DE60119552T2

DE60119552T2 - Isolierte peptide, die an hla-c moleküle binden und deren verwendung

Info

Publication number: DE60119552T2
Application number: DE60119552T
Authority: DE
Inventors: Ludwig Institute for Cancer Rch Sacha New York GNJATIC; J. Lloyd New York OLD; Yasuhiro New York NAGATA; Elke Jager; Yao-Tseng New York CHEN; Alexander Knuth
Original assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Cornell Research Foundation Inc; Ludwig Institute for Cancer Research New York
Current assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Cornell Research Foundation Inc; Ludwig Institute for Cancer Research New York
Priority date: 2000-09-26
Filing date: 2001-09-24
Publication date: 2007-04-19
Anticipated expiration: 2021-09-25
Also published as: US20030050451A1; EP1320609A2; HK1060594A1; US7009035B2; CA2423481C; CA2423481A1; CN1476480A; WO2002026778A2; EP1320609B1; AU2001293051B2; WO2002026778A3; DE60119552D1; ATE325876T1; CN1253572C; JP4174570B2; AU9305101A; US6506875B1; JP2004524271A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft Peptide, die im Zusammenhang mit zellulärer Immunologie nützlich sind. Insbesondere betrifft die Erfindung Peptide, die sich an HLA-Moleküle an der Oberfläche von Zellen binden. Zumindest manche dieser Peptide induzieren auch die Aktivierung von zytolytischen T-Zellen, wenn sie mit ihrem Partner-HLA-Molekül einen Komplex bilden. Ebenfalls Teil der Erfindung sind die Verwendungen dieser Peptide in Bereichen wie der Identifikation von HLA-Cw3- und HLA-Cw6-positiven Zellen, der Provokation von T-Zellen, der Bestimmung der Gegenwart bestimmter T-Zellen sowie die zytolytischen T-Zellen selbst.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG UND STAND DER TECHNIK
Die Untersuchung der Erkennung oder mangelnden Erkennung von Krebszellen durch einen Wirtsorganismus ist in zahlreichen verschiedenen Bereichen bereits weit vorgedrungen. Das Verständnis dieses wissenschaftlichen Bereiches setzt eine gewisse Kenntnis der Grundlagen von Immunologie und Onkologie voraus.
Frühe Forschungsarbeiten an Maustumoren zeigten, dass diese Moleküle aufwiesen, die zur Abstoßung von Tumorzellen führten, wenn diese in syngenetische Tiere transplantiert wurden. Diese Moleküle werden durch T-Zellen in Rezipienten-Tieren "erkannt" und provozieren eine zytolytische T-Zellen-Antwort mit Lyse der transplantierten Zellen. Dieser Beweis wurde als erstes für Tumoren erhalten, die in vitro durch chemische Karzinogene wie z.B. Methylcholanthren induziert wurden. Die von den Tumoren exprimierten Antigene, die die T-Zellen-Antwort hervorriefen, wurden als unterschiedlich für jeden Tumor erkannt. Siehe Prehn et al., J. Natl. Canc. Inst. 18, 769-778 (1957); Klein et al., Cancer Res. 20, 1561-1572 (1960); Gross, Cancer Res. 3, 326-333 (1943); Basombrio, Cancer Res. 30, 2458-2462 (1970), bezüglich allgemeiner Beschreibungen zur Induktion von Tumoren mit chemischen Karzinogenen und Unterschieden bezüglich Zelloberflächenantigenen. Diese Klasse von Antigenen ist mittlerweile als "tumorspezifische Transplantationsantigene" oder "TSTAs" bekannt. Nach der Beobachtung der Präsentation solcher Antigene, wenn sie von che mischen Karzinogenen induziert wurden, wurden ähnliche Resultate erhalten, wenn Tumoren in vitro mittels ultravioletter Strahlung induziert wurden. Siehe Kripke, J. Natl. Canc. Inst. 53, 333-1336 (1974).
Während T-Zellen-vermittelte Immunantworten für die oben beschriebenen Tumortypen beobachtet wurden, wurde für spontane Tumoren angenommen, dass sie im Allgemeinen nicht-immunogen sind. Für diese wurde daher angenommen, dass sie keine Antigene präsentieren, die eine Antwort auf den Tumor in Tumoren aufweisenden Individuen provozieren. Siehe Hewitt et al., Brit. J. Cancer 33, 241-259 (1976). Die Familie von Tum-Antigen-präsentierenden Zelllinien umfasst immunogene Varianten, die durch Mutagenese von Maustumorzellen oder -zelllinien erhalten werden, wie von Boon et al., J. Exp. Med. 152, 1184-1193 (1980), beschrieben wird, dessen Offenbarung hierin durch Verweis aufgenommen ist. Näher beschrieben werden Tum-Antigene durch Mutation von Tumorzellen gewonnen, die keine Immunantwort in syngenetischen Mäusen hervorrufen, und bilden Tumoren (d.h. "Tum⁺"-Zellen). Wenn diese Tum⁺-Zellen Mutagenese unterzogen werden, so werden sie von syngenetischen Mäusen abgestoßen und bilden keine Tumoren (sind somit "Tum^–"). Siehe Boon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 272 (1977), dessen Offenbarung hierin durch Verweis aufgenommen ist. Für zahlreiche Tumortypen wurde gezeigt, dass sie dieses Phänomen an den Tag legen. Siehe z.B. Frost et al., Cancer Res. 43, 125 (1983). Es scheint, dass Tum^–-Varianten keine fortschreitenden Tumoren bilden können, da sie eine Immunabstoßungsprozess initiieren. Der Beweis, der diese Hypothese untermauert, beruht auf der Fähigkeit von "Tum^–"-Varianten von Tumoren, d.h. jenen, die normalerweise keine Tumoren bilden, Tumoren in Mäusen zu bilden, deren Immunsysteme durch subletale Bestrahlung unterdrückt werden, Van Pel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5282-8285 (1979); und auf der Beobachtung, dass sich intraperitoneal injizierte Tum^–-Zellen aus Mastozytom P815 12-15 Tage lang exponentiell vermehren und dann innerhalb von nur einigen wenigen Tagen inmitten eines Zustroms von Lymphozyten und Makrophagen eliminiert werden (Uyttenhove et al., J. Exp. Med. 152, 1175-1183 (1980)). Ein weiterer Beweis umfasst die Beobachtung, dass Mäuse ein Immungedächtnis entwickeln, das es ihnen ermöglicht, gegenüber einer späteren Provokation mit der Variante desselben Durchgangs resis tent zu sein, auch wenn immunsupprimierende Strahlungsmengen mit dem folgenden Challenge von Zellen verabreicht werden (Boon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 272-275 (1977); Van Pel et al., s.o.; Uyttenhove et al., s.o.). In späteren Forschungsarbeiten wurde erkannt, dass, wenn spontane Tumoren Mutagenese unterzogen wurden, immunogene Varianten produziert wurden, die eine Antwort hervorriefen. Tatsächlich waren diese Varianten in der Lage, eine schützende Immunantwort gegen den ursprünglichen Tumor hervorzurufen. Siehe Van Pel et al., J. Exp. Med. 157, 1992-2001 (1983). Somit wurde gezeigt, dass es möglich ist, die Präsentation eines so genannten "Tumorabstoßungsantigen" in einem Tumor hervorzurufen, das ein Target für eine syngenetische Abstoßungsantwort darstellt. Ähnliche Resultate wurden erzielt, wenn Fremdgene in spontane Tumoren transfiziert wurden. Siehe diesbezüglich Fearon et al., Cancer Res. 48, 2975-2980 (1988).
Eine Klasse von Antigenen wurde erkannt, die an der Oberfläche von Tumorzellen präsentiert und von zytolytischen T-Zellen erkannt werden, was zu Lyse führt. Diese Klasse von Antigenen wird nachstehend als "Tumorabstoßungsantigene" oder "TRAs" bezeichnet. TRAs können Antikörperreaktionen hervorrufen oder auch nicht. Das Ausmaß, in dem diese Antigene bisher untersucht wurden, war mittels Charakterisierungsstudien von zytolytischen T-Zellen in vitro, d.h. eine Studie der Identifikation des Antigens durch eine bestimmte Untergruppe von zytolytischen T-Zellen (nachstehend als "CTL" bezeichnet). Die Untergruppe proliferiert bei Erkennung des präsentierten Tumorabstoßungsantigens, und die die Tumorabstoßungsantigene präsentierenden Zellen werden lysiert. Charakterisierungsstudien identifizierten CTL-Klone, die Zellen spezifisch lysieren, die die Tumorabstoßungsantigene exprimieren. Beispiele für diese Arbeit sind in Levy et al., Adv. Cancer Res. 24, 1-59 (1977); Boon et al., J. Exp. Med. 152, 1184-1193 (1980); Brunner et al., J. Immunol. 124, 1627-1634 (1980); Maryanski et al., Eur. J. Immunol. 124, 1627-1634 (1980); Maryanski et al., Eur. J. Immunol. 12, 406-412 (1982); Palladino et al., Cancer Res. 47, 5074-5079 (1987), zu finden. Diese Art von Analyse ist für andere Typen von Antigenen erforderlich, die durch CTLs erkannt werden, einschließlich kleiner Histokompatibilitätsantigene, der männlichen spezifischen H-Y-Antigene und der Gruppe von Antigenen, die als "Tum^–"-Antigene, wie hierin erläutert, bezeichnet werden.
Ein Tumor, der ein Beispiel für den oben beschriebenen Gegenstand ist, ist als P815 bekannt. Siehe DePlaen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2274-2278 (1988); Szikora et al., EMBO J. 9, 1041-1050 (1990); und Sibille et al., J. Exp. Med. 172, 35-45 (1990), deren Offenbarungen durch Verweis aufgenommen sind. Der P815-Tumor ist ein Mastozytom, induziert in einer DBA/2-Maus mit Methylcholanthren und sowohl als In-vitro-Tumor als auch als Zelllinie kultiviert. Die P815-Linie bildete zahlreiche Tum-Varianten nach erfolgter Mutagenese, einschließlich Varianten, die als P91A (DePlaen, s.o.), 35B (Szikora, s.o.) und P198 (Sibille, s.o.) bezeichnet werden. Im Gegensatz zu Tumorabstoßungsantigenen – und dies ist eine zentrale Unterscheidung – sind die Tum-Antigene nur vorhanden, nachdem die Tumorzellen Mutagenese unterzogen wurden. Tumorabstoßungsantigene sind an Zellen eines gegebenen Tumors ohne Mutagenese vorhanden. Somit kann, unter Verweis auf die Literatur, eine Zelllinie Tum⁺ sein, wie beispielsweise die Linie, die als "P1" bezeichnet wird, und kann provoziert werden, um Tum^–-Varianten zu produzieren. Da sich der Tum^–-Phänotyp von jenem der Eltern-Zelllinie unterscheidet, wird ein Unterschied in der DNA von Tum-Zelllinien im Vergleich zu ihren Tum⁺-Eltern-Linien erwartet, und dieser Unterschied kann verwendet werden, um das Gen von Interesse in Tum^–-Zellen zu lokalisieren. Folglich wurde erkannt, dass sich Gene von Tum-Varianten wie P91A, 35B und P198 von ihren normalen Allelen durch Punktmutationen in den Kodierregionen des Gens unterscheiden. Siehe Szikora & Sibille, s.o., und Lurquin et al., Cell 58, 293-303 (1989). Es erwies sich, dass dies für die TRAs dieser Erfindung nicht der Fall ist. Diese Publikationen zeigten auch, dass Peptide, die aus dem Tum^–-Antigen stammen, von H-2^d-Klasse-I-Molekülen zur Erkennung durch CTLs präsentiert werden. P91A wird von L^d, P35 von D^d und P198 von K^d präsentiert.
Die PCT-Anmeldung PCT/US92/04354, eingereicht am 22. Mai 1992 und demselben Abtretungsempfänger wie die vorliegende Anmeldung übertragen, lehrt eine Familie von für menschlichen Tumorabstoßungsgen-Vorläufer kodierenden Genen, die hierin als die MAGE-Familie bezeichnet wird. Mehrere von diesen Genen werden auch in van der Bruggen et al., Science 254, 1643 (1991), erläutert. Mittlerweile ist bekannt, dass die verschiedenen Gene der MAGE-Familie in Tumorzellen exprimiert werden und als Marker für die Diagnose solcher Tumoren sowie den darin erläuterten Zwe cken dienen können. Siehe auch Traversari et al., Immunogenetics 35, 145 (1992); van der Bruggen et al., Science 254, 1643 (1991), und De Plaen et al., Immunogenetics 40, 360 (1994). Der Mechanismus, durch den ein Protein verarbeitet und an einer Zelloberfläche präsentiert wird, wurde mittlerweile recht gut dokumentiert. Eine oberflächliche Zusammenfassung der Entwicklung auf dem Gebiet ist in Barinaga, "Getting Some 'Backbone': How MHC Binds Peptides", Science 257, 880 (1992), zu finden; siehe auch Fremont et al., Science 257, 919 (1992); Matsumura et al., Science 257, 927 (1992); Engelhard, Ann. Rev. Immunol. 12, 181-207 (1994); Madden et al., Cell 75, 693-708 (1993); Ramensee et al., Ann. Rev. Immunol. 11, 213-244 (1993); Germain, Cell 76, 287-299 (1994). Diese Schriften weisen im Allgemeinen auf das Erfordernis, dass das Peptid, das sich an ein MHC/HLA-Molekül bindet, neun Aminosäuren lang (ein "Nonapeptid") ist, sowie auf die Bedeutung des zweiten und neunten Rests des Nonapeptids hin. Bei H-2k^b nehmen die Ankerreste die Positionen 5 und 8 eines Octamers ein, bei H-2D^b liegen sie an den Positionen 5 und 9 eines Nonapeptids, während die Ankerreste für HLA-A1 an den Positionen 3 und 9 eines Nonamers liegen. Im Allgemeinen sind bei den HLA-Molekülen die Positionen 2 und 9 Anker.
Studien der MAGE-Familie von Genen zeigten nun, dass ein bestimmtes Nonapeptid tatsächlich an der Oberfläche mancher Tumorzellen präsentiert wird und dass die Präsentation des Nonapeptids erfordert, dass das präsentierende Molekül HLA-A1 ist. Komplexe des MAGE-1-Tumorabstoßungsantigens (des "TRA" oder "Nonapeptids") führen zur Lyse der Zelle, die es durch zytolytische T-Zellen ("CTLs") präsentiert.
Forschungsarbeiten, die z.B. im US-Patent Nr. 5.405.940, eingereicht am 31. August 1992, und im US-Patent Nr. 5.571.711 präsentiert werden, erkannten, dass bei einem Vergleich homologer Regionen verschiedener MAGE-Gene mit der Region des MAGE-1-Gens, das für das relevante Nonapeptid kodiert, ein großes Ausmaß an Homologie zu finden ist. Tatsächlich führen diese Beobachtungen zu einem der Aspekte der Erfindung, der hierin offenbart und beansprucht wird und sich auf eine Familie von Nonapeptiden bezieht, die alle dieselben N-terminalen und C-terminalen Aminosäuren aufweisen. Diese Nonapeptide wurden als für verschiedene Zwecke nützlich beschrieben, was ihre Verwendung als Immunogene, entweder alleine oder gebunden an Trägerpeptide, umfasst. Nonapeptide sind ausreichend groß, um ein antigenes Epitop zu bilden, und die hiergegen gebildeten Antikörper wurden als für die Identifikation des Nonapeptids nützlich beschrieben, entweder in der Form, wie es alleine existiert, oder als Teil eines größeren Polypeptids.
Die vorangehende Übersicht zur relevanten Literatur zeigt, dass verschiedene Peptide, üblicherweise mit einer Länge von acht, neun oder zehn Aminosäuren, mit MHC-Molekülen Komplexe bilden und Targets für die Erkennung durch zytolytische T-Zellen darstellen. Zahlreiche Studien wurden an Melanomen durchgeführt, und Melanomantigene, die durch zytolytische T-Zellen erkannt werden, werden nun in drei große Kategorien eingeteilt. Die ersten, die zahlreiche der oben erläuterten Antigene (z.B. MAGE) umfassen, werden in manchen Melanomen sowie in anderen Tumortypen und gesunden/r Hoden und Plazenta exprimiert. Die Antigene sind das Expressionsprodukt von normalen Genen, die üblicherweise in normalen Geweben stumm sind.
Eine zweite Familie von Melanomantigenen umfasst Antigene, die von mutierten Formen normaler Proteine abstammen. Beispiele für diese Familie sind MUM-1 (Coulie et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 7976-7980 (1955)); CDK4 (Wölfel et al., Science 269, 1281-1284 (1955)); Bcatenin (Robbins et al., J. Exp. Med. 183, 1185-1192 (1996)); und HLA-A2 (Brandel et al., J. Exp. Med. 183, 2501-2508 (1996)). Eine dritte Kategorie, die auch bereits oben erläutert wurde, umfasst die Differenzierungsantigene, die sowohl von Melanom als auch Melanozyten exprimiert werden. Beispiele hierfür sind Tyrosinase, gp100, gp75 und Melan A/Mart-1. Siehe das US-Patent Nr. 5.620.886, hierin durch Verweis aufgenommen, in Bezug auf Melan-A. Siehe Wölfel et al., Eur. J. Immunol. 24, 759 (1994), und Brichard et al., Eur. J. Immunol. 26, 224 (1996), bezüglich Tyrosinase; Kang et al., J. Immunol. 155, 1343 (1995); Cox et al., Science 264, 716 (1994); Kawakami et al., J. Immunol. 154, 3961 (1995), bezüglich gp 100; Wang et al., J. Exp. Med. 183, 1131 (1996), bezüglich gp75.
Es gibt mehrere Ansätze, die zur Identifikation von HLA-eingeschränkten Peptiden zur Verfügung stehen. Boon et al., J. Exp. Med. 183, 725-729 (1996), beispielsweise beschreiben, wie Peptidtargets von CD8+-T-Zellen mit Reaktivität für autologe Melanomzellen identifiziert werden können. Das Verfahren erfordert den Transfer von Antigenexpression auf nicht-exprimierende Zellen entweder über Cosmide oder über cDNA-Vektoren. Siehe Van der Bruggen et al., Science 254, 1643-1650 (1991); bzw. Kawakami et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 6458-6492 (1994), die beide hierin durch Verweis aufgenommen sind. In jedem Fall muss das transfizierende Molekül für das relevante Antigen kodieren. Sofern erforderlich, kann auch ein HLA-Klasse-I-Restriktionselement verwendet werden. Siehe De Plaen et al., Methods 12, 125-142 (1997).
Wenn Kodiersequenzen für durch T-Zellen erkannte Tumorantigene identifiziert wurden, kann HLA-Bindungsmotivanalyse, wie sie von Falk et al., Nature 357, 290-296 (1991), beschrieben wird, zur Identifikation relevanter Peptide sehr nützlich sein.
Hunt et al., Science 255, 1261-1263 (1992), beschreiben ein Verfahren zur Identifikation von Peptiden durch Elution dieser aus HLA-Molekülen, Fraktionieren von ihnen über HPLC und anschließende Verwendung struktureller Identifikationsverfahren. Beispiele für die Verwendung dieses Verfahren sind in Cox et al., Science 264, 716-719 (1994); Skipper et al., J. Exp. Med. 183, 527-534 (1996); und Castelli et al., J. Exp. Med. 181, 363-368 (1995), zu finden. Dieser Ansatz weist technische Schwierigkeiten auf und kam bisher noch nicht sehr umfassend zum Einsatz.
Ein Ansatz zur Identifikation von Peptidtargets bekannter Tumorantigene, die Virusvektoren verwenden, ist bekannt. Das Verfahren induziert eine spezifische De-novo-Reaktion durch naive T-Zellen (Chaux et al., J. Immunol. 163, 2928-2936 (1999); Butterfield et al., J. Immunol. 161, 5607-5613 (1998)); und das Stimulieren und Vermehren sensibilisierter T-Zellen in vivo. Siehe z.B. Toso et al., Canc. Res. 56, 16-20 (1996); Yee et al., J. Immunol. 157, 4079-4086 (1996); Kim et al., J. Immunother. 20, 276-286 (1997); Ferrari et al., Blood 90, 2406-2416 (1997). Die T-Zellen werden dann verwendet, um verarbeitete Tumorpeptide auf natürliche Weise zu identifizieren, die eine T-Zellen-Antwort hervorrufen.
Einer der Nachteile der oben beschriebenen Arbeiten ist die Fokussierung auf HLA-A-Allele, insbesondere auf HLA-A2-Präsentation. Bisher ist nur sehr wenig über MHC/HLA-Restriktion für andere MHC/HLA-Moleküle bekannt. Aus der Gruppe der MHC/HLA-Moleküle, die nicht dem HLA-A-Subtyp angehören, wurde das HLA-B27-Molekül am ausführlichsten untersucht. Siehe z.B. Parker et al., J. Immunol. 152, 163 (1994), hierin durch Verweis aufgenommen. Seine Häufigkeit würde darauf schließen lassen, dass in einem gegebenen Molekül, das zu MHC/HLA-Liganden und/oder Epitopen verarbeitet ist, HLA-B27-Binder erwartet werden könnten. Wie jedoch gezeigt wird, war dies bei der hierin beschriebenen Erfindung nicht der Fall.
Im Gegensatz zu HLA-A2 und HLA-B27 ist die vorhandene Information über HLA-C-Moleküle und ihre Bindungspeptide bisher noch sehr dürftig. Bindungsmotive sind nicht gut charakterisiert, und wenige Peptide wurden getestet. Die Häufigkeit des Auftretens von HLA-C ist viel geringer als jene des Auftretens von HLA-A- und HLA-B-Molekülen, und die HLA-C-Moleküle sind weit davon entfernt, in einem Populationspool die erste Wahl für eine Untersuchung zu sein. Eine der unerwarteten Erkenntnisse in der hierin beschriebenen Forschungsarbeit war die Identifikation von zwei HLA-C-Epitopen, da aus der bisherigen Literatur und, wie hierin noch näher ausgeführt wird, aus dem Versuchskonzept kaum ein Hinweis auf diese hervorging.
Das als "NY-ESO-1" bezeichnete Molekül, wie es z.B. im US-Patent Nr. 5.804.381, hierin durch Verweis aufgenommen, beschrieben wird, wird als eines der am stärksten immunogenen Tumorantigene erkannt. Beinahe die Hälfte der Patienten mit fortgeschrittenem Krebs exprimieren das Antigen (Stockert et al., J. Exp. Med. 187, 1349-1354 (1998)), und die Expression geht mit einer starken CD4+- und einer starken CD8+-T-Zellen-Antwort einher. Siehe Jäger et al., J. Exp. Med. 191, 625-630 (2000); Jäger et al., J. Exp. Med. 167, 265-270 (1998); Jäger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 4760-4765 (2000); Chen et al., J. Immunol. (in Druck). Von diesem Molekül abstammende Peptide, die HLA-A2-Epitope sind, sind bekannt (Jäger et al., J. Exp. Med. 187, 265-270 (1998)); und Wang et al., J. Immunol. 161, 3598-3600 (1998), beschreiben HLA-A31-Bindungsepitope.
Die WO 99/18206 beschreibt decamere Peptide, die von NY-ESO-1/CAG-3 abstammen, durch zytotoxische T-Lymphozyten erkannt werden und HLA-A-Allele binden.
Die WO 00/20445 beschreibt ein Verfahren zur Isolierung von CTL-Klonen, die gegen ein antigenes Protein, wie beispielsweise ein Element der MAGE-Familie aus Blutproben, gerichtet sind.
Nun wurde erkannt, dass NY-ESO-1 auch Epitope aufweist, die sich an HLA-C-Moleküle, wie beispielsweise HLA-Cw3 und HLA-Cw6, binden. Siehe z.B. S. 7, Zeile 13 des englischen Originals unter "...HLA-Cw3 und HLA-Cw6". NY-ESO-1 weist eine Sequenz auf, die zu einem anderen Tumorabstoßungsantigen, genannt LAGE-1, homolog ist (Lethe et al., US-Patent Nr. 5.811.519). Aus dem, was über die MAGE-A1/HLA-A1- und MAGE-A3/HLA-A1-Peptide bekannt ist, lässt sich ableiten, dass die äquivalenten Regionen von LAGE-1, die für die relevanten Nonapeptide kodieren, auch Epitope aufweiser würden, die sich an HLA-C-Moleküle wie z.B. HLA-Cw3 und HLA-Cw6 binden. Diese Peptide und der Weg zu ihrer Entdeckung sind Teil der Erfindung. Ebenfalls Teil der Erfindung ist das Verfahren, durch das sie identifiziert wurden. Alle Aspekte der Erfindung werden in der folgenden Offenbarung erläutert.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
BEISPIEL 1
Diese Versuche beschreiben, wie Zellproben zur Verwendung in weiteren Versuchen hergestellt wurden.
Periphere Blutlymphozyten (nachstehend als "PBLs" bezeichnet) wurden Krebspatienten unter Verwendung von Standardverfahren abgenommen. Anschließend wurden sie behandelt, um CD8+-Lymphozyten unter Verwendung von magnetischen Kügelchen, die mit CD8-spezifischen Antikörpern beschichtet waren, und von auf dem Gebiet der Erfindung anerkannten Verfahren zu entfernen. Nachdem die Trennung abgeschlossen war, wurden die CD8+-Zellen in 96-Well-Platten mit rundem Boden in einer Konzentration von 5 × 10⁵ Zellen pro Well überimpft, wozu RPMI-Medium 1640, ergänzt mit 10 % menschlichem AB-Serum, L-Glutamin (2 mM), Penicillin (100 E/ml), Streptomycin (100 μg/ml) und 1 % nichtessentiellen Aminosäuren, zugesetzt wurde.
Die von CD8+-Zellen befreiten PBLs wurden als Antigen-präsentierende Zellen (nachstehend als "APCs" bezeichnet) verwendet. Wie nachstehend noch näher ausgeführt wird, wurden diese Zellen entweder mit 10 μM Peptid gepulst oder mit Adenoviruskonstrukten bei 1.000 IE/Zelle über Nacht bei 37 °C in 300 μl serumfreiem Medium infiziert.
BEISPIEL 2
Die Expression von NY-ESO-1-Protein in CD8-abgereicherten PBLs wurde bestimmt. CD8-freie PBLs wurden wie oben beschrieben gesichert. Diese wurden dann entweder mit Adenovirusvektoren, die für das NY-ESO-1-Protein kodierende cDNA enthalten, oder mit einem "leeren" Adenovirusvektor transfiziert. PBLs wurden sowohl einem gesunden Spender als auch einem Krebspatienten abgenommen.
Zur Herstellung der Vektoren wurde die in Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1914-1918 (1997), und im US-Patent Nr. 5.804.381, die beide durch Verweis aufgenommen sind, beschriebene Arbeitsvorschrift verwendet. Kurz zusammengefasst wurde der Vektor pBK-CMV NY-ESO-1, der in beiden der oben genannten Verweise beschrieben wird, mit EcoRI und XbaI verdaut, woraus ein 0,8 kb umfassendes Fragment entstand, das cDNA für NY-ESO-1 enthielt. Dieses Fragment wurde isoliert und in die EcoRI- und XbaI-Stellen des im Handel erhältlichen Shuttlevektors pSV2-ICEU-1 pAd kloniert. Das resultierende Shuttleplasmid, das als pSV2-ICEU-1-NY-ESO-1 bezeichnet wird, wurde dann mit ICEU verdaut, woraus eine Expressionskas sette entstand, die den CMV-Promotor/Enhancer, NY-ESO-1-cDNA und eine BGH-poly-A-Sequenz enthielt. Dieses Fragment wurde dann isoliert und in die einmalige Stelle ICEU-1 von "pAd Quick"-Plasmid kloniert. Dieses Plasmid wurde anschließend mit SmaBI verdaut, und der Verdau wurde verwendet, um 293-Zellen zu transfizieren, woraus ein rekombinanter Adenovirusvektor entstand, der für NY-ESO-1 kodierte.
PBLs wurden mit 1.000 IE/Zelle der Adenoviruskonstrukte infiziert und anschließend über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden permeabilisiert und mit 1 μg/ml monoklonalem Antikörper, der für NY-ESO-1 spezifisch war und in Stockert et al., J. Exp. Med. 187, 1349-1354 (1998), und der PCT-Anmeldung WO 99/53938, die beide hierin durch Verweis aufgenommen sind, beschrieben wird, gefärbt.
Bis zu 85 % der infizierten PBLs exprimierten die rekombinanten NY-ESO-1-Zellen, was darauf hinweist, dass der Ansatz in weiteren Versuchen verwendet werden könnte.
BEISPIEL 3
Diese Versuche bestimmten, ob Stimulierung mit APCs, die mit rekombinantem NY-ESO-1-Adenovirus infiziert waren, mit einer Stimulierung mit APCs, die mit Peptid gepulst worden waren, vergleichbar war. Diese Versuche stellen auch ein Verfahren zur Analyse des Auftretens und der Häufigkeit von NY-ESO-1-reaktiven T-Zellen in Krebspatienten bereit. Noch bedeutender ist, dass unter Verwendung rekombinanter Virusvektoren zur Transduktion von Expression von NY-ESO-1 in den APCs und nicht in exogenen Peptiden, wie solchen der Seq.-ID Nr. 1, diese Analyse im Zusammenhang mit natürlich verarbeiteten und präsentierten Peptidepitopen erfolgen kann.
In diesen Versuchen wurden Zellproben aus zwei Patienten entnommen, für die davor identifiziert wurde, dass sie spontane T-Zellen-Antworten auf HLA-A2-eingeschränktes Peptid SLLMWITQC (Seq.-ID Nr. 1), beschrieben in Jäger et al., J. Exp. Med. 167, 265-270 (1998), und Jäger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 4760-4765 (2000), die beide hierin durch Verweis aufgenommen sind, aufwiesen. Die aus den zwei Patienten entnommenen PBLs wurden wie oben beschrieben behandelt, um CD8+-Zellen davon abzutrennen. Die CD8-freien PBLs wurden anschließend entweder mit 10 μM Proben der Seq.-ID Nr. 1 gepulst, mit für NY-ESO-1 kodierendem Adenovirus, wie oben beschrieben, oder mit für grün fluoreszierendes Protein kodierendem Adenovirus transfiziert. Autologe CD8+-Zellen wurden dann mit den PBLs acht Tage lang stimuliert. Die Stimulierung erfolgte durch den Zusatz von 1 × 10⁶ APCs pro Well von CD8+-Zellen, wie oben beschrieben (d.h. diese wurden zu Wells zugesetzt, die 5 × 10⁸ CD8+-Zellen/Well enthielten). Nach 8 h Stimulierung wurde IL-2 (10 E/ml) und IL-7 (20 ng/ml) zugesetzt. Dieses Verfahren wurde drei Tage lang wiederholt, bis die Zellen zum Testen geerntet wurden.
Die Zellen wurden in einem Tetramertest durch Färben der CD8+-T-Zellen in 50 μl PBS, die 1 % FCS enthielt, mit Phycoerythrin-("PE"-)markierten Tetrameren getestet. Tetramersynthese erfolgte gemäß Altman et al., Science 274, 94-96 (1996), hierin durch Verweis aufgenommen. Tetramere wurden unter Verwendung von Seq.-ID Nr. 1 als das Peptid assembliert. Die Zellen wurden 15 min lang bei 37 °C gefärbt, wonach ein im Handel erhältlicher monoklonaler Antikörper, der für CD8 spezifisch war, d.h. "Tricolor-CD8mAb", auf Eis 15 min lang zugesetzt wurde. Die Zellen wurden gewaschen und mittels Durchflusszytometrie analysiert.
Nach 8 Tagen Stimulierung war die Häufigkeit von Tetramer-positiven Populationen äquivalent, d.h. die Antworten waren unter Verwendung von Peptiden und Adenovirus-transfizierten Zellen dieselben. Die Reaktion war für NY-ESO-1 spezifisch, da, wenn für grün fluoreszierendes Protein kodierendes Adenovirus verwendet wurde, die Tetramerfärbung negativ war.
BEISPIEL 4
Diese Versuche wurden entworfen, um CD8+-T-Zellen, die aus einem Individuum gewonnen wurden, ausführlicher zu untersuchen. Cytospot-Tests, wie von Jung et al., J. Immunol. Meth. 159, 197-207 (1993), durch Verweis aufgenommen und wie hierin beschrieben angepasst, beschrieben, wurden verwendet. CD8+-T-Zellen, die wie oben beschrieben im Vorfeld sensibilisiert wurden, wurden mit autologen EBV-B-Target-Zellen bei einem 1:2-Verhältnis in 300 μl serumfreiem Medium 30 min lang vermischt. Brefeldin A wurde zu den Proben bei 10 μg/ml weitere 5 h lang zugesetzt. Die autologen EBV-B-Zellen, auf die bereits oben Bezug genommen wurde, wurden entweder mit dem Peptid der Seq.-ID Nr. 1 gepulst oder sie wurden mit Vakzinia-Vektorkonstrukten transfiziert. Das verwendete Vakziniaviruskonstrukt enthielt NY-ESO-1-cDNA voller Länge unter der Steuerung von Vakziniavirus-40K-Promotor, wie von Gritz et al., J. Virol. 64, 5948-5957 (1990), hierin durch Verweis aufgenommen, beschrieben, und E.-coli-IacZ-Gen unter der Steuerung von Geflügelpockenvirus-C1-Promotor, wie von Jenkins et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 7, 991-998 (1991), hierin durch Verweis aufgenommen, beschrieben. Fremdsequenzen wurden in das Thymidinkinasegen des Konstrukts, das in der Hind-III-Region des Genoms von Vakziniavirus des Wyeth-Stamms angeordnet war, gemäß Mazzara et al., Meth. Enzymol. 217, 557-581 (1993), hierin durch Verweis aufgenommen, eingeführt.
Die Zellen wurden fixiert, permeabilisiert und mit dem dreifärbigen, CD8-spezifischen mAb, der oben beschrieben wurde, einem FITC-markierten IFN-α-mAb und einem PE-markiertem, TNF-α-spezifischen mAb 15 min lang bei Raumtemperatur gefärbt. Die Resultate wurden mittels Durchflusszytometrie über Ausblendung von CD8+-Lymphozyten analysiert.
Die Resultate zeigten, dass die Effektorzellen, die mit den Adenoviruskonstrukten stimuliert worden waren, als Reaktion auf autologe EBV-B-Zellen, die mit den für NY-ESO-1 kodierenden Vakziniaviruskonstrukten transfiziert worden waren, große Mengen sowohl an IFN-γ als auch an TNF-α produzierten; sie reagierten jedoch nicht auf Wildtyp-Vakziniatransfektanten. Es wurde keine Kreuzreaktion zwischen dem zur Sensibilisierung verwendeten Adenovirusvektor und dem für das Ablesen verwendeten Vakziniavirus beobachtet. Die sensibilisierten Effektoren wiesen typische Eigenschaften aktivierter Gedächtnis-T-Zellen auf, einschließlich hoher Expression von CD45RO und niedriger Expression von CD62L, und sie konnten über einen Monat lang in Kulturen ohne Stimulierung aufrechterhalten werden.
Jegliche CD8+-T-Zellen, die gegenüber dem oben beschriebenen Tetramer positiv waren, wurden mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung der zuvor beschriebenen Verfahren aussortiert. Zwei Populationen wurden gefunden, d.h. eine Subpopulation, die gegenüber dem Tetramer positiv war, und eine zweite Population, die ihm gegenüber negativ war.
BEISPIEL 5
In diesen Versuchen werden weitere Analysen der zwei zuvor beschriebenen Subpopulationen entwickelt. Nach dem Sortieren wurden die Zellen mit allogenen Feeder-PBLs in der Gegenwart von 0,1 μg/ml PHA, IL-2 (10 E/ml) und IL-7 (20 ng/ml) stimuliert. Jede Subpopulation wurde dann ELISPOT-Analyse unterzogen, um ihre Spezifität zu bestimmen. Genauer beschrieben wurden flachbödige 96-Well-Nitrocelluloseplatten mit IFN-γ (2 μg/ml) beschichtet und dann über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Platten wurden mit PBS gewaschen und mit 10 % menschlichem AB-Serum 1 h lang bei 37 °C blockiert. Vorsensibilisierte CD8+-T-Zellen wurden wie oben beschrieben wurden in Mengen im Bereich von 1 × 10³ bis 5 × 10⁴ Zellen/Well, zusammen mit 5 × 10⁴ Targetzellen, zugesetzt. Targetzellen waren PBLs, die mit dem Peptid der Seq.-ID Nr. 1 gepulst waren, PBLs, die mit NY-ESO-1 exprimierendem Vakziniavirus oder mit EBV-B-Zellen, wie oben beschrieben, transfiziert waren. Die Zellen wurden 20 h lang in RPMI-Medium 1640, dem IL-2 und menschliches Serum fehlte, inkubiert. Die Platten wurden sorgfältig mit PBS gewaschen, um Zellen zu entfernen, und IFN-γ-mAbs (0,2 μg/ml) wurden zu den Wells zugesetzt. Nach 2-stündiger Inkubation bei 37 °C wurden die Platten gewaschen und mit Strepatividin, alkalischer Phosphatase (1 μg/ml) 1 h lang bei Raumtemperatur entwickelt. Daraufhin folgte Waschen, und anschließend wurde Substrat (5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat/Nitroblautetrazolium) zugesetzt und 5 min lang inkubiert. Nach abschließenden Waschschritten wiesen Plattenmembranen dunkelviolette Flecken auf, die unter dem Mikroskop gezählt wurden.
Zusätzliche Versuche unter Verwendung der Tetramer-positiven Subpopulation, die oben beschrieben wurde, wiesen darauf hin, dass CD8+-T-Zellen, die mit rekombinantem NY-ESO-1-Adenovirus vorsensibilisiert worden waren, Effektorzellen hervorrufen konnten, die NY-ESO-1 exprimierende HLA-A2-Tumorzellen als Targets erkennen. Dies wurde mittels Durchführung des oben beschriebenen ELISPOT-Tests unter Verwendung verschiedener Melanomzelllinien, die NY-ESO-1 exprimieren, festgestellt. Eine Zelllinie wurde ausgewählt, die NY-ESO-1 nicht exprimierte. Die ausgewählten Zelllinien exprimierten alle HLA-A2 unter Ausnahme einer Zelllinie; dies war jedoch eine Zelllinie, die NY-ESO-1 exprimierte. Insgesamt exprimierten von den fünf getesteten Melanomzelllinien drei sowohl NY-ESO-1- als auch HLA-A2-Moleküle, eine exprimierte HLA-A2, aber nicht NY-ESO-1, und eine exprimierte NY-ESO-1, jedoch nicht HLA-A2.
Die Resultate wiesen darauf hin, dass für die Tetramer-positiven CD8+-T-Zellen sowohl NY-ESO-1- als auch HLA-A2-Expression zur Erkennung erforderlich war.
BEISPIEL 6
Wie zuvor angemerkt führte Sortieren zu einer Subpopulation von CD8+-T-Zellen, die Tetramer-negativ waren; überraschenderweise reagierte jedoch diese Subpopulation, wenn sie getestet wurde, mit autologen EBV-B-Zellen, die mit Vakziniavirus, das rekombinantes NY-ESO-1 exprimierte, infiziert waren. Dies wies darauf hin, dass das NY-ESO-1-Protein zu einem Epitop verarbeitet wurde, das von einem MHC-Molekül, das nicht HLA-A2 war, präsentiert wurde. Wie oben im Abschnitt über den "Hintergrund der Erfindung" angemerkt, wird das HLA-B27-Molekül mit gewisser Häufigkeit exprimiert, und ein Bindungsmotiv ist bekannt, wie es in Parker et al., J. Immunol. 152, 163 (1994), beschrieben wird, hierin durch Verweise aufgenommen. Dies ist ein Nona- oder Decamer mit Arginin an Position 2 und einem hydrophoben Rest am C-Terminus. Da der Patient, aus dem die T-Zellen stammen, HLA-B27 exprimierte, war es angebracht anzunehmen, dass das Peptidmolekül von diesem HLA-Molekül präsentiert werden könnte.
Skandierung der NY-ESO-1-Aminosäuresequenz unter Verwendung des Motivs nach Parker ergab elf Peptidsequenzen, von denen angenommen werden würde, dass sie sich an HLA-B27-Moleküle binden und als T-Zellen-Epitope wirken. Jedes dieser Peptide wurde synthetisiert und im oben beschriebenen ELISPOT-Test getestet. Keines war positiv. Die betreffenden Peptide wurden alle entlang der Sequenz von NY-ESO-1 gefunden, d.h. an den Aminosäurepositionen 42-50, 51-60, 76-85, 80-88, 85-94, 105-113, 124-133, 135-143, 157-165, 159-167 und 163-171. Siehe z.B. die WO 99/53938, hierin durch Verweis aufgenommen, in der die Aminosäuresequenz bereitgestellt wird. Wie angegeben ergab keines der Peptide positive Resultate.

Die Tetramer-negative Subpopulation wurde dann mit einer Auswahl an EBV-B-Zellen, die dem gesunden Spender entnommen wurden, getestet und mit rekombinantem Virus transduziert, um NY-ESO-1 zu exprimieren, wies jedoch variierende HLA-Spezifitäten auf, d.h.:

LINIENNAME	HLA-TYPEN
9-EBV	A0101; A0301; B15; B4406; Cw0303; Cw0704
10-EBV	A3001; A3301; B4501; B5301; Cw*0602
19-EBV	A0201; A2402; B2705; B37.01; Cw0202; Cw0602
20-EBV	A0301; A2301; B0702; B4403; Cw0401; Cw0702
21-EBV	A2402; A3101; B15; B2705; Cw0202; Cw0303
26-EBV	A0201; B0801; B5701; Cw0602; Cw*0701
32-EBV	A0101; A0201; B0801; B15; Cw0303; Cw0701

Proben von diesen EBV-Zellen wurde entweder mit für NY-ESO-1 kodierendem Vakziniavirus oder mit Wildtyp-Vakziniavirus transfiziert. Die Proben wurden auf dieselbe Weise wie oben beschrieben getestet. Diese Zelllinien, die HLA-Cw3-positiv waren, waren in der Lage, NY-ESO-1 der Tetramer-negativen Zellsubpopulation zu präsentieren. Anschließend wurden Untersuchungen durchgeführt, um zu erkennen, welches Peptid eingebunden war. Um dies zu erreichen, wurden lange, überlappende Peptide unter Verwendung von auf dem Gebiet der Erfindung anerkannten Verfahren synthetisiert, sodass sie die gesamte Sequenz von NY-ESO-1 zu überspannten. Diese Peptide wurden auf autologe EBV-B-Zellen gepulst und unter Verwendung von ELISPOT, wie oben beschrieben, getestet. Peptide, die den Aminosäuren 85-102 und 91-108 entsprachen, wurden von den CD8+-T-Zellen erkannt. Ein Motiv für HLA-Cw3-Bindugn wird von Falk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 12005-12009 (1993), beschrieben. Unter Verwendung dieses Motivs wurde ein Peptid, bestehend aus den Aminosäuren 92-100 von NY-ESO-1, synthetisiert und getestet. Um diese Tests durchzuführen, wurde Zelllinie 721.221, die HLA-Klasse-I-negativ ist, mit cDNA, die für HLA-Cw3 kodiert, transfiziert und dann mit dem Peptid pulsiert. In Vergleichstests waren nach der Transfektion mit HLA-Cw4 die Resultate negativ. Beide Subtypen HLA-Cw*0303 und HLA-Cw*0304 präsentierten das Peptid gut. Tatsächlich wurde es bei Konzentrationen unter 1 nM erkannt. Die Sequenz des Peptids lautet:
LAMPFATPM
(Seq.-ID Nr. 2).
BEISPIEL 7
In Anbetracht der obigen Offenbarung wurden diese Versuche entworfen, um spontane T-Zellen-Reaktionen auf NY-ESO-1 in Individuen, die nicht HLA-A2-positiv sind, zu testen.
Ein Patient, der gegenüber NY-ESO-1 seropositiv war, wurde ausgewählt. PBLs wurden dem Patienten entnommen, und nach der Abtrennung von CD8+-T-Zellen, wie oben beschrieben, wurden Effektorzellen in vitro durch CD8-freie PBLs, die mit dem Adenoviruskonstrukt, das für NY-ESO-1 kodiert, infiziert worden waren, stimuliert. Nach 9 Tagen Kultur unter Verwendung der oben erläuterten Verfahren waren beinahe 40 % der sensibilisierten CD8+-T-Zellen in der Lage, IFN-γ als Reaktion auf NY-ESO-1, das von Vakzinia-infizierten, histokompatiblen EBV-B-Zellen exprimiert wurde, spezifisch zu produzieren. Wie oben offenbart, wurden überlappende, NY-ESO-1 überspannende Peptide verwendet, um festzustellen, dass Peptide, die aus den Aminosäuren 73-90 und 79-96 bestanden, von präsensibilisierten T-Zellen-Effektoren aus dem Individuum erkannt wurden. HLA-Cw6 wurde unter Verwendung der oben beschriebenen EBV-B-Zellen als ein Restriktionselement für diese Antwort identifiziert. Ankermotive für HLA-Cw6 werden von Falk et al., s.o., beschrieben. Ein Peptid, das aus den Aminosäuren 80-88 (ARGPESRLL; Seq.-ID Nr. 3) besteht, wurde als das relevante Nonamer abgeleitet. Das Peptid wurde synthetisiert, wie oben getestet, und seine Erkennung durch Effektorzellen auf eine HLA-Cw*0602-eingeschränkte Weise wurde bestätigt.
BEISPIEL 8
Bereits früher zeigten Jäger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 4760-4765 (2000), dass CD8+-T-Zellenreaktivität gegenüber NY-ESO-1 nur in Patienten mit Antikörpern gegen das Protein zu erkennen war. Es wurden Untersuchungen durchgeführt, um zu bestimmen, ob dies auch der Fall war, wenn das hierin beschriebene Adenovirus/Vakzinia-Kreuzsensibilisierungsverfahren verwendet wurde. Um dies zu testen, wurden drei Patienten mit NY-ESO-1-positiven Tumoren untersucht. Ein Patient war seropositiv, und die anderen waren seronegativ. CD8+-T-Zellen aus dem seropositiven Patienten wurden mit CD8-freien PBLs, die mit dem oben beschriebenen, für NY-ESO-1-kodierenden Adenovirusvektor infiziert worden waren, stimuliert. NY-ESO-1-spezifische Antworten wurden gegen histokompatible EBV-B-Zellen, die NY-ESO-1 über die Vakziniavirusvektoren exprimierten, beobachtet. Sowohl das HLA-A2-eingeschränkte Peptid (Seq.-ID Nr. 1) als auch das HLA-Cw3-eingeschränkte Peptid (Seq.-ID Nr. 2) waren Targets für diese Antwort. Keine Antworten wurden bei den seronegativen Probanden beobachtet.
Die obigen Beispiele beschreiben die Eigenschaften der Erfindung, die u.a. ein Verfahren zur Identifikation von T-Zellen, wie CD8+-T-Zellen, die für einen Peptid/MHC-Komplex spezifisch sind, worin das Peptid aus einem Protein von Interesse abstammt, umfassen. In diesem Verfahren wird eine Probe, von der angenommen wird, dass sie relevante CD8+-Zellen enthält, mit einer Antigen-präsentierenden Zelle, wie beispielsweise einer dendritischen Zelle, die mit einem ersten Virusvektor infiziert worden war, der für das Protein von Interesse kodiert, kontaktiert. Nach diesem Kontakt werden die CD8+-Zellen anschließend mit einer zweiten Population von Antigen-präsentierenden Zellen kontaktiert, die mit einem zweiten Virusvektor infiziert worden waren, der ebenfalls für das Protein von Interesse kodiert, worin sich der zweite Virusvektor vom ersten Virusvektor unterscheidet. Ein Vorteil, den man aus diesem Ansatz zu gewinnen glaubt, ist, dass jegliche Immunantwort darin weiter verfeinert werden kann, dass sie auf das Antigen, und nicht auf irgendeinen Aspekt der Viren, gerichtet wird. In einer bevorzugten Ausführungsform ist dieser erste Virusvektor ein Adenovirusvektor, vorzugsweise einer, der nicht replikativ ist, und der zweite Vektor ist ein Vakziniavektor. Es gilt jedoch zu verstehen, dass diese beiden genau umgekehrt eingesetzt werden können und dass nur eine dieser zwei Möglichkeiten verwendet werden kann, in Kombination mit einem zweiten Virus, das sich von einer dieser zwei Möglichkeiten unterscheidet.
Wie angegeben erfordert das Verfahren eine Antigen-präsentierende Zelle, wie beispielsweise eine dendritische Zelle, oder einen anderen Zelltyp, der in der Lage ist, Komplexe aus einem MHC- oder HLA-Molekül und einem Peptid an seiner Oberfläche zu präsentieren. In der Praxis umfasst das Verfahren vorzugsweise die Verwendung autologer Zellen, d.h. Antigen-präsentierender Zellen und CD8+-T-Zellen aus demselben Patienten, wobei jedoch diese Art von Verfahren auch mit allogenen Zellen durchgeführt werden kann. Die Verwendung des Verfahrens ermöglicht es Fachleuten, wie aus den Beispielen ersichtlich ist, Epitope zu identifizieren, die durch ihr Präsentieren des MHC/HLA-Moleküls eingeschränkt sind. Wie hierin gezeigt, ermöglicht das Verfahren die Identifikation von Peptiden, die sich an HLA-Moleküle wie HLA-Cw3- und HLA-Cw6-Moleküle binden, einschließlich, jedoch nicht eingeschränkt auf, Peptide, die durch die Seq.-ID Nr. 2 und 3 definiert sind. Diese Peptide können z.B. verwendet werden, um die Produktion zytolytischer T-Zellen zu stimulieren, die für Komplexe aus dem HLA-Molekül und dem Peptid spezifisch sind, um Zellen zu identifizieren, die das HLA-Molekül präsentieren, und so weiter. Die Peptide können therapeutisch verwendet werden, z.B. als die einzelne Peptidkomponente einer Formulierung, deren Zweck die Unterstützung einer Immunantwort ist, oder als eines aus einer Vielzahl von mehr als einem Peptid. Solche Zusammensetzungen können eine zusätzliche Komponente wie z.B. ein Adjuvans umfassen. Ein Beispiel für solch ein Adjuvans ist GM-CSF, wie von Jäger et al. im US-Patent, das durch Verweis hierin aufgenommen ist, beschrieben wird.
Das NY-ESO-1-Gen und das kodierte Protein weisen Homologie zu einem Molekül auf, das alternativ als "LAGE" und "LL-1" bezeichnet wird. Siehe z.B. Lethe et al., US-Patent Nr. 5.811.519, durch Verweis hierin in seiner Gesamtheit aufgenommen. LAGE-Peptide, die homolog zu den Seq.-ID Nr. 2 und 3 sind, d.h.:
ITMPFSSPM (Seq.-ID Nr. 4)
ARRPDSRLL (Seq.-ID Nr. 5),
sind ebenfalls ein Teil der Erfindung, wie auch Epitope für HLA-Cw3, die Subtypen HLA-Cw*0303 und HLA-Cw*0304, insbesondere, bzw. HL-C26.
Es muss berücksichtigt werden, dass es einen auf dem Gebiet der Erfindung anerkannten Unterschied zwischen MHC-Liganden und MHC-Epitopen gibt. Erstere sind Peptide, die sich an MHC-Moleküle binden, jedoch in dieser Verbindung keine T-Zellenantwort hervorrufen. Letztere, also MHC-Epitope, sind Peptide, die sich an MHC-Moleküle binden und T-Zellen stimulieren, wenn sie mit einer T-Zelle konfrontiert werden, die für den Peptid/MHC-Komplex spezifisch ist. Falk et al., s.o., stellen Vorschläge für Bindungsmotive für HLA-Cw*3, HLA-Cw*0301, HLA-Cw*0304, HLA-Cw*0601, HLA-Cw*0602 bereit. Falk et al. unterscheiden zwischen Liganden und Epitopen, wie in ihrer Publikation deutlich gezeigt wird. Es ist daraus jedoch auch zu erkennen, dass noch keine T-Zellen-Epitope für irgendeines dieser Allele identifiziert wurden.
Ebenfalls ein Teil der Erfindung sind die so genannten "Minigene", d.h. Nucleinsäuremoleküle, die aus einer Nucleotidsequenz bestehen, die für die Peptide von Interesse kodieren. Die Peptide weisen eine Länge auf, die eine einfache Konstruktion aller degenerierten Sequenzen, die für das Epitop von Interesse kodieren, ermöglicht. Diese Kodiersequenzen können unter Verwendung von auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannten Verfahren zu einem Teil einer verlängerten "polytopischen" Sequenz gemacht werden und können zur Expression in einer Wirtszelle in Kodiervektoren inkorporiert werden, worin das Minigen oder die Minigene von Interesse operabel an einen Promotor gebunden ist/sind.
Die Minigene können auch zusammen mit Genen verwendet werden, die für ein MHC-Molekül von Interesse kodieren, wie beispielsweise die HLA-Cw3- oder HLA-Cw6-Kodiersequenzen. Die zwei Sequenzen können Teil eines einzelnen Vektors, eines Vektorpaars, das dann in einem Set verwendet wird, oder auch einer anderen Kombination sein, was Fachleuten die Verwendung dieser Sequenzen zur Stimulation einer T-Zellenantwort ermöglicht, und so weiter.
Andere Eigenschaften der Erfindung werden Fachleuten ersichtlich sein und müssen an dieser Stelle nicht spezifisch angegeben werden.

Claims

Isoliertes Peptid, das sich an ein HLA-Cw3-Molekül bindet und Proliferation von T-Zellen hervorruft, die gegenüber Komplexen aus diesem Peptid und HLA-Cw3-Molekül spezifisch sind, worin dessen Aminosäuresequenz aus Seq.-ID Nr. 2 besteht.
Isoliertes Peptid, das sich an ein HLA-Cw6-Molekül bindet und Proliferation von T-Zellen hervorruft, die gegenüber Komplexen aus diesem Peptid und HLA-Cw6-Molekül spezifisch sind, worin dessen Aminosäuresequenz aus Seq.-ID Nr. 3 besteht.
Isolierte zytolytische T-Zelle, die gegenüber einem Komplex aus einem HLA-Cw3-Molekül und dem Peptid nach Anspruch 1 spezifisch ist.
Isolierte zytolytische T-Zelle, die gegenüber einem Komplex aus einem HLA-Cw6-Molekül und dem Peptid nach Anspruch 2 spezifisch ist.
Verfahren zur Stimulation von Proliferation einer zytolytischen T-Zellen-Reaktion, umfassend das Kontaktieren einer T-Zellen-hältigen Probe mit einer Zelle, die einen Komplex aus HLA-Cw3 und dem Peptid nach Anspruch 1 an seiner Oberfläche aufweist, um Proliferation einer zytolytischen T-Zelle, die gegenüber diesem Komplex spezifisch ist, zu stimulieren.
Verfahren zur Stimulation von Proliferation einer zytolytischen T-Zellen-Reaktion, umfassend das Kontaktieren einer T-Zellen-hältigen Probe mit einer Zelle, die einen Komplex aus einem HLA-Cw6-Molekül und dem Peptid nach Anspruch 2 an seiner Oberfläche aufweist, um Proliferation einer zytolytischen T-Zelle, die gegenüber diesem Komplex spezifisch ist, zu stimulieren.