Verwendung eines solchen „Farbstandards" ermöglicht es einer Person, die die Arbeiten ausführt, zu beurteilen, ob eine Probe, die gefärbt sein kann, der „Standard"farbe ähnlich ist oder sich von dieser unterscheidet. Beispielsweise kann erwartet werden, dass die Probe, wenn sie gefärbt wird, eine bestimmte blaue Farbe erzeugt, wenn sie positiv ist, und der Referenzstandard kann dementsprechend eine detektierbare Einheit umfassen, die eine solche blaue Farbe aufweist oder gefärbt werden kann, so dass sie eine solche blaue Farbe erzeugt. Die Farbe in der Probe kann dementsprechend mit der blauen Farbe, die durch den Referenzstandard bereitgestellt wird, verglichen werden, um zu ermitteln, ob die Probe als positiv angesehen werden sollte oder nicht.
Darüber hinaus kann der „Farbstandard" auch beispielsweise für eine Kalibrierung von optischen Geräten verwendet werden. Farbabweichungen oder -fehler bei der Farbdetektion, die während einer Verwendung von optischen Geräten auftreten, können dementsprechend verhindert werden oder dafür Anpassungen getroffen werden durch Vergleich der Response der Geräte auf die Standardfarbe und durch geeignete Anpassung, sofern erforderlich. Für eine genauere Kalibrierung können zwei oder mehrere „Standard"farben, beispielsweise von verschiedenen Wellenlängen, in den Referenzstandard aufge- nommen werden.
Positionsstandard
Die Position der detektierbaren Einheit innerhalb des Referenzstandards kann detektiert oder bestimmt werden. Dementsprechend kann der Bereich, der die erwartete Farbe umfasst, durch eine Person, die die Arbeiten vornimmt, oder durch Geräte detektiert werden, um beispielsweise einen Referenzpunkt für eine Gitterlokalisierung oder Gitterposition in der Probe zu ermitteln. Der Abstand zwischen einem solchen Referenzpunkt und einem Punkt in der Probe kann leicht gemessen werden, um Informationen über Abstand, Fläche oder Volumen innerhalb des Referenzstandards oder der Probe bereitzustellen. Der Referenzstandard oder der Positionsstandard können zwei oder mehrere solche Positionsstandards, vorzugsweise drei oder mehrere Positionsstandards umfassen. Die Verwendung einer Mehrzahl von Farbe aufweisenden Positionen mit der gleichen oder unterschiedlichen Farben ermöglicht eine höhere Genauigkeit von Bemessung, Positionierung und Navigierung durch Dreiecknavigation.
Quantität/Qualitätsstandard
In anderen Ausführungsformen wird die Menge der detektierbaren Einheit detektiert oder bestimmt. Dies wird am leichtesten erzielt durch Reaktion mit dem Bindemittel und das Bindemittel kann für diesen Zweck markiert werden. Das Bindemittel bindet vorzugsweise an die detektierbare Einheit in einer stöchiometrischen Weise. Die Intensität der Färbung durch das Bindemittel liefert dann Informationen über die Quantität oder Menge der detektierbaren Einheit. Es versteht sich jedoch, dass andere Merkmale der Färbung und nicht nur die Intensität genauso wichtig oder nützlich sein können.
Validierungsstandard
Zusätzlich zu den anderswo in diesem Dokument beschriebenen anderen Verwendungen kann der hier beschriebene Referenzstandard für das Validieren oder Verifizieren von einem oder mehreren Maßnahmenschritten in einem Verfahren verwendet werden. Mit Validierung und Verifizierung beziehen wir uns speziell auf ein Verfahren, durch welches der Erfolg, die Effektivität oder Effizienz eines Maßnahmenschritts gemessen wird.
Allgemein offenbaren wir ein Verfahren zur Validierung einer Maßnahme, wobei das Verfahren umfasst, einen Referenzstandard für eine detektierbare Einheit, wie in diesem Dokument offenbart, bereitzustellen, die Maßnahme auf den Referenzstandard oder einen Abschnitt davon (insbesondere eine Scheibe oder einen Schnitt davon) anzuwenden und eine Veränderung bei einer Eigenschaft der detektierbaren Einheit als Ergebnis der Maßnahme zu detektieren. Die Eigenschaft der detektierbaren Einheit, die verändert wird, ist vorzugsweise eine, die den Erfolg oder das Fehlschlagen (oder den relativen Erfolg oder das relative Fehlschlagen) der Maßnahme anzeigt. Insbesondere kann die detektierbare Einheit auf eine solche Weise modifiziert werden, dass die Maßnahme, wenn sie erfolgreich ist, die Modifizierung entfernt. Alternativ oder zusätzlich kann die detektierbare Einheit durch die Maßnahme modifiziert werden. In jedem Falle ist die Modifizierung eine, die leicht detektierbar ist als ein Mittel, um den Erfolg oder das Fehlschlagen der Maßnahme zu detektieren.
Dementsprechend offenbaren wir ein Verfahren zum Bestimmen der Wirksamkeit oder des Erfolgs einer Maßnahme, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Bereitstellen eines Referenzstandards, wie in diesem Dokument beschrieben, in welchem eine detektierbare Eigenschaft der detektierbaren Einheit als ein Ergebnis der Maßnahme verändert wird; und (b) Ausführen der Maßnahme an dem Referenzstandard; und (c) Detektieren einer Veränderung bei der detektierbaren Eigenschaft der detektierbaren Einheit.
In einer Ausführungsform wird eine detektierbare Eigenschaft der detektierbaren Einheit als ein Ergebnis einer erfolgreichen Maßnahme verändert, welche Veränderung in der detektierbaren Eigenschaft der detektierbaren Einheit detektiert wird, um zu ermitteln, dass die Maßnahme erfolgreich ist. Alternativ oder zusätzlich wird eine detektierbare Eigenschaft der detektierbaren Einheit als ein Ergebnis einer nicht erfolgreichen Maßnahme verändert, welche Veränderung in der detektierbaren Eigenschaft der detektierbaren Einheit detektiert wird, um zu ermitteln, dass die Maßnahme nicht erfolgreich ist.
Wir offenbaren auch die Verwendung eines Referenzstandards, wie in diesem Dokument beschrieben, als einen Validierungsstandard für die Antigengewinnung (Antigen-Retrieval), einen Entparaffinierungsstandard, einen Validierungsstandard für die Blockierung, einen Validierungsstandard für das Waschen, einen Validierungsstandard für primäre Antikörper, einen Validierungsstandard für sekundäre Antikörper, einen Kalibrierungsstandard oder einen diagnostischen Standard. Die detektierbare Einheit umfasst vorzugsweise eine Eigenschaft, die detektierbar ist und die als ein Ergebnis der Maßnahme verändert wird, d.h. ob die Maßnahme erfolgreich oder nicht erfolgreich ist.
Insbesondere kann der hier beschriebene Referenzstandard verwendet werden, um einen jeglichen oder mehrere der Schritte, die bei traditionellen IHC-Färbungsprozeduren eingesetzt werden, zu validieren. Solche Schritte können umfassen: Entfernung von Paraffin, Antigengewinnung (Antigen-Retrieval, AR), Blockierung, endogene Biotin-Blockierung (beispielsweise wenn ein auf Biotin basierendes Visualisierungssystem verwendet wird), endogene Enzym-Blockierung (beispielsweise Phosphatase- oder Peroxidaseaktivität), ein oder mehrere Waschschritte, Inkubation mit Visualisierungsmittel, wie einem primären Antikörper, Inkubation mit sekundären Visualisierungskomponenten, Chromogen-Färbung (beispielsweise enzymkatalysiert), Informationserfassung betreffend die Färbung und -analyse.
Insbesondere kann der Referenzstandard verwendet werden, um zu validieren: i) Verifizieren der Fähigkeit oder Funktionalität des Visualisierungssystems, um die Zellpopulation im Rahmen derjeweiligen Färbungsprozedur anzufärben, ii) Verifizieren der Fähigkeit oder Funktionalität des primären Antikörpers, die Zellpopulation im Rahmen derjeweiligen Färbungsprozedur anzufärben, iii) Definieren einer Färbungs-Schwellenwertsintensität für das Zählen von positiv gefärbten Zellen, iv) Definieren des diagnostischen Schwellenwertsintensitätsverhältnisses zwischen zwei oder mehreren gefärbten Populationen, v) oder Verifizieren der Funktion von individuellen Reagenzien in dem Färbungsprotokoll, beispielsweise Antigengewinnung (Antigen-Retrieval), Wascheffizienz, Blockierung von Peroxidaseaktivität und sekundäre Visualisierungsreagenzien.
In hochgradig bevorzugten Ausführungsformen kann der Referenzstandard als ein Validierungsstandard für die Schritte der Zugabe des primären Antikörpers, des Antigengewinnungsschritts, der Zugabe der sekundären Visualisierungsreagenzien und der Färbungsinformationserfassung und -analyse verwendet werden.
Allgemeiner Maßnahmensvalidierungsstandard
In einer besonderen Ausführungsform kann die detektierbare Einheit Streptavidin oder Avidin umfassen. Das Streptavidin oder Biotin können an den länglichen Pfad, wie die Faser, gebunden werden. Der resultierende Referenzstandard kann dann als ein einfacher Indikator für die korrekte Zugabe von bestimmten Reagenzien, beispielsweise Inkubation mit dem korrekten primären Antikörper, verwendet werden. Durch Zugeben von beispielsweise einer geringen Menge von biotinyliertem Maus-Antikörper zu der ansonsten unmarkierten primären Antikörperlösung wird das Visualisierungssystem den Referenzstandard positiv anfärben, wenn der korrekte primäre Antikörper an dem jeweiligen Schnitt verwendet wird.
In einer anderen besonderen Ausführungsform kann die detektierbare Einheit ein Immunglobulin, beispielsweise ein(en) Kaninchen- oder Maus-Immunglobulin oder -Antikörper, umfassen. Das Immunglobulin könnte beispielsweise an die Faser gebunden werden in Ausführungsformen, die diese einsetzen. Die Fähigkeit der sekundären Visualisierungssysteme, Kaninchen- oder Mäuse-Antikörper zu erkennen und zu färben, kann dadurch validiert werden.
In noch einer anderen besonderen Ausführungsform kann die detektierbare Einheit ein Hapten, beispielsweise DNP (2,4-Dinitrophenyl (DNP)-Hapten), umfassen. Andere Haptene, die geeignet sind, umfassen: Phosphorylcholin, Dextran, NIP (4-Hydroxy-3-iod-5-nitrophenylacetyl), NP (4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl), PC (Phosphorylcholin) und TNP (2,4-6-Trinitrophenyl).
Das Hapten könnten beispielsweise an die Faser gebunden werden in Ausführungsformen, die diese einsetzen. Ein solcher Maßnahmensvalidierungsstandard könnte verwendet werden, um die Zugabe eines primären Antikörpers zu einem Detektionssystem zu validieren. In diesem Falle würde eine Menge von anti-Hapten-Antikörper verwendet werden, um damit die primäre Antikörperlösung „zu versetzen" („spike"). Eine Zugabe des primären Antikörpers (welcher den anti-Hapten-Antikörper enthält) würde es erlauben erlauben, dass der anti-Hapten-Antikörper an das Hapten, das mit der Faser konjugiert ist, bindet und dieses nachweist. Wenn das Hapten nachgewiesen wird, kann daraus geschlossen werden, dass der primäre Antikörper korrekt zu dem Test hinzugegeben worden ist. Dementsprechend wird das Visualisierungssystem den Referenzstandard positiv anfärben, wenn der korrekte primäre Antikörper an dem jeweiligen Schnitt verwendet wird.
Der Begriff „Hapten", wie er in diesem Dokument verwendet wird, sollte so verstanden werden, dass er sich auf ein kleines Molekül bezieht, welches aus sich selbst heraus üblicherweise nicht antigen ist, das mit Antikörpern von geeigneter Spezifität reagieren und die Bildung von solchen Antikörpern bei Konjugation mit einem größeren antigenen Molekül, dem Träger oder Schlepper, auslösen kann. Wenn ein anti-Hapten-Antikörper verwendet wird, um den primären Antikörper damit zu versetzen, sollte der anti-Hapten-Antikörper vorzugsweise aus der gleichen tierische Quelle wie der primäre Antikörper stammen, z.B. sollte ein Kaninchen-anti-Hapten-Antikörper vorzugsweise verwendet werden, um die Zugabe eines Kaninchen-anti-Antigen-Antikörpers zu validieren.
Schnittdicken-Standard
Der Referenzstandard kann als ein Standard, um die korrekte Dicke einer Scheibe aus einem Paraffinblock zu validieren, verwendet werden. Es ist beispielsweise bekannt, dass es wichtig ist, dass eine Paraffinscheibe von korrekter Dicke durch das Mikrotom geschnitten wird. Aufgrund von Variationen bei der Temperatur, unterschiedlichen Arten oder Herstellungen von Mikrotomen oder von verwendeten Klingen, unterschiedlichen Kalibrierungen von solchen Instrumenten von einem Labor zum anderen, kann jedoch die Dicke einer Paraffinscheibe, welche eine Probe enthält, oftmals schwierig bis unmöglich zu standaridisieren sein.
Ein Referenzstandard gemäß der Beschreibung kann verwendet werden, um diese Maßnahme zu validieren, indem er auf die gleiche Dicke geschnitten wird wie die fragliche Scheibe, welche eine Probe enthält. In anderen Worten wird ein die Probe enthaltender Paraffinblock geschnitten, um eine Scheibe mit einer bestimmten Dicke zu bilden, parallel mit einem Referenzstandard in Form eines Blocks. Abhängig von der Dicke der Scheibe des Referenzstandards wird die detektierbare Einheit in dem Referenzstandard eine unterschiedliche detektierbare Eigenschaft, wie eine höhere optische Dichte, Dunkelheit u.s.w., aufweisen. Wenn die Beziehung zwischen der Dicke des Referenzstandards und dem Wert der detektierbaren Eigenschaft bekannt ist, kann dem Verwender eine Angabe des erwarteten Werts der detektierbaren Einheit für die optimale Schnitt- oder Scheibendicke bereitgestellt werden. Dementsprechend ermittelt der Verwender, ob die korrekte Dicke erzielt worden ist, indem der Wert der detektierbaren Eigenschaft in dem zu Scheiben geschnittenen Referenzstandard gemessen und dieser mit dem erwarteten Wert verglichen wird.
Validierungsstandard für die Antigengewinnung (Antigen-Retrieval)
Der Referenzstandard kann als ein Validierungsstandard für die Antigengewinnung (Antigen-Retrieval) verwendet werden. Zu diesem Zweck offenbaren wir ein Verfahren zum Bestimmen der Wirksamkeit oder des Erfolgs einer Antigengewinnungs (Antigen-Retrieval)-Maßnahme, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Bereitstellen eines Referenzstandards, wie in diesem Dokument beschrieben, in welchem eine detektierbare Eigenschaft der detektierbaren Einheit als ein Ergebnis der Antigengewinnungs (Antigen-Retrieval)-Maßnahme verändert wird, wobei die detektierbare Eigenschaft der detektierbaren Einheit das Maskieren oder Demaskieren von einem oder mehreren Epitopen umfasst; (b) Ausführen der Antigengewinnungs (Antigen-Retrieval)-Maßnahme an dem Referenzstandard; und (c) Detektieren einer Veränderung bei der detektierbaren Eigenschaft der detektierbaren Einheit.
In hochgradig bevorzugten Ausführungsformen wird die detektierbare Einheit in dem Referenzstandard modifiziert, so dass ein oder mehrere Epitope maskiert werden, von denen einige oder alle im Rahmen einer Antigengewinnungs (Antigen-Retrieval)-Maßnahme, die erfolgreich ist, demaskiert werden.
Antigengewinnungs (Antigen-Retrieval; „AR")-Maßnahmen können standardisiert oder überwacht werden durch Einsatz von Referenzstandards, die detektierbare Einheiten umfassen, die normalerweise nicht gefärbt werden können oder in denen das Färbungsausmaß stark von dem Antigengewinnungs-Prozess abhängt.
Die detektierbare Einheit kann derart modifiziert werden, dass sie ihre Antigenität vollständig oder teilweise verliert. In anderen Worten können ein oder mehrere Epitope in der detektierbaren Einheit künstlich oder natürlich maskiert werden. Eine korrekte Antigengewinnung (Antigen-Retrieval) demaskiert das oder die Epitope) oder Antigene und wird durch korrekte Färbung der detektierbaren Einheit im Rahmen von nachfolgenden Maßnahmen nachgewiesen.
Das Maskieren oder der Verlust von Antigenität (das bzw. der ein oder mehrere Epitope betreffen kann) kann chemisch ausgeführt werden. Beispielsweise könnte die gleiche Immunglobulin-modifizierte Faser, wie sie oben beschrieben wurde, mit beispielsweise Formaldehyd fixiert werden. Insbesondere könnte die detektierbare Einheit „maskiert" werden durch Überfixierung mit Formaldehyd, was zu dem Verlust der meisten oder von allen der Epitope und einer geringen Diffusion in dem Referenzmaterial führt.
Paraformaldehyd oder jegliche andere Fixiermittel, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, können ebenfalls verwendet werden. Derivate mit acetylierenden, alkylierenden oder andersartigen maskierenden Reagenzien können für diesen Zweck ebenfalls eingesetzt werden. Es sind aus der Literatur der organischen Chemie zahlreiche Methoden bekannt, beispielsweise ein Maskieren unter Verwendung von Schiff-Basen, Estern, Ethern oder Halbacetal-Derivaten.
Das Maskieren kann auch immunologisch bewirkt werden, durch beispielsweise die Verwendung eines geeigneten maskierenden Antikörpers oder anderen Bindemittels. Das Referenzmaterial kann dementsprechend chemisch und/oder immunologisch maskierte Ziele für entweder den primären Antikörper oder das sekundäre Visualisierungssystem enthalten.
Demaskierung oder Schutzgruppenentfernung kann durch entweder chemoselektive Antigenrückgewinnung („Antigen-Retrieval") oder zufallsgesteuerte Antigengewinnung („Antigen-Retrieval") erzielt werden. Maskierte Mittel, die nur gefärbt werden, wenn umfassende Antigengewinnungsmaßnahmen verwendet werden, können auch eingesetzt werden.
Ein solcher Referenzstandard kann als ein Indikator für eine korrekte Antigengewinnung (Antigen-Retrieval) verwendet werden. Eine korrekte Antigen-Retrieval-Maßnahme wird das Immunglobulin demaskieren und diese Ausführungsform des Referenzstandards färben. Fasern mit anderen Proteinen oder Peptiden könnten mit beispielsweise Formaldehyd fixiert werden und dadurch ihre Antigenität voll ständig verlieren. Ein solcher Referenzstandard wird eine korrekte Antigengewinnung (Antigen-Retrieval) anzeigen. Eine korrekte Antigengewinnungs (Antigen-Retrieval)-Maßnahme wird das Immunglobulin demaskieren und diese Ausführungsform des Referenzstandards färben.
Entparaffinierungsstandard
Der Referenzstandard kann als Validierungsstandard für die Entparaffinierung, d.h. für den Schritt der Paraffinentfernung, verwendet werden.
Zu diesem Zweck offenbaren wir ein Verfahren zum Bestimmen der Wirksamkeit oder des Erfolgs einer Entparaffinierungsmaßnahme, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Bereitstellen eines Referenzstandards, wie in diesem Dokument beschrieben, in welchem eine detektierbare Eigenschaft der detektierbaren Einheit als ein Ergebnis der Entparaffinierungsmaßnahme verändert wird, wobei die detektierbare Eigenschaft der detektierbaren Einheit das Vorliegen oder die Menge von detektierbarer Einheit in dem Referenzstandard nach der Entparaffinierungsmaßnahme umfasst; (b) Ausführen der Antigengewinnungs (Antigen-Retrieval)-Maßnahme an dem Referenzstandard; und (c) Detektieren einer Veränderung bei der detektierbaren Eigenschaft der detektierbaren Einheit.
In hochgradig bevorzugten Ausführungsformen ist die detektierbare Einheit in dem Referenzstandard in dem Entparaffinierungsmedium löslich und wobei wenigstens ein Teil, vorzugsweise die Gesamtmenge der detektierbaren Einheit nach einer erfolgreichen Entparaffinierungsmaßnahme entfernt wird.
Dementsprechend kann Referenzmaterial mit nicht-kovalent gebundenen und in Wasser unlöslichen Zielstrukturen, die durch beispielsweise die sekundären Visualisierungssysteme detektiert werden, eine unzureichende Entparaffinierung anzeigen, wenn sie gefärbt werden.
Beispielsweise erfolgt bei traditionellen IHC-Verfahren die Entparaffinierung durch Waschen mit Toluol oder beispielsweise Citrus- oder Kokosnussöl, gefolgt von einer Rehydratisierung in Alkohol/Wasser-Lösungen. Dementsprechend kann ein Referenzstandard, der für einen solchen Zweck verwendet wird, detektierbare Einheiten umfassen, die von ihren Positionen innerhalb des Trägermediums leicht abgelöst oder entfernt oder verdrängt werden. Sie können beispielsweise in bestimmten Ausführungsformen an die Fasern lose, beispielsweise durch nicht-kovalente Mittel, angeheftet sein. Für solche Zwecke ist es wünschenswert, dass die detektierbare Einheit in Wasser unlöslich ist. Wenn der Entparaffinierungsschritt korrekt ausgeführt wird, dann sollte die detektierbare Einheit durch die Reagenzien, wie sekundäre Visualisierungssysteme, nicht nachgewiesen werden.
Darüber hinaus kann ein Marker, wie ein Farbstoff, zu dem Paraffin hinzugegeben werden. Ein solcher Farbstoff würde vorzugsweise die detektierbare Einheit oder die Faser, an welche die detektierbare Einheit gebunden ist, anfärben. Wenn eine unzureichende Entparaffinierung stattgefunden hat, wird das Vorliegen von Farbstoff für das menschliche Auge leicht sichtbar sein (oder durch Geräte, wie Bildanalysesysteme, leicht detektiert werden). Dies wird anzeigen, dass eine unzureichende Entparaffinierung stattgefunden hat.
Validierungsstandard für das Blockieren
Der hier beschriebene Referenzstandard kann auch eingesetzt werden, um jegliche Blockierungsschritte zu validieren, beispielsweise das Blockieren von endogener Aktivität, wie von endogener Biotin-Aktivität oder enzymatischer Aktivität.
So müssen beispielsweise Biotin oder andere Haptene, die von Natur aus in Geweben abgelagert sind, blockiert werden, bevor man ein Visualisierungssystem unter Verwendung von Biotin oder anderen Haptenen verwenden kann. Aufgrund des Vorliegens von endogenem Biotin sind sekundäre (beispielsweise Ziege-anti-Maus- oder Ziege-anti-Kaninchen-)-Visualisierungssysteme bevorzugt, da sie weniger „Hintergrund"-rauschen erzeugen. Für das Validieren der Blockierung kann das Referenzmaterial Biotin (oder andere Haptene, wie Digoxigenin oder DNP), das in dem Visualisierungssystem verwendet wird, das an die Faser, wo vorhanden, gebunden sein kann, enthalten. Eine positive Färbung dieses Referenzmaterials wird eine unzureichende Biotin-Blockierung anzeigen – aufgrund von beispielsweise nicht-reaktiven Reagenzien, ineffizientem Mischen/nicht-effizienter Diffusion auf der Scheibe oder zu kurzer Inkubationszeit.
Das Referenzmaterial kann auch kovalent gebundenes Enzym enthalten, das in dem Enzymkatalysierten Färbesystem als detektierbare Einheit verwendet wird. Die typischen Enzyme, die verwendet werden, sind Peroxidase oder Phosphatase. Beispielsweise kann die detektierbare Einheit Meerrettich-Peroxidase enthalten. Alternativ oder zusätzlich, wenn der Referenzstandard Fasern umfasst, können solche Fasern, die mit beispielsweise Meerrettich-Peroxidase modifiziert sind, für das Validieren einer korrekten und effizienten endogenen Peroxid-Blockierung verwendet werden. Wenn der Referenzstandard nach dem letzten Peroxid-Chromogen-Schritt ungefärbt bleibt, wird festgestellt werden, dass die Blockierung effizient ist
Dementsprechend wird eine positive Färbung dieses Referenzmaterials eine unzureichende latente Enzymblockierung anzeigen – aufgrund von beispielsweise nicht-reaktiven Reagenzien, reversibler Blockierung, ineffizientem Mischen/nicht-effizienter Diffusion auf der Scheibe oder zu kurzer Inkubationszeit. Das Material könnte mit dem Antigengewinnungs (Antigen-Retrieval)-Referenzmaterial kombiniert werden.
Validierungsstandard für das Waschen
Der Referenzstandard kann auch verwendet werden, um die Effizienz einer jeglichen Anzahl von Waschschritten, beispielsweise Waschen mit Puffer, zu validieren. Das Referenzmaterial könnte für entweder das primäre oder sekundäre Visualisierungssystem eine detektierbare Einheit umfassen, die in organischem Lösemittel unlöslich ist (beispielsweise in Toluol unlöslich ist) und teilweise in Wasser unlöslich ist. Das Ziel sollte nicht kovalent an das Referenzmaterial gebunden werden. Es sollte durch Ionenpaarbildung oder Metallkomplexbindung oder einfach durch Adsorption gebunden werden.
Das Ziel könnte ein hohes Molekulargewicht aufweisen, um die Fähigkeit von Waschpuffern zu. testen, in das Material hinein zu diffundieren und das Ziel zu entfernen. Der Molekulargewichts-Ausschluss („MwCO") des Referenzmaterials (beispielsweise Cellulosefaser) sollte mit dem Mw der Ziele übereinstimmen, z.B. durch Auswahl der Porengröße oder des Fixierungsausmaßes.
Eine positive Färbung von diesem Referenzmaterial wird ein unzureichendes Waschen anzeigen - entweder aufgrund beispielsweise der Anzahl von Waschschritten, der Art des verwendeten Puffers, von ineffizientem Mischen auf dem Objektträger oder zu niedriger Temperatur oder zu geringen Diffusi onszeiten. Zu diesem Zweck sollten der aufgebrachte Probengewebeschnitt und das Referenzmaterial vorzugsweise die gleiche Dicke haben.
Alternativ könnte das Ziel durch einen detektierbaren Farbstoff mit hohem Molekulargewicht, der in dem Referenzmaterial eingeschlossen ist, ersetzt werden. Der Farbstoff wird durch effizientes Waschen entfernt werden – und wäre nur vorhanden, wenn das Waschen unzureichend oder unwirksam ist. Alternativ könnte ein Referenzstandard, welcher eine Faser (als detektierbare Einheit), hergestellt aus einem teilweise wasserlöslichen Material, verwendet werden. Wenn die Faser verschwindet, war das Waschen effizient.
Validierungsstandard für primäre Antikörper
Der Referenzstandard kann als ein Standard für einen jeglichen Inkubationsschritt, beispielsweise den Inkubationsschritt mit dem korrekten primären Antikörper, verwendet werden. Einer der kritischsten menschlichen Irrtümer bei der IHC-Färbung ist eine Inkubation mit dem falschen Antikörper.
Der Referenzstandard für eine Verwendung bei der Validierung der Zugabe des korrekten primären Antikörpers oder Inkubation könnte dementsprechend eine detektierbare Einheit umfassen, die in der Lage ist, an einen Bindungspartner zu binden (vorzugsweise spezifisch zu binden). Der Bindungspartner würde zu der Lösung des primären Antikörpers als ein „Marker", der spezifisch die detektierbare Einheit binden oder spezifisch sich daran anheften würde, hinzugesetzt werden und dementsprechend anzeigen, dass der korrekte primäre Antikörper verwendet worden war. Es wird sich verstehen, dass der primäre Antikörper in einer Form, die den „Marker" umfasst, vertrieben werden kann.
Als ein besonderes Beispiel könnte die detektierbare Einheit Streptavidin umfassen oder daraus bestehen und der „Marker" Biotin umfassen oder daraus bestehen. Beispielsweise kann der primäre Antikörper mit einem biotinylierten irrelevanten Maus-Antikörper ergänzt werden, der sich spezifisch an eine detektierbare Einheit in dem Referenzstandard, beispielsweise eine detektierbare Einheit, welche Biotin umfasst oder daraus besteht, anheften würde. Wenn Scheiben oder Schnitte des Referenzmaterials genommen werden (wie bevorzugt ist), würde die Referenz durch das Visualisierungssystem positiv angefärbt werden, wenn der korrekte Antikörper verwendet worden war. Es versteht sich, dass der primäre Antikörper selbst mit Biotin modifiziert werden und als „Marker" funktionieren könnte, so dass ein zusätzlicher „Marker" nicht streng notwendig ist.
Validierungsstandard für sekundäre Antikörper
Für eine Verwendung bei der Validierung der Zugabe des sekundären Antikörpers könnte das Referenzmaterial kovalent gebundene Maus- oder Kaninchen-Antikörper oder Fraktionen davon in verschiedener Dichte umfassen. Eine positive und abgestufte Anfärbung dieses Referenzmaterials wird die Funktionalität des sekundären Visualisierungssystems validieren. Das gleiche Referenzmaterial könnte mit dem Referenzmaterial, das für das Validieren des Antigengewinnungs (Antigen-Retrieval)-Schritts nützlich ist, kombiniert werden.
Kalibrierungsstandard
Neben einer Analyse der verschiedenen Referenzmaterialien für eine abgestufte primäre oder sekundäre Anfärbung könnte das Referenzsystem aus permanenten Farben und physikalischen Formen, die für das Kalibrieren von Kameras, optischen Vorrichtungen und Software-Algorithmen geeignet sind, bestehen oder diese enthalten.
Dementsprechend kann unter einem noch anderen Aspekt das Referenzmaterial als eine Kalibrierungssubstanz für eine jegliche Ausrüstung, beispielsweise eine digitale Bildverarbeitungsanlage oder eine jegliches automatisches Bildanalysensystem, dienen. Dies kann beispielsweise erzielt werden, indem eine bestimmte Farbe, Intensität oder eine bestimmte Anzahl von Ereignissen definiert wird. Dies ist besonders nützlich bei automatisierten Scannern (Abtastgeräten) und Mikroskopen. Indem ein gefärbtes Material mit einer immunologischen oder speziellen Färbung kombiniert wird, können Orientierung und Navigation an dem mit Objektträgern arbeitenden Mikroskop vereinfacht werden.
Ein solches Referenzmaterial könnte dazu beitragen, Größen, Farben, Farbspektren, Grenzen zwischen gefärbten Bereichen, Gegenfärbungsniveau und Hintergrund zu definieren.
Aus dem Obigen versteht sich, dass es möglich ist, einen Referenzstandard zu konstruieren, der in der Lage ist, verwendet zu werden, um mehr als einen der Verfahrensschritte zu validieren. Wir offenbaren beispielsweise Referenzstandards, die in der Lage sind, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 oder mehr Verfahrensschritte in einem jeglichen Verfahren zu validieren. Solche Referenzstandards können in geeigneter Weise eine Mehrzahl (oder mehr als eine) von detektierbare(n) Einheit(en), die gleich oder verschieden sein können, wie oben beschrieben, umfassen. Die Anordnung der detektierbaren Einheiten in dem Referenzstandard ist vorzugsweise derart, dass die resultierende Scheibe oder der resultierende Schnitt, die von dem Referenzstandard hergestellt worden sind, mehr als einen „Dot" (Fleck, Punkt) oder Referenzbereich, der in geeigneter Weise in einer Anordnung („array") angeordnet ist, umfasst.
Solche Referenzstandards können Scheiben oder Schnitte erzeugen, die beispielsweise eine Fleckenanordnung" („spot array") von 9 unterschiedlichen Referenzmaterialien umfassen. Sie können beispielsweise Flecken mit Zielen für den primären Antikörper in unterschiedlicher Dichte – was abgestufte Färbungsniveaus ergibt; Flecken mit leicht und abgestuft fixierten Zielen für das sekundäre Visualisierungssystem – allgemeine Validierung des Antigengewinnungs (Antigen-Retrieval-)-Schritts; Flecken mit leicht und abgestuft fixierten Zielen für den primären Antikörper – Validierung des spezifischen Ziel-Antigengewinnungs (Antigen-Retrieval-)-Schritts oder des Antigengewinnungs-(Antigen-Retrieval) -„Schwellenwerts", der für eine Färbung erforderlich ist; einen Fleck mit „überfixierten" Zielen für das sekundäre Visualisierungssystem – allgemeine Validierung des Antigengewinnungs (Antigen-Retrieval-) -Schritts; Flecken mit Zielen für das sekundäre Visualisierungssystem (beispielsweise Maus- oder Kaninchen-Abs) in unterschiedlicher Dichte – allgemeine Validierung des sekundären Visualisierungssystems; Flecken mit Peroxidase- und/oder Phosphataseaktivität – Validierung des endogenes Enzym-Blockierungsschritts; Flecken mit gebundenem Biotin – Validierung des endogenes Enzym-Blockierungsschritts (wenn beispielsweise Visualisierungssysteme vom LSAB-Typ verwendet werden); Flecken mit nicht-kovalent gebundenen und ein relativ hohes Molekulargewicht aufweisenden Zielen für das sekundäre Visualisierungssystem- allgemeine Validierung der Waschschritte; Flecken mit deutlicher, homogener und permanenter Form, Größe und Farbe – Kalibrierung des automatischen Bildanalysesystems; umfassen.
In hochgradig bevorzugten Ausführungsformen umfasst der Referenzstandard eine Anordnung von Referenz "flecken" auf demselben Objektträger wie das Patientenprobengewebe. In einer solchen Ausführungsform ist es möglich, dass eine Validierung automatisch durch die Bildanalysesoftware erfolgt.
DIAGNOSTISCHE STANDARDS
In hochgradig bevorzugten Ausführungsformen wird oder kann der Referenzstandard als ein diagnostischer Standard verwendet werden. Damit meinen wir, dass die detektierbare Einheit zum Zweck einer Ermittlung eines Zustands einer Zelle, vorzugsweise eines physiologischen oder medizinischen Zustands der Zelle, detektiert wird. Es versteht sich jedoch, dass in einigen oder mehreren Fällen die reine Detektion einer Eigenschaft der detektierbaren Einheit an sich unzureichend sein kann, um eine medizinische Diagnose zu erstellen. Es wird sich dementsprechend verstehen, dass in einigen Fällen es wünschenswert sein kann, andere Tests auszuführen, um eine Diagnose zu erstellen.
In Ausführungsformen, wo der Referenzstandard als ein diagnostischer Standard eingesetzt wird, umfasst die detektierbare Einheit geeignetenrweise einen Indikator eines Zustands einer Zelle, wie einen Indikator für die Gesundheit oder den Krankheitszustand der Zelle, beispielsweise einen Krankheitsmarker. Dementsprechend kann eine detektierbare Einheit aufgrund ihres Vorliegens oder ihrer Menge in einer relevanten Probe den Zustand des Organismus, aus welchem die Probe entnommen worden ist, (wie seinen Gesundheitszustand oder seinen Krankheitszustand) anzeigen. Krankheitsmarker, insbesondere Krebsmarker, werden nachfolgend detaillierter diskutiert.
Der Referenzstandard ist vorzugsweise derart, dass ein Querschnitt davon einen definierten Bereich, der eine Menge einer detektierbaren Einheit umfasst, umfasst. Dies wird in der Veranschaulichung in 2B gezeigt. Die Menge an detektierbarer Einheit in dem Referenzstandard oder dem Querschnitt kann verglichen werden mit jener in der Probe, um zu ermitteln, ob die Letztgenannte in identischen oder ähnlichen Mengen oder in geringeren Mengen oder in höheren Mengen als jene in dem Standard vorhanden ist. Es wird sich jedoch verstehen, dass, obwohl der hier beschriebene Referenzstandard am nützlichsten ist, um das Vorliegen und/oder die Menge einer detektierbaren Einheit in einer Probe zu detektieren, er einfacher verwendet werden kann, um anzuzeigen, ob eine detektierbare Einheit in einer Probe die gleiche ist wie die detektierbare Einheit des Referenzstandards oder davon verschieden ist.
Die Quantität oder Menge einer detektierbaren Einheit in dem Referenzstandard oder Querschnitt ist vorzugsweise eine bekannte oder vorab festgelegte Quantität. Die Menge kann variiert werden, indem die Menge, die in dem länglichen Pfad angeheftet ist oder zurückgehalten wird, gesteuert wird, wie detaillierter nachfolgend beschrieben wird. Wenn Scheiben oder Schnitte des Referenzstandards herangezogen werden, kann eine Variation bei der Quantität auch erzielt werden, indem die Dicke (und folglich die Menge an eingefangener detektierbarer Einheit) des Schnitts oder der Scheibe verändert wird.
In hochgradig bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Menge einer detektierbaren Einheit in dem Referenzstandard eine diagnostisch relevante Menge.
Im Gegensatz zum Stand der Technik können exakte und bekannte Mengen einer detektierbaren Einheit in den Referenzstandard aufgenommen werden, wie beschrieben. Darüber hinaus kann eine Variation von Probe zu Probe, wie sie im Stand der Technik vorkam, überwunden werden. Das Ergebnis ist ein präziseres Klassifizierungssystem.
In einigen Ausführungsformen sind in dem Referenzstandard unterschiedliche Mengen der detektierbaren Einheit vorhanden. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Referenzstandard zwei oder mehrere Mengen der detektierbaren Einheit in getrennten länglichen Pfaden. Vorzugsweise wird ein Spektrum von Quantitäten von steigenden Mengen der detektierbaren Einheit bereitgestellt, vorzugswei se in einem arithmetischen oder mehr bevorzugt einem logarithmischen Bereich. Der Bereich oder das Spektrum umfasst vorzugsweise eine diagnostisch oder klinisch relevante Menge einer detektierbaren Einheit, d.h. eine Menge von detektierbarer Einheit, die, wenn sie in der Probe in jener oder oberhalb von jener Menge vorhanden ist, anzeigt, dass die Probe Zellen oder Gewebe, die erkrankt sind oder bezüglich einer Erkrankung anfällig sind, enthält oder wahrscheinlich enthält.
Ein Vergleich der Mengen, die in einer Zelle oder einem Gewebe oder einer anderen biologischen Probe vorhanden sind, mit dem Referenzstandard gemäß dieser Ausführungsform wird eine Anzeige bereitstellen, ob eine bestimmte Probe „positiv" oder „negativ" für die jeweilige detektierbare Einheit ist. Wenn die detektierbare Einheit ein Krankheitsantigen, wie ein Krebsantigen, umfasst (oder DNA/RNA, einschließlich mRNA, welche sich von einem Krebsgen ableiten, exprimiert), kann dessen Vorliegen oder Menge als ein Diagnostikum für eine relevante Erkrankung verwendet werden. Wir stellen dementsprechend ein Verfahren zur Diagnose einer Erkrankung in einem Individuum bereit, welches umfasst, das Vorliegen oder die Menge (oder beide) einer detektierbaren Einheit in einer biologischen Probe von dem Individuum mit der Menge in einem Referenzstandard, wie hier beschrieben, zu vergleichen. Der Vergleich erfolgt vorzugsweise mit einer klinisch relevanten Menge der detektierbaren Einheit in dem Referenzstandard (d.h. einer Menge in einer Probe, bei oder oberhalb von welcher das Vorliegen einer Erkrankung angezeigt, vermutet oder diagnostiziert wird).
In einer besonderen Ausführungsform umfasst die detektierbare Einheit das HER2-Antigen, umfasst die Zelle oder das Gewebe Brustgewebe und umfasst die Erkrankung, die diagnostiziert wird oder deren Vorliegen angezeigt wird, Brustkrebs. Die detektierbare Einheit kann auch andere Antigene anstelle von oder zusätzlich zu HER2, die vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus: ER, PR, p16, Ki-67 oder EGFR (siehe auch Abschnitt „Detektierbare Einheit") ausgewählt werden, umfassen. Es können Mischungen von beliebigen zwei oder mehreren von diesen verwendet werden. Die detektierbare Einheit kann eine Nukleinsäure, die ein jegliches der obigen kodiert, oder eine jegliche detektierbare Einheit, wie sie in dem Abschnitt „Detektierbare Einheit" spezifiziert werden, umfassen; solche Nukleinsäuren umfassende Referenzstandards sind insbesondere nützlich für das Standardisieren einer in situ-Hybridisierung. Der Referenzstandard kann insbesondere einen Nukleinsäure-Krebsmarker, wie DNA/RNA-Krebsmarker (beispielsweise einen mRNA-Krebsmarker), umfassen.
Der Referenzstandard umfasst vorzugsweise zusätzlich zu einer klinisch oder diagnostisch relevanten Menge einer detektierbaren Einheit eine Negativkontrolle, d.h. einen definierten Bereich oder ein definiertes Volumen oder einen definierten Pfad, umfassend keine detektierbare Einheit oder detektierbare Einheit in einer nicht detektierbaren Menge.
Die diagnostizierte Erkrankung kann gegebenenfalls durch Verabreichung eines geeigneten therapeutischen Mittels behandelt werden. Ein solches Mittel oder Arzneimittel kann eines sein, das bekanntermaßen wirksam ist, um eine solche Erkrankung zu behandeln. Insbesondere kann das therapeutische Mittel einen Antikörper, vorzugsweise einen Antikörper gegen die detektierbare Einheit umfassen. Ein solcher Antikörper kann den gleichen Antikörper umfassen, der für das Anfärben und Detektieren der detektierbaren Einheit in dem Referenzstandard und/oder der biologischen Probe verwendet worden ist, oder er kann eine Variante davon, wie ein humanisierter Antikörper oder ein einzelkettiger Antikörper, wie ein ScFv, sein.
Insbesondere kann die detektierbare Einheit HER2 umfassen, kann das Bindemittel einen jeglichen anti-HER2-Antikörper umfassen und kann das therapeutische Mittel einen humanisierten anti-HER2-Antikörper, wie Herceptin (Trastuzumab, Genentech), umfassen. Die detektierbare Einheit kann eine HER2-Nukleinsäure, wie HER2-RNA, HER2-mRNA oder eine HER2-DNA, umfassen. Die detektierbare Einheit kann ein jegliches Molekül, wie eine Nukleinsäure, das in der Lage ist, an die HER2-Nukleinsäure zu binden, umfassen und kann insbesondere eine Sequenz, die zu wenigstens einem Abschnitt der HER2-Nukleinsäure komplementär ist, umfassen.
HER2 und Heceptin werden in diversen Veröffentlichungen beschrieben, einschließlich Pegram M, Hsu S, Lewis G, et al. Inhibitory effects of combinations of HER-2/neu antibody and chemotherapeutic agents used for treatment of human breast cancers. Oncogene. 1999;18:2241-2251; Argiris A, DiGiovanna M. Synergistic interactions between tamoxifen and Herceptinú. Proc Am Assoc Cancer Res. 2000;41:718. Abstract 4565; Pietras RJ, Fendly BM, Chazin VR, et al. Antibody to HLR-2/neu receptor blocks DNA repair after cisplatin in human breast and ovarian cancer cells. Oncogene. 1994;9:1829-1838; Baselga J, Norton L, Albanell J, et al. Recombinant humanized anti-HER2 antibody (Herceptinú) enhances, the antitumor activity of paclitaxel and doxorubicin against HER2/neu overexpressing human breast cancer xenografts. Cancer Res. 1998;58:2825-2831; Sliwkowski MX, Lofgren JA, Lewis GD, et al. Nonclinical studies addressing the mechanism of action of trastuzumab (Herceptin). Semin Oncol.1999;26(suppl 12):60-70; Lewis GD, Figari I, Fendly B, et al. Differential responses of human tumor cell lines to anti-p185^HER2 monoclonal antibodies. Cancer Immunol Immunother. 1993;37:255-263 and Pegram MD, Baly D, Wirth C, et al. Antibody dependent cell-mediated cytotoxicity in breast cancer patients in Phase III clinical trials of a humanized anti-HER2 antibody. Proc Am Assoc Cancer Res. 1997;38:602. Abstract 4044.
In anderen Ausführungsformen ist mehr als eine detektierbare Einheit in dem Referenzstandard vorhanden. Insbesondere fassen wir eine Mehrzahl von unterschiedlichen Arten von detektierbaren Einheiten in einem einzelnen Referenzstandard ins Auge. Wenn mehr als eine detektierbare Einheit in dem Referenzstandard vorhanden ist, kann jede von diesen sich in dem gleichen länglichen Pfad befinden oder es kann mehr als ein länglicher Pfad vorhanden sein. In dem letztgenannten Falle kann der oder jeder längliche Pfad eine oder mehrere unterschiedliche detektierbare Einheit(en) umfassen. Die detektierbaren Einheiten können in der gleichen oder unterschiedlichen Mengen in dem oder jedem länglichen Pfad vorhanden sein.
Dementsprechend können zwei oder mehrere unterschiedliche detektierbare Einheiten in dem Trägermedium enthalten sein, vorzugsweise eingebettet in das Einbettungsmedium, von denen wenigstens eine einen allgemein länglichen Pfad beschreibt. Vorzugsweise beschreiben alle unterschiedlichen detektierbaren Einheiten einen allgemein länglichen Pfad. Der Referenzstandard kann eine einzelne oder mehr als eine Menge einer ersten detektierbaren Einheit und eine einzelne oder mehr als eine Menge einer zweiten detektierbaren Einheit umfassen. In dem Referenzstandard kann eine Mehrzahl von detek tierbaren Einheiten, in gleicher oder unterschiedlichen Menge(n), vorhanden sein. Wenn mehr als eine detektierbare Einheit vorhanden ist, umfasst das Referenzmedium vorzugsweise wenigstens eine detektierbare Einheit in einer Quantität oder Menge, die diagnostisch oder klinisch relevant ist.
Der Referenzstandard kann dementsprechend eine Menge einer ersten detektierbaren Einheit darin in einem länglichen Pfad umfassen. Der Referenzstandard kann ferner eine Menge einer zweiten detektierbaren Einheit in dem länglichen Pfad oder in einem zweiten länglichen Pfad umfassen. Darüber hinaus kann der Referenzstandard eine zweite unterschiedliche Menge des oder jeder detektierbaren Einheit in dem länglichen Pfad oder in einem zweiten oder weiteren länglichen Pfad umfassen. Die Mehrzahl von gleichen oder unterschiedlichen detektierbaren Einheiten und/oder Mengen von diesen kann gemischt vorliegen oder hinsichtlich Raum und/oder Zeit getrennt vorliegen.
Die detektierbaren Einheiten können beispielsweise HER2 zusammen mit einem anderen Krebsantigen, wie ras, oder insbesondere einem Brustkrebsantigen, wie BRCA1- oder BRCA2-Protein, umfassen. Alternativ oder zusätzlich umfasst der Referenzstandard eine Menge eines Tumorsuppressorproteins, wie Retinoblastom (Rb)-Protein. Die detektierbaren Einheiten können auch Nukleinsäuren, wie HER2-Nukleinsäuren, und andere Krebsantigen-Nukleinsäuren umfassen. Die detektierbaren Einheiten können eine oder mehrere detektierbare Polypeptid-Einheiten zusammen mit einer oder mehreren detektierbaren Nukleinsäure-Einheiten umfassen.
Solche Ausführungsformen von Referenzstandards, welche eine Mehrzahl von detektierbaren Einheiten umfassen, sind in Anwendungen nützlich, wo ein Testen einer Probe unter Verwendung von mehr als einem Bindemittel ausgeführt wird. Wir ziehen daher die Verwendung von solchen Referenzstandards beispielsweise bei einem Testen unter Verwendung von „Banken" oder „Panels" von Antikörpern/Sonden mit in Betracht. Ein solches Testen kann verwendet werden, um das Vorliegen oder Fehlen oder relative oder absolute Konzentrationen von unterschiedlichen detektierbaren Einheiten in einer Probe, von denen jede diagnostisch relevant sein kann, zu detektieren. Solche relativen oder vergleichenden Informationen sind typischerweise nützlicher als ein einzelner Test auf Vorliegen/Fehlen. Ein mehrfaches Testen auf diese Weise kann verwendet werden, um ein „Profil" des fraglichen Patienten oder Individuums zu erzeugen. Ausgehend von Individuen, die unter einer Erkrankung oder einem Zustand leiden (oder von denen vermutet wird, dass sie darunter leiden), erzeugte Profile können mit übereinstimmenden Profilen von „normalen" oder nicht-befallenen Individuen verglichen werden. Die Profile oder Informationen, die durch Vergleich von Profilen erzeugt werden, können verwendet werden, um eine Erkrankung oder einen Zustand in jenem Individuum zu diagnostizieren (oder um zur Diagnose beizutragen) zum Zweck einer Auswahl der besten möglichen Behandlung („individualisierte Therapie").
In Ausführungsformen, wo mehr als ein länglicher Pfad vorhanden ist, kann es vorteilhaft sein, die länglichen Pfade in einem Bündel oder mehr als einem Bündel anzuordnen. Die länglichen Pfade können so angeordnet werden, dass es leicht gemacht wird, die verschiedenen Referenzpunkte und – cluster zu finden. Beispielsweise kann ein asymmetrisches Muster von Faserbündeln dem Verwender dabei helfen, den Objektträger richtig zu orientieren.
Ausführungsformen, in denen eine Mehrzahl von länglichen Pfaden eine einzelne detektierbare Einheit in unterschiedlichen Mengen oder mehr als eine unterschiedliche detektierbare Einheit enthalten, sind in 2C gezeigt.
Es ist unnötig zu sagen, dass, wenn mehr als eine detektierbare Einheit in dem Referenzstandard vorhanden ist, die zwei oder mehreren detektierbaren Einheiten in unterschiedlichen länglichen Pfaden vorhanden sein können. Alternativ kann mehr als eine detektierbare Einheit in einem einzigen Pfad vorhanden sein. Wenn die Pfade durch die Verwendung von Fasen definiert werden, wie nachfolgend beschrieben, kann beispielsweise mehr als eine detektierbare Einheit mit einer Faser konjugiert oder an diese angeheftet werden. Es kann eine Mehrzahl von Fasern, die jeweils eine einzelne, zwei oder mehrere detektierbare Einheiten umfassen, verwendet werden.
Die oder jede detektierbare Einheit verläuft in einem länglichen Pfad in dem Referenzstandard; dies kann erzielt werden durch verschiedene Mittel, wie nachfolgend weiter detailliert beschrieben wird. Der oder jeder längliche Pfad kann sich quer durch wenigstens einen Teil des Referenzstandards, vorzugsweise von einem Ende zum anderen erstrecken. Wenn der Referenzstandard beispielsweise ein oberes Ende und ein unteres Ende umfasst, kann die oder jede detektierbare Einheit auf einem länglichen Pfad angeordnet sein, der sich von dem oberen Ende bis zu dem unteren Ende erstreckt (oder umgekehrt).
KITS UND DIAGNOSTISCHE KITS
Der Referenzstandard oder Scheiben oder Schnitte davon können in einem diagnostischen Kit verpackt werden. Dementsprechend kann der Referenzstandard, wenn er als ein diagnostischer Standard verwendet wird, bequem als ein Kit, welcher einen Referenzstandard oder einen ebenen Schnitt davon zusammen mit einer oder mehreren Komponenten und gegebenenfalls zusammen mit Anweisungen für die Verwendung umfasst, verpackt werden. Die Anweisungen können insbesondere eine Beschreibung eines jeglichen der Verfahren zum Detektieren des Vorliegens von oder zum Ermitteln der Menge oder Konzentration einer detektierbaren Einheit, wie sie in diesem Dokument erläutert werden, umfassen.
Der Kit kann zwei oder mehrere Scheiben oder Schnitte, welche die gleichen oder unterschiedliche detektierbare Einheiten in der gleichen oder vorzugsweise unterschiedlichen Mengen, wie anderswo in diesem Dokument beschrieben, umfassen, umfassen.
Der Kit kann ein Bindemittel, wie einen Antikörper, das in der Lage ist, spezifisch an die detektierbare Einheit zu binden, umfassen. Der Kit kann einen Mikrotomblock mit dem bzw. den darauf aufgebrachten Referenzstandard, Scheiben oder Schnitten umfassen. Der Kit kann weiter andere Reagenzien, wie Detektions-, Wasch- oder Verarbeitungsreagenzien, wie auch Anweisungen für eine Verwendung umfassen.
Der Kit kann ferner Anweisungen für eine Verwendung oder andere Angaben, beispielsweise Hilfsmittel zum Ermitteln des Score, wie Diagramme, oder Photographien von erkranktem und/oder normalem Gewebe, umfassen. Die Angaben können im Allgemeinen das Niveau eines Signals, welches ausgehend von der detektierbaren Einheit in der biologischen Probe erwartet werden sollte, damit dieses ein relevantes, z.B. diagnostisch relevantes Niveau ist, angeben. Abhängig von der Detektionsmethode können dies ein Bild, eine Mikrophotographie oder Daten, welche die optische Dichte u.s.w. betreffen, sein. Angaben bzw. Indizien, die negative Ergebnisse zeigen, können auch mit aufgenommen werden. Die Angaben bzw. Indizien können auch das Ausmaß an Varianz zwischen dem Referenzsignal und dem detektierten Signal von der biologischen Probe, welches als akzeptabel für ein positives oder negatives Ergebnis angesehen werden könnte, angeben. Wenn eine Mehrzahl von Referenzstandards oder Schnitten davon in dem Kit enthalten ist, kann mehr als ein Angabenmittel in dem Kit enthalten sein.
Der Kit kann auch ein therapeutisches Mittel umfassen, das in der Lage ist, zumindest eines der Symptome einer Erkrankung zu behandeln oder zumindest zu lindern. Wir stellen auch eine Kombination eines Referenzstandards, wie hier beschrieben, oder eines Schnitts oder einer Scheibe davon zusammen mit einem therapeutischen Mittel bereit.
In besonderen Ausführungsformen ist die Erkrankung eine, deren Vorliegen in einem Individuum angezeigt oder vermutet wird, wenn eine biologische Probe eine diagnostisch relevante Menge einer detektierbaren Einheit umfasst. Insbesondere kann das therapeutische Mittel einen Antikörper gegen die detektierbare Einheit oder eine Nukleinsäure, die in der Lage ist, an die detektierbare Einheit zu binden, oder ein jegliches anderes therapeutisches Mittel, welches bekanntermaßen bei der Behandlung oder Verhütung der Erkrankung wirksam ist, umfassen. Ein Kit oder eine Kombination zum Detektieren von Brustkrebs kann beispielsweise einen Referenzstandard, in welchem die detektierbare Einheit HER2-Antigen oder HER2-Nukleinsäure umfasst, umfassen. Der Kit kann weiter anti-HER2-Antikörper zum Detektieren von jenem Antigen umfassen und kann auch ferner ein jegliches Brustkrebs-Arzneimittel, beispielsweise Herceptin (einen humanisierten monoklonalen Antikörper, der zielgerichtet HER2-Protein in metastasierenden Brustkrebspatienten ansteuert), umfassen. Andere Ausführungsformen des Kits umfassen ein jegliches Antigen, welches aus der Gruppe bestehend aus: ER, PR, p16, Ki-67 oder EGFR ausgewählt wird (siehe auch Abschnitt „Detektierbare Einheit").
In bevorzugten Ausführungsformen ist die detektierbare Einheit von molekularer Natur (siehe nachfolgende Beschreibung) und der Referenzstandard ist dementsprechend im Wesentlichen frei von zellulärem Material. Jedoch können in einigen Ausführungsformen zelluläre Komponenten, beispielsweise Teile einer Zelle (beispielsweise ein jegliches subzelluläres Kompartiment oder eine jegliche subzelluläre Organelle, wie der Zellkern, Mitochondrien, Chloroplast, Vakuole u.s.w.) oder ganze Zellen selbst in den Referenzstandard eingebracht werden.
DETEKTIERBARE EINHEIT
Die detektierbare Einheit ist eine, deren Vorliegen und vorzugsweise Menge ermittelbar ist, d.h. deren Vorliegen nachweisbar ist oder deren Menge messbar ist, entweder direkt oder indirekt. Im Allgemeinen kann die detektierbare Einheit alles sein, was in der Lage ist, ein detektierbares Signal oder ein nachweisbares Signal zu erzeugen, entweder aus sich selbst heraus, natürlich, oder bei Stimulation, dies zu tun.
Die detektierbare Einheit kann ein Signal allein oder in Verbindung mit einer oder mehreren anderen Einheiten, beispielsweise wenn sie mit Nachweismitteln, wie Antikörpern und/oder sekundären Antikörpern, in Kontakt gebracht wird, erzeugen. Die detektierbare Einheit kann selbst markiert werden, wie anderswo diskutiert, unter Verwendung einer jeglichen von verschiedenen Markierungen, beispielsweise radioaktiven und nicht-radioaktiven Markierungen, wie sie in diesem Fachgebiet bekannt sind. Eine weitergehende Diskussion dieses Aspekts ist nachfolgend in dem Abschnitt „Detektion und Visualisierung" enthalten.
Der Referenzstandard umfasst vorzugsweise die detektierbare Einheit in einem relativ reinen Zustand, d.h. im Wesentlichen isoliert von anderen Molekülen oder Verbindungen. Die detektierbare Ein heit ist vorzugweise frei oder im Wesentlichen frei von zellulären Bestandteilen, mit denen sie normalerweise assoziiert sein kann. Die detektierbare Einheit kann beispielsweise in isolierter Form vorliegen.
Die detektierbare Einheit ist vorzugsweise von nicht-zellulärer Natur, aber nicht notwendigerweise von nicht-zellulärer Herkunft. Damit meinen wir, dass die detektierbare Einheit aus der Zelle stammen kann, aber vorzugsweise eine ist, die eine gewisse Verarbeitung durchlaufen hat, beispielsweise eine Reinigung oder Konzentrierung, um die detektierbare Einheit von wenigstens einer anderen zellulären Komponente zu isolieren. Insbesondere umfasst die detektierbare Einheit beispielsweise kein rohes Zellmaterial oder ganze Zellen. Die detektierbare Einheit umfasst vorzugsweise keine substantiellen Mengen von zellulären Strukturen, wie Zellwänden, Zellmembranen, Organellen, Zytoskelett u.s.w. In solchen Ausführungsformen umfasst die detektierbare Einheit vorzugsweise „molekulare" Bestandteile in einem relativ reinen Zustand verglichen mit ihrer Umgebung innerhalb der Zelle.
In anderen Worten umfasst die detektierbare Einheit vorzugsweise nicht-zelluläres Material und/oder nicht-zelluläre Komponenten. Sie umfasst vorzugsweise keine substantiellen Mengen von zellulärem Material, sie ist beispielsweise „zellfrei". Zu diesem Zweck ist eine chemische Synthese oder rekombinante Produktion der detektierbaren Einheit bevorzugt.
Die Natur des Bindemittels wird von der detektierbaren Einheit abhängen, kann aber ein nicht-spezifisches oder vorzugsweise ein spezifisches Bindemittel umfassen. Dementsprechend können als Bindemittel nicht-spezifische Bindemittel, wie Farbstoffe, beispielsweise Farbstoffe, die typischerweise verwendet werden, um Gewebe zu färben, eingesetzt werden. Jedoch sind spezifische Bindemittel bevorzugt.
Die detektierbare Einheit kann ein „kleines Molekül", wie einfache anorganische oder organische Veribndungen, umfassen. Die detektierbare Einheit kann insbesondere ein Hapten, wie Dinitrophenol (DNP), umfassen. Die detektierbare Einheit kann Farbstoffe, wie fluoreszierende Farbstoffe, umfassen.
In hochgradig bevorzugten Ausführungsformen umfasst die detektierbare Einheit eine Nukleinsäure, wie DNA, RNA, PNA oder LNA, oder ein Polypeptid, wie ein Protein oder Antigen, oder ein anderes Epitop-umfassendes Polypeptid. Referenzstandards, welche detektierbare Protein- u.s.w. -Einheiten umfassen, sind für die Immunhistochemie (IHC) bevorzugt, während Referenzstandards, welche Nukleinsäuren u.s.w. umfassen, für die in situ-Hybridisierung (ISH) bevorzugt sind.
Wenn die detektierbare Einheit eine Nukleinsäure umfasst, kann das Bindemittel insbesondere eine Nukleinsäuresonde umfassen. Zu diesem Zweck kann es eine Nukleinsäure, wie DNA oder RNA, oder ein Derivat davon, wie eine Peptidnukleinsäure, PNA, oder „Locked-Nukleinsäure", LNA, umfassen. Die Nukleinsäuresonde ist vorzugsweise in der Lage, spezifisch mit einer Sequenz in der detektierbaren Einheit zu hybridisieren, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen. Insbesondere kann die Nukleinsäuresonde wenigstens eine Sequenz, die zu einer Sequenz in der detektierbaren Einheit komplementär ist, umfassen. Das Nukleinsäure-Bindemittel oder die Nukleinsäuresonde umfasst vorzugsweise einen einzelsträngigen Abschnitt oder ist denaturiert, um Bindungsstellen zu exponieren.
Wenn die detektierbare Einiheit ein Protein, wie ein Antigen, umfasst, umfasst das Bindemittel vorzugsweise ein jegliches Molekül, das in der Lage ist, spezifisch an das Protein zu binden. Insbesondere kann das Bindemittel einen Antikörper (unabhängig davon, ob monoklonal oder polyklonal), der in der Lage ist, spezifisch an das Antigen zu binden, umfassen.
In den obigen Beispielen werden Nukleinsäuren typischerweise durch Bindemittel, welche Nukleinsäuren umfassen, detektiert, während Proteine typischerweise durch Antikörper detektiert werden. Es wird sich jedoch verstehen, dass detektierbare Einheit-Bindemittel-Paare basierend auf Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen ausgewählt werden können. So ist beispielsweise bekannt, dass Nuleinsäure bindende Proteine, wie Zinkfinger-Proteine, HLH-Proteine u.s.w., spezifisch an Nukleinsäuresequenzen binden können. So kann ein Nukleinsäure bindendes Protein als ein Bindemittel verwendet werden, um eine detektierbare Einheit, welche eine die Erkennungssequenz umfassende Nukleinsäure umfasst, zu detektieren, und kann eine Nukleinsäure als ein Bindemittel verwendet werden, um eine detektierbare Einheit, welche ein die Erkennungssequenz umfassendes Nukleinsäure bindendes Protein umfasst, zu detektieren.
Die detektierbare Einheit wird vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Protein, einem Polypeptid, einem Peptid, einem phosphylierten Peptid, einem phosphorylierten Peptid, einem mit Glucoseeinheiten modifizierten Peptid, einem Glycopeptid, einer Nukleinsäure, einem Virus, einem virusartigen Partikel, einem Nukleotid, einem Ribonukleotid, einem synthetischen Analog eines Nukleotids, einem synthetischen Analog eines Ribonukleotids, einem modifizierten Nukleotid, einem modifizierten Ribonukleotid, einer Aminosäure, einem Aminosäure-Analog, einer modifizierten Aminosäure, einem modifizierten Aminosäure-Analog, einem Steroid, einem Proteoglycan, einem Lipid und einem Kohlenhydrat oder einer Kombination davon (beispielsweise chromosomales Material, welches sowohl Protein- als auch DNA-Bestandteile umfasst, oder ein Paar oder Satz von Effektoren, wobei ein oder mehrere einander, beispielsweise katalytisch, in eine aktive Form umwandeln.)
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die detektierbare Einheit ein Polypeptid oder eine Nukleinsäure. In hochgradig bevorzugten Ausführungsformen umfasst die detektierbare Einheit geeigneterweise einen Indikator für einen Zustand einer Zelle, wie einen Indikator des Gesundheits- oder Erkranungszustands der Zelle.
Das Vorliegen oder die Menge der detektierbaren Einheit kann beispielsweise dazu dienen, anzuzeigen, dass die Zelle sich in einem gesunden, normalen oder funktionalen Zustand befindet. Jedoch ist die detektierbare Einheit vorzugsweise derart, dass sie ein Indikator für einen abnormalen Zustand der Zelle, beispielsweise einen erkrankten Zustand der Zelle ist. In anderen Worten kann, wenn die detektierbare Einheit in einer Zelle oder einem Gewebe vorhanden ist, geschlossen werden, dass die Zelle oder das Gewebe oder das Organ oder das Individuum, die diese umfassen, erkrankt sind. Die detektierbare Einheit kann eine einzelne Erkrankung oder verschiedene Erkrankungen oder ein Syndrom, wie AIDS, oder einen medizinischen Zustand diagnostizieren. Die Erkrankung, das Syndrom oder der Zustand ist vorzugsweise eine behandelbare, ein behandelbares bzw. ein behandelbarer.
Das Vorliegen, die Menge oder Konzentration der detektierbaren Einheit in einer Zelle oder einem Gewebe wird vorzugsweise detektiert, um eine Anzeige eines Zustands der Zelle oder des Gewebes, vorzugsweise eines pathologischen Zustands der Zelle oder des Gewebes bereitzustellen. Dementsprechend kann in Ausführungsformen, wo der Referenzstandard als ein diagnostischer Standard eingesetzt wird, die detektierbare Einheit eine jegliche diagnostisch relevante Einheit umfassen.
Dementsprechend ist in dieser bevorzugten Ausführungsform die detektierbare Einheit im Wesentlichen ein Marker eines pathologischen Zustands oder ein Krankheitsmarker, dessen Vorliegen oder Menge innerhalb einer Zelle anzeigt, dass die Zelle erkrankt ist oder wahrscheinlich erkrankt ist. Das Vorliegen der detektierbaren Einheit kann eine Diagnose ermöglichen oder es kann lediglich als ein Indikator dienen, welcher zusammen mit anderen Indikatoren, beispielsweise einem Satz von Indikatoren, auf die Wahrscheinlichkeit einer Erkrankung hindeutet. Die Menge der detektierbaren Einheit in der Zelle oder dem Gewebe kann signifikant sein, d.h. ob sie oberhalb eines Schwellenwerts, der eine Erkrankung anzeigt, liegt oder nicht.
Die Erkrankung umfasst vorzugsweise Krebs. Die detektierbare Einheit ist dementsprechend vorzugsweise ein Krebsmarker oder ein Krebsprotein oder eine Krebs-Nukleinsäure. Eine Anzahl von Krebs- und mit Krebs in Zusammenhang stehenden Proteinen sind in diesem Fachgebiet bekannt, beispielsweise ras, BRCA1, HER2, ATM, RhoC, Telomerase u.s.w. Das carcinoembryonale Antigen (CEA) ist mit Krebserkrankungen des Verdauungstrakts (beispielsweise des Colons) wie auch anderen malignen und nicht-malignen Störungen assoziiert. Beispiele für andere Krebsmarker werden nachfolgend erläutert und es versteht sich, dass Nukleinsäuren, die diese kodieren, ebenfalls als detektierbare Einheiten verwendet werden können:
Prostata-spezifisches Antigen (PSA)-Spiegel sind bei Krebserkrankungen der Prostata erhöht und sind dies manchmal bei Zuständen einer vergrößerten Prostata (beispielseise BPH) oder einer Prostatitis.
CA 19.9 ist hauptsächlich mit Krebserkrankungen des Gastrointestinaltrakts assoziiert. Manchmal sind erhöhte Werte auch bei jenen Patienten mit Metastasen und bei nicht-malignen Zuständen, beispielsweise Hepatitis, Zirrhose, Pankreatitis, beobachtet worden.
HER2 ist mit Brustkrebserkrankungen assoziiert. Erhöhte Werte des HER2-Proteins, Überexpression, sind oftmals mit einer schnellen Vermehrung der Tumorzellen, die zu metastasierenden Bedingungen führen kann, assoziiert. Patienten mit Metastasen, die HER2-Protein überexprimieren, könnten aus einer HERCEPTIN-Therapie (Therapie mit anti-HER2-Antikörpern) Nutzen ziehen.
Erhöhte CA 125-Werte sind oftmals mit einer Krebserkrankungen der Eierstöcke assoziiert. Jedoch können nicht-maligne Zustände, wie Endometriose, Schwangerschaft im ersten Semester, Eierstockzysten oder aszendierende Adnexitis, auch erhöhte CA 125-Spiegel bewirken. Über die Verbindung zwischen der Familiengeschichte und der Inzidenz von Krebs ist umfassend berichtet worden.
CA 15.3-Werte sind oftmals bei Patienten mit Brustkrebserkrankungen erhöht. Wenn es eine Geschichte von Krebs unter Familienmitgliedern gibt, kann Patienten der Rat gegeben werden, auch eine Mammographie der Brust vornehmen zu lassen. Neben Brustkrebs haben auch andere nicht-maligne Zustände (beispielsweise Zirrhose, gutartige Erkrankungen der Eierstöcke & Brust) bekanntermaßen erhöhte CA 15.3-Spiegel hervorgerufen.
Alpha-Fetoprotein (AFP)-Spiegel sind oftmals bei Krebserkrankungen der Leber (hepatozellulär) und Krebserkrankungen der Testikel (nicht-seminomatös) erhöht. Erhöhte Spiegel sind auch während der Schwangerschaft oder bei einigen gastrointestinalen Krebserkrankungen vorhanden. AFP wird auch in Kombination mit anderen Tests als ein Screeningtest auf offenes Neuralrohr-Defekte verwendet.
Das nasopharyngeale Karzinom (NPC) ist ein nicht-lymphatisches, nicht-glanduläres Plattenepithelzellkarzinom, welches ausgehend von den Epithelzellen des Nasopharynx entsteht. Es ist die häufigste Form von Krebserkrankungen des Nasenrachenraums mit einer höheren Inzidenz bei Erwachsenen. Einige klinische Symptome umfassen Nasen- und Ohrenprobleme, Blut im Nasenausfluss, Nackenschwellungen, vergrößerte Lymphknoten (üblicherweise zervikal) und das Empfinden einer Nasenobst ruktion. Es ist gezeigt worden, dass das Epstein-Barr-Virus (EBV) einen direkten Zusammenhang mit NPC aufweist, wo es in NPC-Tumoren detektiert werden kann, und Patienten mit NPC neigen dazu, höhere Titer an EBV-spezifischen Antikörpern aufzuweisen als die allgemeine Population. Eine frühe Detektion durch Screening führt üblicherweise zu einer günstigen Prognose.
Tumorsuppressorproteine, wie p53 und Rb, können auch als detektierbare Einheiten verwendet werden.
Die detektierbaren Einheiten können leichte Kappa- und Lambda-Ketten von Immunglobulinen umfassen. Die detektierbare Einheit oder Einheiten können einen oder mehrere prognostische Marker, wie den Östrogenrezeptor (ER) alpha und beta und den Progesteronrezeptor (PR), das p53-Protein, mit der Proliferation in Zusammenhang stehende Proteine, wie Ki-67 und das „Proliferating cell nuclear antigen" (PCNA), umfassen. Die detektierbare Einheit oder Einheiten können ein oder mehrere Zelladhäsionsmolekül(e), wie Cadherin E, und Tumorsuppressorprotein(e), wie p16, p21, p27 und Rb, umfassen. Die detektierbare Einheit oder Einheiten können einen oder mehrere hämatologischen Faktor(en), wie CD3, CD15, CD20, CD30, CD34, CD45, CD45RO, CD99, leichte Kappa- und Lambda-Ketten und Faktor VIIII, umfassen. Nukleinsäuren, die jegliche von diesen kodieren, können ebenfalls als detektierbare Einheiten verwendet werden.
Die detektierbare Einheit oder Einheiten können einen oder mehrere epitheliale Differenzierungsmarker, wie das Prostata-spezifische Antigen (PSA), Prostata-spezifische alkalische Phosphatase (PSAP), Cytokeratin, epitheliales Membranantigen, carcinoembryonales Antigen (CEA), polymorphes epitheliales Mucin, mesenchymale Differenzierungsmarker, Desmin, Aktin, Vimentin, Collagen Typ IV umfassen. Die detektierbare Einheit oder Einheiten können einen oder mehrere Melanozyten-Marker, wie S-100, HMB45, umfassen. Die detektierbare Einheit oder Einheiten können einen oder mehrere der Marker, wie CD117, CD133, CD45, CD4, CD8, CD19, CD20, CD56, CD13, CD33, CD235a, CD15, BerEP4, Neuronen-spezifische Enolase, gliales fibrilläres saures Protein, Chromogranin, Synaptophysin, c-Kit, epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptoren (EGFR), HER2/neu, HER3 und HER4 und deren Ligand, wie EGF und TGF-alpha und andere Rezeptorprotein-Tyrosinkinasen, wie der Insulinrezeptor (IR), der Plättchenwachstumsfaktor-Rezeptor (PDGFR) und die vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-Rezeptoren (VEGFR-1, VEGFR-2 und VEGFR-3), mit Apoptose in Zusammenhang stehende Proteine, wie M30, Bcl-2, p53, Caspasen und Fas, umfassen.
Es versteht sich, dass es nicht strikt notwendig ist, die Proteine der obigen detektierbaren Einheiten in den Referenzstandards, wie hier beschrieben, zu verwenden und dass es möglich ist, die Antigene durch Verwendung von Nukleinsäuren, die die Proteine kodieren, zu detektieren. Es sollte sich dementsprechend verstehen, dass der Referenzstandard eine detektierbare Einheit umfassen kann, die eine Nukleinsäure ist, welche in der Lage ist, eine jegliche der detektierbaren Polypeptid-Einheiten, wie oben beschrieben, zu kodieren. Es ist unnötig zu sagen, dass das Bindemittel oder Aufdeckungsmittel in diesem Falle vorzugsweise eine Nukleinsäure, vorzugsweise eine Nukleinsäure, die zu einer spezifischen Bindung an wenigstens eine Abschnitt der detektierbaren Nukleinsäure-Einheit in der Lage ist, vorzugsweise eine komplementäre Nukleinsäure umfassen würde..
Wenn die detektierbare Einheit ein Polypeptid umfasst, kann dieses unmodifiziert sein oder eine oder mehrere posttranslationale Modifizierungen, vorzugsweise eine Phosphorylierung, umfassen. Die detektierbare Einheit kann beispielsweise phosphoryliertes HER2 oder phosphorylierten EGFR umfas sen. Die detektierbare Einheit kann auch in geeigneter Weise ein Antigen, vorzugsweise ein diagnostisch relevantes Antigen, das durch Binden an einen relevanten Antikörper detektierbar ist, umfassen. Es kann ein jegliches geeignetes Antigen eingesetzt werden und ein Fachmann auf diesem Gebiet wird wissen, welche Antigene für welchen diagnostischen Zweck geeignet sind.
Wie hier verwendet, umfasst der Begriff „detektierbare Einheit" ein Atom oder Molekül, wobei ein Molekül anorganisch oder organisch sein kann, ein Hapten, ein biologisches Effektormolekül und/oder eine Nukleinsäure, die ein Mittel, wie ein biologisches Effektormolekül, kodiert, ein Protein, ein Polypeptid, ein Peptid, ein phosphyliertes Peptid, ein phosphoryliertes Peptid, ein mit Glucoseeinheiten modifiziertes Peptid, ein Glycopeptid, eine Nukleinsäure, ein Virus, ein virusartiges Partikel, ein Nukleotid, ein Ribonukleotid, eine Nukleinsäure, eine DNA, eine RNA, eine Peptid-Nukleinsäure (PNA), eine „locked" Nukleinsäure (LNA), ein synthetisches Analog eines Nukleotids, ein synthetisches Analog eines Ribonukleotids, ein modifiziertes Nukleotid, ein modifiziertes Ribonukleotid, eine Aminosäure, ein Aminosäure-Analog, eine modifizierte Aminosäure, ein modifiziertes Aminosäure-Analog, ein Steroid, ein Proteoglycan, ein Lipid und ein Kohlenhydrat, ist aber nicht darauf beschränkt. Die detektierbare Einheit kann in Lösung oder in Suspension (beispielsweise in kristalliner, kolloidaler oder anderer partikulärer Form) vorliegen. Die detektierbare Einheit kann in Form eines Monomers, Dimers, Oligomers u.s.w. oder in anderer Weise in einem Komplex vorliegen.
Es versteht sich, dass es nicht notwendig ist, dass eine einzelne detektierbare Einheit verwendet wird, und dass es möglich ist, zwei oder mehrere detektierbare Einheiten in dem Referenzstandard zu verwenden. Dementsprechend umfasst der Begriff „detektierbare Einheit" auch Mischungen, Fusionen, Kombinationen und Konjugate von Atomen, Molekülen u.s.w., wie hier offenbart. Eine detektierbare Nukleinsäure kann beispielsweise umfassen, ist aber nicht beschränkt auf: eine mit einem Polypeptid kombinierte Nukleinsäure; zwei oder mehrere miteinander konjugierte Polypeptide; ein mit einem biologisch aktiven Molekül (das ein kleines Molekül, wie ein Prodrug, sein kann) konjugiertes Protein; oder eine Kombination von jeglichen von diesen mit einem biologisch aktiven Molekül.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die detektierbare Einheit ein „biologisches Effektormolekül" oder „biologisch aktives Molekül". Diese Begriffe beziehen sich auf eine Einheit, die eine Aktivität in einem biologischen System aufweist, umfassend, aber nicht beschränkt auf ein Protein, Polypeptid oder Peptid, umfassend, aber nicht beschränkt auf ein Strukturprotein, ein Enzym, ein Zytokin (wie ein Interferon und/oder ein Interleukin), ein Antibiotikum, einen polyklonalen oder monoklonalen Antikörper oder einen wirksamen Teil davon, wie F(ab)2, F(ab') oder Fv-Fragment, welcher Antikörper oder Teil davon natürlich, synthetisch oder humanisiert sein kann, ein Peptidhormon, einen Rezeptor, ein Signamolekül oder anderes Protein; eine Nukleinsäure, wie unten definiert, einschließlich, aber nicht beschränkt auf ein Oligonukleotid oder modifiziertes Oligonukleotid, ein Antisense-Oligonukleotid oder modifiziertes Antisense-Oligonukleotid, cDNA, genomische DNA, ein künstliches oder natürliches Chromosom (beispielsweise ein künstliches Hefechromosom) oder ein Teil davon, RNA, einschließlich mRNA, tRNA, rRNA oder ein Ribozym, oder eine Peptid-Nukleinsäure (PNA), „locked" Nukleinsäure (LNA), ein Virus oder virusartige Partikel; ein Nukleotid oder Ribonukleotid oder ein synthetisches Analog davon, das modifiziert oder unmodifiziert sein kann; eine Aminosäure oder ein Aminosäureanalog davon, welches) modifiziert oder unmodifiziert sein kann; ein Nicht-Peptid (beispielsweise Steroid-) Hormon; ein Proteoglcan; ein Lipid oder ein Kohlenhydrat. Kleine Moleküle, einschließlich anorganischer und organischer Chemika lien, sind als detektierbare Einheiten ebenfalls nützlich. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das biologisch aktive Molekül eine pharmazeutisch aktive detektierbare Einheit, beispielsweise ein Isotop.
Die detektierbare Einheit kann ein detektierbares Signal, wie Licht oder eine andere elektromagnetische Strahlung, aussenden. Die detektierbare Einheit kann ein Radioisotop sein, wie in diesem Fachgebiet bekannt, beispielsweise ³²P oder ³⁵S oder ⁹⁹Tc, oder ein Molekül, wie eine Nukleinsäure, ein Polypeptid oder anderes Molekül, wie nachfolgend erläutert, das mit einem solchen Radioisotop konjugiert ist. Die detektierbare Einheit kann strahlungsundurchlässig, wie undurchlässig für Röntgenstrahlung, sein. Die detektierbare Einheit kann auch ein Targeting-Mittel umfassen, das auf eine bestimmte Zelle, ein bestimmtes Gewebe, Organ oder anderes Kompartiment innerhalb des Körpers eines Tiers gerichtet ist. Die detektierbare Einheit kann beispielsweise einen radioaktiv markierten Antikörper, der für definierte Moleküle, Gewebe oder Zellen in einem Organismus spezifisch ist, umfassen.
Die detektierbare Einheit kann einen Farbstoff, einschließlich Azofarbstoffen, organischen Pigmenten, Cibracronblau u.s.w., umfassen.
Es versteht sich, dass die detektierbare Einheit eine oder mehrere Einheiten, wie oben erläutert, umfassen kann und insbesondere zwei oder mehrere oder eine Mehrzahl von jeglichen der obigen Einheiten oder Kombinationen von einer oder mehreren der obigen Einheiten umfassen kann.
LÄNGLICHER PFAD
Der hier beschriebene Referenzstandard umfasst die detektierbare Einheit in einem im Allgemeinen länglichen Pfad in dem Trägermedium. Die detektierbare Einheit weist dementsprechend eine im Allgemeinen längliche Gestalt in dem Referenzstandard, wie hier beschrieben, auf.
Es versteht sich aus dem Obigen, dass der „längliche Pfad" oder die „längliche Gestalt" oder „längliche Form" sich nicht auf die spezifische Gestalt der Moleküle oder Atome, die die detektierbare Einheit bilden, beziehen, da diese eine jegliche Gestalt aufweisen können. Der Begriff sollte vielmehr so aufgefasst werden, dass er sich auf die allgemeine Anordnung oder Lokalisierung der detektierbaren Einheit innerhalb des Trägermediums bezieht. Beispielsweise weist die Masse oder Hauptmenge der detektierbaren Einheit, beispielsweise in einem aneinander angrenzenden Zustand, vorzugsweise eine „längliche Gestalt oder Form", wenn sie in dem Trägermedium angeordnet ist, auf.
Mit „länglich" meinen wir eine Gestalt oder Form, die im allgemeinen länger als breit ist; dementsprechend haben solche länglichen Gestalten oder Formen wenigstens zwei lineare Abmessungen, die sich beträchtlich unterscheiden. Vorzugsweise ist die längste Abmessung der detektierbaren Einheit signifikant größer als die kürzeste Abmessung.
Das Verhältnis der längsten Abmessung zu der kürzesten Abmessung beträgt vorzugsweise 5:1 oder mehr, mehr bevorzugt wenigstens 10:1, am meisten bevorzugt wenigstens 20:1, 50:1 oder 100:1 oder mehr. Das Verhältnis kann insbesondere 5:1 oder mehr, 6:1 oder mehr, 7:1 oder mehr, 8:1 oder mehr, 9:1 oder mehr, 10:1 oder mehr, 15:1 oder mehr, 20:1 oder mehr, 25:1 oder mehr, 30:1 oder mehr, 40:1 oder mehr, 45:1 oder mehr, 50:1 oder mehr, 55:1 oder mehr, 60:1 oder mehr, 65:1 oder mehr, 70:1 oder mehr, 75:1 oder mehr, 80:1 oder mehr, 85:1 oder mehr, 90:1 oder mehr, 95:1 oder mehr oder 100:1 oder mehr betragen.
Dementsprechend ist, wo anwendbar, die Länge des Pfads vorzugsweise wenigstens das Zehnfache von dessen Breite oder Durchmesser, vorzugsweise mehr als das Zehnfache von dessen Breite oder Durchmesser, vorzugsweise mehr als das Zwanzigfache, am meisten bevorzugt mehr als das Hundertfache oder mehr.
Jedoch werden auch Ausführungsformen, in denen der Pfad kompakter oder gleichförmiger oder regelmäßiger in der Gestalt ist, wobei er nach wie vor länglich ist, ins Auge gefasst, beispielsweise eine Ballongestalt, eine Zigarrengestalt, eine Wurstgestalt, eine Scheibengestalt, eine Tränentropfen-Gestalt, eine Ballgestalt oder eine elliptische Gestalt. Jedoch sind regelmäßige Gestalten, in denen die linearen Abmessungen ungefähr gleich sind oder vergleichbar sind oder in denen das Verhältnis der längsten Abmessung zu der kürzesten Abmessung weniger als 5:1 beträgt, in den hier beschriebenen Referenzstandards nicht enthalten.
Der Pfad kann nicht-linear sein und kann eine gekrümmte Orientierung, welche eine oder mehrere gekrümmte Abschnitte umfasst, aufweisen. Er kann von gekräuselter oder welliger Gestalt sein, beispielsweise wie in 4A veranschaulicht. Jedoch ist in bevorzugten Ausführungsformen der Pfad geradlinig oder im Wesentlichen geradlinig. Die detektierbare Einheit nimmt in solchen bevorzugten Ausführungsformen dementsprechend eine lineare Konfiguration an.
Insbesondere kann der Pfad eine stab- oder stangenartige Gestalt oder Orientierung aufweisen. Der Pfad kann beispielsweise einen linearen Stab umfassen. Wenn mehr als ein länglicher Pfad in der detektierbaren Einheit enthalten ist, beschreibt die oder jede detektierbare Einheit einen stabartigen Pfad in dem Träger- oder Einbettungsmedium. Die Stäbe sind vorzugsweise parallel orientiert, so dass die parallelen Stäbe in dem Träger- oder Einbettungsmedium ein Bündel bilden. Die oder jede detektierbare Einheit ist vorzugsweise im Wesentlichen längs orientiert. Die Stäbe können jedoch entlang einer kurzen Kante des Träger- oder Einbettungsmediums parallel verlaufen.
In einigen Ausführungsformen ist der Pfad, den die detektierbare Einheit beschreibt, im Querschnitt nicht-gleichförmig. Der Pfad kann dementsprechend die Gestalt einer Linse oder die Gestalt einer Wurst aufweisen. Jedoch weist der Pfad in bevorzugten Ausführungsformen einen gleichförmigen Querschnitt entlang wenigstens eines substantiellen Teils des Pfads, vorzugsweise entlang im Wesentlichen der Länge des Pfads auf. Die Querschnittsfläche des Pfads ist in solchen Ausführungsformen dementsprechend im Wesentlichen die gleiche entlang aller Abschnitte der detektierbaren Einheit. Es können jedoch Ausführungsformen, in welchen die detektierbare Einheit nicht gleichförmig entlang des Pfads verteilt ist, ins Auge gefasst werden. Die detektierbare Einheit kann beispielsweise eine „Kugeln auf einem Faden"-Konfiguration annehmen, wie in 4A gezeigt.
Das Querschnittsprofil des Pfads, d.h. die definierte Fläche, welche die detektierbare Einheit in einem Querschnitt umfasst, kann verschiedene Konfigurationen aufweisen. Die definierte Fläche ist vorzugsweise von zirkulärer oder elliptischer oder ellipsoidischer Gestalt. Die definierte Fläche kann jedoch die Gestalt einer Pille, eine regelmäßige Gestalt oder eine unregelmäßige Gestalt aufweisen. Durch die Verwendung von Pfaden mit einem geeigneten Profil können unterschiedliche Querschnittsprofile erstellt werden.
In hochgradig bevorzugten Ausführungsformen ist das Querschnittsprofil ähnlich zu der Größe oder Gestalt einer Zelle oder zu beidem, beispielsweise einer prokaryotischen Zelle oder einer eukaryotischen Zellen, vorzugsweise einer tierischen Zelle und am meisten bevorzugt einer humanen Zelle. Dem entsprechend wird ein Querschnittsprofil in einer Scheibe des Referenzstandards eine Gestalt aufweisen, die eine reale Zelle in der Probe nachahmt. Dies ermöglicht, dass leicht ein direkter Vergleich zwischen einer Zelle in einer Probe und dem in der Scheibe vorhandenen Querschnittsprofil vorgenommen werden kann. Ein Verwender kann beispielsweise leicht (mit dem Auge) das Ausmaß einer Färbung einer Zelle und das Ausmaß einer Färbung des Querschnittsprofils vergleichen, um eine Beurteilung darüber zu treffen, ob jene Zelle „positiv" oder nicht ist.
Das Querschnittsprofil des Pfads oder die kürzeste Abmessung des Pfads hat einen Durchmesser von (oder eine größte Abmessung von) zwischen ungefähr 0,5 μm und 100 μm, mehr bevorzugt zwischen 1 μm und 100 μm, sogar noch mehr bevorzugt zwischen 10 μm und 20 μm und am meisten bevorzugt zwischen 2 μm und 20 μm. Besonders bevorzugte Ausführungsformen sind jene mit Durchmessern oder größten Abmessungen von oder im Wesentlichen von 1 μm, 2 μm, 3 μm, 4 μm, 5 μm, 6 μm, 7 μm, 8 μm, 9 μm, 10 μm, 11 μm, 12 μm, 13 μm, 14 μm, 15 μm, 16 μm, 17 μm, 18 μm, 19 μm oder 20 μm.
Es versteht sich, dass diese Größen nicht-einschränkend sind und der Verwender wird wissen, wie die Größe abhängig von der Anwendung variiert werden muss. Darüber hinaus versteht es sich, dass, wenn der Referenzstandard mehr als eine detektierbare Einheit oder mehr als einen Pfad oder beides umfasst, jeder von diesen unabhängig die Merkmale und Eigenschaften, die oben erläutert wurden, aufweisen kann. Wenn der Referenzstandard zwei oder mehr Pfade umfasst, können diese darüber hinaus mit der gleichen Dichte oder mit unterschiedlichen Dichten gefärbt werden.
Wenn der Referenzstandard zwei oder mehr Pfade umfasst, können diese mit der gleichen Dichte oder mit unterschiedlichen Dichten gefärbt werden.
In bevorzugten Ausführungsformen werden die Pfade, welche die detektierbare Einheit umfasst, in dem Trägermedium realisiert mittels einer Faser, welche die detektierbare Einheit umfasst, oder indem ein Kanal in dem Einbettungsmedium, welcher die detektierbare Einheit umfasst, erzeugt wird. Darüber hinaus wird an die Verwendung von „Hohlfasern", „Blockcopolymeren" und Makrostrukturen (insbesondere sich selbst zusammenlagernde Makrostrukturen) gedacht. Jede dieser Methoden wird in den nachfolgenden Abschnitten detaillierter beschrieben.
FASERN
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die detektierbare Einheit an eine längliche Faser angeheftet und die die Einheit umfassende Faser wird in dem Trägermedium getragen. Wenn in bevorzugten Ausführungsformen ein Einbettungsmedium eingesetzt wird, ist die die detektierbare Einheit umfassende Faser in dem Einbettungsmedium eingebettet.
Der Begriff „Faser", wie er in diesem Dokument verwendet wird, sollte so aufgefasst werden, dass er eine(n) jegliche(n) natürliche(n) oder künstlich hergestellte(n) Faser oder Strang oder Faden umfasst. Fasern sind typischerweise dünn und haben eine längliche Gestalt. Fasern umfassen natürliche Fasern, wie Tierhaar, Keratin u.s.w. Der Begriff umfasst des Weiteren ein jegliches Polymer von beispielsweise Aktin oder Tubulin, welches unter Bildung eines langen dünnen Strangs zusammengelagert ist. Fasern, die ausgehend von einer Extrusion oder einem Ziehen hergestellt werden, werden mit umfasst wie dies längliche micelläre Strukturen werden. Tatsächlich wird eine jegliche Makrostruktur, die beispielsweise durch selbsttätige Zusammenlagerung von Komponenten gebildet wird, mit umfasst. Je doch sind synthetische und natürliche Fasern, die in Textilerzeugnissen oder in der Bekleidungsindustrie verwendet werden, besonders bevorzugt.
Die detektierbare Einheit kann an eine Faser angeheftet, mit dieser gekoppelt, fusioniert, gemischt, kombiniert oder in einer anderen Weise verbunden werden. Diese Anheftung u.s.w. zwischen der detektierbaren Einheit und der Faser kann permanent oder vorübergehend sein und kann kovalente oder nicht-kovalente Wechselwirkungen (einschließlich Wasserstoffbrückenbindung, ionische Wechselwirkungen, hydrophobe Kräfte, Van der Waals-Wechselwirkungen u.s.w.) umfassen.
Obwohl der Begriff „angeheftet" eine permanente oder semi-permanente Assoziierung zwischen der Faser und der detektierbaren Einheit impliziert, sollte er nicht so aufgefasst werden, dass er auf diese Möglichkeiten beschränkt ist. Stattdessen sollte eine Anheftung jedoch so aufgefasst werden, dass sie auf eine jegliche Assoziierung zwischen der detektierbaren Einheit und der Faser verweist, eine vorübergehende oder lose, solange die Assoziierung ausreichend ist, damit die detektierbare Einheit einen Pfad beschreibt oder annimmt, der im Wesentlichen durch die Positionierung einer Faser während und nach dem Aufbringen auf den Träger oder der Einbettung definiert wird. Alles was wichtig ist, ist, dass die Faser die detektierbare Einheit während des Schritts oder der Schritte des Aufbringens auf einen Träger oder vorzugsweise eines Einbettens in das Medium an Ort und Stelle hält.
Die Faser kann die detektierbare Einheit lediglich zurückhalten oder in anderer Weise daran hindern, fort zu diffundieren oder weg gewaschen zu werden. Die Zurückhaltung kann vorübergehend sein oder kann während eines substantiellen Teils des Schritts des Aufbringens auf einen Träger oder des Einbettungsschritts, vorzugsweise während des gesamten Verlaufs von jenem Schritt bestehen bleiben. Die Verwendung einer Beize, wie sie in diesem Fachgebiet für das Aufziehen oder Koppeln von Farbstoffen oder anderen Molekülen auf bzw. an Fasern bekannt ist, kann vorteilhaft sein.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die detektierbare Einheit kovalent in die Faser angeheftet. In solchen bevorzugten Ausführungsformen wird die detektierbare Einheit chemisch gekoppelt oder vernetzt mit einem oder mehreren Molekülen, die die Faser bilden. Bevorzugte Verfahren zum chemischen Koppeln werden nachfolgend detaillierter in dem mit „Kopplung" überschriebenen Abschnitt beschrieben. Es ist unnötig, zu sagen, dass die Menge von detektierbarer Einheit, die in dieser Ausführungsform an die Faser gekoppelt wird, steuern wird, wie viel detektierbare Einheit in einem Querschnitt präsentiert wird, und dementsprechend das erzielte Färbungsausmaß.
Darüber hinaus kann es in bestimmten Ausführungsformen wünschenswert sein, Abstandshaltermittel zwischen die detektierbare Einheit und die Faser oder Komponenten der Faser aufzunehmen. Solche Abstandshaltermittel können in geeigneter Weise Linker oder Spacer, wie sie in diesem Fachgebiet bekannt sind, umfassen. Der Zweck des Abstandshaltermittels ist, die detektierbare Einheit in einem Abstand von der Faser (oder anderen Komponente des Pfads) anzuordnen, um beispielsweise sterische Hinderung zu vermeiden und um die Detektion der detektierbaren Einheit zu fördern. Dementsprechend kann abhängig von der Anwendung die Verwendung von kürzeren oder längeren Spacern bevorzugt sein.
Das Abstandshaltermittel kann Linker oder Spacer umfassen, die Polymere von unterschiedlichen Längen sind (deren Länge gesteuert werden kann, indem der Polymerisationsgrad gesteuert wird). In diesem Fachgebiet sind zahlreiche Spacer und Linker bekannt und der Fachmann wird wissen, wie sie abhängig von der Anwendung auszuwählen und zu verwenden sind. Der Fachmann wird auch wissen, welche Spacerlänge verwendet werden muss.
Die Spacer können beispielsweise aus Polyethylenglycol, PEG-Derivaten oder Polyalkanen oder Homopolyaminosäuren hergestellt werden. Dextrane und Dendrimere, wie sie in diesem Fachgebiet bekannt sind, können ebenfalls verwendet werden. Insbesondere können die Linker oder Spacer Nukleotid-Polymere (Nukleinsäuren, Polynukleotide u.s.w.) oder Aminosäure-Polymere (Proteine, Peptide, Polypeptide u.s.w.) umfassen.
Wenn die detektierbare Einheit ein Peptid oder Polypeptid umfasst, kann diese beispielsweise zusammen mit zusätzlichen Aminosäureresten (wobei diese den Spacer oder Linker bilden) synthetisiert oder exprimiert werden. Der Linker oder Spacer muss jedoch nicht an die detektierbare Einheit angrenzen, sondern kann selbst, entweder kovalent oder nicht-kovalent (wie nachfolgend beschrieben), unter Verwendung eines jeglichen geeigneten Mittels, beispielsweise durch die Verwendung der nachfolgend beschriebenen Vernetzungsmittel (Crosslinker), daran gekoppelt werden.
Es versteht sich, dass, wenn Peptide als Spacer verwendet werden, die Konfiguration und Länge der Peptid-Spacer nur durch die Peptidsyntheseverfahren selbst begrenzt werden. Dementsprechend ermöglicht beispielsweise die Flexibilität von Peptidsyntheseverfahren die Synthese von langen, kurzen und verzweigten Peptiden, einschließlich Peptiden mit natürlichen und nicht in der Natur vorkommenden Aminosäuren. Insbesondere ist die Verwendung von verzweigten Spacern, beispielsweise verzweigten Peptidstrukturen, wünschenswert, da dies ermöglicht, dass mehr als ein Molekül einer detektierbaren Einheit an einen Spacer oder Linker angeheftet werden kann. Darüber hinaus ermöglichen Spacer mit verzweigten oder Baum-Strukturen die Kopplung oder Anheftung von mehr als einer Art von detektierbarer Einheit. Beispielsweise kann eine erste detektierbare Einheit an einen Arm des Spacers gekoppelt werden, eine zweite detektierbare Einheit an einen zweiten Arm gekoppelt werden, u.s.w. Darüber hinaus können unterschiedliche Mengen der gleichen oder einer unterschiedlichen detektierbaren Einheit an jeden Arm gekoppelt werden.
Die Faser kann ein jegliches geeignetes Material umfassen. Vorzugsweise ist die Faser eine gesponnene Faser. Die Faser kann von natürlicher Herkunft oder synthetisch sein. Natürliche Fasern und Kunstfasern und Quellen, um diese zu erhalten, sind in diesem Fachgebiet wohlbekannt. Beispiele von natürlichen Fasern, die für eine Verwendung geeignet sind, umfassen Baumwolle, Leinen, Seide, Cellulose, Keratin u.s.w. Beispiele von Kunstfasern, die für eine Verwendung geeignet sind, umfassen Rayon, Nylon, Polyester, Polycarbamat u.s.w. Nylon umfasst eine Polyamidfaser, und es kann eine jegliche andere geeignete Polyamidfaser ebenfalls verwendet werden. Rayon besteht hauptsächlich aus Cellulose, und andere Cellulosefasern, wie sie in diesem Fachgebiet bekannt sind, können ebenfalls in geeigneter Weise für die hier beschriebenen Zwecke eingesetzt werden.
Mischungen, welche Mengen von zwei oder mehreren dieser Fasern umfassen, können ebenfalls eingesetzt werden und Mischfasern und Mischtechniken werden in diesem Fachgebiet bekannt sein. Beispielsweise Textilfasern. Es können geeignete Mischungen von Polyamid und Cellulose, Polyamid/Polyestern oder Polyester/Seide eingesetzt werden. Die Faser wird vorzugsweise wenigstens eine gewisse mechanische Widerstandsfähigkeit, zumindest eine gewisse Beständigkeit gegen einen chemischen Angriff oder gegen eine Wärmebehandlung oder eine jegliche Kombination von diesen aufweisen.
Kunstfasern, die verwendet werden können, können umfassen (sind aber nicht beschränkt auf) Polyester (beispielsweise Dacron und Terylen), Polyacrylnitril (beispielsweise Orlon), Acrylat, Polyamid (beispielsweise Nylon), Polyolefin, Polypropylen, Poly(ethylenterephthalat), Poly(1,4-dimethylencyclohexanterephthalat), Poly(tetramethylenterephthalat), Polyurethan, Poly(vinylchlorid), Poly(vinylidenchlorid), Poly(vinylalkohol), nachchloriertes Poly(vinylchlorid) (CPVC) und Polytetrafluorethylen.
Copolymere von diesen Fasern, einschließlich beispielsweise aus Polyester und Polyethylen bestehender Copolymere (beispielsweise Karat), können ebenfalls verwendet werden. Von besonderem Interesse sind die dünnsten der industriellen Textilfasern – sogenannte Mikrofasern von beispielsweise Polyester, Nylon oder acrylischen Polymeren. Andere Fasern, die verwendet werden können, umfassen jene von halbnatürlicher Herkunft, wie Rayon, Acetat-Rayon, Cellulose, Milchproteine (beispielsweise Aralac) oder Holzzellstoff (beispielsweise Lyocell oder Tencel). Die Kunstfasern können durch nasses, trockenes oder Schmelzspinnen hergestellt werden.
Es können auch natürliche Fasern verwendet werden, welche die Gruppe von Wollfasern aus Tierfellen von Schafen, Ziegen, Kaninchen, Alpakas, Lamas u.s.w., Baumwolle, Seide, beispielsweise aus dem Kokon des Seidenwurms, Leinen aus Flachs, Hanf, Ramie, Sisal und Jute umfassen, aber nicht darauf beschränkt sind.
In bevorzugten Ausführungsformen wird eine Faser in ein Paraffin-Einbettungsmedium eingebettet. Ein Flussdiagramm, welches zeigt, wie ein Referenzstandard gemäß dieser Ausführungsform hergestellt werden kann, ist in den 7 und 8 gezeigt. Der Agarose-Einbettungsschritt, welcher nachfolgend detaillierter beschrieben wird, ist optional.
In dem Referenzstandard kann mehr als eine Faser vorhanden sein. Es können beispielsweise zwei oder mehr Fasern, die jeweils eine unterschiedliche detektierbare Einheit umfassen, eingesetzt werden. Darüber hinaus können auf unterschiedlichen Fasern unterschiedliche Mengen der gleichen detektierbaren Einheit bereitgestellt werden. Schließlich kann mehr als eine detektierbare Einheit mit einer Faser konjugiert oder an diese angeheftet werden. Es kann eine Mehrzahl von Fasern, die jeweils eine einzelne, zwei oder mehrere detektierbare Einheit(en) in identischen oder unterschiedlichen Mengen umfassen, verwendet werden.
Die oder jede Faser, welche die oder jede detektierbare Einheit umfasst, kann sich durch im Wesentlichen den gesamten Referenzstandard oder wenigstens durch einen Abschnitt davon erstrecken. Wenn beispielsweise der Referenzstandard in Form eines rechteckigen Kastens hat, kann sich die oder jede Faser von einem Ende zum anderen (d.h. quer durch im Wesentlichen die gesamte Länge des rechteckigen Kastens) erstrecken.
Der Kanal hat vorzugsweise einen Durchmesser zwischen ungefähr 0,5 μm und 100 μm, mehr bevorzugt zwischen 1 μm und 100 μm, sogar noch mehr bevorzugt zwischen 10 μm und 20 μm und am meisten bevorzugt zwischen 2 μm und 20 μm.
Die detektierbare Einheit oder jede Faser kann unter Verwendung eines jeglichen von verschiedenen Farbstoffen, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, zur leichteren Identifizierung und/oder Lokalisierung gefärbt werden. Wenn zwei oder mehr Fasern in dem Referenzstandard enthalten sind, wird jede der Fasern, wenn sie gefärbt werden, vorzugsweise unter Verwendung einer unterschiedlichen Farbe gefärbt, um eine leichtere Unterscheidung zwischen den Fasern zu ermöglichen.
Wie oben beschrieben, kann die oder jede Faser in das gleiche Einbettungsmedium wie die Probe (beispielsweise eine Zelle oder ein Gewebe, die bzw. das untersucht werden soll) selbst, zum gleichen Zeitpunkt wie, bevor oder nachdem die Probe in jenes Medium eingebettet wird, eingebettet werden. In bevorzugten Ausführungsformen wird die oder jede Faser in ein Paraffin umfassendes Einbettungsmedium coeingebettet. Eine solche Fasereinbettung findet vorzugsweise als ein Teil des Paraffin-Einbettungsprozesses der Probe in FFPE statt.
QUELLEN
In einigen Ausführungsformen können die Fasern vor oder während der Assoziierung mit der detektierbaren Einheit zumindest teilweise gequollen werden. In bevorzugten Ausführungsformen kann man die Faser vor oder während der chemischen Kopplung mit der detektierbaren Einheit teilweise oder vollständig quellen lassen.
Obwohl der Begriff „Quellen" in gewissen Kontexten als Verweis auf die Aufnahme von Lösemitteln in ein unlösliches Polymergel aufgefasst werden kann, versteht sich unsere Verwendung des Begriffs so, dass sie allgemeiner ist und spezifisch mechanische, physikalische oder chemische Behandlungen, um das Volumen oder die Oberfläche oder die Zugänglichkeit zu Stellen, vorzugsweise zu Stellen im Inneren, des länglichen Pfads, wie einer Faser, zu erhöhen, umfasst.
Ein Quellen der Faser ermöglicht, dass die detektierbare Einheit Zugang zum Inneren der Faser wie auch zu Abschnitten der Oberfläche erlangt. Das Ausmaß des Eindringens der detektierbaren Einheit in Kernabschnitte der Faser und folglich einer Kopplung daran kann dann moduliert oder gesteuert werden. Die resultierenden unterschiedlichen modulierten Verteilungsmuster der detektierbaren Einheit in der Faser können für unterschiedliche detektierbare Einheiten abhängig von deren Verteilung in der Zelle verwendet werden.
Die Faser kann durch verschiedene Mittel oder Maßnahmen gequollen werden. Beispielsweise kann die Faser mechanisch behandelt werden, indem sie beispielsweise abgewickelt wird. Die Faser kann mechanisch geöffnet werden, wie beispielsweise durch Auseinanderkämmen. Das Ausmaß des Quellens oder der Schrumpfung kann gesteuert werden, indem das Ausmaß des Abwickelns oder Auseinanderkämmens je nach Fall gesteuert wird.
Man lässt jedoch vorzugsweise die Faser quellen, indem sie einem Quellungsmittel ausgesetzt wird, dessen Absorption oder Adsorption ermöglicht, dass das Volumen der Faser verändert, vorzugsweise erhöht wird. Ein bevorzugtes Beispiel eines Quellungsmittels ist Wasser. Wenn ein Quellungsmittel verwendet wird, kann das Ausmaß des Quellens durch verschiedene Methoden moduliert werden. Beispielsweise kann die Menge eines Quellungsmittels, wie Wassers, die gegenüber einer festgelegten Fasermenge exponiert wird, variiert werden. Darüber hinaus können auch die Dauer oder Temperatur oder beide der Exposition des Quellungsmittels oder Wassers gegenüber der Faser variiert werden in Verbindung mit oder statt einem Steuern der exponierten Menge.
In bevorzugten Ausführungsformen erfolgt die Kopplung zwischen der detektierbaren Einheit und der Faser derart, dass sie optimalerweise in einem nicht-wässrigen Medium, wie einem organischen Medium, stattfindet. Ein bevorzugtes organisches Medium ist Toluol, Xylol, Dichlormethan, Aceton oder Dimethylformamid, da diese mit bevorzugten Kopplungs- und Aktivierungsreagenzien, beispielsweise Vinylsulfon, Azlactonen, Cyanurchlorid, Dichlortriazin, Chlortriazin, Isocyanaten, N-Hydroxylsuccinimidestern, Aldehyden, Epoxiden, Carbonyldiimidazol, Bromcyan, Tresylchlorid, Bromacetyl und Alkylbromid, verträglich sind.
In einem solchen Falle kann das Ausmaß oder der Grad des Quellens bequem gesteuert werden, indem Mengen von unterschiedlichen Lösemitteln zu dem nicht-wässrigen Medium hinzugegeben werden. In anderen Worten kann das Ausmaß des Quellens gesteuert werden, indem eine Kopplung in einer Mischung von nicht-wässrigem Medium und Wasser in variierenden Anteilen ermöglicht wird oder durch Mischen von unterschiedlichen nicht-wässrigen Lösemitteln, wie Toluol und Alkoholen.
Mischungen von Lösemitteln, ob organisch, anorganisch, mit Wasser mischbar, mit Wasser nicht mischbar u.s.w., können ebenfalls verwendet werden. Die Lösemittelmischungen könnten jegliche mischbare Lösemittel sein – beispielsweise bevorzugte Alkohole und Wasser, Aceton und Wasser, Alkohole und Toluol, Toluol und Dimethylformamid – oder eine jegliche Mischung davon, die mit den Fasern und der verwendeten Kopplungschemie verträglich sind.
In einem solchen Falle kann das Ausmaß oder der Grad des Quellens bequem gesteuert werden, indem Mengen von Wasser zu dem nicht-wässrigen Medium hinzugesetzt werden. In anderen Worten kann das Ausmaß des Quellens gesteuert werden, indem eine Kopplung in einer Mischung von nicht-wässrigem Medium und Wasser in variierenden Anteilen ermöglicht wird. Je mehr Wasser vorhanden ist, umso höher wird das Ausmaß des Quellens sein.
6A zeigt eine Ausführungsform, in welcher man die Faser während oder vor der Kopplung hat im Wesentlichen vollständig quellen lassen. Die detektierbare Einheit hat dann Zugang zu dem Inneren oder Kern der Faser und kann daran koppeln, was zumindest zu einem gewissen Ausmaß an Färbung in solchen Kernabschnitten führt. In extremen Fällen wird die detektierbare Einheit an im Wesentlichen alle Abschnitte in einem Querschnitt der Faser gekoppelt. Eine Exposition gegenüber einem relevanten Antikörper führt zu einer homogenen Färbung (d.h. Färbung sowohl in Kern- als auch peripheren Bereichen der Faser). Das Querschnittsprofil der Faser und dementsprechend des Referenzstandards weist dementsprechend eine gleichförmige Verteilung von detektierbaren Einheiten auf. Eine solche Ausführungsform ist bevorzugt, wenn die detektierbare Einheit bekanntermaßen eine Verteilung sowohl in der Zellmembran als auch im Zytoplasma oder sogar quer durch im Wesentlichen alle Abschnitte der Zelle aufweist.
Wenn bekannt ist oder vermutet wird, dass die detektierbare Einheit eine gewisse Verteilung im Zytoplasma hat, aber vielleicht die Hauptmenge in der Zellmembran vorliegt, kann eine solche Verteilung oder ein solches Färbungsmuster nachgeahmt werden, indem es der Faser ermöglicht oder erlaubt wird, während oder nach der Kopplung teilweise zu quellen. Ein teilweises Quellen erzeugt Fasern, in welchen Querschnitte substantiell mehr detektierbare Einheit in Oberflächenabschnitten verglichen mit Kernabschnitten aufweisen, wie in 6B gezeigt. Eine Antikörperfärbung ist nicht-homogen und ist auf die peripheren oder Oberflächenbereiche der Faser konzentriert mit einer begrenzten Färbung im Inneren.
Wenn man kein Quellen stattfinden lässt, werden die Moleküle der detektierbaren Einheit nur mit Oberflächenabschnitten der Faser reagieren oder nur an Oberflächenabschnitte der Faser koppeln. Die detektierbare Einheit ist nur in der Lage, Zugang zu den peripheren oder Oberflächenabschnitten der Faser zu erlangen und daran zu koppeln. In den inneren oder Kernabschnitten der Faser findet keine Kopplung statt, was zu einer Färbung führt, die im Wesentlichen auf die Oberfäche begrenzt ist (dichte Oberflächenfärbung, keine Färbung im Inneren).
Dies führt zu einer Faser mit einer Querschnittsverteilung von detektierbarer Einheit, die im Wesentlichen auf äußere Abschnitte der Faser begrenzt ist mit im Wesentlichen keiner Färbung im Inneren oder in Kernabschnitten der Faser. Das resultierende Profil wird dementsprechend eine „Ring"-Form haben. Eine solche Verteilung ist in 6C gezeigt. Eine solche Ringform kann nützlich sein, wenn bekannt ist, dass die detektierbare Einheit in einer Zelle auf die Zelloberfläche beschränkt ist, da das Färbungsmuster in beiden Fällen ähnlich sein wird. Referenzstandards, wie beschrieben, bei denen man kein Quellen stattfinden lässt, können dementsprechend in nützlicher Weise als Standards eingesetzt werden, um das Vorliegen, die Menge und/oder die Verteilung einer detektierbaren Einheit, die beispielsweise ein Membranprotein oder ein Zelloberflächenrezeptor ist, zu messen.
Darüber hinaus wird sich verstehen, dass die verschiedenen Verteilungen, die wie oben beschrieben erzielt werden, indem das Quellen moduliert wird, für die Zwecke einer Überwachung des Eintretens eines Mittels in eine Zelle eingesetzt werden können. Dementsprechend können sie beispielsweise verwendet werden, um zu verfolgen, ob ein bestimmtes Mittel, wie in Arzneimittel, in der Lage ist, durch die Zellmembran hindurchzutreten, und zu einem Eindringen in die Zelle in der Lage ist. Die Effizienz einer Membrantranslokationssequenz (MTS), wie des Drosophila-Antennapaedia-Proteins oder von HIV-TAT (oder von deren Fragmenten), kann auf diese Weise überwacht werden.
Wenn er mittels einer Faser definiert wird, wird der längliche Pfad in dem Medium auf verschiedene Weisen etabliert. Am einfachsten wird das Medium um die Faser, welche die detektierbare Einheit daran angeheftet umfasst, herum gebildet. Beispielsweise kann ein Einbettungsmedium, wie Paraffin, mit Wärme behandelt und geschmolzen werden und das geschmolzene Einbettungsmedium um die Faser herumgegossen werden; einmal verfestigt, wird das Einbettungsmedium die Faser innerhalb von sich einschließen. In solchen Situationen kann es wünschenswert sein, dass während des Verfahrens die Faser beispielsweise mit einem Gerüst oder anderen Träger an Ort und Stelle gehalten wird. Ein solches Gerüst kann die Faser gespannt (unter Spannung) halten und kann die Möglichkeit haben, mehr als eine Faser zu tragen, vorzugsweise eine Mehrzahl von Fasern in im Wesentlichen paralleler Orientierung. Hat sich das Einbettungsmedium einmal verfestigt, kann das Gerüst von den Fasern gelöst werden.
Darüber hinaus können die Fasern in ein anderes Medium eingebettet oder auf dieses aufgebracht werden, bevor sie in das Einbettungsmedium eingebettet werden. Eine solche Ausführungsform wird in dem in den 7 und 8 gezeigten Flussdiagramm veranschaulicht, welche einen Agarose-Einbettungsschritt umfassen. Bei dieser Ausführungsform wird die Faser an Ort und Stelle gehalten im Kontext eines Agarosegels, welches geschmolzen und um die Faser herum gegossen werden kann, um diese einzuschließen. Die Faser kann während dieser Prozedur mit einem Gerüst an Ort und Stelle gehalten werden, wie oben beschrieben. Dann kann ein Streifen aus dem Agarosegel geschnitten werden, welcher die eingeschlossene Faser enthält. Der Agarosestreifen wird dann selbst in das Einbettungsmedium eingebettet, beispielsweise durch Schmelzen, Gießen und Verfestigen des Einbettungsmediums, wie oben beschrieben. Der Vorteil einer solchen Ausführungsform besteht darin, dass das Agarosegel einfacher gehandhabt wird und seine längliche Form leichter als die bloße Faser beibehält. Es ist unnötig zu sagen, dass das Agarosegel eine adäquate Steifheit haben sollte und Konzentrationen von Agarose zwischen 0,5 und 1%, 2%, 3%, 4%, 5% oder mehr erforderlich sein können.
Die Verwendung von Agarosestreifen wird in den Photographien, die die 9 bilden, veranschaulicht. Fasern werden als erstes auf einen Rahmen aufgezogen und gespannt. Der Rahmen wird dann in einen Behälter gelegt und geschmolzene Agarose wird über den Rahmen gegossen. Man lässt die Agarose erstarren und die erstarrte Agarose wird entfernt. Aus dem Agaroseblock werden Agarosestreifen, welche individuelle Fasern enthalten, geschnitten und die Agaroseblöcke, die individuelle Fasern enthalten, werden in Paraffin eingebettet. Es wird sich jedoch verstehen, dass die Einbettung der Fasern in Agarose für den Zweck erfolgt, die Fasern in der gewünschten Konformation (hier einer länglichen Konformation) zu halten, während das Paraffin erstarrt. Dementsprechend sind die Agarose-Einbettungsschritte optional, solange die Fasern in gewünschten Konformationen für und während des Paraffin-Einbettungsschritts gehalten werden können.
Es wird sich auch verstehen, dass in Agarose eingebettete Fasern (ohne Paraffin-Einbettung) ihrerseits als Referenzstandard verwendet werden können. In einer solchen Ausführungsform ist das Einbettungsmedium die Agarose selbst. Der eingebettete Fasern enthaltende Agaroseblock kann in Schnitte geschnitten werden, wie anderswo in diesem Dokument beschrieben, um Scheiben oder Schnitte für nachfolgende Fixierungs- und Färbemaßnahmen herzustellen. Zu diesem Zweck können die Agaroseblöcke eingefroren werden, so dass das Schneiden von Scheiben erleichtert wird.
KANÄLE
In einer alternativen Ausführungsform wird der längliche Kanal der detektierbaren Einheit durch einen Kanal in dem Trägermedium definiert. In einer solchen Ausführungsform wird ein länglicher Kanal in dem Trägermedium geöffnet, in welchen die detektierbare Einheit platziert wird. Es kann eine Mehrzahl von Kanälen gebildet werden, um unterschiedliche Mengen einer detektierbaren Einheit oder unterschiedliche detektierbare Einheiten oder beides aufzunehmen.
Wir stellen des Weiteren eine Ausführungsform bereit, in welcher Kanäle in Form von Hohlfasern (siehe unten) bereitgestellt werden; in einer solchen Ausführungsform können die Kanäle sowohl in den Hohlfasern selbst als auch in dem Trägermedium (beispielsweise einem Paraffinblock) oder beidem, gegebenenfalls in Kombination mit Fasern, wie oben beschrieben, bereitgestellt werden.
Die Kanäle können in dem Trägermedium durch jegliche Mittel oder Maßnahmen gebildet werden, wie beispielsweise Schnitzen oder Bohren. Die Kanäle können gebildet werden, indem das Trägermedium unter Verwendung einer dünnen Nadel durchbohrt wird. Es können gewöhnliche Metallnadeln oder aus Kunststoff hergestellte Nadeln verwendet werden. Es können auch Trinkhalme von geeigneter Steifheit verwendet werden, um Löcher in Trägermedium zu stanzen, wenn es weich genug, beispielsweise Paraffin, ist.
Alternativ oder zusätzlich können die Kanäle gebildet werden, indem Platzhalter, beispielsweise Stäbe (hergestellt aus Metall oder anderem Material), in einem verflüssigten Einbettungsmedium positioniert werden. Man lässt das Einbettungsmedium sich verfestigen und die Platzhalter werden entfernt. Zu diesem Zweck können geeignete Formen, welche einzelne oder eine Mehrzahl von Platzhaltern umfassen, eingesetzt werden. Eine solche Technik ist nützlich, um Kanäle beispielsweise in Paraffin herzustellen. Die Verwendung von Laserstrahlen, um die Kanäle heraus zu brennen oder zu schneiden, ist ebenfalls möglich.
Die Menge an detektierbarer Einheit kann dann in die Kanäle durch jegliche geeignete Mittel oder Maßnahmen eingebracht werden. Wenn die detektierbare Einheit sich in einem festen Zustand befindet, kann sie beispielsweise lediglich in den Kanal gefüllt und gepackt oder verdichtet werden, sofern erforder lich. Wenn die detektierbare Einheit in Form eines Pulvers oder von Körnern vorliegt, kann die Verwendung eines Klebstoffs oder anderen Mediums, um diese miteinander zu verbinden, ins Auge gefasst werden. In ähnlicher Weise kann die detektierbare Einheit in einem flüssigen Medium gelöst und das flüssige Medium in die Kanäle injiziert werden und man lässt dieses sich verfestigen. Beispielsweise kann eine geschmolzene Agaroselösung hergestellt und die detektierbare Einheit darin gelöst oder suspendiert werden. Die Agaroselösung kann in den Kanal injiziert oder in anderer Weise eingebracht werden und man lässt sie sich verfestigen. Die detektierbare Einheit kann in einer Monomerlösung gelöst oder suspendiert werden, die Monomerlösung in den Kanal injiziert oder eingebracht werden und man lässt diese polymerisieren.
Der Kanal hat vorzugsweise einen Durchmesser zwischen ungefähr 0,5 μm und 100 μm, mehr bevorzugt zwischen 1 μm und 100 μm, noch mehr bevorzugt zwischen 10 μm und 20 μm und am meisten bevorzugt zwischen 2 μm und 20 μm.
Der Referenzstandard, wie hier beschrieben, kann während der Herstellung entweder einzeln oder chargenweise hergestellt werden. Eine chargenweise Herstellung ist bevorzugt.
In einigen Ausführungsformen wird der Kanal in dem gleichen Einbettungsmedium wie die Probe gebildet. So kann ein jeglicher der oben für das Bilden des Kanals beschriebenen Schritte an dem Einbettungsmedium, welches die Probe aufnehmen soll, ausgeführt werden. Standardmaßnahmen für eine FFPE-Einbettung können dementsprechend modifiziert werden, um dies zu bewirken. Beispielsweise können Kanäle in dem die Probe enthaltenden Einbettungsmedium gebildet werden, indem Platzhalter, wie oben beschrieben, in einem verflüssigten Einbettungsmedium, wie Paraffin, positioniert werden. Man lässt das Paraffin sich verfestigen und sowohl die Probe als auch den Platzhalter umhüllen und die Platzhalter werden entfernt. Alternativ kann ein Paraffinblock, der die Probe umfasst, vorab hergestellt werden und ein Kanal in dem Block durch Bohren gebildet werden. Die detektierbare Einheit wird dann in den Kanal gegeben, wie oben beschrieben.
HOHLFASERN
Es versteht sich, dass der Referenzstandard Hohlfasern verwenden kann.
Hohlfasern sind, wie der Begriff in diesem Dokument verwendet wird, Fasern, die ein oder mehrere Löcher aufweisen, die durch deren gesamte Länge hindurch verlaufen. Sie werden z.B. durch ein Trockene/Nasse Phase-Trennungsverfahren durch Extrudieren einer Polymerlösung durch eine Spinndüse mit einem Ring oder einer ringförmigen Öffnung zusammen mit einem Bohrungen bildenden Fluid oder Koagulans hergestellt.
Das verwendete Polymer ist typischerweise Silicon, Polypropylen, Cellulose, Cellulosederivate, Polysulfon oder Polyester. Hohlfasern werden weithin für z.B. Membranfiltervorrichtungen, Textilien oder Polsterungen verwendet.
Da Hohlfasern oftmals durch einfache Extrusion hergestellt werden, können die inneren Löcher leer sein oder mit einem andern Material während des Herstellungsverfahrens gefüllt werden. Dies macht Hohlfasern attraktiv für eine Verwendung in dem Referenzmaterial der Erfindung. Nach dem Schneiden zu Schnitten werden die Fasern eine vorhersagbare Morphologie, die Zellen oder Zellstrukturen nachahmen kann, zeigen.
Dementsprechend kann die detektierbare Einheit eine Hohlfaser in dem Referenzstandard umfassen oder daran gebunden sein (wobei die Hohlfaser ein Träger für die detektierbare Einheit ist). Darüber hinaus können, wenn die Hohlfaser Löcher oder Kanäle umfasst, diese Löcher oder Kanäle Pfade für die detektierbare Einheit bilden. In anderen Worten wird der längliche Pfad der detektierbaren Einheit durch einen Kanal in der Hohlfaser definiert. Die detektierbare Einheit kann dann in dem Hohlfaserkanal oder den Hohlfaserkanälen, wie oben in dem Abschnitt „Kanäle" beschrieben, lokalisiert sein.
Es wird sich verstehen, dass in solchen Ausführungsformen die Hohlfaser selbst als Referenzstandard angesehen werden kann.
10 veranschaulicht verschiedene Hohlfasern, die für eine Verwendung in dem hier beschriebenen Referenzstandard geeignet sind. Die 10A und 10B zeigen Profile oder Querschnitte von Hohlfasern. Die Hohlräume oder Kanäle sind deutlich sichtbar. 10C zeigt eine Ausführungsform, in welcher eine Anzahl von Hohlfasern, die eine oder mehrere gleiche oder unterschiedliche detektierbare Einheiten umfassen können, die an jede oder alle der Hohlfaser gekoppelt sind. Alternativ oder zusätzlich kann der oder jeder Hohlraum oder Kanal der oder jeder Hohlfaser die gleiche oder eine unterschiedliche detektierbare Einheit umfassen.
Kern-Schale („core-shell"-) -Fasern zeigen einige der gleichen Eigenschaften wie Hohlfasern und können in dem hier beschriebenen Referenzstandard verwendet werden. Kern-Schale-Fasern bestehen aus einem Kernmaterial, das von einer aus einem unterschiedlichen Material hergestellten Schale umgeben ist. Die beiden Materialien können Kombinationen von z.B. PVC, Teflon, Polyamiden, Cellulose, Cellulosederivaten, Polysulfon, Polyestern oder Polycarbonaten sein.
BLOCKCOPOLYMERE
Sich selbst zusammenlagernde Makromoleküle können Materialien mit vorhersagbarer Struktur und Morphologie bereitstellen. Eine wichtige Klasse von Makromolekülen sind Blockcopolymere. Dementsprechend wird die Verwendung von Makromolekülen, beispielsweise sich selbst zusammenlagernden Makromolekülen, wie auch von Blockcopolymeren in dem hier beschriebenen Referenzstandard ins Auge gefasst.
Blockcopolymere werden hergestellt, indem zwei oder mehrere chemisch unterschiedliche Homopolymer-Blöcke, jeweils eine lineare Abfolge von identischen Monomeren, miteinander verknüpft werden. Bei Verwendung von Kombinationen einer Mehrzahl von Homopolymer-Blöcken kann man Materialien mit maßgeschneiderten physikalischen Eigenschaften herstellen.
Einige der Blockcopolymere lagern sich aufgrund von Mikrophasentrennung selbst spontan zu Mikrodomänenstrukturen zusammen. Die sich wiederholenden Strukturen können z.B. Kugeln, Zylinder, Doppelkreisel, doppelte Diamant- oder lamellare Strukturen sein.
Da die unterschiedlichen Polymerblöcke unterschiedliche chemische Eigenschaften haben, kann man z.B. einen der Blöcke weiter selektiv modifizieren und den anderen unmodifiziert lassen.
Fasern aus sich selbst zusammenlagernden Blockcopolymeren sind für eine Verwendung in dem Referenzmaterial der Erfindung attraktiv. Nach dem Schneiden von Schnitten werden die hochgradig geordneten Strukturen in den Fasern ein vorhersagbares Färbungsmuster und eine vorhersagbare Morphologie, das bzw. die Zellen oder Zellstrukturen nachahmen kann, ergeben.
GESTALT DES REFERENZSTANDARDS
Der hier beschriebene Referenzstandard kann eine jegliche geeignete Form oder Gestalt annehmen.
Der Referenzstandard kann eine amorphe Gestalt, beispielsweise eine längliche amorphe Gestalt haben, weist aber vorzugsweise eine definierte Gestalt auf. Er kann allgemein die Form einer Kugel annehmen, der Referenzstandard ist aber bevorzugt von polyedrischer Gestalt.
Mehr bevorzugt weist der Referenzstandard im Wesentlichen eine Gestalt auf, die aus der Gruppe bestehend aus: einem regelmäßigen Polyeder, einem Prisma, einem aufrechten Prisma, einem regelmäßigen aufrechten Prisma, einem rechtwinkligen Prisma, einem rechteckigen Kasten und einem Kubus ausgewählt wird.
Der Referenzstandard weist vorzugsweise eine längliche Gestalt auf, so dass er eine Längsachse aufweist. In bevorzugten Ausführungsformen verläuft der (oder jeder, wenn mehr als einer vorhanden ist) längliche Pfad, der durch die detektierbare Einheit definiert wird, entlang einer Längsachse oder im Wesentlichen parallel dazu. Eine solche Längsorientierung ist bevorzugt.
In hochgradig bevorzugten Ausführungsformen weist der Referenzstandard die Gestalt eines rechtwinkligen Prismas auf. Ein rechtwinkliges Prisma, wie der Begriff hier verwendet wird, bezieht sich auf einen geschlossenen Kasten, bestehend aus drei Paaren von rechteckigen Flächen, die einander gegenüberliegend angeordnet sind und mit rechten Winkeln miteinander verbunden sind, auch bekannt als ein rechteckiges Parallelepiped. Das rechtwinklige Prisma ist auch ein aufrechtes Prisma, ein spezieller Fall des Parallelepipeds, und entspricht dem, was in der tagtäglichen Sprache als ein (rechteckiger) „Kasten" bekannt ist. In solchen bevorzugten Ausführungsformen befindet sich der oder jeder längliche Pfad, welcher die detektierbare Einheit definiert, in im Wesentlichen paralleler Orientierung zu einer Längskante des rechtwinkligen Prismas.
Wenn Scheiben oder Schnitte von dem Referenzstandard hergestellt werden, werden diese vorzugsweise in Ebenen, die im Wesentlichen in rechten Winkeln zu dem länglichen Pfad, den die detektierbare Einheit annimmt, verlaufen, hergestellt. Alternativ oder in Kombination damit können die Schnitte oder Scheiben quer in Bezug auf die Orientierung des Referenzstandards hergestellt werden.
TRÄGERMEDIUM
Ein jegliches Material oder Medium, das in der Lage ist, die detektierbare Einheit zu tragen, kann als „Trägermedium" verwendet werden.
Ein solches Trägermedium ist vorzugsweise in der Lage, die detektierbare Einheit zu tragen, so dass sie ihre Gestalt oder Konfiguration im Wesentlichen beibehält. In bevorzugten Ausführungsformen trägt das Trägermedium die detektierbare Einheit in einem länglichen Pfad. Das Trägermedium kann einen Feststoff, Halbfeststoff oder ein Gel umfassen. Das Trägermedium kann beispielsweise aus einer Matrix oder einem Gewebe oder Netzwerk oder Gitter, auf der oder dem die detektierbare Einheit getragen wird, bestehen. Die Matrix, das Gewebe u.s.w. können aus jeglichen geeigneten faserförmigen Materialien, beispielsweise Kohlefaser oder Glasfaser, bestehen. Es kann eine lose Matrix, ein loses Gewebe u.s.w. mit der Maßgabe einer im Wesentlichen offenen Struktur eingesetzt werden. Alternativ kann in bestimmten Ausführungsformen eine dichtere Struktur bevorzugt sein.
In hochgradig bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Trägermedium ein Einbettungsmedium. Das Einbettungsmedium umgibt oder umhüllt vorzugsweise zumindest einen Teil der detektierbaren Einheit, vorzugsweise in ihrer Gänze. Zu diesem Zweck kann ein jegliches Einbettungsmedium, wie in diesem Fachgebiet bekannt, wie ein immunhistochemisches (IHC) oder in situ-Hybridisierungs (ISH)-Einbettungsmedium, eingesetzt werden. Polymere, die vorzugsweise durch Polymerisation von Monomeren hergestellt worden sind, können verwendet werden, wie nachfolgend beschrieben. Bevorzugte Beispiele von solchen Einbettungsmedien umfassen Paraffin und Agarose.
Das Träger- oder Einbettungsmedium kann homogen sein oder es kann heterogen sein und anderes Material umfassen. Dieses „andere Material" kann Zellen, Teile von Zellen, Gewebefragmente, Farbstoffe, granuläre Materialien u.s.w. umfassen.
Der Zweck, dieses andere Material mit aufzunehmen, besteht darin, einen „Untergrund" oder „Hintergrund" in einer jeglichen Scheibe oder einem jeglichen Schnitt, die bzw. der von dem Referenzstandard hergestellt wird, zu erzeugen; das Vorliegen eines „Untergrunds" ermöglicht, dass der definierte Bereich, der die detektierbare Einheit umfasst, leichter detektiert oder lokalisiert wird, d.h. er erhöht den Kontrast. Darüber hinaus ermöglicht das Vorliegen des „Untergrunds" es dem Betrachter, eine genauere Bestimmung des Vorliegens oder der Menge der detektierbaren Einheit innerhalb des Trägermediums vorzunehmen. Der Grund dafür ist der wohlbekannte „optische Effekt", durch welchen das Auge zwei Signale von gleicher Intensität abhängig von dem Hintergrund als unterschiedliche Intensitäten wahrnimmt. Dementsprechend kann beispielsweise in einer klinischen Probe das durch das Auge zu detektierende Signal (z.B. eine Zelle, die gefärbt ist) einen andere Zellen, andere Zellen unterschiedlicher Arten, Blutgefäße, Knochengewebe u.s.w. umfassenden Hintergrund haben. Dementsprechend stellt die Verwendung des anderen Materials innerhalb des Trägermediums sicher, dass das Auge Signale von dem Referenzstandard mit einer ähnlichen Intensität zu jener von der fraglichen Probe so wahrnehmen wird, dass sie ähnlich oder identisch sind, anstatt von unterschiedlicher Intensität.
Das Träger- oder Einbettungsmedium kann des Weiteren Orientierungsmittel umfassen. Das Orientierungsmittel kann eine jegliche sichtbare Anzeige innerhalb des Mediums, welche dazu beiträgt oder es dem Verwender ermöglicht, dessen Orientierung oder Richtung oder Position zu bestimmen, umfassen. Das Orientierungsmittel kann insbesondere Netzstrukturen oder ein Netzwerk von Linien innerhalb des Mediums umfassen. Das Orientierungsmittel kann eine oder mehrere im Allgemeinen parallele Linien in einer oder mehreren Ebenen umfassen. Vorzugsweise wird ein dreidimensionales Netzwerk von solchen Ebenen, die jeweils parallele Linien umfassen, mit aufgenommen. Die Matrix kann dementsprechend sichtbare Strukturen umfassen, die beispielsweise wie Maschendrahtzaun (Hühnerdraht) aussehen, um dem Verwender zu helfen, über den Objektträger zu navigieren, da Pathologen darauf trainiert sind, nach „Maschendraht"-Strukturen zu suchen.
Das Träger- oder Einbettungsmedium kann biologisches Material, wie Zellen, Gewebe, Organe u.s.w. oder einen jeglichen Teil von diesen, wie Organellen, zelluläre Strukturen u.s.w, umfassen. Das biologische Material kann die detektierbare Einheit vollständig umschließen oder räumlich davon beabstandet sein. In jeder Konfiguration wird ein ebener Schnitt oder eine ebene Scheibe einen definierten Bereich, welcher die detektierbare Einheit umfasst, zusammen mit einem Schnitt des Gewebes u.s.w. umfassen. Bei der erstgenannten Konfiguration befindet sich der definierte Bereich innerhalb des Schnitts des Gewebes und kann ermöglichen, dass zwischen den beiden leichter Vergleiche angestellt werden können.
EINBETTUNGSMEDIUM
In hochgradig bevorzugten Ausführungsformen bettet das Trägermedium die detektierbare Einheit ein und kann dementsprechend als ein „Einbettungsmedium" angesehen werden. Das Einbettungsmedium kann ein jegliches geeignetes Material, beispielsweise ein Material, das verwendet wird, um Gewebe oder Proben in der Immunhistochemie einzubetten, wie Paraffin, umfassen.
Das Einbettungsmedium ist vorzugsweise inert. Mehr bevorzugt ist das Einbettungsmedium durchlässig für Strahlung, vorzugsweise durchlässig für sichtbares Licht.
Obwohl Paraffin das am häufigsten verwendete Einbettungsmedium ist, kann ein jeglicher anderer Typ von geeignetem Einbettungsmedium verwendet werden. Umfasst werden Materialien, wie Araldite M, Dammar Resin, Divinylbenzol, Durcupan (Fluka), Epoxy Embedding Medium, Ethylenglycoldimethacrylat, Glycolmethacrylat, Histocryl-Einbettungsharz, Lowicryl HM20, Butylmethacrylat, Hydroxypropylmethacrylat, Methylmethacrylat, Paraffinwachs, Paraplast. Einbettungsmedien können aus einer Polymerisation von Monomeren, wie Methacrylsäure-Monomer und Styrol-Monomer, gebildet werden. Weitere Einzelheiten zur Herstellung von Einbettungsmedien durch Polymerisation werden in dem nachfolgenden mit „Polymere" überschriebenen Abschnitt bereitgestellt.
Das Einbettungsmedium kann Eis umfassen, d.h. einen gefrorenen Abschnitt, welcher gefrorenes Wasser, in welchem das Gewebe u.s.w. eingebettet ist, umfasst. Dementsprechend wird in bestimmten Ausführungsformen der längliche Pfad in dem gleichen Einbettungsmedium wie das Probengewebe, die Probenzelle, das Probenorgan selbst getragen. Solche Ausführungsformen sind vorteilhaft, da nur ein einzelner Schnitt gehandhabt werden muss, anstelle von einem für den Referenzstandard und einem für die Probe.
Solche Ausführungsformen der Referenzstandards können hergestellt, erzielt werden, indem eine Faser, wie nachfolgend beschrieben, in das gleiche Einbettungsmedium wie die Probe eingebettet wird. Alternativ, und wie detaillierter nachfolgend beschrieben, wird der längliche Pfad der detektierbaren Einheit definiert durch einen Kanal in demselben Trägermedium. Es wird sich verstehen, dass der längliche Pfad in dem Trägermedium zu dem gleichen Zeitpunkt, bevor oder nachdem die Probe in jenes Medium eingebettet wird, definiert werden kann. In anderen Worten kann die Faser in das Trägermedium eingebettet (und/oder der Kanal geschnitten) werden zu einem jeglichen Zeitpunkt bezogen auf die Einbettung der Probe in das Trägermedium. Wenn der längliche Pfad eine Faser umfasst, wird diese vorzugsweise als Teil des Paraffin-Einbettungsverfahrens im Rahmen einer FFPE eingebettet.
SCHNITTE UND AUFBRINGEN
Der Referenzstandard kann in einem einzigen Stück bereitgestellt und ohne weitere Verarbeitung verwendet werden. Jedoch kann der Referenzstandard vorzugsweise in Scheiben oder Schnitte geschnitten werden und diese Schnitte oder Scheiben werden ihrerseits als Standards verwendet. Wie in 2C veranschaulicht, umfassen die Scheiben oder Schnitte definierte Bereiche, welche die detektierbare Einheit umfassen, und aus einem Referenzstandard kann eine Mehrzahl von Scheiben oder Schnitten hergestellt werden.
Es versteht sich, dass die definierten Bereiche in den Scheiben oder Schnitten, die die detektierbare Einheit umfassen, die Form von länglichen Gestatten annehmen können und da diese durch das Trägermedium getragen werden, können sie ihrerseits vorzugsweise als „Referenzstandards", wie in diesem Dokument beschrieben, behandelt werden.
Die Scheiben oder Schnitte können unter Verwendung von jeglichen geeigneten Mitteln oder Maßnahmen (beispielsweise eines Mikrotoms, wie eines Ständermikrotoms („bench microtome") oder eines sich hin- und herbewegenden Mikrotoms) hergestellt werden. Die Dicke der Scheiben oder Schnitte ist typischerweise jene von Standard-Mikrotomscheiben. Die Scheiben oder Schnitte sind vorzugsweise zwischen ungefähr 0,5 und 300 μm, vorzugsweise zwischen 5 und 200 μm, vorzugsweise zwischen ungefähr 10 und 100 μm, vorzugsweise zwischen ungefähr 1 und 100 μm, vorzugsweise zwischen ungefähr 20 und 30 μm, am meisten bevorzugt zwischen ungefähr 2 und 10 μm dick. In einer hochgradig bevorzugten Ausführungsform sind die Scheiben oder Schnitte 5 μm dick oder liegen in diesem Bereich.
Auf eine ähnliche Weise wie für eine jegliche FFPE-Probe kann eine Mehrzahl von Schnitten oder Scheiben des Referenzstandards hergestellt werden. Der resultierende Schnitt oder die resultierende Scheibe des Referenzstandards kann auf die gleiche Weise wie eine jegliche andere fixierte und eingebettete Gewebe- oder Zellprobe behandelt werden.
Die Scheibe oder der Schnitt des Referenzstandards kann auf einen geeigneten Träger aufgelegt oder aufgebracht werden, um die Handhabung zu unterstützen. Ein solcher Träger kann in geeigneter Weise einen Objektträger, wie einen Mikroskop-Objektträger, hergestellt aus Glas oder einem anderen Material, umfassen. Der Schnitt oder die Scheibe des Referenzschnitts kann in einer ähnlichen Weise zu einem Schnitt eines FFPE-eingebetteten Materials aufgelegt oder aufgebracht werden. Solche Aufbringtechniken sind in diesem Fachgebiet bekannt. Der Schnitt oder die Scheibe kann in einer temporären, permanenten oder halbpermanenten Weise aufgebracht werden und kann insbesondere auf dem Träger durch beispielsweise Klebstoff oder Oberflächenspannung fixiert werden.
Die Scheibe oder der Schnitt kann auch auf einem Einlegestreifen platziert werden, der typischerweise ein dünnes, ebenes Materialstück ist, welches in der Lage ist, die Scheibe oder den Schnitt zu tragen. Die Scheibe oder der Schnitt kann mit dem Einlegestreifen versandt oder verkauft werden, entweder eine Scheibe oder ein Schnitt auf einem einzelnen Einlegestreifenstück oder eine Mehrzahl von Scheiben oder Schnitten. Ein solcher Einlegestreifen kann beispielsweise aus Papier, Karton, Kunststoff, Celluloseacetat u.s.w. hergestellt werden. Die Oberfläche des Einlegestreifens kann behandelt werden, um ein Anhaften der Scheibe oder des Schnitts zu verhindern, beispielsweise durch Silicon. Eine bevorzugte Ausführungsform eines solchen Einlegestreifens umfasst dementsprechend siliconisiertes Papier. Die Verwendung eines solchen Einlegestreifens ermöglicht es, dass die Scheibe oder der Schnitt leicht auf einen Mikroskop-Objektträger aufgelegt werden kann, vorzugsweise angrenzend an die Proben von dem Patienten.
Die Verfahren zum Anheften oder Aufbringen von Schnitten auf Objektträger umfassen, saubere Objektträger zu verwenden und sich auf die Kapillaranziehung und keine Klebstoffe zu verlassen. Andere Techniken umfassen Klebstoffe, wie Eiweiß-Glycerin, Glycerin-Gelatine-Mischungen, Polyvinylacetat-Klebstoff, Chrom-Aluminiumoxid-Gelatine und Polylysin-Überzug. Ein Erwärmen oder „Backen" des Schnitts als ein Mittel, um das Aufbringen des Schnitts zu vereinfachen, sollte mit Vorsicht verwendet werden, da das Gewebe zerstört werden kann.
Der Träger kann Vermerke umfassen, um zu der Quantifizierung der detektierbaren Einheit beizutragen. Solche Vermerke können vorzugsweise in der Nähe des Bereichs, welcher die detektierbare Einheit umfasst, lokalisiert sein. Die Vermerke können sich auf die Menge der detektierbaren Einheit oder die Klassifizierung, die jener Menge zugewiesen worden ist, oder die Natur der detektierbaren Einheit beziehen.
Das Ausmaß an Färbung in der Scheibe oder dem Schnitt kann dann mit jenem in der Probe verglichen werden, um eine Bewertung der Signifikanz des Färbungsniveaus der Letztgenannten bereitzustellen. Es versteht sich, dass, obwohl bevorzugt ist, dass die Scheibe oder der Schnitt, die oder der von dem Referenzstandard hergestellt wird, den Verarbeitungsprozeduren unterworfen wird, es in einigen Ausführungsformen wünschenswert sein kann, dass der Referenzstandard selbst der Verarbeitung unterzogen wird.
DETEKTION UND VISUALISIERUNG
Der Referenzstandard kann die detektierbare Einheit in einem bereits visualisierbaren Zustand umfassen; in anderen Worten eine detektierbare Einheit in einer Form, die nicht weiter verarbeitet werden muss, um ihr Vorliegen oder ihre Menge zu identifizieren. Die detektierbare Markierung kann dementsprechend eine Markierung, wie eine fluoreszierende oder radioaktive Markierung umfassen oder in anderer Weise mit einem Mittel, das in der Lage ist, Strahlung auszusenden, markiert sein. Die Markierung sendet vorzugsweise Licht aus; am meisten bevorzugt wird das Licht als Ergebnis einer Fluoreszenz ausgesandt. Die detektierbare Einheit kann detektiert werden, indem eine Signalemission (oder eine Veränderung einer Signalemission) durch die detektierbare Markierung detektiert wird, und die Detektion kann des Weiteren umfassen, die detektierbare Markierung anzuregen und die Fluoreszenzemission zu überwachen. Die Menge des ausgesandten Signals kann gemessen werden, um die Menge an detektierbarer Einheit, die vorhanden ist, anzuzeigen.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst der Referenzstandard jedoch eine detektierbare Einheit, die gegenüber ihrer nativen Form nicht substantiell modifiziert ist, beispielsweise unmarkiert ist. In solchen Ausführungsformen wird die Anwesenheit und/oder Menge der detektierbaren Einheit nur bei einer weiteren Verarbeitung des Referenzstandards aufgedeckt oder nachgewiesen, beispielsweise durch Anwendung der Schritte, die herkömmlicherweise unternommen werden, um eine detektierbare Einheit in einer biologischen Probe aufzudecken oder nachzuweisen.
Dementsprechend kann eine Anwendung eines primären Aufdeckungsmittels, wie eines Bindemittels, welches an die detektierbare Einheit bindet, vorzugsweise spezifisch, verwendet werden. Die detektierbare Einheit, das Bindemittel oder die Kombination der zwei kann weiter durch die Verwendung von sekundären Aufdeckungsmitteln detektiert werden. Wenn das Bindemittel einen Antikörper umfasst und die detektierbare Einheit ein Antigen umfasst, kann der Antikörper, das Antigen oder der Antigen-Antikörper-Komplex durch einen sekundären Antikörper aufgedeckt oder nachgewiesen werden. Der sekundäre Antikörper kann mit einem Enzym, das in der Lage ist, ein Signal zu erzeugen, wenn es mit einem chromogenen Substrat umgesetzt wird, konjugiert sein. Es versteht sich, dass ein jeglicher Schritt oder eine jegliche Reihe von Schritten, die verwendet werden können, um eine detektierbare Einheit in einer biologischen Probe aufzudecken bzw. nachzuweisen, zu detektieren oder zu quantifizieren, auf den Referenzstandard oder dessen Schnitte angewendet werden kann. Ein solcher Schritt bzw. solche Schritte ist bzw. sind vorzugsweise jene, die herkömmlicherweise in der Immunhistochemie eingesetzt werden, beispielsweise Detektionsschritte, um die Einheit in FFPE-Schnitten zu detektieren.
Der Schnitt oder die Scheibe des Referenzstandards kann insbesondere einer jeglichen oder mehreren der Maßnahmen, die verwendet werden, um eine FFPE-eingebettete Probe oder einen Schnitt davon zu färben, unterworfen werden. Dementsprechend soll und kann die Scheibe oder der Schnitt des Referenzstandards einer jeglichen oder mehreren der typischen Nacheinbettungsmaßnahmen, die verwendet werden, um Gewebeproben zu färben, um das Antigen aufzudecken oder nachzuweisen, unterzogen werden. In bevorzugten Ausführungsformen wird der Schnitt oder die Scheibe allen oder im Wesentlichen allen derartigen Maßnahmen unterzogen. Dementsprechend wird der Schnitt oder die Scheibe vorzugsweise einem jeglichen oder mehreren, bevorzugt allen der Folgenden unterzogen: Auflegen oder -bringen auf einen Objektträger, Backen, Entparaffinierung, Rehydratisierung, Antigengewinnung (Antigen-Retrieval), Blockierung, Aussetzen an bzw. Exposition gegenüber Antikörper, Aussetzen an bzw. Exposition gegenüber primärem Antikörper, Waschen, Aussetzen an bzw. Exposition gegenüber sekundärer Antikörper-Enzym-Konjugat, Aussetzen an bzw. Exposition gegenüber Enzymsubstrat, Aussetzen an bzw. Exposition gegenüber Chromogen-Substrat und Gegenfärbung.
Das Backen bezieht sich auf ein sanftes Erwärmen des Objektträgers mit der Paraffinscheibe darauf. Das Paraffin schmilzt teilweise davon und das Gewebe haftet an der Glasoberfläche.
In bevorzugten Ausführungsformen wird die detektierbare Einheit einem Antikörper ausgesetzt und das Binden von Antikörper auf eine jegliche von mehreren Weisen visualisiert. Für eine allgemeine Einführung in verschiedene Immunzytochemie-Visualisierungstechniken siehe beispielsweise Lars-Inge Larsson „Immunocytochemistry: Theory and Practice", CRC Press Inc., Boca Raton, Florida, 1988, ISBN 0-8493-6078-1, und John D. Pound (Hrsg.); „Immunochemical Protocols, Vol. 80", in der Reihe: „Methods in Molecular Biology", Humana Press, Totowa, New Jersey, 1998, ISBN 0-89603-493-3.
Die am geläufigsten verwendeten Detektionsmethoden in der Immunhistochemie sind eine direkte Visualisierung von Fluoreszenz oder Goldpartikel und eine Enzym-vermittelte kolorimetrische Detektion.
Für direkte Fluoreszenzuntersuchungen können die Markierungen beispielsweise 5-(und 6-)-Carboxyfluorescein, 5- oder 6-Carboxyfluorescein, 6-(Fluorescein)-5-(und 6-)-carboxamidohexansäure, Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Rhodamin, Tetramethylrhodamin und Farbstoffe, wie Cy2, Cy3 und Cy5, gegebenenfalls substituiertes Cumarin, einschließlich AMCA, PerCP, Phycobiliproteine, einschließlich R-Phycoerythrin (RPE) und Allophycoerythrin (APC), Texas Red, Princeston Red, Green fluorescent protein (GFP) und Analoga davon und Konjugate von R-Phycoerythrin oder Allophycoerythrin und beispielsweise Cy5 oder Texas Red und anorganische fluoreszierende Markierungen, die auf Halbleiter-Nanokristallen basieren (wie „quantum dot" und Qdot^TM-Nanokristalle), und zeitlich aufgelöste fluoreszierende Markierungen, die auf Lanthaniden, wie Eu3+ und Sm3+, basieren, sein.
Als direkte Markierungen für immunzytochemische Untersuchungen für Elektronenmikroskopie und Lichtmikroskopie können kolloidales Gold oder Silber verwendet werden. Eine Verstärkung des Signals kann durch weitere Silber-Verstärkung der kolloidalen Goldpartikel erzielt werden.
Die allgemeinen enzymatischen Methoden verwenden markiertes Avidin- oder Streptavidin-Biotin (LAB oder LSAB), Avidin- oder Streptavidin-Biotin-Komplexe (ABC), Enzym-anti-Enzym-Komplexe (PAP und APAAP), einen direkten auf Dextran-Polymer basierenden Antikörper-Enzym-Komplex (EPOS, DakoCytomation); einen indirekten auf Dextran-Polymer basierenden Antikörper-Enzym-Komplex (Envision, DakoCytomation) und einen Doppelbrücken-Enzym-anti-Enzym-Komplex.
Die enzymatische Färbung verwendet enzymatische Markierungen, wie Meerrettich-Peroxidase (HRP), alkalische Phosphatase (AP), β-Galactosidase (GAL), Glucose-6-phosphatdehydrogenase, beta-N-Acetylglucosaminidase, Invertase, Xanthinoxidase, Leuchtkäfer-Luciferase und Glucoseoxidase (GO).
Beispiele von üblicherweise verwendeten Substraten für Meerrettich-Peroxidase umfassen 3,3'-Diaminobenzidin (DAB), Diaminobenzidin mit Nickel-Verstärkung, 3-Amino-9-ethylcarbazol (AEC), Benzidindihydrochlorid (BDHC), Hanker-Yates-Reagens (HYR), Indophanblau (IB), Tetramethylbenzidin (TMB), 4-Chlor-1-naphthol (CN), -Naphtholpyronin (-NP), o-Dianisidin (OD), 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP), Nitroblautetrazolium (NBT), 2-(p-Iodphenyl)-3-p-nitrophenyl-5-phenyltetrazoliumchlorid (INT), Tetranitroblautetrazolium (TNBT), 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-beta-D-galactosid/ferro-ferricyanid (BCIG/FF).
Beispiele von üblicherweise verwendeten Substraten für alkalische Phosphatase umfassen Naphthol-AS-B1-phosphat/Fast Red TR (NABP/FR), Naphthol-AS-MX-phosphat/Fast Red TR (NAMP/FR), Naphthol-AS-B1-phosphat/Fast Red TR (NABP/FR), Naphthol-AS-MX-phosphat/Fast Red TR (NAMP/FR), Naphthol-AS-B1-phosphat/New Fuchsin (NABP/NF), Bromchlorindolylphosphat/Nitroblautetrazolium (BCIP/NBT), 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-b-d-galactopyranosid (BCIG).
Eines der leistungsfähigsten Detektionssysteme ist die „catalysed reporter deposition" (CARD; katalysierte Reporter-Abscheidung); dieses Verstärkungsverfahren basiert auf der Abscheidung von markiertem Tyramid auf Gewebe durch die enzymatische Wirkung von HRP. Nach einer HRP-Immunfärbung wird markiertes Tyramid aufgetragen und nahe der Stelle der HRP-Aktivität gebunden. Das gebundene und markierte Tyramid wird dann durch traditionelle Fluoreszenz oder kolorimetrische Enzym-vermittelte Detektion visualisiert.
Die oben erwähnten Markierungsverbindungen können im Allgemeinen sowohl auf Sonden als auch Antikörper (oder eine jegliche andere Substanz, die verwendet wird, um ein gewünschtes Ziel zu detektieren) angewendet werden.
Die Methode der Betrachtung der gefärbten Proben umfasst Hellfeld-Mikroskope oder -Scanner, Fluoreszenzmikroskope oder -scanner, ein Transmissionselektronenmikroskop (TEM) oder Scanningelektronenmikroskop (SEM).
Es sind automatisierte Färbesysteme eingeführt worden, um Kosten zu verringern, die Gleichförmigkeit der Objektträger-Präparation zu erhöhen, mühsame Routinearbeiten zu verringern und am signifikantesten die Vorgehensweise oder Verfahrensschritte betreffende menschliche Irrtümer zu verringern.
Die gegenwärtigen automatisierten Systeme können einen jeglichen immunchemischen Assay, einschließlich Assays, die auf Immunfluoreszenz beruhen, indirekte Immunoassay-Prozeduren, Enzym- oder Gold-Färbemethoden handhaben. Sie führen alle Schritte des immunhistochemischen Assays ohne Ansehen der Komplexität oder deren Reihenfolge zu dem vorgeschriebenen Zeitpunkt und bei der vorgeschriebenen Temperatur aus.
Immunzytochemie-Techniken haben traditionell spezifische Antikörper zur Identifizierung und Visualisierung von spezifischen Antigenen verwendet. Die Technik ist komplex, es werden viele Schritte und Moleküle mit hohen Affinitäten für eine spezifische Färbung benötigt.
Es können auch „special stains" (spezielle Färbemittel), die nachfolgend in einem separaten Abschnitt beschrieben werden, verwendet werden, entweder allein oder in Kombination mit einer immunhistochemische Visualisierung.
FÄRBUNG UND IMMUNFÄRBUNG
Im Folgenden werden einige der individuellen Schritte in einem Färbeverfahren beschrieben. Jeder, einige oder alle dieser Schritte kann bzw. können auf den Referenzstandard oder eine Scheibe oder einen Schnitt davon angewendet werden.
Es werden Fixiermittel benötigt, um Zellen und Gewebe in einer reproduzierbaren und lebensähnlichen Weise zu konservieren. Um dies zu erzielen, werden Gewebeblöcke, Schnitte oder Abstriche in ein fixierendes Fluid eingetaucht oder werden im Falle von Abstrichen getrocknet. Fixiermittel stabilisieren Zellen und Gewebe, wodurch sie vor den Härten der Verarbeitungs- und Färbetechniken geschützt werden.
Es kann ein jegliches geeignetes Fixiermittel verwendet werden, beispielsweise Ethanol, Essigsäure, Pikrinsäure, 2-Propanol, 3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid-Dihydrat, Acetoin (Mischung von Monomer) und Dimer, Acrolein, Crotonaldehyd (cis + trans), Formaldehyd, Glutaraldehyd, Glyoxal, Kaliumdichromat, Kaliumpermanganat, Osmiumtetroxid, Paraformaldehyd, Quecksilberchlorid, Tolylen-2,4-diisocyanat, Trichloressigsäure, Wolframsäure. Bevorzugte Arten von Fixiermitteln umfassen Formalin (wässriges Formaldehyd) und neutral gepuffertes Formalin (NBF) befindet sich unter denen, die am häufigsten verwendet werden. Andere bevorzugte Fixiermittel umfassen Glutaraldehyd, Acrolein, Carbodiimid, Imidate, Benzochinon, Osmiumsäure und Osmiumtetroxid.
Frische Biopsieproben, zytologische Präparate (einschließlich Berührungspräparate und Blutabstriche), gefrorene Schnitte und Gewebe für eine immunhistochemische Analyse werden üblicherweise in organischen Lösemitteln, einschließlich Ethanol, Essigsäure, Methanol und/oder Aceton, fixiert.
ANTIKÖRPER
In bevorzugten Ausführungsformen wird ein Antikörper, der in der Lage ist, an die detektierbare Einheit zu binden, eingesetzt, um dessen Vorliegen aufzudecken oder nachzuweisen.
Antikörper umfassen Immunglobulin-Moleküle. Immunglobulin-Moleküle sind im breitesten Sinne Mitglieder der Immunglobulin-Überfamilie, einer Familie von Polypeptiden, welche die Immunglobulin-Faltungscharakteristik von Antikörpermolekülen, welche zwei β-Faltblätter und üblicherweise eine konservierte Disulfidbindung enthält, umfassen. Mitglieder der Immunglobulin-Überfamilie sind an vielen Aspekten von zellulären und nicht-zellulären Wechselwirkungen in vivo beteiligt, einschließlich weitverbreiteter Rollen im Immunsystem (beispielsweise Antikörper, T-Zell-Rezeptormoleküle und dergleichen), Beteiligung an Zelladhäsion (beispielsweise die ICAM-Moleküle) und intrazelluläre Signalerzeugung und – weiterleitung (beispielsweise Rezeptormoleküle, wie der PDGF-Rezeptor). Die hier beschriebenen Verfahren zum Detektieren von detektierbaren Einheiten und zur Verwendung des Referenzstandards können dementsprechend Gebrauch machen von einem jeglichen Immunglobulin-Überfamilienmolekül, welches in der Lage ist, an ein Ziel zu binden. Peptide oder Fragmente, die von Immunglobulinen abgeleitet sind, können ebenfalls verwendet werden.
Antikörper, wie hier verwendet, beziehen sich auf vollständige Antikörper oder Antikörperfragmente, die in der Lage sind, an ein ausgewähltes Ziel zu binden, und umfassend Fv, ScFv, F(ab') und F(ab')₂, monoklonale und polyklonale Antikörper, gentechnologisch modifizierte Antikörper, einschließlich chimärer, durch CDR-Grafting modifizierter und humanisierter Antikörper, und künstlich ausgewählte Antikörper, die unter Verwendung von Phage-Display oder alternativen Techniken hergestellt worden sind. Kleine Fragmente, wie Fv und ScFv, besitzen vorteilhafte Eigenschaften für diagnostische und therapeutische Anwendungen aufgrund ihrer geringen Größe und folglich überlegenen Gewebeverteilung. Der Antikörper ist vorzugsweise ein Einzelketten-Antikörper oder ScFv.
Die Antikörper können veränderte Antikörper sein, welche ein Effektorprotein, wie ein Toxin oder eine Markierung, umfassen. Eine Verwendung von markierten Antikörpern ermöglicht die Bildgebung von der Verteilung des Antikörpers in vivo. Solche Markierungen können radioaktive Markierungen oder strahlenundurchlässige Markierungen, wie Metallteilchen, die innerhalb des Körpers eines Patienten leicht visualisierbar sind, sein. Darüber hinaus können sie fluoreszierende Markierungen (wie diejenigen, die hier beschrieben wurden) oder andere Markierungen, die auf Gewebeproben, die Patienten entnommen worden sind, visualisierbar sind, sein. Antikörper mit Effektorgruppen können mitjeglichen Assoziierungsmitteln, wie oben beschrieben, verknüpft werden.
Antikörper können aus tierischem Serum erhalten werden oder im Falle von monoklonalen Antikörpern oder Fragmenten davon in Zellkultur produziert werden. Die Technik der in vitro-DNA-Rekombination kann verwendet werden, um die Antikörper gemäß einer etablierten Vorgehensweise in bakterieller, Hefe-, Insekten- oder vorzugsweise Säugetier-Zellkultur herzustellen. Das ausgewählte Zellkultursystem sekretiert das Antikörperprodukt vorzugsweise.
Das Kultivieren von Hybridomzellen oder Säugetier-Wirtszellen wird in vitro ausgeführt in geeigneten Kulturmedien, die die üblichen Standardkulturmedien sind, beispielsweise Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) oder RPMI 1640-Medium, gegebenenfalls ergänzt durch ein Säugetierserum, beispielsweise fötales Kälberserum, oder Spurenelemente und die Vermehrung unterhaltende Ergänzungen, beispielsweise Feeder-Zellen, wie normale peritoneale Maus-Exsudat-Zellen, Milzzellen, Knochenmark-Makrophagen, 2-Aminoethanol, Insulin, Transferrin, Lipoprotein niedriger Dichte, Ölsäure oder dergleichen. Eine Vermehrung von Wirtszellen, die Bakterienzellen oder Hefezellen sind, wird in ähnlicher Weise in geeigneten Kulturmedien, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, ausgeführt, beispielsweise für Bakterien in LB-Medium, NZCYM-, NZYM-, NZM-, Terrific Broth-, SOB-, SOC-, 2 × YT-Medium oder M9-Minimalmedium und für Hefe in YPD-, YEPD-Medium, Minimal Medium oder Complete Minimal Dropout Medium.
Die Verwendung von Insektenzellen als Wirte für die Expression von Proteinen weist Vorteile auf, indem der Klonierungs- und Expressionsprozess relativ leicht und schnell ist. Zusätzlich gibt es eine hohe Wahrscheinlichkeit, korrekt gefaltetes und biologisch aktives Protein verglichen mit einer bakteriellen oder in Hefe erfolgenden Expression zu erhalten. Insektenzellen können in serumfreiem Medium kultiviert werden, was verglichen mit Serum enthaltendem Medium billiger und sicherer ist. Rekombinante Baculoviren können als ein Expressionsvektor verwendet werden und das Konstrukt kann verwendet werden, um eine Wirtszelllinie zu transfizieren, die eine jegliche von verschiedenen Lepidopteran-Zelllinien sein kann, insbesondere Spodoptera frugiperda Sf9, wie in diesem Fachgebiet bekannt. Übersichten über eine Expression von rekombinanten Proteinen in Insekten-Wirtszellen werden bereitgestellt von Altmann et al. (1999), Glycoconj. J. 1999, 16, 109-23 und Kost und Condreay (1999), Curr. Opin. Biotechnol., 10, 428-33.
Eine in vitro-Produktion liefert relativ reine Antikörperpräparate und ermöglicht eine maßstäbliche Vergrößerung, um große Mengen der gewünschten Antikörper zu erhalten. Techniken für die Kultivierung von Bakterienzellen, Hefe-, Insekten und Säugetierzellen sind in diesem Fachgebiet bekannt und umfassen eine homogene Suspensionskultur, beispielsweise in einem Airlift-Reaktor oder in einem kontinuierlichen Rührerreaktor, oder eine immobilisierte oder eingeschlossene Zellkultur, beispielsweise in Hohlfasern, Mikrokapseln, auf Agarose-Mikrokörnchen oder keramischen Kartuschen.
Große Mengen der gewünschten Antikörper können auch erhalten werden, indem Säugetierzellen in vivo vermehrt werden. Zu diesem Zweck werden Hybridomzellen, die die gewünschten Antikörper produzieren, in histokompatible Säugetiere injiziert, um das Wachstum von Antikörper-produzierenden Tumoren hervorzurufen. Gegebenenfalls werden die Tiere mit einem Kohlenwasserstoff, speziell Mineralölen, wie Pristan (Tetramethylpentadecan), vor der Injektion vorbehandelt (geprimt bzw. primiert). Nach einer bis drei Wochen werden die Antikörper aus den Körperfluiden von jenen Säugetieren isoliert. Beispielsweise werden Hybridomzellen, die durch Fusion von geeigneten Myelomzellen mit Antikörperproduzierenden Milzzellen aus Balb/c-Mäusen erhalten worden sind, oder transfizierte Zellen, die von der Hybridomzelllinie Sp2/0 abgeleitet worden sind, die die gewünschten Antikörper produzieren, intraperitoneal Balb/c-Mäusen, die gegebenenfalls mit Pristan vorbehandelt worden sind, injiziert und nach einer bis zwei Wochen wird von den Tieren Aszitesflüssigkeit gewonnen.
Die vorangegangenen und andere Techniken werden beispielsweise in Köhler und Milstein, (1975), Nature 256:495-497; US 4,376,110 ; Harlow und Lane, Antibodies: a Laboratory Manual, (1988), Cold Spring Harbor, diskutiert. Techniken für die Herstellung von rekombinanten Antikörpermolekülen werden in den obigen Referenzen und beispielsweise auch in EP 0623679 , EP 0368684 und EP 0436597 beschrieben.
Die Zellkulturüberstände werden auf die gewünschten Antikörper gescreent, vorzugsweise durch Immunfluoreszenzanfärbung von Zellen, die das gewünschte Ziel exprimieren, durch Immunblotting, durch einen Enzymimmunassay, beispielsweise einen Sandwich-Assay oder einen Dot-Assay oder einen Radioimmunassay.
Für eine Isolierung der Antikörper können die Immunglobuline in den Kulturüberständen oder in der Aszitesflüssigkeit konzentriert werden, beispielsweise durch Ausfällung mit Ammoniumsulfat, Dialyse gegen hygroskopisches Material, wie Polyethylenglycol, Filtration durch selektive Membranen oder dergleichen. Sofern erforderlich und/oder gewünscht, werden die Antikörper durch gewöhnliche Chromatographiemethoden, beispielsweise Gelfiltration, Ionenaustauschchromatographie, Chromatographie über DEAE-Cellulose und/oder Immunaffinitätschromatographie, beispielsweise Affinitätschromatographie mit dem Protein, welches eine Zielstruktur enthält, oder mit Protein-A, gereinigt.
Gemäß den vorangegangenen Maßnahmen erzeugte Antikörper können durch Isolierung von Nukleinsäure aus Zellen gemäß Standardmaßnahmen kloniert werden. In nützlicher Weise können Nukleinsäuren für die variablen Domänen der Antikörper isoliert und verwendet werden, um Antikörperfragmenten, wie scFv, zu konstruieren.
Die hier beschriebenen Verfahren setzen vorzugsweise rekombinante Nukleinsäuren ein, die ein eine variable Domäne einer schweren Kette und/oder eine variable Domäne einer leichten Kette von Antikörpern kodierendes Insert umfassen. Per definitionem umfassen solche Nukleinsäuren kodierende einzelsträngige Nukleinsäuren, doppelsträngige Nukleinsäuren, bestehend aus den kodierenden Nukleinsäuren und aus dazu komplementären Nukleinsäuren, oder diese komplementären (einzelsträngigen) Nukleinsäuren selbst.
Darüber hinaus können Nukleinsäuren, die eine variable Domäne einer schweren Kette und/oder eine variable Domäne einer leichten Kette von Antikörpern kodieren, enzymatisch oder chemisch synthetisierte Nukleinsäuren sein, welche die authentische Sequenz, welche eine in der Natur vorkommende variable Domäne einer schweren Kette und/oder die variable Domäne einer leichten Kette kodiert, oder eine Mutante davon aufweisen. Eine Mutante der authentischen Sequenz ist eine Nukleinsäure, welche eine variable Domäne einer schweren Kette und/oder eine variable Domäne einer leichten Kette der oben erwähnten Antikörper kodiert, in welcher eine oder mehrere Aminosäuren deletiert oder durch eine oder mehrere andere Aminosäuren ausgetauscht ist bzw. sind. Die Modifikation(en) liegen vorzugsweise außerhalb der „complementary determining regions" (CDRs; Komplementaritäts-bestimmende Regionen) der variablen Domäne der schweren Kette und/oder der variablen Domäne der leichten Kette des Antikörpers. Es ist beabsichtigt, dass eine solche mutierte Nukleinsäure auch eine stumme Mutante sein kann, in welcher ein oder mehrere Nukleotide durch andere Nukleotide ersetzt sind, wobei die neuen Codons die gleiche(n) Aminosäure(n) kodieren. Eine solche mutierte Sequenz ist auch eine degenerierte Sequenz. Degenerierte Sequenzen sind innerhalb der Bedeutung des genetische Codes degeneriert, indem eine unbegrenzte Anzahl von Nukleotiden durch andere Nukleotide ersetzt ist, ohne dass dies zu einer Veränderung der ursprünglich kodierten Aminosäuresequenz führt. Solche degenerierte Sequenzen können nützlich sein aufgrund ihrer unterschiedlichen Restriktionsstellen und/oder Häufigkeit von bestimmten Codons, die durch den speziellen Wirt, insbesondere Hefe, Bakterien- oder Säugetierzellen, bevorzugt werden, um eine optimale Expression der variablen Domäne der schweren Kette und/oder einer variablen Domäne einer leichten Kette zu erhalten.
Der Begriff Mutante soll eine DNA-Mutante umfassen, die durch in vitro- oder in vivo-Mutagenese von DNA gemäß Verfahren, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, erhalten wird.
Die Technologie der in vitro-DNA-Rekombination kann verwendet werden, um Antikörper zu verbessern. So können chimäre Antikörper konstruiert werden, um die Immunogenität davon bei diagnostischen oder therapeutischen Anwendungen zu verringern. Darüber hinaus kann Immunogenität minimiert werden, indem die Antikörper humanisiert werden durch CDR-Grafting [Europäisches Patent 0 239 400 (Winter)] und gegebenenfalls Gerüstmodifizierung [Europäisches Patent 0 239 400; Riechmann et al., (1988), Nature 322:323-327; und wie zusammenfassend dargestellt in der Internationalen Patentanmeldung WO 90107861 (Protein Design Labs)].
Es können rekombinante Nukleinsäuren eingesetzt werden, welche ein Insert umfassen, welches eine variable Domäne einer schweren Kette eines Antikörpers fusioniert mit einer humanen konstanten Domäne γ, beispielsweise γ1, γ2, γ3 oder γ4, vorzugsweise γ1 oder γ4, kodiert. In ähnlicher Weise können auch rekombinante DNAs, welche ein Insert umfassen, welches eine variable Domäne einer leichten Kette eines Antikörpers fusioniert mit einer humanen konstanten Domäne κ oder λ, vorzugsweise κ kodiert, verwendet werden.
Mehr bevorzugt können durch CDR-Grafting modifizierte Antikörper, die bevorzugt nur aus durch CDR-Grafting modifizierten variablen Domänen von leichten Ketten und schweren Ketten bestehen, verwendet werden. In vorteilhafter Weise sind die variable Domäne der schweren Kette und die variable Domäne der leichten Kette miteinander verknüpft mittels einer Spacer-Gruppe, welche gegebenenfalls eine Signalsequenz, welche die Prozessierung des Antikörpers in der Wirtszelle vereinfacht, und/oder eine DNA, welche ein Peptid kodiert, welches die Reinigung des Antikörpers erleichtert, und/oder eine Spaltstelle und/oder einen Peptid-Spacer und/oder ein Effektormolekül umfasst. Solche Antikörper sind als ScFvs bekannt.
Antikörper können darüber hinaus durch Mutagenese von Antikörpergenen, um künstliche Repertoire von Antikörpern zu erzeugen, erzeugt werden. Diese Technik erlaubt die Herstellung von Antikörper-Bibliotheken, wie nachfolgend weiter diskutiert wird; Antikörper-Bibliotheken sind auch kommerziell erhältlich. Daher werden künstliche Repertoire von Immunglobulinen, vorzugsweise künstliche ScFv-Repertoire, als Immunglobulin-Quelle verwendet.
Isolierte oder klonierte Antikörper können mit anderen Molekülen, beispielsweise Nukleinsäure- oder Proteinassoziierungsmitteln durch chemische Kopplung verknüpft werden unter Verwendung von Protokollen, die in diesem Fachgebiet bekannt sind (beispielsweise Harlow und Lane, Antibodies: a Laboratory Manual, (1988) Cold Spring Harbor, und Maniatis, T., Fritsch, E.F., und Sambrook, J. (1991), Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
NUKLEINSÄURESONDEN
Wie oben angemerkt, kann die detektierbare Einheit eine Nukleinsäure umfassen und solche Referenzstandard-Ausführungsformen, welche detektierbare Nukleinsäure-Einheiten umfassen, werden in geeigneter Weise als Standards im Rahmen einer in situ-Hybridisierung verwendet. In solchen Ausführungsformen wird eine Nukleinsäuresonde eingesetzt, die in der Lage ist, an die detektierbare Nukleinsäure-Einheit zu binden, um deren Vorliegen aufzudecken oder nachzuweisen.
Die Nukleinsäuresonde umfasst besonders bevorzugt wenigstens eine Sequenz, die in der Lage ist, mit einer Sequenz in der detektierbaren Einheit zu hybridisieren. Insbesondere kann sie wenigstens eine Sequenz umfassen, die zu einer solchen Sequenz komplementär ist. Die Nukleinsäuresonde ist vorzugsweise einzelsträngig und kann insbesondere einzelsträngige DNA oder einzelsträngige RNA umfassen.
Der Begriff „Hybridisierung", wie er in diesem Dokument verwendet wird, bezieht sich auf „den Prozess, durch welchen ein Strang von Nukleinsäure sich mit einem komplementären Strang durch Basenpaarung verbindet". Die Nukleinsäuresonde umfasst vorzugsweise Sequenzen, die zu einer Hybridisierung unter stringenten Bedingungen (beispielsweise 50°C und 0,2 × SSC {1 × SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Na₃-citrat, pH 7,0}) mit wenigstens einer Nukleotidsequenz in der detektierbaren Einheit in der Lage sind. Mehr bevorzugt umfasst die Nukleinsäuresonde Sequenzen, die zu einer Hybridisierung unter hochstringenten Bedingungen (beispielsweise 65°C und 0,1 × SSC {1 × SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Na₃-citrat, pH 7,0}) in der Lage sind.
Nukleinsäuresonden, die zu einer selektiven Hybridisierung mit einer Nukleotidsequenz in der detektierbaren Einheit oder mit deren komplementärer Sequenz in der Lage sind, werden im Allgemeinen zu wenigstens 75%, vorzugsweise wenigstens 85 oder 90% und mehr bevorzugt wenigstens 95% oder 98% homolog sein zu der entsprechenden komplementären Nukleotidsequenz in der detektierbaren Einheit über einen Bereich von wenigstens 20, vorzugsweise wenigstens 25 oder 30, beispielsweise wenigstens 40, 60 oder 100 oder mehr aneinander angrenzenden Nukleotiden. Bevorzugte Sonden umfassen wenigstens einen Bereich, welcher vorzugsweise zu wenigstens 80 oder 90% und mehr bevorzugt wenigstens 95% homolog ist zu der Nukleotidsequenz in der detektierbaren Einheit.
Der Begriff „selektiv hybridisierbar" bedeutet, dass die Nukleinsäuresonde in der Lage ist, mit der Zielnukleinsäuresequenz in einem Ausmaß signifikant oberhalb des Hintergrunds zu hybridisieren. Die Hintergrundhybridisierung kann auftreten, da beispielsweise andere Nukleotidsequenzen in der Probe, die für eine ISH verarbeitet wird, vorhanden sind. In diesem Falle impliziert Hintergrund ein Signalniveau, welches durch Wechselwirkung zwischen der Sonde und einem nicht-spezifischen DNA-Mitglied der Bibliothek erzeugt wird, das weniger als 10-fach, vorzugsweise weniger als 100-fach weniger intensiv als die mit der Ziel-DNA beobachtete spezifische Wechselwirkung ist. Die Intensität der Wechselwirkung kann beispielsweise durch radioaktive Markierung der Sonde, beispielsweise mit ³²P, gemessen werden.
Hybridisierungsbedingungen basieren auf der Schmelztemperatur (Tm) des Nukleinsäurebindungskomplexes, wie in Berger und Kimmel gelehrt wird (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Band 152, Academic Press, San Diego, CA) und verleihen eine definierte „Stringenz", wie oben erläutert.
Maximale Stringenz tritt typischerweise bei ungefähr Tm-5°C (5°C unterhalb der Tm der Sonde) auf; hohe Stringenz bei ungefähr 5°C bis 10°C unterhalb der Tm; mittlere Stringenz bei ungefähr 10°C bis 20°C unterhalb der Tm; und niedrige Stringenz bei ungefähr 20°C bis 25°C unterhalb der Tm. Wie sich für die Fachleute auf diesem Gebiet versteht, kann eine Hybridisierung bei maximaler Stringenz verwendet werden, um Sonden zu identifizieren, die identische Nukleotidsequenzen umfassen, während eine Hybridisierung bei mittlerer (oder niedriger) Stringenz verwendet werden kann, um Sonden zu identifizieren, welche ähnliche oder verwandte Polynukleotidsequenzen umfassen.
Nukleotidsequenzen, die nicht zu 100% homolog zu einer Sequenz in der detektierbaren Einheit sind, die aber als Sonden verwendet werden können, können auf verschiedene Weisen erhalten werden. Konservierte Sequenzen können beispielsweise vorhergesagt werden, indem die Aminosäuresequenzen aus mehreren Varianten/Homologen anhand von Homologie gegeneinander ausgerichtet werden (Alignment). Sequenz-Alignments können unter Verwendung von Computer-Software, die in diesem Fachgebiet bekannt ist, ausgeführt werden. Beispielsweise wird das GCG Wisconsin PileUp-Programm weithin verwendet.
Die Sonden können rekombinant, synthetisch oder durch jegliche Mittel oder Maßnahmen, die den Fachleuten auf diesem Gebiet zur Verfügung stehen, hergestellt werden. Im Allgemeinen werden Sonden durch Synthesemaßnahmen hergestellt werden, welche eine schrittweise Herstellung der gewünschten Nukleinsäuresequenz mit einem Nukleotid nach dem anderen umfassen. Techniken, um dies unter Verwendung von automatisierten Techniken zu bewerkstelligen, sind in diesem Fachgebiet leicht verfügbar.
Längere Nukleotidsequenzen für eine Verwendung als Nukleinsäuresonden werden im Allgemeinen unter Verwendung von Rekombinationsmaßnahmen, beispielsweise unter Verwendung von PCR (Polymerasekettenreaktion)-Klonierungstechniken, hergestellt werden. Dies wird umfassen, ein Paar von Primern (beispielsweise ungefähr 15 bis 30 Nukleotide), die einen Bereich der Zielsequenz, die man klonieren möchte, flankieren, herzustellen, die Primer in Kontakt mit mRNA oder cDNA, erhalten aus einer tierischen oder humanen Zelle, zu bringen, eine Polymerasekettenreaktion (PCR) auszuführen unter Bedingungen, die eine Amplifizierung des gewünschten Bereichs ermöglichen, das amplifizierte Fragment zu isolieren (beispielsweise durch Reinigen der Reaktionsmischung auf einem Agarosegel) und die amplifizierte DNA zu gewinnen. Die Primer können so gestaltet werden, dass sie geeignete Restriktionsen zymerkennungsstellen enthalten, so dass die amplifizierte DNA in einen geeigneten Klonierungsvektor kloniert werden kann.
Die Nukleinsäuresonden können durch verschiedene Mittel oder Maßnahmen, die in diesem Fachgebiet bekannt sind, markiert werden. Die Sonde kann beispielsweise unter Verwendung von radioaktiven Markierungen, wie ³¹P, ³³P oder ³²S, oder nicht-radioaktiv unter Verwendung von Markierungen, wie Digoxigenin oder fluoreszierenden Markierungen, von denen sehr viele in diesem Fachgebiet bekannt sind, markiert werden.
FÄRBEMITTEL UND FARBSTOFFE
Obwohl Antikörper als Bindemittel für eine Verwendung beim Aufdecken oder Nachweisen der detektierbaren Einheit bevorzugt sind, können andere geeignete Färbemittel oder Farbstoffe verwendet werden, um das Ziel aufzudecken oder nachzuweisen. Es können beispielsweise Farbstoffe, die typischerweise verwendet werden, um Textilien zu färben, verwendet werden, um das Ziel oder die detektetierbare Einheit oder die Faser selbst zu färben. Solche Farbstoffe werden typischerweise in einer stöchiometrischen Weise binden, so dass, je mehr detektierbare Einheit oder Faser vorhanden ist, umso mehr Farbstoff gebunden wird. Jedoch kann ein einfaches Färben, um das Vorliegen und/oder die Lokalisierung aufzudecken oder nachzuweisen, oftmals genug Informationen liefern.
„Spezielle" Färbemittel und Farbstoffe
Es sollte sich dementsprechend verstehen, dass der hier beschriebene Referenzstandard auch nicht nur unter Verwendung einer immunologischen Erkennung unter Verwendung von beispielsweise Antikörpern, sondern auch mittels Chemikalien, die wir als „spezielle Färbemittel" bezeichnen, gefärbt werden kann.
Die am geläufigsten verwendeten sind die allgemeine Hämatoxylin-Eosin (N & E)-Färbung, die Gomori-Methenamin-Silber-Färbung (GMS), die für das Identifizieren von beispielsweise Kohlenhydraten aus Pilzen nützlich sind, und die Periodic Acid-Schift (PAS)-Färbung, die für das Identifizieren von beispielsweise Glycogen, sauren und neutralen Mukosubstanzen, pilzlicher Zellwand, Basalmembranen, Collagenfasern und retikulären Fasern nützlich ist.
Es gibt zahlreiche spezielle Färbemittel-Formulierungen, Variationen und Kombinationen, einschließlich Trichrome Blue, Massons Trichrome, Preußischblau, Giemsa, Diff-Quik, Reticulum, Kongorot (Congo Red), Alcian Blau (Alcian Blue), Steiner, AFB, PAP, Gram, Mucicarmin, Verhoeff-van Gieson, Elastic, Carbol Fuchsin und Golgi-Färbemitteln.
Es sollte sich auch verstehen, dass einige der oben erwähnten speziellen Färbemittel spezifisch Zielsonden, wie beispielsweise einige Kohlenhydrate oder hydrophobe Gruppierungen, die in den hier beschriebenen Referenzstandard leicht eingeführt werden, färben werden. Darüber hinaus kann auch eine jegliche Kombination von einer oder mehreren immunologischen Färbungen und einem oder mehreren speziellen Färbemitteln ausgeführt werden.
Geeignete Färbemittel und Farbstoffe können beispielsweise jegliche der folgenden umfassen: 1,4-Phenylendiamin, 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid, 2,4-Dinitro-5-fluoranilin, 2-Naphthol (beta), 3,3'-Diaminobenzidin, 4-Chlor-1-naphthol, 4-Chlor-1-naphthol, Acridinorange, Acridinorange-hydrochlorid-Hydrat, Silberproteinat, Alcian Blue 8GX, Alizarin, Alizarinrot S, Alkali Blue 4B, Ammoniummolybdat- Tetrahydrat, Anilinhydrochlorid, Auramin O, Azocarmin B, Azocarmin G, Azophloxin, Azure A, Azure B, Azure II, Azure II-Eosin, Azure Mixture sicc. Giemsa Stain, Bengal Rose B, Benzopurpurin 4B, lösliches Preußischblau, unlösliches Preußischblau, Bismarck Brown Y (G), Bismarck Brown R, basisches Bismuth(III)-nitrat, Blei(II)-acetat-Trihydrat, Blei(II)-citrat-Trihydrat, Blei(II)-nitrat, Blei(II)-nitrat, Blei(II)-tartrat, Bleitetraacetat, Borax Carmin Solution ((nach Grenacher), Brilliantgrün, Brilliantkresylblau, „Brilliant Cresyl Blue", Brilliant Cresyl Blue Solution, Bromkresolgrün „andcomplexometry", Bromkresolgrün, Natriumsalz, Bromkresolpurpur, Bromphenolblau, Bromsulfalein, Bromthymolblau, Natriumsalz, Carbol-Fuchsin Dye Powder, Carbo-Fuchsin Solution (nach Kinyoun), Carbol-Fuchsin Solution (nach Ziehl-Neelsen), Carbol-Gentianaviolet Solution, Carbol-Methylenblau-Lösung, Carmin, Carminsäure, Celestinblau, Chinacrin-Senf-dihydrochlorid, Chinolingelb, Chlorazolschwarz, Chrom(VI)-oxid, Chrom(VI)-oxid, Chromotrop 2R „andcomplexometry", Chrysoidin G, wasserfreies Cobalt(II)-chlorid, Cobaltnaphthenat, ∼10% Co, Cyanosin, Cytochrom c aus Pferdeherz-Lyophilisat, salzfreies Pulver, Cytochrom c aus Pferdeherz, Cytochrom c aus Pferdeherz, Cytochrom c aus Rinderherz, Cytochrom c aus Taubenbrustmuskel, Differential Stain Solution, Direktrot, Direktrot 80, Fast Blue B-Salz, Fast Blue BB-Salz, Fast Blue RR-Salz, Fast Green FCF, Fast Red 3 GL-Salz, Fast Red RC-Salz, Fast Violet B-Salz, alkohollösliches Eosin, Eosin Yellowish, Eosin Yellowish-Lösung, Eosin-Hämatoxylin-Lösung (nach Ehrlich), Eosin-Methylenblau (nach Leishman), Eosin-Methylenblau (nach Wright), Eosin Methylene Blue, Eosin-Methylenblau-Lösung (nach Wright), Eosin Methylenblau-Lösung (nach Wright-Lillie), Eosin Scarlet, Eriochrom Red B, Erythrosin extra Bluish, Acetic acid Solution, Ethylviolett, Evans Blue Fluka, Farbstofflösung (nach Boroviczeny, A: Toluidine Blue-Safranine fix), Farbstofflösung (nach Boroviczeny, B: EosineSolution), Ferritin aus Pferdemilz, Fat Red Bluish, Fat Black, Fluoresceinisothiocyanat, Fuchsin, Fuchsin-Lösung, Gailocyanin, Gentian Violet, Giemsa-Lösung, Goldchlorid-Hydrat (∼52% Au), Goldchlorid-Hydrat (ACS, > 49% Au), Gold Solution, kolloidal, Hämalaun, Hämatein, Hämatoxylin, Hämatoxylin-Lösung A (nach Weigert), Hämatoxylin-Lösung B (nach Weigert), Hämatoxylin-Lösung (nach Boehmer), Hämatoxylin-Lösung (nach Delafield), Hämatoxylin-Lösung (nach Mayer), Hanker-Yates-Reagens, Hayem's-Lösung, Hesperidin, Indigocarmin, Indium(III)-chlorid-Hydrat, wasserfreies Indium(III)-chlorid, Iodnitrotetrazoliumchlorid, iso-Chloridazonlösung, Janus GreenB, Kaliumdichromat, Kaliumhexahydroxoantimonat (V), Kaliumpermanganat, Kaliumpermanganat (Hg < 0,000005%, ACS), ammoniakalische Carmin-Lösung (nach Best), saure Carmin-Lösung (nach Mayer), Nuclear Fast Red, Kongorot, Indikator, Kresolrot, Kresylviolettacetat, Kristallviolett-Indikator, Kristallviolett-Lösung, Lactophenol Blue-Lösung, Lanthannitrat-Hexahydrat, Light Green SF Yellowish, Lipid Crimison, Lithiumcarbonat, Lugol-Lösung, Malachitgrün-oxalat, May-Grünwald-Lösung, Metanil Yellow, Methylenblau-Zinkchlorid-Doppelsalz, Methylenblau, Methylenblau-Konzentrat (nach Ehrlich), alkalische Methylenblau-Lösung (nach Löffler), Methylengrün-Zink-Doppelsalz, Methylgrün, Methylorange, Methylviolett, Morin, Mucicarmin, N-(4-Amino-2,5-diethoxyphenyl)benzamid, N,N-Dimethylanilin, N,N-Dimethyl-p-toluidin, Naphthol-AS-acetat, Naphthol AS-BI-beta-D-glucuronid, (die folgenden Naphthol-Derivate sind Enzym (AP)-Substrate), Naphthol AS-BI-phosphat, Dinatriumsalz-Heptahydrat, Naphthol AS-BI-phosphat, Naphthol AS-Bi-phosphat, Naphthol AS-BS-phosphat, Naphthol AS-chloracetat, Naphthol AS-D-acetat, Naphthol AS-D-chloracetat, Naphthol AS-E-acetat, Naphthol AS-E-phosphat, Naphthol AS-MX-acetat, Naphthol AS-MX-phosphat, Dinatriumsalz-Nonahydrat, Naphthol AS-MX-phosphat, für die Histologie, Naphthol AS-phosphat, für die Histologie, Naphthol AS-TR-phosphat, Naphthol AS-TR-phosphat, Naphthol Blue Black, Naphthol Yellow S, Naphthol Green B „and- complexometry", Natriumwolframat-Dihydrat, Nelkenöl, Neotetrazoliumchlorid, New Coccine, New Fuchsine, New Methylene Blue N, Neutralrot, alkohollösliches Nigrosin B, wasserlösliches Nigrosin, Nile Blue A, Nile Blue-chlorid, Ninhydrin, Ninhydrin, Nitrazingelb, Nitrotetrazoliumblau-chlorid, Nitrotetrazolium Blue chloride, Nitrotetrazolium Blue chlor, Orange G, Orange G-Lösung (alkoholisch), Orcein, Orcein, wasserfreies Palladium(II)-chlorid, Palladium(II)-oxid-Hydrat, Parafuchsin, Parafuchsin-Hydrochlorid, Peroxidase aus Meerrettich (lyoph. Pulv. salzfrei ∼100 E/mg), Phenosafranin, Phosphomolybdänsäure, Ammoniumsalz-Hydrat, Phosphomolybdänsäure-Hydrat, Phosphomolybdänsäure, Natriumsalz-Hydrat, Phosphorpentoxid, Phosphorwolframsäure-Hydrat, Phthalocyanin, Pikrinsäure, befeuchtet mit Wasser (H2O 40%), Pinacyanoliodid, Platin(IV)-oxid-Hydrat, Ponceau BS, Ponceau S, Pyridin, Pyronin Y(G), Resorufin, Rhodamin B, wasserfreies Ruthenium(III)-chlorid, Ruthenium Red, Safranin T, Safranin-Lösung (nach Olt), Acid Fuchsin, Calciumsalz, Acid Fuchsin-Indikator, Scarlet R, Schiffs-Reagens für Aldehyde, Silber, Codex France, kolloidal, Silbernitrat, Sirius Rose BB, „Stains-all", Sudanblau II, Sudanorange G, Sudanrot B, Sudanschwarz B, Sulforhodamin B-Säurechlorid, Tartrazin, Tetranitroblautetrazoliumchlorid, Tetrazoliumblauchlorid, Tetrazoliumviolett, Thallium(I)-nitrat, Thiazole Yellow G, Adsorptionsindikator, Thiazolylblautetrazoliumbromid, Thiocarbohydrazid, Thioflavin T, Thioninacetat, Toluidinblau, Tropaeolin 000 Nr. 1, Tropaeolin 000 Nr. 2, Trypanblau, Trypanblau-Lösung, 0,4%, Tuerk-Lösung, Uranylacetat-Dihydrat, Uranylnitrat-Hexahydrat, Variamine Blue B-Salz, Vesuvine-Lösung (nach Neisser), Victoria Blue B, Water Blue, Weigerts-Lösung, Wolframsiliciumsäure-Hydrat, Wright-Stain, Xylencyanol FF (Redox-Indikator).
ANTIGENGEWINNUNG (ANTIGEN-RETRIEVAL)
Um die spezifische Erkennung in fixiertem Gewebe zu vereinfachen, ist es oftmals notwendig, die Ziele durch Vorbehandlung der Proben (wieder) zu gewinnen oder zu demaskieren, um die Reaktivität der Hauptmenge der Ziele zu erhöhen. Diese Maßnahme wird als „Antigengewinnung", „Antigen-Retrieval", „Target-Retrieval" oder „Epitop-Retrieval", „Target-Demaskierung" oder „Antigen-Demaskierung" bezeichnet. Eine umfassende Übersicht über die Antigengewinnung (Antigen-Retrieval, Antigen-Demaskierung) kann in Shi S-R, Cote RJ, Taylor CR, Antigen retrieval immunocytochemistry: past, present, future. J. Histochem. Cytochem. 1997: 45(3); 327-343, gefunden werden.
Die Antigengewinnung (Antigen-Retrieval) oder Zielgewinnung (Target-Retrieval) umfasst verschiedene Verfahren, durch welche die Verfügbarkeit des Ziels für eine Wechselwirkung mit einem spezifischen Detektionsreagens maximiert wird. Die üblichsten Techniken sind ein enzymatischer Verdau mit einem proteolytischen Enzym (beispielsweise Proteinase, Pronase, Pepsin, Papain, Trypsin oder Neuraminidase) in einem geeigneten Puffer oder eine wärmeinduzierte Epitopgewinnung (HIER; „heat induced epitope retrieval") unter Verwendung von Mikrowellenbestrahlung, Erwärmen in einem regulären Ofen, Autoklavieren oder Kochen in einem Dampfdrucktopf in einem geeignet pH-stabilisierten Puffer, welcher üblicherweise EDTA, EGTA, Tris-HCl, Citrat, Harnstoff, Glycin-HCl oder Borsäure enthält.
Es können Detergentien zu dem HIER-Puffer zugesetzt werden, um die Epitopgewinnung zu erhöhen, oder zu dem Verdünnungsmedium und/oder den Spülpuffern zugesetzt werden, um eine unspezifische Bindung zu verringern.
Zusätzlich kann das Signal-Rausch-Verhältnis durch verschiedene physikalische Methoden erhöht werden, einschließlich der Anwendung von Vakuum und Ultraschall oder Einfrieren und Auftauen der Schnitte vor oder während der Inkubation der Reagenzien.
Endogene Biotin-Bindungsstellen oder endogene Enzymaktivität (beispielsweise Phosphatase, Katalase oder Peroxidase) können als ein Schritt in dem Färbeverfahren entfernt werden.
In ähnlicher Weise wird weithin ein Blockieren von unspezifischen Bindungsstellen mit inerten Proteinen, wie HSA, BSA, Ovalbumin, fötalem Kälberserum oder anderen Seren, oder Detergentien, wie Tween20, Triton X-100, Saponin, Brij oder Pluronics, verwendet. Blockieren von unspezifischen Bindungsstellen in dem Gewebe oder den Zellen mit unmarkierten und nicht-zielspezifischen Versionen der spezifischen Reagenzien.
ANDERE TECHNIKEN
Bei Färbeverfahren unter Verwendung der sogenannten „free floating techniques" (Techniken im frei schwebenden Zustand) wird ein Gewebeschnitt in Kontakt mit verschiedenen Reagenzien und Waschpuffern in Suspension oder frei schwebend in geeigneten Behältern, beispielsweise Mikrozentrifugenröhrchen, gebracht.
Die Gewebeschnitte können mit verschiedenen Reagenzien und Puffern während des Färbeverfahrens unter Verwendung beispielsweise einer „Angelhaken-artigen" Vorrichtung, eines Spatels oder eines Glasrings von Röhrchen zu Röhrchen transferiert werden.
Die verschiedenen Reagenzien und Puffer können auch durch sanftes Dekantieren oder Vakuum-Absaugen gewechselt werden. Alternativ können Behälter mit den Gewebeschnitten in ein spezielles Färbenetz, wie die Corning „Netwells" entleert und der Gewebeschnitt gewaschen werden, bevor er für den nächsten Färbeschritt zurück in das Röhrchen transferiert wird.
Alle individuellen Färbeverfahrensschritte, einschließlich beispielsweise Fixierung, Antigengewinnung (Antigen-Retrieval), Waschen, Inkubation mit Blockierungsreagenzien, immunspezifischen Reagenzien und beispielsweise die enzymatisch katalysierte Entwicklung der gefärbten Färbungen, erfolgen, während der Gewebeschnitt frei schwebt oder auf Netzen zurückgehalten wird. Nach der Entwicklung der Färbung wird der Gewebeschnitt auf Objektträger aufgelegt, getrocknet, bevor er gegengefärbt und mit einem Deckgläschen abgedeckt wird, bevor er in beispielsweise einem Mikroskop analysiert wird.
Gelegentlich wird der Gewebeschnitt auf Objektträger nach der kritischen Inkubation mit den immunspezifischen Reagenzien aufgebracht. Der Rest des Färbeverfahrens wird dann an den auf den Objektträger aufgebrachten Gewebeschnitten ausgeführt.
Das Verfahren in frei schwebendem Zustand ist hauptsächlich an dicken Gewebeschnitten verwendet worden. Es ist wichtig, dass die Schnitte während des Färbeverfahrens niemals austrocknen.
Vorteile des Verfahrens in frei schwebendem Zustand umfassen eine gleichmäßige und gute Penetration der immunhistochemischen Färbereagenzien. Das Verfahren in frei schwebendem Zustand ermöglicht hohe Konzentrationen von Reagenzien und ein gutes Mischen.
HISTOLOGISCHE MATERIALIEN, TECHNIKEN UND ANALYSEN
Es gibt allgemein zwei Kategorien von histologischen Materialien. Der hier beschriebene Referenzstandard kann in geeigneter Weise für eine Analyse von jedem Typ eingesetzt werden.
Die erste Kategorie umfasst Präparate, die frisches Gewebe und/oder Zellen sind, die im Allgemeinen nicht mit auf Aldehyd basierenden Fixiermitteln fixiert werden. Diese Proben umfassen üblicherweise Biopsiematerialien, die analysiert werden können, während das Operationsverfahren noch läuft (gefrorene Schnitte), zytologische Präparate (einschließlich z.B. Berührungspräparate und Blutabstriche), und Gewebe, die histochemisch analysiert werden sollen. Solche Proben werden entweder direkt auf einen Objektträger oder ein Deckgläschen platziert oder eingefroren und zu Scheiben geschnitten. Solche Proben werden dann fixiert, üblicherweise mit einem auf Alkohol oder Aceton basierenden Fixiermittel, und gefärbt.
Die üblichere zweite Kategorie umfasst eine fixierte, in Paraffin eingebettete Gewebeprobe, oftmals Archivmaterial. Diese werden oftmals als „Formalin-fixierte und in Paraffin eingebettete" (FFPE)-Proben bezeichnet. Diese Proben werden üblicherweise unter Verwendung eines auf Formalin basierenden Fixiermittels fixiert, durch Verwendung von beispielsweise Xylol dehydratisiert, in ein geeignetes Einbettungsmedium, wie Paraffin oder Kunststoff (beispielsweise Epon, Araldite, Lowicryl, LR White oder Polyacrylamid) eingebettet, zu einer Scheibe geschnitten, entparaffiniert oder auf andere Weise behandelt, rehydratisiert und gefärbt.
Biologische Proben können behandelt werden unter Verwendung der zytologischen und histologischen Techniken, die hier beschrieben werden, bevor sie gefärbt und mit dem Referenzstandard verglichen werden.
Die Probe kann vor der Analyse gereinigt oder konzentriert werden oder es können Zellen isoliert werden. Die Probe kann auch vor der Analyse in Paraffin eingebettet werden und in Schnitte zerschnitten werden. Solche Maßnahmen sind den Fachleuten auf diesem Gebiet wohlbekannt.
Die Probe kann auf einen Träger aufgelegt oder -gebracht werden. Der Begriff „aufgelegt" oder „aufgebracht" wird verstanden als platziert auf oder angeheftet an einen im Wesentlichen ebenen Träger. Es kann ein jeglicher geeigneter Träger eingesetzt werden. Mit umfasst wird, das Gewebe oder die Zellprobe auf einem Träger zu platzieren, beispielsweise für ein Betrachten auf einem Mikroskop-Objektträger. Die Probe kann angeheftet werden, um sie weiter daran zu hindern, während der Handhabung des Trägers herunterzufallen oder herunter zu gleiten. Das Anheftungsverfahren an den Träger umfasst das Sich-Verlassen auf die physikalische Kapillaranziehung, Klebstoffe und eine chemische Bindung. Die Probe kann fixiert oder nicht fixiert werden.
Insbesondere kann der Träger ein Glasobjektträger, eine Membran, ein Filter, ein Polymer-Objektträger, ein Kammer-Objektträger („chamber slide"), eine Schale oder eine Petrischale sein.
Die Probe oder Teile davon können in geeigneter Weise vor der Analyse direkt auf dem Träger gezüchtet oder kultiviert werden. Beispiele von geeigneten Kulturmedien umfassen Medien von biologischer Herkunft, wie Blutserum oder Gewebeextrakt; chemisch definierte synthetische Medien; oder Mischungen davon. Zellkulturen werden üblicherweise entweder als Einzelschichten von Zellen auf beispielsweise einer Glas- oder Kunststoffoberfläche, in Kolben oder auf Kammerobjektträgern oder als Suspension in einem flüssigen oder halbfesten Medium kultiviert. Die Zellen können zu einem besser geeigneten Träger, beispielsweise einen Glas-Objektträger, transferiert und auf diesen aufgebracht werden. Wenn sie auf einem Kammerobjektträger, der beispielsweise für das Betrachten in einem Mikroskop geeignet ist, kultiviert werden, können die Zellen potentiell auf dem Träger verbleiben.
Jedoch müssen die Zellen vor der Analyse nicht gezüchtet oder kultiviert werden. Oftmals wird die Probe direkt ohne Kultivierung analysiert werden. Es versteht sich, dass Proben für eine direkte Analyse die oben beschriebenen Verarbeitungsprozeduren durchlaufen können.
Die Probe kann, entweder direkt oder nachdem sie einen oder mehrere Verarbeitungsschritte durchlaufen hat, mittels primär zwei Arten von Methoden, in situ-Methoden (in situ-Analysen) und in vitro-Methoden (in vitro-Analysen), analysiert werden.
In diesem Kontext verstehen sich in situ-Methoden als Assays, in denen die Morphologie der Probenzellen im Wesentlichen bewahrt bleibt. Mit „im Wesentlichen bewahrt" ist gemeint, dass die Morphologie insgesamt bewahrt bleibt, was es möglich macht, einige oder alle der strukturellen Zusammensetzungen des Gewebes oder der Zellen zu identifizieren. Beispiele sind Analysen von Abstrichen, Biopsien, Berührungspräparaten und Ausstrichen der Probe auf den Träger. Proben können vor einer Analyse u.a. einer Fixierung, Permeabilisierung oder anderen Verarbeitungsschritten unterworfen werden.
In vitro-Methoden verstehen sich als Methoden, bei denen die Morphologie insgesamt nicht bewahrt bleibt. In dem Falle von in vitro-Methoden wird die Probe einer Behandlung unterzogen, die die Morphologie der Zellstruktur zerstört. Solche Behandlungen sind den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt und umfassen eine Behandlung mit organischen Lösemitteln, Behandlung mit starken chaotropen Reagenzien, wie hohen Konzentrationen von Guanidinthiocyanat, eine Enzymbehandlung, eine Detergensbehandlung, ein Beschießen mit Kügelchen („bead beating"), eine Wärmebehandlung, Beschallung und/oder Anwendung einer French-Press.
DETAILLIERTE MASSNAHMEN
Der folgende Abschnitt stellt eine detaillierte Beschreibung von Maßnahmen zur Herstellung von FFPE-Proben wie auch Antikörperfärbung und Detektion bereit. Er ist aus dem Referenztextbuch Antibodies: A Laboratory Manual von Ed Harlow (Herausgeber), David Lane (Herausgeber) (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-314-2), 1855, entnommen.
Herstellung von Paraformaldehyd
Kommerzielle 37%-ige Standardlösungen von Formaldehyd sind mit 10-15% Methanol stabilisiert, um die Polymerisation des Formaldehyds zu Paraformaldehyd zu hemmen. Für die meisten Fixiermittel sollte Paraformaldehyd anstelle von kommerziellem Formaldehyd verwendet werden. Paraformaldehyd löst sich in Wasser, wobei es in dem Prozess Formaldehyd freisetzt. Um eine 4%-ige Lösung von Paraformaldehyd herzustellen, gibt man 8 g zu 100 ml Wasser zu. In einem Abzug auf 60°C erwärmen. Einige Tropfen 1 N NaOH zugeben, um die Auflösung zu unterstützen. Wenn der Feststoff sich vollständig gelöst hat, die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen lassen, 100 ml 2 × PBS zugeben. Diese Stammlösung sollte täglich frisch hergestellt werden.
Herstellung von in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten
1. Kleine Blöcke von ungefähr 1 cm² × 0,4 cm schneiden. 2. In entweder frisch hergestelltes 4%-iges Paraformaldehyd oder Bouins-Fixiermittel (Um 1 l herzustellen, 2 g Pikrinsäure in 500 ml entionisiertem Wasser lösen. Durch Whatman Nr. 1 oder einen äquivalenten Filter filtrieren. 20 g Paraformaldehyd zugeben und in einem Abzug auf 60°C erwärmen. Zur Auflösung einige Tropfen 1 N NaOH zugeben. Abkühlen und 500 ml 2 × PBS zugeben) geben. 3. 2 h bis über Nacht inkubieren. 4. Standard-Paraffin-Einbettungsprozeduren folgen. 5. 4 μm-Schnitte auf sauberen Glas-Objektträgern sammeln. 6. 30 min in einen 60°C-Ofen geben. 7. In Xylol entparaffinieren. Zweimal wechseln, jeweils 3 min. 8. Rehydratisieren durch Hindurchleiten durch abgestufte Alkohole (zwei Wechsel, absolutes Ethanol, jeweils 3 min, gefolgt von zwei Wechseln 95% Ethanol, jeweils 3 min). 9. In Wasser spülen.
Antikörper können jetzt auf die Proben aufgebracht werden, wie nachfolgend beschrieben.
Wenn Detektionsmethoden mit Peroxidase-Markierung verwendet werden sollen, kann es erforderlich sein, endogene Enzymaktivität innerhalb der Probe vor dem Anwenden des Antikörpers zu blockieren oder zu hemmen. Um endogene Peroxidase-Aktivität zu blockieren, wird die Probe mit einer Lösung von 4 Teilen Methanol auf 1 Teil 3% Wasserstoffperoxid 20 min inkubiert. Wasserstoffperoxid wird im Allgemeinen als eine 30%-ige Lösung geliefert und sollte bei 4°C aufbewahrt werden, bei welcher Temperatur es ungefähr 1 Monat halten wird. Für Proben, die hohe Peroxidase-Aktivitäten enthalten, wie Milz oder Knochenmark, können bessere Ergebnisse erhalten werden, indem eine Lösung von 0,1% Phenylhydrazinhydrochorid in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) verwendet wird.
Fixierung
Alle Fixierprotokolle müssen (1) Antigen-Lecken verhindern, (2) die Zelle permeabilisieren, um den Zutritt des Antikörpers zu erlauben, (3) das Antigen in einer solchen Form halten, dass es durch den Antikörper effizient erkannt werden kann, und (4) die Zellstruktur aufrechterhalten.
Allgemein wird ein breites Spektrum von Fixiermitteln verwendet und die korrekte Methodenwahl wird von der Natur des untersuchten Antigens und von den Eigenschaften des Antikörperpräparats abhängen. Fixiermethoden fallen allgemein in zwei Klassen, organische Lösemittel und vernetzend wirkende Reagenzien. Organische Lösemittel, wie Alkohole und Aceton, entfernen Lipide und dehydratisieren die Zellen, wobei sie die Proteine an der zellulären Architektur ausfällen. Vernetzend wirkende Reagenzien bilden intermolekulare Brücken, normalerweise durch freie Aminogruppen, wodurch ein Netzwerk von verknüpften Antigenen erzeugt wird. Beide Methoden können Protein-Antigene denaturieren und aus diesem Grund können gegen denaturierte Proteine erzeugte Antikörper für eine Zellfärbung nützlicher sein. In einigen Fällen sind anti-denaturiertes Protein-Antikörper die einzigen, die funktionieren können.
Fixieren von anhaftenden Zellen in Paraformaldehyd oder Glutaraldehyd
Eine Fixierung in Protein vernetzenden Reagenzien, wie Paraformaldehyd oder Glutaraldehyd, bewahrt die Zellstruktur besser als organische Lösemittel, kann aber die Antigenität von einigen Zellkomponenten verringern. Eine einfache Fixierung mit Paraformaldehyd oder Glutaraldehyd ermöglicht keinen Zutritt des Antikörpers zu der Probe und dieser folgt dementsprechend ein Permeabilisierungsschritt unter Verwendung eines organischen Lösemittels oder nicht-ionischen Detergens. Die Verwendung des organischen Lösemittels ist leicht, aber sie kann bestimmte Elemente der Zellarchitektur zerstören, obwohl die vorherige Fixierung mit Paraformaldehyd dazu beiträgt, die Zellstruktur zu bewahren. Wenn die Bewahrung der Zellstruktur wichtig ist, bestünde die beste erste Wahl darin, ein nicht-ionisches Detergens zu verwenden.
1. Vor der Färbung entweder die Paraformaldehyd- oder Glutaraldehyd-Lösung herstellen. Für Paraformaldehyd eine 4%-ige Lösung herstellen. Für Glutaraldehyd eine 1%-ige Lösung (Elektronenmikroskopie-Qualität) in PBS herstellen. Vorsicht: Glutaraldehyd ist toxisch. In einem Abzug arbeiten. 2. Das Deckgläschen, den Objektträger oder die Platte sanft in PBS waschen. 3. Für Paraformaldehyd 10 min in einer 4%-igen Lösung bei Raumtemperatur inkubieren. Für Glutaraldehyd 1 h in einer 1%-igen Lösung bei Raumtemperatur in einem Abzug inkubieren. 4. Die Zellen zweimal mit PBS waschen. In diesem Stadium können mit Glutaraldehyd fixierte Zellen aus dem Abzug entfernt werden. 5. Die fixierten Zellen permeabilisieren durch Inkubation in einem der Folgenden: (i) 0,2% Triton X-100 in PBS für 2 min bei Raumtemperatur. Einige Antigene können bis zu 15 min benötigen. Dies ist für jedes Antigen zu überprüfen; (ii) Methanol für 2 min bei Raumtemperatur; oder (iii) Aceton für 30 s bei Raumtemperatur (für auf Gewebekulturplatten kultivierte Zellen 50% Aceton/50% Methanol verwenden). (Optional) Für Glutaraldehyd freie reaktive Aldehydgruppen durch Inkubation mit 0,2 M Ethanolamin, pH 7,5, für 2 h bei Raumtemperatur oder durch Inkubation mit drei Wechseln von 5 min, jeweils mit 0,5 mg/ml Natriumborhydrid in PBS, blockieren. In einigen Fällen kann dies auch Paraformaldehyd-fixierten Zellen helfen, aber im Allgemeinen ist dies nicht erforderlich. 6. Sanft mit PBS mit vier Wechseln über 5 min spülen.
Die Probe ist nun bereit für das Auftragen von Antikörpern, wie nachfolgend beschrieben.
Demaskieren von versteckten Epitopen mit Proteasen
Eine Fixierung in Formaldehyd oder Glutaraldehyd kann einige Epitope maskieren oder verändern. Diese Epitope können oftmals erneut exponiert werden durch eine sanfte Inkubation der Probe mit Proteasen. Trypsin funktioniert gut. Die Probe in einer 0,1% Trypsin, 0,1% CaCl₂, 20 mM Tris, pH 7,8, – Lösung 2-20 min bei Raumtemperatur inkubieren. Den Verdau durch Spülen der Probe unter dem kalten Wasserhahn für 5 min stoppen.
Binden von Antikörpern an anhaftende Zellen
Antikörper werden im Allgemeinen direkt auf den Bereich der Zellen oder Gewebe, der untersucht wird, aufgetragen.
1. Zellen werden fixiert und gewaschen. Deckgläschen, Objektträger oder Platten in eine befeuchtete Kammer legen. Objektträger und Deckgläschen können in eine Petrischale, die einen wassergesättigten Filter enthält, gelegt werden. Deckgläschen werden am besten auf eine Lage Parafilm gelegt; dieser trägt dazu bei, die Antikörperlösung zu stoppen, bevor sie von der Kante des Deckgläschens herunter fließt, und macht es leicht, die Deckgläschen mit feinen Pinzetten aufzuheben, da der Parafilm zusammendrückbar ist. 2. Die erste Antikörperlösung zugeben. Alle Verdünnungen müssen in Protein enthaltenden Lösungen ausgeführt werden. Beispielsweise 3% BSA enthaltende PBS verwenden. Für unmarkierte primäre Antikörper: Monoklonale Antikörper werden am besten als Gewebekulturüberstände (spezifische Antikörperkonzentration von 20-50 mg/l, unverdünnt verwenden) aufgetragen. Aszitesflüssigkeit, gereinigte monoklonale und polyklonale Antikörper und rohe polyklonale Seren sollten in einem Bereich von Verdünnungen, die darauf abzielen, spezifische Antikörperkonzentrationen zwischen 0,1 und 10 mg/l zu erzeugen, getestet werden. Wenn die spezifische Antikörperkonzentration der Antikörperprobe unbekannt ist, 1/10-, 1/100-, 1/1000 und 1/10000-Verdünnungen des Ausgangsmaterials herstellen und testen. Für markierte primäre Antikörper: Primäre Antikörper können mit Enzymen, Fluorochromen oder Iod markiert werden. Sie sollten in mehreren Verdünnungen in vorab erfolgenden Tests getestet werden, um den korrekten Arbeitsbereich zu bestimmen. Zu hohe Konzentrationen werden hohe Hintergründe ergeben; eine zu niedrige Konzentration wird sowohl von dem reichhaltigen Vorkommen des untersuchten Antigens als auch der Spezifität des Antikörpers abhängen. 3. Die Deckgläschen, Objektträger oder Platten mindestens 30 min bei Raumtemperatur in der befeuchteten Kammer inkubieren. Für einige Reaktionen können verlängerte Inkubationen von bis zu 24 h die Empfindlichkeit erhöhen. 4. In drei Wechseln von PBS über 5 min waschen. Dieser Puffer kann mit 1% Triton X-100 oder NP-40 ergänzt werden, um bei jeglichen Hintergrund-Problemen Hilfe zu liefern.
Wenn der erste Antikörper markiert ist, ist die Probe nun bereit für den Detektionsschritt. Ansonsten:
5. Das markierte sekundäre Reagens auftragen. Es ist essentiell, alle Verdünnungen in einer Protein enthaltenden Lösung, wie 3% BSA in PBS oder 1% Immunglobulin in PBS (hergestellt aus der gleichen Spezies wie das Detektionsreagens) auszuführen. Nützliche sekundäre Reagenzien umfassen anti-Immunglobulin-Antikörper, Protein A oder Protein G. Sie können mit Enzymen, Fluorochromen, Gold oder Iod markiert werden. Markierte sekundäre Reagenzien können von mehreren Lieferanten erworben werden oder können hergestellt werden. Für Enzym-markierte Reagenzien: Bei Verwendung eines kommerziellen Präparats Testverdünnungen der sekundären Antikörper: 1/50 bis 1/1000. Mit alkalischer Phosphatase markierte Reagenzien sollten unter Verwendung von Tris-gepufferter Kochsalzlösung, nicht PBS gehandhabt werden. Für Fluorochrom-markierte Reagenzien: Bei einer Verwendung von kommerziellen Präparaten Testverdünnungen zwischen 1/10 und 1/300. Für Gold-markierte Reagenzien: Die Goldpartikel einmal in PBS waschen. In PBS, enthaltend 1% Gelatine, verdünnen und zu der Probe hinzugeben. Für Iod-markierte Reagenzien: Den iodierten Antikörper in einer Konzentration von ungefähr 0,1 mg/l zugeben. Üblicherweise werden spezifische Aktivitäten zwischen 10 und 100 Ci/g verwendet.
6. Mit dem markierten sekundären Reagens minimal 20 min bei Raumtemperatur in der befeuchteten Kammer inkubieren. Für Gold-markierte Reagenzien in Zeitabständen unter dem Mikroskop beobachten, bis ein zufrieden stellendes Signal erhalten wird. 7. In drei Wechseln von PBS (oder Tris-Kochsalzlösung) über 5 min waschen.
Die Probe ist nun bereit für den Detektionsschritt.
Detektion unter Verwendung von Enzym-markierten Reagenzien
Enzym-markierte Reagenzien werden detektiert unter Verwendung von chromogenen Substraten, die nach Enzymwirkung ausfallen, was an der Stelle der Enzym-Lokalisierung ein unlösliches gefärbtes Produkt ergibt (Avrameas und Uriel, 1996; Nakane und Pierce, 1967a, b; Avrameas, 1972). Für jedes Enzym steht ein Spektrum von Substraten zur Verfügung und die folgenden Protokolle repräsentieren einige der nützlichsten Alternativen. Ein breites Spektrum von konjugierten Reagenzien ist kommerziell erhältlich oder kann, wie beschrieben, hergestellt werden. Enzyme können mit anti-Immunglobulin-Antikörpern, Protein A, Protein G, Avidin oder Streptavidin gekoppelt werden.
Meerrettich-Peroxidase-markierte Reagenzien
Ein Spektrum von Substraten ist nützlich, einschließlich Diaminobenzidin, Chlornaphthol und Aminoethylcarbazol. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Verwendung von Diaminobenzidin angezeigt.
Diaminobenzidin
Diaminobenzidin (DAB) ist das am weitesten verbreitet verwendete Substrat und eines der empfindlichsten für Meerrettich-Peroxidase. Es ergibt ein intensives braunes Produkt, das sowohl in Wasser als auch Alkohol unlöslich ist. Eine DAB-Färbung ist mit einem breiten Spektrum von üblichen histologischen Färbungen verträglich.
1. 6 mg DAB (verwende DAB-tetrahydrochlorid) in 10 ml 0,05 M Tris-Puffer, pH 7,6, lösen. 2. 0,1 ml einer 3%-igen Lösung von H₂O₂ in H₂O zugeben. H₂O₂ wird im Allgemeinen als eine 30%-ige Lösung vertrieben und sollte bei 4°C aufbewahrt werden, bei welcher Temperatur sie sich ungefähr 1 Monat halten wird. 3. Wenn ein Niederschlag auftritt, durch Whatman No. 1-Filterpapier (oder ein äquivalentes Material) filtrieren. 4. Auf Probe auftragen, 1-20 min inkubieren. Die Reaktion durch Waschen mit Wasser stoppen. (Optional) Gegenfärben, sofern nötig. 5. In DPX eindecken.
Diaminobenzidin/Metall
Das Diaminobenzidin-Substrat für Meerrettich-Peroxidase kann empfindlicher gemacht werden, indem Metallsalze, wie Cobalt oder Nickel, zu der Substratlösung zugesetzt werden. Das Reaktionsprodukt ist schiefergrau bis schwarz und die Produkte sind sowohl in Wasser als auch Alkohol stabil. Eine DAB/Metall-Färbung ist mit einem breiten Spektrum von üblichen histologischen Färbungen verträglich.
1. 6 mg DAB (verwende DAB-tetrahydrochlorid) in 9 ml 0,05 M Tris-Puffer, pH 7,6, lösen. 2. 1 ml einer 0,3%-igen (Gew./Vol.) Stammlösung von Nickelchlorid in H₂O zugeben (als Alternative kann die gleiche Menge Cobaltchlorid verwendet werden). 3. 0,1 ml einer 3%-igen Lösung von H₂O₂ in H₂O zugeben. H₂O wird im Allgemeinen als eine 30%-ige Lösung vertrieben und sollte bei 4°C aufbewahrt werden, bei welcher Temperatur sie sich ungefähr 1 Monat halten wird. 4. Wenn ein Niederschlag auftritt, durch Whatman No. 1-Filterpapier (oder ein äquivalentes Material) filtrieren. 5. Auf Probe auftragen, 1-20 min inkubieren. Die Reaktion durch Waschen mit H₂O stoppen. (Optional) Gegenfärben, sofern nötig. 6. In DPX eindecken.
KOPPLUNG
Die detektierbare Einheit kann an die Faser durch verschiedene Methoden gekoppelt werden. Beispielsweise kann die detektierbare Einheit an die Faser durch die Verwendung von Bromcyan gekoppelt werden.
Es werden chemische Vernetzungsmittel verwendet, um Proteine kovalent für das Untersuchen von Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen, Konformationsveränderungen in der Tertiärstruktur zu modifizieren, oder für eine Proteinmarkierung. Vernetzungsmittel werden in homobifunktionelle Vernetzungsmittel, welche zwei identische reaktive Gruppen enthalten, oder heterobifunktionelle Vernetzungsmittel mit zwei unterschiedlichen reaktiven Gruppen unterteilt. Heterobifunktionelle Vernetzungsmittel erlauben nacheinander erfolgende Konjugationen, wodurch eine Polymerisation minimiert wird.
Homobifunktionell
Heterobifunktionell
Jedes dieser Reagenzien kann von verschiedenen Herstellern erhalten werden, beispielsweise von Calbiochem (Code-Nr. in Spalte 2) oder Pierce Chemical Company.
Die Faser kann vor dem Koppeln aktiviert werden, um ihre Reaktivität zu erhöhen. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Faser unter Verwendung von Chloressigsäure aktiviert, gefolgt von einem Koppeln unter Verwendung von EDAC/NHS-OH. Fasern können auch unter Verwendung von Hexandiisocyanat aktiviert werden, um primäre Aminogruppen zu erhalten. Solche aktivierten Fasern können in Kombination mit einem jeglichen heterobifunktionellen Vernetzungsmittel verwendet werden. Die Faser wird in bestimmten Ausführungsformen unter Verwendung von Dinvinylsulfon aktiviert. Solche aktivierten Fasern umfassen Gruppierungen, die beispielsweise mit Amino- oder Thiolgruppen an einem Peptid reagieren können.
Die Faser kann auch unter Verwendung von Tresylchlorid aktiviert werden, was Gruppierungen ergibt, die in der Lage sind, mit Amino- oder Thiolgruppen zu reagieren. Die Faser kann auch unter Verwendung von Chlorcyan aktiviert werden, was Gruppierungen ergibt, die mit Amino- oder Thiolgruppen reagieren können.
PEPTID-KOPPLUNG
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die detektierbare Einheit ein Peptid. Das Koppeln von Peptiden an Fasern wird in diesem Abschnitt im Detail beschrieben.
Peptide können durch Festphasensynthese-Methoden erhalten werden. Der erste Schritt der Technik, die erstmalig von Merrifield eingeführt wurde (R.B. Merrifield, Solid Phase Peptide Synthesis. The synthesis of a Tetrapeptide, J. Am. Chem. Soc. 85, Seite 2149-2154, (1963), und R.B. Merrifield, Solid Phase Synthesis, Science 232, Seite 341-347, (1986)) besteht aus dem Zusammenbau einer Peptidkette mit geschützten Aminosäurederivaten an einem polymeren Träger. Der zweite Schritt der Technik besteht in dem Abspalten des Peptids von dem Träger mit der gleichzeitigen Abspaltung aller Seitenketten-Schutzgruppen, wodurch das rohe freie Peptid erhalten wird. Um größere Peptide zu erhalten, können diese Vorgänge nacheinander wiederholt werden.
Die Flexibilität des Verfahrens erlaubt die Synthese von langen, kurzen und verzweigten Peptiden, einschließlich Peptiden mit natürlichen und in der Natur nicht vorkommenden Aminosäuren, verschiedenen Linkern und sogenannten Spacern, wobei die Spacer typischerweise aus Polyethylenglycol, PEG-Derivaten oder Polyalkanen oder Homopolyaminosäuren bestehen. Die Festphasensynthese-Methode erlaubt die Herstellung von Peptiden, die in reaktiven Funktionalitäten enden, beispielsweise freien Thiolen, für chemoselektive Kopplungsschemata an das Fasermaterial.
Eine Sequenz von Aminosäuren kann in der fertigen Peptidsequenz wiederholt werden, um die Immunreaktivität mit einem spezifischen Antikörper zu erhöhen. Die Wiederholungssequenz und reaktive Sequenz kann in einem linearen Peptid durch irrelevante Aminosäuresequenzen beabstandet werden. Die Immunreaktivität kann auch durch Synthetisieren von verzweigten oder dendritischen Peptidkonstrukten, wie der „multiple antigen peptides" (MAP; Mehrfachantigen-Peptide), verstärkt werden.
Für eine zusammenfassende Übersicht über die allgemeine Methodik, einschließlich der unterschiedlichen chemischen Schutzschemata und der festen und löslichen Träger, siehe beispielsweise G. Barany, N. Kneib-Cordonier, D.G. Mullen, Solid-phase peptide synthesis: A silver anniversary report, Int. J. Peptide Protein Res. 30, Seite 705-739 (1987), und G.B. Fields, R.L. Noble, Solid phase peptide Synthesis utilizing 9-fluorenylmethoxycarbonyl amino acids, Int. J. Peptide Protein Res. 35, Seite 161-214 (1990).
Andere Methoden zum Gewinnen von Peptiden umfassen enzymatische Fragmentligation, Techniken der gentechnologischen Modifizierung, wie beispielsweise ortsgerichtete Mutagenese. Die gentechnologische Modifizierung von Oligonukleotiden, PCR-Produkten oder klonierten Fragmenten von DNA-Material, welches eine relevante Aminosäuresequenz kodiert, unter Verwendung von Standard-DNA-Klonierungstechniken ist ein gut etabliertes Verfahren zur Gewinnung von Polypeptiden gewesen. Alternativ können die Peptide nach Isolierung aus natürlichen Quellen erhalten werden, wie durch Proteinreinigung und Verdau.
Eine Konjugation des Zielmoleküls (beispielsweise eines Peptids) kann erzielt werden, indem kovalente Bindungen ausgebildet werden oder starke Bindungspaare, beispielsweise Ionenbindung, Biotin-Avidin, verwendet werden. Beispiele von anderen Bindungseinheiten als Streptavidin, Avidin und Derivaten und Biotin und Biotin-Analoga sind die Leucin-Zipper-Domäne von AP-1 (Jun und fos), hexa-his (Metallchelat-Einheit), hexa-hat GST (Glutathion-S-transferase) Glutathion-Affinität, dreiwertiges Vancomycin, D-Ala-D-Ala, Lectine, die an verschiedene Verbindungen, einschließlich Kohlenhydrate, Lipide und Proteine, binden, beispielsweise ConA (Canavalia ensiformis) und WGA (Weizenkeim-Agglutinin) und Tetranectin oder Protein A oder G. Diese und andere Methoden sind einem jeden Fachmann auf dem Gebiet der Konjugation wohlbekannt.
Eine kovalente Konjugation verleiht mehrere Vorteile, einschließlich erhöhter Widerstandsfähigkeit gegen einen Abbau.
Das Kopplungsverfahren, das für eine Konjugation nützlich ist, ist von der chemischen Struktur des Ziels und der Faser, die beteiigt sind, abhängig. Typische chemische Reagenzien, die verwendet werden, sind sogenannte „zero-length crosslinker" (Nulllängen-Vernetzungsmittel), homobifunktionelle, heterobifunktionelle oder polymere Vernetzungsmittel.
Zero-length crosslinkers", wie 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDAC) oder 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)carbodiimid-metho-p-toluolsulfonat (CHMC) und andere Carbodiimide, können eine direkte Kopplung zwischen beispielsweise Glu oder Asp an Lysinreste und beispielsweise den N-Terminus eines Peptids vereinfachen.
Homobifunktionelle Vernetzungsmittel, wie Glutar(di)aldehyde, Imidate, bis-diazotierte Benzidine, Bis(imidoester), Bis(succinimidylester), Diisocyanate, Disäurechloride, Divinylsulfon oder ähnliche, erlauben, dass Amino- oder Hydroxylgruppen miteinander kovalent durch ein kurzes Linkermolekül verbunden werden. Formaldehyd oder Glutar(di)aldehyd können auch eine Vernetzung zwischen Faser und Peptid vereinfachen.
Die Verwendung von heterobifunktionellen Vernetzungsmitteln wird detaillierter für das Vernetzen von Peptiden mit einer Faser durch eine Methodik, die jedem Fachmann auf dem Gebiet der Konjugation bekannt ist, beschrieben.
Heterobifunktionelle Vernetzungsmittel haben den Vorteil, dass sie eine bessere Kontrolle über die Vernetzung ermöglichen als Methoden, die auf beispielsweise homobifunktionellen Vernetzungsmitteln beruhen.
Die üblichsten Schemata für eine Bildung eines Heterokonjugats umfassen die indirekte Kopplung einer Amingruppe an einem Biomolekül mit einer Thiolgruppe an einem zweiten Biomolekül, üblicherweise durch eine zwei- oder dreistufige Reaktionsabfolge. Die hohe Reaktivität von Thiolen und deren relative Seltenheit in vielen Biomolekülen macht Thiolgruppen zu idealen Zielen für eine kontrollierte chemische Vernetzung.
Wenn ein Thiol nicht vorhanden ist, können Thiolgruppen durch mehrere Methoden eingeführt werden. Eine übliche Methode umfasst die Verwendung von Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP), gefolgt von einer Reduktion des 3-(2-Pyridyldithio)propionyl-Konjugats mit DTT oder TCEP. Eine Reduktion setzt das Chromophor 2-Pyridinthion frei, das verwendet werden kann, um das Thiolierungsausmaß zu bestimmen.
Alternativ kann das Thiolierungsausmaß gemessen werden unter Verwendung von 5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure) (DTNB, Ellman's-Reagens), welches nach Reaktion mit einer Thiolgruppe stöchiometrisch das Chromophor 5-Mercapto-2-nitrobenzoesäure ergibt.
Heterobifunktionelle Vernetzungsmittel enthalten typischerweise eine aktivierte Carboxylgruppe an einem Ende, die mit Aminogruppen reagieren kann, und eine Maleimido- oder Iodacetamidgruppe an dem gegenüberliegenden Ende, die leicht mit der Sulfhydrylgruppe von Cysteinresten reagiert.
Zwei häufig verwendete heterobifunktionelle Vernetzungsmittel sind N-gamma-Maleimidobutyryloxysuccinimidester (GMBS) und Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carbonat (SMCC).
Es sollte sich verstehen, dass das Vernetzungsmittel eine photoaktivierte reaktive Gruppierung enthalten kann. Die photoreaktive Gruppierung wirkt wie eine maskierte reaktive Gruppe. Indem eine photoreaktive Kopplungsmethode verwendet wird, ist es möglich, das Zielmolekül in einen speziellen Abschnitt von beispielsweise der Faser zu bringen, bevor die photoreaktive Gruppe für die kovalente Kopplung verwendet wird.
Das Peptid wird typischerweise mit einem einzelnen Cysteinrest am entweder N- oder C-Terminus synthetisiert. Alternativ können die internen Cys-Reste oder Cys-Reste an einem Linker verwendet werden. Wenn das Peptid keine Thiolgruppen enthält, dann können eine oder mehrere unter Verwendung von einer von mehreren Thiolierungsmethoden eingeführt werden, typischerweise indem eine der Aminogruppen modifiziert wird.
Es sollte sich verstehen, dass das Koppeln von Zielsonden, wie beispielsweise Peptiden, nicht durch die Verwendung von selektiven Thiol-Kopplungsschemata begrenzt wird.
Andere nützliche chemische Einheiten für sowohl chemoselektive als auch zufällige Konjugationsschemata umfassen Carboxyl-, Hydroxy-, aromatische, phenolische oder Aminogruppen. Besonders Aminogruppen sind nützlich, da sie bei relevantem pH sehr reaktiv sind, starke chemische Bindungen ausbilden können und in biologischem Material, einschließlich Seidenfasern, Proteinen und Peptiden, weit verbreitet sind.
Die Möglichkeit, Konjugationsschemata einzusetzen, die die Aminogruppe an den N-Termini von Peptiden, einschließlich der Aminogruppe in der Seitenkette von Lysin oder Polylysin, verwenden, ist von besonderer Relevanz für die hier beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren.
Das Vernetzungsmittel wird zuerst mit den Aminogruppen an der Faser umgesetzt, gefolgt von einer Entfernung des nicht-umgesetzten Vernetzungsmittels unter Verwendung beispielsweise einer Dekantation oder Zentrifugation. Der aktivierte Träger wird dann mit dem Cys-enthaltenden Peptid umgesetzt. Überschüssiges Peptid wird entfernt, indem beispielsweise eine Entsalzungssäule, Dialyse oder Zentrifugation verwendet wird. Die Menge von gebundenem Peptid oder Vernetzungsmittel kann durch verschiedene direkte oder indirekte Analysenmethoden bestimmt werden.
Die Konjugationsabfolge kann umgekehrt werden, indem zuerst das heterobifunktionelle Vernetzungsmittel an das Peptid gebunden wird, bevor dieses an Thiole an der Faser gebunden wird.
Während der Konjugationsreaktion werden die freien Thiole oftmals gegen eine spontane Oxidation durch die Zugabe von EDTA, EGTA oder Tributylphosphin oder ähnlichen Reagenzien oder durch Verwendung einer Schutzatmosphäre geschützt.
Andere Verfahren zur kovalenten Vernetzung umfassen die Verwendung von homo- oder heterofunktionellen polymeren Vernetzungsmitteln. Beispiele von Reagenzien umfassen Tresyl- oder Vinylsulfon-aktivierte Dextrane oder aktivierte Polyacrylsäure-Polymere oder -Derivate. Divinyl ist für eine Aktivierung von beispielsweise Hydroxylgruppen an Fasern besonders bevorzugt, da das resultierende zweite Vinylsulfon gegenüber Thiolen hochgradig reaktiv ist.
Die Menge von gekoppeltem Peptid kann durch mehrere Methoden bestimmt werden, einschließlich des Einbaus eines beta-Alanin-Rests unmittelbar angrenzend an den Cysteinrest in dem Peptid. Dann kann eine Aminosäureanalyse verwendet werden, um die Menge von beta-Alanin, die nach Reinigung des resultierenden Konjugats vorhanden ist, zu bestimmen.
Die Vernetzungsmittel können die Möglichkeit bieten, einen Tracer oder eine detektierbare Gruppierung mit aufzunehmen. Diese Grupierung kann verwendet werden, um die an das Biomolekül gebundene Menge an Vernetzungsmittel zu messen. Der Tracer kann fluoreszierend, radioaktiv, ein Hapten oder ein jegliches anderes detektierbares Molekül sein.
POLYMERE
In bestimmten Ausführungsformen kann das Trägermedium in Form eines Einbettungsmediums vorliegen. Ein solches Einbettungsmedium kann durch Polymerisation von Monomeren hergestellt werden, wie in diesem Abschnitt detailliert beschrieben wird.
Aus polymerisierbaren Monomeren hergestellte Polymere haben weit verbreitete Anwendungen. Beispielsweise werden Polymere als Zusätze für Beschichtungsanwendungen, wie Farben, und Klebstoffe verwendet.
Polymere werden hergestellt, indem eine oder mehrere Arten von polymerisierbaren Monomeren polymerisiert werden, wie durch Emulsionspolymerisaton, Lösungspolymerisation, Suspensionspolymerisation oder Polymerisation in Masse. Das oder die Monomer(e) kann bzw. können polymerisiert werden in Gegenwart von optionalen Inhaltsstoffen, wie einem oder mehreren von Emulgatoren, Stabilisatoren, grenzflächenaktiven Mitteln, Initiatoren (wie Photoinitiatoren), Inhibitoren, Dispergiermitteln, Oxidationsmitteln, Reduktionsmitteln, Viskositätsmodifizierungsmitteln, Katalysatoren, Bindemitteln, Aktivatoren, Beschleunigern, Klebrigmachern, Weichmachern, Verseifungsmitteln, Kettentransfermitteln, Tensiden, Füllstoffen, Farbstoffen, Metallsalzen und Lösemittteln.
Es gibt zahlreiche Referenzen bezüglich der Polymerisation von polymerisierbaren Monomeren. Beispielsweise können einige Lehren gefunden werden in „Emulsion Polymerization: Theory and Practice", von D.C. Blackley (veröffentlicht von Wiley in 1975) und „Emulsion Polymerization" von F.A. Bovey et al. (veröffentlicht von Interscience Publishers in 1965). Ein Polymer kann beispielsweise aus Monomeren, wie Methylacrylat, Ethylacrylat, Butylacrylat, 2-Ethylhexylacrylat, Decylacrylat, Methylmethacrylat, Ethylmethacrylat, Butylmethacrylat, Styrol, Butadien, Ethylen, Vinylacetat, Vinylestern, tertiären C₉-, C₁₀- und C₁₁-Monocarbonsäuren, Vinylchlorid, Vinylpyridin, Vinylpyrrolidin, Vinylidenchlorid, Acrylnitril, Chloropren, Acrylsäure, Methacrylsäure, Itaconsäure, Maleinsäure und Fumarsäure, hergestellt werden.
Beispiele für weitere Lehren betreffend die Polymerisation von polymerisierbaren Monomeren können gefunden werden in „Vinyl and Related Polymers" von C.E. Schildknecht (New York: John Wiley & Sons 1952) und „Monomeric Acrylic Esters" von E.H. Riddle (New York: Reinhold Publishing Corp. 1954) und von A.G. Alexander (J Oil Colour Chemists' Association [1962] 45 12) und G.G. Greth und J.E. Wilson (J Appl Polymer Sci [1961] 5 135).
Neuere Lehren, die Polymerisationsmethoden betreffen, können gefunden werden in EP-A-0622378, EP-A-0634428, EP-A-0623632, EP-A-0635522, EP-A-0633273, EP-A-0632157, EP-A-0630908, EP-A-0630641, EP-A-0628614, EP-A-0628610, EP-A-0622449, EP-A-0626430 und EP-A-0625529.
Mit dem Begriff „Vernetzungsmittel" meinen wir eine Verbindung, die den Vernetzungsgrad eines Monomers während der Polymerisation verglichen mit der Polymerisation des Monomers in Abwesenheit des Vernetzungsmittels erhöht.
Die Monomere können in Form einer polymerisierbaren Zusammensetzung bereitgestellt werden. Die polymerisierbare Zusammensetzung kann auch herkömmliche zusätzliche Bestandteile oder Komponenten umfassen, wie jegliches oder mehrere von Emulgatoren, Stabilisatoren, grenzflächenaktiven Mitteln, Initiatoren (wie Photoinitiatoren), Inhibitoren, Dispergiermitteln, Oxidationsmitteln, Reduktionsmitteln, Viskositätsmodifizierungsmitteln, Katalysatoren, Bindemitteln, Aktivatoren, Beschleunigern, Klebrigmachern, Weichmachern, Verseifungsmitteln, Kettentransfermitteln, Vernetzungsmitteln, Tensiden, Füllstoffen, Farbstoffen, Metallsalzen und Lösemittteln.
Als Beispiel können die Tenside und Dispergiermittel Salze von fettem Kolophonium („fatty rosin") und Naphthensäuren, Kondensationsprodukte von Naphthalinsulfonsäure und Formaldehyd mit niedrigem Molekulargewicht, carboxylische Polymere und Copolymere mit dem geeigneten Hydrophile-Lipophile-Gleichgewicht, höhere Alkylsulfate, wie Natriumlaurylsulfat, Alkylarylsulfonate, wie Dodecylbenzolsulfonat, Natrium- oder Kaliumisopropylbenzolsulfonate oder Isopropylnaphthalinsulfonate; Sulfosuccinate, wie Natriumdioctylsulfosuccinat, Alkalimetall-höheres Alkylsulfosuccinate, beispielsweise Natriumoctylsulfosuccinat, Natrium-N-methyl-N-palmitoyltaurat, Natriumoleylisethionat, Alkalimetallsalze von Alkylarylpolyethoxyethanolsulfaten oder -sulfonaten, beispielsweise Natrium-tert.-octylphenoxypolyethoxyethylsulfat mit 1 bis 5 Oxyethyleneinheiten, sein. Typische Polymerisationsinhibitoren, die verwendet werden können, umfassen Hydrochinon, Monomethylether, Benzochinon, Phenothiazin und Methylenblau.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Farbstoff ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 2-Hydroxybenzophenon, Oxidiazolen, Salicylsäure, Resorcinolmonobenzoat, Benzotriazol, vorzugsweise 2H-Benzotriazol, Benzothiazoloazin, vorzugsweise 2N-Benzothiazoloazin, α-Cyano-β-phenylzimtsäure, Polyalkylpiperidin und Derivaten davon.
Der Farbstoff wird vorzugsweise aus Benzotriazol, insbesondere 2H-Benzotriazol und Derivaten davon ausgewählt.
Die Zusammensetzung kann ein oder mehrere zusätzliche Comonomere umfassen. Beispiele des einen oder der mehreren zusätzlichen Comonomere, die verwendet werden können, umfassen eines von: (Alkyl- und Cycloalkyl-)acrylaten; (Alkyl- und Cycloalkyl-)methacrylaten; radikalisch polymerisierbaren olefinischen Säuren, einschließlich Alkoxy-, Alkylphenoxy-, Alkylphenoxy(polyethylenoxid)-, Vinylester-, Amin-substituierte (einschließlich quartäre Ammoniumsalze davon), Nitril-, Halogen-, Hydroxy- und Säure-substituierten (beispielsweise Phospho- oder Sulfo-) Derivaten davon; und anderen geeigneten ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Gruppierungen, einschließlich Kombination davon. Die Alkyl- und Cycloalkylgruppen enthalten vorzugsweise bis zu 20 Kohlenstoffatome, beispielsweise (C₁-C₂₀-Alkyl- und C₁-C₂₀-Cycloalkyl)acrylate und (C₁-C₂₀-Alkyl- und C₁-C₂₀-Cycloalkyl)methacrylate. Detaillierter umfassen typische Comonomere ein jegliches von Methylacrylat, Ethylacrylat, n-Propylacrylat, Isopropylacrylat, n-Butylacrylat, Isobutylacrylat, tert.-Butylacrylat, Isobornylacrylat, Pentylacrylat, Hexylacrylat, Octylacrylat, Isooctylacrylat, Nonylacrylat, Laurylacrylat, Stearylacrylat, Eicosylacrylat, 2-Ethylhexylacrylat, Cyclohexylacrylat, Cycloheptylacrylat, Methylmethacrylat, Ethylmethacrylat, Hydroxymethylacrylat, Hydroxymethylmethacrylat, Propylmethacrylat, n-Butylmethacrylat, tert.-Butylmethacrylat, Isobutylmethacrylat, Pentylmethacrylat, Hexylmethacrylat, Cyclohexalmethacrylat, 2-Ethylhexylmethacrylat, Isobornylmethacrylat, Heptylmethacrylat, Cycloheptylmethacrylat, Octylmethacrylat, Isooctylmethacrylat, Nonylmethacrylat, Decylmethacrylat, Laurylmethacrylat, Eicosylmethacrylat, Dodecylacrylat, Pentadecylacrylat, Cetylacrylat, Stearylacrylat, Eicosylacrylat, Isodecylacrylat, Vinylstearat, Nonylphenoxy(ethylenoxid)_1-20-acrylat, Octadecen, Hexadecen, Tetradecen, Dodecen, Dodecylmethacrylat, Pentadecylmethacrylat, Cetylmethacrylat, Stearylmethacrylat, Eicosylmethacrylat, Isodecylmethacrylat, Nonylphenoxy(ethylenoxid)_1-20-methacrylat, Acrylsäure, Methacrylsäure, Fumarsäure, Crotonsäure, Itaconsäure, Fumarsäureanhydrid, Crotonsäureanhydrid, Itaconsäureanhydrid, Maleinsäure, Maleinsäureanhydrid, Styrol, alpha-Methylstyrol, Vinyltoluol, Acrylnitril, Methacrylnitril, Ethylen, Vinylacetat, Vinylchlorid, Vinylidenchlorid, Acrylamid, Methacrylamid, Methacrylamid-2-cyanethylacrylat, 2-Cyanethylmethacrylat, Dimethylaminoethylmethacrylat, Dimethylaminopropylmethacrylat, tert.-Butylaminoethylmethacrylat, Glycidylacrylat, Glycidylmethacrylat, Glycerylacrylat, Glycerylmethacrylat, Benzylacrylat, Benzylmethacrylat, Phenylacrylat, Phenylmethacrylat, Vinylpyridin, Vinylpyrrolidin, Siloxane, Silane und Mischungen davon. Andere polymerisierbare Monomere werden in US-A-2879178, US-A-3037006, US-A-3502627, US-A-3037969 und US-A-3497485 offenbart.
Bevorzugte Comonomere umfassen ein jegliches von Glycerylmethacrylat (GMA), (2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-yl)methylmethacrylat (GMAK), Hydroxyethylmethacrylat (HEMA), Methacrylsäure, Acrylsäure, GYMA, N-Vinylpyrrolidon, Alkylmethacrylaten (wie C_1-20-Alkylmethacrylaten, mehr bevorzugt C_1-15-Alkylmethacrylaten, mehr bevorzugt C_1-10-Alkylmethacrylaten, mehr bevorzugt C_1-5-Alkylmethacrylaten, wie Methylmethacrylat), Alkylacrylaten (wie C_1-20-Alkylacrylaten, mehr bevorzugt C_1-15-Alkylacrylaten, mehr bevorzugt C_1-10-Alkylacrylaten, mehr bevorzugt C_1-5-Alkylacrylaten, wie Methylacrylat), Arylmethacrylaten, Arylacrylaten, Diacetonacrylamid, Acrylamid, Methacrylamid, N-Alkylacrylamiden (wie C_1-20-N-Alkylacrylamiden, mehr bevorzugt C_1-15-N-Alkylacrylamiden, mehr bevorzugt C_1-10-N-Alkylacrylamiden, mehr bevorzugt C_1-5-N-Alkylacrylamiden, wie Methylacrylamid), N-Alkylmethacrylamiden (wie C_1-20-N-Alkylmethacrylamiden, mehr bevorzugt C_1-15-N-Alkylmethacrylamiden, mehr bevorzugt C_1-10-N-Alkylmethacrylamiden, mehr bevorzugt C_1-5-N-Alkylmethacrylamiden, wie Methylmethacrylamid), Vinylacetat, Vinylestern, Styrol, anderen substituierten Olefinen, N-Dialkylacrylamiden (wie C_1-20-N-Dialkylacrylamiden, mehr bevorzugt C_1-15-N-Dialkylacrylamiden, mehr bevorzugt C_1-10-N-Dialkylacrylamiden, mehr bevorzugt C_1-5-N-Dialkylacrylamiden, wie N,N-Dimethylacrylamid), N-Dialkylmethacrylamiden (wie C_1-20-N-Dialkylmethacrylamiden, mehr bevorzugt C_1-15-N-Dialkylmethacrylamiden, mehr bevorzugt C_1-10-N-Dialkylmethacrylamiden, mehr bevorzugt C_1-5-N-Dialkylmethacrylamiden, wie N,N-Dimethylmethacrylamid), 3-Methacryloxypropyltris(trimethylsilylsiloxy)silan (TRIS-Monomer), fluorsubstituierte Alkyl- und Arylacrylate und -methacrylate (in welchen das Alkyl vorzugsweise C_1-20-Alkyl, mehr bevorzugt C_1-15-Alkyl, mehr bevorzugt C_1-10-Alkyl, mehr bevorzugt C_1-5-Alkyl ist) und Kombinationen davon.
Mehr bevorzugte Comonomere umfassen jegliche von Glycerylmethacrylat (GMA), (2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-yl)methylmethacrylat (GMAK), 2-Hydroxyethylmethacrylat (2-HEMA), Methacrylsäure, Acrylsäure und Glycidylmethacrylat oder Kombinationen davon.
Die Listen von Comonomeren umfassen auch substituierte Derivate von jenen Monomeren, wie halogenierte Monomere, speziell fluorierte Monomerderivate, und Acetal- und Ketalderivate.
Das polymerisierbare Monomer der Zusammensetzung und das eine oder die mehreren zusätzlichen Comonomere können so ausgewählt werden, dass die Zusammensetzung im Wesentlichen aus GMA und HEMA besteht.
Es kann ein jegliches typisches, geeignetes Polymerisationsverfahren verwendet werden. Das bevorzugte Verfahren ist eine radikalische Polymerisation, thermisch oder UV-initiiert.
WEITERE ASPEKTE
Weitere Aspekte und Ausführungsformen der Erfindung werden jetzt in den folgenden nummerierten Paragraphen erläutert; es versteht sich, dass die Erfindung diese Aspekte umfasst:
Paragraph 1. Ein Referenzstandard für eine detektierbare Einheit, wobei der Referenzstandard umfasst: (a) ein Trägermedium; und (b) eine Menge einer detektiebaren Einheit, die von dem Trägermedium getragen wird; wobei die detektierbare Einheit einen länglichen Pfad beschreibt; wobei eine detektierbare Menge der detektierbaren Einheit in einem definierten Bereich in einem Querschnitt des Referenzstandards vorliegt.
Paragraph 2. Ein Referenzstandard nach Paragraph 1, in welchem der definierte Bereich in wenigstens einem anderen Querschnitt des Referenzstandards vorliegt, welcher vorzugsweise eine ähnliche Menge von detektierbarer Einheit umfasst.
Paragraph 3. Ein Referenzstandard nach Paragraph 1 oder 2, in welchem die detektierbare Einheit eine im Wesentlichen gleichförmige Verteilung entlang des länglichen Pfads aufweist.
Paragraph 4. Ein Referenzstandard nach Paragraph 1, 2 oder 3, in welchem das Trägermedium ein Einbettungsmedium, in welches die detektierbare Einheit eingebettet ist, umfasst.
Paragraph 5. Ein Referenzstandard nach einem der vorangegangenen Paragraphen, in welchem die detektierbare Einheit im Wesentlichen frei von zellulärem Material ist.
Paragraph 6. Ein Referenzstandard nach einem der vorangegangenen Paragraphen, in welchem die detektierbare Einheit ein diagnostisch relevantes Ziel umfasst.
Paragraph 7. Ein Referenzstandard nach einem der vorangegangenen Paragraphen, in welchem die detektierbare Einheit ein Antigen, ein Epitop, ein Peptid, ein Polypeptid, ein Protein, eine Nukleinsäure oder zwei oder mehrere oder eine Mehrzahl von jeglichen der obigen oder Kombinationen von einem oder mehreren der obigen umfasst.
Paragraph 8. Ein Referenzstandard nach einem der vorangegangenen Paragraphen, in welchem das Vorliegen und/oder die Menge der detektierbaren Einheit durch ein Bindemittel, vorzugsweise ein markiertes Bindemittel aufdeckbar oder nachweisbar ist.
Paragraph 9. Ein Referenzstandard nach Paragraph 8, in welchem das Bindemittel ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus: einem Antikörper, vorzugsweise einem Antikörper, der spezifisch an die detektierbare Einheit binden kann, einer Nukleinsäure, wie einer DNA oder einer RNA, vorzugsweise einer Nukleinsäure, die spezifisch an die detektierbare Einheit binden kann, einer Proteinnukleinsäure (PNA), einem Farbstoff, einem speziellen Färbemittel, Hämatoxylin-Eosin (N & E), Gomori-Methenaminsilber-Färbemittel (GMS), Periodic Acid-Schift (PAS; Periodsäure-Schiff)-Färbemittel, Trichromblau (Trichrome Blue), Massons Trichrome, Preußischblau, Giemsa, Diff-Quik, Reticulum, Kongo-Rot (Congo Red), Alcian-Blau (Alcian Blue), Steiner, AFB, PAP, Gram, Mucikarmin, Verhoeff-van Gieson, Elastic, Carbol-Fuchsin und Golgi-Färbemitteln.
Paragraph 10. Ein Referenzstandard nach einem der vorangegangenen Paragraphen, in welchem das Vorliegen der detektierbare Einheit in einer Zelle, einem Gewebe, Organ oder Organismus eine Erkrankung oder einen Zustand anzeigt.
Paragraph 11. Ein Referenzstandard nach einem der vorangegangenen Paragraphen, in welchem die detektierbare Einheit in allen quer verlaufenden ebenen Schnitten des Referenzstandards in im Wesentlichen dem gleichen Bereich, der gleichen Menge oder Konzentration vorliegt.
Paragraph 12. Ein Referenzstandard nach einem der vorangegangenen Paragraphen, in welchem der definierte Bereich einen Referenzbereich umfasst, wobei der Referenzbereich die detektierbare Einheit in einer vorab definierten Menge umfasst.
Paragraph 13. Ein Referenzstandard nach Paragraph 11, in welchem die Menge der detektierbaren Einheit in dem Referenzbereich mit der Menge der detektierbaren Einheit in einer Probe verglichen wird, um das Vorliegen, die Menge oder Konzentration der detektierbaren Einheit in der Probe zu bestimmen.
Paragraph 14. Ein Referenzstandard nach einem der vorangegangenen Paragraphen, in welchem der Referenzstandard in der Form eines rechteckigen Kastens vorliegt und die detektierbare Einheit in der Form einer im Wesentlichen linearen Stange, die entlang oder im Wesentlichen parallel zu einer Längsachse der Referenzstandards angeordnet ist, vorliegt.
Paragraph 15. Ein Referenzstandard nach einem der vorangegangenen Paragraphen, in welchem die detektierbare Einheit an eine längliche Faser angeheftet, vorzugsweise mit dieser chemisch gekoppelt ist.
Paragraph 16. Ein Referenzstandard für eine detektierbare Einheit, umfassend: (a) ein Einbettungsmedium in Form eines im Wesentlichen rechteckigen Kastens; und (b) eine längliche Faser mit einer Menge einer daran gekoppelten detektierbaren Einheit; wobei die längliche Faser der Länge nach in das Einbettungsmedium eingebettet ist.
Paragraph 17. Ein Referenzstandard nach Paragraph 14 oder 15, wobei die Faser ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus: einer Polyamidfaser, einer Cellulosefaser, einer Polycarbamatfaser, einer Seidenfaser, einer Polyesterfaser, einer Nylonfaser, einer Rayonfaser und Gemischen davon.
Paragraph 18. Ein Referenzstandard nach Paragraph 14, 15 oder 16, in welchem die detektierbare Einheit sowohl an Kern- als auch Oberflächenabschnitten der Faser im Wesentlichen gleichförmig vorliegt.
Paragraph 19. Ein Referenzstandard nach Paragraph 14, 15 oder 16, in welchem die detektierbare Einheit an Oberflächenabschnitten der Faser in einer größeren Menge als an Kernabschnitten vorliegt.
Paragraph 20. Ein Referenzstandard nach einem der Paragraphen 14, 15 oder 16, in welchem Kernabschnitte der Faser im Wesentlichen keine detektierbare Einheit umfassen.
Paragraph 21. Ein Referenzstandard nach einem der Paragraphen 1 bis 13, in welchem die detektierbare Einheit in einem länglichen Kanal in dem Einbettungsmedium gebildet wird.
Paragraph 22. Ein Referenzstandard nach einem der Paragraphen 14 bis 21, in welchem die Faser oder der Kanal entlang im Wesentlichen seiner gesamten Länge eine gleichförmige Querschnittsfläche aufweist.
Paragraph 23. Ein Referenzstandard nach einem der Paragraphen 14 bis 22, in welchem die Faser oder der Kanal einen Durchmesser zwischen ungefähr 0,5 μm und 100 μm, vorzugsweise zwischen 2 μm und 20 μm aufweist.
Paragraph 24. Ein Referenzstandard nach einem der vorangegangenen Paragraphen, welcher zwei oder mehrere lineare Fasern oder Kanäle in im Wesentlichen paralleler Orientierung, vorzugsweise in einem Bündel, umfasst.
Paragraph 25. Ein Referenzstandard nach einem der vorangegangenen Paragraphen, welcher zwei oder mehrere unterschiedliche detektierbare Einheiten umfasst, von denen jede in oder auf einer individuellen Faser oder in oder an einem individuellen Kanal angeordnet ist.
Paragraph 26. Ein Referenzstandard nach einem der vorangegangenen Paragraphen, welcher zwei oder mehrere Fasern oder Kanäle umfasst, die jeweils die gleiche detektierbare Einheit umfassen.
Paragraph 27. Ein Referenzstandard nach einem der vorangegangenen Paragraphen, welcher zwei oder mehrere Fasern oder Kanäle umfasst, die unterschiedliche Mengen von detektierbarer Einheit an jeder bzw. jedem umfassen.
Paragraph 28. Ein Referenzstandard nach einem der vorangegangen Paragraphen, in welchem ein ebener Schnitt des Referenzstandards eine Mehrzahl von Flächen, auf welchen die detektierbare Einheit in unterschiedlicher Dichte präsentiert wird, umfasst.
Paragraph 29. Ein Referenzstandard nach einem der vorangegangenen Paragraphen, in welchem ein ebener Schnitt des Referenzstandards eine erste Fläche, welche die detektierbare Einheit im Wesentlichen in einer diagnostisch signifikanten Dichte umfasst, umfasst.
Paragraph 30. Ein Referenzstandard nach einem der vorangegangen Paragraphen, welcher des Weiteren eine Kontrolle umfasst, welche eine Faser oder einen Kanal, die bzw. der im Wesentlichen keine detektierbare Einheit umfasst, umfasst.
Paragraph 31. Ein Referenzstandard nach einem der vorangegangenen Paragraphen, in welchem die detektierbare Einheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: einem Hapten, einem biologisch aktiven Molekül, einem Antigen, einem Epitop, einem Protein, einem Polypeptid, einem Peptid, einem Antikörper, einer Nukleinsäure, einem Virus, einem virusartigen Partikel, einem Nukleotid, einem Ribonukleotid, einem Desoxyribonukleotid, einem modifizierten Desoxyribonukleotid, einem Heteroduplex, einem Nanopartikel, einem synthetischen Analogen eines Nukleotids, einem synthetischen Analogen eines Ribonukleotids, einem modifizierten Nukleotid, einem modifizierten Ribonukleotid, einer Aminosäure, einem Aminosäureanalogen, einer modifizierten Aminosäure, einem modifizierten Aminosäureanalogen, einem Steroid, einem Proteoglycan, einem Lipid, einem Kohlenhydrat, einem Farbstoff und Gemischen, Fusionen, Kombinationen oder Konjugaten der obigen.
Paragraph 32. Ein Referenzstandard nach einem der vorangegangenen Paragraphen, in welchem die detektierbare Einheit irgendeines oder mehrere von HER2-, ER-, PR-, p16-, Ki-67- und EGFR-Protein und diese kodierende Nukleinsäuren umfasst.
Paragraph 33. Ein Referenzstandard nach einem der vorangegangen Paragraphen, in welchem das Einbettungsmedium ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus: Eis, Wachs, Paraffin, Acrylharz, Methacrylatharz, Epoxid, Epon, Araldit, Lowicryl, K4M und LR-Weiß (LR White) und Durcupan.
Paragraph 34. Ein Referenzstandard für eine detektierbare Einheit, umfassend ein umgebendes Medium zusammen mit einer Menge einer detektierbare Einheit, die in dem umgebenden Medium in einer definierten Menge lokalisiert ist, wobei die detektierbare Einheit in einer im Allgemeinen der Länge nach verlaufenden Konfiguration in dem umgebenden Medium angeordnet ist.
Paragraph 35. Eine Menge eines detektierbaren Mittels, die in einem definierten Volumen in einer Matrix angeordnet ist, wobei das Mittel im Wesentlichen frei von zellulären Materialien ist, derart, dass ein ebener Schnitt der Matrix das detektierbare Mittel in einer vorab festgelegten Menge aufweist.
Paragraph 36. Ein Kit, umfassend einen Referenzstandard nach einem der vorangegangenen Paragraphen zusammen mit einem Bindemittel, welches zu einer spezifischen Bindung an die detektierbare Einheit in der Lage ist, gegebenenfalls zusammen mit Anweisungen für eine Verwendung.
Paragraph 37. Ein ebener Schnitt, vorzugsweise ein ebener Querschnitt, vorzugsweise von im Wesentlichen gleichförmiger Dicke, eines Referenzstandards nach einem der vorangegangenen Paragraphen.
Paragraph 38. Ein Träger, vorzugsweise ein Objektträger, wie ein Mikroskop-Objektträger, umfassend einen darauf aufgelegten oder aufgebrachten ebenen Schnitt nach Paragraph 37.
Paragraph 39. Ein Referenzstandard, Kit oder ebener Schnitt nach einem der vorangegangenen Paragraphen, in welchem der Referenzstandard gefärbt worden ist, vorzugsweise mit einem Antikörper oder einer Nukleinsäuresonde.
Paragraph 40. Ein diagnostischer Kit für das Detektieren des Vorliegens oder einer Menge einer detektierbaren Einheit in einer biologischen Probe, umfassend: (a) einen Referenzstandard, ebenen Schnitt oder Objektträger nach einem der vorangegangenen Paragraphen; (b) ein Bindemittel, welches zu einer spezifischen Bindung an die detektierbare Einheit in der Lage ist; und gegebenenfalls (c) Anweisungen für eine Verwendung.
Paragraph 41. Eine Kombination eines Referenzstandards, ebenen Schnitts, Objektträgers oder diagnostischen Kits nach einem der Paragraphen 1 bis 40 zusammen mit einem therapeutischen Mittel, welches in der Lage ist, wenigstens eines der Symptome einer Erkrankung oder eines Zustands in einem Individuum zu behandeln oder zu lindern.
Paragraph 42. Eine Kombination nach Paragraph 41, wobei bei dem Invididuum diagnostiziert wird, dass es unter der Erkrankung oder dem Zustand leidet oder für diese empfindlich ist, wenn die Menge von detektierbarer Einheit in der biologischen Probe oder Komponente ähnlich jener oder größer als jene in dem Referenzstandard ist.
Paragraph 43: Ein diagnostischer Kit nach Paragraph 40 oder eine Kombination nach Paragraph 41 oder 42, wobei das Bindemittel oder therapeutische Mittel einen Antikörper gegen die detektierbare Einheit umfasst.
Paragraph 44. Verwendung eines Referenzstandards, eines ebenen Schnitts oder eines Kits nach einem der vorangegangen Paragraphen zum Bestimmen des Vorliegens oder der Menge einer detektierbaren Einheit in einer biologischen Probe.
Paragraph 45. Ein Verfahren zum Vergleichen der Menge einer detektierbaren Einheit in einer biologischen Probe mit einem Referenzstandard, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Bereitstellen einer biologischen Probe und Erhalten eines ersten Signals, welches die Menge von detektierbarer Einheit in der biologischen Probe oder einer Komponente davon anzeigt; (b) Bereitstellen eines Referenzstandards, eines ebenen Schnitts oder eines Kits nach einem der Paragraphen 1 bis 39; (c) Erhalten eines zweiten Referenzsignals, welches die Menge von detektierbarer Einheit in dem Referenzstandard oder ebenen Schnitt davon anzeigt; und (d) Vergleichen des in (a) erhaltenen ersten Signals mit dem Referenzsignal.
Paragraph 46. Ein Verfahren nach Paragraph 45, in welchem das detektierbare Signal aus der Gruppe bestehend aus: Strahlung, optischer Dichte, Reflexion, Radioaktivität, Fluoreszenz, enzymatischer Aktivität ausgewählt wird.
Paragraph 47. Ein Verfahren nach Paragraph 45 oder 46, in welchem der Referenzstandard oder der ebene Schnitt davon dem gleichen einen oder den gleichen mehreren Schritten oder Zuständen, vorzugsweise allen, wie die biologische Probe unterworfen wird.
Paragraph 48. Ein Verfahren nach Paragraph 45, 46 oder 47, in welchem der Referenzstandard oder der ebene Schnitt davon durch einen oder mehrere, vorzugsweise alle der folgenden Schritte verarbeitet wird: Auflegen oder Aufbringen auf einen Objektträger, Backen, Entparaffinieren, Rehydratisieren, Antigengewinnung (Antigen-Retrieval), Blockieren, Aussetzen an oder gegenüber Antikörper, Aussetzen an oder gegenüber primären Antikörper, Aussetzen an oder gegenüber Nukleinsäuresonde, Waschen, Aussetzen an oder gegenüber sekundärem Antikörper-Enzym-Konjugat, Exposition an oder gegenüber Enzymsubstrat, Aussetzen an oder gegenüber Chromogensubstrat und Gegenfärbung.
Paragraph 49. Ein Verfahren oder eine Verwendung nach den Paragraphen 45 bis 48, wobei die biologische Probe eine Zelle, ein Gewebe oder Organ, vorzugsweise eine Zelle, ein Gewebe oder Organ eines Organismus, von welchem vermutet wird, dass er unter einer Erkankung oder einem Zustand leidet, umfasst.
Paragraph 50. Ein Verfahren zur Diagnose einer Erkrankung oder eines Zustands in einem Individuum, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Erhalten einer biologischen Probe von einem Individuum; und (b) Vergleichen der Menge einer detektierbaren Einheit in einer biologischen Probe oder Komponente davon mit einem Referenzstandard in einem Verfahren nach Paragraph 43; wobei bei dem Individuum diagnostiziert wird, dass es unter der Erkrankung oder dem Zustand leidet oder dafür empfindlich ist, wenn die Menge an detektierbarer Einheit in der biologischen Probe oder Komponente ähnlich jener oder größer als jene in dem Referenzstandard ist.
Paragraph 51. Ein Verfahren zur Behandlung einer Erkrankung oder eines Zustands in einem Individuum, wobei das Verfahren die Schritte umfasst, die Erkrankung oder den Zustand in einem Individuum in einem Verfahren nach Paragraph 50 zu diagnostizieren und ein therapeutisches Mittel an das Individuum zu verabreichen.
Paragraph 52. Ein Behandlungsverfahren nach Paragraph 51, in welchem das therapeutische Mittel einen Antikörper, der zu einem Binden an die detektierbare Einheit in der Lage ist, umfasst. Paragraph 53. Ein Verfahren zur Herstellung eines Referenzstandards für eine detektierbare Einheit, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) ein Trägermedium bereitzustellen; und (b) eine Menge von detektierbarer Einheit darin in einem länglichen Pfad einzubringen.
Paragraph 54. Ein Verfahren nach Paragraph 53, welches des Weiteren umfasst, eine Menge einer zweiten detektierbaren Einheit in den länglichen Pfad oder in einen zweiten länglichen Pfad einzubringen.
Paragraph 55. Ein Verfahren nach Paragraph 53 oder 54, welches des Weiteren umfasst, eine zweite unterschiedliche Menge der oder jeder detektierbaren Einheit in den länglichen Pfad oder in einen zweiten oder weiteren länglichen Pfad einzubringen.
Paragraph 56. Ein Verfahren nach Paragraph 53, 54 oder 55, in welchem das Trägermedium ein Einbettungsmedium umfasst und die oder jede detektierbare Einheit eingebracht wird, indem sie in das Einbettungsmedium eingebettet wird.
Paragraph 57. Ein Verfahren nach einem der Paragraphen 53 bis 56, welches des Weiteren einen oder mehrere Schritte umfasst, die ausgewählt werden aus den folgenden: (a) Bilden einer Menge einer zweiten detektierbaren Einheit in einem im Wesentlichen länglichen Pfad und Einbetten der zweiten detektierbaren Einheit in das Einbettungsmedium; und (b) Bilden einer zweiten unterschiedlichen Menge der detektierbaren Einheit in einem im Wesentlichen länglichen Pfad und Einbetten der zweiten Menge von detektierbarer Einheit in das Einbettungsmedium.
Paragraph 58. Ein Verfahren nach einem der Paragraphen 53 bis 57, in welchem der längliche Pfad des oder jeder detektierbaren Einheit durch Anheften, vorzugsweise kovalentes Koppeln der oder jeder detektierbaren Einheit an eine längliche Faser definiert wird.
Paragraph 59. Ein Verfahren nach Paragraph 58, in welchem man die oder jede detektierbare Einheit sich an Oberflächenabschnitte, aber nicht substantiell an Kernabschnitte der Faser anheften lässt.
Paragraph 60. Ein Verfahren nach Paragraph 58 oder 59, in welchem man die Faser vor oder während der Anheftung der detektierbaren Einheit zumindest teilweise quellen lässt, so dass die oder jede detektierbare Einheit in der Lage ist, zu Kernabschnitten der Faser Zugang zu erlangen und an diese kovalent gekoppelt zu werden.
Paragraph 61. Verfahren nach Paragraph 58, 59 oder 60, in welchem die oder jede detektierbare Einheit an die Faser angeheftet wird, indem sie kovalent an Polymerketten, die an die Oberfläche der Faser angeheftet sind, gekoppelt wird.
Paragraph 62. Ein Verfahren zum Herstellen eines Referenzstandards für eine detektierbare Einheit, wobei das Verfahren die Schritte umfasst, eine längliche Faser bereitzustellen, eine Menge einer detektierbaren Einheit an die Faser anzuheften oder kovalent daran zu koppeln und die Faser in einer der Länge nach verlaufenden Orientierung in ein Einbettungsmedium einzubetten.
Paragraph 63. Ein Verfahren nach einem der Paragraphen 58 bis 62, in welchem die Faser ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus: einer Polyamidfaser, einer Cellulosefaser, einer Polycarbamatfaser, einer Seidenfaser, einer Polyesterfaser; einer Nylonfaser, einer Rayonfaser und Gemischen davon.
Paragraph 64. Ein Verfahren nach einem der Paragraphen 53 bis 57, in welchem der längliche Pfad der oder jeder detektierbaren Einheit in Schritt (b) definiert wird, indem ein Kanal in dem Einbettungsmedium gebildet und der Kanal mit detektierbarer Einheit gefüllt wird.
Paragraph 65. Ein Verfahren nach Paragraph 64, in welchem detektierbare Einheit in flüssiger Form, vorzugsweise in einer Lösung von Agarose oder Agar, in den Kanal injiziert wird und man diese sich verfestigen lässt.
Paragraph 66. Ein Verfahren nach einem der Paragraphen 53 bis 55, in welchem das Einbettungsmedium ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus: Eis, Wachs, Paraffin, Acrylharz, Methacrylatharz, Epoxid, Epon, Araldit, Lowicryl, K4M und LR-Weiß (LR White) und Durcupan.
Paragraph 67. Ein Referenzstandard für eine detektierbare Einheit, wobei der Referenzstandard umfasst: (a) ein Trägermedium; und (b) eine Menge einer detektierbaren Einheit, die von dem Trägermedium getragen wird; wobei die detektierbare Einheit einen länglichen Pfad beschreibt.
Paragraph 68. Ein Referenzstandard nach Paragraph 67, wobei eine detektierbare Menge der detektierbaren Einheit in einem definierten Bereich in einem Querschnitt des Referenzstandards vorliegt.
Paragraph 69. Ein Referenzstandard nach einem der Paragraphen 2 bis 33, 67 oder 68, wobei die detektierbare Menge der detektierbaren Einheit in wenigstens zwei der Querschnitten ähnlich ist.
Paragraph 70. Ein Referenzstandard nach einem der Paragraphen 2 bis 33, 67, 68 oder 69, wobei die detektierbare Menge der detektierbaren Einheit in jedem Querschnitt ähnlich ist.
Paragraph 71. Ein Referenzstandard für eine detektierbare Einheit, umfassend: (a) ein Einbettungsmedium; (b) eine Menge einer detektierbaren Einheit, die darin in einem im Allgemeinen länglichen Pfad angeordnet ist.
Paragraph 72. Ein Referenzstandard nach Paragraph 71, wobei die detektierbare Einheit in einem definierten Bereich, einer definierten Menge oder Konzentration in einem Querschnitt vorliegt.
Paragraph 73. Ein Verfahren zur Herstellung eines Referenzstandards für eine detektierbare Einheit, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Bereitstellen eines Einbettungsmediums; (b) Bilden einer Menge von detektierbarer Einheit in einem im Allgemeinen länglichen Pfad; und (c) Einbetten der detektierbaren Einheit in das Einbettungsmedium.
Paragraph 74. Ein Referenzstandard für eine detektierbare Einheit, wobei der Referenzstandard umfasst: (a) ein Trägermedium; und (b) eine Menge einer detektierbaren Einheit, die durch das Trägermedium getragen wird; wobei die detektierbare Einheit nicht-zelluläre Komponenten und/oder nichtzelluläres Material umfasst.
Paragraph 75. Ein Referenzstandard nach Paragraph 74, wobei eine detektierbare Menge der detektierbaren Einheit in einem definierten Bereich in einem Querschnitt des Referenzstandards vorliegt.
Paragraph 76. Ein Referenzstandard wie in Paragraph 74 oder 75 aufgeführt, welcher des Weiteren eines der Merkmale der Paragraphen 2 bis 34, 69 oder 70 umfasst.
Paragraph 77. Ein Verfahren zum Bestimmen der Wirksamket oder des Erfolgs einer Maßnahme, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Bereitstellen eines Referenzstandards nach einem der vorangegangen Paragraphen, wobei eine detektierbare Eigenschaft der detektierbaren Einheit als Ergebnis der Maßnahme verändert wird; (b) Ausführen der Maßnahme an dem Referenzstandard; und (c) Detektieren einer Veränderung in der detektierbaren Eigenschaft der detektierbaren Einheit.
Paragraph 78. Ein Verfahren nach Paragraph 77, wobei eine detektierbare Eigenschaft der detektierbaren Einheit als ein Ergebnis einer erfolgreichen Maßnahme verändert wird, welche Veränderung der detektierbaren Eigenschaft der detektierbaren Einheit detektiert wird, um zu ermitteln, dass die Maßnahme erfolgreich ist.
Paragraph 79. Ein Verfahren nach Paragraph 77, wobei eine detektierbare Eigenschaft der detektierbaren Einheit als ein Ergebnis einer nicht erfolgreichen Maßnahme verändert wird, welche Veränderung der detektierbaren Eigenschaft der detektierbaren Einheit detektiert wird, um zu ermitteln, dass die Maßnahme nicht erfolgreich ist.
Paragraph 80. Ein Verfahren zum Validieren einer Maßnahme nach Paragraph 77, 78 oder 79, wobei die Maßnahme ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus: einer in situ-Hybridisierungsprozedur, einer immunhistochemischen Prozedur, Entparaffinierung, Antigengewinnung (Antigen-Retrieval), Blockierung, endogener Biotin-Blockierung, endogener Enzymblockierung, einem Waschschritt, Inkubation mit einem Aufdeckungsmittel, wie einem primären Antikörper, Inkubation mit sekundären Visualisierungskomponenten, Chromogen-Färbung, Informationserfassung betreffend die Färbung und Analyse.
Paragraph 81. Ein Verfahren nach Paragraph 77, 78, 79 oder 80, wobei die Maßnahme eine Antigengewinnungs (Antigen-Retrieval)-Maßnahme ist und wobei die detektierbare Eigenschaft der detektierbaren Einheit das Maskieren oder Demaskieren von einem oder mehreren Epitopen umfasst.
Paragraph 82. Ein Verfahren nach Paragraph 77, 78, 79, 80 oder 81, wobei die detektierbare Einheit in dem Referenzstandard modifiziert ist, so dass sie ein oder mehrere Epitope maskiert, von denen einige oder alle im Rahmen einer Antigengewinnungs (Antigen-Retrieval)-Maßnahme, die erfolgreich ist, demaskiert werden.
Paragraph 83. Ein Verfahren nach Paragraph 77, 78, 79 oder 80, wobei die Maßnahme eine Entparaffinierungsmaßnahme ist und wobei die detektierbare Eigenschaft der detektierbaren Einheit das Vorliegen oder die Menge von detektierbarer Einheit in dem Referenzstandard nach der Entparaffinierungsmaßnahme ist.
Paragraph 84. Ein Verfahren nach Paragraph 77, 78, 79, 80 oder 83, wobei die detektierbare Einheit in dem Referenzstandard in dem Entparaffinierungsmedium löslich ist und wobei wenigstens ein Teil, vorzugsweise die Gesamtmenge der detektierbaren Einheit nach einer erfolgreichen Entparaffinierungsmaßnahme entfernt ist.
Paragraph 85. Verwendung eines Referenzstandards, wie in einem der vorangegangenen Paragraphen aufgeführt, als ein Validierungsstandard für die Antigengewinnung (Antigen-Retrieval), ein Entparaffinierungsstandard, ein Validierungsstandard für die Blockierung, ein Validierungsstandard für das Waschen, ein Validierungsstandard für primäre Antikörper, ein Validierungsstandard für sekundäre Antikörper, ein Kalibrierungsstandard oder ein diagnostischer Standard.
Paragraph 86. Ein Referenzstandard, welcher eine detektierbare Einheit umfasst, die in einem länglichen Pfad in einem Trägermedium lokalisiert ist.
Paragraph 87. Ein Referenzstandard nach Paragraph 86, welcher ferner ein oder mehrere der oben in den Paragraphen 1 bis 85 aufgeführten Merkmale umfasst.
Paragraph 88. Ein Referenzstandard oder ein Verfahren zur Herstellung eines solchen oder ein Verfahren unter Verwendung eines Referenzstandards nach einem der vorangegangenen Paragraphen, wobei die detektierbare Einheit von einer länglichen Faser, an welche sie angeheftet ist, beabstandet ist durch Abstandshaltermittel, wie einen Spacer oder eine Kopplungsstruktur („coupler").
Paragraph 89. Ein Referenzstandard im Wesentlichen wie zuvor beschrieben unter Bezugnahme auf und wie gezeigt in den 2 bis 38 der begleitenden Zeichnungen.
Paragraph 90. Ein ebener Schnitt von vorzugsweise im Wesentlichen gleichförmiger Dicke eines Referenzstandards im Wesentlichen wie zuvor beschrieben unter Bezugnahme auf und wie gezeigt in den 2 bis 38 der begleitenden Zeichnungen.
Paragraph 91. Verwendung eines Referenzstandards oder eines ebenen Schnitts zum Bestimmen des Vorliegens oder einer Menge einer detektierbaren Einheit in einer biologischen Probe, eine solche Verwendung im Wesentlichen wie zuvor beschrieben unter Bezugnahme auf und wie gezeigt in den 2 bis 38 der begleitenden Zeichnungen.
Paragraph 92. Ein Verfahren zur Bestimmung der Menge einer detektierbaren Einheit in einer biologischen Probe im Wesentlichen wie zuvor beschrieben unter Bezugnahme auf und wie gezeigt in den 2 bis 38 der begleitenden Zeichnungen.
Paragraph 93. Ein Verfahren zur Diagnose einer Erkrankung oder eines Zustands in einem Individuum im Wesentlichen wie zuvor beschrieben unter Bezugnahme auf und wie gezeigt in den 2 bis 38 der begleitenden Zeichnungen.
BEISPIELE
Um die allgemeine Nützlichkeit und einige der hier beschriebenen allgemeinen Aspekte zu veranschaulichen, sind mehrere Referenzmaterialien hergestellt und ausgewertet worden, einschließlich der Verwendung von verschiedenen Fasermaterialien, Anheftung von Haptenen, Farbstoffen und Verfahren zum Einbetten des Materials, um eine gute Anheftung an Objektträger zu ermgölichen.
Das Referenzmaterial ist als in Paraffin eingebettete (FFPE) Präparate hergestellt und in einem Hellfeld-Mikroskop ausgewertet worden.
Beispiel 1. Herstellung von Fluorescein- und DNP-Referenzmaterial
Das folgende Beispiel beschreibt die Herstellung von Fluorescein und Dinitrophenyl (DNP) enthaltendem Modell-Referenzmaterial: unter Verwendung von drei verschiedenen Fasern und gekoppelt in wässrigen oder organischen Lösemitteln in unterschiedlichen Konzentrationen, um zu veranschaulichen i) die Variation hinsichtlich der Färbungsintensität und ii) die Lokalisierung der Färbung durch Quellen der Fasern.
Sowohl die Fluorescein- als auch die Dinitrophenyl-Gruppierung sind wohlbekannte allgemeine Haptene für diagnostische Assays. Die Haptene sind beide unter Verwendung von spezifischen Antikörpern erkennbar.
Die Modell-Haptene werden ausgewählt, um die Verwendung von zwei unterschiedlichen Kopplungschemien zu veranschaulichen: der aktivierten Arylhalogen- und der reaktiven Isothiocyanatgruppen.
Die drei unterschiedlichen Fasern, die verwendet wurden, sind:
Unifloss-Fasern (50% Nylon, 50% Rayon, 15 Yds, 600 1X, einzelsträngiger Faden, blau, UNI Products J.G. Côté Inc., QC, Kanada, erhalten von LP Fly Shop, DK-8900 Randers, Dänemark).
LP-floss-Fasern (Rayon Seide, Cellulose, weiß, LP Fly Shop, DK-8900 Randers, Dänemark) und Lagertun-Fasern (natürliche Seide, weiß, erhalten vom LP Fly Shop, hergestellt in Frankreich, aufgespult in den USA, mehrsträngige Seide, 8 Yds).
Alle Fasern werden zu 40 cm Länge geschnitten und es werden Knoten an den Enden geknüpft, um zu vermeiden, dass sich die Faserbündel aufrollen und um sie gegenüber einander zu identifizieren.
Die drei unterschiedlichen Fasern werden in die gleichen Reaktionsgefäße gelegt (5 ml Glasflaschen aus dunklem Glas mit Schraubkappen) in jedem der folgenden vier Kopplungsexperimente:
1A. Kopplung von DNP in wässriger Lösung
Es wird eine 1,0 M Stammlösung von Sanger's-Reagens (2,4-Dinitrofluorbenzol, F-DNP, Sigma, Code-Nr. D 1529; 36,4 mg in 200 μl trockenem N-Methylpyrrolidon, NMP, Lab-Scan, Code-Nr. C 2538) hergestellt.
Zu den drei Reaktionsgefäßen mit Fasern werden Wasser, NMP und Carbonatpuffer, pH 9,0, zugesetzt und 20 min quellen gelassen, bevor Sanger's-Reagens aus der Stammlösung zugesetzt wird.
Die gesamten Reaktionsvolumen (3,0 ml) umfassen 50 mM Carbonat, pH 9,0, 20% NMP in Wasser bzw. 5, 10 oder 25 mM F-DNP.
Nach 18 h in einem 30°C-Wasserbad werden die neun Fasern zweimal mit HEPES-Puffer (10 mM HEPES, Sigma, Code-Nr. N-3375, 100 mM NaCl, pH 7,0) 2 min gewaschen, gefolgt von einem zweimaligen Waschen in entionisiertem Wasser und einem viermaligen Waschen mit absolutem Ethanol.
Die Unifloss- und LP-floss-Fasern sind gegenüber den unmodifizierten Fasern unverändert, wohingegen die Lagertun-Fasern bei allen 3 Präparaten gelber sind als die unmodifizierte Faser.
1B. Kopplung von DNP in organischer Lösung
Toluol (Lab-Scan, Code-Nr. C2522), NMP und Triethylamin (Aldrich, Code-Nr. 13,206-0) wird zu zwei Reaktionsgefäßen mit Fasern zugegeben und 20 min quellen gelassen, bevor Sanger's-Reagens aus der Stammlösung zugegeben wird.
Die gesamten Reaktionsvolumen (3,0 ml) umfassen 10 mM Triethylamin, 20% NMP in Toluol bzw. 5 oder 10 mM F-DNP.
Nach 18 h in einem 30°C-Wasserbad werden die sechs Fasern einmal mit NMP für 2 min gewaschen, gefolgt von einem viermaligen Waschen mit Toluol und einem viermaligen Waschen mit absolutem Ethanol.
Alle sechs Fasern sind visuell unverändert verglichen mit den unmodifizierten Fasern.
1C. Kopplung von FITC in wässriger Lösung
Es wird eine 1,0 M Stammlösung von FITC (Fluoresceinisothiocyanat-Isomer 1, Molecular Probes, Eugene, USA, Code-Nr. F-1906), 65,1 mg in 170 μl NMP, hergestellt.
Zu den drei Reaktionsgefäßen mit Fasern werden Wasser, NMP und Carbonatpuffer zugesetzt und 20 min quellen gelassen, bevor FITC aus der Stammlösung zugesetzt wird.
Die gesamten Reaktionsvolumen (3,0 ml) umfassen 50 mM Carbonat, pH 9,0, 20% NMP in Wasser bzw. 5, 10 oder 25 mM FITC. Reaktionsdauer, -bedingungen und Waschschritte sind wie für Beispiel 1A.
Die resultierenden Unifloss-Fasern erschienen bei allen 3 Präparaten olivgrün und die LP-floss-Fasern und Lagertun-Fasern hellgelb verglichen mit den unmodifizierten Fasern.
1D. Kopplung von FITC in organischer Lösung
Toluol, NMP und Triethylamin werden zu zwei Reaktionsgefäßen mit Fasern zugeben und 20 min quellen gelassen, bevor FITC aus der Stammlösung zugegeben wird.
Die gesamten Reaktionslösungen (3,0 ml) umfassen 10 mM Triethylamin, 20% NMP in Toluol bzw. 5 oder 10 mM FITC. Reaktionsdauer, -bedingungen und Waschschritte sind wie für Beispiel 1B.
Alle sechs Fasern sind verglichen mit den unmodifizierten Fasern visuell unverändert.
Alle 30 Faserpräparate werden in absolutem Ethanol (2-8°C) aufbewahrt, bevor sie eingebettet, geschnitten, gefärbt und untersucht werden.
Unmodifizierte Unifloss-, LP-floss- und Lagertun-Fasern werden auf eine ähnliche Weise als negative Kontrollen aufbewahrt.
Beispiel 2. Einbettung von Referenzmaterial
Das folgende Beispiel beschreibt das allgemeine Verfahren zur Herstellung von Paraffinblöcken unter Verwendung von verschiedenen Fasern, einschließlich der in Beispiel 1 hergestellten Fasern.
Die modifizierten oder unmodifizierten Fasern werden auf einen 9 × 9 cm-Stahlrahmen aufgebracht (11A) und in einen 10 × 10 × 2 cm-Metallbehälter mit einem Stahlkorb, um dabei zu helfen, das Gel mit Letztgenanntem zu entfernen, gelegt (11B).
Eine Agaroselösung (80 ml, 2 Gew.-% in entionisiertem Wasser, HSA 1000 Protein-Qualität, FMC BioPolymer/Litex, erhalten von Medinova Scientific A/S, Hellerup, Dänemark) wird in einem Wasserbad auf 60°C erwärmt, bevor sie über die Fasern gegossen wird (11C).
Man lässt die Gellösung auf Raumtemperatur abkühlen und sich verfestigen.
Das resultierende verfestigte Gel wird aus dem Behälter herausgenommen (11D) und unter Verwendung eines Skalpells aus dem Stahlrahmen geschnitten. Die Gelplatte wird weiter in ungefähr 5 × 5 mm dicke rechteckige Stücke von ungefähr 1,5-2,0 cm Länge geschnitten (11E). Die Fasern sind im Zentrum der Agarose-Gelstücke eingebettet.
Jedes Gelstück wird in einen Behälter (30 ml, Polystyrol, Nunc/Nalgene-Teströhrchen) mit Neutral-gepuffertem Formalin, NBF (20 ml, 50 mM Tris-HCl, 0,15 M NaCl, pH 7,6, ausgehend von einer 37%-igen Formaldehyd- (Merck, Code-Nr. 4003) und 10%-igen Methanol-Stammlösung auf 4% Formaldehyd eingestellt und über Nacht in einem belüfteten Laborabzug stehen gelassen (18 h, bei Raumtemperatur).
Die in ein Formalin-fixiertes Agarosegel eingebetteten Fasern werden dehydratisiert, indem jedes in eine markierte Histokapsel (Sekura ProNosp: Mega-cassette Code-Nr. 59040, ungefähr 32 × 26 × 10 mm) gegeben wird und die Kapseln nacheinander in 70% Ethanol für 15 min, zweimal in 96% Ethanol für 15 min, zweimal in 99% Ethanol für 15 min und zweimal in Xylol für 15 min gegeben werden.
Alle geschrumpften und leicht gelblichen Gelstücke werden in geschmolzenes Paraffin (Merck, Code-Nr. 7337.9020, Schmelzpunkt 56-58°C) transferiert und über Nacht bei 60°C stehengelassen.
Die Gelstücke werden in frisches warmes Paraffin transferiert und darin zusätzliche zwei Stunden belassen, bevor sie mit Paraffin in einer Schmelze (Sekura, ProHosp 4166 mega, ungefähr 31 × 23 × 13,55 mm) eingebettet und abgekühlt werden, um die endgültigen Paraffinblöcke zu bilden.
Die markierten Paraffinblöcke, welche die eingebetteten Fasern enthalten, werden bei Raumtemperatur aufbewahrt, bevor sie geschnitten, aufgelegt und gefärbt werden.
Beispiel 3. Immunfärbung von Fluorescein- und DNP-Referenzmaterial
Das folgende Beispiel beschreibt das Schneiden und das Färben von Fluorescein- und DNP-modifiziertem Modell-Referenzmaterial mit abgestufter Färbungsintensität und gesteuerter Lokalisierung der Färbung.
Paraffinblöcke aus Beispiel 2 werden in ein Mikrotom (Leica 0355 Modell RM2065, Feather S35-Messer, eingestellt auf 5 Mikrometer) mit den Längen der Fasern senkrecht zu der Schnittrichtung eingespannt. Die ersten wenigen mm werden schnell abgeschnitten, bevor die Paraffinschnitte zu 5 μm Dicke geschnitten und gesammelt werden. Die Paraffinschnitte werden auf einem 60°C heißen Wasserbad sanft gestreckt, bevor sie auf markierte Mikroskop-Glasobjektträger (Superfrost plus, Menzel-gläser, Code-Nr. 041300) aufgelegt werden.
Die Objektträger werden getrocknet, in einem Ofen bei 60°C gebacken, überschüssiges und geschmolzenes Paraffin wird mit einem Zellstofftuch weggewischt.
Die Objektträger werden durch aufeinanderfolgendes zweimaliges Inkubieren in Xylol für 2-5 min, zweimaliges Inkubieren in 96% Ethanol für 2-5 min, zweimaliges Inkubieren in 70% Ethanol für 2-5 min und einmaliges Inkubieren in TBS (50 mM Tris-HCl (Tris(hydroxymethyl)aminomethan p.a., Crystal Chem. Inc., IL, USA), 150 mM NaCl, pH 7,6) für 5 min entparaffiniert.
Um ein gutes Bedecken des Reagens auf dem Material sicherzustellen, wird die Fläche auf dem Objektträger mit Referenzmaterial mit einer Silicon-Barriere („DakoPen", DakoCytomation, Code-Nr. S 2002) umgeben.
Die Objektträger werden auf ein Regal in einer kleinen Kammer transferiert, um ein Austrocknen während der folgenden Verfahrensschritte zu vermeiden.
Alle Objektträger werden mit einem Blockierungspuffer („Casein based blocking buffer concentrate", Sigma-Genosys Ltd., Vereinigtes Königreich, Code-Nr. SU-07-250, 15 min) inkubiert, dreimal 1 min mit TBS gewaschen, gefolgt von einem Blockieren von jeglicher Peroxidase-Aktivität durch Inkubieren mit ChemMate^TM Peroxidase-Blocking Solution (DakoCytomation, Code-Nr. S 2023), bevor sie einmal 2 min mit TBS gewaschen werden.
Die Immunvisualisierung der DNP-modifizierten Fasern erfolgt unter Verwendung des Meerrettich-markierten F(ab')-Kaninchen-Antikörpers gegen DNP (DakoCytomation, Code-Nr. P 5102, Verdünnnung 1:100, 100 μl pro Objektträger, Inkubation für 60 min.)
Die Objektträger werden sanft dreimal 2 min in dem TBS-Puffer gewaschen, gefolgt von einer Inkubation mit einem chromogenen Diaminobenzidin-Substratsystem (DAB+, DakoCytomation, Code-Nr. 3468) für 10 min.
Die Immunvisualisierung von Fluorescein-modifizierten und unmodifizierten Fasern erfolgt genau wie für das DNP-modifizierte Material mit der Ausnahme, dass der Meerrettich-markierte F(ab')-Kaninchen-Antikörper gegen FITC (DakoCytomation, Code-Nr. P 5100, Verdünnung 1:100, 100 μl pro Objektträger, Inkubation für 60 min) verwendet wird.
Alle Objektträger werden zweimal mit dem TBS-Puffer gewaschen, gefolgt von einmaligem Waschen mit destilliertem Wasser. Die Objektträger werden unter Verwendung eines wässrigen Eindeckungsmediums, Faramount (DakoCytomation, Code-Nr. S 3025) mit einem Deckgläschen bedeckt und in einem Hellfeld-Mikroskop (Leica DM LB) bei 10-facher oder 40-facher Vergrößerung unter Verwendung einer Lichtstärkeneinstellung von 8 untersucht, digital photographiert (Olympus DP50-CU) und die Bilder wurden bezüglich des Hintergrunds korrigiert.
12 zeigt einen Gesamtvergleich von humanem Brustgewebe, gefärbt mit dem den Stand der Technik darstellenden Herceptest^TM (12A), Lagertun-Fasern, modifiziert mit DNP und gefärbt unter Verwendung von anti-DNP-HRP/DAB (12B), und gefärbte HER2 +3-Referenzzellen aus dem Herceptest^TM (12C). Die gesamte Morphologie und das gesamte Erscheinungsbild des Referenzstandards sind ähnlich zu jenen der herkömmlichen Gewebefärbung unter Verwendung von Referenzzellen in Hinblick auf Größe, Gestalt und Verteilung. Die Seidenfasern sind in der Größe homogener verglichen mit den Herceptest-Referenzzellen. Das humane Gewebe weist verglichen mit den beiden Referenzsystemen eine kompliziertere Morphologie auf
Ergebnisse
13 zeigt die resultierende Färbung in 10-facher Vergrößerung. 13A: Unifloss, 13B: LP-floss und 13C: Lagertun-Fasern, gekoppelt mit 25 mM F-DNP in wässriger Lösung und im Vergleich 13D: Unmodifizierte Unifloss-Faern als negative Kontrolle.
Die Unifloss- und LP-floss-Fasern werden an den äußeren Oberflächen oder Kanten der Fasern nur sehr schwach gefärbt. Die Lagertun-Fasern werden sowohl an der Oberfläche als auch im Inneren positiv gefärbt (ungefähr 2+). Die Färbung ist für alle Fasern homogen.
Als Schlussfolgerung werden die Unifloss- und LP-floss-Fasern, die mit Sanger's-Reagens in wässriger Lösung modifiziert worden sind, in einem Ausmaß gefärbt, das sich nicht signifikant vom Hintergrund unterscheidet, wohingegen die Lagertun-Seidenfasern homogen und in einem hohen Ausmaß gefärbt werden.
14 zeigt die resultierende Färbung, betrachtet bei 10-facher Vergrößerung. 14A: Unifloss, 14B: LP-floss und 14C: Lagertun-Fasern, gekoppelt mit 10 mM FITC in Toluol, und im Vergleich 14D: Unmodifizierte Unifloss-Fasern als negative Kontrolle.
Die Unifloss- und LP-floss-Fasern werden an den Oberflächen nur sehr schwach gefärbt – fast in einem Ausmaß, das sich vom Hintergrund nicht signifikant unterscheidet. Die Lagertun-Fasern werden hauptsächlich an der Oberfläche schwach gefärbt (ungefähr 1+) und erscheinen im Inneren ungefärbt. Die Färbung ist für alle Fasern homogen.
Als Schlussfolgerung werden die mit FITC in Toluol modifizierten Unifloss- und LP-floss-Fasern in einem Ausmaß gefärbt, welches sich nicht signifikant von dem Hintergrund unterscheidet. Die Lagertun-Seidenfasern werden homogen und nahezu nur an der äußeren Oberfläche der Faser gefärbt. Dies unterscheidet sich von dem Färbungsmuster für die in 13C gezeigten wässrig/F-DNP-modifizierten Lagertun-Fasern, was eine Veränderung der Lokalisierung aufgrund der unterschiedlichen Quelleigenschaften von Seide in Wasser und Toluol anzeigt. Seide quillt in Toluol nicht viel.
Als Folge konnten die reaktiven Gruppen während der Kopplung in Toluol den inneren Teil der ungequollenen Seidenfaser nicht erreichen. Dies wird in 14C veranschaulicht.
Beispiel 4: Immunfärbung von Fluorescein- und DNP-Referenzmaterial unter Verwendung eines sekundären Visualisierungssystems
Das folgende Beispiel beschreibt die Färbung von Fluorescein- und DNP-modifiziertem Modell-Referenzmaterial mit abgestufter Färbungsintensität und gesteuerter Lokalisierung der Färbung unter Verwendung eines sekundären Visualisierungssystems, das empfindlicher ist als das in Beispiel 3 oben verwendete primäre oder direkte Färbesystem.
Das Referenzmaterial wird geschnitten, auf Objektträger aufgelegt und entparaffiniert, wie in Beispiel 3 oben beschrieben.
In ähnlicher Weise erfolgen das Blockieren mit Protein und das Blockieren der Peroxidase-Aktivität wie für Beispiel 3.
Die Gesamtprozedur umfasst, zuerst mit Konjugaten, welche einen primären Antikörper gegen DNP oder Fluorescein enthalten, zu inkubieren. Gefolgt von Waschen, Inkubation mit einer polymeren Dextrankonjugat-Mischung, enthaltend Meerrettich-Peroxidase und sowohl Ziege-anti-Kaninchen als auch Ziege-anti-Maus, und Färbung mit einem HRP-Chromogen.
Detaillierter werden die DNP-modifizierten Fasern 60 min mit HRP-markiertem F(ab')-Kaninchen-Antikörper gegen DNP (DakoCytomation, Code-Nr. P 5102, Verdünnung 1:100, 100 μl pro Objektträger) inkubiert.
Die FITC-modifizierten Fasern werden 60 min mit HRP-markiertem F(ab')-Kaninchen-Antikörper gegen FITC (DakoCytomation, Code-Nr. P 5100, Verdünnung 1:100, 100 μl pro Objektträger) inkubiert. Alle Objektträger werden dreimal sanft 2 min in dem TBS-Puffer gewaschen, gefolgt von einer Inkubation mit Envision+/HRP-Konjugat (DakoCytomation, Code-Nr. K 5007, 100 μl pro Objektträger) für 30 min.
Die Objektträger werden dreimal sanft 2 min in dem TBS-Puffer gewaschen, gefolgt von einer Inkubation mit einem chromogenen Diaminobenzidin-Substratsystem (DAB+, DakoCytomation, Code-Nr. K 3468) für 10 min.
Alle Objektträger werden wie in Beispiel 3 gewaschen, mit einem Deckgläschen bedeckt, im Mikroskop untersucht und photographiert.
15 zeigt die Färbung von (a) Unifloss-, (b) LP-floss- und (c) Lagertun-Fasern, gekoppelt mit 10 mM FITC in Toluol und (d) unmodifizierten Unifloss in 10-facher Vergrößerung. Alle behandelt als FFPE-Proben und gefärbt mit anti-FITC/HRP/EnVision+/DAB+ (DakoCytomation, Code-Nr. P 5100 und K 4010/4011).
Die Unifloss- und LP-floss-Fasern werden ausschließlich an den Oberflächen gefärbt (ungefähr 1+-1½+). Die Lagertun-Fasern werden an der äußeren Oberfläche mit höherer Intensität gefärbt (ungefähr 2+). Die Färbung ist für alle Fasern homogen.
16 zeigt die Färbung von Unifloss-Fasern, gekoppelt mit Sanger's-Reagens (F-DNP) bei unterschiedlichen Bedingungen: a) Gekoppelt mit 5 mM F-DNP in wässrigem Lösemittel, b) Gekoppelt mit 25 mM F-DNP in wässrigem Lösemittel, c) Gekoppelt mit 5 mM F-DNP in Toluol, d) Gekoppelt mit 10 mM F-DNP in Toluol und e) unmodifizierte Fasern.
Die in wässriger Lösung modifizierten Unifloss-Fasern werden sowohl an der Oberfläche als auch im Inneren der Faser gefärbt. Die Intensität nimmt von ungefähr ½+ bei Verwendung von 5 mM F-DNP auf 1+ bei Verwendung von 25 mM F-DNP zu.
Die in Toluol modifizierten Unifloss-Fasern werden nahezu ausschließlich an den Oberflächen gefärbt. Die mit 5 mM F-DNP modifizierten Fasern weisen eine Färbungsintensität nur geringfügig über jener der unmodifizierten Fasern auf, wohingegen die mit 10 mM F-DNP modifizierten Fasern stärker gefärbt werden (ungefähr ½-1+).
Die Färbung ist für alle Fasern homogen. Die unmodifizierten Fasern werden nicht gefärbt. Es kann nur ein Schatten von der Faser nahe den Kanten festgestellt werden.
17 zeigt die Färbung von LP-floss-Fasern, gekoppelt mit Sanger's-Reagens (F-DNP) unter unterschiedlichen Bedingungen: a) Gekoppelt mit 5 mM F-DNP in wässrigem Lösemittel; b) Gekoppelt mit 25 mM F-DNP in wässrigem Lösemittel; c) Gekoppelt mit 5 mM F-DNP in Toluol und d) Gekoppelt mit 10 mM F-DNP in Toluol.
Die in wässriger Lösung modifizierten LP-Fasern sind durch die gesamte Faser hindurch homogen gefärbt. Die Intensität nimmt von ungefähr 1+ bei Verwendung von 5 mF F-DNP auf 2+ bei Verwendung von 25 mM F-DNP zu.
Die in Toluol modifizierten LP-Fasern sind an den Oberflächen mit geringer Intensität gefärbt. Die mit 10 mM F-DNP modifizierten Fasern färben sich geringfügig mehr als die mit 5 mM F-DNP modifizierten Fasern. Die Färbung ist für alle Fasern homogen.
18 zeigt die Färbung von Lagertun-Seidenfasern, gekoppelt mit Sanger's-Reagens (F-DNP) unter unterschiedlichen Bedingungen: a) Gekoppelt mit 5 mM F-DNP in wässrigem Lösemittel; b) Gekoppelt mit 25 mM F-DNP in wässrigem Lösemittel; c) Gekoppelt mit 5 mM F-DNP in Toluol und d) Gekoppelt mit 10 mM F-DNP in Toluol.
Die in wässriger Lösung modifizierten Lagertun-Seidenfasern sind mit hoher Intensität sowohl an der Oberfläche als auch im Inneren gefärbt. Die mit einer niedrigen Konzentration von F-DNP modifizierten Fasern färbten sich mit ungefähr 2,0-2,5 + an der Oberfläche und ungefähr 1+ im Inneren. Die mit 25 mM F-DNP modifizierten Fasern werden mit sogar noch höherer Intensität gefärbt: ungefähr 3+ an der Oberfläche und 2+ im Inneren.
Die in Toluol modifizierten Lagertun-Fasern werden hauptsächlich an den Oberflächen nur schwach gefärbt. Die mit 25 mM F-DNP modifizierten Fasern färben sich fast in dem gleichen Ausmaß wie die mit 5 mM F-DNP modifizierten Fasern. Die Färbung ist für alle Fasern homogen.
Als Schlussfolgerung zeigen die verschiedenen oben beschriebenen Färbungen, dass es möglich ist, abhängig von den Modifizierungsbedingungen, hier der Konzentration der beiden reaktiven Haptene, FITC und Sanger's-Reagens, mit unterschiedlichen Intensitäten zu färben.
Es ist auch möglich, das Ziel spezifisch mit geringer Intensität, aber eindeutig oberhalb des Hintergrunds zu färben.
Dies ist oftmals überaus erwünscht, da die diagnostisch interessierende Schwellenwertfärbung für viele IHC-Färbungen bei ungefähr 1+ liegt und eindeutig von einer unspezifischen Färbung unterscheidbar sein sollte. Dies kann sehr schwierig zu erzielen sein, da eine schwache spezifische Färbung oftmals in der unspezifischen Hintergrundfärbung untergeht.
Die Färbungsintensität hängt auch von dem verwendeten Hapten und den Lösemitteln, die während der Modifizierung verwendet werden, ab. Offensichtlich werden die FITC-modifizierten Fasern schwächer gefärbt als die F-DNP-modifizierten Fasern. Zusätzlich führt ein besseres Quellen während der Modifizierung zu einer höheren Färbungsintensität.
Die Lokalisierung der Färbung ist abhängig von den Quelleigenschaften des Lösemittels während der Modifizierung. Im Allgemeinen quoll keine der Fasern in Toluol und diese werden folglich hauptsächlich an den Oberflächen gefärbt.
Die Lagertun-Seidenfasern quollen in wässrigen Lösemitteln und werden dementsprechend auch im Inneren der Faser gefärbt.
LP-floss und Unifloss werden mit unterschiedlichen Intensitäten an der Oberfläche und in der Mittel der Faser gefärbt, wenn während der Modifzierung wässrige Bedingungen verwendet werden.
Beispiel 5. Vergleich von Größe und Gestalt
Das folgende Beispiel vergleicht die Größe und Gestalt des Referenzmaterials mit den in dem HercepTest^TM enthaltenen Referenzsystemen.
Gefärbte Unifloss-, LP-floss- und Lagertun-Faser-Objektträger, die in 16B, 17B und 28B gezeigt sind (alle gekoppelt mit 25 mM F-DNP bei wässrigen Bedingungen, aus Beispiel 4) werden hinsichtlich der Größe unter Verwendung der Software „Olympus DP-soft, Version 3.1" gemessen.
Der Durchschnitt von 10 Messungen bei 40-facher Vergrößerung im Hellfeld-Mikroskop ergab einen durchschnittlichen Durchmesser von 3,3, 3,5 bzw. 1,6 μm für die DNP-gefärbten Unifloss-, LP-floss- und Lagertun-Fasern.
19 veranschaulicht die Größe und Gestalt aller drei Fasern, wobei eine Skala unter Verwendung der oben erwähnten Software eingeschoben ist.
20A ist ein Bild, das bei 10-facher Vergrößerung von den 3+-Niveau-Referenzzellen, angefärbt auf HER2 unter Verwendung des HercepTest^TM (DakoCytomation, Code-Nr. K 5204), aufgenommen worden ist.
20B ist ein Bild, das von den gefärbten Negativkontroll-Referenzzellen, die in demselben Kit verwendet werden, bei der gleichen Vergrößerung aufgenommen worden ist.
Die 3+-Zelllinie (20A) liefert eine starke (3+) Membranfärbung und keine zytoplasmatische Färbung. Die Färbung ist homogen und es kann festgestellt werden, dass das Präparat wenige tote Zellen und einige Zellrückstände enthält.
21 ist ein Bild, das bei 10-facher Vergrößerung von den DAB+-gefärbten und mit Hämatoxylin gegengefärbten EGFR-Referenzzellen aus dem DakoCytomation EGFR PharmDx-Kit (Code-Nr. K 1492) aufgenommen worden ist.
Das Bild zeigt eine starke Membranfärbung (3+) und eine gewisse schwache zytoplasmatische Färbung (1+). Die Färbung ist homogen und das Präparat enthält einige Tote Zellen und einige Zellrückstände.
Die Größe, Verteilung und Gestalt der gefärbten Fasern in 14 bis 19 kann mit den in dem HercepTest^TM und dem EGFR PharmDX-Kit verwendeten Referenzzellen verglichen werden (20 und 21).
Die Größenmessungen der Fasern zeigen an, dass die individuellen Punkte von grob der gleichen Größe wie die Zellen, die beispielsweise in dem HercepTest^TM verwendet werden, sind. Insbesondere sind die Unifloss- und LP-floss-Fasern von der gleichen Größe, wohingegen die Lagertun-Fasern signifikant kleiner sind.
Auch ist die Größenverteilung homogener und enger verglichen mit den Zellen aus dem HercepTest^TM (20), wo die Zellen zufällig geschnitten werden, was zu verschiedenen Größen von Zellfragmenten und Zellen führt.
Im Gegensatz zu den Referenzzelllinien weist keine der Fasern sichtbare Rückstände oder rückstandsartige Fragmente auf.
Die Unifloss-Fasern erscheinen als kugelförmige Punkte mit einer ungleichmäßigen und flaumigen Kante. Der LP-floss ist viel gleichmäßiger sogar an den Kanten, aber nicht so kugelförmig.
Die Lagertun-Fasern sind an den Kanten gleichmäßig und leicht oval, wodurch sie vielen Kristallen ähneln.
Die Gestalt der Fasern ähnelt nicht perfekt natürlichen Zellen, aber die Größe und die Gesamtkonturen sind zellartig.
Beispiel 6. Färbung von Fasern unter Verwendung von reaktiven Farbstoffen
Das Beispiel veranschaulicht die Herstellung von permanentem, einen Ring aufweisendem Referenzmaterial und dessen Fähigkeit, Entparaffinierung und Epitop-Retrieval zu widerstehen.
2,0 m Unifloss-, Uni Floss- und Lagertun-Fasern werden separat in Teströhrchen mit einer reaktiven roten Farbstofflösung (33 mg Procion Red MX-5B, Aldrich, Produkt-Nr. 40,436-5, 615,34 Da, in 662,5 μl entionisiertem Wasser) oder reaktiven blauen Farbstofflösung (Cibacronblau 3 GA, Sigma-Aldrich Co., Produkt-Nr. C-9534, 774,2 Da, in 662,5 μl entionisiertem Wasser) gegeben. Alle verschlossenen Teströhrchen werden auf einem 60°C-Wasserbad 30 min erwärmt und alle 10 min geschüttelt.
Zu jedem Teströhrchen wird Natriumchlorid (25 μl, 4 M) und Natriumcarbonat (312,5 μl, 0,8 M, pH 9,0) zugegeben und 2 h bei 80°C inkubiert, während alle 10 min geschüttelt wird.
Die Fasern werden mit Leitungswasser gewaschen, bis kein Farbstoff mehr aus den Fasern leckt. Die Fasern werden in entionisiertem Wasser, welches Natriumazid enthält (15 mM, 2-8°C), aufbewahrt, bevor sie wie in Beispiel 2 oben in ein Agarosegel eingebettet, zu Gelblöcken geschnitten, dehydratisiert und in Paraffin eingebettet werden.
Die Paraffinblöcke, die die gefärbten Fasern enthalten, werden bei Raumtemperatur aufbewahrt, bevor sie wie in Beispiel 3 geschnitten und auf Objektträger aufgebracht werden.
Die Objektträger werden in drei Gruppen aufgeteilt. Die ersten Objektträger werden erst unmittelbar vor dem Entparaffinierungsschritt mit einem Deckgläschen abgedeckt, die zweite Gruppe wird entparaffiniert, bevor sie mit einem Deckgläschen abgedeckt wird, und die dritte Gruppe wird entparaffiniert und einem Epitop-Retrieval-Schritt (DakoCytomation, Code-Nr. S 1700) in einem gerade unterhalb des Siedepunkts (95-99°C) befindlichen Wasserbad für 40 min unterworfen, man lässt sie 20 min auf Raumtemperatur abkühlen, es wird einmal 5 min mit TBS gewaschen, bevor sie mit einem Deckgläschen abgedeckt werden.
Die Entparaffinierung und das Abdecken mit einem Deckgläschen erfolgen wie in Beispiel 3.
Alle mit einem Deckgläschen abgedeckten Objektträger werden im Hellfeld-Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung und bei der Lichteinstellung 8 in dem Mikroskop untersucht.
Allgemein zeigen alle Fasern einen starken Ring und die Farbstoffgehalte sind nach Entparaffinierung und Epitop-Retrieval die gleichen, was stark darauf hinweist, dass die Farbstoffe gegenüber den IHC-Standardverfahrensschritten stabil sind.
Auch werden die Lagertun-Seidenfasern viel stärker rot oder blau gefärbt als die beiden anderen Fasern.
Detaillierter für die Procion Red-modifizierten LP-floss- und Unifloss-Fasern:
22 sind digitale Bilder von Procion Red-modifiziertem LP-floss vor der Entparaffinierung, nach der Entparaffinierung bzw. nach dem Epitop-Retrieval-Schritt.
23 sind digitale Bilder von Procion Red-modifiziertem Unifloss vor der Entparaffinierung, nach der Entparaffinierung bzw. nach dem Epitop-Retrieval-Schritt.
Überraschenderweise ist die rote Farbe deutlich sichtbar und nach den verschiedenen Schritten offensichtlich von derselben Stärke oder auf dem gleichen Niveau. Die Färbung der Fasern ist dementsprechend während der Standard-IHC-Schritte permanent und stabil.
Die Unifloss-Faser erscheint allgemein weniger stark gefärbt als die LP-floss-Faser.
Die LP-floss-Fasern scheinen geringfügig homogener gefärbt zu sein als Unifloss-Fasern.
In 23B und in einem gewissen Ausmaß in 23C scheinen die LP-floss-Fasern nicht perfekt senkrecht zu den Faserlängen geschnitten worden zu sein, was zu ovalen und nicht kugelförmigen Punkten führt.
Beispiel 7. Die Wirkung von verschiedenen Einbettungsmedien und Glasobjektträgern
Das folgende Beispiel veranschaulicht, wie das Referenzmaterial auf den Objektträgern nach chemisch rauen Antigen-Retrieval-Prozeduren intakt bleibt.
Verschiedene Additive in den Einbettungsmedien werden mit verschiedenen Glasobjektträgern und unter Verwendung von verschiedenen Routine-Epitop-Retrieval-Methoden kombiniert.
In diesem Beispiel werden unmodifizierte Fasern (Unifloss, LP-floss und Lagertun) verwendet.
Die drei unterschiedlichen Fasern werden auf Stahlrahmen aufgebracht und in unterschiedliche Agarosegel-Formulierungen eingebettet: (i) 2% Agarose, (ii) 4% Agarose, (iii) 2% Agarose, 0,25% PVA (Fluka, Code-Nr. 81386), (iv) 2% Agarose, 0,25% PEI (Fluka, Code-Nr. 03880).
Die Agarose ist die gleiche wie in Beispiel 3.
Die in Gel eingebetteten Fasern werden fixiert, dehydratisiert, in Paraffin eingebettet, geschnitten und auf Objektträger aufgelegt, wie in Beispiel 3 beschrieben.
Die verwendeten Objektträger sind: (1) Super Frost (Menzel-gläser, Code-Nr. 041300), (2) ChemMate^TM Capillary Gap Microscope Slides (DakoCytomation, Code-Nr. S 2024), (3) DakoCytomation Silanized Slides (Code-Nr. S 3003), (4) Poly-L-Lysine Slides (Poly-L-lysin-Objektträger) (Electron Microscopy Sciences, Code-Nr. 63410-01).
Die auf die verschiedenen Objektträger aufgelegten oder aufgebrachten Schnitte werden entparaffiniert, unter dem Mikroskop untersucht, photographiert und mit einer oder folgenden Epitop-Retrieval-Prozeduren behandelt.

(a) High pH epitope retrieval buffer, pH 9,9 (DakoCytomation, Code-Nr. S 3308), 40 min in einem 95-99°C-Wasserbad, abkühlen gelassen auf Raumtemperatur für 20 min, einmal 5 min mit TBS gewaschen, bevor mit einem Deckgläschen abgedeckt wurde.
(b) Ein Epitop-Retrieval-Puffer auf Basis von Citrat, pH 6,1 (DakoCytomation, Code-Nr. S 1700), gleiche Vorgehensweise wie (a) mit der Ausnahme, dass 20 min in dem Wasserbad erwärmt und mit entionisiertem Wasser gewaschen wird.
(c) Citrat, pH 6,2 (10 mM), gleiche Vorgehensweise wie (a)
(d) ChemMate^TM Buffer for Antigen Retrieval, Citrat, pH 6,0 (DakoCytomation, Code-Nr. S 2031), gleiche Vorgehensweise wie (a)

Nach der Antigen-Retrieval-Prozedur werden alle markierten Objektträger mit einem Deckgläschen abgdeckt und in einem Hellfeld-Mikroskop untersucht und erneut photographiert.
Alle Kombinationen von Faser, Gelformulierung, Objektträger und Antigen-Retrieval werden in Form von Doppelproben untersucht.
Die Anzahl von Punkten von jedem Faserbündel auf jedem Objektträger wird abgeschätzt, indem Photographien vor und nach dem Antigen-Retrieval verglichen werden.
In den Tabellen 1-4 sind die Ergebnisse für jede der vier Epitop-Retrieval-Prozeduren zusammengefasst.
Die Anzahl von nach der Entparaffinierung und dem Epitop-Retrieval verbleibenden Punkten wird angegeben als Näherungswerte. < 10%: Weniger als 10% der Punkte blieben erhalten. < 20%: Weniger als 20% der Punkte blieben erhalten. > 20%: Mehr als 20% der Punkte blieben erhalten. > 90% Mehr als 20% der Punkte blieben erhalten.
24 und 25 sind repräsentative Beispiele der Photographien, die vor und nach Entparaffinierung und Antigen-Retrieval aufgenommen wurden.
24 sind Bilder von Unifloss-Fasern, eingebettet in 2% Agarose mit 0,25% PEI, aufgelegt auf ChemMate^TM-Objektträger vor und nach Entparaffinierung und Antigen-Retrieval mit DakoCytomation-Citrat-Antigen-Retrieval-Puffer, pH 6,1, aufgenommen bei 10-facher Vergrößerung (Experiment 8 – ChemMate^TM Capillary Gap Microscope Slide in der Tabelle 2).
Die Unifloss-Fasern können als kleine Kugeln zwischen der Agarose und der Paraffin-Matrix auf dem Objektträger beobachtet werden (24A). Nach Entparaffinierung und Antigen-Retrieval können die Fasern klarer als individuelle Punkte beobachtet werden (24B).
Ungefähr 50-60% der individuellen Punkte blieben nach Entparaffinierung und Antigen-Retrieval an den Objektträger angeheftet.
25 sind Bilder von LP-Fasern, eingebettet in 2% Agarose mit 0,25% PEI, aufgelegt auf Poly-L-lysin-Objektträger vor und nach Entparaffinierung und Antigen-Retrieval unter Verwendung von Puffer mit hohem pH (DakoCytomation, Code-Nr. S 3308), aufgenommen bei 10-facher Vergrößerung. (Experiment 20 – Poly-L-lysin-Objektträger in Tabelle 1).
Mehr als 90% der individuellen Punkte blieben nach Entparaffinierung und Antigen-Retrieval an den Objektträger angeheftet.
Der Schatten auf der linken Seite auf 25A ist die Kante der Paraffinplatte und interferiert mit der Abschätzung der Anzahl von Fasern in dem Bündel nicht.
Aus den Tabellen kann ersehen werden, dass ein Epitop-Retrieval bei hohem pH (DakoCytomation, Code-Nr. S 3308, pH 9,9) im Allgemeinen für das Referenzmaterial am härtesten ist, nahezu unabhängig von dem Fasertyp.
Der Einfluss der Agarosegel-Formulierung weist stark darauf hin, dass 2% Agarose mit 0,25% PEI den anderen drei Formulierungen weit überlegen ist. 4% Agarose ist besser als 2% Agarose und 2% Agarose mit 0,25% PVA.
Allgemein sind die am besten funktionierenden Objektträger in diesen Experimenten Poly-L-lysin-Objektträger, die besser als ChemMate^TM und Superfrost-Objektträger sind, die beide besser als die Silan-beschichteten Objektträger sind.
Es ist etwas überraschend, dass die individuellen Punkte nach dem Antigen-Retrieval-Verfahrensschritt im Allgemeinen an die Objektträger angeheftet bleiben.
Es ist darüber hinaus überraschend, dass die Kombination von z.B. 2% Agarose mit PEI, Lysinbeschichteten Objektträgern und den härtesten Antigen-Retrieval-Bedingung es der Hauptmenge der Punkte erlaubt, an den Objektträger angeheftet zu bleiben.
Im Vergleich ist es nicht ungewöhnlich, dass 50% von natürlichen Zellen während des Antigen-Retrieval von den Objektträgern herunterfallen.
Tabelle 1. Der geschätzte Prozentsatz von Fasern, die an die Objektträger nach Entparaffinierung und Epitop-Retrieval bei hohem pH unter Verwendung von DakoCytomation, Code-Nr. S 3308 (pH 9,9) angeheftet blieben, für die verschiedenen Gelformulierungen, Objektträger und Fasern: Unifloss (Experiment Nr. 1-4), LP-floss (Experiment Nr. 17-20) und Lagertun (Experiment-Nr. 33-36).
Tabelle 2. Der geschätzte Prozentsatz von Fasern, die an die Objektträger nach Entparaffinierung und Antigen-Retrieval unter Verwendung von DakoCytomation, Code-Nr. S 1700 (pH 6,1) angeheftet blieben, für die verschiedenen Gelformulierungen, Objektträger und Fasern: Unifloss (Experiment Nr. 5-8), LP-floss (Experiment Nr. 21-24) und Lagertun (Experiment-Nr. 37-40).
Tabelle 3. Der geschätzte Prozentsatz von Fasern, die an die Objektträger nach Entparaffinierung und Antigen-Retrieval unter Verwendung von 10 mM Citratpuffer, pH 6,2, angeheftet blieben, für die verschiedenen Gelformulierungen, Objektträger und Fasern: Unifloss (Experiment Nr. 9-12), LP-floss (Experiment Nr. 25-28) und Lagertun (Experiment-Nr. 41-44).
Tabelle 4. Der geschätzte Prozentsatz von Fasern, die an die Objektträger nach Entparaffinierung und Antigen-Retrieval unter Verwendung von Citratpuffer, pH 6,0 (DakoCytomation, Code-Nr. 2031), angeheftet blieben, für die verschiedenen Gelformulierungen, Objektträger und Fasern: Unifloss (Experiment Nr. 13-16), LP-floss (Experiment Nr. 29-32) und Lagertun (Experiment-Nr. 45-48).
Beispiel 8. Herstellung und Immunfärbung von IgG-Referenzmaterial
Das Beispiel veranschaulicht die Verwendung von CDI-aktivierten und mit IgG oder mit biotinyliertem IgG modifizierten Fasern als Kontrolle für die Funktion des Visualisierungssystems.
Die Fasern werden mit Carbonyldiimidazol funktionalisiert. Das resultierende reaktive Imidazolcarbamat, das an den Fasern eingeführt wird, wird verwendet, um direkt Kaninchen-IgG oder biotinyliertes Kaninchen-IgG zu koppeln. Die Fasern werden mit Envision/DAB plus immunvisualisiert. Detaillierter:
20 cm lange Stücke von Lagertun-Fasern werden mit trockenem DMF (Aldrich Chemical Co., getrocknet über 4 A-Molekularsieben) gewaschen, gefolgt von Waschen in DMF:Aceton (1:1, Aldrich Chemical Co., Aceton getrocknet über festem Kaliumcarbonat) für 5 min.
Jede Faser wird in einem geschlossenen Behälter 60 min bei Raumtemperatur mit 1,0 ml einer frisch hergestellten Carbonyldiimidazol-Lösung (CDI, Aldrich Chemical Co., Kat.Nr. 11, 553-3, 10% (Gew./Vol.), 1:1 DMF:Aceton) sanft geschüttelt.
IgG oder biotinyliertes IgG (Kaninchen-IgG, DakoCytomation x0936, biotinyliertes Kaninchenanti-Maus-IgG, E0354) wird gegen 0,10 M NaCl mit (10 kDa Molekulargewichtsausschluss (MwCO), 3 ml:1000 ml, 4 Wechsel) dialysiert, bevor auf 12,5 bzw. 8,0 g/l aufkonzentriert wird.
Die Fasern werden aus dem CDI-Reaktionsbehälter genommen, überschüssige Flüssigkeit wird auf einem Papierfilter entfernt und sie werden direkt in Lösungen von IgG oder biotinyliertem IgG transferiert, bevor Carbonatpuffer zugesetzt wird (insgesamt 5 g/l IgG, 0,10 M NaCl, 50 mM Carbonat, pH 9,0) und über Nacht (17 h) bei Raumtemperatur sanft geschüttelt wird.
Jegliche verbleibenden aktiven Gruppen werden durch Waschen mit Ethanolamin (10 mM Ethanolamin, 50 mM Carbonat, pH 9,0) 6 h gequencht.
Parallel dazu werden Fasern ohne Zugabe von CDI behandelt.
Die modifizierten Fasern werden aus den Behältern entfernt, überschüssige Flüssigkeit wird auf einem Papierfilter entfernt und die Fasern werden einmal in Wasser gewaschen und bei 2-8°C aufbewahrt, bevor sie gemäß der allgemeinen Vorgehensweise mittels Formaldehyd fixiert, in Agarose eingebettet, dehydratisiert, in Paraffin eingebettet, geschnitten und auf Polylysin-beschichtete Objektträger aufgelegt und entparaffiniert werden.
Einige der Objektträger werden einer 40-minütigen Antigen-Retrieval-Prozedur bei 95°C unter Verwendung von DakoCytomation S 1700AR-Puffer unterzogen.
Die Objektträger mit unmodifizierten Fasern oder mit IgG modifizierten Fasern werden gefärbt, indem zuerst mit Genosys-Puffer blockiert wird, dreimal mit TBS-Puffer gewaschen wird, mit Chemmate-Peroxidase-Blockierungspuffer (DakoCytomation S2023) blockiert wird, dreimal mit TBS-Puffer gewaschen wird und mit Envision dual link (DakoCytomation K5007, gegen Maus- und Kaninchen-IgG) oder Envision anti mouse (DakoCytomation K4001, gegen Maus-IgG) inkubiert wird, dreimal mit TBS gewaschen wird, 10 min mit DAB inkubiert wird, gefolgt von einem dreimaligen Waschen mit TBS und einmaligem Waschen mit Leitungswasser. Die Objektträger werden mit Deckgläschen abgedeckt und unter dem Mikroskop inspiziert. Alle der obigen Schritte erfolgten gemäß der allgemeinen Vorgehensweise.
Die Objektträger mit mit biotinyliertem IgG modifizierten Fasern werden durch Inkubation mit Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase (DakoCytomation P0397, in TBS 1000-fach verdünnt) anstelle der EnVision-Konjugate gefärbt.
26 sind Mikrophotographien, aufgenommen bei 40-facher Vergrößerung, die die DAB-Färbung der Lagertun-Fasern zeigen:
Die mit Kaninchen-IgG gekoppelten und mit Kaninchen-Envision-HRP/DAB gefärbten, CDI-aktivierten Fasern (26A).
Die mit Kaninchen-IgG gekoppelten und dem Antigen-Retrieval unterzogenen und mit Kaninchen-Envision-HRP/DAB gefärbten, CDI-aktivierten Fasern (26B).
Die mit biotinyliertem Kaninchen-IgG gekoppelten und mit Streptavidin-HRP/DAB gefärbten, CDI-aktivierten Fasern (26C).
Native Fasern, behandelt ohne CDI, mit Kaninchen IgG und gefärbt mit Envision-HRP/DAB (26D).
Native Fasern, gefärbt mit Envision-HRP/DAB (26E).
Die mit Kaninchen-IgG gekoppelten, AR-behandelten und mit anti-Maus-Envision-HRP/DAB gefärbten, CDI-aktivierten Fasern (26F).
Die mit Kaninchen-IgG gekoppelten und mit Kaninchen-Envision-HRP/DAB gefärbten Lagertun-Seidenfasern ergeben eine klare Färbung, die ausschließlich an der Kante der Fasern lokalisiert ist (26A). Die Färbungsintensität beträgt ungefähr 0,5+.
Das Antigen-Retrieval der gleichen Fasern (26B) ergibt die gleiche Lokalisierung der Färbung und nur eine höhere Färbungsintensität.
Die mit biotinyliertem Kaninchen-IgG gekoppelten und mit Streptavidin-HRP/DAB gefärbten Lagertun-Seidenfasern ergeben eine klare Färbung, die ausschließlich an der Kante der Fasern lokalisiert ist (26C). Die Färbungsintensität beträgt ungefähr 0,25+.
Die ohne CDI-Aktivierung behandelten Lagertun-Fasern (26D), native Fasern (26E) und mit Kaninchen-IgG gekoppelte, AR-behandelte und mit anti-Maus-Envision-HRP/DAB gefärbte Fasern ergeben allesamt keine sichtbare DAB-Färbung. Als Schlussfolgerung ist der unspezifische Hintergrund nicht signifikant.
Die Carbonyldiimidazol-Aktivierungsmethode ermöglicht eine leichte Herstellung des Referenzmaterials. Die Modifizierung befindet sich nur an der äußeren Oberfläche der Faser.
Die beiden unterschiedlichen Visualisierungssysteme (EnVision und SA-HRP) ergeben beide eine spezifische Färbung. Die Intensität ist nicht die gleiche, was auf die unterschiedlichen Ziele und die unterschiedliche Natur der Visualisierungssysteme zurückzuführen ist.
Das Beispiel veranschaulicht die Herstellung und Färbung von Referenzmaterial, das für die Verifizierung der Funktionalität des sekundären oder indirekten Immunvisualisierungssystems nützlich ist.
Beispiel 9: Herstellung und Immunfärbung von Her2-Referenzmaterial
Das Beispiel veranschaulicht die Herstellung und Immunfärbung von mit HER2-Peptid modifizierten Fasern als Kontrolle für die Funktion des primären Antikörpers und des Visualisierungssystems. Das Zielpeptid ist an einen Aminolinker durch ein chemoselektives heterobifunktionelles Vernetzungsmittel gekoppelt.
Detaillierter:
Die Fasern werden modifiziert, wobei die primären Aminogruppen an einen Linker gebunden werden durch Umsetzung zunächst mit Hexandiisocyanat, gefolgt von einer Hydrolyse.
Die Aminogruppe wird mit GMBS funktionalisiert, gefolgt von einem Koppeln des Thiol enthaltenden Peptids. Die Fasern werden mit dem HercepTest^TM-Visualisierungssystem immunvisualisiert.
Sogar noch detaillierter:
6 Stücke von 20 cm langen Stücken von jeder Faser, Lagertun, LP floss und Unifloss, werden mit trockenem DMSO (Aldrich Chemical Co., getrocknet über 4 A-Molekularsieben) gewaschen und 3 h stehen gelassen, um in DMSO zu quellen.
Die Fasern werden mit einer 1,6-Hexandiisocyanat-Lösung (HDI, Aldrich Chemical Co., D12, 470-2, 10% (Gew./Vol.) in DMSO) über Nacht bei Raumtemperatur behandelt, während sie sanft geschüttelt werden.
Die Fasern werden zweimal in DMSO gewaschen, bevor die Isocyanatgruppen hydrolysiert werden, indem die Fasern über Nacht mit einer DMSO/Wasser-Lösung (1:1) bei Raumtemperatur behandelt werden. Die Fasern werden in DMSO gewaschen und in Wasser bei 2-8°C aufbewahrt, bevor sie an Peptid gekoppelt werden.
Die an den Aminogruppen modifizierten Fasern werden auf Filterpapier teilweise getrocknet, bevor sie mit einer N-Succinimidyl-4-maleimidobutyrat-Lösung (10 mM GMBS, Pierce, Kat. Nr. 22309, 10 mM Dipropylethylamin, DIPEA, Aldrich, DMSO) 120 min bei Raumtemperatur behandelt werden, wobei sie sanft geschüttelt werden
Die Fasern werden aus dem Reaktionsgefäß entnommen und überschüssiges Lösemittel mit Filterpapier entfernt. Die modifizierten Fasern werden zweimal mit DMSO gewaschen, bevor das Peptid an die gegenüber Thiolgruppen reaktive Maleimidogruppe gekoppelt wird.
Als negative Kopplungskontrolle werden Fasern parallel dazu ohne Zugabe von GMBS behandelt.
Eine frisch hergestellte Her2-Peptid-Lösung wird zu jeder Faser hinzugesetzt (insgesamt 0,10 g Peptid/ml, 5 mM EDTA, 500 mM HEPES, 30% DMSO, pH 8,0) und 60 min bei Raumtemperatur sanft geschüttelt.
Das Her2-Peptid wird von Neosystems (Strasbourg, T-16-C-SP991729E) erhalten, ist ein 16 Aminosäuren-Peptid (1678 Da) mit Cystein am C-Terminus und enthält ein HER2-Peptidmotiv, das von dem DakoCytomation-HercepTest^TM-Kit erkannt wird.
Überschüssige reaktive Gruppen werden durch Schütteln mit Ethanolamin (100 mM, 100 mM HEPES, pH 8,0) für 10 min gequencht.
Die Fasern werden zweimal mit einem HEPES-Puffer (100 mM, pH 8,0) gewaschen und bei 2-8°C aufbewahrt, bevor sie in Agarose mit 0,05% PEI eingebettet, fixiert, dehydratisiert, in Paraffin eingebettet, geschnitten und auf Polylysin-Objektträger aufgebracht werden, wie in den vorherigen Beispielen beschrieben.
Die Hälfte der Objektträger wird einem Antigen-Retrieval unter Verwendung von S1700 für 40 min (DakoCytomation) unterzogen.
Alle Objektträger werden gemäß den Anweisungen in dem Herceptest^TM-Kit (DakoCytomation K5205) gefärbt.
Kurz zusammengefasst, werden die Objektträger mit Kaninchen-anti-HER2 inkubiert, gefolgt von einer Inkubation mit einem Envision HRP-anti-Kaninchen-Visualisierungssystem unter Verwendung von DAB als Chromogen.
Parallel dazu werden native Fasern und nicht mit GMBS behandelte Fasern gefärbt.
27 zeigt Mikrophotographien der gefärbten Objektträger, aufgenommen bei 40-facher Vergrößerung.
27A bis 27E zeigen HER2-modifizierte LP-floss (A), Unifloss- (B) und Lagertun-Fasern (C), HER2-modifizierte Unifloss-Fasern mit Antigen-Retrieval (D) und HER2-modifizierte Lagertun-Fasern mit Antigen-Retrieval (E).
27F ist eine negative Kopplungskontrolle unter Verwendung von nicht-aktivierten Lagertun-Fasern, die parallel behandelt wurden.
27G bis 27I zeigen negative primärer Antikörper-Kontrollen von HER2-modifizierten LP-floss (G), Unifloss- (H)- und Lagertun-Fasern (I).
Die nativen und unmodifizierten Fasern zeigten keinerlei Färbung.
27J zeigt die gefärbten 0, 1+ und 3+-Kontrollzelllinien, die in dem HercepTest^TM-Kit enthalten sind, aufgenommen bei 10-facher Vergrößerung.
Alle drei Fasertypen ergeben eine deutliche DAB-Färbung, die an der Kante der Fasern lokalisiert ist.
(27A-C). Die Färbungsintensität beträgt ungefähr 1,0+.
Ein Antigen-Retrieval (Antigengewinnung) der gleichen HER2-modifizierten Unifloss- und Lagertun-Fasern (27D und 27E) ergibt die gleiche Lokalisation der Färbung und eine höhere Färbungsintensität. Einige der indivuellen Punkte sind nach der AR-Behandlung von den Objektträgern abgefallen.
Die negative Kopplungskontrolle, negativer primärer Antikörper und native Fasern (27F-27I) ergaben keinerlei Färbung, was einen sehr geringen allgemeinen Hintergrund anzeigt.
Die erhaltene Färbungsintensität ist von praktischem Nutzen, da Färbungsschwellenwerte zwischen 0,5 und 1,5+ typischerweise von diagnostischer Relevanz sind.
Durch Vergleich mit den Referenzzellen kann ersehen werden, dass das Referenzsystem der Erfindung in Bezug sowohl auf die Lokalisierung der Färbung als auch die Färbungsintensität gleichförmiger zu sein scheint.
Als Schlussfolgerung erlaubten die HDI-Aktivierung und ein chemoselektives Kopplungsverfahren die Herstellung von das HER2-Peptid enthaltendem Referenzmaterial. Die Färbung ist hauptsächlich an der äußeren Oberfläche der Faser lokalisiert.
Das Beispiel veranschaulicht die Herstellung und Färbung von Referenzmaterial, das für die Verifizierung der Funktionalität des Immunvisualisierungssystems nützlich ist.
Beispiel 10. Herstellung und Immunfärbung von abgestuftem Her2- und P16-Referenzmaterial
Das Beispiel veranschaulicht die Herstellung und abgestufte Immunfärbung von mit dem HER2-Peptid und dem p16-Peptid modifizierten Fasern als Kontrolle für z.B. die Funktion des primären Antikörpers und des Visualisierungssystems.
Mischungen der beiden Peptide werden durch ein chemoselektives heterobifunktonelles Vernetzungsmittel an einen Aminolinker gekoppelt.
20 cm lange Stücke von durch Maleimidogruppen modifizierten Unifloss-Fasern werden wie in Beispiel 9 hergestellt. Kurz zusammengefasst, werden die Fasern mit HDI behandelt, hydrolysiert und mit GMBS umgesetzt.
Als negative Kopplungskontrolle werden Fasern parallel dazu ohne Zugabe von GMBS behandelt.
Eine Anzahl von frisch hergestellten HER2-p16-Peptid-Mischungen (wird) hergestellt (insgesamt 0,20 g Peptid/ml, 5 mM EDTA, 100 mM HEPES, 30% DMSO, pH 8,0, 1000 Mikroliter), gemäß dem Schema:

a) 0,20 g/l Her2-Peptid + 0,00 g/l p16-Peptid
b) 0,19 g/l Her2-Peptid + 0,01 g/l p16-Peptid
c) 0,15 g/l Her2-Peptid + 0,05 g/l p16-Peptid
d) 0,10 g/l Her2-Peptid + 0,10 g/l p16-Peptid
e) 0,05 g/l Her2-Peptid + 0,15 g/l p16-Peptid
f) 0,01 g/l Her2-Peptid + 0,19 g/l p16-Peptid
g) 0,00 g/l Her2-Peptid + 0,20 g/l p16-Peptid

Die frisch hergestellten HER2-p16-Peptid-Mischungen werden zu jeder Faser hinzugegeben und 60 min bei Raumtemperatur sanft geschüttelt.
Das Her2-Peptid wird von Neosystems (Strasbourg, T-16-C-SP991729E) erhalten, ist ein 16 Aminosäuren-Peptid (1678 Da) mit Cystein am C-Terminus und enthielt ein HER2-Peptidmotiv, das von dem DakoCytomation-HercepTest^TM-Kit erkannt wird.
Das p16-Peptid wird durch Festphasen-Peptidsynthese unter Verwendung einer Boc/TFA-Strategie synthetisiert, durch HPLC gereinigt und durch MALDI-TOF-Analyse identifiziert. Das 17 Aminosäuren-Peptid (2114 Da) enthält Cysteinamid am C-Terminus, ein Fluorescein am Aminoterminus und ein Peptidmotiv, das von dem DakoCytomation-CINtec^TMp16-INK4-Histology Kit erkannt wird.
Überschüssige reaktive Gruppen werden durch Schütteln mit Ethanolamin (100 mM, 100 mM HEPES, pH 8,0) für 10 min gequencht.
Die Fasern werden zweimal mit einem HEPES-Puffer (100 mM, pH 8,0) gewaschen und bei 2-8°C aufbewahrt, bevor sie in Agarose mit 0,05% PEI eingebettet, fixiert, dehydratisiert, in Paraffin eingebettet, geschnitten und auf Polylysin-Objektträger aufgebracht werden, wie in den vorherigen Beispielen beschrieben.
Alle Objektträger werden gemäß den Anweisungen in dem Herceptest^TM-Kit (DakoCytomation K5205) und dem CINtec^TMp16-INK4-Histology Kit (DakoCytomation K5334) mit Ausnahme des Antigen-Retrieval-Schritts gefärbt.
Kurz zusammengefasst, werden die Objektträger mit Kaninchen-anti-HER2 oder Maus-anti-p16-Antikörper inkubiert, gefolgt von einer Inkubation mit einem Envision HRP-anti-Kaninchen/Maus-Visualisierungssystem unter Verwendung von DAB als Chromogen.
Parallel dazu werden native Fasern und nicht mit GMBS behandelte Fasern gefärbt und negative Kontroll-Antikörper- und Visualisierungsfärbungen werden als Kontrollen verwendet.
Auch die in dem Herceptest^TM enthaltenen Referenzzelllinien werden nach Antigen-Retrieval gemäß der Prozedur gefärbt.
28 zeigt Mikrophotographien der HER2-gefärbten Objektträger, aufgenommen bei 40-facher Vergrößerung.
28A, B, C, D, E und F sind Mikrophotographien der HER2-gefärbten Objektträger, hergestellt unter Verwendung von 0,20; 0,19; 0,15; 0,10; 0,05 bzw. 0,01 g/l HER2-Peptid.
28G ist die Kopplungskontrolle, d.h. der Objektträger ohne HER2-Peptid und nur mit 0,20 g/l p16.
28H ist die Kopplungskontrolle, hergestellt ohne Zugabe von GMBS oder Peptiden.
28I ist die hinsichtlich des primären Antikörpers negative Kontrolle unter Verwendung von Nonsense-Kanichen-Antikörper (DakoCytomation K5205).
28J ist die native unmodifizierte Faser-Kontrolle.
28K ist die hinsichtlich des sekundären Visualisierungssystems negative Kontrolle unter Verwendung von anti-Maus-IgG Envision HRP (DakoCytomation K4006).
28L, M und N sind die in dem Herceptest^TM enthaltenen gefärbten Referenzzellen mit 0+, 1+ bzw. 3+-Zellen.
Der Objektträger mit nur p16-Peptid und keinem Her2-Peptid (28G) ergibt keine oder eine nicht signifikante Färbung.
Die Objektträger mit abgestuften Konzentrationen von Her2-Ziel (28A-F) ergeben eine deutliche DAB-Färbung, die hauptsächlich an der Kante der Fasern lokalisiert ist.
Die Färbungsintensität beträgt ungefähr 1,5+; 1,5+; 1,5+, 1,0-1,5+; 1,0+ bzw. 0,5+.
Die negativen Kontroll-Objektträger ohne GMBS-Aktivierung, mit primärem Nonsense-Antikörper, nativen Fasern und sekundärem Nonsense-Visualisierungssystem, 28H, I, J und K, zeigen keine sichtbare DAB-Färbung, was einen sehr niedrigen allgemeinen Hintergrund anzeigt.
29 zeigt Mikrophotographien der p16-gefärbten Objektträger, aufgenommen bei 40-facher Vergrößerung.
29A ist die Kopplungskontrolle, d.h. der Objektträger ohne p16-Peptid und nur mit 20 g/l HER2.
29B, C, D, E, F und G zeigen Mikrophotographien der p16-gefärbten Objektträger, die unter Verwendung von 0,01; 0,05; 0,10; 0,15; 0,19 bzw. 0,20 g/l p16-Peptid hergestellt worden sind.
29H ist eine Kopplungskontrolle, die ohne Zugabe von GMBS hergestellt worden ist.
29I ist die hinsichtlich des primären Antikörpers negative Kontrolle unter Verwendung von Nonsense-Kanichen-Antikörper (Teil des CINtec^TM p16-INK4-Histology Kit).
29J ist die native unmodifizierte Faser-Kontrolle.
29K ist die hinsichtlich des sekundären Visualisierungssystems negative Kontrolle unter Verwendung von anti-Kaninchen-IgG Envision HRP (DakoCytomation 4003).
Der Objektträger mit nur HER2-Peptid und keinem p16-Peptid (29A) ergibt keine oder eine nicht signifikante Färbung.
Die Objektträger mit abgestuften Konzentrationen von p16-Ziel (29B-G) ergeben eine deutliche DAB-Färbung, die hauptsächlich an der Kante der Fasern lokalisiert ist.
Die Färbungsintensität beträgt ungefähr 0-0,5+; 1,0+; 1,0-1,5+; 1,5-2,0+; 1,5+ bzw. 1,5+.
Bei einigen auf den p16-Objektträgern konnte eine gewisse unspezifische Färbung außerhalb der Fasern beobachtet werden. Dies könnte auf eine Haftung von Konjugat oder Antikörpern an ausgetrockneten Agaroseresten zurückzuführen sein. Die Färbung auf den Objektträgern kann leicht von der DAB-Färbung in der Agarose-Matrix unterschieden werden.
Die negativen Kontroll-Objektträger ohne GMBS-Aktivierung, mit primärem Nonsense-Antikörper, nativen Fasern und sekundärem Nonsense-Aktivierungssystem, 29H, I, J und K, ergeben keine sichtbare Färbung, was einen sehr geringen allgemeinen Hintergrund anzeigt.
Das Beispiel veranschaulicht die Herstellung und Färbung von Referenzmaterial, das für die Verifizierung der Funktionalität des Immunvisualisierungssystems nützlich ist.
Die erhaltene Färbungsintensität ist von praktischem Nutzen, da Färbungsschwellenwerte zwischen 0,5 und 1,5+ typischerweise von diagnostischer Relevanz sind und oftmals technisch schwierig zu erhalten sind.
Es könnte angemerkt werden, dass der dynamische Bereich für die Färbung bei ungefähr 0,01 bis 0,15 g/l Peptidbereich zu sein scheint. D.h. die Färbung ist ungefähr die gleiche für die Fasern, die mit mehr als 0,15 g/l Peptid konjugiert sind. Er könnte zusammenfallen, d.h. er ist der gleiche für beide Peptide.
Die beiden Peptide schienen einander nicht zu beeinflussen. Dadurch konnte z.B. das HER2-Peptid an die Faser gekoppelt werden und als ein Nonsense-Peptid für die p16-Färbung wirken. Dies ist von Bedeutung für die Herstellung des Materials, da oftmals bevorzugt wird, während einer Konjugation im Rahmen einer Standardproduktionsverfahrensmaßnahme eine konstante Peptidkonzentration zu haben, wobei das nachfolgende gewünschte Färbungsniveau durch Zugabe von Nonsense-Peptid eingestellt wird.
Durch Vergleich mit den Herceptest^TM-Referenzzellen kann festgestellt werden, dass das Referenzsystem der Erfindung in Bezug auf sowohl die Lokalisierung der Färbung als auch die Intensität von dieser gleichförmiger zu sein scheint.
Als Schlussfolgerung ist es möglich, ein Referenzmaterial mit abgestuften Konzentrationen von HER2 und p16 mit sehr geringem unspezifischem Hintergrund unter Verwendung eines chemoselektiven Kopplungsschemas und von Mischungen von Cystein-funktionalisierten Peptiden herzustellen.
Beispiel 11. Herstellung und Immunfärbung von Kontrollmaterial für eine korrekte Zugabe von primärem Reagens während der Färbeprozedur
Das Beispiel veranschaulicht die Verwendung von gefärbten und Hapten-modifizierten Fasern für eine Verwendung als ein Kontrollsystem für eine korrekte Zugabe von primärer Antikörper-Lösung zu dem Objektträger.
Procion Red-modifizierte Lagertun-Fasern und DNP-modifizierte (wässrige Reaktionsbedingungen, 25 mM F-DNP) Lagertun-Fasern werden wie in Beispiel 6 und 1 hergestellt.
Die Procion Red-modifizierten Lagertun-Fasern und DNP-modifizierten Lagertun- und Unifloss-Fasern werden gebündelt und zusammen eingebettet, wie zuvor beschrieben. Der resultierende Paraffinblock enthielt rote Fasern und farblose DNP-modifizierte Fasern eng beieinander.
Die primärer Antikörper-Lösung, welche Kaninchen-anti-HER2-IgG enthält, wird mit Kaninchenanti-DNP-IgG-HRP-Konjugat (2772 ml Ra-a-Her2-IgG aus dem Herceptest^TM-Kit, DakoCytomation K5205, und 0,028 ml Ra-a-DNP-HRP, DakoCytomation 5102 versetzt.
FFPE-Mamma (Brust-)-gewebeschnitte und Schnitte aus dem Block, welche Procion Red- und DNP-modifizierte Fasern enthalten, werden auf Mikroskop-Objektträger aufgebracht. Die Fasern werden angrenzend an die Gewebeschnitte aufgebracht.
Die Objektträger werden gebacken, entparaffiniert und behandelt, wie zuvor beschrieben.
Objektträger werden gemäß den Anweisungen in dem Herceptest-Kit (DakoCytomation K5205) gefärbt mit Ausnahme der Verwendung der versetzten primärer Antikörper-Lösung anstelle der ursprünglichen HER2-Antikörperlösung.
Auch werden Objektträger genau gemäß den Anweisungen in dem Herceptest-Kit (DakoCytomation K5205) gefärbt.
Kurz zusammengefasst, werden die Objektträger mit primärer Antikörper-Lösung inkubiert, gefolgt von einer Inkubation mit einem EnVision-HRP-anti-Kaninchen-Visualisierungssystem unter Verwendung von DAB als Chromogen.
Parallel dazu werden Objektträger mit nativen Fasern gefärbt.
Auch werden Objektträger mit einem negative Antikörper-Kontrolle-Antikörper und einer negativen Kontrolle für das Visualisierungssystem gefärbt.
30A ist eine Mikrophotographie von gefärbten Objektträgern. Das DAB-gefärbte Brustgewebe sieht man auf dem unteren Abschnitt des Objektträgers. Das Faser-Referenzmaterial sieht man auf dem oberen Abschnitt des Objektträgers.
30B bis E zeigen Mikrophotographien der gleichen Objektträger, die unter Verwendung der mit anti-DNP versetzten primären Reagenzienlösung mittels des Herceptest^TM-Färbeprotokolls gefärbt worden sind.
30B und C sind die DAB-gefärbten DNP-Fasern links unten und die roten Lagertun-Fasern rechts oben, aufgenommen bei 4- bzw. 40-facher Vergrößerung.
30D und E sind das DAB-gefärbte Brustgewebe, aufgenommen bei 10-facher bzw. 4-facher Vergrößerung.
30F bis I zeigen Mikrophotographien der gleichen Objektträger, die unter Verwendung des originalen Herceptest^TM-Färbeprotokolls ohne versetztes primäres Reagens gefärbt worden sind.
30F und G sind die gefärbten DNP-Fasern links unten und die roten Lagertun-Fasern rechts oben, aufgenommen mit 4- bzw. 40-facher Vergrößerung.
30H ist das DAB-gefärbte Brustgewebe, aufgenommen bei 10-facher Vergrößerung.
30I bis L zeigt Mikrophotographien der gleichen Objektträger, die unter Verwendung des negativen Kaninchen-IgG-Antikörper-Kontrollreagens aus dem Herceptest^TM-Färbekit gefärbt worden sind.
30I sind die gefärbten DNP-Fasern links unten und die roten Lagertun-Fasern rechts oben, aufgenommen bei 40-facher Vergrößerung.
30J sind die roten Lagertun-Fasern, aufgenommen bei 10-facher Vergrößerung.
30K und L ist das DAB-gefärbte Brustgewebe, aufgenommen bei 10-facher bzw. 4-facher Vergrößerung.
30M bis N zeigen Mikrophotographien der gleichen Objektträger, die unter Verwendung von Kaninchen-anti-DNP-HRP-Konjugat (DakoCytomation K5102), 100-fach verdünnt, anstelle des Antikörper-Reagens aus dem Herceptest^TM-Färbeprotokoll gefärbt worden sind.
30M sind die gefärbten DNP-Fasern links unten und die roten Lagertun-Fasern rechts oben, aufgenommen bei 40-facher Vergrößerung.
30N ist das gefärbte Brustgewebe, aufgenommen bei 4-facher Vergrößerung.
30O bis R zeigen Mikrophotographien der gleichen Objektträger, die unter Verwendung von Maus-Envision-HRP-Visualisierungskonjugat anstelle des anti-Kaninchen-EnVision-Visualisierungsreagens in dem Herceptest^TM-Färbeprotokoll gefärbt worden sind.
30O sind die DAB-gefärbten DNP-Fasern links unten und die roten Lagertun-Fasern rechts oben, aufgenommen bei 40-facher Vergrößerung.
30P ist das DAB-gefärbte Brustgewebe, aufgenommen bei 10-facher Vergrößerung.
Figur Q sind die DAB-gefärbten roten Portion-Fasern, aufgenommen bei 10-facher Vergrößerung.
30R ist das gefärbte Brustgewebe, aufgenommen bei 4-facher Vergrößerung.
30S zeigt Mikrophotographien von mittels des Herceptest^TM gefärbten nativen Lagertun-Fasern.
30T, U und V sind Mikrophotographien von mittels des Herceptest^TM gefärbten 0+, 1+ bzw. 3+-Referenzzellen.
Indem die gefärbten Objektträger untersucht werden, kann zusammengefasst werden, dass:
Das mit anti-DNP-IgG versetzte primäre Reagens in dem Herceptest^TM färbt die DNP-Faser mit einer Intensität bis zu ungefähr 1+ und zur gleichen Zeit das Brustgewebe.
Der originale Herceptest-Färbekit färbt die DNP-Faser nicht, färbt aber das Gewebe.
Nonsense-Antikörper färbt das Brustgewebe nicht und ebenso wenig die DNP-modifizierte Faser.
Anti-DNP-HRP-IgG färbte die DNP-modifizierte Faser und nicht das Gewebe. Es färbte auch bei Verwendung des sekundären Nonsense-Visualisierungsssystems an. Dies wird erwartet, da das anti-DNP-Konjugat HRP enthielt, die ein Substrat für DAB ist.
Durch Versetzen mit einem HRP enthaltenden anti-DNP-Konjugat konnte die Wirkung des korrekten sekundärer Antikörper-Visualisierungssystem teilweise aufgehoben werden.
Der Herceptest^TM-Kit arbeitete zufrieden stellend gemäß den Referenzzellen aus dem Kit.
Die rot gefärbte Faser wird durch die unterschiedlichen Färbeprozeduren nicht beeinflusst.
Als Schlussfolgerung veranschaulicht das Beispiel die Möglichkeit, ein einfaches Kontrollmaterial für das korrekte Auftragen von korrektem primärem Reagens auf den Objektträger herzustellen.
Die rote Faser identifizierte leicht das Kontrollmaterial in diesem Beispiel. Die positive DAB-Färbung verifizierte die korrekte Zugabe von primärem Antikörper-Reagens.
Die gefärbten Fasern machen es möglich, schnell die Referenzfaser auf dem Objektträger zu finden. Man kann ins Auge fassen, dass automatisierte Bildverarbeitungssysteme die Referenzpunkte finden und überprüfen können, ob die Färbung oberhalb einer Schwellenwertintensität liegt, und dadurch die korrekte Zugabe des primären Reagens bestätigen können.
Beispiel 12. Herstellung von Bündeln von Referenzmaterial, welche verschiedene Farben und Formen enthalten.
Dieses Beispiel veranschaulicht Kombinationen einer Mehrzahl von einen Ring aufweisenden Fasern als Indikatoren für die Position auf dem Objektträger und die Form.
Unifloss-, LP-floss- und Lagertun-Fasern, die wie in Beispiel 6 mit rotem Farbstoff (Procion Red MX-5B) oder blauem Farbstoff (Cibacronblau 3 GA) modifiziert worden sind, werden mit modifizierten Fasern, mit HER2 modifizierten Fasern aus Beispiel 9 gebündelt und in Agarose mit 0,05% PEI eingebettet, fixiert, dehydratisiert, in Paraffin eingebettet, geschnitten und auf Polylysin-Objektträger aufgebracht, wie in den vorigen Beispielen beschrieben.
31A, B und C zeigen Mikrophotographien der einen roten und blauen Ring aufweisenden Unifloss-, Lagertun- und LP-floss-Fasern, aufgenommen bei 5-facher (A), 10-facher (B) und 40-facher (C) Vergrößerung.
Die verschiedenen Gestalten und Farben können klar identifiziert und voneinander getrennt werden.
Das Beispiel veranschaulicht die Möglichkeit, die gefärbten Fasern zu verwenden, um zu helfen, den Objektträger zu orientieren und ein automatisiertes Bildanalysensystem zu kalibrieren.
Beispiel 13. Herstellung und Immunfärbung von zufällig orientiertem Referenzmaterial, welches HER2-Ziel enthält.
Das Beispiel veranschaulicht die Herstellung eines Färbe-Referenzmaterials unter Verwendung von zufällig geschnittenen kurzen Fasern und von Färbekontrollen unter Verwendung eines fluoreszierenden Chromogens.
HER2-modifizierte Fasern aus Beispiel 9 werden in 2-5 mm-Stücke geschnitten und in einem kleinen Röhrchen in Agarose mit 0,05% PEI eingebettet, bevor sie fixiert, dehydratisiert, in Paraffin eingebettet, geschnitten und auf Polylysin-Objektträger aufgebracht werden, wie in den vorherigen Beispielen beschrieben.
Die Hälfte der Objektträger mit HER2-modifizierten Fasern wird unter Verwendung des Herceptest^TM gemäß den Anweisungen DAB-gefärbt.
32A und B zeigen Mikrophotographien von immungefärbten HER2-modifizierten Lagertun-Fasern, aufgenommen bei 4-facher Vergrößerung.
32C sind 4 Mikrophotographien der immungefärbten HER2-modifizierten Lagertun-Fasern, aufgenommen bei 20-facher Vergrößerung.
Die negative Antikörper-Kontrolle und negative Envision-Kontrolle zeigte keinerlei Färbung (nicht gezeigt).
Die andere Hälfte der Objektträger wird gefärbt unter Verwendung des Herceptest gemäß den Anweisungen mit Ausnahme der Verwendung von Alkaline phosphatase (AP) Envision dual link (DakoCytomation K4017) und des Fast red-Chromogens (DakoCytomation K0597). Die gefärbten Objektträger werden mit wässrigem Faramount-Eindeckmedium eingedeckt und sowohl im Hellfeld- als auch Fluoreszenz-Mikroskop untersucht.
32D und E zeigen Mikrophotographien, aufgenommen im Hellfeld-Mikroskop, von mit Fast red immungefärbten, zufällig geschnittenen, HER2-modifizierten Unifloss-Fasern, aufgenommen bei 40-facher (D) bzw. 20-facher (E) Vergrößerung.
32F und G zeigen Mikrophotographien, aufgenommen im Hellfeld-Mikroskop, von mit Fast red immungefärbten, zufällig geschnittenen, HER2-modifizierten Lagertun-Fasern, aufgenommen bei 40-facher (F) bzw. 20-facher (G) Vergrößerung.
32H und I zeigen Mikrophotographien, aufgenommen im Hellfeld-Mikroskop, von mit negativem Kontrollantikörper behandelten, mit Fast red immungefärbten, zufällig geschnittenen, HER2-modifizierten Unifloss- (H) und Lagertun (I)-Fasern, aufgenommen bei 20-facher Vergrößerung.
32J und K zeigen Mikrophotographien, aufgenommen im Hellfeld-Mikroskop, von mit Fast red immungefärbten, zufällig geschnittenen nativen Unifloss- (J) und Lagertun (K)-Fasern, aufgenommen bei 20-facher Vergrößerung.
32L und M zeigen Mikrophotographien, aufgenommen im Fluoreszenz-Mikroskop, von mit Fast red immungefärbten, zufällig geschnittenen, HER2-modifizierten Unifloss- (L) und Lagertun-Fasern (M), aufgenommen bei 40-facher Vergrößerung.
32N zeigt Mikrophotographien, aufgenommen im Fluoreszenz-Mikroskop, von mit negativem Kontrollantikörper behandelten, mit Fast red immungefärbten, zufällig geschnittenen, HER2-modifizierten Unifloss-Fasern, aufgenommen bei 40-facher Vergrößerung.
Zusammengefasst, machen die zufällig orientierten Fasern es schwieriger, die Färbungsintensität zu bestimmen.
Das Fast red-Chromogen erscheint stark und sehr deutlich an der Kante der Faser lokalisiert.
Das fluoreszierende Färbungsmuster ist ähnlich zu der DAB- und Fast red-Färbung, die im Hellfeld-Mikroskop beobachtet wird. Die Faser weisen eine gewisse Autofluoreszenz auf, die als ein blauer Schleier in der Mitte der Faser beobachtet wird.
Die negative Kontrollfärbung ergibt keine sichtbare Färbung auf der Faser. Eine gewisse schwache unspezifische Färbung kann außerhalb der Unifloss-Faser detektiert werden.
Beispiel 14. Herstellung und Hämatoxylin- und Eosin-Färbung von verschiedenem modifiziertem Referenzmaterial
Das Beispiel veranschaulicht die Färbung von verschiedenen nativen und modifizierten Fasern unter Verwendung von nicht-immunologischen Färbungen, Hämatoxylin und Eosin („HE"), welche oftmals als eine generelle Gegenfärbung verwendet werden.
Es werden verschiedene FFPE-Blöcke, die Fasern enthalten, geschnitten, aufgebracht und gefärbt:
Die nativen Fasern in FFPE-Blöcken, HDI-behandelte und hydrolysierte Faserblöcke aus Beispiel 9.
CDI-aktivierte und mit Kaninchen-IgG modifizierte LP-Floss-, Unifloss- und Lagertun-Fasern aus Beispiel 8.
DNP-gekoppelte LP-Floss-, Unifloss- und Lagertun-Fasern aus Beispiel 1 (wässrige Reaktionsbedingungen, 25 mM F-DNP).
Fluorescein-modifizierte HDI-Faser. Die Aminogruppen werden, wie oben in Beispiel 9 beschrieben, durch Behandlung mit HDI, gefolgt von einer Hydrolyse, eingeführt. Die drei unterschiedlichen aminofunktionalisierten Fasern werden zu einer Fluorescein-N-hydroxysuccinimidesterlösung (Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA, Kat.-Nr. C-1311, insgesamt 10 mM FLU-NHS, 20% DMSO, 50 mM HEPES, pH 8,0) zugesetzt und über Nacht bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Jegliche verbleibende aktive Gruppen werden durch Schütteln mit Ethanolamin für 30 min (10 mM Ethanolamin, 50 mM Carbonat, pH 9,0) gequencht. Die Fluorescein-modifizierten Fasern werden dreimal mit DMSO und Wasser gewaschen. Die Fasern werden in Wasser bei 2-8°C aufbewahrt, werden in Agarose mit 0,05% PEI eingebettet, fixiert, dehydratisiert, in Paraffin eingebettet, geschnitten und auf Polylysin-Objektträger aufgebracht, wie in den vorherigen Beispielen beschrieben.
Die die native und modifizierte Faser enthaltenden Blöcke werden geschnitten, auf Objektträger aufgelegt oder aufgebracht und entparaffiniert, wie zuvor beschrieben.
Die Objektträger werden in einen vertikalen Objektträgerhalter gesetzt und in ein Bad von filtriertem Mayers-Hämatoxylin (Bie&Bertsen, Lab00254, Roedovre, Dänemark) 5 min bei Raumtemperatur eingetaucht. Die Objektträger werden unter laufendem Leitungswasser 5 min gewaschen, bevor sie in eine frisch hergestellte Eosin-Lösung (10 ml 1% Eosin in 70%-igem Ethanol (Bie&Bertsen, Roedovre, Dänemark), gemischt mit 190 ml 70%-igem Ethanol und 3 ml 0,20 M HCl) eingetaucht werden.
Der Objektträgerhalter wird aus der Lösung entfernt und überschüssiges Reagens mit Filterpapier entfernt. Die Objektträger werden durch Behandlung in einer Reihe von Ethanolbädern und Xylol dehydratisiert (zweimal in 96% Ethanol, zweimal in 99,9% Ethanol und zweimal in Xylol).
Die Objektträger werden luftgetrocknet und mit einem permanenten Eindeckmedium (DakoCytomation S3026) eingedeckt.
Zum Vergleich wird FFPE-Brustgewebe parallel dazu mittels Hämatoxylin und Eosin gefärbt.
33 zeigt Mikrophotographien der mittels Hämatoxylin und Eosin gefärbten Objektträger, aufgenommen bei 40-facher Vergrößerung, mit Ausnahme von 33S, die bei 20-facher Vergrößerung aufgenommen worden ist.
33A, B und C sind mittels Hämatoxylin und Eosin gefärbte native LP-Floss-, Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern.
33D, E und F sind mittels Hämatoxylin und Eosin gefärbte, Hexandiisocyanat-modifizierte und hydrolysierte LP-Floss-, Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern.
33G, H und I sind mittels Hämatoxylin und Eosin gefärbte, durch Kaninchen-IgG modifizierte LP-Floss-, Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern.
33J, K und L sind mittels Hämatoxylin und Eosin gefärbte, durch Fluorescein modifizierte LP-Floss-, Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern.
33M, N und O sind mittels Hämatoxylin und Eosin gefärbte, DNP-modifizierte LP-Floss-, Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern.
33P sind mittels Procion Red modifizierte Faserbündel mit DNP-modifizierten Fasern (rechts).
33Q, R und S sind HE-gefärbtes FFPE-Brustgewebe zum Vergleich.
Allgemein ist das Färbungsmuster homogen in den Fasermaterialien verteilt.
Die Lagertun-Fasern sind verglichen mit den anderen nativen und modifizierten Fasern allesamt geringfügig mehr blau/rot gefärbt.
Es erwies sich, dass die Fluorescein-modifizierten Fasern mehr Farbe aufnehmen als die nativen oder in anderer Weise modifizierten Fasern. Dies könnte auf das sowohl hochgradig hydrophobe als auch geladene Fluorescein-Molekül zurückzuführen sein.
Allgemein ergab die Hämatoxylin- und Eosin-Färbung keine starken und lokalisierten Färbungsmuster für die verschiedenen Fasermaterialien. Dies ist hochgradig vorteilhaft, da eine Hämatoxylin- und Eosin-Färbung als eine generelle Gegenfärbung, um zu helfen, die allgemeine Morphologie zu identifizieren, verwendet wird.
Beispiel 15. Beispiele einer speziellen Färbung von verschiedenem modifiziertem Referenzmaterial
Das folgende Beispiel veranschaulicht die Färbung von verschiedenen nativen und modifizierten Fasern unter Verwendung von Beispielen von nicht-immunologischen Färbemitteln, sogenannten speziellen Färbemitteln.
Die FFPE-Blöcke aus dem vorherigen Beispiel 14, enthaltend die native und modifizierte Faser, werden geschnitten und auf Polylysin-Objektträger, wie zuvor beschrieben, aufgebracht.
Die Objektträger werden in den Artisan (Cytologix, Cambridge, MA, und DakoCytomation), ein automatisiertes Färbegerät, welches in der Lage ist, eine Mehrzahl von speziellen Färbungen auszuführen, eingespannt. Die Objektträger werden in dem Artisan-Instrument gefärbt gemäß den Anweisungen des Kits unter Verwendung von:
Periodic Acid Schift-Färbemittel (DakoCytomation, Kat.-Nr. AR165),
Alcian Blue (Alcian-Blau), pH 2,5, -Färbemittel (DakoCytomation, Kat.-Nr. AR160),
Jones Basement membrane-Färbemittel (DakoCytomation, Kat-Nr. AR180) oder
Massons Trichrome-Färbemittel (DakoCytomation, Kat.-Nr. AR173).
Nach dem Färben werden die Objektträger 5 min in 99,9% Ethanol gewaschen und zwei Stunden luftgetrocknet, bevor sie mit einem permanenten Eindeckmedium (DakoCytomation, Kat. S3026) eingedeckt und über Nacht aufbewahrt werden, bevor sie überprüft und digital photographiert werden.
34, 35, 36 und 37 sind Mikrophotographien der speziell gefärbten Objektträger, aufgenommen bei 40-facher Vergrößerung.
34A, B und C sind Periodic Acid Schiff-gefärbte native LP-Floss-, Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern.
34D, E und F sind Periodic Acid Schiff-gefärbte, mit Fluorescein modifizierte LP-Floss-, Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern.
34G, H und I sind Periodic Acid Schift-gefärbte, DNP-modifizierte LP-Floss-, Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern.
35A und B sind Alcian Blue-gefärbte native Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern.
35C, D und E sind Alcian Blue-gefärbte, mit Hexandiisocyanat modifizierte und hydrolysierte LP-Floss-, Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern.
35F, G und H sind Alcian Blue-gefärbte, mit Kaninchen-IgG modifizierte LP-Floss-, Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern.
35I, J und K sind Alcian Blue-gefärbte, mit Fluorescein modifizierte LP-Floss-, Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern.
35L, M und N sind Alcian Blue-gefärbte, DNP-modifizierte LP-Floss-, Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern.
36A und B sind Jones Basement membrane-gefärbte native Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern.
36C, D und E sind Jones Basement membrane-gefärbte, mit Hexandiisocyanat modifizierte und hydrolysierte LP-Floss-, Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern.
36F und G sind Jones Basement membrane-gefärbte, mit Kaninchen-IgG modifizierte LP-Floss-, Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern.
36H, I und J sind Jones Basement membrane-gefärbte, mit Fluorescein modifizierte LP-Floss-, Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern.
36K, L und M sind Jones Basement membrane-gefärbte, DNP-modifizierte LP-Floss-, Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern.
37A, B und C sind Massons Trichrome-gefärbte native LP-Floss-, Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern.
37D, E und F sind Massons Trichrome-gefärbte, mit Hexandiisocyanat modifizierte und hydrolysierte LP-Floss-, Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern.
37G und H sind Massons Trichrome-gefärbte, mit Kaninchen-IgG modifizierte LP-Floss-, Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern.
37I, J und K sind Massons Trichrome-gefärbte, mit Fluorescein modifizierte LP-Floss-, Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern.
37L, M und N sind Massons Trichrome-gefärbte, DNP-modifizierte LP-Floss-, Unifloss- bzw. Lagertun-Fasern.
Allgemein gibt es signifikante Unterschiede bei den Färbungsintensitäten und -verteilungen für die verschiedenen Fasern.
Das Periodic Acid Schift-Färbemittel färbte die nativen Fasern nicht viel an. Die Fluoresceinmodifizierten LP-floss- und Unifloss-Fasern haben eine deutliche rote Färbung nahe den Kanten, wohingegen die Lagertun-Faser homogener und stärker gefärbt wird.
Die DNP-modifizierten LP-floss- und Unifloss-Fasern weisen wenig oder gar keine Färbung aufgrund des Periodic Acid Schift-Färbemittels auf, wohingegen die DNP-modifizierte Lagertun-Faser eine homogene rötliche Färbung aufweist.
Das Alcian Blue (Alcian Blau)-Färbemittel färbte im Allgemeinen die gesamte Unifloss-Faser im Inneren blau und rötlich an der Kante, wohingegen die Lagertun-Faser nur schwach homogen rötlich erschien.
Die LP-floss-Faser erschien blau, mit einigen Unterschieden für die verschiedenen Modifizierungen. Die HDI- und hydrolysierte Faser erschien rötlich, wohingegen die IgG-modifizierte LP-floss-Faser blau ist.
Die mit Fluorescein modifizierte LP-floss-Faser hatte eine rötliche Färbung an der Kante und ein blaues Inneres. Das Gleiche kann sogar noch stärker bei der Fluorescein-modifizierten Unifloss-Faser festgestellt werden. Bei allen Alcian Blue-Färbungen kann zwischen den Fasern eine gewisse blaue Hintergrundfärbung beobachtet werden.
Alle Unifloss- und LP-floss-Fasern werden durch das Jones Basement membrane-Färbemittel stark rot gefärbt. Die verschiedenen Lagertun-Fasern erscheinen nur schwach rötlich.
Der blaue Hintergrund ist bei allen Jones Basement membrane-Färbungen sehr intensiv, obwohl die gesamten Fasern leicht identifiziert werden können.
Das Massons Trichrome-Färbemittel ergibt starke leuchtende rote Färbungen an allen Lagertun-Fasern, wohingegen die Unifloss- und LP-floss-Fasern überhaupt nicht gefärbt wurden. Die DNP-modifizierten Fasern werden verglichen mit den anderen Lagertun-Fasern etwas schwächer gefärbt.
Als Schlussfolgerung veranschaulicht das Beispiel die Möglichkeit, das Referenzmaterial zu verwenden
z.B. für die Verifizierung der Funktionalität von speziellen Färbemitteln. Die Natur der ursprünglichen Faser scheint für die Färbungsintensität, die Farbe und das Gesamterscheinungsbild wichtiger zu sein als die verschiedenen chemischen Modifizierungen.
Beispiel 16. Herstellung, Immunfärbung und Verwendung von zu unterschiedlichen Dicken geschnittenem Referenzmaterial
Dieses Beispiel veranschaulicht die Verwendung des Referenzmaterials für das Überwachen und das Verifizieren der Dicke der geschnittenen Schnitte.
FFPE-Blöcke, welche permanent gefärbte Fasern und DNP-modifizierte Fasern enthalten, werden an einem Mikrotom zu unterschiedlicher Dicke geschnitten, auf Objektträger aufgebracht, immungefärbt und in einem Mikroskop ausgewertet.
Detaillierter:
Wie in Beispiel 6 mit rotem Farbstoff (Procion Red MX-5B) modifizierte Unifloss- und Lagertun-Fasern werden gebündelt mit modifizierten Fasern, Lagertun- und Unifloss-Fasern aus Beispiel 6 und 1, die unter Verwendung von 25 mM DNP während der wässrigen Kopplung mit DNP modifiziert wurden, und in Agarose mit 0,05% PEI eingebettet, fixiert, dehydratisiert und in Paraffin eingebettet, wie in den vorangehenden Beispielen beschrieben.
die drei Arten von Fasern werden zusammen eingebettet, was zu Paraffinblöcken mit permanent gefärbten Fasern und ungefärbten Fasern mit kovalent gebundenem DNP-Hapten führt.
parallel dazu werden FFPE-Blöcke, welche native Unifloss- und Lagertun-Fasern enthalten, geschnitten und auf Objektträger aufgebracht.
die Blöcke werden zu 3, 5 oder 7 μm Dicke an einem Standard-Mikrotom geschnitten, bevor sie auf Polylysin-Objektträger aufgebracht werden, wie in den vorangegangenen Beispielen beschrieben. die Objektträger werden immungefärbt wie in Beispiel 4 unter Verwendung von Kaninchen-anti-DNP-HRP und anti-Kaninchen-Envision-HRP/DAB plus.
parallel dazu werden Objektträger unter Verwendung einer negativen primärer Antikörper-Kontrolle (DakoCytomation rabbit negative control, N1699) oder einer negativen sekundäres Visualisierungssystem-Kontrolle (anti-Maus-EnVision HRP/DAB plus), wie in den vorangegangenen Beispielen beschrieben, gefärbt.
die resultierenden gefärbten Objektträger werden bei 40-facher Vergrößerung betrachtet.
38 sind Mikrophotographien von Procion Red-modifizierten, zu 3 μm (a), 5 μm (B) und 7 μm (C) geschnittenen Lagertun-Fasern.
38 zeigt Mikrophotographien von anti-DNP-Envision-HRP/DAB-gefärbten, DNP-modifizierten, zu 3 μm (D), 5 μm (E) und 7 μm (F) geschnittenen Lagertun-Fasern.
38 zeigt Mikrophotographien von anti-DNP-Envision-HRP/DAB-gefärbten, DNP-modifizierten, zu 3 μm (G), 5 μm (H) und 7 μm (I) geschnittenen Unifloss-Fasern.
38 sind Mikrophotographien von zu 5 μm Dicke geschnittener nativer Unifloss-Faser (J), zu 5 μm Dicke geschnittener, nativer Lagertun-Faser (K), einer negativen primärer Antikörper-Färbung einer zu 7 μm Dicke geschnittenen, DNP-modifizierten Lagertun-Faser (L) und einer negativen Envision-Kontrollfärbung von zu 5 μm Dicke geschnittener, DNP-modifizierter Lagertun-Faser (M).
Die Färbungsintensität wird zu ungefähr 0,5-1,0+; 0,5-1,0+ und 1,0-1,5+ für die DNP-modifizierten Lagertun-Fasern (38D, E und F), geschnitten zu 3 μm (D), 5 μm (E) bzw. 7 μm (F), ermittelt. Die DNP-modifizierten Unifloss-Fasern (38G, H und I) werden mit einem Score von 0,5+; 1,0+ und 1,5+ für die zu 3 μm (G), 5 μm (H) bzw. 7 μm (I) geschnittenen Fasern bewertet. Die DNP-modifizierte Unifloss-Faser erschien geringfügig leichter einzustufen als die Lagertun-Faser.
die 38D zeigt sowohl die DAB-gefärbten Fasern als auch die permanent gefärbte Faser.
die Procion red-modifizierten Fasern sind durch die gesamte Faser hindurch homogen gefärbt und werden durch die Immunfärbung nicht beeinflusst.
die DAB-Färbung ist hauptsächlich in der Kante lokalisiert mit einer gewissen diffusen Färbung im Inneren.
Zwischen den Fasern wird ein gewisses Maß an unspezifischer Färbung festgestellt. Der Hintergrund scheint in der Agarose-Matrix lokalisiert zu sein. Einige der Mikrophotographien zeigen Fasern geringfügig außerhalb des optischen Fokus.
es sollte sich verstehen, dass die Fasern gleichförmige Längen aufweisen und dementsprechend auf die Objektträger als Säulen mit unterschiedlichen Höhen aufgebracht werden.
ein schwacher Schatten kann als ein dunkler Rand an den Fasern festgestellt werden. Je dicker der geschnittene Schnitt ist, umso besser sichtbar scheint der Schatten zu sein. Die präzipitierte DAB-Färbung wird dementsprechend leicht sichtbar lokalisiert und quantifiziert.
die negative Antikörper-Kontrolle und negative Envision-Kontrolle zeigte keinerlei Färbung.
die verschiedenen Formen und Farben können klar identifiziert und voneinander getrennt werden.
als Schlussfolgerung ist es möglich, das Referenzmaterial der Erfindung zu unterschiedlicher Dicke zu schneiden und unterschiedliche Intensitäten zu erhalten, sowohl für direkt gefärbtes Material als auch für das immungefärbte Material.
das Beispiel veranschaulicht die Möglichkeit, immungefärbte Fasern zu verwenden, um zu helfen, die Mikrotom-Schnittdicke zu verifizieren.
das Beispiel veranschaulicht ferner die Möglichkeit, die gefärbten Fasern zu verwenden, um zu helfen, den Objektträger zu orientieren und ein automatisiertes Bildanalysensystem in Hinblick auf Form, Größe und Farbe des Referenzmaterials zu kalibrieren.

Claims

Verfahren, welches folgendes umfaßt: (a) Bereitstellen eines Referenzstandards oder eines ebenen Schnitts davon, wobei der Referenzstandard folgendes umfaßt: (i) ein Trägermedium und (ii) eine Menge einer detektierbaren Einheit, die von dem Trägermedium getragen wird, wobei die detektierbare Einheit einen länglichen Pfad beschreibt, dessen Querschnittsprofil eine Größe von zwischen 0,5 μm und 100 μm hat, wobei eine vorbestimmte Menge der detektierbaren Einheit in einem definierten Bereich in einem Querschnitt des Referenzstandards vorliegt, (b) Erhalten eines ersten Referenzsignals, welches das Vorliegen oder die Menge einer detektierbaren Einheit in dem Referenzstandard, dem ebenen Schnitt davon oder dem definierten Bereich anzeigt, (c) Bereitstellen einer biologischen Probe und Erhalten eines zweiten Signals, welches das Vorliegen oder die Menge der detektierbaren Einheit in der biologischen Probe oder einer Komponente davon anzeigt, und (d) Vergleichen des in (b) erhaltenen Referenzsignals mit dem in (c) erhaltenen zweiten Signal.
Verfahren zum Erhalten einer Anzeige bezüglich des Vorliegens, der Menge oder der Konzentration einer detektierbaren Einheit in einer biologischen Probe nach Anspruch 1, wobei das Referenzsignal mit dem zweiten Signal verglichen wird, um das Vorliegen, die Menge oder die Konzentration der detektierbaren Einheit in der Probe zu bestimmen.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Referenzstandard oder der ebene Schnitt davon der oder den gleichen und vorzugsweise im wesentlichen alten Stufe(n) oder Bedingung(en) unterworfen wird wie die biologische Probe.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, wobei der Referenzstandard oder der ebene Schnitt davon durch eine oder mehrere und vorzugsweise alle der folgenden Stufen verarbeitet wird: Auflegen auf einen Objektträger, Backen, Entparaffinieren, Rehydratisieren, Antigengewinnung, Blockieren, Aussetzen an Antikörper, Aussetzen an primären Antikörper, Aussetzen an Nukleinsäuresonde, Waschen, Aussetzen an sekundäres Antikörper-Enzym-Konjugat, Aussetzen an Enzymsubstrat, Aussetzen an Chromogensubstrat und Kontrastfärbung.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die detektierbare Einheit aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem Hapten, einem biologisch aktiven Molekül, einem Antigen, einem Epitop, einem Protein, einem Palypeptid, einem Peptid, einem Antikörper, einer Nukleinsäure, einem Virus, einem virusartigen Partikel, einem Nukleotid, einem Ribonukleotid, einem Desoxyribonukleotid, einem modifizierten Desoxyribonukleotid, einem Heteroduplex, einem Nanopartikel, einem synthetischen Analogen eines Nukleotids, einem synthetischen Analogen eines Ribonukleotids, einem modifizierten Nukleotid, einem modifizierten Ribonukleotid, einer Aminosäure, einem Aminosäureanalogen, einer modifizierten Aminosäure, einem modifizierten Aminosäureanalogen, einem Steroid, einem Proteoglycan, einem Lipid, einem Kohlenhydrat, einem Farbstoff, einem diagnostisch relevanten Ziel, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Antigen, einem Epitop, einem Peptid, einem Palypeptid, einem Protein, einer Nukleinsäure oder zwei oder mehreren aus einer Mehrzahl von irgendwelchen der oben genannten oder Gemischen, Fusionen, Kombinationen oder Konjugaten von einem oder mehreren der oben genannten.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die detektierbare Einheit irgendeines oder mehrere von HER2-, ER-, PR-, p16-, Ki-67- und EGFR-Protein und diese codierende Nukleinsäuren umfaßt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, welches weiterhin die Bereitstellung eines zweiten Referenzstandards oder eines ebenen Schnitts davon, das Erhalten eines zweiten Referenzsignals, welches die Menge der detektierbaren Einheit in dem zweiten Referenzstandard, dem ebenen Schnitt davon oder dem definierten Bereich anzeigt, und das Vergleichen des in (c) erhaltenen zweiten Signals mit dem ersten Referenzsignal und dem zweiten Referenzsignal umfaßt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Vorliegen und/oder die Menge der detektierbaren Einheit durch ein Bindemittel, vorzugsweise ein markiertes Bindemittel erfaßt werden kann, welches vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem Antikörper, vorzugsweise einem Antikörper, der spezifisch an die detektierbare Einheit binden kann, einer Nukleinsäure, wie einer DNA oder einer RNA, vorzugsweise einer Nukleinsäure, die spezifisch an die detektierbare Einheit binden kann, einer Proteinnukleinsäure (PNA), einem Farbstoff, einem speziellen Färbemittel, Hämatoxylin-Eosin (H & E), Gomori-Methenaminsilber-Färbemittel (GMS), Periodic-Acid-Schiff-(PAS-) Färbemittel, Trichromblau, Massons Trichrome, Preußischblau, Giemsa, Diff-Quik, Reticulum, Kongo-Rot, Alcian-Blau, Steiner, AFB, PAP, Gram, Mucikarmin, Verhoeffvan Gieson, Elastic, Carbol-Fuchsin und Golgi-Färbemittel.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das detektierbare Signal aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Strahlung, optischer Dichte, Reflexion, Radioaktivität, Fluoreszenz und enzymatischer Aktivität.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei (a) der Referenzstandard die Form eines rechteckigen Kastens hat und die detektierbare Einheit die Form einer im wesentlichen linearen Stange hat, die entlang oder im wesentlichen parallel zu einer Längsachse des Referenzstandards angeordnet ist, (b) der definierte Bereich in wenigstens einem anderen Querschnitt des Referenzstandards vorliegt, welcher vorzugsweise eine ähnliche Menge der detektierbaren Einheit umfaßt, und (c) die detektierbare Einheit entlang des länglichen Pfades im wesentlichen einheitlich verteilt ist, oder (d) die detektierbare Einheit in allen quer geführten ebenen Schnitten des Referenzstandards in im wesentlichen demselben Bereich, derselben Menge oder Konzentration vorliegt, oder irgendeine Kombination der obigen.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Trägermedium ein Einbettungsmedium umfaßt, in welches die detektierbare Einheit eingebettet ist, wobei das Einbettungsmedium vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Eis, Wachs, Paraffin, Acrylharz, Methacrylatharz, Epoxid, Epon, Araldit, Lowicryl, K4M und LR-Weiß und Durcupan.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die detektierbare Einheit an eine längliche Faser, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Polyamidfaser, einer Zellulosefaser, einer Polycarbamatfaser, einer Seidenfaser, einer Polyesterfaser, einer Nylonfaser, einer Rayonfaser und Gemischen davon, angefügt, vorzugsweise chemisch gekoppelt ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die detektierbare Einheit sowohl an den Kern- als auch in den Oberflächenabschnitten der Faser im wesentlichen gleichnmäßig verteilt ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die detektierbare Einheit an den Oberflächenabschniten der Faser in größeren Mengen vorliegt als in den Kernabschnitten, wobei vorzugsweise die Kernabschnitte der Faser im wesentlichen keine detektierbare Einheit umfassen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die detektierbar Einheit in einem länglichen Kanal in dem Einbettungsmedium gebildet ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 15, wobei die Faser oder der Kanal im wesentlichen über ihre bzw. seine gesamte Länge hinweg eine gleichmäßige Querschnittsfläche hat, wobei die Faser oder der Kanal vorzugsweise einen Durchmesser von zwischen etwa 0,5 μm bis 25 μm, bevorzugt zwischen 1,5 μm und 15 μm hat.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei der Referenzstandard folgendes umfaßt: (a) zwei oder mehr lineare Fasern oder Kanäle in im wesentlichen paralleler Ausrichtung, vorzugsweise in einem Bündel, oder (b) zwei oder mehr verschiedene detektierbare Einheiten, von denen jede in oder auf einer einzelnen Faser oder einem einzelnen Kanal angeordnet ist, oder (c) zwei oder mehr Fasern oder Kanäle, die jeweils dieselbe detektierbare Einheit umfassen, die vorzugsweise Jeweils verschiedene Mengen der detektierbaren Einheit aufweisen, oder irgendeine Kombination der obigen.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei ein ebener Schnitt des Referenzstandards eine Mehrzahl von Bereichen umfaßt, in welchen die detektierbare Einheit in unterschiedlichen Dichten präsentiert wird.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei ein ebener Schnitt des Referenzstandards einen ersten Bereich umfaßt, welcher die detektierbare Einheit im wesentlichen in einer diagnostisch signifikanten Dichte umfaßt, und vorzugsweise weiterhin eine Kontrolle umfaßt, welche eine Faser oder einen Kanal umfaßt, die bzw. der im wesentlichen keine detektierbare Einheit umfaßt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche zum Erhalten einer Anzeige, die für die Bestimmung der Wahrscheinlichkeit einer Erkrankung oder eines Zustands in einem Individuum geeignet ist, wobei das Vorliegen der detektierbaren Einheit oder das Vorliegen einer vorbestimmten Menge der detektierbaren Einheit in der biologischen Probe die Wahrscheinlichkeit einer Erkrankung oder eines Zustands in der biologischen Probe oder in einem Individuum, von dem die Probe genommen wurde, anzeigt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die biologische Probe eine Zelle, ein Gewebe oder ein Organ, vorzugsweise eine Zelle, ein Gewebe oder ein Organ eines Organismus, von vermutet wird, daß er an einer Erkrankung oder einem Zustand leidet, umfaßt.
Verfahren zum Bereitstellen einer Anzeige, die bei der Diagnose einer Erkrankung oder eines Zustands in einem Individuum geeignet ist, wobei das Verfahren umfaßt, daß man die Menge einer detektierbaren Einheit in einer biologischen Probe von dem Individuum oder einer Komponente davon mit einem Referenzstandard in einem Verfahren gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche vergleicht, wobei angezeigt wird, daß das Individuum wahrscheinlich an der Erkrankung oder dem Zustand leidet oder dafür empfänglich ist, wenn die Menge der detektierbaren Einheit in der biologischen Probe oder der Komponente ähnlich derjenigen oder größer als diejenige in dem Referenzstandard ist.
Verfahren zum Bestimmen der Wirksamkeit oder des Erfolgs einer Maßnahme, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfaßt: (a) Bereitstellen eines Referenzstandards oder eines ebenen Schnitts davon, wobei der Referenzstandard folgendes umfaßt: (i) ein Trägermedium und (ii) eine Menge einer detektierbaren Einheit, die von dem Trägermedium getragen wird, wobei die detektierbare Einheit einen länglichen Pfad beschreibt, dessen Querschnittsprofil eine Größe von zwischen 0,5 μm und 100 μm hat, wobei eine vorbestimmte Menge der detektierbaren Einheit in einem definierten Bereich in einem Querschnitt des Referenzstandards vorliegt, und wobei eine detektierbare Eigenschaft der detektierbaren Einheit als Ergebnis der Maßnahme verändert wird, (b) Durchführen der Maßnahme an dem Referenzstandard und (c) Erfassen einer Veränderung in der detektierbaren Eigenschaft der detektierbaren Einheit.
Verfahren nach Anspruch 23 zum Feststellen der Wirksamkeit oder des Erfolgs einer an einer Probe durchgeführten Maßnahme, wobei die Maßnahme an dem Referenzstandard oder einem ebenen Schnitt, der im wesentlichen parallel zu der Probe ist, durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, wobei eine detektierbare Eigenschaft der detektierbaren Einheit als Ergebnis einer erfolgreichen Maßnahme verändert wird, wobei die Veränderung in der detektierbaren Eigenschaft der detektierbaren Einheit erfaßt wird, um festzustellen, daß die Maßnahme erfolgreich war.
Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, wobei eine detektierbare Eigenschaft der detektierbaren Einheit als Ergebnis einer nicht erfolgreichen Maßnahme verändert wird, wobei die Veränderung in der detektierbaren Eigenschaft der detektierbaren Einheit erfaßt wird, um festzustellen, daß die Maßnahme nicht erfolgreich war.
Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 26, wobei die Maßnahme aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einer in situ-Hybridisierungsmaßnahme, einer immunohistochemischen Maßnahme, Entparaffinierung, Antigengewinnung, Blockieren, endogener Biotin-Blockierung, endogener Enzymblockierung, einer Waschstufe, Inkubation mit einem Aufdeckungsmittel, wie einem primären Antikörper, Inkubation mit sekundären Visualisierungskomponenten, Chromogenfärbung, Gewinnung von Färbungsinformationen und Analyse.
Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 27, wobei die Maßnahme eine Antigengewinnungsmaßnahme ist und wobei die detektierbare Eigenschaft der detektierbaren Einheit das Maskieren oder Demaskieren eines oder mehrerer Epitope umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 27, wobei die detektierbare Einheit in dem Referenzstandard modifiziert wird, um ein oder mehrere Epitope zu maskieren, von denen einige oder alle in einer erfolgreichen Antigengewinnungsmaßnahme demaskiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 27, wobei die Maßnahme eine Entparaffinierungsmaßnahme ist und wobei die detektierbare Eigenschaft der detektierbaren Einheit das Vorliegen oder die Menge der detektierbaren Einheit in dem Referenzstandard nach der Entparaffinierungsmaßnahme umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 27, wobei die detektierbare Einheit in dem Referenzstandard in dem Entparaffinierungsmedium löslich ist und wobei wenigstens ein Teil der und vorzugsweise die gesamte detektierbare Einheit im Anschluß an eine erfolgreiche Entparaffinierungsmaßnahme entfernt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 27, wobei die Wirksamkeit oder der Erfolg zweier oder mehrerer Maßnahmen vorzugsweise parallel bestimmt wird.
Verwendung eines Referenzstandards zur Validierung einer Maßnahme, wobei der Referenzstandard folgendes umfaßt: (i) ein Trägermedium und (ii) eine Menge einer detektierbaren Einheit, die von dem Trägermedium getragen wird, wobei die detektierbare Einheit einen länglichen Pfad beschreibt, dessen Querschnittsprofil eine Größe von zwischen 0,5 μm und 100 μm hat, wobei eine vorbestimmte Menge der detektierbaren Einheit in einem definierten Bereich in einem Querschnitt des Referenzstandards vorliegt und wobei eine detektierbare Eigenschaft der detektierbaren Einheit als Ergebnis der Maßnahme verändert wird.
Verwendung nach Anspruch 33, wobei der Referenzstandard als ein Validierungsstandard für die Antigengewinnung, ein Entparafinierungsstandard, ein Validierungsstandard für die Blockierung, ein Validierungsstandard für das Waschen, ein Validierungsstandard für primäre Antikörper, ein Validierungsstandard für sekundäre Antikörper, ein Kalibrierungsstandard oder ein diagnostischer Standard verwendet wird.
Kit, welcher einen Referenzstandard oder einen ebenen Schnitt davon zusammen rr it Anweisungen für die Verwendung in einem Verfahren gemäß einem der varangegangenen Ansprüche umfaßt, wobei der Referenzstandard folgendes unmfaßt: (i) ein Trägermedium und (ii) eine Menge einer detektierbaren Einheit, die von dem Trägermedium getragen wird, wobei die detektierbare Einheit einen länglichen Pfad beschreibt, dessen Querschnittsprofil eine Größe von zwischen 0,5 μm und 100 μm hat, wobei eine vorbestimmte Menge der detektierbaren Einheit in einem defnieren Bereich In einem Querschnitt des Referenzstandards vorliegt.
Kit nach Anspruch 35, welcher weiterhin ein Bindemittel umfaßt, welches spezfisch an die detektierbare Einheit binden kann, wobei das Bindemittel ein Signal erzeugt, welches das Vorliegen oder die Menge der detektierbaren Einheit in dem Referenzstandard, dem ebenen Schnitt davon oder dem definierten Bereich anzeigt.
Diagnostischer Kit zum Detektieren eines diagnostisch relevanten Vorliegens oder der Menge einer detektierbaren Einheit in einer biologischen Probe, wobei der diagnostische Kit einen Kit nach Anspruch 35 oder 36 umfaßt.
Kit oder diagnostischer Kit nach einem der Ansprüche 35 bis 37 zusammen mit einem therapeutischen Mittel, welches wenigstens eines der Symptome einer Erkrankung oder eines Zustands in einem Individuum behandeln oder lindem kann, und der vorzugsweise einen Antikörper geger die detektierbare Einheit umfaßt.
Satz von zwei oder mehreren ebenen Schnitten, die jeweils von einem Referenzstandard erhalten wurden, wobei der Referenzstandard folgendes umfaßt: (i) ein Trägermedium und (ii) eine Menge einer detektierbaren Einheit, die von dem Trägermedium getragen wird, wobei die detektierbare Einheit einen länglichen Pfad beschreibt, dessen Querschnittsprofil eine Größe von zwischen 0,5 μm und 100 μm hat, wobei eine vorbestimmte Menge der detektierbaren Einheit in einem definierten Bereich in einem Querschnitt des Referenzstandards vorliegt, wobei wenigstens zwei ebene Schnitte in dem Satz eine unterschiedliche Menge der detektierbaren Einheit umfassen.
Satz von zwei oder mehreren ebenen Schnitten, welche einen definierten Bereich umfassen, der eine detektierbare Einheit aufweist, wobei die Menge der detektierbaren Einheit in dem definierten Bereich zwischen wenigstens zweien der ebenen Schnitte in dem Satz unterschiedlich ist, wobei jeder ebene Schnitt von einem Referenzstandard erhalten wurde, welcher folgendes umfaßt: (i) ein Trägermedium und (ii) eine Menge einer detektierbaren Einheit, die von dem Trägermedium getragen wird, wobei die detektierbare Einheit einen länglichen Pfad beschreibt, dessen Querschnittsprofil eine Größe von zwischen 0,5 μm und 100 μm hat.