DE60118620T2

DE60118620T2 - Biologisch wirksam wässrige fraktion extrakt erhalten aus einer mangrove pflanz salvadora persica l

Info

Publication number: DE60118620T2
Application number: DE60118620T
Authority: DE
Inventors: National Institute of Oceanography Usha GOSWAMI; Nat. Inst. of Oceanography Nazarine FERNANDES
Original assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Current assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Priority date: 2001-03-29
Filing date: 2001-03-29
Publication date: 2007-04-05
Anticipated expiration: 2021-03-30
Also published as: DE60118620D1; WO2002078724A1; EP1372680B1; EP1372680A1; AU2001256653B2; BR0116955A; JP2004534007A

Description

Technischer Bereich
Die Erfindung betrifft biologisch aktive Extrakte, die man aus der Pflanze Salvadora persica Linneaus 1753 erhält. Mit der Erfindung wird auch ein Verfahren zur Gewinnung des Rohextrakts geschaffen. Des weiteren werden mit der Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen geschaffen, die biologische Wirkung und, insbesondere tokolytische Wirkung aufweisen.
Stand der Technik
Die assoziierte Mangrovenpflanze Salvadora persica Linneaus 1753 gehört zur Ordnung Salvadoracea und bildet Büsche oder kleine Bäume mit weißen Blüten, die in geschwächten Mangrovensümpfen und Salzbänken an der gesamten Westküste Indiens häufig auftreten. Es wurde eine große Anzahl von Meerespflanzen auf biologisch aktive Substanzen untersucht. Nazarine, F.; Anita, F.; Rataboli, P. V.; Diniz D'Souza, R. S. und Dhume, V. G. berichteten 1998 im Indian Journal of Marine Sciences, 27: 499–501 über vielversprechende pharmakologische Wirkungen in Meeresorganismen aus indischen Gewässern.
Aus allen Teilen der Welt stehen mehrere Patente zur Verfügung, welche Verfahren und Verbindungen aus der Natur für verschiedene Zwecke betreffen. Kwak; Wie-jong; Han; Chang-Kyun; Kum; Hwan-su, An; Jae-Suk; Kum; Taek-soo, Patented process of extracting and purifying biologically effective ingredients from combined medicinal plant and their extract composition (US-Patent Nr. 5,910,307, veröffentlicht am 8. Juni 1999). D'Amelio; Frank S.; Mirhom; Youssef W. offenbarten eine therapeutische Zusammensetzung und ein Verfahren zur Hautbehandlung mit Hilfe eines Extrakts aus der Pflanze Centipeda cunninghami in dem US-Patent Nr. 5,804,206, veröffentlicht am 8. September 1998. Zimmermann; Richard C.; Alber; Randall S.; Todd; James S.; Crews; Philip isolierten eine Verbindung aus dem Methanol-Extrakt des Aalgrases Zostrea marina mit sehr starken, das Faulen von Wasserpflanzen verhindernden Eigenschaften (US-Patent Nr. 5,607,741, veröffentlicht am 4. März 1997).
Betulinsäure, die aus der Verbindung Betulin hergestellt wird, weist viele pharmazeutische Potenziale auf. Pezzuto, John M.; Darrick, S. H. L. offenbarten Verfahren zur Herstellung von Betulinsäure aus Betulin (US-Patent Nr. 5,804,575, veröffentlicht am 8. September 1998). Die Betulinsäure wird als potentielles therapeutisches Mittel intensiv für eine Vielzahl von Krankheiten untersucht. Pezzuto, John M., Das Gupta, Tapas, K.; Schmidt; Mary Lou; Kuzmanoff; Konrad Marc; Ling Indeck; Lydia and Kim; Darrick, S. H. L. (US-Patent Nr. 5,962,527 vom 5. Oktober 1999), Pisha, E., Chai, H., Lee IS, Chagwedera TE, Framsworth NR, Cordell GA, Beecher CW, Fong H H, Kinghorn AD, Brown DM offenbaren in Nature Medicine, 1, Seiten 1046–1051 (1995), dass Betulinsäure eine unerwartete selektive, Anti-Tumor-Wirkung gegen Melanome, beispielsweise MEL-1, MEL-2 und Mel-3, beim Menschen aufweist. Des weiteren offenbaren Fujioka, T.; Kashiwada, Y; Kilkuskie RE, Cosentino LM, Ballas LM, Jiang JB, Janzen WP, Chen IS, Lee KH in J. Nat. Prod 57 (2), Seiten 243–247 (1994), daß Betulinsäure eine Anti-HIV-Wirkung in Lymphozytenzellen H9 aufweist. Diese Erfinder erwähnten, daß die auf Betulinsäure als therapeutisches Mittel zielenden Forschungen behindert werden, da die Betulinsäure in sehr beschränkten Mengen und zu sehr hohen Kosten zur Verfügung steht. Ramadoss, Sunder, Jaggi, Manu; Siddiqui; Mohammed Jamshed Ahmed beschreiben in dem US-Patent Nr. 6,048,847, veröffentlicht am 11. April 2000, Verwendungszwecke der Betulinsäure und ihrer Derivate zur Verhinderung von Krebswachstum sowie ein Verfahren zur Überwachung derselben. Kang; Raphael, K. L.; Zyzak; Li Li; Nakatsu; Tetsuo veröffentlichten in dem US-Patent Nr. 5,948,460 vom 7. September 1999 aromatische Produktzusätze, bei denen Ursolsäure eine der Verbindungen innerhalb einer Gruppe von drei Verbindungen war, die einem aromatischen Produkt zugesetzt wurde, um einen Beigeschmack in dem Produkt zu vermindern und dessen süßen Geschmack wie in einem Diatgetränk zu verstärken. Sie wurde auch als Bestandteil in einem Präparat zur Verhinderung der Hauttumorbildung verwendet.
Herman, S. offenbarte (in dem US-Patent Nr. 5,190,979, veröffentlicht am 2. März 1993) Lupeol ebenfalls als eine Verbindung, die pharmakologisch aktive Terpenozonide mit medizinischem Wert ergeben kann.
Aufgaben der Erfindung
Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung eines Rohextrakts aus dem Stängel, den Blättern und den Blüten von Salvadora persica, einem allgemein in Mangrovensümpfen zur Verfügung stehenden Strauch, und zum Screenen desselben zur Erforschung seiner Bioaktivität zu schaffen.
Der Erfindung liegt die weitere Aufgabe zugrunde, natürlich vorkommende Verbindungen aus der Pflanze Salvadora persica zu isolieren und deren Molekulargewichte, Molekülformeln, Schmelzpunkte und ihre Strukturformeln zu identifizieren, was bei der chemischen Synthese dieser Verbindungen von Nutzen ist.
Der Erfindung liegt noch die weitere Aufgabe zugrunde, den Rohextrakt, seine Fraktionen und seine gereinigten Verbindungen pharmakologisch zu erforschen, um sicherzustellen, daß die von dem Rohextrakt und seinen Fraktionen gezeigten Wirkungen ganz und gar erhalten bleiben.
Der Erfindung liegt die weitere Aufgabe zugrunde, pharmazeutische Zusammensetzungen zu schaffen, die Extrakte aus der Pflanze Salvadora persica enthalten und eine biologische Wirkung, insbesondere eine tokolytische Wirkung, aufweisen.
Zusammenfassung der Erfindung
Mit der vorliegenden Erfindung sollen die dem Stand der Technik innewohnenden Nachteile durch Bereitstellung des hochwirksamen und selektiven Mittels zur Verarbeitung des aktiven Rohextrakts und zu dessen Fraktionierung, Isolierung und Reinigung der aktiven Verbindungen beseitigt werden. Des weiteren werden mit der Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen geschaffen, welche den aus der Pflanze Salvadora persica gewonnenen Extrakt enthalten und zum Lindern von Schmerzen in den Uterusmuskeln geeignet sind.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
In der vorliegenden Erfindung sind zum ersten Mal die Verfahren zur Isolierung, Reinigung und pharmakologischen Screening aller dieser oben genannten, kommerziell wichtigen Verbindungen aus einer allgemein zur Verfügung stehenden Pflanze aus Mangrovensümpfen der Westküste Indiens offenbart. Diese als Salvadora persica bezeichnete Pflanze ist eine assoziierte Mangrovenpflanze. Sie ist ein Strauch, und die Zweige mit Blütenblättern können mit der Hand gepflückt werden. Selbst der Rohextrakt und die Fraktionen weisen einen therapeutischen Wert auf. Wichtig ist, daß die von dem Extrakt gezeigte biologische Wirkung in den gereinigten Verbindungen wie Methylpalmitat und Betulin erhalten bleibt.
Mit dieser Offenbarung wird auf zukünftige potentielle klinische Zwecke des Extrakts und der Fraktionen zur Behandlung von Krankheiten, beispielsweise als Entspannungsmittel für glatte Muskeln, gegen Bronchialasthma und Nierenkoliken und zur Verhinderung der Frühgeburt hingewiesen. Die Offenbarung betrifft des weiteren die Verwendung von Methylpalmitat und Betulin bei Bewegungskrankheit und Abdominalkrämpfen.
Mit der Erfindung werden Verfahren geschaffen, mit welchen der biologisch wirksame Rohextrakt einer als Salvadora persica Linneaus 1753 bezeichneten assoziierten Mangrovenpflanze hergestellt wird. Die Salvadora persica Linneaus (Salvadoraceae) bildet Sträucher oder kleine Bäume mit weißen Blüten, die in entarteten Mangrovensümpfen und Salzbänken an der gesamten Westküste Indiens und Westasiens häufig auftreten. Das in der Erfindung offenbarte Verfahren betrifft des weiteren die Extraktion, Fraktionierung und Reinigung aktiver Metabolitenbestandteile der Pflanze. Die Erfindung betrifft auch die Spektralerkennung der Verbindungen, beispielsweise β-Amyrin (nichtsteroidal-polyzyklisches Triterpen), Betulin, Ursolsäure (Triterpensäure), Methylpalmitat (aliphatischer Ester) und Lupeol (nichtsteroidal-polyzyklisches Triterpen). Die Erfindung betrifft auch Molekülformeln, Molekulargewichte, Schmelzpunkte und Strukturformeln der genannten Verbindungen. Mit der Erfindung wird ein hocheffektives und selektives Mittel zur Verarbeitung eines aus der Salvadora persica gewonnenen aktiven Rohextrakts und zu dessen Fraktionierung, Isolierung und Reinigung geschaffen. Der hier verwendete Begriff "Fraktionierung" bezeichnet das Abtrennen des Rohextrakts. Der Begriff "Isolierung und Fraktionierung" bezeichnet das Trennen der Fraktion in reine Verbindungen.
Des weiteren betrifft die Erfindung Verfahren zum Screening pharmakologischer Wirkungen der Verbindungen in Geweben von Säugetieren. Die Anmelderin hat festgestellt, daß der aus der Pflanze Salvadora persica gewonnene Rohextrakt in zwei Fraktionen, d.h. Chloroform und eine wässrige Fraktion, getrennt werden kann. Wie festgestellt wurde, wies die wäßrige Fraktion eine tokolytische Wirkung auf, welche in der vorliegenden Erfindung ausführlich beschrieben wird.
Demgemäß wird mit der Erfindung ein Verfahren zum Extrahieren und Reinigen biologisch nützlicher Moleküle aus einer assoziierten Mangrovenpflanze geschaffen, welches die folgenden Schritte umfaßt:

i) Sammeln und Verarbeiten der Pflanzenteile der Salvadora persica,
ii) Herstellung eines Rohextrakts aus den Pflanzenteilen der Salvadora persica,
iii) Untersuchen des Rohextrakts mit Hilfe pharmakologischer Verfahren,
iv) Fraktionieren des Rohextrakts,
v) Untersuchen des Rohextrakts mit Hilfe pharmakologischer Verfahren,
vi) Isolieren der reinen Verbindungen durch Säulenchromatographie,
vii) Untersuchen der reinen Verbindungen mit Hilfe pharmakologischer Verfahren, und
viii) Identifizieren der Verbindungen durch Spektroskopie.

Wie weiter oben festgestellt, zeigte die wässrige Fraktion des aus der Mangrovenpflanze Salvadora persica gewonnenen Rohextrakts eine tokolytische Wirkung, während die übrigen 2 Fraktionen (Butanol und Petrolether) inaktiv waren.
Mit der Erfindung wird auch für die Identifizierung der Moleküle aus den Spektraldaten gesorgt. Die Molekülformel der fünf Verbindungen wird aus den Spektraldaten bereitgestellt. Mit der Erfindung werden die Molekulargewichte der Moleküle aus EIMS bereitgestellt. Aus den Spektraldaten wird auch die Strukturformel der Verbindungen bereitgestellt.
Daher wurde aus der Pflanze Salvadora persica ein Rohextrakt gewonnen. Der Rohextrakt wurde auf seine Bioaktivität untersucht und wurde, wenn er in Bezug auf seine pharmakologische Wirkung als vielversprechend befunden wurde, mit Hilfe von Lösungsmitteln mit zunehmender Polarität fraktioniert, um Fraktionen wie Petrolether, Chloroform, Butanol und wäßrige Fraktionen zu erhalten. Jede von diesen wurde auch auf ihre pharmakologische Wirkung untersucht.
Die fünf aus dem Extrakt der Pflanze gereinigten Verbindungen waren β-Amyrin (nichtsteroidal-polyzyklisches Triterpen), Betulin, Ursolsäure (Triterpensäure), Methylpalmitat (aliphatischer Ester) und Lupeol (nichtsteroidal-polyzyklisches Triterpen).
Wie festgestellt wurde, ist β-Amyrin ein nichtsteroidal-polyzyklisches Triterpen mit den folgenden Einzelheiten:

Molekülformel: C₃₀H₅₀O

Molekulargewicht: 426

Schmelzpunkt: 160 Grad C
Ein anderes festgestelltes Molekül war Betulin mit:

Molekülformel: C₃₀H₅₀O₂

Molekulargewicht: 442

Schmelzpunkt: 255 Grad C
In dem Extrakt wurde auch das Ursolsäuremolekül (Triterpensäuremolekül) festgestellt. Es wies folgendes auf:

Molekülformel: C₃₀H₄₈O₃

Molekulargewicht: 456

Schmelzpunkt: 292 Grad C
Das in dem Extrakt festgestellte Methylpalmitat (aliphatischer Ester) wies folgendes auf:

Molekülformel: C₁₆H₃₂O₂

Molekulargewicht: 256

Schmelzpunkt: 30 Grad C
Das in dem Extrakt festgestellte Lupeol (nichtsteroidal-polyzyklisches Triterpen) wies folgendes auf:

Molekülformel: C₁₆H₅₀O

Molekulargewicht: 426

Schmelzpunkt: 215 Grad C
Eine der Verbindungen, das Betulin, kann bei der Herstellung von Betulinsäure verwendet werden (US-Patent Nr. 5,804,575, veröffentlicht am 8. September 1998). Betulinsäure wird als potentielles therapeutisches Mittel für eine Vielzahl von Krankheiten intensiv untersucht.
Ursolsäure wird einem aromatisierten Produkt zugesetzt, um einen Nachgeschmack in dem Produkt zu vermindern und dessen süßen Geschmack, beispielsweise in einem Diatgetränk, zu verstärken. Sie wurde auch als Bestandteil in einem Präparat zur Verhinderung der Hauttumorbildung verwendet.
Die Extrakte aus manchen Pflanzen zeigen gefäßverengende und analgesische Eigenschaften und enthalten auch das Triterpenoid β-Amyrin. Diese Zusammensetzungen zur Hemmung des Entstehens einer unerwünschten Hauptpigmentierung verbinden in sich Tyrosinaseblockierungsfähigkeiten mit Stabilität in kosmetischen Präparaten, das Fehlen größerer zytotoxischer Wirkungen und eine Synergie der Wirkungen (US-Patente 5,773,014 und 5,679,393). β-Amyrin und Lupeol werden als Bestandteile für Dimethylsterole in medizinischen Formulierungen verwendet (US-Patent 4,808,574).
Wie in dem im April 2000 veröffentlichten US-Patent Nr. 6,049,014 erwähnt wird, ist Methylpalmitat eine Verbindung, die bei der Herstellung von Alkoholen verwendet wird. Lupeol kann als Bestandteil für mehrere heilende Medikamente, Insektenabwehrmittel, Anti-Tumor-Destillate und chemische Industriezweige verwendet werden (US-Patente Nr. 4,808,574; 5,962,527; 5,908,628).
Daher enthielt der Extrakt aus Salvadora persica mehrere Verbindungen, die oben aufgeführt sind. Die wäßrige Fraktion des Extrakts der Pflanze Salvadora persica wurde dann an Meerschweinchen auf ihre biologische Wirkung untersucht. Die Anmelder stellten zu ihrer Überraschung fest, daß die wäßrige Fraktion eine sehr gute tokolytische Wirkung aufwies.
Demgemäß werden mit der Erfindung Zusammensetzungen geschaffen, welche die wäßrige Fraktion des aus der Salvadora persica gewonnenen Extrakts, wahlweise mit herkömmlichen Additiven zum Lindern von Schmerzen in den Uterusmuskeln, enthalten. Die Zusammensetzung kann etwa 10 μg des Extrakts enthalten. Daher ist die wäßrige Fraktion des aus der Salvadora persica gewonnenen Rohextrakts ein potenzielles tokolytisches Mittel. Die Zusammensetzungen können je nach Bedarf in verschiedenen physikalischen Formen formuliert werden. Der Extrakt kann je nach Bedarf als solcher oder mit herkömmlichen Additiven, physiologisch verträglichen Trägern, Konservierungsstoffen, Puffern usw. verwendet werden.
Zusätzlich sieht die Erfindung die Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge des aus der Salvadora persica gewonnenen Extrakts zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung tokolytischer Zustände vor. Der Extrakt kann bei normalen Erwachsenen mit einem Dosierungsgrad im Bereich von 50 μg/ml bis 250 μg/ml verabreicht werden. Die genaue Dosierung ist verschieden und hängt von dem zu behandelnden Patienten ab und richtet sich nach Faktoren wie den Erfordernissen des Patienten, der Schwere des zu behandelnden Zustands und der Wirkung des Extrakts. Wie optimale Dosierungen für einen speziellen Patienten festgelegt werden, ist dem Fachmann wohlbekannt.
Ausführliche Beschreibung der anliegenden Zeichnungen
1(a) zeigt die Mangrovenpflanze und
1(b) zeigt den Zweig der verwendeten assoziierten Mangrovenpflanze.
2 zeigt die aus dem Rohextrakt der Pflanze Salvadora persica gewonnenen verschiedenen Fraktionen.
3 zeigt die Strukturformel des β-Amyrins (nichtsteroidal-polyzyklisches Triterpen).
4 die Strukturformel des Betulins,
5 die Strukturformel der Ursolsäure (Triterpensäure),
6 die Strukturformel des Methylpalmitats (aliphatischer Ester),
7 die Strukturformel des Lupeols (nichtsteroidal-polyzyklisches Triterpen).
8 Fraktionierungsschema des Extrakts aus der Salvadora persica.

Die Erfindung wird ausführlich beschrieben und durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, die nicht als Einschränkungen an dem hier verkörperten Erfindungskonzept aufzufassen sind. Beispiel 1: In diesem Beispiel werden die verwendeten Chemikalien, Reagenzien und Geräte und deren Quellen bereitgestellt.

Name der Reagenzien/Chemikalien	Firma
Wäßriges Methanol	Sisco Research Laboratories Pvt Ltd.
Petrolether	Ranbaxy Fine Chemicals Ltd.
Chloroform	Sisco Research Laboratories Pvt Ltd.
Butanol	Sisco Research Laboratories Pvt Ltd.
Ethylacetat	Sisco Research Laboratories Pvt Ltd.
Histaminsäurephosphat	Blenkinsop & Co. Ltd.
Acetylcholinchlorid	Hopkin & Williams Ltd.
5-Hydroxytryptamin-Kreatinsulfat	Sigma Chemicals
Bariumchlorid	Apex Chemicals
Nicotinsulfat	BDH Chemicals
Oxytocin	Parke Davis India Ltd.
Prostodin-PGF 2 Alpha	Astra IDL Ltd.

GERÄTE:

1. Physiograph Firma: Biodevices, Ambala, Indien
2. Kraftmesswandler Modell-Nr. T-305 Fa.: GRASS, USA
3. Stimulator Modell SS44 Fa.: Biodevices, Ambala
4. Polygraph Modell 7 Fa.: GRASS, USA
5. Kraftmesswandler Modell Nr. FT-03 Fa.: GRASS, USA
6. Organbad Ambala, Indien

Beispiel 2:
Das Sammeln der Mangrovenpflanze Salvadora persica L von der Küste von Goa, einem Staat in Indien, erfolgte um Ribandar stromaufwärts nahe der Mündung des Mandovideltas (Indien). Diese Spezies ist überall in den Küstenbereichen von Goa zu finden und wurde manuell von den Gezeitenbänken gesammelt.
Beispiel 3:
Zur Verarbeitung der gesammelten Mangroven wurden diese zuerst mit Meerwasser und dann mit Leitungswasser gewaschen. Die unerwünschten Materialien wurden ausgesondert und dabei mit Leitungswasser gewaschen, um die Salze zu entfernen. Die Blätter, Stengel und Blüten der assoziierten Mangrovenpflanze wurden an der Luft getrocknet. Nach dem Trocknen wurde das Pflanzenmaterial in kleine Stücke geschnitten und etwa eine Woche lang zur Extraktion in das Lösungsmittel, ein 90-%iges wäßriges Methanolbad, eingetaucht. Es wurde sorgfältig sichergestellt, daß die Stücke richtig in das Lösungsmittel eingeweicht/eingetaucht waren und auf Verfaulen kontrolliert wurden.
Beispiel 4:
Die Extraktion und die Herstellung des Rohextrakts erfolgten durch ein Kaltfiltrierverfahren bei Raumtemperatur und durch Verdampfen des Lösungsmittels in einem Wasserbad (Temperatur 50°C) unter vermindertem Druck. Dadurch wird etwaiger darin enthaltener wärmelabiler Metabolit besser geschützt. Es erfolgte eine zweimalige Reextraktion, bis der Extrakt unter Vakuum konzentriert war, um den Rohextrakt zu gewinnen.
Beispiel 5
Fraktionierung des Rohextrakts
Der Rohextrakt wurde mit Hilfe eines Scheidetrichters in Petrolether, Chloroform, n-Butanol und die wäßrige Fraktion getrennt. Der Petrolether wurde dem Extrakt in dem Scheidetrichter zugesetzt und abgetrennt. Als nächstes wurde dem Rest Chloroform zugesetzt und gut gemischt, und die untere Schicht wurde abgetrennt. Dem Rest wurde das Butanol zugesetzt, wobei die obere Schicht die Butanol-Fraktion und die untere Schicht die wäßrige Fraktion darstellten. Die Extraktion jeder Fraktion erfolgte zwei Mal, und überall dort, wo eine Emulsion bestand, wurde Natriumchlorid zum Auflösen der Emulsion zugesetzt. Der Chloroform- und der Butanol-Fraktion wurde Natriumsulfat zugesetzt, um vor dem Konzentrieren Wasserspuren zu beseitigen. Sämtliche Fraktionen wurden auf die gleiche Weise wie der Rohextrakt konzentriert. Diese Fraktionen wurden auf die gleiche pharmakologische Wirkung wie der rohe Stammextrakt untersucht. Die Säulenchromatographie zur Isolierung der reinen Verbindung wurde durch mehrmalige Chromatographie und durch Dünnschichtchromatographie der Eluierungsmittel ausgeführt. Durch die Dünnschichtchromatographie wurden Verbindungen wie β-Amyrin, Betulin, Ursolsäure und Lupeol enthüllt.
Beispiel 6
Zur Gewinnung der Verbindungen β-Amyrin und Betulin erfolgte eine Trennung durch Dünnschichtchromatographie an 0,25 mm dicken Platten aus Kieselsäuregel (Qualigen). Das Eluierungsmittel war eine 90:10-Mischung (v/v) von Petrolether und Ethylacetat, und die Flecken wurden durch Besprühen mit einer 5%-igen H₂SO₄-Lösung und Fixierung durch Erhitzen auf 110 Grad C ausgebildet.
Für die Verbindungen Ursolsäure und Methylpalmitat erfolgte die Trennung durch Dünnschichtchromatographie an 0,25 mm dicken Platten aus Kieselsäuregel (Qualigen). Das Eluierungsmittel war eine 85:15-Mischung (v/v) von Petrolether und Ethylacetat, und die Flecken wurden durch Besprühen mit einer 5%-igen H₂SO₄-Lösung und Fixierung durch Erhitzen auf 110 Grad C ausgebildet.
Für die Verbindung Lupeol erfolgten die Trennungen durch Dünnschichtchromatographie an 0,25 mm dicken Platten aus Kieselsäuregel (Qualigen). Das Eluierungsmittel war eine 75:25-Mischung (v/v) von Petrolether und Ethylacetat, und die Flecken wurden durch Besprühen mit einer 5%-igen H₂SO₄-Lösung und Fixierung durch Erhitzen auf 110 Grad C ausgebildet.
Bei der vorliegenden Erfindung wurde die aktive wäßrige Fraktion der Mangrovenpflanze S. persica über Kieselsäuregel säulenchromatographiert, um den aktiven Bestandteil zu isolieren. Die Eluate aus der Säule mit dem gleichen Dünnschichtchromatographieprofil wurden gemischt und einem pharmakologischen Test unterworfen. Die aktiven Nebenfraktionen wurden weiter chromatographiert, bis man aktive reine Verbindungen erhielt. Die Flecken bei der Dünnschichtchromatographie (TLC) wurden durch Verwendung von Joddämpfen und Besprühen mit methanolischer Schwefelsäure sichtbar gemacht.
Die Dünnschichtchromatographie erfolgte auf Glasplatten (von 20 × 20 cm), die mit einer 0,25 mm messenden Schicht von für die TLC geeignetem Kieselsäuregel (Qualigen) überzogen waren, das 1 Stunde lang vor der Verwendung bei 110°C aktiviert worden war. Die aktive wäßrige Fraktion wurde durch eine XAD-Säule geleitet, und die Eluierungsmittel wurden in der oben erwähnten Weise behandelt, um aktive Metabolitenbestandteile zu isolieren und zu reinigen.
Die fünf Verbindungen wurden mit Hilfe von Spektraldaten identifiziert, die man am Regional Sophisticated Instrumentation Centre (RSIC) mit den folgenden Spektren erhielt:
¹H-NMR zur Bestimmung der Protonenumgebung des Moleküls, ausgeführt an einem Bruker DPX-200 MHz.
Gerät: Bruker-Spektrometer
Modell: DPX
Fa. Bruker
¹³C-NMR für Kohlenstoffatome, Bruker DPV 300 MHz Die Verbindungen wurden durch einen Vergleich ihrer Spektraldaten mit denen von in der Literatur genannten ähnlichen Verbindungen identifiziert.
Ein Massenspektrum mit Elektronenstoß-Massenspektrometrie (EIMS) wurde zur Bestimmung der Molekulargewichte zusammen mit deren Fragmentierungsmuster ausgeführt mit einem Massenspektrometer (E1/CIMS) des Modells D.300 JEOL.
Gerät: Massenspektrometer (EIMS)
Modell: D-300
Fa. JEOL, Japan
Beispiel 6
Pharmakologischer Test reiner Verbindungen
Es wurden die folgenden Standard-Inhaltsstoffe verwendet:
Histaminsäurephosphat (Blenkinsop & Co. Ltd.) am Ileum
Acetylcholinchlorid (Hopkin & Williams Ltd.) am Ileum
5-Hydroxytryptamin-Kreatininsulfat (Sigma Chemicals Co.) am Magen-Darm-Kanal.
Bariumchlorid (Apex Chemicals) bei Glattmuskelkontraktion
Nicotinsulfat (BDH Chemicals) am Darm als Ganglionstimulans
Oxytocin (Parke Davis India Ltd.) am Uterus
Prostidin – PGF₂ (Astra IDL Ltd.) am Uterus
Alle anderen verwendeten Reagenzien wiesen Analysequalität auf.
Am Ileum von Meerschweinchen wurde Tyrode-Lösung verwendet, und am Uterus von Meerschweinchen wurde de-Jalon-Lösung verwendet.
An der Meerschweinchenherzvorkammer Tabelle 3 wurde eine physiologische Ringer-Locke-Lösung verwendet.
Alle anderen verwendeten Reagenzien wiesen Analysequalität auf.
Verwendete physiologische Lösungen und verschiedene Parameter:
Alle physiologischen Lösungen wurden zum Zeitpunkt des Experiments frisch zubereitet.
pH-Wert: Der pH-Wert der verschiedenen physiologischen Salzlösungen schwankte zwischen 7,3 und 7.4. Bei niedrigerem pH-Wert neigt der Tonus zur Abnahme und ist deshalb geeignet, die Wirkung der Inhaltsstoffe zu verändern.
Temperatur: Um beständige Wirkungen zu erzielen, war es wichtig, die Temperatur der Badlösung auf einer festgelegten Höhe zu halten, denn wenn die Temperatur unter 37°C abgesenkt wird, nimmt der Tonus des Darms zu, die Kontraktionen werden kleiner, und die Kontraktions- und Entspannungszeiten werden länger.
Luft: Für die richtige Funktionsweise der Gewebe sind Luft oder Sauerstoff notwendig. Außerdem wurde die Badlösung bei Zuführung von Sauerstoff zu den Geweben auch durch den Strom der Gasblasen umgewälzt, wodurch die dem Bad zugesetzten Inhaltsstoffe leichter diffundieren konnten.
Die Lösung in dem Bad wurde häufig gewechselt, weil sich der pH-Wert durch längere Belüftung leicht ändert.
In-vitro-Experimente:
Es wurden weibliche jungfräuliche Meerschweinchen verwendet, die 300 bis 350 g wogen und unter einheitlichen häuslichen Bedingungen (Temperatur 25 ± 1°C) untergebracht waren. Man ließ die Tiere 24 Stunden lang vor dem Experiment hungern, ad libitum wurde Wasser verabreicht.
Zur Untersuchung der tokoloytischen Wirkung wurde der isolierte Uteri der Meerschweinchen verwendet.
Für die Experimente an isolierten Meerschweinchen wurde der Uterus bicornis disseziert und von Fettgewebe befreit. Ein Horn wurde abgeschnitten und in einer flachen Schale mit der physiologischen Lösung – der de-Jalon-Lösung – darin aufbewahrt, die vorher mit Luft belüftet worden war. Die Luft wurde dem Sauerstoff vorgezogen, da das Gewebe dünn war und die Sättigung schneller verlief. Die de-Jalon-Lösung umfaßt:

Glucose 0,5 g

Natriumchlorid 9,0 g

Natriumbicarbonat 0,5 g

Kaliumchlorid 0,42 g

Calciumchlorid 0,06 g
Alle wurden in 1000 ml Wasser gelöst.
Die beiden Enden wurden zugenäht. Das untere Ende des Uterusstreifens wurde an einem Gewebehalter angebunden und in einem Organbad mit 10 ml Kapazität aufgehängt, und da das obere Ende empfindlicher ist, wurde es an dem Hebel des Kraftmesswandlers (Ft 03) angebunden, der mit einem Grass-Polygraph (Modell 7) verbunden war. Man ließ es sich 30 Min. lang stabilisieren und erneuerte dabei die physiologische Lösung in dem Bad aller 10 Min. Die Reaktion des Uterus auf verschiedene Dosen des Extrakts (50 & 250 μg/ml) gegenüber standardmäßigen Uterustimulantien wie Oxytocin und PG F_2α mit einem Kontaktzeitraum von 60 Sekunden (wurde an dem Polygraphen registriert). Die tokolytische Wirkung wurde mit der folgenden Formel bewertet:
wobei:

X: = Höhe der standardmäßigen Kontraktion (mm)
Y: = Höhe der standardmäßigen Kontraktion in Anwesenheit des Extrakts (mm)

Die jeweilige tokolytische in-Vitro-Wirkung des Extrakts aus der Salvadora persica am Uterus von Meerschweinchen ist in der folgenden Tabelle gezeigt (Mittel aus 5 Ablesewerten).

Claims

Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge eines wässrigen Extrakts, das erhalten wird aus der Pflanze Salvadora persica, optional mit konventionellen Zusätzen, zur Herstellung eines Medikaments zum Lindern von Schmerzen in den Uterusmuskeln eines Subjekts, das dessen bedarf.
Verwendung nach Anspruch 1, worin 3 bis 10 μg/ml Menge des Extrakts an das Subjekt verabreicht werden muss für einen Zeitraum von 10 Minuten.
Verwendung nach Anspruch 1, worin das Subjekt ein Mensch oder Tier ist.
Verfahren zur Extraktion und Reinigung biologisch nützlicher Moleküle aus der Mangrovenpflanze Salvadora persica, welches die Schritte umfaßt von: i) Trocknen der Pflanze, ii) Schneiden der getrockneten Pflanze in kleine Stücke, iii) Eintauchen der kleinen Pflanzenstücke in etwa 95% wässriges Methanol für etwa eine Woche, um ein Extrakt zu erhalten, iv) Verdampfen des wässrigen Methanols aus dem erhaltenen Extrakt unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von etwa 55°C, v) Kaltfiltrieren des Extrakts bei Raumtemperatur, vi) zweimal Wiederholen der Schritte iii) bis v), um ein konzentriertes Rohextrakt zu erhalten, vii) Fraktionieren des konzentrierten Rohextrakts in eine Petroletherfraktion, eine Chloroformfraktion, eine n-Butanolfraktion und eine wässrige Fraktion unter Verwendung von Scheidetrichtern, viii) Isolieren der biologisch nützlichen Moleküle über Chromatographie und ix) Identifizieren der Verbindungen über Spektroskopie.
Verfahren nach Anspruch 4, worin die Pflanzenteile gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus Blättern, Stengeln und Blüten.
Verfahren nach Anspruch 4, worin die biologisch nützlichen Moleküle weiter identifiziert und gereinigt werden durch Säulenchromatographie und/oder Dünnschichtchromatographie.
Verfahren nach Anspruch 6, worin Silicagelplatten bei der Dünnschichtchromatographie verwendet werden.
Verfahren nach Anspruch 4, worin die biologisch nützlichen Moleküle gewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus β-Amyrin, Betulin, Ursolsäure, Methylpalmitat und Lupeol.