DE60124376T2

DE60124376T2 - Funktionalisierter festträger zur organischen synthese von peptiden und kleinen molekülen

Info

Publication number: DE60124376T2
Application number: DE60124376T
Authority: DE
Inventors: c/o Central Drug Research Institute Wahajul Lucknow 226 001 HAQ; c/o Central Drug Research Inst. Seturam B Lucknow 226 001 KATTI
Original assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Current assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Priority date: 2001-01-04
Filing date: 2001-01-04
Publication date: 2007-09-06
Anticipated expiration: 2021-01-05
Also published as: CN1300168C; DK1263800T3; CN1366539A; EP1263800B1; JP2004513191A; US20020147297A1; WO2002053606A1; AU2001234056B2; US6492460B2; DE60124376D1; EP1263800A1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen festen Träger auf der Basis eines Linkers zur Verwendung bei der Peptidsynthese und kombinatorischen Bibliotheksynthese, Verfahren zur Herstellung des Linkeranteils auf dem festen Träger und Verfahren zur Verwendung der Träger für die Synthese von Peptiden und kombinatorischen Bibliotheken kleiner Moleküle. Der neue erfindungsgemäße feste Träger umfasst auch einen funktionalisierten Linker, der kovalent an die festen Träger gebunden ist, wie Polystyrol.
STAND DER TECHNIK
Die schnelle Entwicklung der Festphasensynthese verlangt die Entwicklung von neuen und vielseitig verwendbaren festen Trägern, um die neueren Syntheseprobleme zu lösen. Feste Träger für die Synthese von Peptiden sind seit langem gut bekannt und heute ist sogar die direkte Synthese von cyclischen Peptiden, Peptidamiden, Peptidaldehyden usw. auf dem Träger möglich [(a) Barany, G. et al., Int. J. Peptide protein Res. 30, 705-739, 1987; (b) Fields, G. B. et al., Int. J. Peptide protein Res. 35, 161-214, 1990, (c) Lloyd-Williams, P. et al., Tetrahedron, 49, 11065-11133, 1993 (d) Wang, S. S., J. Amer. Chem. Soc. 95, 1328, 1973 (e) Barlos, K, et al., Tetrahedron Letters, 30, 3947, 1989 (f) Beebe, X. et al., J. Org. Chem., 60, 4204, 1995 (g) Rink, H., Tetrahedron Letters, 28, 3787, 1987 (h) Rapp, W et al., in "Peptides 1988", Proc. 20th European Peptide Symposium, Jung G. und Boyer E. (Hrsg.), Walter de Gruyter, Berlin, S. 199, 1989]. Ferner verlangt die Synthese kleiner organischer Moleküle ein vielseitiger einsetzbares und breites Spektrum fester Träger. Aus der Literatur sind eine Anzahl von Trägern mit einer Vielfalt von funktionellen Gruppen zum Binden von Synthonen sowie deren Stabilität und Empfänglichkeit gegenüber den verwendeten synthetischen Reagenzien und Versuchsbedingungen bekannt [Oesapay, G., et al., in Peptides Chemistry, Structure and Biology, Proc. 13th American Peptide Symposium", Hodges, R. S. und Smith J. A. (Hrsg.), ESCOM, Leiden, S. 435, 1994, (b) Hermkens, P. X. H. et al. Tetrahedron, 52, 4527, 1996 (c) Hermkens, P. H. H. et al., Tetrahedron, 53, 5643, 1997 (d) Brown, R. C., J. Chem. Soc. Perkin-I, 3293, 1998]. In der Regel verlangen die verfügbaren Träger extreme Bedingungen, um die Moleküle von dem festen Träger zu spalten, was starke Säuren beinhaltet, die für die Moleküle schädlich sind. Außerdem führen Aminolyse- und Reduktionsspaltverfahren, insbesondere im Falle von Peptiden, zu Nebenreaktionen und Racemisierung. Andererseits sind Träger, die verhältnismäßig milde Bedingungen verlangen, gegenüber verschiedenen Reagenzien und Versuchsbedingungen, die bei organischen Synthesen, insbesondere bei kleinen Molekülen, verwendet werden, weniger beständig. Aus diesem Grund ist die Entwicklung neuer, vielfach anwendbarer Träger mit orthogonaler Kompatibilität besonders nützlich.
Im Blickpunkt steht derzeit die Entwicklung verschiedener Träger, die im Wesentlichen auf der Strategie basiert, einen bifunktionellen Linker zwischen der festen Matrix und dem wachsenden Molekül einzubauen. Der erste Schritt beinhaltet die Bindung des Linkermoleküls an die feste Matrix, wonach anschließend das gewünschte synthetische Gerüst auf dem festen, den Linker aufweisenden Träger konstruiert wird. Dies ermöglicht die Nutzung der gewünschten funktionellen Gruppen beim Binden des synthetischen Gerüsts auf dem festen Träger und das Erzielen der gewünschten chemischen Eigenschaften. Auf der Grundlage dieser Prämisse wurden eine Reihe von festen Trägern auf der Basis eines Linkers entwickelt und kommerziell genutzt [Oesapay, G., et al., in Peptides Chemistry, Structure and Biology, Proc. 13^th American Peptide Symposium", Hodges, R S. und Smith J. A. (Hrsg.), ESCOM, Leiden, S. 435, 1994, (b) Hermkens, P. H. H. et al. Tetrahedron, 52, 4527, 1996 (c) Hermkens, P. H. H. et al., Tetrahedron, 53, 5643, 1997 (d) Brown, R C., J. Chem. Soc. Perkin-I, 3293, 1998. Und (a) Blackburn, C. Biopolymers, peptide sciences, 47, 311, 1998 (b) Patek, M. und Lebl, M. ibid. 353 (c) Barany, G. et al., United States Patent: 5.235.028 1993, (d) Barany, G., United States Patent: 5.306.562, 1994 (e) Jensen, K. J., et al., United States Patent 5.917.015, 1999].
Die Anmelder entwickelten in einem ähnlichen Ansatz bereits einen Linker für die Festphasensynthese von Peptiden [Katti, S. B. et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 843-844, 1992]. Dieser basenlabile Linker, dargestellt in II Formel VII, wurde unter Verwendung von leicht zugänglichen Ausgangsmaterialien hergestellt und für jede Aminosäure, die am C-Terminus verwendet werden soll, getrennt synthetisiert. Er wurde gemäß dem Verfahren hergestellt, das zur Synthese von PAM-Harz verwendet wird [Michell, A. R. et al., J. Org. Chem. 43, 2845, 1978]. Dadurch wird eine vorbeladene Aminosäure mit Linker auf einem festen Träger für die weitere Synthese von Peptiden bereitgestellt. Die Synthese begann mit der Behandlung von Chloressigsäure (I) mit Phenacylbromid (II), um den entsprechenden Ester (III) zu erhalten. Der Ester III wurde mit Mercaptoethanol (IV) behandelt, um den geschützten Linker (V) zu erhalten. Die Hydroxygruppe des Linkers wurde mit einer passend geschützten Aminosäure (Boc oder Fmoc) mit DCC und DMAP acyliert, woran sich ein Entblocken des Phenacylesters durch Zn/AcOH anschloss, um die freie Säure (VI) zu erhalten. Die Sulfidgruppe der freien Säure VI wurde anschließend oxidiert, um durch die Behandlung mit Oxon das entsprechende Sulfon (VII) zu erhalten. Das Aminomethylharz wurde mithilfe des DIC/HOBT-Verfahrens mit der Linkersäure, die eine passend geschützte Aminosäure trug beladen, wobei eine quantitative Beladung erreicht wurde. Nach dem Beladen des festen Trägers mit der ersten einen Linker aufweisenden Aminosäure wurde die Nützlichkeit des festen Trägers auf der Basis eines Linkers anhand einer Peptidsynthese unter Verwendung der Boc- und Fmoc-Chemie mit bekannten Verfahren nachgewiesen. Die Spaltung des Peptids vom festen Träger wurde unter extrem milden Bedingungen durch 30-minütige Behandlung mit Dioxan/Methanol/4N NaOH (30:9:1) durchgeführt. Dies bietet die Möglichkeit, geschützte Peptidfragmente zu erhalten, die sehr nützliche Zwischenstufen bei der Synthese von großen Peptiden und Proteinen sind [Kaiser, E. T., Acc. Chem. Res. 22, 47, 1989; Williams, P. et al. Tetrahedron, 49, 11065, 1993]. So wurde nachgewiesen, dass der Linker mit sowohl Boc- als auch Fmoc-Chemieprotokollen kompatibel ist und problemlos im Labor synthetisiert werden kann. Unter Verwendung dieses Linkers wurden mehrere Peptide und geschützte Peptidfragmente synthetisiert.
TECHNISCHES PROBLEM
Trotz der verschiedenen Vorteile weisen die vorstehend genannten festen Träger auf Basis eines Linkers bestimmte Begrenzungen auf. Bei der Synthese von Peptiden muss der Linker mit der Aminosäure am C-Terminus für jede Synthese separat synthetisiert werden [II in den beiliegenden Zeichnungen]. Aus diesem Grund verlangt die Synthese jeder Sequenz zusätzliche Schritte und einen längeren Zeitraum. Ferner wird der Linker mit geschützter Aminosäure vor dem Koppeln an den festen Träger unter Verwendung von Oxon, einem kräftigen Oxidationsmittel, oxidiert, weswegen Aminosäuren, die gegenüber Oxidation empfindlich sind, nicht als erste Aminosäure verwendet werden können. Somit stellen Peptidsequenzen mit Cystein, Methionin, Tryptophan und Tyrosin am C-Terminus ein Problem dar, da diese Aminosäuren während der Oxidation mit Oxon oxidiert werden. Zum anderen wurde beobachtet, dass der Linker der Formel VII, wie in II der beiliegenden Zeichnungen dargestellt, unter den Spaltbedingungen, die zum Entfernen der Fmoc-Gruppe insbesondere bei der Synthese von längeren Peptiden verwendet werden, nicht vollständig stabil ist. Es wurde beobachtet, dass längeres Einwirken einer 20%igen Piperidinlösung zum Spalten der wachsenden Kette vom festen Träger führt. Da die Spaltung der Produkte vom festen Träger über eine β-Eliminierung erfolgt, reicht die Alkalinität der 20%igen Piperidinlösung aus, um die β-Eliminierung des Linkers zu verursachen, was bei jedem Entblockungsschritt zu einer Teilspaltung des Peptids führt.
AUFGABEN DER ERFINDUNG
Die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines orthogonal kompatiblen festen Trägers auf der Basis eines Linkers für organische Synthesen.
Eine andere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen festen Trägers auf der Basis eines Linkers für die Peptidsynthese unter Verwendung des Boc- und Fmoc-Chemieprotokolls getrennt oder in Kombination.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen festen Trägers, der einen funktionalisierten Linker umfasst, welcher kovalent an die festen Träger gebunden ist, wie Polystyrol.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Synthese von Hydroxyethylsulfenylacetamid-Harz.
Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen festen Trägers für die Synthese von geschützten Peptidfragmenten zur Verwendung bei der konvergenten Festphasensynthese langer Peptide.
Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Erweiterung des Anwendungsbereichs des neuen festen Trägers auf der Basis eines Linkers auf die Synthese kleiner organischer Moleküle zur Erzeugung kombinatorischer Bibliotheken.
KURZE BESCHREIBUNG DER BEILIEGENDEN ZEICHNUNGEN
Es zeigen in den beiliegenden Zeichnungen
I die Struktur des Hydroxyethylsulfenylacetamid-Harzes
II die herkömmliche Peptidsynthese
III die Synthese des Hydroxyethylsulfenylacetamid-Harzes HESA)
IV die Synthese von Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH mithilfe des Boc-Chemieprotokolls.
V die Synthese von Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH mithilfe des Fmoc-Chemieprotokolls
VI und VII die Synthese von Thiazolidinderivaten.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Zur Erfüllung der vorstehend genannten Aufgaben beschreibt die vorliegende Erfindung die Entwicklung eines neuen orthogonal kompatiblen festen Trägers, Hydroxyethylsulfenylacetamid-Harz (HESA), dargestellt in Formel 1 in I. Der hier beschriebene neue feste Träger kann zur Synthese biologisch aktiver Peptide unter Verwendung der Boc- und der Fmoc-Chemie getrennt oder in Kombination verwendet werden.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Bereiche der Festphasensynthese und der kombinatorischen Chemie haben sich vermischt und als nützliche Werkzeuge für neue Entdeckungen erwiesen. Die Festphasensynthese wird in erster Linie angetrieben von der Arzneimittelindustrie und deren Suche nach immer neuen Verbindungen für zahlreiche organische Transformationen genutzt. Im Gleichschritt mit diesem erneuten Interesse entwickeln sich die Möglichkeiten für technische Entwicklungen, nämlich neue Linker und/oder feste Träger, die an die Anforderungen der organischen Synthese angepasst sind. Die zur Verfügung stehenden festen Träger mit verschiedenen chemischen Eigenschaften sind zwar vom Konzept her elegant, eignen sich aber nur für das eine oder das andere Chemieprotokoll und verlangen komplexe chemische Reaktionen. Der vorliegende Träger lässt sich einfach aus im Handel erhältlichen, preiswerten Ausgangsstoffen herstellen. Die Endprodukte können unter sehr milden Bedingungen gespalten werden. Die vorliegende Erfindung beschreibt die Synthese und Anwendung eines neuen festen Trägers auf der Basis eines Linkers für die Synthese von Peptiden und kleinen Molekülen zur Erzeugung kombinatorischer Bibliotheken.
Da die Spaltung der Produkte vom Träger eine sehr milde Alkalinität verlangt, bietet sie eine schnelle Synthese von geschützten Peptidfragmenten, die für die konvergierende Synthese großer Peptide nützlich ist. Die Peptide werden mit hoher Ausbeute und hervorragender Reinheit synthetisiert. Ferner enthalten die Produkte keine Racemate. Das ermöglicht die Synthese von Sequenzen mit oxidationsanfälligen Aminosäuren am C-Terminus. Ein weiteres wichtiges Merkmal der Erfindung ist, dass der neue feste Träger für die Festphasensynthese kleiner organischer Moleküle und die Erzeugung kombinatorischer Bibliotheken aus Peptiden und kleinen organischen sowie heterocyclischen Molekülen verwendet werden kann. Der neue feste Träger kann sehr zweckmäßig in großen Mengen im Labor synthetisiert werden und verlangt keine speziellen Vorsichtsmaßregeln bei der Lagerung und kann zur anschließenden Anwendung für Synthesen monatelang bei Umgebungstemperatur aufbewahrt werden. Ferner wurde ein neues, bisher unbekanntes Verfahren zu dessen Synthese entwickelt.
Die Synthese des neuen festen Trägers mit einem chemisch definierten reaktiven Zentrum erfolgte in zwei Schritten. Im ersten Schritt wird Chloressigsäure und ihr Äquivalent enthaltend eine geeignete Austrittsgruppe anstatt Halogen in einem bekannten Verfahren [SCHRITT 1] mit einem Aminomethylharz, wie in III der beiliegenden Zeichnungen dargestellt, gekoppelt. Dieser Reaktionsschritt ist quantitativ, was anhand eines negativen Kaiser-Tests nachgewiesen wird. Im nächsten Schritt [SCHRITT 2] wurde Mercaptoethanol mit dem in Schritt 1 erhaltenen Träger umgesetzt, um den gewünschten festen Träger 1 zu erhalten, wie in III der beiliegenden Zeichnungen dargestellt. Der neue feste Träger auf der Basis eines Linkers 1, wie in den beiliegenden Zeichnungen dargestellt, wurde auf der Grundlage eines kräftigen Peaks bei 1666 cm^–1, der dem Carbonyl des neu eingeführten Acetamidanteils entspricht, und eines Peaks bei 3219 cm^–1, der der primären Hydroxygruppe entspricht, charakterisiert.
Die Quantifizierung der funktionellen Hydroxygruppe erfolgte anhand von aus der Literatur bekannten Standardverfahren durch Beladen mit Aminosäuren mit passender Boc- oder Fmoc-Schutzgruppe unter Verwendung von Standardprotokollen. Im Falle der Boc-Chemie erfolgte die Quantifizierung durch Abschätzen der funktionellen Aminogruppen auf dem festen Träger mittels des Pikrinsäureverfahrens [Verfahren A][Gisin, B. F., Anal. Chim. Acta, 58, 248, 1972]. Im Falle der Fmoc-Chemie wurde die Fmoc-Gruppe durch eine Piperidinbehandlung entfernt und anschließend 9- Fluorenylmethylpiperidin durch Messen der Extinktion bei 301 nm bestimmt [Verfahren B] [Meienhofer, J. et al., Int. J. Peptide protein Res. 13, 35, 1979]. Das neue Harz 1 erwies sich bei Umgebungstemperatur über mehrere Monate als stabil und kann nach der Herstellung über einen längeren Zeitraum für anschließende Syntheseanwendungen ohne besondere Lagerungsbedingungen verwendet werden. Ferner wurde das Harz mit der Aminosäure auch auf Stabilität gegenüber den Reagenzien und Versuchsbedingungen geprüft, die üblicherweise für die Peptidsynthese mit Boc- und Fmoc-Chemieprotokoll gelten. Die Anmelder beobachteten keine Spaltung der an das Harz gebundenen Aminosäure bei 50% TFA/DCM sowie 20% Piperidin in DMF.
RACEMISIERUNGSUNTERSUCHUNGEN:
Die alkalischen Bedingungen für die Spaltung des Peptids vom Harz sind zwar recht milde, die Anmelder hielten es jedoch für angebracht, eindeutige Nachweise hinsichtlich des Racemisierungsrisikos zu erbringen. Zu diesem Zweck wurde ein Paar geschützte Dipeptide, Boc-Gly-L-Phe-OH und Boc-Gly-D-Phe-OH, synthetisiert. Dieses Dipeptid wurde gewählt, weil das Enzym Carboxypeptidase-A vorzugsweise die Peptidbindung neben einer aromatischen Aminosäure am C-Terminus hydrolysiert [Bradshaw, R. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 63, 1389, 1969]. Während der Peptidspaltung vom Träger wäre im Falle einer Racemisierung ein Peak zu erwarten, der bei Boc-Gly-L-Phe-OH dem nicht hydrolysierten Dipeptid entspricht, während bei Boc-Gly-D-Phe-OH in Abhängigkeit vom Racemisierungsausmaß eine gewisse Hydrolyse auftritt. Die geschützten Dipeptide wurden nach dem Entfernen vom festen Träger ohne weitere Reinigung einer Enzymhydrolyse mit Carboxypeptidase-A unterworfen. Nach 30 min wurden Aliquote mittels TLC geprüft. Boc-Gly-L-Phe-OH war vollständig hydrolysiert und an dessen Stelle wurden zwei Flecken, die Boc-Gly und L-Phenylalanin entsprachen, beobachtet. Boc-Gly-D-Phe-OH hingegen war vollständig hydrolysebeständig, was an der Abwesenheit von Flecken erkennbar ist, die den Hydrolyseprodukten entsprechen, und das Dipeptid war intakt. Die Prüfung wurde auch mittels HPLC durchgeführt, wobei ähnliche Ergebnisse erreicht wurden. Bei Boc-Gly-L-Phe-OH wurde eine vollständige Hydrolyse beobachtet, bei Boc-Gly-D-Phe-OH fand keine hydrolytische Spaltung statt, was anhand der Abwesenheit von Peaks erkennbar ist, die im HPLC-Profil Boc-Gly entsprechen. Diese Ergebnisse zeigen eindeutig, dass während des Entfernens des Peptids vom festen Träger keine Racemisierung der Aminosäure am C-Terminus auftritt.
SYNTHESEANWENDUNGEN DES FESTEN TRÄGERS AUF DER BASIS EINES LINKERS:
Um die Nützlichkeit des Linkers zu zeigen, wurden einige Peptide unter Verwendung der Boc- und Fmoc-Chemie und mehrere Thiazolidinderivate synthetisiert. Leu-Enkephalin wurde getrennt unter Verwendung der Boc- und Fmoc-Chemie synthetisiert. Ein schrittweiser Entschützungs-/Kopplungszyklus für die Einführung weiterer Aminosäurereste wurde mit einem üblichen DIC/HOBt-Protokoll durchgeführt. Das Entblocken der Boc-Gruppe wurde mit 50% TFA in DCM oder 5N HCl/Dioxan und das der Fmoc-Gruppe mit 20% Piperidin/DMF durchgeführt. Bei jedem Schritt wurden die Kopplungsreaktionen wiederholt, wenn dies anhand des Kaiser-Tests erforderlich war, um bessere Ausbeuten zu erzielen. Die endgültigen Peptide wurden unter alkalischen Bedingungen vom festen Träger gelöst und mit 5N HCl/Dioxan behandelt. Nach Aufarbeitung und Kristallisation betrug die Gesamtausbeute aller Peptide mehr als 60–70%. Zur Charakterisierung wurden Spektroskopieverfahren verwendet.
Alle Verbindungen zeigten bei Umkehrphasen-HPLC eine Reinheit von mehr als 90% und zeigten bei FAB-MS korrekte Molekülionen-Peaks. Zur Erweiterung des Anwendungsbereichs der vorliegenden Linker galt es als wünschenswert, Peptide mit funktionellen Gruppen in Seitenketten. Zu synthetisieren. Zu diesem Zweck wurde ein Pentapeptid, Lys-Thr-Thr-Lys-Ser, was den Resten 211–216 von Prokollagen Typ-I entspricht, gewählt [Katayama K. et al., J. Biol. Chem., 268, 9941, 1993]. Die Synthese wurde mit Boc-Chemie unter Verwendung von DIC/HOBT für Kopplungsreaktionen durchgeführt. Boc Ser(Bzl) wurde anhand des in IV dargestellten Protokolls mit dem Linker verbunden. Dem schloss sich eine sequenzielle Addition passend geschützter Aminosäuren an. Am Ende der Synthese wurde das geschützte Peptid mit Aminokette und Seitenkette wie vorstehend beschrieben vom festen Träger gespalten. Das geschützte Peptidfragment wurde mittels des Molekülionen-Peaks bei passendem [M+H]⁺ im FAB-MS-Spektrum charakterisiert. Die Tatsache, dass das Peptid unter Bewahrung der die Aminokette und Seitenkette schützenden Gruppen selektiv vom festen Träger gespalten werden kann, deutet darauf hin, dass dieser Linker für die Synthese größerer Peptide mithilfe des Fragmentkondensierungsverfahrens nützlich sein kann. Die Schutzgruppen wurden am Ende quantitativ entfernt und das Pentapeptid in einer Ausbeute von 78% erhalten.
Als Nachweis für die Anwendung des neuen festen Trägers bei der Synthese von kleinen organischen Molekülen wurden mehrere Thiazolidinderivate synthetisiert [Patek, M. et al., Tetrahedron Letters 36, 2227, 1995]. Das für die Synthese angepasste Protokoll geht aus dem Schema hervor (VI und VII, worin: R=H, Cl, Br, I, F, NO₂, OH, OMe, Alkyl, Aralkyl, Aryl und solche mit Substitutionen; X=C oder N; R' = Acyl, Alkyl, Boc, Bz, Z oder Aminosäuren; und R'' = Schutzgruppe der Aminosäure). Ein passend geschütztes Cysteinderivat, nämlich Fmoc Cys(Trt), wurde mittels DIC/DMAP oder jedem anderen Katalysator unter Verwendung des für die Peptidsynthese beschriebenen Protokolls an den festen Träger gebunden. Die Fmoc-Gruppe wurde durch Behandlung mit 20% Piperidin in DMF gespalten und die Tritylgruppe anschließend durch Behandlung mit 10% TFA in DCM entfernt. Das am Träger gebundene Cystein mit freier Amino- und Sulfhydrylgruppe wurde mit den erwünschten im Handel erhältlichen Aldehyden (unter Verwendung eines zweimolaren Überschusses) bei Raumtemperatur oder erhöhter Temperatur umgesetzt. Die Ringbildung war nach 6-8 h abgeschlossen. Alternativ wurde(n) das Thiazolidin bzw. die Thiazolidine erfolgreich unter Verwendung von Boc-Cys(trt) als Ausgangsmaterial gebunden an den festen Träger synthetisiert. Der Vorteil dieses Derivats ist, dass die Schutzgruppe an der Amino- und der Sulfhydrylgruppe in einem einzigen Schritt, d. h. mit einer TFA-Behandlung, entfernt werden kann. Das derart erhaltene Thiazolidinderivat kann von dem festen Träger direkt gespalten oder auf dem festen Träger derivatisiert/acyliert werden. Demgemäß wurde der Träger mit einem Thiazolidin in mehrere Teile geteilt und die freie Aminogruppe getrennt mit verschiedenen aromatischen und aliphatischen Acylierungsmitteln in parallelen Syntheseprotokollen acyliert. Unter Verwendung verschiedener Aldehyde und Acylierungsmittel wurden eine Anzahl neuer Derivate in hohen Ausbeuten und mit hoher Reinheit erzeugt.
Zur Erweiterung des Anwendungsbereichs des festen Trägers auf der Basis eines Linkers, wie er in Formel 1 in I der beiliegenden Zeichnungen dargestellt ist, wurde das Thiazolidingerüst an verschiedenen Aminosäuren/Peptiden oder jedem anderen an den Träger gebundenen Molekül synthetisiert. Auf diese Weise wurde ein passend mit Boc oder Fmoc geschützte Aminosäure unter Verwendung eines Standardprotokolls an den festen Träger gebunden. Die Aminoschutzgruppe wurde entfernt und das freie Amin mit einem passend geschützten Cysteinrest mittels des DIC/HOBt-Verfahrens gekoppelt. Nach abgeschlossener Kopplung, die mit dem Kaiser-Test überwacht wurde, wurden beide Schutzgruppen auf die vorstehend beschriebene Weise von Cystein entfernt. Das Harz mit dem Dipeptid mit freier Amino- und Sulfhydrylgruppe des Cysteins wurde mit den gewünschten im Handel erhältlichen Aldehyden (unter Verwendung eines zweimolaren Überschusses) bei Raumtemperatur auf dem festen Träger umgesetzt. Die Ringbildung war nach 6–8 h abgeschlossen. Das bzw. die derart erhaltene(n) Thiazolidinylderivat(e) kann bzw. können von dem festen Träger direkt gespalten oder auf dem festen Träger derivatisiert/acyliert werden. Der Träger mit einem bzw. mehreren der Thiazolidinyldipeptidderivate wurde in mehrere Teile geteilt und die freie Aminogruppe getrennt mit verschiedenen aromatischen und aliphatischen Acylierungsmitteln in parallelen Syntheseprotokollen acyliert. Unter Verwendung verschiedener C-terminaler Aminosäuren, verschiedener Aldehyde und Acylierungsmittel wurde eine große Vielfalt neuer Verbindungen in hohen Ausbeuten und mit hoher Reinheit erzeugt.
Kurz gesagt kann der neue Linker zweckmäßig im Labor hergestellt werden und eignet sich hervorragend für die Peptidsynthese mit dem Boc- und dem Fmoc-Chemieprotokoll. Geschützte Peptide können zur Verwendung in Segmentkondensationsverfahren synthetisiert werden. Die beim Ablösen der Peptide vom festen Träger verwendeten Bedingungen führen nicht zu einer Racemisierung. Wir sind der Auffassung, dass der neue hier vorgestellte Linker gegenüber sauren und milden alkalischen Bedingungen stabil ist und somit hervorragende Möglichkeiten für die Verwendung bei der Peptid-/Oligonukleotidsynthese und der Konstruktion einer Vielzahl von Bibliotheken mit kleinen Molekülen bietet.
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung die Entwicklung von Hydroxyethylsulfenylacetamid-Harz, einem orthogonal kompatiblen festen Träger für die Festphasensynthese von Peptiden und geschützten Peptidfragmenten unter Verwendung der Boc- und der Fmoc-Chemie getrennt oder in Kombination sowie für die Synthese kleiner organischer Moleküle für kombinatorische Bibliotheken. Die vorliegende Erfindung stellt auch ein neues Verfahren zur Synthese von Hydroxyethylsulfenylacetamid-Harz mit der in Formel 1 in I gezeigten Formel bereit, wobei der feste Träger ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus aminofunktionellen Membranen, porösem Glas, Polystyrol, Baumwolle und Papier und das Polystyrol ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Aminopolystyrol und Aminomethylpolystyrol, wobei das Verfahren umfasst:

(a) das Reagieren von Chloressigsäure oder ihres Äquivalents enthaltend eine geeignete Austrittsgruppe anstatt Halogen mit einem Aminomethylharz in Gegenwart von Diisopropylcarbodiimid oder irgendeines anderen häufig verwendeten Kopplungsreagenses unter Verwendung bekannte Verfahren [Sequenz wie in III der beiliegenden Zeichnungen dargestellt],
(b) das Reagieren des obigen festen Trägers, der eine Austrittsgruppe aufweist, mit Mercaptoethanol in Gegenwart von Natriumiodid, um den erwünschten festen Träger der Formel 1 aus III zu erhalten und, falls erwünscht,
(c) das Verwenden des derart erhaltenen neuen festen Trägers für die Synthese von Peptiden, geschützten Peptidfragmenten und kleinen organischen Molekülen, wie in IV–VII der beiliegenden Zeichnungen dargestellt.

Gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung wurde die Synthese des festen Trägers auf der Basis eines Linkers unter Verwendung leicht zugänglicher und im Handel erhältlicher preiswerter Ausgangsmaterialien durchgeführt.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung beschreibt, dass der derart erhaltene orthogonal kompatible feste Träger eine optimale Funktionalität (0,3–0,5 meq/g) aufwies und dass sich das neue Harz 1 bei Raumtemperatur über mehrere Monate als stabil erwies und nach der Herstellung über einen längeren Zeitraum für anschließende Syntheseanwendungen ohne besondere Lagerungsbedingungen verwendet werden konnte.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wurde das Harz mit der Aminosäure auf Stabilität gegenüber den Reagenzien und Versuchsbedingungen geprüft, die üblicherweise für die Peptidsynthese mit Boc- und Fmoc-Chemieprotokoll verwendet werden, und erwies sich bei 50% TFA/DCM sowie 20% Piperidin in DMF, die beide bei der Festphasensynthese von Peptiden im Überschuss verwendet wurden, als stabil.
In noch einer weiteren Ausführungsform wird der feste Träger für die Festphasensynthese von Peptiden, geschützten Peptidfragmenten und kleinen organischen Molekülen verwendet.
In noch einer weiteren Ausführungsform wird orthogonal kompatibles Hydroxyethylsulfenylacetamid-Harz für die Festphasensynthese von Peptiden durch das Boc-Chemieprotokoll verwendet.
In noch einer weiteren Ausführungsform wird orthogonal kompatibles Hydroxyethylsulfenylacetamid-Harz für die Festphasensynthese von Peptiden durch das Fmoc-Chemieprotokoll verwendet.
In noch einer weiteren Ausführungsform wird das orthogonal kompatible Hydroxyethylsulfenylacetamid-Harz für die Festphasensynthese von Peptiden sowohl durch das Boc- als auch das Fmoc-Chemieprotokoll getrennt oder in Kombination verwendet.
In noch einer weiteren Ausführungsform wird das orthogonal kompatible Hydroxyethylsulfenylacetamid-Harz für die Festphasensynthese von heterocyclischen kleinen organischen Molekülen, wie Thiazolidinderivaten, verwendet.
In noch einer weiteren Ausführungsform wird das orthogonal kompatible Hydroxyethylsulfenylacetamid-Harz für die Festphasensynthese von kleinen organischen Molekülen für kombinatorische Bibliotheken verwendet.
In noch einer weiteren Ausführungsform sind die Endprodukte unter milden alkalischen Bedingungen spaltbar.
In noch einer weiteren Ausführungsform sind die Endprodukte von dem festen Träger unter Verwendung einer Mischung von wässrigem 0,1–0,5 N Alkali und organischen Lösungsmitteln, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Dioxan, Tetrahydrofuran, Methanol, Ethanol und Dimethylformamid, spaltbar.
In noch einer weiteren Ausführungsform wird der feste Träger nach geeigneter Modifizierung mit funktionellen Gruppen, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Aldehyd-, Carboxyl-, Thiol-, Amino- und Polylaminogruppen als Reinigungsharz oder immobilisiertes Reagenz verwendet.
In noch einer weiteren Ausführungsform werden die Reaktionen in Gegenwart von organischen Lösungsmitteln, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Methylenchlorid, Tetrahydrofuran, Dimethylformamid, Ether, Petroleumether, Essigsäure, Methanol usw., in Gegenwart von N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid, 1-Hydroxybenzotriazol, N-Hydroxysuccinimid usw. bei Temperaturen im Bereich zwischen 15°C und 85°C ausgeführt.
In noch einer weiteren Ausführungsform werden die Reaktionen unter Verwendung von Kopplungsreagenzien, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Dicyclohexylcarbodiimid, gemischtes Anhydrid, aktive Ester, Benzotriazol-1-yl-oxy-tris(dimethylamino)phosphoniumhexafluorphosphat (BOP), Benzotriazol-1-yltetramethyluroniumhexafluorphosphat (HBTU) und 7-Azabenzotriazol-1-yltetramethyluroniumhexafluorphosphat (HATU), ausgeführt.
In noch einer weiteren Ausführungsform sind Säuren für die acidolytische Spaltung der Schutzgruppen, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend HBr/AeOH, HCl/Dioxan, Ameisensäure und Trifluoressigsäure.
In noch einer weiteren Ausführungsform ist ein Merkmal der Erfindung, dass racematfreie Produkte erhalten werden. Ferner stellt die Erfindung auch ein Verfahren für die Synthese von Peptiden unter Verwendung des Boc- und des Fmoc-Chemieprotokolls getrennt oder in Kombination und zur Festphasensynthese von kleinen organischen Molekülen, wie Thiazolidinderivaten bereit [IV–VII, wie in den beiliegenden Zeichnungen dargestellt]. Die Endprodukte können nach der Festphasensynthese unter sehr milden Bedingungen von dem festen Träger gespalten werden. Die vorliegende Erfindung beschreibt auch die Synthese von Peptiden und kleinen Molekülen für die Erzeugung kombinatorischer Bibliotheken mit guten Ausbeuten und in guter Reinheit unter Verwendung des neuen festen Trägers.
Die Erfindung ist nachstehend anhand der folgenden ausführlichen Beispiele beschrieben. Diese Beispiele dienen der weiteren Veranschaulichung der verschiedenen spezifischen und beispielhaften Ausführungsformen und Techniken und sollten nicht als Begrenzung des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung ausgelegt werden.
EXPERIMENTELLER TEIL:
ALLGEMEINE VERFAHREN
Alle in der vorliegenden Studie verwendeten Aminosäuren hatten, sofern nicht anders angegeben, L-Konfiguration. Als Träger wurde 2% vernetztes aminomethyliertes Styrol/Divinylbenzol-Copolymer mit einer Substitution von 0,5–0,9 meq/g verwendet. Alle Kopplungsreaktionen wurden mit wasserfreien Reagenzien und trockenen Lösungsmitteln durchgeführt. Die Homogenität aller Zwischenprodukte und der endgültigen Verbindungen wurde mittels TLC auf Kieselgelplatten mit den folgenden Lösungsmittelsystemen bestimmt: (a) CHCl₃/MeOH/AcOH (49:1:1), (b) CHCl₃/MeOH (19:1), (c) CHCl₃/MeOH/AcOH (48:1:1), (d) CHCl₃/MeOH/AcOH (18:1:1), (e) CHCl₃/MeOH/AcOH (17:2:1), (f) n-BuOH/AcOH/H₂O (4:1:5, obere Schicht). Die Reinheit der endgültigen Verbindungen wurde mittels RP-HPLC unter Verwendung einer μ-Bondapak-C₁₈-Säule und eines linearen Gradienten von 0–40% B über 40 min (A = 0,1% wässriges TFA, B = Acetonitril) geprüft und bei 225 nm (UV) überwacht. Die optische Drehung von mit einem Polarimeter Perkin Elmer 241 gemessen. NMR-Spektren wurden mit einem Spektrometer Bruker DRX 300 MHz aufgezeichnet. IR-Spektren wurde mit einem Shimadzu 8201 PC FTIR aufgezeichnet.
BEISPIEL 1
Synthese von Hydroxyethylsulfenylacetamid-Harz (Verbindung 1)
2,0 g im Handel erhältliches Aminomethylpolystyrol-Harz (0,9 meq/g) wurden in ein Gefäß für Festphasenreaktionen eingetragen und mit trockenem Dichlormethan (DCM) versetzt. Die Suspension wurde unter Rühren in Stickstoffatmosphäre 30 min lang quellen gelassen. Sie wurde dreimal mit DCM und einmal mit einer DCM/DMF-Mischung (1:1) gewaschen. Sie wurde mit Chloressigsäure (0,45 g, 5 mmol) und DIC (0,8 ml, 5 mmol) in Gegenwart einer katalytischen Menge Dimethylaminopyridin (DMAP) in DCM/DMF (1:1) behandelt. Die Reaktionsmischung wurde in Stickstoffatmosphäre 8 h lang oder bis zum negativen Kaiser-Test gerührt. Das Harz wurde filtriert, nacheinander mit jeweils 25 ml DMF, DCM/DMF (1:1), DMF, DCM/DMF (1:1) und schließlich DCM gewaschen. Das Harz mit einem Chloracetyl-Zentrum wurde unter Rühren in Stickstoffatmosphäre mit einer Lösung aus Mercaptoethanol (0,4 ml, 5 mmol) in 20 ml DCM/DMF (1:1) 6–8 h lang in Gegenwart eines tertiären Amins und Natriumiodid als Katalysatoren umgesetzt. Das Harz wurde filtriert, dreimal mit DCM/DMF (1:1) und schließlich mit DCM gewaschen und getrocknet, was das gewünschte Harz 1 (2,1 g) ergab.
CHARAKTERISIERUNG DES FESTEN TRÄGERS
Der neue feste Träger auf der Basis eines Linkers 1 wurde auf der Grundlage eines kräftigen Peaks bei 1666 cm^–1, der dem Carbonyl des neu eingeführten Acetamidanteils entspricht, und eines Peaks bei 3219 cm^–1, der der primären Hydroxygruppe entspricht, charakterisiert.
BESTIMMUNG DES SUBSTITUTIONSGRADS
Die Quantifizierung der funktionellen Hydroxygruppe erfolgte anhand von aus der Literatur bekannten Standardverfahren durch Beladen mit Aminosäuren mit passender Boc- oder Fmoc-Schutzgruppe unter Verwendung von Standardprotokollen. Im Falle der Boc-Chemie erfolgte die Quantifizierung mittels des Pikrinsäureverfahrens [Verfahren A]. Im Falle der Fmoc-Chemie wurde die Fmoc-Gruppe durch die Piperidinbehandlung entfernt und anschließend 9-Fluorenylmethylpiperidin durch Messen der Extinktion bei 301 nm quantifiziert [Verfahren B]. Der Substitutionsgrad des neuen Linkers wurde bei 0,35–0,45 meq/g beobachtet. Einzelheiten siehe nachstehend;
VERFAHREN A: (BOC-CHEMIE)
Das Hydroxyethylsulfenylacetamid-Harz (1) (0,5 g) wurde in das Reaktionsgefäß eingetragen und in Dichlormethan (DCM) unter Rühren in Stickstoffatmosphäre quellen gelassen. Nach 30 min wurde das Harz filtriert und mit DCM gewaschen. Zu dem Harz wurde eine Lösung aus Boc-Leu (0,42 g, 2,4 mmol), DIC (0,2 ml, 2,5 mmol) und 20 ml Dimethylaminopyridin (DMAP) oder N-Methylimidazol (NMI) (0,4 mmol) in DCM/DMF (1:1) gegeben. Diese Mischung wurde 8–10 h lang gerührt. Das Harz wurde dreimal mit DCM gewaschen und getrocknet. Zum Entfernen der Boc-Gruppe wurde ein Aliquot des getrockneten Harzes (∼30,0 mg) 30 min lang einer Säurehydrolyse (5N HCl/Dioxan, 5 ml) unterworfen. Danach wurde das Harz mit DCM und DMF gewaschen. Durch Ausschütteln mit DIEA (2 ml) in DCM/DMF (1:1) (40 ml) wurde das derart erhaltene Hydrochloridsalz neutralisiert. Das Harz wurde dann nacheinander mit DMF und DCM gewaschen. Das vorstehende Produkt wurde dann mittels des Pikrinsäureverfahrens quantifiziert, um die Mengen an Aminogruppen auf dem festen Träger zu bestimmen. Ein Aliquot (2,5 mg) des Harzes wurde in Pikrinsäure (50 mg) in DCM (2 ml) und ethanol (8 ml) eingerührt. Nach gründlichem Waschen des Harzes wurde es mit DIEA (1 ml) verrührt, wodurch die am Harz gebundene Pikrinsäure als DIEA-Salz in die Lösung abgegeben wurde. Die Lösung wurde auf 50 ml aufgefüllt und die Extinktion mithilfe eines UV-Spektrometers bei 350 nm ermittelt. Zur Berechnung wurde die folgende Formel verwendet.

Hier E = 14500,

VERFAHREN B: (Fmoc-CHEMIE)
Das Hydroxyethylsulfenylacetamid-Harz (1) (0,5 g) wurde in das Reaktionsgefäß eingetragen und in Dichlormethan (DCM) unter Rühren in Stickstoffatmosphäre quellen gelassen. Nach 30 min wurde das Harz filtriert und mit DCM gewaschen. Zu dem Harz wurde eine Lösung aus Fmoc-Leu (0,82 g, 2,4 mmol), DIC (0,2 ml, 2,5 mmol) und 20 ml Dimethylaminopyridin (DMAP) oder N-Methylimidazol (NMI) (0,4 mmol) in DCM/DMF (1:1) gegeben. Diese Mischung wurde 8–10 h lang gerührt. Das Harz wurde dreimal mit DCM gewaschen und getrocknet. Ein Aliquot des getrockneten Fmoc-Leu-Harzes (2,5 mg) wurde in ein Reagenzglas überführt und 15–20 min lang unter gelegentlichem Verwirbeln mit 0,5 ml 20% Piperidin in DMF behandelt. In einem zweiten Reagenzglas wurden 0,5 ml 20% Piperidin in DMF als Referenz hergestellt. Nach 20 min wurde das Volumen in beiden Reagenzgläsern mit DMF auf 50 ml aufgefüllt. Die Extinktion der beiden Lösungen wird mit einem UV-VIS-Spektrophotometer bei 301 nm bestimmt. Der Substitutionsgrad (mMol/g) wird anhand der folgenden Formel berechnet.
worin:
A₃₀₁ = Extinktion der harzhaltigen Lösung
Vol = Endgültiges Volumen der Lösung
wt = Genaues Gewicht des eingetragenen Harzes
STABILISIERUNGSUNTERSUCHUNGEN:
Zum Nachweis der Stabilität des Linkers beim Entblocken der Boc- und/oder Fmoc-Schutzgruppe bei längerem Einwirkgen der Reagenzien wurden die folgenden Versuche durchgeführt. Kleine Aliquote der mit Fmoc geschützten an den festen Träger gebundenen Aminosäure (0,41 meq/g, 100 mg) wurden getrennt unter Rühren 8 h lang mit jeweils 1 ml 50% TFA in DCM und 5N HCl/Dioxan behandelt und die Harze wurden anschließend filtriert, gewaschen und getrocknet. In einem zweiten Kolben wurde mit Boc geschützte an den festen Träger gebundene Aminosäure (0,38 meq/g, 120 mg) unter Rühren 10 h lang mit 1,2 ml 20% Piperidin/DMF behandelt und das Harz anschließend filtriert, gewaschen und getrocknet. Die getrockneten Harze wurden unter Verwendung der Verfahren A und B quantitativ bestimmt und die Ergebnisse waren praktisch mit denen der nicht behandelten Harze identisch, was den Schluss zulässt, dass der Linker bei den beim Entschützen der Fmoc- und Boc-Gruppe verwendeten Bedingungen stabil ist.
RACEMISIERUNGSUNTERSUCHUNGEN
Als Substrat für die Erfassung einer Racemisierung, die möglicherweise bei der Synthese auf dem Produkt und der Spaltung des Produkts vom festen Träger auftritt, wurden die Dipeptide verwendet, die wie in Beispiel 6 und 7 beschrieben auf dem neuen basenlabilen festen Träger synthetisiert wurden.
Jeweils 0,0064 g (20 μM) Boc-Gly-L-Phe-OH (6) und Boc-Gly-D-Phe-OH (7) wurden in getrennten Reaktionsgefäßen in 1M NaCl (50 μl) gelöst und 1M trisHCl (50 μl) eingetragen, um den pH-Wert auf 7,5 zu halten. 15–50 μl Carboxypeptidase-A wurden in verschiedenen Versuchsansätzen in jedes der Gefäße gegeben und bei 25°C 5 min lang geschüttelt. Ein Aliquot der Reaktionsmischung vor und 5 min nach der Zugabe des Enzyms wurde mittels RP-HPLC unter Verwendung eines linearen Gradienten von 0–90% Acetonitril in Wasser mit 0,1% TFA über 40 min untersucht. Boc-Gly-L-Phe-OH und Boc-Gly-D-Phe-OH zeigten eine Retentionszeit von 12,5 bzw. 13 min, wohingegen Boc-Gly-L-Phe-OH nach der enzymatischen Hydrolyse keinen Peak bei der Retentionszeit des Dipeptids zeigte, dafür jedoch einen Peak bei der Retentionszeit 8 min, was Boc-Gly entspricht. Das HPLC-Profil von Boc-Gly-D-Phe-OH nach der Enzymbehandlung zeigte keine veränderte Retentionszeit im Vergleich zum Dipeptid vor der Hydrolyse, d. h. 13 min.
BEISPIEL 2
Synthese von Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH (Verbindung 2)
Der feste Träger, das Hydroxyethylsulfenylacetamid-Harz (1) (1,25 g, 0,5 mmol) mit einer Substitution von 0,4 meq/g wurde in das Reaktionsgefäß eingetragen und in Dichlormethan (DCM) unter Rühren in Stickstoffatmosphäre quellen gelassen. Nach 30 min wurde das Harz filtriert und mit DCM gewaschen. Zu dem Harz wurde eine Lösung aus Boc-Leu (0,25 g, 1,2 mmol), und 20 ml Dimethylaminopyridin (DMAP) oder N-Methylimidazol (NMI) (0,2 mmol) in DCM/DMF (1:1) gegeben. Diese Mischung wurde 8–10 h lang gerührt. Das Harz wurde dreimal mit DCM gewaschen und getrocknet. Mit einem Aliquot des getrockneten Harzes (2,5 mg) wurde die Beladung geprüft, was eine Beladung von 78% ergab [Verfahren B]. Zum Entfernen der Boc-Gruppe wurde das Harz 30 min lang mit 50% TFA in DCM behandelt. Nach 30 min wurde das Harz filtriert und mit DCM, 20 ml × 3, 20% DIEA in DCM, 20 ml × 3, DCM, 20 ml × 3, gewaschen. Zu dem vorstehend genannten Harz wurde unter Rühren in Stickstoffatmosphäre Boc-Phe (0,26 g, 1 mmol) und 20 ml HOBt (0,153 g, 1 mmol) in DCM/DMF (1:1) gegeben. Diese Suspension wurde mit DIC (0,18 ml, 1,2 mmol) versetzt und die Mischung 3 h lang oder bis zum negativen Kaiser-Test gerührt.
Zum Entfernen der Boc-Gruppe wurde das Harz 30 min lang mit 50% TFA in DCM behandelt. Das Harz wurde filtriert und mit DCM, 20 ml × 3, 20% DIEA in DCM, 20 ml × 3, DCM, 20 ml × 3, gewaschen und das Harz mit der freien Aminogruppe wurde mithilfe des DIC/HOBt-Verfahrens mit Boc-Gly gekoppelt. Nach beendeter Kopplungsreaktion wurde das Harz filtriert und zum Entfernen der Boc-Gruppe auf die übliche Weise mit 50% TFA in DCM behandelt und mit Boc-Gly gekoppelt. Nach beendeter Kopplungsreaktion, die mit dem Kaiser-Test überwacht wurde, wurde Boc-Gruppe auf die übliche Weise entfernt und anschließend mithilfe des DIC/HOBt-Verfahrens mit Boc-Tyr gekoppelt. Das Harz mit dem Pentapeptid wurde 30 min lang unter Rühren in Stickstoffatmosphäre mit einer Dioxan/MeOH/4N NaOH-Mischung (30:9:1, 20 ml) behandelt und das Harz filtriert und mit 2 ml Wasser gewaschen. Das vereinigte Filtrat wurde in Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und mit Ether extrahiert. Die wässrige Schicht wurde mit 1N Salzsäure angesäuert und mit EtOAc (3 × 75 ml) extrahiert. Die vereinigte EtOAc-Schicht wurde mit Wasser und Natriumchloridlösung gewaschen, dann über Na₂SO₄ getrocknet und in Vakuum verdampft, was einen amorphen Feststoff ergab. Die derart erhaltene rohe Pentapeptidsäure wurde aus McOH-Ether umkristallisiert, was 0,21 g der Titelverbindung ergab. Ausbeute: 83%; R_f: 0,8(d); Schmelzpunkt 134–136°C; [α]_D ²⁵ = –9,8° (c = 4,1, McOH); ¹H NMR (DMSO-d₆) δ: 0,97 (d, 6H), 1,16 (s, 9H), 3,6-3,8 (m, 4H), 4,10, 4,24 und 4,58 (C°-Protonen), 6,63-7,00 (ABq, 4H), 7,40 (m, 5H), 7,8-8,1 (NHs). Die vorstehend erhaltene Peptidsäure (0,21 g, 0,3 mmol), wurde 1 h lang in Gegenwart von Thioanisol (0,2 ml) in 5N HCl/Dioxan (2 ml) gerührt. Nach Überwachung der Reaktion mit TLC wurde das Lösungsmittel in Vakuum abgedampft. Nach Zugabe von wasserfreiem Ether und Verreiben wurde das Pentapeptid-Hydrochlorid (HCl), Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH (2), als weißer hygroskopischer Feststoff erhalten. Dieser wurde filtriert und in einem Vakuumexsikkator getrocknet. Ausbeute: 0,15 g (85%); R_f: 0,67 (F); Schmelzpunkt 141°C; [α]_D ²⁵ = –5,6° (c = 0,54, McOH); FAB-MS [M+H]⁺ 556; ¹H NMR (DMSO-d₆) δ: 0,9 (d, 6H), 3,8-3,9 (m, 4H), 4,2, 4,3 und 4,68(C^α-Protonen), 6,8-7,1 (ABq, 4H), 7,3 (m, 5H), 7,5-8,5 (NHs), 9,0 (s, 1H, phenolisches OH).
BEISPIEL 3
Synthese von Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-OH (Verbindung 3)
Der feste Träger, das Hydroxyethylsulfenylacetamid-Harz (1) (0,75 g, 0,3 mmol) mit einer Substitution von 0,4 meq/g wurde in das Reaktionsgefäß eingetragen und in Dichlormethan (DCM) unter Rühren in Stickstoffatmosphäre quellen gelassen. Nach 30 min wurde das Harz filtriert und mit DCM gewaschen. An dieses Harz wurde auf die übliche Weise eine Boc-Leu-Lösung unter Verwendung eines dreimolaren Überschusses gebunden. Mit einem Aliquot des Harzes (3,4 mg) wurde die Beladung geprüft, was eine Beladung von 81% ergab [Verfahren B]. Anschließend wurde die Synthese von Boe-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-OH auf ähnliche Weise wie bei der Herstellung von Boc-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH durch Substitution von Boc-D-Ala anstatt Boc-Gly an Position 2 durchgeführt. Nach der Spaltung von dem festen Träger wurde Boc-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH (0,13 g, 79%) als weißes Pulver isoliert. Dieses wurde dann 1 h lang in Gegenwart von Thioanisol (0,1 ml) mit 5N HCl-Dioxan (2 ml) behandelt. Nach Überwachung der Reaktion mit TLC wurde das Lösungsmittel in Vakuum abgedampft und der Rückstand mit trockenem Ether verrieben. Dieser wurde filtriert und in einem Vakuumexsikkator getrocknet, was 0,16 g (82,8%) des endgültigen Peptid-HCl, Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-OH, als weißen Feststoff ergab. R_f: 0,48 (F); Schmelzpunkt 183°C; [α]_D ²⁵ = +14,3° (c = 0,56, McOH); Ausbeute: 0,15 g (85%); R_f: 0,67 (F); Schmelzpunkt 141°C; [α]_D ²⁵ = –5,6° (c = 0,54); ¹H NMR (DMSO-d₆) δ: 0,85 (d, 6H), 1,02 (d, 3H), 3,6 (d, 2H), 4,26, 4,38, 4,44 und 4,68 (C°-Protonen), 6,8-7,0 (ABq, 4H), 7,24 (m, 5H), 7,5-8,5 (NHs), 9,05 (s, 1H, phenolisches OH)
BEISPIEL 4
Synthese von Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH (Verbindung 2 über Fmoc-Chemie)
Das Hydroxyethylsulfenylacetamid-Harz (1) (0,1 g, 0,4 mmol) mit einer Substitution von 0,4 meq/g wurde in das Reaktionsgefäß eingetragen und in Dichlormethan (DCM) unter Rühren in Stickstoffatmosphäre quellen gelassen. Nach 30 min wurde das Harz filtriert und mit DCM gewaschen. Zu dem Harz wurde eine Lösung aus Fmoc-Leu (0,41 g, 1,2 mmol), DIC (0,2 ml, 1,5 mmol) und 20 ml Dimethylaminopyridin (DMAP) oder N-Methylimidazol (NMI) (0,2 mmol) in DCM/DMF (1:1) gegeben.
Diese Mischung wurde 8–10 h lang gerührt. Das Harz wurde dreimal mit DCM gewaschen und getrocknet. Mit einem Aliquot des getrockneten Harzes (2,5 mg) wurde die Beladung geprüft, was eine Beladung von 78% ergab [Verfahren A]. Das Harz wurde zum Entfernen der Fmoc-Gruppe 20 min lang mit 12 ml 20% Piperidin in DCM/DMF (1:1) behandelt. Das Harz wurde dreimal mit DCM gewaschen. Nach dreimaligem Waschen des Harzes mit DCM wurde eine Lösung aus Fmoc-Phe (0,38 g 1,0 mmol) und HOBt (0,15 g 1,0 mmol) in DCM/DMF (1:1), 10 ml, eingerührt. Diese Mischung wurde mit DIC (0,18 ml, 1,2 mmol) versetzt und das Rühren 3 h lang oder bis zum negativen Kaiser-Test fortgesetzt. Das Harz wurde filtriert und mit DCM, 20 ml × 3, gewaschen. Die Fmoc-Gruppe wurde durch eine 20 min lange Behandlung mit 12 ml 20% Piperidin in DCM/DMF (1:1) auf die übliche Weise entfernt. Anschließend wurden Fmoc-Gly (Schritt 3 in V), Fmoc-Gly (Schritt 4 in V) wie vorstehend beschrieben mittels des DIC/HOBt-Verfahrens gekoppelt. Bei der letzten Kopplung wurde anstatt Fmoc-Tyr Boc-Tyr verwendet. Das Harz mit dem Pentapeptid wurde 30 min lang unter Rühren in Stickstoffatmosphäre mit einer Dioxan/MeOH/4N NaOH-Mischung (30:9:1, 20 ml) behandelt und das Harz filtriert und mit 2 ml Wasser gewaschen. Das vereinigte Filtrat wurde in Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und mit Ether extrahiert. Die wässrige Schicht wurde mit 1N Salzsäure angesäuert und mit EtOAc (3 × 75 ml) extrahiert. Die vereinigte EtOAc-Schicht wurde mit Wasser und Natriumchloridlösung gewaschen, dann über Na2SO4 getrocknet und in Vakuum verdampft, was einen amorphen Feststoff ergab. Die derart erhaltene rohe Pentapeptidsäure wurde aus McOH-Ether umkristallisiert, was die Titelverbindung ergab. Ausbeute: 0,16 g, (77%); Rf 0,8 (d); Schmelzpunkt 140–141°C; [a]D25 = –5,6° (c = 0,54, McOH); FAB-MS [M+H]⁺ 570; ¹H NMR (DMSO-d₆) δ: 0,91 (d, 6H), 3,8-3,9 (m, 4H), 4,26, 4,37 und 4,60 (C^α-Protonen), 6,8-7,1 (ABq, 4H), 7,30 (m, 5H), 7,5-8,5 (NHs), 9,05 (s, 1H, phenolisches OH)
BEISPIEL 5
Synthese von Lys-Thr-Thr-Lys-Ser-OH (Verbindung 5)
Boc-Ser(Bzl) wurde mithilfe des Standardverfahrens an das Hydroxyethylsulfenylacetamid-Harz gebunden. Der feste Träger (0,73 g, 0,25 mmol) mit einer Substitution von 0,34 meq/g wurde in das Reaktionsgefäß eingetragen und in Dichlormethan (DCM) unter Rühren in Stickstoffatmosphäre quellen gelassen. Nach 30 min wurde das Harz filtriert und mit DCM gewaschen. Zu dem Harz wurde eine Lösung aus Boc-Ser(Bzl) (0,30 g, 1,0 mmol), und 15 ml Dimethylaminopyridin (DMAP) oder N-Methylimidazol (NMI) (0,2 mmol) in DCM/DMF (1:1) gegeben. Dann wurde DIC (0,16 ml, 1 mmol) zu der Reaktionsmischung gegeben. Diese Mischung wurde 8–10 h lang gerührt. Das Harz wurde dreimal mit DCM gewaschen und getrocknet. Mit einem Aliquot des getrockneten Harzes (2,0 mg) wurde die Beladung geprüft, was eine Beladung von 81% ergab [Verfahren B]. Zum Entfernen der Boc-Gruppe wurde das Harz 30 min lang mit 50% TFA in DCM behandelt. Nach 30 min wurde das Harz filtriert und mit DCM, 20 ml × 3,3, 20% DIEA in DCM, 20 ml × 3, DCM, 20 ml × 3, gewaschen. Das Harz mit der freien Aminogruppe Boc-Lys(Cl-Z) wurde mit den sich daran anschließenden Aminosäuren gekoppelt, es wurden dann nämlich nacheinander Boc-Lys(2-Cl-Z), Boc-Thr(Bzl), Boc-Thr(Bzl) und schließlich Boc-Lys(2-Cl-Z) mit der wachsenden Peptidkette gekoppelt. Das Entfernen der Boc-Gruppe in jedem Schritt erfolgte unter Verwendung von 50% TFA in CH2Cl2. Das fertige geschützte Peptid Boc-Lys(2-Cl-Z)-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(2-Cl-Z)-Ser(Bzl)-OH wurde dann durch Behandlung des Harzes mit 0,1N NaOH erhalten. Das geschützte Peptid wurde dann unter Verwendung von Pd/C einer katalytischen Transferhydrierung unterworfen, was Boc-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser-OH ergab. Im letzten Schritt wurde die Boc-Gruppe unter Verwendung von 5N HCl in Dioxan entfernt, was das Endpeptid Lys-Thr-Thr-Lys-Ser-OH ergab. Ausbeute 0,09 g, (78,5%); R_f 0,33 (F); Schmelzpunkt 158°C; FAB-MS [M+H]⁺ 564; [α]_D ²⁵ = +20° (c = 0,1, DMF); ¹H NMR (DMSO-d₆) δ: 1,06 (d, 3H), 1,10 (d, 3H), 1,36 (m, 2H), 1,53 (m, 2H), 2,73 (t, 4H), 4,15 (m, 2H), 4,16-4,4 (C^αHs), 7,49 (t, 3H), 7,59 (t, 3H), 7,8-8,70 (NHs).
BEISPIEL 6
Synthese von Boc-Gly-L-Phe-OH (Verbindung 6)
Die Titelverbindung (0,5 mmol Maßstab) wurde auf dem vorstehend genannten basenlabilen Linkser, der an den festen Träger gebunden war, auf ähnliche Weise wie bei der Herstellung von 2 synthetisiert. Ausbeute 0,10 g (76%); R_f 0,34 (a); Schmelzpunkt 118°C; [α]_D ²⁵ = +40° (c = 0,11, DMF); FAB-MS [M+H]⁺ 323; ¹H NMR (DMSO-d₆) δ: 1,16 (s, 9H), 2,3 (m, 2H), 3,6 (m, 2H), 4,58 (bs, 1H), 7,4 (m, 5H), 7,9-8,2 (NHs).
BEISPIEL 7
Boc-Gly-D-Phe-OH (Verbindung 7)
Auf ähnliche Weise wurde Verbindung 7 im 0,5 mmol-Maßstab synthetisiert. Ausbeute: 0,12 g (80%); R_f 0,34 (a); Schmelzpunkt 109°C; [α]_D ²⁵ = +50° (c = 0,11); FAB-MS [M+H]⁺ 323; ¹H NMR (DMSO-d₆) δ: 1,16 (s, 9H), 2,3 (m, 2H), 3,6 (m, 2H), 4,58 (bs, 1H), 7,4 (m, 5H), 7,9-8,2 (NHs).
BEISPIEL 8
Synthese von 2-(4-Methoxyphenyl)thiazolidin-4-carbonsäure (Verbindung 8)
Im Handel erhältliches Fmoc-Cys(Trt) wurde mithilfe des DIC/DMAP-Verfahrens an den festen Träger 1 auf der Basis eines Linker gebunden. Der feste Träger (1,0 g) mit einer Substitution von 0,4 meq/g wurde in das Reaktionsgefäß eingetragen und in Dichlormethan (DCM) unter Rühren in Stickstoffatmosphäre quellen gelassen. Nach 30 min wurde das Harz filtriert und mit DCM gewaschen. Zu dem Harz wurde eine Lösung aus Fmoc-Cys(Trt) (0,70 g, 1,2 mmol), und 20 ml Dimethylaminopyridin (DMAP) oder N-Methylimidazol (NMI) (0,4 mmol) in DCM/DMF (1:1) gegeben. Diese Mischung wurde 8–10 h lang gerührt. Das Harz wurde dreimal mit DCM gewaschen und getrocknet. Mit einem Aliquot des Harzes wurde durch Behandlung mit 20% Piperidin und anschließender Bestimmung der Extinktion mit UV [Verfahren A] die Beladung geprüft. Es ergab sich eine Beladung von 90%. Das Harz mit Fmoc-Cys(Trt) wurde zum Entfernen der Fmoc-Gruppe 20 min lang mit 20 ml 20% Piperidin in DCM/DMF (1:1) behandelt. Das Harz wurde dreimal mit DCM gewaschen und dann zum Entfernen der Tritylgruppe von Cys 30 min lang (dreimal) mit 10% Trifluorsäure (TFA)/Bu3SiH behandelt. Nach dreimaligem Waschen des Harzes mit DCM wurden unter Rühren 15 ml einer Lösung aus p-Anisaldehyd (0,5 ml) in DCM/DMF (1:1) zugegeben und das Rühren 8–10 h lang fortgesetzt. Das Harz wurde dreimal mit DCM gewaschen und getrocknet. Es wurde 30 min lang unter Rühren in Stickstoffatmosphäre mit einer Dioxan/MeOH/4N NaOH-Mischung (30:9:1, 20 ml) behandelt und das Harz filtriert und mit 2 ml Wasser gewaschen. Das vereinigte Filtrat wurde in Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und mit Ether extrahiert. Die wässrige Schicht wurde mit 1N Salzsäure angesäuert und mit EtOAc (3 × 70 ml) extrahiert. Die vereinigte EtOAc-Schicht wurde mit Wasser und Natriumchloridlösung gewaschen, dann über Na₂SO₄ getrocknet und in Vakuum verdampft, was 2-(4-Methoxyphenyl)thiazolidin-4-carbonsäure als weißes kristallines Material ergab. Ausbeute: 0,061 g, 72%; Schmelzpunkt 150–51°C; FAB-MS [M+H]⁺ 239; ¹H NMR (DMSO-d₆) δ: 3,5 (m, 2H), 3,7 (s, 3H), 4,8 (bs, 1H), 5,9 (bs, 1H), 6,8-7,1 (Abq, 4H)
BEISPIEL 9
Synthese von N-Boc-2-(4-Methoxyphenyl)thiazolidin-4-carbonsäure (Verbindung 9)
Im Handel erhältliches Fmoc-Cys(Trt) wurde mithilfe des DIC/DMAP-Verfahrens an den festen Träger # auf der Basis eines Linker gebunden. Der feste Träger (0,50 g) mit einer Substitution von 0,34 meq/g wurde in das Reaktionsgefäß eingetragen und in Dichlormethan (DCM) unter Rühren in Stickstoffatmosphäre quellen gelassen. Nach 30 min wurde das Harz filtriert und mit DCM gewaschen. Zu dem Harz wurde eine Lösung aus Fmoc-Cys(Trt) (0,56 g, 1,0 mmol), und 20 ml Dimethylaminopyridin (DMAP) oder N-Methylimidazol (NMI) (0,25 mmol) in DCM/DMF (1:1) gegeben. Diese Mischung wurde 8–10 h lang gerührt. Das Harz wurde dreimal mit DCM gewaschen und getrocknet. Mit einem Aliquot des Harzes wurde durch Behandlung mit 20% Piperidin und anschließender Bestimmung der Extinktion mit UV [Verfahren A] die Beladung geprüft, was eine Beladung von ungefähr 88% ergab. Das Harz mit Fmoc-Cys(Trt) wurde zum Entfernen der Fmoc-Gruppe 20 min lang mit 12 ml 20% Piperidin in DCM/DMF (1:1) behandelt. Das Harz wurde dreimal mit DCM gewaschen und dann zum Entfernen der Tritylgruppe von Cys 30 min lang (dreimal) mit 10% Trifluorsäure (TFA)/Bu3SiH behandelt. Nach dreimaligem Waschen des Harzes mit DCM wurden unter Rühren 10 ml einer Lösung aus p-Anisaldehyd (0,5 ml) in DCM/DMF (1:1) zugegeben. Das Rühren wurde 8–10 h lang fortgesetzt. Das Harz wurde dreimal mit DCM gewaschen. Dieses Harz wurde mit 10 ml einer Lösung aus Di-tert-butyldicarbonat (0,22 g, 1 mmol) und DIEA (0,2 ml, 1,0 mmol) in DCM/DMF (1:1) versetzt und das Rühren wurde 3 h lang fortgesetzt. Nach drei Stunden war der Kaiser-Test des Harzes negativ. Das Harz wurde mit DCM/DMF (1:1), 10 ml × 3, mit DMF, 10 ml × 3, DCM/DMF (1:1), 10 ml × 2, und schließlich dreimal mit DCM gewaschen und getrocknet. Es wurde 30 min lang unter Rühren in Stickstoffatmosphäre mit einer Dioxan/MeOH/4N NaOH-Mischung (30:9:1, 20 ml) behandelt und das Harz filtriert und mit 2 ml Wasser gewaschen. Das vereinigte Filtrat wurde in Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und mit Ether extrahiert. Die wässrige Schicht wurde mit 1N Salzsäure angesäuert und mit EtOAc (3 × 70 ml) extrahiert. Die vereinigte EtOAc-Schicht wurde mit Wasser und Natriumchloridlösung gewaschen, dann über Na2SO4 getrocknet und in Vakuum verdampft, was N-Boc-2-(4-Methoxyphenyl)thiazolidin-4-carbonsäure als weißes kristallines Material ergab. Ausbeute: 0,048 g, 82%; Schmelzpunkt 160–162°C; FAB-MS [M+H]⁺ 340; ¹H NMR (DMSO-d₆) δ: 1,2 (s, 9H), 3,4 (m, 2H), 3,9 (s, 3H), 4,7 (bs, 1H), 5,9 (bs, 1H), 6,8-7,1 (Abq, 4H)
BEISPIEL 10
Synthese von N-Benzoyl-2-(4-Methoxyphenyl)thiazolidin-4-carbonsäure (Verbindung 10)
Im Handel erhältliches Fmoc-Cys(Trt) wurde mithilfe des DIC/DMAP-Verfahrens an den festen Träger # auf der Basis eines Linker gebunden. Der feste Träger (0,50 g) mit einer Substitution von 0,34 meq/g wurde in das Reaktionsgefäß eingetragen und in Dichlormethan (DCM) unter Rühren in Stickstoffatmosphäre quellen gelassen. Nach 30 min wurde das Harz filtriert und mit DCM gewaschen. Zu dem Harz wurde eine Lösung aus Fmoc-Cys(Trt) (0,56 g, 1,0 mmol), und 20 ml Dimethylaminopyridin (DMAP) oder N-Methylimidazol (NMI) (0,25 mmol) in DCM/DMF (1:1) gegeben. Diese Mischung wurde 8–10 h lang gerührt. Ein Aliquot des Harzes wurde dreimal mit DCM gewaschen und getrocknet. Mit einem Aliquot des Harzes wurde durch Behandlung mit 20% Piperidin und anschließender Bestimmung der Extinktion mit UV [Verfahren A] die Beladung geprüft, was eine Beladung von ungefähr 88% ergab. Das Harz mit Fmoc-Cys(Trt) wurde zum Entfernen der Fmoc-Gruppe 20 min lang mit 12 ml 20% Piperidin in DCM/DMF (1:1) behandelt. Das Harz wurde dreimal mit DCM gewaschen und dann zum Entfernen der Tritylgruppe von Cys 30 min lang (dreimal) mit 10% Trifluoressigsäure (TFA)/Bu₃SiH behandelt. Nach dreimaligem Waschen des Harzes mit DCM wurden unter Rühren 10 ml einer Lösung aus p-Anisaldehyd (0,5 ml) in DCM/DMF (1:1) zugegeben. Das Rühren wurde 8–10 h lang fortgesetzt. Das Harz wurde dreimal mit DCM gewaschen. Dieses Harz wurde mit 10 ml einer Lösung aus Benzoylchlorid (0,2 ml, 2 mmol) und DIEA (0,4 ml, 2,0 mmol) in DCM/DMF (1:1) versetzt und das Rühren wurde 3 h lang fortgesetzt, bis der Kaiser-Test negativ war. Das Harz wurde mit DCM/DMF (1:1), 10 ml × 3, mit DMF, 10 ml × 3, DCM/DMF (1:1), 10 ml × 2, und schließlich dreimal mit DCM gewaschen und getrocknet. Es wurde 30 min lang unter Rühren in Stickstoffatmosphäre mit einer Dioxan/MeOH/4N NaOH-Mischung (30:9:1, 20 ml) behandelt und das Harz filtriert und mit 2 ml Wasser gewaschen. Das vereinigte Filtrat wurde in Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und mit Ether extrahiert. Die wässrige Schicht wurde mit 1N Salzsäure angesäuert und mit EtOAc (3 × 70 ml) extrahiert. Die vereinigte EtOAc-Schicht wurde mit Wasser und Natriumchloridlösung gewaschen, dann über Na₂SO₄ getrocknet und in Vakuum verdampft, was N-Benzoyl-2-(4-Methoxyphenyl)thiazolidin-4-carbonsäure als weißes kristallines Material ergab. Ausbeute: 0,043 g, 72%; Schmelzpunkt 108–110°C; FAB-MS [M+H]⁺ 344; ¹H NMR (DMSO-d₆) δ: 3,3 (m, 2H), 3,9 (s, 3H), 4,7 (bs, 1H), 5,7 (bs, 1H), 6,6 (m 5H), 6,9-7,2 (Abq, 4H).
BEISPIEL 11
Synthese von N-Boc-2-(4-Methoxyphenyl)thiazolidinylleucin (Verbindung 11)
Der neue feste Träger auf der Basis eines Linkers 1 (1,0 g) mit einer Substitution von 0,4 meq/g wurde in das Reaktionsgefäß eingetragen und in Dichlormethan (DCM) unter Rühren in Stickstoffatmosphäre quellen gelassen. Nach 30 min wurde das Harz filtriert und mit DCM gewaschen. Zu dem Harz wurde eine Lösung aus Boc-Leu (0,45 g, 2 mmol), und 20 ml Dimethylaminopyridin (DMAP) oder N-Methylimidazol (NMI) (0,4 mmol) in DCM/DMF (1:1) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 8–10 h lang gerührt. Das Harz wurde dreimal mit DCM gewaschen und getrocknet. Mit einem Aliquot des getrockneten Harzes (2,5 mg) wurde die Beladung geprüft, was eine Beladung von 82% ergab [Verfahren B]. Zum Entfernen der Boc-Gruppe wurde das Harz 30 min lang mit 50% TFA in DCM behandelt. Nach 30 min wurde das Harz filtriert und mit DCM, 20 ml × 3, 20% DIEA in DCM, 20 ml × 3, DCM, 20 ml × 3, gewaschen und schließlich in 20 ml 20%iger Piperidinlösung mit DMF/DCM (1:1) suspendiert und mit 20 ml DCM/DMF (1:1) behandelt. Das Harz mit der freien Aminogruppe Leu wurde mit 20 ml einer Lösung aus Boc-Cys-(Trt) (0,56 g, 1 mmol) und HOBt (0,153 g, 1 mmol) in DCM:DMF (1:1) unter Rühren in Stickstoffatmosphäre umgesetzt. Diese Suspension wurde mit DIC (0,18 ml, 1,2 mmol) versetzt und die Mischung 3 h lang bis zum negativen Kaiser-Test gerührt. Sie wurde filtriert und mit DCM/DMF (1:1), 15 ml × 3, und schließlich mit DCM gewaschen. Das Harz wurde 30 min lang mit 50% Trifluoressigsäure (TFA)/Bu3SiH in DCM behandelt und dann zum Entfernen der Boc- und der Tritylgruppe von Cys 10 min lang (dreimal) mit 10% Trifluorsäure (TFA)/Bu3SiH in DCM behandelt. Nach dreimaligem Waschen des Harzes mit DCM wurden unter Rühren 10 ml einer Lösung aus p-Anisaldehyd (0,5 ml) in DCM/DMF (1:1) zugegeben. Das Rühren wurde 8–10 h lang fortgesetzt. Das Harz wurde dreimal mit DCM gewaschen. Dieses Harz wurde mit 10 ml einer Lösung aus Benzoylchlorid (0,2 ml, 2 mmol) und DIEA (0,4 ml, 2,0 mmol) in DCM:DMF (1:1) versetzt und das Rühren wurde 3 h lang fortgesetzt. Nach drei Stunden war der Kaiser-Test des Harzes negativ. Das Harz wurde mit DCM/DMF (1:1), 10 ml × 3, mit DMF, 10 ml × 3, DCM/DMF (1:1), 10 ml × 2, und schließlich dreimal mit DCM gewaschen und getrocknet. Es wurde 30 min lang unter Rühren in Stickstoffatmosphäre mit einer Dioxan/MeOH/4N NaOH-Mischung (30:9:1, 20 ml) behandelt und das Harz filtriert und mit 2 ml Wasser gewaschen. Das vereinigte Filtrat wurde in Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und mit Ether extrahiert. Die wässrige Schicht wurde mit 1N Salzsäure bis pH 2,0 angesäuert und mit EtOAc (3 × 70 ml) extrahiert. Die vereinigte EtOAc-Schicht wurde mit Wasser und Natriumchloridlösung gewaschen, dann über Na₂SO₄ getrocknet und in Vakuum verdampft, was N-Boc-2-(4-Methoxyphenyl)thiazolidinylleucin als weißes kristallines Material ergab. Ausbeute: 0,11 g, 78%; FAB-MS [M+H]⁺ 453; ¹H NMR (DMSO-d₆) δ: 0,9 (m, 6H), 1,2 (bs, 9H), 1,7 (m, 2H), 4,3 (m 1H), 3,5 (m, 2H), 3,7 (s, 3H), 4,86 (bs, 1H), 5,9 (bs, 1H), 6,8-7,1 (Abq, 4H).
VORTEILE DER ERFINDUNG:
Der neue feste Träger auf der Basis eines Linkers, Hydroxyethylsulfenylacetamid-Harz (HESA-Harz), wie in Formel 1, I, dargestellt ist ein orthogonal kompatibler fester Träger für die Peptidsynthese, kann nämlich zur Synthese biologisch aktiver Peptide unter Verwendung der Boc- und Fmoc-Chemie getrennt oder in Kombination verwendet werden. Da die Spaltung der Produkte vom Träger eine sehr milde Alkalinität verlangt, bietet sie eine schnelle Synthese von geschützten Peptidfragmenten, die für die konvergierende Synthese großer Peptide nützlich ist. Die Peptide werden mit hoher Ausbeute und hervorragender Reinheit synthetisiert. Ferner enthalten die Produkte keine Racemate. Das ermöglicht die Synthese von Sequenzen mit oxidationsanfälligen Aminosäuren am C-Terminus. Der neue feste Träger kann für die Festphasensynthese kleiner organischer Moleküle und die Erzeugung kombinatorischer Bibliotheken aus Peptiden und kleinen organischen sowie heterocyclischen Molekülen verwendet werden kann. Der neue feste Träger kann sehr zweckmäßig in großen Mengen im Labor synthetisiert werden und verlangt keine speziellen Vorsichtsmaßregeln bei der Lagerung und kann für die anschließende Anwendung für Synthesen monatelang bei Umgebungstemperatur aufbewahrt werden. Ferner wurde ein neues, bisher unbekanntes Verfahren zu dessen Synthese entwickelt.

Claims

Fester Träger auf der Basis eines Linkers zur Verwendung bei der Peptidsynthese und kombinatorischen Bibliotheksynthese, aufweisend einen Hydroxyethylsulfenylacetamid-(HESA-) Linkeranteil der Formel CH₂OH-CH₂-S-CH₂-CO-NH, der kovalent an einen festen Träger gebunden ist.
Fester Träger auf der Basis eines Linkers nach Anspruch 1, wobei der Linkeranteil kovalent an einen festen Träger gebunden ist ausgewählt unter aminofunktionellen Membranen, porösem Glas, Siliciumdioxid, Polystyrolen, Polydimethylacrylamiden, Baumwolle und Papier.
Fester Träger auf der Basis eines Linkers nach Anspruch 2, wobei der Linkeranteil entweder direkt oder durch eine Methylengruppe kovalent an einen festen Polystyrolträger gebunden ist.
Fester Träger auf der Basis eines Linkers nach Anspruch 1, wobei der Träger für die Festphasensynthese von Peptiden, geschützten Peptidfragmenten und kleinen organischen Molekülen/Oligonukleotiden nützlich ist.
Fester Träger auf der Basis eines Linkers nach Anspruch 4, wobei die Endprodukte der Festphasensynthese unter milden alkalischen Bedingungen spaltbar sind.
Fester Träger auf der Basis eines Linkers nach Anspruch 4, wobei die Endprodukte der Festphasensynthese von dem festen Träger durch Anwendung einer Mischung von wässrigem 0,1–0,5 N Alkali und organischen Lösungsmitteln ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Dioxan, Tetrahydrofuran, Methanol, Ethanol und Dimethylformamid abpaltbar sind.
Fester Träger auf der Basis eines Linkers nach Anspruch 1, des Weiteren funktionalisiert mit funktionellen Gruppen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aldehyd-, Carboxyl-, Thiol-, Amino- und Polyaminogruppen, wobei der feste Träger auf der Basis eines Linkers als Radikalfängerharz und immobilisiertes Reagenz nützlich ist.
Verfahren für die Synthese eines festen Trägers auf der Basis eines Linkers wie in Anspruch 1 definiert, für die Verwendung bei der Peptidsynthese und kombinatorischen Bibliotheksynthese, wobei die Methode Folgendes umfasst: i) das Reagieren von Chloressigsäure oder ihres Äquivalents enthaltend eine geeignete Austrittsgruppe anstatt Halogen, mit einem Aminomethylharz in Gegenwart von Diisopropylcarbodiimid oder irgendeines anderen häufig verwendeten Kopplungsreagenses zum Erhalten eines festen Trägers, der eine Austrittsgruppe aufweist, ii) das Reagieren des obigen festen Trägers, der eine Austrittsgruppe aufweist, mit Mercaptoethanol in Gegenwart von Natriumiodid, um den erwünschten festen Träger auf der Basis eines Linkers zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der feste Träger auf der Basis eines Linkers für die Festphasensynthese von Peptiden, geschützten Peptidfragmenten und kleinen organischen Molekülen verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der feste Träger auf der Basis eines Linkers für die Festphasensynthese von Peptiden durch das Boc-Chemiprotokol verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der feste Träger auf der Basis eines Linkers für die Festphasensynthese von Peptiden durch das Fmoc-Chemieprotokoll verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der feste Träger auf der Basis eines Linkers für die Festphasensynthese von Peptiden sowohl durch die Boc- als auch die Fmoc-Chemieprotokolle getrennt oder in Kombination verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der feste Träger auf der Basis eines Linkers für die Festphasensynthese von heterocyclischen kleinen organischen Molekülen wie Thiazolidinderivaten verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der feste Träger auf der Basis eines Linkers für die Festphasensynthese von kleinen organischen Molekülen für kombinatorische Bibliotheken verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Endprodukte der Festphasensynthese unter milden alkalischen Bedingungen gespalten werden.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Endprodukte der Festphasensynthese von dem festen Träger unter Anwendung einer Mischung von wässrigem 0,1–0,5 N Alkali und organischen Lösungsmitteln ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Dioxan, Tetrahydrofuran, Methanol, Ethanol und Dimethylformamid, gespalten werden.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der feste Träger auf der Basis eines Linkers nach geeigneter Modifizierung mit funktionellen Gruppen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aldehyd-, Carboxyl-, Thiol-, Amino- und Polylaminogruppen als Reinigungsharz oder immobilisiertes Reagenz verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Reaktionen des Schritts (i) in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels ausgeführt werden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Methylenchlorid, Tetrahydrofuran, Dimethylformamid, Ether, Petroleumether, Essigsäure und Methanol, in Gegenwart von N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid, 1-Hydroxybenzotriazol und N-Hydroxysuccinimid bei einer Temperatur im Bereich zwischen 15°C und 85°C.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Reaktionen von Schritt (i) unter Anwendung von Kopplungsreagentien durchgeführt werden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Dicyclohexylcarbodiimid, gemischtem Anhydrid, aktiven Estern, Benzotriazol-1-yl-oxy-tris(dimethylamino)phosphoniumhexafluorphosphat (BOP), Benzotriazol-1-yltetramethyluroniumhexafluorphosphat (HBTU) und 7-Azabenzotriazol-1-yltetramethyluroniumhexafluorphosphat (HATU).
Verfahren nach Anspruch 9, wobei Säuren für die acidolytische Spaltung der Schutzgruppen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus HBr:AcOH, HCl:Dioxan, Ameisensäure und Trifluoressigsäure, verwendet werden.