DE60037263T2

DE60037263T2 - Virus-ähnliche Partikel, ihre Herstellung und ihre Verwendung beim pharmazeutischen Screening und funktionelle Genomanwendungen

Info

Publication number: DE60037263T2
Application number: DE2000637263
Authority: DE
Inventors: Nicholas Hunt
Original assignee: Evotec OAI AG
Current assignee: Evotec OAI AG
Priority date: 2000-12-29
Filing date: 2000-12-29
Publication date: 2008-10-09
Anticipated expiration: 2020-12-30
Also published as: DE60037263D1; EP1219705A1; EP1219705B1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf virusartige Partikel, deren Herstellung und Verwendung vorzugsweise beim pharmazeutischen Screening und bei der funktionellen molekularen Genomforschung. Die Erfindung stellt zudem eine Vielfalt von Assay-Formaten bereit, die mit diesen virusartigen Partikeln verwendet werden sollen.
Die Analyse von funktionellen integralen Membranproteinen kann in einer Anzahl von Systemen und Umgebungen des Standes der Technik durchgeführt werden. Rezeptoren können entweder direkt auf den Zellen, in denen sie endogen exprimiert sind, oder in einem rekombinanten Zellsystem, in dem sie üblicherweise überexprimiert sind, auf Liganden-Wechselwirkungen analysiert werden. Obwohl diese Moleküle üblicherweise in einer solchen Umgebung funktionell sind, wird ihre Analyse als Ergebnis der hohen Hintergrundgehalte durch das Vorliegen einer großen Anzahl/Konzentration von kontaminierenden funktionell ähnlichen oder verwandten Proteinen behindert. Somit ist die Probe sehr heterogen, selbst wenn das bestimmte Protein oder der interessierende endogene Rezeptor bereits in einer großen Anzahl von Kopien exprimiert ist oder unter einem starken rekombinanten Promoter überexprimiert ist.
Weiterhin können jedoch bindende Domänen, unabhängig davon, ob sie ein Rezeptor, ein Adhäsionsmolekül oder katalytische Moleküle sind, nach der Anreicherung oder Reinigung des entsprechenden Moleküls zur Homogenität aus einer Quelle, in der die ursprüngliche Aktivität nachgewiesen wurde, analysiert werden. Solche Reinigungsschritte führen jedoch oft zur Entfernung der entsprechenden Proteine aus ihrer normalen Lipid/Lipid-Protein-Umgebung, was den Verlust entweder der partiellen oder vollständigen Funktion aufgrund von Denaturierungseffekten nach dem Entfernen des interessierenden spezifischen Moleküls aus seiner nativen Umgebung zur Folge haben kann. Daraus resultiert üblicherweise die Notwendigkeit, dass große Mengen an Ausgangsmaterial oder rekombinantem Material erforderlich sind, um entsprechende Mengen des interessierendes Zielmoleküls zu reinigen (oder wenigstens zu konzentrieren).
Verschiedene systematische Formate, die beim Screening mit ultrahohem Durchsatz (uHTS) angewendet werden, einschließlich Assays, die auf homogener zeitaufgelöster Fluoreszenz (HTRF) oder konfokalen Nachweistechniken, z. B. Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS), basieren, verwenden spezifische Membranfraktionen wie Vesikel, in denen das interessierende integrale oder Membran-assoziierte Protein in hohen Konzentrationen vorliegt. Ähnliche Probleme mit Hintergrundsignalen liegen jedoch auch bei solchen Präparaten vor, und üblicherweise sind beträchtliche Mengen an Zellen notwendig, um zuweilen minimale Mengen der Probe herzustellen. Wiederum sind solche Präparate üblicherweise in Bezug auf ihre Qualität und Integrität heterogen, wodurch sich beträchtliche Inter-Assay-Variationen ergeben.
Wie oben erwähnt wurde, leiden Standardassay-Systeme, die entweder ganze Zellen oder angereicherte Membranpräparate derselben (Vesikel) verwenden, an einer Anzahl von dahingehenden Nachteilen, dass selbst in rekombinanten gentechnisch hergestellten Zellsystemen, in denen das interessierende Molekül überexprimiert ist, immer noch ein beträchtlich hoher Grad an Hintergrund besteht (siehe oben). Bei einigen Anwendungen kann dieses Problem des hohen Hintergrundes unter Verwendung einer Methodologie für das Liganden-induzierte spezifische Markieren von sieben Transmembranrezeptoren (7-TMRs, Patent DE 197 09 168 C1 und internationale Patentanmeldung PCT/EP 98/01229 ) teilweise reduziert werden.
Somit besteht ein Ziel – bei dem alle oben erwähnten Probleme gelöst sind – darin, das entsprechende Protein (z. B. ein biologisch aktives 7-TMR oder ein anderes integrales Membranprotein) in einer stabilen und vorzugsweise seiner natürlichen Umgebung (z. B. der Plasmamembran), die frei von kontaminierenden Proteinen ist, auf eine zweckmäßige und wirtschaftliche Weise zu exprimie ren, was die Herstellung ausreichender Mengen eines Materials hoher Qualität ergibt, das für ein Screening mit hohem Durchsatz zugänglich ist.
Eine Methodik ist notwendig, die es z. B. ermöglicht, große Mengen eines spezifischen rekombinanten integralen Membranproteins in einer stabilen Umgebung zu erhalten, in der die spezifische Funktion nicht verringert ist und in der der Anteil ansonsten kontaminierender störender Membranproteine vorzugsweise < 10% ist. (Die kontaminierenden Proteine können entweder durch die Membran oder in der Membran während der Herstellung nicht spezifisch eingekapselt werden oder können akzessorische Proteine darstellen, deren Affinität und Nähe derartig ist, dass sie während ihrer entsprechenden biologischen oder experimentellen Anwendung nicht segregierbar sind). Ein solches System sollte es vorzugsweise ermöglichen, optische Nachweistechniken anzuwenden, wie Nachweissysteme auf Einzelmolekül- oder Einzelpartikel-Basis (wie z. B. in EP 0 679 251B1 beschrieben ist), um die funktionelle Wechselwirkung eines bekannten oder unbekannten Liganden mit einem ausgewählten Zielprotein zu beobachten, z. B. in einem Rezeptor-Ligand-Bindungsassay. Es ist von besonderem Interesse, neue Agonisten und Antagonisten für die große Anzahl von Rezeptoren vom Orphan-Typ zu finden, wie im Patent DE 197 09 168 C1 und der internationalen Patentanmeldung PCT/EP 98/01229 beschrieben ist, in Kombination mit einem vorzugsweise homogenen optischen Assay, der von definitiven und präzisen Signalen abhängig ist, verglichen mit Western Blots, die eine Vielfalt von Hintergrundsignalen tolerieren, solange sie von einem interessierenden spezifischen Signal räumlich getrennt sind. Die letztgenannte Methodik ist jedoch nicht für ein Screening mit hohem Durchsatz zugänglich, und somit muss eine Technik angewendet werden, die auf das Screening angepasst werden kann. Zu diesem Zweck wäre ein homogener Assay, d. h. ein Misch- und Mess-Assay, der nicht auf Trennungsschritte angewiesen ist, um z. B. Rezeptor-gebundene und freie Liganden zu unterscheiden, von großem Vorteil. Ein solches Assay-System wäre von höchstem Interesse und größter Bedeutung für die pharmazeutische Industrie, die ständig auf der Suche nach einem funktionellen Assay-Zugang ist, der für die sehr große Anzahl von Rezeptoren anwendbar ist, die durch zahlreiche funktionelle molekulare Genomforschungsprogramme gefunden wurden. Sezernierte Proteine und äußere Membranproteine sind wirtschaftlich bis jetzt die wichtigste Klasse von therapeutischen Zielen. Etwa 64% aller bekannten Medikamente sind zur Zeit gegen die Familie von 7-Transmembran-Rezeptoren gerichtet. Zusätzlich dazu sind Reagenzien für das Durchführen der oben erwähnten Assays notwendig.
Diese Probleme werden durch die Erfindung gelöst, die unterschiedliche virusartige Partikel und Assay-Formate bereitstellt, in denen diese virusartigen Partikel angewendet werden können.
Virusartige Partikel, deren Herstellung und Nachweis
In einem ersten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, um proteinartige Zielmoleküle in virusartige Partikel (VLPs) selektiv einzubauen oder einzukapseln. Zielmoleküle werden in rekombinanten Zellen zusammen mit Signalmolekülen coexprimiert. Jedes Zielmolekül und jedes Signalmolekül umfasst eine erste und eine zweite Aminosäuresequenz. Die zweite Aminosäuresequenz des Signalmoleküls verleiht dem Signalmolekül die Fähigkeit, sich zu virusartigen Partikeln zusammenzusetzen, die vorzugsweise in eine extrazelluläre Umgebung freigesetzt werden, in der sie leicht nachgewiesen werden können. Die ersten Aminosäuresequenzen dieser Signalmoleküle werden so ausgewählt, dass sie in der Lage sind, in einer nichtkovalenten Weise mit den ersten Aminosäuresequenzen der Zielmoleküle funktionell zusammenzuwirken. Durch diese Wechselwirkung wird eine zweite interessierende Aminosäuresequenz, z. B. ein Rezeptor oder eine bindende Domäne, durch das virusartige Partikel eingebaut oder eingekapselt. Die ersten Aminosäuresequenzen dieser Signalmoleküle Wechselwirken funktionell mit den ersten Aminosäuresequenzen der Zielmoleküle durch nichtkovalente Kräfte, wie van-der-Waals-Kräfte, elektrostatische Kräfte, Stapelwechselwirkungen, Wasserstoffbrückenbindungen oder sterische Erkennung. Vorzugsweise haben diese Kräfte eine Bindungskonstante von K_ass ≥ 10^–6 M.
Die durch die Erfindung beschriebene Strategie verwendet vorzugsweise eine allgemeine Markierungsstrategie, so dass alle Proteine unter Verwendung der gleichen Komponenten modifiziert werden können, was ein Standardeinsatzverfahren für alle zu validierenden Proteine ergibt.
Es ist möglich, eine homogene Population von VLPs zu erzeugen, in der ein funktionelles Zielprotein der Wahl entweder in der Lipid-Doppelschicht eines umhüllten VLP oder in dem Kapsid eines nackten oder umhüllten VLP exprimiert ist. Es ist auch möglich, Zielproteine in dem VLP einzukapseln. Diese Reaktionen werden durch die spezifische Wechselwirkung mit einem Signalprotein vermittelt. Der Einbau/das Einkapseln der entsprechenden Zielproteine wird vorzugsweise durch die Verwendung eines Signalmoleküls mit einer spezifischen konkatameren Proteinsequenz erreicht, die spezifisch und mit hoher Affinität mit einem komplementären konkatameren Tag in Wechselwirkung tritt, der entweder an dem Carboxyl- oder Amino-terminalen Ende des entsprechenden Zielproteins lokalisiert ist. Wenn diese beiden modifizierten Proteine (Signal und Ziel) in der gleichen Wirtszelle exprimiert werden, dann assoziieren die exprimierten Protein-Produkte miteinander über die spezifischen Tags. Die Wechselwirkung ergibt eine bevorzugte Ausführungsform der Translokation der entsprechenden Komplexe zur Zellmembran in hohen Konzentrationen, wo sie aus den Zellen über einen Knospungsvorgang ausgestoßen werden, der der Freisetzung von reifen Viruspartikeln ähnlich ist. Die meisten umhüllten virusartigen Partikel erwerben ihre Membran oder "Hülle", eine Lipid-Doppelschicht und assoziierte Zielproteine, durch Knospung durch eine geeignete Zellkernmembran, die Plasmamembran in vielen Fällen, das Endoplasmatische Retikulum (ER), den Golgi-Apparat oder Zellkernmembranen unter anderen. Einzelheiten des Knospungsvorgangs sind aus dem Stand der Technik bekannt (für eine allgemeine Übersicht siehe Fields et al. "Fundamental Virology", Kapitel 3, 3. Auflage, Lippincott-Raven, 1996). Virusartige Partikel können jedoch auch durch Exocytose oder Lyse aus der Zelle freigesetzt werden.
In vielen Fällen ist diese zweite Aminosäuresequenz des Zielmoleküls zum virusartigen Partikel heterolog. Es könnte von Interesse sein, als zweite Sequenz einen Rezeptor, einen Innenkanal, ein Enzym, ein Adhäsionsmolekül, eine Komponente einer Membranpore, ein Antigen oder Fragmente oder Derivate der vorhergehenden auszuwählen. Es wird besonders bevorzugt, einen Transmembranrezeptor auszuwählen, insbesondere einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor, der durch einen Knospungsvorgang auf der Basis der vorliegenden Erfindung in eine Hülle eines virusartigen Partikels eingebaut wird. Cytosolische oder Zellkernrezeptoren können jedoch auch durch ein Proteinkapsid oder ein nacktes oder umhülltes VLP eingebaut oder verkapselt werden. Zum Durchführen der nachstehend beschriebenen unterschiedlichen Assay-Formate kann es auch zweckmäßig sein, als zweite Aminosäuresequenz der Zielmoleküle ein lumineszentes Peptid oder Protein auszuwählen.

Bei der zweiten Aminosäuresequenz des Signalmoleküls wird es bevorzugt, dass sie wenigstens ein Fragment eines Viruskapsid- oder Virushüllproteins oder einen Vorläufer eines Viruskapsid- oder Virushüllproteins oder eine Mutante eines Viruskapsid- oder Virushüllproteins umfasst. Sie kann jedoch auch wenigstens ein Fragment eines Kapsid- oder Virushüllproteins eines virusartigen Partikels oder einen Vorläufer des Kapsid- oder Virushüllproteins umfassen. Kapsid- oder Hüllproteine können aus einer Vielfalt von Virusfamilien ausgewählt werden, die unter anderem Retroviren, Picornaviren, Reoviren, Polyomviren, Papillomviren, Parvoviren, Nodaviren, Coronaviren, Herpesviren, Hepadnaviren, Baculoviren und Bakteriophagen einschließen. Es ist z. B. auch möglich, eine zweite Aminosäuresequenz dieses Signalmoleküls zu verwenden, die von wenigstens einem Fragment eines Retrotransposons, insbesondere einem Ty-Element in Hefe, einem Copia-Element in Insekten, einem Copia-artigen Element in Insekten, VL30 in Mäusen oder einem IAP-Gen in Mäusen kodiert wird. Eine Liste von besonders geeigneten Sequenzen ist in der folgenden Tabelle angegeben.

Virusfamilie	selbstaggregierende Kapsid- oder Hüllkomponente	Beispiel	Literatur
Retroviridae	Komponenten, die von gag-Gen, Polyprotein-Vorläufer von Gag oder verkürztem Gag kodiert werden	Molney-Murin-Leukämievirus (MoMULV) gag Pr65	Delchambre et al., EMBO J 8, 2653–2660, 1989; Luo et al., Virology 179, 874–880, 1990; Royer et al., Virology 184, 417–422, 1991; Morikawa et al., Virology 183, 288–297, 1991; Zhou et al., J. Virol. 68, 2556–2569, 1994; Gheysen et al., Cell 59, 103–112, 1989; Hughes et al., Virology 193, 242–255, 1993; Yamshchikov et al., Virology 214, 50–58, 1995. WO 96/30523 , Anmelder: H. Wolf. WO 94/20621 , Anmelder: British Biotechnology LtD. WO 96/35798 , Anmelder: Introgene B. V. EP 0972841 A1 , Anmelder: Introgene B. V. EP .. EP 0960942 A2 , Anmelder: Introgene B. V. EP .. EP 0959135 A1 , Anmelder Applicant: Introgene B. V. EP.
Picornaviridae	Kapsid-Komponenten, die von Polyprotein-Vorläufer abgeleitet sind	Poliovirus VP0, VP1 und VP3	Fundamental Virology (dritte Aufl.) herausgegeg. von Fields et al. 1996. Kapitel 16. Picornaviridae. 477–522.
Reoviridae	Struktur-Kapsid-Komponenten, die von RNA-Segmenten kodiert werden	Rotavirus VP2, VP1/2, VP1/2/3, VP2/3, VP2/6, VP2/6/7, VP2/4/6/7, VP1/2/3/6	Fundamental Virology (dritte Aufl.) herausgeg. von Fields et al. 1996. Kap. 24. Reoviruses. 691–730.
Polyomavirinae	Struktur-Kapsidproteine	Polyomavirus VP1, VP2 und VP3	Fundamental Virology (dritte Aufl.) herausgeg. von Fields et al. 1996. Kap. 28. Polyomaviridae. 917–945. DE 19543553 A1 , Anmelder: Deutsches Primaten Zentrum.
Papillomavirinae	Struktur-Kapsidproteine	Humanopapilomavirus L1 und L1/12	Fundamental Virology (dritte Aufl.) herausgeg. von Fields et al. 1996. Kap. 29. Papilomavirinae. 947–978. WO 00/09157 , Anmelder: Merck & CO. Inc. WO 99/50424 , Anmelder: M. Stanley. WO 98/02548 , Anmelder: The government of the United States of America.
Parvoviridae	Struktur-Kapsidproteine	Adenoassoziertes Virus VP1, VP2 und VP3	Fundamental Virology (dritte Aufl.) herausgeg. von Fields et al. 1996. Kap. 31. Parvoviridae. 1017–1041.
Herpesviridae	Struktur-Kapsidproteine	Herpes simplex Virus VP5, VP19C, VP23, VP26	Fundamental Virology (dritte Auf.) herausgeg. von Fields et al. 1996. Kap. 32. Herpes. Simplex viruses and their replication. 1043–1107.
Hepadnaviridae	Struktur-Kapsidprotein	Hepatitisvirus S-Protein	Fundamental Virology (dritte Aufl.) herausgegeb. von Fields et al. 1996. Kap. 35. Hepadnaviridae and in their replic. 1199–1233. WO 98/28004 , Anmelder: The crown in the right of the Queensland department of health
Nodaviridae	Struktur-Kapsidprotein	Flock house-Virus, Protein Alpha	Fundamental Virology (dritte Aufl.) herausgeg. von Fields et al. 1996. Kap. 13. Insect viruses. 401–424. WO 99/29723 , Anmelder: Pentamer Pharmaceuticals
Coronaviridae	Strukturproteine	Maus-Hepatitisvirus M und E-Proteine	Fundamental Virology (dritte Aufl.) herausgeg. von Fields et al. 1996. Kap. 18. Coronaviridae. 541–559. WO 98/49195 , Applicant: Universiteit Utrecht.
Retrotransposons	Retrotransposoncodierender Bereich	Protein, das von Hefe-Retrotransposon-Ty, Insekten-Copia und Copiaartigen Elementen, Murin VL30 und IAP-Genen. kodiert wird	WO 88/03563

Es wird jedoch besonders bevorzugt, als zweite Aminosäuresequenz des Signalmoleküls ein Strukturprotein zu verwenden, das von dem gag-Gen von Retroviren kodiert wird. Die Erfindung wird größtenteils in Bezug auf die Verwendung des Gag-Proteins beschrieben. Diese Erläuterung soll den Umfang in keiner Weise einschränken.
Künstliche Konstrukte, die sich von Retroviren ableiten, können verwendet werden, um z. B. selektiv ein interessierendes Protein, wie einen Rezeptor oder eine Rezeptor-Untereinheit, auf der Außenoberfläche eines virusartigen Partikels aufzuzeigen. Im Folgenden wird der derzeitige Stand der Kenntnis der Organisation von Retroviren zusammengefasst.
Retroviren haben ein Proteinkapsid, das unter anderen Bestandteilen das virale genetische Material und den Reverse-Transcriptase-Komplex enthält. Außerhalb des Kapsids befindet sich eine Lipid-Doppelschicht, die sich von der Wirtszell-Plasmamembran ableitet, in der virale Hüllglycoproteine eingebettet sind. Während des Infektionszyklus initiieren diese Hüllglycoproteine eine Infektion durch Erkennen und Binden spezifischer Rezeptoren auf der Oberfläche einer Wirtszelle und Einleiten einer Fusion der viralen und Zellmembranen. Nach der intrazellulären Genom-Replikation und ihrer Integration in das Zellchromosom werden virale RNAs, die Strukturproteine kodieren, hergestellt, und naszierende Virionen aggregieren sich. Neu synthetisierte virale Kapside bauen insbesondere während der viralen Knospung größtenteils virale Glycoproteine aus der Plasmamembran ein, während Zellproteine ausgeschlossen sind. Das retrovirale Zusammenlagerungsverfahren ist ein wichtiger Aspekt der grundlegenden Molekularbiologie von Retroviren. Die Komplexität dieses Verfahrens der Viruskapsid-Bildung und der Freisetzung aus der Wirtszelle durch den Knospungsvorgang wird nachstehend ausführlicher beschrieben.
Das Genom aller Retroviren kodiert für prinzipiell drei Hauptgenprodukte, insbesondere das gag-Gen, das für Strukturproteine kodiert, das pol-Gen, das für die Reverse Transcriptase und assozierte proteolytische Polypeptide, Nuclease und Integrase-assoziierte Funktionen kodiert, und env, dessen kodierte Glycoprotein-Membranproteine auf der Oberfläche infizierter Zellen und auch auf der Oberfläche von reifen freigesetzten Viruspartikeln nachgewiesen werden. Das gag-Gen aller bisher analysierten Retroviren hat eine Gesamtstrukturähnlichkeit und wird insbesondere auf dem Aminosäureniveau in jeder Gruppe konserviert. Das gag-Gen und das pol-Gen können für beide Produkte zusammen gruppiert werden und werden als einfaches hochmolekulares Vorläufer- Polyprotein, z. B. Pr65^Gag (für das Murin-Leukämievirus, MuLV) oder Pr200^Gag-Pol, synthetisiert, das anschließend gespalten wird, um zu reifen Proteinen zu führen. Die Gag-Proteine führen zu Kernproteinen ausschließlich der Reversen Transcriptase. Für MuLV ist das Gag-Vorläufer-Polyprotein Pr65^Gag, und es wird in vier Proteine aufgespalten, deren Reihenfolge auf dem Vorläufer NH2-p15-pp12-p30-p10-COOH ist. Diese Spaltungen scheinen durch eine virale Protease vermittelt zu werden. Das MuLV-Gag-Protein existiert in einer glycosylierten und einer nicht-glycosylierten Form. Die glycosylierten Formen werden von gPr80^Gag abgespalten, das ausgehend von einem unterschiedlichen In-Frame-Startcodon synthetisiert wird, das stromabwärts vom AUG-Codon für das nicht-glycosylierte Pr65^Gag lokalisiert ist. Deletionsmutanten von MuLV, die nicht das glycosylierte Gag synthetisieren, sind noch infektiös, so dass sich die Frage hinsichtlich der Bedeutung der Glycosylierungsvorgänge stellt. Die posttranslationale Spaltung des HIV-1-Gag-Vorläufers von 55000 Da (pr55^Gag) durch die Virus-codierte Protease ergibt das N-myristoylierte und intern phosphorylierte p17-Matrixprotein (p17MA), das phosphorylierte p24-Kapsidprotein (p24CA) und das Nucleokapsidprotein p15 (p15NC), das weiterhin in p9 und p6 gespalten wird.
Die Translation des MuLV-pol-Gens wird durch eine ribosomale -1-Rasterverschiebung nahe am Ende des gag-Gens erreicht. Die Translations-Rasterverschiebung ermöglicht die Synthese eines 160 kD Polyproteins, das aus einem abgestumpften Gag-Fusionsprotein besteht, das zu dem Produkt des pol-Leserasters verschmolzen ist. Der Herstellungsgrad des Gag-Pol-Fusionsproteins beträgt nur 5–10% der Produktionsmenge des Gag-Proteins (Jacks et al., Cell 55, 447–458, 1988; Wilson et al., Cell 55, 1159–1169, 1988).
Das pol-Gen kodiert die virale Enzymprotease, die Reverse Transcriptase und Integrase, die aus dem Vorläufer durch die virale Protease abgespalten werden (Lightfoote et al., J. Virol. 60, 771–775, 1986; Oroszlan und Luftig Curr Top Microbiol Immunol 157, 153–185, 1990; Peng et al., J. Virol. 65, 2751–2756, 1991).
Das env-Gen kodiert die Oberflächen-Glycoproteine des Virions, die für die Initiierung eines Infektionszyklus notwendig sind. Aufgrund ihrer Lokalisierung und ihrer Rolle bestimmen die env-Produkte sowohl das Wirtsspektrum als auch die Neutralisationsantigene des Virions. Obwohl sie nicht eng miteinander verwandt sind, weisen die env-Gene unterschiedlicher Gruppen eine sehr große strukturelle Ähnlichkeit auf. Die Amino-terminale Sequenz des env-Produkts kodiert ein Signalpeptid, das als Folge der Transmembran-Verarbeitung des Env-Vorläufers abgespalten wird. Das env-Gen-Produkt von MuLV Pr90^Env wird glycosyliert und zu gp70 und p15E gespalten, die über eine Disulfid-Bindung aneinander gebunden bleiben. P15E ist ein Transmembranprotein, dessen Carboxyl-Terminus innerhalb der Lipidmembran lokalisiert ist und dessen Amino-Terminus außerhalb der Membran lokalisiert ist. In Elektronenmikrophotographien stellt p15E die Spikes auf der viralen Hülle dar, während gp70 der Buckel ist, der den Spike überragt. Wie bereits beschrieben wurde, enthält das größere aminoterminale Protein Determinanten, um den Wirtsbereich zu spezifizieren. Das kleinere carboxylterminale Protein enthält immer nahe seinem Carboxyl-Terminus eine hydrophobe Domäne von 20 Aminosäuren oder mehr, die einen Transmembran-Ankerbereich darstellen, gefolgt von einer basischen Aminosäure und einer cytoplasmatischen Domäne unterschiedlicher Größe, die wahrscheinlich an dem Erkennen der Kapsidproteine beteiligt ist.
Ein Zusammenlagern von Retroviren erfolgt durch einen Knospungsvorgang an der Zellkern-Plasmamembran. Untersuchungen mit mehreren Retroviren haben gezeigt, dass das Gag-Polyprotein, das in Abwesenheit anderer viraler Komponenten exprimiert wird, für die Partikelbildung und die Knospung an der Zelloberfläche selbstgenügsam ist (Wills und Craven AIDS 5, 639–654, 1991; Zhou et al., J. Virol. 68, 2556–2569, 1994; Morikawa et al., Virology 183, 288–297, 1991; Royer et al., Virology 184, 417–422, 1991; Gheysen et al., Cell 59, 103–112, 1989; Hughes et al., Virology 193, 242–255, 1993; Yamshchikov et al., Virology 214, 50–58, 1995). Die Bildung von Retrovirus-artigen Partikeln nach der Expression des Gag-Vorläufers in Insektenzellen unter Verwendung eines Baculovirus-Vektors wurde durch verschiedene Gruppen gezeigt (Delchambre et al., EMBO J 8, 2653–2660, 1989; Luo et al., Virology 179, 874–880, 1990; Royer et al., Virology 184, 417–422, 1991; Morikawa et al., Virology 183, 288–297, 1991; Zhou et al., J. Virol. 68, 2556–2569, 1994; Gheysen et al., Cell 59, 103–112, 1989; Hughes et al., Virology 193, 242–255, 1993; Yamshchikov et al., Virology 214, 50–58, 1995; Loisel et al., Nature Biotechnology 15 (1997), 1300–1304). Diese Gag-Partikel ähneln unreifen Lentivirus-Partikeln und setzen sich durch Knospung aus der Insektenzellen-Plasmamembran auf wirksame Weise zusammen und werden daraus freigesetzt. Im Gegensatz zur Expression in Sängerzellen führt der Einschluss des Proteasebereichs in Gag-exprimierenden Vektoren im Baculovirus-System zur Überexpression der Protease und zur frühen Verarbeitung des Gag-Vorläufers zu reifen Strukturproteinen in Insektenzellen, was die Partikelbildung und -freisetzung verhindert (Morikawa et al., Virology 183, 288–297, 1991; Hughes et al., Virology 193, 242–255, 1993). Unreife Partikel unterliegen einem Reifungsverfahren durch die virale Protease, das die Spaltung des Gag-Vorläufers zu Strukturproteinen, Matrix, Kern und Nucleokapsidproteinen beinhaltet (Wills und Craven AIDS 5, 639–654, 1991).
Es wurde berichtet, dass der aminoterminale Bereich des Gag-Vorläufers ein Zielsteuerungssignal für den Transport zur Zelloberfläche und die Membranbindung ist, die für die Viruszusammenlagerung erforderlich ist (Yu et al., J. Virol. 66, 4966–4971, 1992; und X et al., J. Virol. Zhou et al., J. Virol. 68, 2556–2569, 1994; Lee und Linial J. Virol. 68, 6644–6654, 1994; Dorfman et al., J. Virol. 68, 1689–1696, 1994; Facke et al., J. Virol. 67, 4972–4980, 1993). Der Mechanismus des spezifischen Einbaus von Hüllprotein in die von Plasmamembran abgeleitete Hülle der Viruspartikel wird nicht verstanden, aber die Wechselwirkung von Env mit dem Matrixprotein scheint wichtig zu sein (Yu et al., J. Virol. 66, 4966–4971, 1992; Dorfman et al., J. Virol. 68, 1689–1696, 1994; Gallaher et al., AIDS Res Hum Retroviruses 11, 191–202, 1995; Bugelski, P. J. et al., AIDS Res Hum Retroviruses 11, 55–64, 1995). Das Humanimmunodefizienzvirus Typ 1 HIV-1 gehört zu der Lentivirusgruppe von Retroviren. Wie andere Retroviren setzt HIV-1 seinen reifen Kernpartikel aus zwei Polyprotein-Vorläufern zusammen, die von dem gag- und pol-Gen kodiert werden. Das env-Gen kodiert das Hüllglycoprotein des reifen Viruspartikels (Takahashi et al., J Exp Med 170, 2023–2035, 1989). Im HIV wurden die Strukturen und Funktionen der gag- und pol-Genprodukte ausführlich untersucht, um ihre Rollen in dem viralen morpho-genetischen Vorgang zu verstehen. Dies hat zu einer Beschreibung des Viruspartikels geführt, gemäß derer er aus dem Nucleokapsidprotein-Komplex in einem hydrophoben Kern von p24 besteht, der von einer Matrixschicht von p17 umgeben ist. Der Kern zusammen mit der Matrixschicht wird von der Wirtszellmembran umhüllt, die das virale Env-Glycoprotein enthält. Der Nucleoprotein-Komplex besteht aus dem viralen RNA-Genom zusammen mit dem p9-Protein und den viralen Enzymen, die für die Replikation und Integration des viralen Genoms erforderlich sind (Gelderblom, AIDS 5, 617–637, 1991; Wills und Craven AIDS 5, 639–654, 1991). Es wurde vorgeschlagen, dass ein zweites Protein p6, das von dem 3'-Bereich des gag-Gens kodiert wird, zwischen dem Kern- und dem Hüllbereich lokalisiert ist, obwohl weder die Rolle noch der präzise Ort des Proteins definiert sind.
Das Zusammenlagern von rekombinanten HIV-artigen Partikeln, die Gag-Strukturproteine sowie Env-Glycoproteine gp120 und gp41 enthalten, wurde berichtet, wobei ein Vacciniavirus-Expressionssystem verwendet wurde (Haffar et al., J. Virol. 66, 4279–4287, 1992). Es wurde berichtet, dass diese Partikel eine HIV-spezifische humorale und zelluläre Immunität in Kaninchen induzieren (Haffar et al., J. Virol. 66, 4279–4287, 1992) und eine Virus-Produktion in latent infizierten peripheren mononukleären Blutzellen von HIV-1-seropositiven Spendern hemmen können (Haffar et al., J. Virol. 66, 4279–4287, 1992).
Die Expressionsmuster von Hüllglycoproteinen von Retroviren in dem Baculovirus-System haben auch verschiedene unübliche Merkmale im Vergleich zur Expression in Sängerzellen. Diese Proteine werden sehr ineffizient gespalten und sind hauptsächlich zellassoziiert (Rusche et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6924–6928, 1987; Wells und Compans Virology 176, 575–586, 1990; Hu et al., Nature 328, 721–723, 1987). Die HIV-1-Env-Proteine, die in Insektenzellen gebildet werden, sind jedoch immunologisch und biologisch aktiv, wie durch ihre Fähigkeit zur spezifischen Reaktion mit Immunserum (Hu et al., Nature 328, 721–723, 1987; Wells und Compans Virology 176, 575–586, 1990) und zur Induktion der Syncytium-Bildung nach der Co-Kultivierung mit HeLa-T4-Zellen (Wells and Compans Virology 176, 575–586, 1990) gezeigt wurde.
Das Verfahren zum selektiven Einbauen oder Einkapseln von proteinartigen Zielmolekülen in virusartige Partikel in einer speziellen Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung basiert auf Beobachtungen, dass dann, wenn man spezifische Strukturgen-Komponenten von Retroviren (das gag-Gen oder Strukturprotein-Komponenten von anderen Virusfamilien) als ein nicht-verarbeitetes Polyprotein in Wirtszellen exprimiert, dieses Gen allein für die Bildung und Freisetzung von VLPs in das extrazelluläre Milieu über einen Vorgang der Knospung aus der Plasmamembran befähigt und verantwortlich ist. Diese Beobachtung wurde angepasst und demgemäß zu einer neuen Methodologie entwickelt, in der Peptide oder Polypeptide selektiv in eine Wirtszelle eingebaut werden oder mit derselben verkapselt werden, die sich von definierten Vesikelpartikeln ableitet. Die Spezifität des Einbaus/der Einkapselung des entsprechenden Zielproteins in den VLPs ist das Ergebnis einer starken spezifischen nichtkovalenten Wechselwirkung (die van-der-Waals-Kräfte, elektrostatische Kräfte, Stapelwechselwirkungen, Wasserstoffbrückenbindungen und sterische Erkennung einschließt) eines molekularen Peptid-Tags, der kovalent an das Signalprotein gebunden ist, mit einem komplementären spezifischen Peptid-Tag, der mit dem interessierenden Ziel assoziiert ist. In einigen Fällen kann es jedoch bevorzugt sein, eine kovalente Fusion des Signalproteins in dem interessierenden Protein/Peptid zu verwenden.
Das Signalfusionsprotein, das einen Tag umfasst, wird in einem zellulären System mit dem entsprechenden interessierenden Zielmolekül coexprimiert, das auch einen spezifischen Peptid-Tag entweder im Molekül oder am N- oder C-Terminus trägt. Dieser Tag ist der komplementäre Partner zu demjenigen, der auf dem Signalprotein gefunden wird (und ist üblicherweise sowohl zum Signalmolekül als auch Zielmolekül heterolog) und tritt in eine spezifische Wechselwirkung mit demselben mit hoher Affinität. Die in Wechselwirkung tretenden Peptide sind vorzugsweise spezifisch ausgestaltet, um hydrophil geladene α-Helices als Monomere zu bilden und miteinander in Wechselwirkung zu treten, wobei entweder eine parallele oder antiparallele superspiralisierte α-Helix- Struktur gebildet wird, wenn sie coexprimiert sind. Vorzugsweise liegen die Bindungskonstanten der superspiralisierten α-Helix-Wechselwirkung im niedrigen nM (1–10 nM)-Bereich und sind für die bestimmten Paare spezifisch. Die Expression des modifizierten Signalproteins (z. B. das Gag-Protein aus Retroviren) in den entsprechenden Wirtszellen ergibt eine Akkumulation des Gag-Proteins an der Plasmamembran aufgrund der Signale, die in dem T-terminalen Teil des Gag-Proteins vorliegen. Hohe Konzentrationen dieses Proteins an der Plasmamembran sind üblicherweise eine Voraussetzung für den Knospungsvorgang, in dem diese VLPs in das extrazelluläre Milieu freigesetzt werden. Wenn das Zielprotein (z. B. ein Enzym), das den komplementären Tag trägt, in der gleichen Zelle exprimiert wird und in den intrazellulären Kompartimenten konzentriert wird, dann ergibt die spezifische Wechselwirkung mit dem markierten Gag-Protein den gemeinsamen Transport des Ziels zur Plasmamembran und zum anschließenden Einbau in die freigesetzten VLPs. Wenn das Zielprotein zudem ein lösliches cytoplasmatisches Protein (wie ein Enzym oder ein lumineszentes Peptid oder Polypeptid, das zur Zelle heterolog ist) ist, dann kann es durch eine Standardmethode der Molekularbiologie mit dem C-Terminus des Gag-Proteins kovalent verschmolzen werden. Die Expression dieses Fusionsproteins ergibt die Synthese eines Proteinprodukts, das dann zur Plasmamembran der Wirtszellen transportiert, dort konzentriert und anschließend in den VLPs über einen Knospungsvorgang verpackt und dann in das extrazelluläre Milieu freigesetzt wird. Wenn das Zielprotein ein integrales Membranprotein ist (wie ein Rezeptor, ein Innenkanal, ein Adhäsionsmolekül oder ein Membran-Poren-Komplex), dann ergibt die spezifische Wechselwirkung über die superspiralisierten α-Helix-Tags nach der Co-Lokalisierung und Konzentrierung an der Plasmamembran die anschließende Freisetzung des chimären VLP, das primär das markierte Gag-Protein und das interessierende Zielprotein enthält. In allen Fällen bilden die sich ergebenden VLPs, die in das extrazelluläre Milieu freigesetzt werden, Verbundstrukturen, in denen funktionelle Zielproteine/Peptide entweder in der umhüllten membranartigen Vesikel eingekapselt oder integriert sind. Wie oben beschrieben wurde, kann das Peptid oder Polypeptid-Ziel zur Signalstruktur verschmolzen werden. In einer weiteren Ausführungsform ist das Peptid- oder Polypeptid nichtkovalent an die Signalstruktur gebunden, vorzugsweise durch wechselwir kende Tags mit Bindungskonstanten von K_ass > 10⁶ M^–1. Die Wechselwirkung kann vorzugsweise auf einer Komplexbildung, wie einer Peptid/Peptid-Wechselwirkung, vorzugsweise einer superspiralisierten α-Helix, einer Peptid-Ligand-Wechselwirkung oder einer chelatbildenden Wechselwirkung basieren.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung virusartige Partikel bereit, die proteinartige Zielmoleküle umfassen, welche darin eingebaut/eingekapselt sind. Diese sind durch Coexprimieren dieser Zielmoleküle, die eine erste Aminosäuresequenz und eine zweite Aminosäuresequenz umfassen, zusammen mit Signalmolekülen in Zellen erhältlich. Diese Signalmoleküle umfassen eine erste Aminosäuresequenz und eine zweite Aminosäuresequenz, wobei die letztere den Signalmolekülen die Fähigkeit verleiht, sich zu virusartigen Partikeln zusammenzusetzen und vorzugsweise in eine extrazelluläre Umgebung freigesetzt zu werden. Erste Aminosäuresequenzen dieser Signalmoleküle wirken auf nichtkovalente Weise mit ersten Aminosäuresequenzen dieser Zielmoleküle funktionell zusammen, wodurch diese Zielmoleküle in VLPs eingebaut oder durch dieselben eingekapselt werden. Diese VLPs werden vorzugsweise in eine extrazelluläre Umgebung freigesetzt, wo sie leicht nachgewiesen oder abgetrennt werden können. Die Erfindung stellt zudem einen Reagentienkit, der diese VLPs umfasst, und Medikamente, die diese VLPs umfassen, bereit. Es kann bevorzugt sein, dass die VLPs zudem Moleküle umfassen, die in das Kapsid eines nackten oder umhüllten VLP oder in die Hülle eines umhüllten VLP integriert oder daran befestigt sind, wobei die Moleküle die Funktion haben, das Medikament zu seinem Einflussbereich zu führen. VLPs gemäß der vorliegenden Erfindung können z. B. zur Herstellung eines Medikaments oder eines Vorläufers desselben zur Behandlung oder Prävention von genetischen Krankheiten, Tumorkrankheiten, Autoimmun- oder Infektionskrankheiten verwendet werden. Ein virusartiges Partikel zur Verwendung bei der Behandlung einer Infektion mit Mikroorganismen ist in WO 98/28004 offenbart. Sie sind jedoch auch besonders interessant und ein wertvolles Werkzeug zur Durchführung bestimmter Assays, z. B. zur Identifizierung und Charakterisierung von Wechselwirkungen zwischen Zielmolekülen, die in bestimmte Populationen von VLPs eingebaut sind, z. B. zur Identifizierung und Charakterisierung von Wechselwirkungen zwischen Zielmolekülen und weiteren interessierenden Molekülen, insbesondere Molekülen, die an die Oberfläche von Zellen oder Beads gebunden sind, insbesondere Beads mit durch kombinatorische Chemie daran befestigten Molekülen oder Molekülen, die in wässrigem Medium löslich sind, insbesondere Moleküle von intrazellulärer funktioneller Lokalisierung. Sie werden ein unentbehrliches Werkzeug zur Identifizerung von potentiell pharmazeutisch aktiven Substanzen, bei der Identifizierung von Analyten in diagnostischen Anwendungen und in der funktionellen molekularen Genforschung.
Dieser Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt auch eine neue Form eines Wirkstoffabgabesystems an Zellen bereit, woraus die Produktion eines intrazellulär aktiven Proteins resultiert. Das Protein wird in einer Hersteller-Zelllinie mit einer Fusion zu einem Tag hergestellt, der z. B. mit Gag in Wechselwirkung tritt, welches durch die gleiche Zelle coexprimiert wird, woraus die Verpackung und der Ausschluss von der Hersteller-Zelllinie als ein VLP resultiert. Diese Fraktion kann leicht mit dem bioaktiven nativen und richtig verarbeiteten Protein gereinigt werden. Wenn die VLPs zur gleichen Zeit gentechnisch hergestellt werden, so dass sie richtig gelenkt werden, werden sie ihre entsprechenden Zielzellen in einem Organismus erkennen, woraus sich die Aufnahme des entsprechenden VLP zusammen mit dem bioaktiven Protein ergibt. Nötigenfalls könnte das anzuwendende Protein in das VLP in einer Vorläuferform eingebaut werden, die erst nach dem Einführen in die entsprechenden Wirtszellen korrekt verarbeitet werden kann, wo sie ihren vollen aktiven Zustand erhalten kann. Solche VLPs können lokal oder systemisch angewendet werden.
Ein solches erfindungsgemäßes System ist auch als Reportersystem sowohl für die Transkription als auch die funktionelle Translation eines bekannten oder unbekannten Proteins und/oder als ein Reportersystem für die Analyse molekularer Wechselwirkungen in den Zellen anwendbar. Verglichen mit anderen Verfahren des Standes der Technik besteht keine Notwendigkeit für eine innerzelluläre Anhäufung hoher Konzentrationen von Reaktionsteilnehmern, und es liegt ein reduziertes Hintergrundsignal vor, verglichen mit Assays, in die enzymatische Reaktionen involviert sind, um ein nicht-lineares Signal zu erzeugen, das die interessierende primäre molekulare Wechselwirkung verstärkt. Es bietet viele Vorteile gegenüber Zwei-Hybrid-Systemen, die zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen verwendet werden, was die Methodik anbelangt. Eine Anzahl dieser Vorteile schließt die Folgenden ein: das System kann auf eine breite Vielfalt von Proteinklassen angewendet werden, da die Proteine nicht in den Zellkern importiert werden müssen. Der Assay ist homogen und verwendet keine komplizierten Auswahlsysteme, so dass eine geringere Anzahl von falsch positiven Ergebnissen resultiert. Die Toxizität des Systems ist aufgrund des fortlaufenden Ausstoßens der Produkte aus den Wirtszellen reduziert. Das System eignet sich als universelles Reportersystem, das kontinuierlich analysiert werden kann, ohne dass die Herstellung von Zellextrakten aus den interessierenden Zellen notwendig ist. Dies bedeutet, dass die Kinetik leicht verfolgt werden kann und Zellen synchronisiert werden können, falls es erwünscht ist.
Die Technologie ist auch geeignet, um ein beliebiges interessierendes Molekül in einer Zelle neben Proteinen aufzunehmen, vorausgesetzt, dass es eine Befestigungs/Wechselwirkungs-Stelle an dem Gag-Protein oder irgendeinem geeigneten Signalmolekül gibt. Sie kann zum Befestigen kodierender Sequenzen, wie DNA oder RNA, verwendet werden, wenn die transformierende DNA oder die kodierende RNA an einem Tag befestigt werden können, der durch eine Gag-Fusion erkannt werden kann. Eine Dekodierung von Signalketten ist möglich, z. B. durch die Shotgun-Expression einer cDNA-Bibliothek, die in einen Stamm transformiert wird, der ein interessierendes Protein exprimiert, um seine wechselwirkenden Partnerproteine aufzunehmen, wobei das interessierende Protein mit der Signalstruktur in Wechselwirkung tritt oder daran gebunden ist.
Die Bindung zwischen z. B. Gag und interessierendem Protein wird durch direkte Fusion oder nichtkovalente Wechselwirkungen durchgeführt und vermittelt, wie Protein/Protein-, Peptid/Protein- oder Peptid/Peptid-Wechselwirkungen, die innerhalb einer produzierenden Zelle gebildet werden. Beispiele dafür sind superspiralisierte α-Helix-Peptid-Wechselwirkungen, pDZ-Domänen usw. oder irgendeine evolutionär entwickelte Wechselwirkung, z. B. Spiral-Spiral-Wechselwirkung.
Der Einbau von Zielproteinen in VLPs durch nichtkovalente Protein-Protein-Wechselwirkungen hat erhebliche Vorteile gegenüber dem Einbau durch direkte, kovalente Fusion des Zielproteins mit dem Signalmolekül. Der Einbau von Transmembranproteinen in VLPs erfordert eine spezifische Protein-Protein-Wechselwirkung und kann nicht lediglich durch Fusion mit dem Gag-Signalmolekül erreicht werden. Frühere Erfolge auf dem Gebiet der Verwendung von VLPs für pharmazeutische Zwecke konzentrierten sich auf den Einbau von fremden antigenen Molekülen in VLPs, die dann für Immunisierungszwecke verwendet wurden. Bei dieser Methode wurde die fremde Protein/Protein-Sequenz mit dem C-Terminus einer Vielzahl von Gag-Proteinen fusioniert, wobei nachgewiesen wurde, dass eine solche Fusion die Funktin des Gag-Moleküls in Bezug auf die Bildung, Reifung und Freisetzung von VLPs in die extrazelluläre Umgebung nicht stört. Diese Konstruktion ist auf den C-Terminus beschränkt, da die Integrität des N-Terminus für die Funktion des Gag-Proteins erforderlich ist, da sich an der Prozessierung und dem Membrantransport und der Wechselwirkung beteiligte Signale in diesem Bereich befinden. Insbesondere das Glycin auf Position 2 im Protein ist für posttranslationale Modifikationen, die das Protein zur Membran lenken (eine tatsache, die in der Literatur bewiesen wurde), erforderlich, und der Ersatz oder die strukturelle Modifikation in diesem Bereich zerstört die Funktionalität. Eine Fusion am N-Terminus hat also eine nachteilige Wirkung. So könnte man zwar die Fusionierung eines integralen Membranproteins mit dem N-Terminus von Gag ins Auge fassen, und tatsächlich könnte dieses Protein exprimiert und ohne möglichen Funktionsverlust zur Membran transportiert werden, doch wird dadurch die Funktion von Gag als Signalmolekül, das für die reifung und Freisetzung von VLPs verantwortlich ist, verringert. Die Fusion des integralen Membranproteins mit dem C-Terminus würde jedoch zu einem Fusionsprotein führen, bei dem Gag funktionell bleibt, bei dem jedoch die falsche Topologie des Membranproteins beeinträchtigt ist, was dazu führt, dass es nicht korrekt in das resultierende VLP eingebaut wird. Die einzige Alternative besteht also darin, solche Moleküle in VLPs einzubauen, wodurch die Funktionalität der beiden jeweiligen Proteine (Gag und das integrale Membranprotein) gewährleistet wird, indem man die beiden individuellen Proteine unabhängig voneinander synthetisiert und sie an der Zellmembran über eine spezifische Protein-Protein-Wechselwirkung komplexiert, die durch den gentechnischen Einbau der spezifischen Tags in die jeweiligen Moleküle gewährleistet ist.
VLPs, die auf einer nichtkovalenten Wechselwirkung zwischen Signalmolekülen und Zielmolekülen gemäß der vorliegenden Erfindung basieren, sowie VLPs des Standes der Technik unter Verwendung einer Fusion zwischen Signalmolekülen und Zielmolekülen können in den folgenden Assay-Formaten verwendet werden. Diese VLPs können entweder nackt oder umhüllt sein, und zwar in Abhängigkeit vom Freisetzungsmodus aus der Zelle (Exocytose, Lyse oder Knospung durch eine geeignete Zellmembran). Das interessierende Zielmolekül kann in das Proteinkapsid oder in die Hülle eingebaut werden. Es kann auch innerhalb des Lumens des VLP verkapselt sein.
Zusammengefasst schließen Beispiele für den Einbau/die Einkapselung von Zielmolekülen die Folgenden ein, obwohl dies keinesfalls eine vollständige Liste darstellt:

– Einschluss von Zielmolekülen innerhalb der Abgrenzungen der Kapsidstruktur eines nackten oder umhüllten virusartigen Partikels,
– Integration von Zielmolekülen in die Kapsidstruktur eines nackten oder umhüllten virusartigen Partikels oder eine Befestigung daran oder eine physikalische Assoziation damit,
– Integration von Zielmolekülen in die Membran von umhüllten virusartigen Partikeln oder eine Befestigung daran oder eine physikalische Assoziation damit.

Beispiele für Zellen, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden sollen, umfassen insbesondere Humanzellen, andere Säugerzellen oder andere eukaryontische Zellen, wie Insektenzellen.
Im Allgemeinen wird es bevorzugt, dass alle folgenden Assay-Formate auf eine homogene Weise durchgeführt werden, d. h. in einem Misch-und-Mess-Modus ohne Verwendung irgendwelcher Trennungsschritte, z. B. zum Unterscheiden von gebundenem/nichtgebundenem Liganden in einem Screening-Verfahren für die Wechselwirkung mit einem vorher definierten Zielmolekül. Wegen neuer Synthese-Technologien, wie kombinatorischer Chemie und automatisierter Synthese, hat die Anzahl an neuen Molekülen, die für das Screening verfügbar sind, in den letzten Jahren explosionsartig zugenommen. Weiterhin begann eine wachsende Anzahl neuer Ziele aus den genomischen Bemühungen hervorzugehen. Daher werden die folgenden Assays oft in einem Modus mit hohem Durchsatz verwendet.
In den letzten Jahren wurden verschiedene Fluoreszenz-Verfahren entwickelt, um sich mit einem breiten Bereich von biologischen Assays zu befassen. Es wird bevorzugt, diese Techniken mit den folgenden Assay-Formaten zu verwenden. Obwohl dies keineswegs eine erschöpfende Liste darstellt, wird empfohlen, Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie, Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsspektroskopie, Fluoreszenzintensitäts-Verteilungsanalyse, Fluoreszenz-Lebensdauer-Messungen, Fluoreszenzresonanzenergieübertragung oder Kombinationen derselben zu verwenden. Insbesondere können konfokale Mikroskopie- und Spektroskopie-Techniken wegen ihrer hohen Empfindlichkeit und ihres geringen Hintergrundes verwendet werden. In einigen Fällen kann es jedoch auch zweckmäßig sein, sich auf klassische mikroskopische Aufbauten zu stützen oder Lichtstreuungstechniken zu verwenden. Um VLPs nachzuweisen oder ihre Eigenschaften zu analysieren, kann man sich z. B. auch auf Impedanz- oder Dielektrophorese-Messungen stützen. Alle in der vorliegenden Patentanmeldung offenbarten Assay-Systeme können auch von nicht-fluoreszierenden, nicht-optischen Ablese-Technologien Gebrauch machen, wie radiometrische Ablesun gen. Es kann z. B. besonders bevorzugt sein, Szintillationsproximitätsassays oder Filtertechniken zu verwenden.
Beispiele für Assay-Formate, die gemäß der Erfindung untersucht werden können, schließen die Folgenden ein:

– Assays für die Aufklärung von Ligand/Rezeptor-Wechselwirkungen,
– Assays für die Aufklärung von Rezeptor/Rezeptor-Wechselwirkungen
– Assays für die Aufklärung von intrazellulären Wechselwirkungen in situ, einschließlich Protein-Protein-, Polypeptid-Polypeptid-, Protein-DNA-, Protein-RNA- und niedermolekularer-Ligand-Protein-Wechselwirkung,
– Assays, die Wechselwirkungen zwischen bekannten/bekannten, unbekannten/bekannten, unbekannten/unbekannten Partnern umfassen, Assays zur Aufklärung von
– Zell/Zell-Wechselwirkungen (einschließlich Zelladhäsionsmolekülen)
– auf Transkriptionsaktivierung basierende Assays, einschließlich auf Hormon, cAMP, Serum und Wachstumsfaktor reagierende DNA-Elemente, z. B. CRE, ERE usw.
– Assays von innerzellulären Zielen
– enzymatische Systeme/enzymatische Nachweissysteme, die im VLP befestigt sind, um Mediatoren einer solchen Enzymaktivität zu untersuchen, mit der Maßgabe, dass der Mediator die Membran passieren kann,
– innerzelluläre Wechselwirkungen, um neue wechselwirkende Proteine aufzunehmen und demgemäß das gleiche System als ein Assay-System zur Verstärkung oder Reduktion der Wechselwirkungsstärke zu verwenden.

Es wird auch bevorzugt, VLPs, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, in einem Assay zu verwenden, der in PCT/EP00/01787 beschrieben ist.
Die hierin offenbarten VLPs und Assays können optimal in Kombination mit optischen Nachweissytemen verwendet werden – ohne aber darauf beschränkt zu sein –, die auf dem konfokalem Fluorenzenz-Nachweis basieren, der einzelne Moleküle oder Komplexe oder Partikel wie VLPs verfolgen und messen kann, und zwar basierend auf Translationsdiffusion, Fluoreszenz-Anisotropie/Polarisierung, molekularer Fluoreszenzhelligkeit, Fluoreszenzkreuzkorrelation/Koinzidenz, Fluoreszenz-Lebensdauer. Solche Verfahren werden in EP 0 679 251 , der europäischen Patentanmeldung EP 97 945 816.3 , PCT/EP 98/03509 , PCT/EP 98/06165 , der europäischen Patentanmeldung 97 951 990.7 , dem deutschen Patent 197 02 914 und der europäischen Patentanmeldung 99 112 104.7 beschrieben.
Die hierin offenbarten VLPs können auch mit Handhabungs- und Sortierungstechnologien verwendet werden, wie sie in den europäischen Patentanmeldungen 96 939 933.6 , 97 953 804.8 , 97 952 938.5 , PCT/EP 97/07218 , PCT/EP 98/08370 , PCT/EP 99/02380 , PCT/EP 99/04469 und PCT/EP 99/04470 beschrieben werden.
Im Folgenden werden unterschiedliche Assay-Formate beschrieben, in denen die oben offenbarten VLP-Typen – einschließlich solcher, die gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, sowie solcher, die im Stand der Technik offenbart werden – und Nachweisverfahren geeignet sind.
Reporter-Assays auf Zellbasis
In diesem Assayprinzip tritt ein spezifisches Effektor-Molekül (z. B. ein Hormon oder ein Wachstumsfaktor oder ein niedermolekulares Molekül) in Wechselwirkung mit einem spezifischen Molekül auf der Oberfläche einer Zelle (z. B. ein Plasmamembran-Rezeptor oder ein Innenkanal oder ein Porenkomplex) oder ist befähigt, die Plasmamembran entweder aktiv oder passiv zu durchqueren, wo es dann befähigt ist, mit seinem spezifischen intrazellulären Bindungspartner (ein cytoplasmatischer oder Zellkern-Rezeptor oder ein anderer wechselwirkender Partner) in Wechselwirkung zu treten. Diese Wechselwirkung stimuliert eine Kaskade von spezifischen Signalvorgängen in der Zelle, was die Transkriptions aktivierung einer Anzahl von Genen in der Zelle ergibt, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie unter der Kontrolle spezifischer Transkriptionsfaktoren steht, welche mit spezifischen DNA-Sequenzen in Wechselwirkung treten, die in dem Promotor-Bereich der entsprechenden reagierenden Gene gefunden werden. In einer gentechnisch hergestellten Zelle – in der die reagierenden DNA-Promotor-Sequenzen so platziert sind, dass sie die Transkription eines spezifischen Reportergens kontrollieren, das zur Wirtszelle heterolog ist – wird nach der Stimulierung des spezifischen Zielgens die Transkription des Reportergens hoch- und herunterreguliert und kann quantifiziert werden. Die Quantifizierung dieses Reportergens ergibt dann eine direkte Messung des Aktivierungszustandes des gerade untersuchten Moleküls. Um in einem Assay-Format die Aktivierung des integralen Membranproteins, das auf der Oberfläche der Zelle gefunden wird, zu analysieren, werden Verbindungen zur Kultur gegeben, die entweder die Aktivierung dieses Moleküls entweder anregen oder hemmen, was eine Erhöhung oder Reduktion der Gehalte des Reportermoleküls ergibt, das in der Zelle synthetisiert wird (verglichen mit den Kontrollzellen), wobei die Quantifizierung desselben in direkter Beziehung zum Einfluss der Verbindungen auf das zu untersuchende Molekül steht. Gemäß der Erfindung können VLPs in diesem Assay-System angewendet werden. Es wird bevorzugt, als Signalmoleküle Fusionen zwischen Proteinen, die zum Zusammensetzen zu VLPs befähigt sind, und ein spezifisches Molekül zu verwenden, das den VLPs eine spezifische Eigenschaft verleiht, wodurch ihr Nachweis und ihre Quantifizierung ermöglicht wird. Diese VLPs werden vorzugsweise aus der Zelle in ein extrazelluläres Medium freigesetzt. Somit ergibt die Modulation des gerade untersuchten Moleküls durch Zugabe von entweder Agonisten, Antagonisten oder Verbindungen zu dem Kulturmedium solcher gentechnisch hergestellten Zellen eine Modulation der Mengen an freigesetzten VLPs, die gemäß dem nachweisbaren Rest, der in solchen VLPS vorliegt, quantifiziert werden können. Die Vorteile, die durch die Verwendung von VLPs als Nachweissystem für die Analyse von Reporter-Assays auf Zellbasis entstehen, schließen die Folgenden ein: die Probenahme und Analyse der Assay-Ablesung ist nicht-invasiv, d. h. die Zellen selbst werden nicht zerstört, um Datenpunkte zu bilden, wobei nur Proben vom Zellkulturmedium entfernt werden, in denen die VLPs sich mit der Zeit ansam mein, was somit bedeutet, dass kinetische Messungen möglich sind. Die physikalisch-chemische Beständigkeit der VLPs in dem extrazellulären Medium bedeutet auch, dass die VLPs nicht sofort quantifiziert werden müssen. Wenn intrinsische Eigenschaften (Lumineszenz des verschmolzenen nachweisbaren Rests) der freigesetzten VLPs für die Quantifizierung verwendet werden, dann stört das Vorliegen hoher Konzentrationen an Testverbindungen oder von Metaboliten derselben nicht den Nachweis solcher Partikel. Die Quantifizierung des freigesetzten Partikels kann in einem homogenen Format unter Verwendung intrinsischer Eigenschaften der VLPs durchgeführt werden.
Reporter-Assays auf Zellbasis in Bezug auf funktionelle molekulare Genforschung
Der beschriebene Assay definiert Prinzipien, wodurch spezifische DNA-Moleküle (unter der Transkriptionskontrolle entweder eines starken konstitutiven oder induzierbaren Promotors), die für Genprodukte entweder bekannter oder unbekannter Funktion kodieren, in rekombinante Zellen eingeführt werden, die eine bestimmte Funktion durchführen, wodurch die Assay-Ablesung einen direkten Hinweis darauf gibt, ob diese Genprodukte zur Modulation dieser spezifischen Funktion befähigt sind. Ein spezifisches Beispiel für ein solches Assay-Format wäre die Analyse des Effekts des Einführens einer spezifischen DNA-Sequenz, die, wenn sie translatiert ist, ein Proteinprodukt ergibt, das die stromabwärts gelegene Signalaktivität eines aktivierten integralen Membranproteins modulieren kann. In diesem Assay-Prinzip tritt ein spezifisches Effektor-Molekül (z. B. Hormon oder Wachstumsfaktor oder kleines Molekül) mit einem spezifischen Molekül auf der Oberfläche einer Zelle (z. B. ein Plasmamembran-Rezeptor, ein Innenkanal oder Porenkomplex) in Wechselwirkung oder ist befähigt, die Plasmamembran entweder aktiv oder passiv zu durchqueren, wo es dann mit seinem spezifischen intrazellulären Bindungspartner (ein cytoplasmatischer oder Zellkern-Rezeptor oder wechselwirkender Partner) in Wechselwirkung treten kann. Diese Wechselwirkung stimuliert eine Kaskade von spezifischen Signalvorgängen in der Zelle, was eine Transkriptionsaktivierung einer Anzahl von Genen in der Zelle ergibt, dadurch gekennzeichnet, dass sie unter der Kontrolle spezifischer Transkriptionsfaktoren stehen, die mit spezifischen genomischen DNA-Sequenzen in Wechselwirkung treten, die im Promotorbereich der entsprechenden reagierenden Gene gefunden werden. In einer gentechnisch hergestellten Zelle, in der die reagierenden DNA-Promotorsequenzen so angeordnet sind, dass sie die Transkription eines spezifischen zur Wirtszelle heterologen Reportergens steuern, das dann nach der Stimulation des spezifischen Zielgens verwendet wird, wird die Transkription des Reportergens hoch- und herunterreguliert und kann quantifiziert werden. Die Quantifizierung dieses Reportergens ergibt dann eine direkte Messung des Aktivierungsstatus des zu untersuchten Moleküls.
Um in einem Assay-Format Peptid- oder Polypeptid-Moleküle nachzuweisen, die die stromabwärts gelegene Signalgebungsfähigkeit des auf der Oberfläche der Zelle gefundenen integralen Membranproteins modulieren können, werden dann DNA-Moleküle (unter der Transkriptionskontrolle entweder eines starken konstitutiven oder induzierbaren Promotors), die für Peptide oder Polypeptide bekannter oder unbekannter Funktion kodieren, in die Zellen eingeführt. Diese werden zusammen mit der transkriptions-regulierten Reportermolekül-Fusion (vorzugsweise Gag-lumineszentes Protein) exprimiert. Zellklone werden dann für die Aufnahme und stabile Integration des neu eingeführten DNA-Konstrukts durch positive Auswahlverfahren ausgewählt. Diese Zellklone werden dann einzeln oder in Pools auf die Freisetzung nachweisbarer und quantifizierbarer VLPs analysiert, die in das Zellkulturmedium nach der Zugabe von Effektor-Molekülen abgegeben werden, die befähigt sind, das untersuchte Molekül positiv anzuregen. Die Freisetzung von nachweisbaren quantifizierbaren VLPs aus Kontrollzellen, die das untersuchte Molekül exprimieren und den transkriptions-regulierten Reporter (vorzugsweise Gag-lumineszentes Peptid oder Polypeptid) enthalten, aber keine exogen zugegebene DNA enthalten, wird mit den VLPs verglichen, die aus Zellklon/Pools, die exogene DNA enthalten, freigesetzt werden. Wenn ein Unterschied nachgewiesen wird, dann kann dieser Effekt auf die Funktion des Proteins zurückgeführt werden, das durch das exogen angewendete DNA-Konstrukt kodiert wird. Dieser Effekt kann durch eine Anzahl – obwohl nicht vollständig – von Möglichkeiten erklärt werden:

– das Peptid oder Polypeptid kann mit einem oder mehreren Molekülen direkt in Wechselwirkung treten (eine direkte Protein-Protein-Wechselwirkung), die an der Signal-Transduktionskaskade beteiligt sind, die zum Überführen des auf den Rezeptor wirkenden Stimulus zum Transkriptions-regulierten Reportermolekül verwendet wird, und seine nachfolgende Freisetzung aus der Zelle, die in ein VLP eingebaut ist.
– das Peptid oder Polypeptid kann die Funktion der Moleküle beeinflussen, die an der Signal-Transduktionskaskade beteiligt sind, indem ein oder mehrere Moleküle chemisch modifiziert werden (z. B. Phosphorylierung, Myristolierung, Acetylierung usw.)

Eine Anzahl anderer Erklärungen ist möglich, die keine Auswirkung auf den Signal-Transduktionsweg haben, die aber die Translation der Reportergen-RNA oder die Reifung und Freisetzung der VLPs stören, die in einem primären Screening nachgewiesen werden, die aber in einer zweiten Analyse durch Einschließen der geeigneten Kontrollen ausgeschlossen werden können.
Ein weiteres Assay-Format wäre die Verwendung des oben beschriebenen Systems mit dem Unterschied, dass keine Effektor-Moleküle zum extrazellulären Medium gegeben werden, um das entsprechende Molekül zu aktivieren. Somit würde man exogene DNA-Moleküle prüfen, die für Proteine kodieren, die den Signal-Transduktionskaskadenweg in Abwesenheit eines Agonisten stimulieren können.
Zellbasierter Assay zum Nachweis von Verbindungen, die die virale Reifung und Freisetzung beeinflussen
Virale Pathogene stellen ein Herausforderung für die pharmazeutische Industrie dar, um Wirkstoffe zu entwickeln, die in den Lebenszyklus dieser obligaten Pathogene eingreifen, da solche Wirkstoffe in den meisten Fällen eine hohe Spezifität gegenüber dem Virus ohne schädliche Auswirkungen auf die Wirtszelle aufweisen müssen. Die Stufen, in denen man eingreifen kann, sind größtenteils auf den Replikationszyklus und die Ausbreitung des Virus im Organismus beschränkt. Somit sind die Vorgänge der viralen Reifung und Freisetzung Vorgänge, die man zur Entwicklung von kleinen Molekül-Inhibitoren in Betracht ziehen könnte. Die Assay-Formate des Standes der Technik, die zur Analyse dieser Verfahren verwendet wurden, sind relativ zeitraubend und umfassen üblicherweise entweder Pathogene selbst oder abgeschwächte Varianten derselben zur Quantifizierung der Freisetzung von Virionen. Die VLP-Methodologie stellt eine alternative Methodik bereit, um diese Verfahren in einem Format zu analysieren, das für uHTS zugänglich ist. Diese Expression einer Vielfalt unterschiedlicher viraler Kapsidproteine, Vorläufermoleküle oder Varianten derselben in Abwesenheit anderer viral kodierter Proteine ergibt eine Anzahl von Fällen bei der Reifung von Viruskapsidstrukturen und der nachfolgende Freisetzung von unreifen Proteinpartikeln oder VLPs aus der Wirtszelle in das extrazelluläre Medium. Verfahren, die zum Ausstoßen der VLPs in die Außenumgebung führen, umfassen die Knospung aus der Plasmamembran, die Knospung aus cytoplasmatischen oder Zellkernmembran-Kompartimenten und die anschließende Freisetzung aus der Zelle durch Exocytose oder Lyse der Wirtszelle. In einer Anwendung unter Verwendung solcher Kapsidproteine, vorzugsweise dem Gag-Protein von Retroviren, dann der Expression des Gag-Vorläuferproteins in Zellen, ergibt sich die Bildung und Freisetzung von VLPs in das extrazelluläre Milieu. Zudem ergibt die Expression eines Vorläufer-Gag-Reporter-Fusionsmoleküls in Zeilen die anschließende Freisetzung nachweisbarer lumineszenter VLPs, die vorzugsweise unter Verwendung konfokaler Nachweistechniken quantifiziert werden können. Dieses Assay-Format kann somit auf das Screening von Verbindungen angewendet werden, die in die Reifung und Freisetzung von VLPs in das extrazelluläre Medium eingreifen. Verbindungen werden zu Zellen gegeben, die konstitutiv z. B. das Gag-Reporter-Produkt exprimieren, und die Freisetzung von nachweisbaren quantifizierbaren VLPs wird verglichen, um Zellen zu kontrollieren, die nicht mit der Verbindung behandelt wurden, so dass eine Beurteilung der Hemmung der Virusreifung und -freisetzung durchgeführt werden kann.
Assays zum Identifizieren von Modulatoren der von Zelloberflächenprotein vermittelten Aktivität
In noch einem anderen Aspekt offenbart die Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die die von Zelloberflächenprotein vermittelte Aktivität modulieren, durch Nachweisen der intrazellulären Transduktion eines Signals, das durch die Wechselwirkung der Verbindung mit dem Zelloberflächenprotein erzeugt wird. Diese Methode umfasst das Vergleichen der Menge des Reporter-Gen-Produkts, die in einer ersten rekombinanten Zelle in Gegenwart der Verbindung exprimiert wird, mit der Menge des Reporter-Gen-Produkts in Abwesenheit der Verbindung oder mit der Menge des Reporter-Gen-Produkts in einer zweiten rekombinanten Zelle. Im Prinzip enthält die erste rekombinante Zelle ein Reporter-Gen-Konstrukt und exprimiert das interessierende Zelloberflächenprotein. Die zweite rekombinante Zelle ist mit der ersten rekombinanten Zelle identisch, außer dass sie das Zelloberflächenprotein nicht exprimiert oder das Zelloberflächenprotein auf einem vordefinierten Niveau exprimiert. Das Reporter-Gen-Konstrukt enthält ein Transcriptionskontrollelement, das auf das intrazelluläre Signal anspricht, das durch die Wechselwirkung eines Agonisten mit dem Zelloberflächenprotein erzeugt wird, sowie ein Reporter-Gen, das ein Translationssignalmolekül codiert und in funktioneller Assoziation mit dem Transcriptionskontrollelement vorliegt. Die Translationssignalmoleküle können sich zu virusartigen Partikeln zusammenfügen, die vorzugsweise in eine extrazelluläre Umgebung freigesetzt werden.
Vorzugsweise umfasst das Verfahren weiterhin das Auswählen von Verbindungen, die die Menge des Reporter-Gen-Produkts, die in der ersten rekombinanten Zelle in Gegenwart der Verbindung exprimiert wird, im Vergleich zur Menge des Reporter-Gen-Produkts in Abwesenheit der Verbindung oder im Vergleich zur Menge des Reporter-Gen-Produkts in der zweiten rekombinanten Zelle beeinflussen. In einer Ausführungsform ist die Verbindung ein Agonist des Zelloberflächenproteins, oder in einer anderen Ausführungsform ist die Verbindung ein Antagonist des Zelloberflächenproteins. In letzterem Fall umfasst das Verfahren das vorherige oder gleichzeitige Vergleichen der Differenz der Menge eines Reporter-Gen-Produkts nach dem In-Kontakt-Bringen der rekombinanten Zelle mit einem Agonisten, der das Zelloberflächenprotein aktiviert, wodurch das Translationssignalmolekül exprimiert wird.
Das Zelloberflächenprotein kann zum Beispiel ein Zelloberflächenrezeptor, ein Adhäsionsmolekül, eine Membranpore oder ein Innenkanal sein. Vorzugsweise umfasst das nachweisbare Translationssignalmolekül weiterhin ein lumineszierendes Polypeptid, insbesondere grünes fluoreszierendes Protein oder Mutanten davon, oder umfasst weiterhin eine Entität, die als Tag für die anschließende Markierung mit einem nachweisbaren Reagens wirkt, oder umfasst weiterhin ein Enzym, das durch eine enzymatische Reaktion einen geeigneten Ausleseparameter erzeugt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Transcriptionskontrollbereich wenigstens ein regulatorisches Element, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus serumresponsiven Elementen, gegenüber cyclischem Adenosinmonophosphat responsiven Elementen und Elementen, die gegenüber intrazellulären Calciumionenkonzentrationen responsiv sind, besteht.
In Bezug auf diesen Assayformat stellt die Erfindung auch rekombinante Zellen bereit, die Folgendes umfassen: (i) DNA, die ein Zelloberflächenprotein codiert, dessen Aktivität durch extrazelluläre Signale modulierbar ist; und (ii) ein Reporter-Gen-Konstrukt, das ein Reporter-Gen in funktioneller Verknüpfung mit einem oder mehreren Transcriptionskontrollelementen enthält, das durch das Zelloberflächenprotein reguliert wird. Das Reporter-Gen codiert ein Translationssignalmolekül. Diese Signalmoleküle können sich zu virusartigen Partikeln zusammenfügen, die vorzugsweise in ein extrazelluläres Medium freigesetzt werden. Geeignete Transcriptionskontrollelemente, nachweisbare Struktureinheiten innerhalb der Signalmoleküle und Typen von Zelloberflächenproteinen sind in den Abschnitten vor diesem Kapitel offenbart. Die Erfindung stellt auch Reagenskits bereit, die diese rekombinanten Zellen umfassen.
Modulatoren der Rezeptor- oder Ionenkanal-vermittelten Aktivität
In noch einem weiteren Aspekt gibt die Erfindung einen Ansatz mit besonderem bezug zu funktioneller Genomik an.
Ein Verfahren zum Identifizieren von Substanzen, die die Rezeptor- oder Membranporen- oder Ionenkanal-vermittelte Aktivität modulieren, durch Nachweisen der intrazellulären Transduktion eines Signals, das durch die Wechselwirkung eines Agonisten oder einer Substanz mit dem Rezeptor oder Ionenkanal erzeugt wird, wird angegeben, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:

– Vergleichen der Menge des Reporter-Gen-Produkts, die in einer ersten rekombinanten Zelle in Gegenwart der Substanz exprimiert wird, mit der Menge des Produkts in Abwesenheit der Substanz; wobei
– die erste rekombinante Zelle ein Reporter-Gen-Konstrukt enthält und den Rezeptor oder Ionenkanal exprimiert; und das Reporter-Gen-Konstrukt Folgendes enthält:
(a) ein Transcriptionskontrollelement, das auf das intrazelluläre Signal anspricht, das durch die Wechselwirkung eines Agonisten mit dem Rezeptor oder Ionenkanal erzeugt wird;
(b) ein Reporter-Gen, das ein Translationssignalmolekül codiert und in funktioneller Assoziation mit dem Transcriptionskontrollelement vorliegt; wobei die Translationssignalmoleküle sich zu VLPs zusammenfügen können, die vorzugsweise in eine extrazelluläre Umgebung freigesetzt werden.

Die Menge des Reporter-Gen-Produkts, die in der rekombinanten Zelle in Gegenwart des Agonisten oder der Substanz exprimiert wird, könnte mit der Menge des Reporter-Gen-Produkts in Abwesenheit des Agonisten oder einer anderen Substanz verglichen werden. Bevorzugte Substanzen, die unter Anwendung dieses Assayformats durchmustert werden sollen, umfassen cDNAs, Fragmente genomischer DNA, mRNAs, Vektoren, Peptide und Proteine. Besonders bevorzugt ist die Substanz eine cDNA oder eine cDNA-Expressionsbibliothek. Anstatt die Zellen mit einer cDNA zu transfizieren, ist es auch möglich, die Zelle mit anderen Typen von Nucleinsäuren, wie Fragmenten genomischer DNA oder mRNAs, zu transformieren oder Peptide oder Proteine in die Zelle einzuführen.
Diese Assayvorschrift erlaubt die Identifizierung von Genprodukten, die Signalkaskaden innerhalb einer Zelle stören. Eine transformierte Zelllinie exprimiert ein Reporterkonstrukt unter der Kontrolle eines spezifischen Promotors. Wenn die mit diesem Reporter verbundene Signalkaskade stimuliert wird, kann die Freisetzung von VLPs überwacht und quantifiziert werden. Die Transfektion solcher Zellen mit entweder einem einzelnen oder einer Menge von cDNA-Molekülen, die ein Proteinprodukt exprimieren können, führt zur Beeinflussung der Freisetzung von VLPs in einer stimulierten Zelle, wenn dieses zusätzliche Proteinprodukt den Signalübertragungsweg modulieren kann. Es sind auch andere Ausleseszenarien möglich:

1. Wechselwirkung des eingeführten cDNA-Produkts mit einem Element, das an der von einem Agonisten stimulierten Signalübertragungskaskade beteiligt ist, führt zur Aufhebung der Produktion und Freisetzung von nachweisbaren VLPs.
2. Wechselwirkung des eingeführten cDNA-Produkts mit einem Element, das an der von einem Agonisten stimulierten Signalkaskade beteiligt ist, führt zur Verstärkung der Produktion und Freisetzung von nachweisbaren VLPs.
3. Wechselwirkung des eingeführten cDNA-Produkts mit einem Element, das in Abwesenheit eines Agonisten an der Signalkaskade beteiligt ist, führt zur Stimulation der Produktion und Freisetzung von VLPs.

Wenn die eingeführten cDNA-Moleküle weiterhin aus verschiedenen Quellen oder aus material, das unterschiedlich behandelt wurde (z. B. cDNAs aus stimulierten und nichtstimulierten Zellen), stammen, können auch Unterschiede in Bezug auf die Freisetzung von VLPs nachgewiesen werden. Eine transformierte Zelllinie exprimiert ein Reporterkonstrukt unter der Kontrolle eines spezifischen Promotors. Wenn die mit diesem Reporter verbundene Signalkaskade stimuliert wird, kann die Freisetzung von VLPs überwacht und quantifiziert werden. Die Transfektion solcher Zellen mit entweder einer einzigen oder einer Menge von cDNA-Molekülen, die ein Proteinprodukt exprimieren können, führt zur Beeinflussung der Freisetzung von VLPs in einer stimulierten Zelle, wenn dieses zusätzliche Proteinprodukt den Signalübertragungsweg modulieren kann. Eine Zelllinie, die die obigen Konstrukte trägt, wird mit einzelnen oder einer Menge von cDNAs aus einem spezifischen Gewebe oder einer stimulierten Probe transfiziert. Eine Zelllinie, die die obigen Konstrukte trägt, wird mit einzelnen oder einer Menge von cDNAs aus einem anderen spezifischen Gewebe oder einer zu vergleichenden stimulierten Probe transfiziert. Der Einfluss des eingeführten cDNA-Produkts auf die Freisetzung der nachweisbaren VLPs unter verschiedenen Bedingungen (stimuliert, nichtstimuliert, induziert, konstitutiv usw.) wird zwischen den beiden Zellpopulationen verglichen. Eine weitere Anwendung bezieht sich auf die Durchmusterung von subtraktiven Bibliotheken, die durch die oben skizzierten Experimente erzeugt werden.
In einem weiteren Aspekt wird eine rekombinante Zelle bereitgestellt, die Folgendes umfasst:

– DNA, die einen Rezeptor, eine Membranpore oder einen Ionenkanal codiert; und
– ein Reporter-Gen-Konstrukt, das ein Reporter-Gen in funktioneller Verknüpfung mit einem oder mehreren Transcriptionskontrollelementen enthält, welches auf ein intrazelluläres Signal anspricht, das durch eine Wechselwirkung eines Agonisten mit dem Rezeptor oder der Membranpore oder dem Ionenkanal erzeugt wird, wobei:
– das Reporter-Gen ein Translationssignalmolekül codiert; und
– die Translationssignalmoleküle sich zu virusartigen Partikeln zusammenfügen können, die vorzugsweise in eine extrazelluläre Umgebung freigesetzt werden.

In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung auch Reagenskits bereit, die diese rekombinanten Zellen umfassen. Zu den geeigneten Transcriptionskontrollelementen gehören serumresponsive Elemente, gegenüber cyclischem Adenosinmonophosphat responsive Elemente und Elemente, die gegenüber intrazellulären Calciumionenkonzentrationen responsiv sind. Die Translationssignalmoleküle umfassen vorzugsweise lumineszierende Polypeptide, wie GFP, oder Enzyme oder Entitäten, die als Tags für die anschließende Markierung mit nachweisbaren Reagentien wirken.
Bindungs-, kompetitive und enzymatische Assays. Assays zur Bestimmung der Fähigkeit von Verbindungen, in ein VLP einzutreten
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung von VLPs in einem vorzugsweise homogenen Assay zum Screening mehrerer Verbindungen bereit, um den Hemmungsgrad oder die Stimulierung einer Ligand/Bindungsdomänen-Wechselwirkung oder einer Enzym-katalysierten Reaktion durch diese Verbindungen zu bestimmen oder um den Bindungsgrad der Verbindungen an ein Zielmolekül zu bestimmen. Es ist auch möglich, die Fähigkeit dieser Verbindungen zum Eintreten in ein VLP zu bestimmen. Der Assay umfasst einen Schritt, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus dem In-Kontakt-Bringen dieser zu testenden Verbindungen mit dem Liganden und der Bindungsdömäne, dem In-Kontakt-Bringen dieser zu testenden Verbindungen mit diesem Enzym und dem Substrat für dieses Enzym, dem In-Kontakt-Bringen dieser zu testenden Verbindungen mit dem Zielmolekül und dem In-Kontakt-Bringen dieser zu testenden Verbindungen mit einem virusartigen Partikel besteht. Die Bindungsdomäne oder das Enzym oder das Zielmolekül wird gemäß irgendeiner der oben beschriebenen Methodologien in virusartige Partikel eingebaut oder eingekapselt. Die Hem mung, Stimulierung, Bindung durch eine oder mehrerer dieser Verbindungen oder das Eintreten derselben verursacht eine Änderung der Menge einer optisch nachweisbaren Markierung, die an virusartige Partikel gebunden ist oder von denselben eingekapselt ist, die in diesem Assay vorliegen, und/oder verursacht eine Änderung einer weiteren Eigenschaft der virusartigen Partikel. Die Mengen eines optisch nachweisbaren Signals, das an einzelne VLPs gebunden ist oder durch dieselben eingekapselt ist, werden unter Verwendung optischer Methoden gemessen. Alternativ oder zusätzlich dazu werden die weiteren Eigenschaften von VLPs gemessen (z. B. in einem elektrischen Feld). Der Hemmnungsgrad, die Stimulierung, die Bindung oder das Eintreten können durch Vergleich dieser Mengen des optisch nachweisbaren Signals, das an einzelne virusartige Partikel gebunden ist oder durch dieselben eingekapselt ist, mit der Menge an Hintergrundsignal in diesem Assay bestimmt werden, das durch die Markierung verursacht wird, die nicht an virusartige Partikel gebunden ist oder von denselben eingekapselt ist. Zusätzlich oder alternativ dazu wird ein Schritt des Vergleichs dieser weiteren Eigenschaft dieses zu untersuchenden virusartigen Partikels mit der Eigenschaft eines virusartigen Referenzpartikels durchgeführt. Die optische Methodik umfasst vorzugsweise Methoden der konfokalen Mikroskopie oder Spektroskopie. Diese optisch nachweisbare Markierung ist vorzugsweise ein fluoreszierender Ligand oder ein fluoreszierendes Substrat oder ein fluoreszierendes Produkt einer enzymatischen Reaktion, und diese optische Methodologie umfasst Fluoreszenztechniken, insbesondere Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie, Fluoreszenzkreuzkorrelationsspektroskopie, Fluoreszenzintensitätsverteilungsanalyse, Fluoreszenz-Lebensdauermessungen, Fluoreszenzanisotropie-Messungen, Fluoreszenzresonanzenergieübertragung oder Kombinationen derselben. Weitere Eigenschaften des VLP können z. B. durch elektrische Methodologien bestimmt werden, die Impedanz- oder dielektrophoretischen Messungen umfassen. Bindungsdomäne oder Enzyme oder Zielmoleküle können in die virusartigen Partikel durch Fusion zu Bestandteilen dieses VLP, insbesondere durch Fusion zu Kapsid- oder Hüllen-Bestandteilen, eingebaut oder durch dieselben verkapselt werden, wie oben in dem entsprechenden Kapitel ausführlich erklärt wurde. Sie können jedoch auch durch nichtkovalente physikalische Kräfte zwischen Bestandteilen dieser VLPs und der Bindungsdomäne, dem Enzym oder Zielmolekül eingebaut/eingekapselt werden.
Ein Beispiel für ein Bindungsassay ist die Messung der Wechselwirkung zwischen einem Membran-assozierten Rezeptormolekül und seinem entsprechenden Liganden. In diesem Assay wird die Wechselwirkung zwischen einem Überschuss an markiertem Liganden entweder natürlichen oder synthetischen Ursprungs und einer niedrigen Konzentration seines entsprechenden funktionellen Rezeptors quantifiziert, indem man die Konzentration an freiem (in Lösung) und gebundenem Liganden nach einer Inkubationsperiode bestimmt, in der das Gleichgewicht zwischen den beiden Bestandteilen erreicht wurde. In einem heterogenen Assay werden der gebundene und der freie Ligand durch physikalische oder chemische Verfahren voneinander getrennt, und somit kann der Bindungsgrad berechnet werden. Die Zugabe von Verbindungen oder Molekülen, die diese Wechselwirkung stören können, kann durch Reduktion des nachweisbaren Anteils von markiertem Ligand, der an den Rezeptor gebunden ist, nachgewiesen werden. In einem homogenen Assay-Format werden der freie Ligand und der gebundene Ligand nicht voneinander getrennt, da das Nachweissystem, das zum genauen Ablesen des Assays verwendet wird, diese Populationen voneinander unterscheiden kann, und zwar basierend auf physikalischen oder chemischen Eigenschaften des Liganden oder der Ligand/Rezeptor-Komplexe. Einzelmolekülfluoreszenz-Nachweismethodologien wie Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) sind für solche Assay-Systeme ideal geeignet. In diesem Zusammenhang stellt die Herstellung von VLP-Populationen, die das spezifische funktionelle Zielmolekül tragen, das in die Lipidhülle eingebaut wird, die frei von kontaminierenden Proteinen ist (verglichen mit dem aus Zellen isolierten Vesikel), das ideale Reagens dar, um Ligandbindungs-Untersuchungen durchzuführen. Das Ziel ist homogen und befindet sich in seiner nativen Konformation und Umgebung, wodurch es sich als ideales Material für die Rezeptor-Ligand-Bindungsanalyse erweist. Verglichen mit anderen Materialien, die für die Analyse von Rezeptoren, wie eines entweder gereinigten Rezeptors oder angereicherten Rezeptors bei Membranvesikel-Herstellungen, verwendet werden, wobei beide Quellen derselben an den oben beschriebenen Schwierigkeiten und Nachteilen leiden, bieten die VLPs, die einen funktionellen integralen Membran-Rezeptor tragen, eine Anzahl klarer Vorteile:

– ein homogenes Material in Bezug auf die Anzahl der Zielmoleküle auf der Oberfläche jedes Partikels,
– die Zielmoleküle werden in einer angereicherten und gereinigten Form mit minimalen Mengen an kontaminierenden Proteinen präsentiert, so dass der Hintergrund, verglichen mit komplexen Mischungen, die in Membranpräparaten gefunden werden, reduziert ist.
– die VLPs können leicht aus den Zellen, die sie erzeugen, gewonnen und von denselben abgetrennt werden,
– aufgrund der Natur ihrer Synthese und Herstellung sind sie extrem stabile Reagenzien.

Das Bindungsassay-Prinzip kann auch auf andere Typen von integralen Membranproteinen angewandt werden, deren normale Funktion nicht diejenige ist, die durch einen Rezeptor verkörpert wird. In diesem Zusammenhang kann auch eine große Anzahl von integralen Membranproteinen, die als Kanäle fungieren, welche das Einströmen oder Ausströmen kleiner anorganischer Ionen und komplexer Substanzen kontrollieren, gemäß diesem Prinzip überprüft werden. Eine Anzahl kleiner Moleküle oder Peptid-Nachahmungen wurde charakterisiert, die sich mit hoher Affinität an die Teile des Kanals binden, die für das Pumpen der entsprechenden Ionen entweder aus dem oder in das Zellkompartiment verantwortlich sind, und somit als antagonistische Liganden fungieren. Wie für die Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen beschrieben wurde, können somit kleine Moleküle, die mit den Kanälen in Wechselwirkung stehen, entweder in einem heterogenen oder homogenen Format durch Quantifizierung der Hemmung der Bindung des markierten Liganden wieder nachgewiesen werden. Wiederum ergeben Präparate von VLPs, die solche Zielmoleküle auf der Oberfläche dieser umhüllten Partikel in ihrer korrekten Konformation und ihrem korrekten chemischen Milieu exprimieren, optimale Reagenzien für eine solche Analyse.
Das Prinzip für das Binden eines spezifischen Liganden an einen komplexeren wechselwirkenden Partner ist nicht auf Rezeptoren oder Innenkanäle beschränkt, die als integrale Membranproteine gefunden werden, sondern ist auch auf solche Moleküle anwendbar, die als ein lösliches funktionelles Protein entfernt von ihrer natürlichen Lipid-Umgebung in einer löslichen wässrigen Umgebung isoliert werden.
Zudem ist dieses Assay-Prinzip auch auf lösliche cytoplasmatische oder Zellkern-Proteine anwendbar, die entweder als Rezeptor fungieren (z. B. Zellkern-Hormonrezeptoren) oder eine enzymatische Aktivität aufweisen, wobei in diesem Fall wieder entweder markierte Liganden für den Rezeptor oder ein markiertes nicht-hydrolysierbares Enzymsubstrat zum Nachweis von Verbindungen verwendet werden können, die mit dem in Frage kommenden Protein in Wechselwirkung stehen. Die Quantifizierung dieser Wechselwirkung in einem entweder heterogenen oder homogenen Format bildet die Basis für einen Assay, in dem Verbindungen, die mit dem zu untersuchenden Ziel in Wechselwirkung stehen, nachgewiesen werden können. In diesem Zusammenhang können die zu untersuchenden Zielmoleküle spezifisch in umhüllte VLPs eingebaut werden und stellen somit ein Reagens dar, durch das das Zielmolekül von einer natürlichen Zellgrenze, der Plasmamembran, umgeben ist. Moleküle, die mit diesem Ziel in Wechselwirkung treten (insbesondere kleine Moleküle von pharmazeutischer Relevanz) müssen normalerweise diese Barriere überschreiten, ein Aspekt, der nicht direkt überprüft wird, wenn Bindungsassays auf gereinigten Komponenten in einer wässrigen Umgebung verwendet werden. Wenn jedoch VLPs in diesem Assay-Format verwendet werden, ist man nicht nur befähigt, die konkurrierende Wechselwirkung einer kleinen Verbindung um eine Ligandbindung an ihren erkennenden Rezeptor (oder ein Substrat, das mit einer enzymatischen Aktivität wechselwirkt) zu bestimmen, sondern auch ihre Eigenschaft zum Durchqueren der Plasmamembran, einer natürlichen biologischen Barriere, wodurch die Analyse an Wert gewinnt.
VLP-Festphasen-Wechselwirkungen
In einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf die Messung der Wechselwirkung zwischen einem Membran-assozierten Protein (z. B. ein integraler Membranrezeptor, ein Innenkanal, ein Adhäsionsmolekül oder ein Porenkomplex) und einer Verbindung, die an eine feste Phase gebunden ist, insbesondere ein Bead. Mit der Entwicklung der kombinatorischen Chemie und insbesondere der kombinatorischen Chemie in der festen Phase sind Assays von großem Interesse, die die Wechselwirkung zwischen einem Zielmolekül und Beads, die mit pharmazeutisch relevanten kleinen Molekülen beschichtet sind, nachweisen können. Solche Assay-Formate sind jedoch bisher größtenteils auf die Verwendung von gereinigten löslichen Zielmolekülen beschränkt, die mit einer nachweisbaren Markierung (z. B. einer Fluoreszenz-Markierung) assoziiert sind, die für die Analyse und Quantifizierung der Wechselwirkung notwendig ist. Die Verwendung komplexerer integraler Membranproteine bei dieser Anwendung wird durch diese Anforderung aufgrund der in anderen Kapiteln der vorliegenden Patentanmeldung beschriebenen Gründe erschwert. Die Verwendung von VLPs, die ein solches integrales Membranmolekül aufweisen, das in die Lipidhülle eingebaut ist, ermöglicht die Entwicklung solcher Assays, wie nachstehend beschrieben wird. VLPs, die das interessierende Zielmolekül aufweisen, können mit membrandurchlässigen Farbstoffen angefärbt werden, was den Nachweis und die Quantifizierung der VLPs durch optische Methoden ermöglicht. Wenn solche VLPs zu einer Mischung von mit mehreren chemischen Substanzen beschichteten Beads gegeben wird, die potentielle Bindungspartner darstellen, und dann zum Gleichgewicht inkubieren gelassen werden, dann können Bindungspartner durch das anschließende direkte Markieren der Beads aufgrund der Wechselwirkung mit markierten VLP-Molekülen nachgewiesen werden. In Kombination mit spezifischen, vorzugsweise konfokalen Nachweis- und Isolierungsmethoden eines einzelnen positiven Beads können dann Verbindungen nachgewiesen werden, die spezifisch mit integralen Membranproteinen in Wechselwirkung treten. Eine weitere Ausführungsform umfasst das direkte Markieren des VLP, in das das interessierende Zielmolekül durch die direkte Fusion des Zielmoleküls mit einem lumineszenten Peptid oder Polypeptid eingebaut wurde, wodurch der direkte Nachweis und die Quantifizierung des VLP ohne die Verwendung der membrandurchlässigen Farbstoffe ermöglicht wird. Eine weitere Ausführungsform dieser Methodologie wäre die Verwendung fluoreszenter Konjugate, die sich an reaktive Thiolgruppen entweder auf der Oberfläche oder im Inneren von VLP, das das interessierende Zielmolekül trägt, kovalent binden, um das VLP spezifisch zu markieren, wodurch der Nachweis der Wechselwirkung zwischen dem VLP und dem entsprechenden Bead ermöglicht wird, wie oben beschrieben wurde.
Wechselwirkung zwischen Zielmolekülen, die in VLPS eingebaut sind
In noch einem anderen Aspekt offenbart die Erfindung einen Assay zum Screening einer Vielzahl von Verbindungen, um den Hemmungs- oder Stimulierungsgrad einer Wechselwirkung zwischen wenigstens zwei Zielmolekülen zu bestimmen, wobei dieser Assay die Zugabe einer flüssigen Suspension erster Zielmoleküle, die in erste virusartige Partikel eingebaut sind, und einer flüssigen Suspension zweiter Zielmoleküle, die in zweite virusartige Partikel eingebaut sind, zu einer Mehrzahl von Behältern umfasst. Der Assay umfasst weiterhin die Zugabe mehrerer Verbindungen, die auf diese Hemmung oder Stimulierung durchmustert werden sollen, einzeln oder in Kombination zu diesen mehreren Behältern und die Inkubation dieser Zielmoleküle, die in diese virusartigen Partikel eingebaut sind, und dieser Verbindungen. Der Assay wird durch Messen wenigstens einer Eigenschaft der virusartigen Partikel und Bestimmung der Grades der Hemmung oder Stimulierung der Wechselwirkung zwischen den Zielmolekülen durch eine oder mehrere dieser Verbindungen analysiert. Es wird bevorzugt, dass die Zielmoleküle durch Fusion zu Kapsid- oder Hülle-Bestandteilen dieser VLPs oder gemäß dem oben offenbarten Verfahren auf nichtkovalente Weise in die virusartigen Partikel eingebaut werden. Vorzugsweise wird eine optisch bestimmbare Eigenschaft dieses VLP, z. B. durch Verfahren der konfokalen Mikroskopie oder Spektroskopie, durch die oben offenbarten Fluoreszenztechniken (wie Fluoreszenzkreuzkorrelationsspektroskopie, Fluoreszenzintensitätsverteilungsanalyse, Fluoreszenz-Lebensdauer-Messungen, Fluoreszenzanisotropiemessungen, Fluoreszenzresonanzenergieübertragung oder Kombinationen derselben), Lichtstreuung oder eine weitere Eigenschaft durch Impedanz- Messungen, dielektrophoretische Messungen oder andere gemessen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen diese Signalmoleküle eine Reporter-Struktureinheit, vorzugsweise einen lumineszenten Reporter, insbesondere ein grünes fluoreszentes Protein oder Mutanten desselben.
Zell-Zell-Wechselwirkungen oder Zell-Matrix-Wechselwirkungen sind von großer Bedeutung in den Bereichen der Immunologie und Entzündung, wo die Wechselwirkung zwischen Zellen und Zellmatrix-Grenzflächen von hoher Bedeutung ist. Schwierigkeiten, die mit diesem Assay-System verbunden sind, sind üblicherweise mit den Schwierigkeiten der Verwendung lebensfähiger Zellen in einem uHTS-Screening-Hintergrund verbunden, da eine solches Unterfangen extrem zeitraubend und teuer ist, wobei die Interassay-Variation eine Standardisierung der statistischen Analyse und der Qualitätskontrolle erschwert. Es ist möglich, gereinigte Bestandteile von rekombinanten Zellpopulationen zu verwenden, die die wechselwirkenden Partner überexprimieren, obwohl diese Vorgehensweise üblicherweise eine reduzierte Affinität des Systems ergibt. Diese Reduktion der Affinität (die natürlich nicht den physiologischen Zustand widerspiegelt) hat mehrere Gründe, z. B. Konformationsänderungen nach dem Entfernen der Bestandteile aus ihrer natürlichen Umgebung (z. B. eine Bilipidschicht). In einer Anzahl von Fällen sind solche Bindungspartner (Zielmoleküle) nicht einzelne Moleküleinheiten, sondern sind Komplexe von entweder homologen oder heterologen Bestandteilen, was ihre Reinigung schwierig, wenn nicht unmöglich macht. Die Verwendung alternativer Materialien wie Membranpräparate legt der Assay-Gestaltung und dem Nachweis Beschränkungen auf, falls dies überhaupt machbar ist. Die Verwendung der VLP-Methodik erleichtert eine Anzahl dieser Probleme und stellt somit einen Fortschritt in der Gestaltung und der Leistungsfähigkeit solcher Assays dar. Wenn im Prinzip eine Population, die ein Zielmolekül oder einen Zielkomplex (der entweder aus homologen oder heterologen Bestandteilen besteht) exprimiert, mit einer zweiten Population von VLPs inkubiert wird, die das Wechselwirkungspartner-Zielmolekül (das aus entweder aus homologen oder heterologen Bestandteilen besteht) exprimieren, und die Wechselwirkung bis zum Gleichgewicht fortschreiten kann, dann werden Aggregate von wechselwirkenden VLPs erzeugt. Die Verwendung von Nachweistechni ken, die zwischen Einzel-VLPs und Aggregaten von VLPs differenzieren können, und zwar entweder durch physikalische Attribute dieser Populationen (z. B. Lichtstreuungseigenschaften) oder die spezielle Gestaltung von Reporter-Molekülen, die in die zwei unterschiedliche VLP-Populationen eingebaut werden, die voneinander unterschieden werden können (z. B. lumineszente Proteine oder Membranfarbstoffe), ergibt einen empfindlichen Nachweis und eine Quantifizierung der unterschiedlichen in dieser Mischung dargestellten Populationen. Dieses Prinzip bildet die Basis für ein Assay-Format, das auf uHTS anwendbar ist, indem die Zugabe von Verbindungen, die auf wechselwirkende Partner auf den unterschiedlichen VLP-Populationen einwirken, das Verhältnis der aggregierten VLPs, verglichen mit Kontrollen, beeinflusst.
Intrazelluläre Protein-Protein-Wechselwirkungen
Ein weiteres Assay-Format von großem Interesse bei der Suche nach neuen Pharmazeutika besteht in der Beeinflussung von Protein-Protein-Wechselwirkungen durch kleine Moleküle. Dies kann auf mehreren Wegen versucht werden, von denen einer oben in der Rubrik "Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen von gereinigten Bestandteilen in einer wässrigen Umgebung" beschrieben wurde. Eine stärker physiologische Umgebung für die Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen wäre jedoch von großem Vorteil, da Verbindungen, die in dem obigen Assay isoliert werden, getestet und üblicherweise in Zellsystemen bestimmt werden müssen. Solche Zellsysteme stellen verglichen mit dem einfacheren Bindungsassay eine Reihe von Herausforderungen dar und führen dazu, dass eine große Anzahl von potentiellen Modulatoren nicht weiter als aussichtsreiche Wirkstoff-Kandidaten entwickelt werden muss.
Eine limitierender Faktor ist die Fähigkeit solcher Verbindungen zum Durchqueren der Plasmamembran als natürliche Grenze der Zelle. Die Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen in eukaryontischen Zellen wurde aufgrund der Komplexität des Systems auf das uHTS-Niveau beschränkt und hat nur in Hefe Aufmerksamkeit erlangt, wo das Zweihybrid-System ausführlich als Assay-System untersucht wurde, um Proteinpartner zu identifizieren und zu klonieren, die in Protein-Protein-Wechselwirkungen verwickelt sind, wobei eine sehr geringe Anwendung beim Screening von pharmazeutischen Wirkstoffen erfolgte. Obwohl das System als Methodik für die oben erwähnten Anwendungen sehr brauchbar ist, leidet es an einer Anzahl von Einschränkungen. Erstens wird die Analyse in Hefe durchgeführt, was in gewisser Beziehung das Experimentieren erleichtert, aber natürlich sind bestimmte biologische Reaktionen von solchen in höheren Eukaryonten verschieden, wie das Einführen eines bestimmten Redundanzgrades. Zweitens müssen die wechselwirkenden Partner in den Zellkern überführt werden und können in einigen Fällen somit die Analyse der entsprechenden Proteine herab bis zu Fragmenten oder Domänen der entsprechenden Ziele reduzieren. Dies kann die Affinität und Spezifität des Systems reduzieren, was einen Informationsverlust der Analyse bewirkt. Schließlich leidet das System auch an der großen Menge an Hintergrund, was einen großen Prozentgehalt an falsch positiven Ergebnissen ergibt. In diesem Assay-Format bietet die VLP-Methodologie eine Anzahl von Vorteilen gegenüber der oben beschriebenen Methodik. Der Assay basiert auf dem folgenden Format, in dem Signalmoleküle zwei Aminosäuresequenzen umfassen: eine, die den Signalmolekülen die Fähigkeit zum Zusammensetzen zu VLPs verleiht, die vorzugsweise in die extrazelluläre Umgebung freigesetzt werden und mit ihr fusioniert werden, ist ein erstes wechselwirkendes Molekül der Wahl. Das Zielmolekül der Wahl umfasst auch zwei Aminosäuresequenzen: eine, die mit dem ersten wechselwirkenden Molekül spezifisch in Wechselwirkung tritt, und eine andere, die damit fusioniert ist und ein Reportermolekül ist. Dieser Reporter ist entweder in einem heterogenen oder homogenen Assay nach dem Einbauen in ein VLP nachweisbar und quantifizierbar. Die Expression dieser zwei Fusionsmoleküle in der gleichen Wirtszelle ergibt die Synthese von zwei chimären Molekülen, die spezifisch miteinander in Wechselwirkung treten. Wenn dies der Fall ist, dann wird ein Komplex gebildet, der aus Signal und Ziel besteht. Somit werden die zwei funktionellen Struktureinheiten, Signal und Ziel, zusammengebracht, was das Einbauen des Reporters in vorzugsweise freigesetzte VLPS ergibt, und zwar aufgrund der Eigenschaft des Signalmoleküls, die Bildung von VLPs zu induzieren und in VLPs eingebaut zu werden, die anschließend in die extrazelluläre Umgebung freigesetzt werden. Eine Zelle, die diese Bestandteile exprimiert, bildet somit die Basis für ein Assay-Format, das für die Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit den entsprechenden interessierenden Protein-Molekülpaaren verwendet werden kann. In einem Kontrollversuch wird die Freisetzung von nachweisbaren VLPs während einer bestimmten Zeitspanne quantifiziert und mit der Freisetzung von nachweisbaren VLPs aus einer Zellkultur verglichen, die mit einer Verbindung behandelt wurde, die möglicherweise die Plasmamembran durchqueren kann und die spezifische Protein-Protein-Wechselwirkung der entsprechenden Proteinmoleküle modulieren kann, die in einen Kompartiment in der Zelle lokalisiert sind. Somit liefert der Assay eine direkte Ablesung, die außerhalb der Zelle gemessen wird, aber Wechselwirkungen widerspiegelt, die in einer physiologischen Umgebung in der Zelle erfolgen.
Allgemeiner ausgedrückt stellt die Erfindung die Verwendung von VLPs in einem Assay zur Bestimmung intrazellulärer Protein-Protein-Wechselwirkungen bereit, wobei der Assay Folgendes umfasst:

(a) das Coexprimieren (i) von Zielmolekülen, die eine erste und eine zweite Aminosäuresequenz umfassen, wobei die letztere derselben vorzugsweise ein lumineszenter Reporter ist, und (ii) von Signalmolekülen, die eine erste und eine zweite Aminosäuresequenz umfassen, wobei die letztere den Signalmolekülen die Fähigkeit zum Zusammensetzten zu VLPS verleiht, die vorzugsweise in eine extrazelluläre Umgebung freigesetzt werden, in rekombinanten Zellen;
(b) das Messen des Vorliegens oder Fehlens dieses Reporters in diesen VLPs, und dadurch
(c) die Bestimmung des Grades der Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen der ersten Aminosäuresequenz eines Zielmoleküls und der ersten Aminosäuresequenz eines Signalmoleküls.

In einer weiter verallgemeinerten Form stellt die Erfindung einen Assay zum Bestimmen intrazellulärer Protein-Protein-Wechselwirkungen bereit, in der der Assay die Bereitstellung einer rekombinanten Zelle umfasst, die eine erste DNA umfasst, die ein erstes Fusionsprotein kodiert, das aus wenigstens zwei Struktureinheiten besteht, wobei die erste Struktureinheit ein Molekül ist, das die Bildung und vorzugsweise Freisetzung von virusartigen Partikeln in eine extrazelluläre Umgebung einleiten kann, und die zweite Struktureinheit ein zu untersuchendes Protein sowie eine zweite DNA ist, die ein zweites Fusionsprotein kodiert, das aus wenigstens zwei Struktureinheiten besteht, wobei die erste Struktureinheit vorzugsweise ein lumineszenter Reporter ist und die zweite Struktureinheit ein anderes zu untersuchendes Protein ist. In einer weiteren Variante umfasst die rekombinante Zelle eine erste DNA, die ein Molekül kodiert, das die Bildung und vorzugsweise Freisetzung von virusartigen Partikeln in eine extrazelluläre Umgebung induzieren kann; eine zweite DNA, die ein zu untersuchendes Protein kodiert, wobei sowohl das Molekül als auch das zu untersuchenden Protein so angepasst, dass sie auf nichtkovalente Weise funktionell zusammenzuwirken; und eine dritte DNA, die ein Fusionsprotein kodiert, das aus wenigstens zwei Struktureinheiten besteht, wobei die erste Struktureinheit vorzugsweise ein lumineszenter Reporter ist und die zweite Struktureinheit ein anderes zu untersuchendes Protein ist. In einer anderen Variante umfasst die rekombinante Zelle eine erste DNA, die ein Fusionsprotein kodiert, das aus wenigstens zwei Struktureinheiten besteht, wobei die erste Struktureinheit ein Molekül ist, das die Bildung und vorzugsweise Freisetzung von virusartigen Partikeln in eine extrazelluläre Umgebung induzieren kann, und die zweite Struktureinheit ein zu untersuchendes Protein ist; eine zweite DNA, die einen vorzugsweise lumineszenten Reporter kodiert, und eine dritte DNA, die ein anderes zu untersuchendes Protein kodiert, wobei vorzugsweise sowohl der lumineszente Reporter als auch das andere Protein so angepasst, dass sie auf nichtkovalente Weise funktionell zusammenzuwirken. In einer abschließenden Variante umfasst die rekombinante Zelle eine erste DNA, die ein Molekül kodiert, das die Bildung und vorzugsweise Freisetzung von virusartigen Partikeln in eine extrazelluläre Umgebung induzieren kann, eine zweite DNA, die ein zu untersuchendes Protein kodiert, wobei sowohl das Molekül als auch das Protein angepasst sind, um auf nichtkovalente Weise funktionell zusammenzuwirken, eine dritte DNA, die einen vorzugsweise lumineszenten Reporter kodiert, und eine vierte DNA, die ein anderes zu untersuchendes Protein kodiert, wobei sowohl der lumineszente Reporter als auch das andere Protein so angepasst sind, dass sie auf nichtkovalente Weise funktionell zusammenzuwirken. In diesem Assay werden die Komponenten exprimiert, und der Grad der Protein-Protein-Wechselwirkung wird durch Messen des Vorliegens oder Fehlens des vorzugsweise lumineszenten Reporters in den virusartigen Partikeln bestimmt, die vorzugsweise in eine extrazelluläre Umgebung freigesetzt werden. Dieser Assay ist vorzugsweise homogen. Das Vorliegen oder Fehlen des vorzugsweise lumineszenten Reporters in den virusartigen Partikeln wird vorzugsweise durch konfokale Mikroskopie oder Spektroskopie gemessen, insbesondere durch die Verwendung von Fluoreszenztechniken, wie Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie, Fluoreszenzkreuzkorrelationsspektroskopie, Fluoreszenzintensitäts-Verteilungsanalyse, Fluoreszenz-Lebensdauer-Messungen, Fluoreszenzresonanzenergieübertragung oder Kombinationen derselben.
Vorzugsweise umfasst dieses Assay-Prinzip das In-Kontakt-Bringen der rekombinanten Zellen mit Verbindungen/Substanzen, die auf ihre Fähigkeit zum Eingreifen in die Protein-Protein-Wechselwirkung durchmustert werden. Zu durchmusternde Verbindungen/Substanzen umfassen cDNA-Expressionsbibliotheken, genomische DNA-Fragmente, mRNAs, Peptide, Proteine und niedermolekulare Substanzen. In einer bevorzugten Ausführungsform kann dieses Assay-System für die Identifizierung von Genprodukten verwendet werden, die in Protein-Protein-Wechselwirkungen in der Zelle eingreifen können. Vor der Zugabe der cDNA-Bibliothek exprimiert eine transformierte Zelle die oben erwähnten Konstrukte. Die Wechselwirkung dieser Proteine ergibt die Freisetzung von nachweisbaren VLPs. Durch Transfizieren der Zelle mit einem einzigen oder mehreren cDNA-Molekülen, die ein drittes Proteinprodukt exprimieren können, beeinflusst dann dieses zusätzliche Proteinprodukt, wenn es zur Wechselwirkung mit dem primären oder zweiten Proteinmolekül befähigt ist, die Freisetzung von nachweisbaren VLPs. Auf diese Weise können Moleküle identifiziert werden, die die Wechselwirkung zwischen dem ersten und dem zweiten Proteinmolekül beeinflussen können. Diese Moleküle können nur in die Bindung zwischen dem ersten und dem zweiten Proteinmolekül eingreifen, oder sie können sogar neue Bindungspartner für das erste oder das zweite Proteinmolekül darstellen. In diesem Modell ist eine Anzahl von Szenarien eingeschlossen:

a) die eingeführte cDNA kodiert für ein Protein, das mit dem Proteinmolekül in Wechselwirkung tritt, welches mit dem Reporter-Molekül fusioniert ist, wodurch die Wechselwirkung zwischen der Signalfusion und der Reporterfusion verhindert wird. Das Ergebnis besteht darin, dass VLPs freigesetzt werden, die kein Reporter-Molekül tragen. Trotzdem können diese VLPs von VLPs unterschieden werden, die das Reporter-Molekül tragen;
b) die eingeführte cDNA kodiert für ein Protein, das mit dem Proteinmolekül in Wechselwirkung tritt, welches mit dem Signalmolekül fusioniert ist, wodurch die Wechselwirkung zwischen der Reporterfusion und der Signalfusion verhindert wird. Das Ergebnis besteht darin, dass VLPs freigesetzt werden, die kein Reporter-Molekül tragen, aber das eingeführte Genprodukt dieser cDNA einkapseln, dessen Anwesenheit oder Aktivität direkt in der freigesetzten Population von VLPs bestimmt werden kann. Diese VLPs können auch von VLPs unterschieden werden, die das Reporter-Molekül tragen;
c) es gibt keine Wechselwirkung zwischen dem eingeführten cDNA-Produkt und den Signal- oder Reporter-Fusionsprodukten. Somit wird die Freisetzung von VLPs, die einen nachweisbaren Reporter tragen, nicht behindert.

Anstelle des Transfizierens dieser Zellen mit einer cDNA ist es auch möglich, die Zelle mit anderen Typen von Nucleinsäuren, wie z. B. genomischen DNA-Fragmenten oder mRNAs, zu transformieren oder Peptide oder Proteine in die Zelle einzuführen.
Assays an Transport-/Translokationspolypeptiden
Eine weitere Anwendung der VLP-Methode beinhaltet die Identifizierung von Sequenzen, die Proteine zur Plasmamembran zielsteuern oder translozieren können. Solche Sequenzen könnten spezifische Signalsequenzen beinhalten, die für die Translokation von Polypeptidmolekülen aus der Zelle in das extrazelluläre Medium von kultivierten Zellen in vitro oder für die Translokation von Proteinen in vivo verantwortlich sind. Bei dieser Anwendung wird eine Mutante eines spezifischen Signalproteins verwendet (insbesondere das retrovirale Gag-Protein), die zwar in den Wirtszellen synthetisiert wird, bei der aber das Protein nicht die Fähigkeit besitzt, das Protein zur Plasmamembran zu translozieren, wo es dann die Bildung und Freisetzung von VLPs induziert. Die Mutation im Gag-Protein, die zu diesem Defekt führt, wird vorzugsweise von einem Glycinrest auf Position 2 in der Polypeptidkette codiert und ist dem Methionin-Startcodon benachbart. Bei dieser Anwendung werden DNA-Sequenzen, die von den 5'-Enden von cDNA-Molekülen abgeleitet sind, mit Hilfe von molekularbiologischen Standardmethoden mit dem defekten gag-Gen fusioniert. Mit diesen Konstrukten werden dann Zellen transfiziert, und wenn die Fusion im korrekten Leseraster erfolgt und die hinzugefügte 5'-Sequenz dann entweder für ein sekretorisches Protein codiert, das für die Translokation des nativen Proteins zur Plasmamembran verantwortliche Sequenzen besitzt, oder wenn das von der cDNA codierte native Protein selbst ein integrales Membranprotein ist, wird der Defekt im mutierten Gag-Protein gemildert. Das Ergebnis dieser Rettung wird also sein, dass das defekte Gag-Protein zur Plasmamembran transportiert wird, wo es die Bildung und anschließende Freisetzung von VLPs in das extrazelluläre Medium induzieren könnte. Wenn das Gag-Protein in einer weiteren Ausführungsform so modifiziert wird, dass es an seinem C-Terminus eine Reporter-Polypeptid-Fusion (wie ein lumineszierendes Protein) umfasst, dann wird dieses Molekül in das VLP eingekapselt, was den effizienten Nachweis des freigesetzten VLP ermöglicht.
Folglich wird ein Assay zum Identifizieren von Nucleinsäuresequenzen bereitgestellt, die intrazelluläre Transportpolypeptide oder membranassoziierte Translokationspolypeptide codieren, wobei der Assay Folgendes umfasst:

(a) Bereitstellen einer rekombinanten Zelle, die eine DNA umfasst, welche ein Fusionsprotein codiert, das eine erste und eine zweite Aminosäuresequenz umfasst, wobei die erste Aminosäuresequenz den Fusionsproteinen die Fähigkeit verleiht, sich zu VLPs zusammenzufügen, und wobei die erste Aminosäuresequenz den Fusionsproteinen nicht die Fähigkeit verleiht, zu einer Zellmembran transportiert zu werden, und/oder wobei die erste Aminosäuresequenz den VLPs nicht die Fähigkeit verleiht, durch einen Knospungsvorgang durch die Zellmembran hindurch in eine extrazelluläre Umgebung freigesetzt zu werden, und die zweite Aminosäuresequenz ein Polypeptid ist, das gerade untersucht wird;
(b) Exprimieren der Fusionsproteine;
(c) Messen der An- oder Abwesenheit von VLPs in der extrazellulären Umgebung; und dadurch
(d) Identifizieren von DNA-Sequenzen, die intrazelluläre Transportpolypeptide oder membranassoziierte Translokationspolypeptide codieren.

Vorzugsweise wird eine Bibliothek von DNA-Molekülen in einer Menge von rekombinanten Zellen durchmustert. Die erste Aminosäuresequenz ist vorzugsweise kovalent mit dem C-Terminus der zweiten Aminosäuresequenz verknüpft. Dieses Fusionsprotein umfasst vorzugsweise einen lumineszierenden Reporter, der kovalent mit dem C-Terminus der ersten Aminosäuresequenz verknüpft ist. Der Reporter ist zum Beispiel GFP oder eine Mutante davon. Die erste Aminosäuresequenz wird vorzugsweise von einem mutanten Gen codiert, das für ein Viruskapsid- oder Virushüllprotein codiert, oder von einem mutanten Gen, das für einen Vorläufer eines Viruskapsid- oder Virushüllproteins codiert. Sie könnte jedoch alternativ dazu auch von einem mutanten Gen codiert werden, das für ein Kapsid- oder Hüllprotein eines VLP codiert, oder von einem mutanten Gen, das für einen Vorläufer des Kapsid- oder Hüllproteins codiert. Vorzugsweise ist die erste Aminosäuresequenz ein strukturelles Protein, das von einer Mutante des gag-Gens von Retroviren codiert wird. In diesem Fall führt die Mutante vorzugsweise aus dem Ersatz einer spezifischen Aminosäure in einer spezifischen Position in der Polypeptidkette des Signalmoleküls. Vorzugsweise wird die Position 2 nach dem Startcodon Methionin gegen irgendeinen Rest ausgetauscht, der für eine Aminosäure codiert, die durch Myristoylierung nicht modifiziert werden kann.
Wiederum ist dieser Assay vorzugsweise homogen. Wiederum wird die An- oder Abwesenheit von virusartigen Partikeln in der extrazellulären Umgebung zum Beispiel mit optischen Verfahren, vorzugsweise konfokaler Mikroskopie oder Spektroskopie, gemessen. Insbesondere wird die An- oder Abwesenheit von virusartigen Partikeln in der extrazellulären Umgebung unter Verwendung von Fluoreszenztechniken gemessen, insbesondere Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie, Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsspektroskopie, Fluoreszenzintensitäts-Verteilungsanalyse, Fluoreszenz-Lebensdauer-Messungen, Fluoreszenzanisotropie-Messungen, Fluoreszenzresonanzenergieübertragung oder Kombinationen derselben.
Modulatoren von Signalwegen oder des physiologischen Zustands von Zellen. Weitere funktionelle genomische Aspekte
Eine große Anzahl von Krankheiten oder physiologischen Zuständen ist mit wohl definierten Phänotypen verbunden, die durch bestimmte Moleküle und deren Konzentration oder eine Wechselwirkung solcher Moleküle als Surrogat-Marker widergespiegelt werden. Diese Marker können auch als Surrogate für verschiedene zusätzliche Konzentrationen oder Wechselwirkungen von Molekülen stromaufwärts und stromabwärts in einer solchen Signalkaskade oder Signalnetzwerk agieren. Wie oben beschrieben wurde, können alle diese Moleküle oder Wechselwirkungen von Molekülen als Molekülziele für das Auffinden von eingreifenden pharmazeutischen oder anderweitig biologisch aktiven Molekülen angesehen werden. Solche eingreifenden Moleküle können Verbindungen mit niedriger Molmasse, pharmazeutische Proteine oder sogar Moleküle, die auf wechselwirkenden Zellen oder transformierenden Genen basieren, sein. Sie können als Kandidaten für neue Treffer, Leitsubstanzen oder Wirkstoffe oder zur Identifizierung natürlicher agonistischer oder antagonistischer Mediatoren angesehen werden.
Marker-Moleküle oder Wechselwirkungen von Marker-Molekülen oder Änderungen der Konzentration oder Änderungen von Wechselwirkungen dieser Marker-Moleküle können insbesondere zur Identifizierung einer neuen Gen-Aktivität mit einer früher nicht entdeckten biologischen Funktion verwendet werden. Werkzeuge, um biologische Funktionen von unbekannten neuen Genen oder Genpro dukten leicht zu identifizieren, sind von größter Wichtigkeit bei so genannten funktionellen genomischen Anwendungen, um die biologische Rolle neuer Gene und ihr Potential als Wirkstoffziele der Wirkstoffe selbst aufzuklären. Eine solche Vorgehensweise wäre anwendbar, wenn eine Aktivität eines genetischen Materials oder eines von einem Gen abgeleiteten Produkts in einer Zelle z. B. stromabwärts eines solchen Marker-Moleküls wirken würde, um diese Moleküle oder Wechselwirkungen solcher Moleküle zu beeinflussen. Eine robuste Ablese-Technologie für charakteristische zellbasierte physiologische Endpunkte, die auf große Anordnungen von vorübergehend oder stabil transformierten Zellen anwendbar ist, wäre von größtem Vorteil, um Orphan-Gen-Funktionen individuell oder für größere Anordnungen derselben zu entdecken. Orphan-Gene werden oft durch differenzierte Display-Analyse von mRNAs oder Genom-Sequenzierung gebildet. Sie könnten auch eine vollständige Bank von Expressionsklonen sein.
Mit den Ergebnissen der Massen-Sequenzierung, wie aus dem Sequenzieren des menschlichen Genoms, müssen Orphan-Gene dahingehend getestet werden, ob ihre Produkte für bestimmte Signalwege innerhalb der Zellen von Bedeutung sind. Somit kann aufgeklärt werden, ob unbekannte Gene nach dem Überführen in Zellen einen solchen biologischen Endpunkt beeinflussen, wenn VLPs z. B. den biologischen Signalendpunkt angeben, der die Induktion der Apoptose oder die Sekretion von Oberflächenantigenen als Differenzierungsfaktoren oder die Sekretion von Aβ42-Peptiden als Indikatoren für Alzheimer-Pathogene oder die Induktion von Stressgenen oder als Indikatoren von Toxizität, um einige physiologische Endpunkte zu erwähnen, sein könnten. Die Erzeugung solcher Informationen auf unbekannten Genen wird als funktionelle molekulare Genforschung angesehen.
Die oben erwähnte Erzeugung oder Modifizierung von nachweisbaren VLPs aus rekombinanten Zellen als Ergebnis der Zell-Wechselwirkung mit biologischen Verbindungen kann vorzugsweise als Signal verwendet werden, um den Einfluss eines oder mehrerer genetischer Elemente oder ihrer Antisense-Produkte oder den Einfluss eines Proteins oder einer Protein-Bindungseinheit nach der Aufnahme durch eine solche Zelle oder Population von Zellen aufzuzeigen. Gene oder Genprodukte, wie Peptide oder Proteine oder Sense- oder Antisense-RNA oder entsprechend reagierende Moleküle wie PNAs oder neutralisierende Antikörper, können durch verschiedene wohlbekannte Arbeitsweisen, wie Infektion mit geeigneten Vektorsystemen, unter Verwendung von zellulären Transportmechanismen, DNA-Transformation, Konjugation oder Injektion in die Zellen transportiert werden.
Eine solche Herangehensweise an die funktionelle molekulare Genforschung wird aufgrund effizienter Technologien ermöglicht, um genetisches Material oder von einem Gen abgeleitete Produkte, wie mRNA, verarbeitete mRNA, verkürzte und modifizierte Formen von RNA, wie partielle RNA-Sequenzen oder Antisense-DNA oder RNA-Sequenzen oder Polymere, die mit solchen Sequenzen in Wechselwirkung treten, wie PNAs oder Proteine oder Polypeptide oder modifizierte Formen derselben, einzuführen. Wirksame und miniaturisierte Transformationstechnologien, Injektionstechnologien, wie das Gold-assoziierte Einführen von Nucleinsäuren, die Mikroinjektion von mRNA in befruchtete Oozyten, Technologien des Infizierens von Zellen mit infektiösen Agenzien, wie rekombinanten Viren, oder die endozytotisch vermittelte Aufnahme oder die Aufnahme von Reagenzien, um genetische Funktionen auf dem Proteinniveau spezifisch auszuschalten, wie selektive und/oder reaktive Antikörper oder Peptid-Binder sowie die Handhabungstechnologien von einzelnen Zellen und kleinen Populationen von Zellen, wie in den europäischen Patentanmeldungen 96 939 933.6 , 97 953 804.8 , 97 952 938.5 , oder den internationalen Patentanmeldungen PCT/EP 97/07218 , PCT/EP 98/08370 , PCT/EP 99/02380 , PCT/EP 99/04469 und PCT/EP 99/04470 beschrieben ist, in Kombination mit Assay-Technologien, wie solchen, die in dieser Patentanmeldung beschrieben sind, ermöglichen eine funktionelle Dekodierung des Effekts von funktionell unbekanntem genetischen Material oder von einem Gen abgeleiteten Produkten. In individuellen und parallelisierten Versuchen wird ein solches genetisches Material oder werden von einem Gen abgeleitete Produkte oder Knock-out-Reagenzien auf dem Niveau von Proteinen in einzelne Zellen oder Populationen von Zellen eingeführt. Wenn das entsprechende genetische Material oder das von einem Gen abgeleitete Produkt befähigt sind, ein nachweisbares VLP-Signal als Antwort auf einen zellulären Signalweg zu induzieren, kann eine solche Funktion einem solchen genetischen Material oder einem von einem Gen abgeleiteten Produkt zugeordnet werden.
Oft können neue genetische Informationen über die Funktion ihres kodierten Proteins identifiziert werden, z. B. eine Protease, eine Kinase oder Phosphatase. Zusätzlich dazu könnten Informationen über den Gewebetyp und den physiologischen Expressionszustand bekannt sein. Dies ist jedoch keine ausreichende Information, um ein solches Ziel zu validieren. Die Technologie gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein wichtiges Werkzeug zur Entdeckung neuer molekularer Ziele, um eine Krankheit zu behandeln oder in eine andere Zelleigenschaft einzugreifen, wie das Design von Kulturpflanzen, um deren wirtschaftlichen Wert zu verbessern.
Bezüglich der funktionellen molekularen Genforschung und des Wirkstoff-Screening offenbart die Technologie gemäß der vorliegenden Erfindung auch die Verwendung von VLPs in einem Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die Signalwege und/oder einen physiologischen Zustand einer Zelle spezifisch modulieren, indem sie Vertreter solcher Signalwege beeinflussen, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:

– Vergleich der Menge und/oder der Eigenschaften eines Reportergen-Produkts, das in einer rekombinanten Zelle in Gegenwart des Substrats exprimiert wird, mit der Menge und/oder den Eigenschaften an Produkt in Abwesenheit der Substanz, wobei
– diese Zelle einen Marker oder Surrogatmarker des Signalwegs enthält und
– die Herstellung und/oder Eigenschaften des Reportergen-Produkts oder seine Freisetzung aus dieser Zelle spricht auf die Eigenschaften und/oder die Menge dieses Markers oder Surrogatmarkers oder auf ein intrazelluläres Signal an, das durch den Marker oder Surrogatmarker erzeugt wird, und
– das Reportergen-Produkt umfasst (i) ein Signalmolekül und gegebenenfalls (ii) einen nachweisbaren Rest, wobei die Signalmoleküle sich zu vi rusartigen Partikeln zusammensetzen können, die vorzugsweise in ein extrazelluläres Medium freigesetzt werden.

Es wird insbesondere bevorzugt, dass das Reportergen-Produkt von einem Reportergen-Konstrukt kodiert wird, das ein Transkriptionskontrollelement enthält, welches auf die Eigenschaften und/oder die Konzentration des Markers oder Surrogatmarkers oder auf das extrazelluläre Signal reagiert, das durch diesen Marker oder Surrogatmarker erzeugt wird. Vorzugsweise schließt das Transkriptionskontrollelement wenigstens ein regulatorisches Element ein, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus auf Serum reagierenden Elementen, auf cyclisches Adenosinmonophosphat reagierenden Elementen und Elementen, die auf intrazelluläre Calciumionen-Gehalte ansprechen, besteht.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist diese Substanz aus der Gruppe ausgewählt, die aus niedermolekularen Verbindungen, Nucleinsäuren, Peptiden/Proteinen oder PNAs besteht. Die Nucleinsäure kann aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus genomischer DNA, cDNA, mRNA, Antisense-Sequenzen oder einem Fragment oder einer modifizierten Nucleinsäure der obigen besteht. Dieses Protein ist vorzugsweise ein Antikörper.
Eine andere Anwendung der VLP-Technologie der vorliegenden Erfindung besteht in der Untersuchung der Induktion der Expression von neuen Genen oder der Verarbeitung von posttranskriptionalen Signalen, die sich von neuen Genen ableiten, als Ergebnis der Aktivität einer Leitverbindung oder anderer Moleküle auf einer Zelllinie oder als Ergebnis eines Transformationsverfahrens einer Zelllinie durch Aufnahme definierter regulatorischer Moleküle, Gene, Antisense-Moleküle oder mRNAs oder selektiver Reagenzien, die auf dem Protein-Niveau wirken. Eine Möglichkeit besteht in der Verwendung einer Expressionsbibliothek von Zellen mit Fusionsproteinen, die nachweisbare Signale in VLPs nach der Aktivierung oder Deaktivierung solcher Gene exprimieren. Es ist wichtig, einen direkten Weg zur Beobachtung aller Gene, die nach der Wirkung einer spezifischen Anregung coexprimiert werden, zu verfolgen, um zusätzliche Wirkstoff-Zielkandidaten auszusuchen, damit eine bestimmte biologische Funktion durch ein selektives stromabwärts gelegenes Eingreifen mit einer Signalkette selektiv aktiviert werden kann.
Ein physiologischer Endpunkt kann auch eine Stressantwort sein, die bei einem Testen der biologischen Sicherheit und der biologischen Verfügbarkeit untersucht wird, wie solche Tests, die als frühe ADME/tox-Assays beschrieben sind.
VLPs, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, können z. B. für die funktionelle Analyse von Ionenkanälen oder Komponenten von Ionenkanälen verwendet werden. Z. B. kann der Glutamat-Rezeptor in der Membran von VLPs lokalisiert sein, die mit Ca-anzeigenden Farbstoffen wie Fura-Farbstoffen beladen sind, und das Einströmen von freiem Ca²⁺ kann in Gegenwart oder Abwesenheit von Antagonisten oder Agonisten kontrolliert werden.
Auf VLP basierende Orphan-Rezeptorassays
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die VLP-Technologie auch in Kombination mit einer Technik für eine spezifische molekulare Markierung von GPCRs angewendet werden, was notwendig ist, wenn der natürliche Ligand unbekannt ist (Einzelheiten dieser Technik werden in WO 98/39660 offenbart, wobei auf den Inhalt derselben hierin Bezug genommen wird). Nach der Wechselwirkung mit entweder einem mutmaßlichen oder synthetischen Liganden ändert das GCPR seine Konformation, woraus die Freilegung reaktiver Thiolgruppen resultiert, die dann befähigt sind, mit einem speziellen Farbstoff zu reagieren. Diese Liganden-induzierte Antwort kann verwendet werden, um Verbindungen zu durchmustern, die den Rezeptor entweder als Agonisten oder Antagonisten aktivieren oder modulieren. Anwendungen dieser konkurrentenfreien Assay-Technologie schließen Folgendes ein:

– Identifizierung von Agonisten für einen Orphan-Rezeptor aus einer Liganden-Bibliothek
– Identifizierung des Vorliegens eines Rezeptors für einen mutmaßlichen Liganden
– Unterscheidung zwischen Agonisten und Antagonisten
– Nachweis von Antagonisten (entweder Anti-Rezeptor oder Anti-Antagonist) durch Hemmung der Agonisten-induzierten Markierung.

Komplexierung von Molekülen in virusartigen Partikeln
Bei vielen Familien von Zelloberflächenrezeptoren hat sich gezeigt, dass die Bildung von Komplexen aus mehreren Einheiten, d. h. Homo- oder Heterodimeren oder -oligomeren, eine wesentliche Voraussetzung für die Bildung von strukturell und funktionell aktiven Einheiten ist, was für zusätzliche Komplexität der zellulären Signalvorgänge sorgt. Diese Komplexität hat wichtige Implikationen für die Gestaltung von Screening-Strategien für neue Wirkstoffe. Erst in jüngster Zeit wurde erkannt, dass dieses Konzept auch für die einzelne größte Familie von Zelloberflächenrezeptoren, die G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (Salahpour et al., Trends Endocrinol. Metabol. 11, 163–168, 2000), relevant ist. Zum Beispiel fügen sich einzelne Untertypen des Somatostatin-Rezeptors als funktionelle Homo- und Heterodimere zusammen (Rocheville et al., J. Biol. Chem. 275, 7862–7869, 2000). Weiterhin sind Rezeptoren für Dopamin und Somatostatin in der Lage, Heterooligomere mit verstärkter funktioneller Aktivität zu bilden (Rocheville et al., Science 288, 154–157, 2000). Noch ein weiteres Beispiel ist die Wechselwirkung von m- und d-Opioid-Rezeptoren unter Bildung von Oligomeren, wobei neue pharmakologische und G-Protein-Kopplungseigenschaften entstehen (George et al., J. Biol. Chem. 275, 26128–26135, 2000). Wenn man weiterhin zum Beispiel ein definiertes GPCR in der Zellmembran einer bestimmten Zelle betrachtet, ist dieses individuelle Protein in seinem normalen hochaffinen Zustand mit einer Vielzahl anderer Proteineinheiten assoziiert (komplexiert), die an den Signalvorgängen beteiligt sind, welche nach der Wechselwirkung eines Agonisten mit dem rezeptor stimuliert werden. Diese Proteine (die sogenannten G-Proteine, von denen es α-, β- und γ-Untereinheiten gibt) Wechselwirken mit einer so hohen Affinität und Spezifität mit den jeweiligen Rezeptoren, dass sie durch Immunfällung des Rezeptors in membranlysierten Zellen angereichert und isoliert werden können.
Es wäre also von beträchlichem praktischen Nutzen, nicht nur einzelne, individuelle Zielmoleküle in virusartige Partikel einzubauen oder einzukapseln oder in sonstiger Weise physikalisch damit zu assoziieren, sondern ganze funktionelle Komplexe von Zielmolekülen darin zusammenzufügen. Diese Komplexe können unter anderem aus verschiedenen Untereinheiten oder Untertypen eines einzelnen Zielmoleküls oder von verschiedenen Zielmolekülen, wie verschiedenen Klassen von GPCRs, oder Zielmolekülen mit ihren verschiedenen Hilfs-, Neben- oder anderen assoziierten Faktoren, insbesondere Effektorproteinen, wie G-Proteinen, bestehen.
Die vorliegende Erfindung gibt ein Verfahren an, mit dem dieses Ziel erreicht wird, indem man eine der komplexierenden Komponenten, die im Folgenden als erste Komponente bezeichnet wird, mit einem Tag markiert und somit die Wechselwirkung mit einem markierten Signalmolekül induziert und den anschließenden Einbau oder die Einkapselung in VLPs oder die Assoziation mit VLPs bewirkt. Aufgrund der Bildung von Homo- oder Heterodimeren oder von Homo- oder Heterooligomeren der markierten ersten Komponente eines Zielmolekülkomplexes mit einer unmarkierten Komponente, die im Folgenden als zweite Komponente bezeichnet wird und die entweder endogen in der Wirtszelle vorhanden ist oder coexprimiert wird, kann man spezifische wechselwirkende Partner, die in einer komplexen Einheit arbeiten, in ein virusartiges Partikel einbauen. Dies wurde für den humanen Endothelin-A-Rezeptor untersucht, der in seiner markierten Form mit einem markierten Gag-Proteinmolekül coexprimiert wurde. Durch Western-Blot-Analyse wurde nachgewiesen, dass die resultierenden VLPs, die in den Zellkulturüberstand freigesetzt wurden, wenigstens die endogene Insekten-α-G-Protein-Untereinheit enthalten (siehe 25).
Dieselben Prinzipien, die in Bezug auf die Produktion und die Verwendungen von virusartigen Partikeln mit individuellen Zielmolekülen beschrieben wurden, gelten auch für virusartige Partikel mit Zielmolekülkomplexen.
Verwendung von virusartigen Partikeln für die Konzentration, Isolierung und Reinigung von rekombinanten Molekülen
Eine weitere Anwendung der VLP-Methode beinhaltet den spezifischen Einbau oder die Einkapselung in oder die physikalische Assoziation mit VLPs und die anschließende Freisetzung solcher VLPs in den Zellkulturüberstand, wodurch die VLPs dann als biochemisches Material im ersten Schritt einer Reinigungsvorschrift verwendet werden können.
In einem bevorzugten Beispiel wird ein interessierendes integrales Membranprotein gemäß der oben beschriebenen Methode in das VLP eingebaut. Im Anfangsschritt wird das Molekül somit in eine Umgebung eingebaut, die derjenigen ähnlich ist, in der es sich gewöhnlich als funktionelle Entität befindet, d. h. der Plasmamembran. Dieser spezifische Einbau führt auch zu einem Konzentrationsschritt, bei dem jedes VLP im Vergleich zur Konzentration des interessierenden Membranproteins nur einen kleinen Anteil der endogenen integralen Membranproteine trägt. Wenn man annimmt, dass das interessierende Protein in Kopienzahlen von 1000 pro eukaryontischer Zelle exprimiert wird, beträgt ihre jeweilige Konzentration innerhalb des Zellvolumens von ungefähr 1 pI ungefähr 1 nM. Bei hohen Zelldichten von 1000 Zellen pro μl innerhalb des Mediums beträgt die Konzentration ungefähr 1 pM innerhalb der gesamten Probe. Wenn solche Proteine jedoch auf Partikeln von 100 nm Durchmesser in Kopienzahlen von ungefähr 100 pro Partikel exprimiert werden, wird ihre lokale Konzentration auf ungefähr 1 mM erhöht. VLPs, die durch Exocytose, Lyse, Knospung oder einen verwandten Mechanismus in das Medium freigesetzt werden, können leicht auf 10 pM konzentriert werden, was bedeutet, dass das interessierende Protein eine Konzentration von etwa 10 nM hat, genau wie die physiologische Konzentration innerhalb einer Zelle. Mit der Technologie gemäß der vorliegenden Erfindung können Zielmoleküle auf der Oberfläche oder innerhalb von homogenen VLPs konzentriert werden. Die anschließende Isolierung und Konzentration der VLPs bildet also den ersten Schritt in einer Reinigungsvorschrift, bei der das interessierende Zielmolekül, dann durch biochemische Standardmittel weiter gereinigt werden kann. Dieser anfängliche Reinigungs- und Konzentrationsschritt (Einbau in ein VLP) kann sowohl für integrale Membranproteine als auch für lösliche cytoplasmatische Proteine verwendet werden, die nach Wechselwirkung mit dem Gag-Protein über die spezifischen komplementären Superspiralensequenzen innerhalb des VLP eingekapselt werden können. Diese Methode kann auch als Genomikstrategie angewendet werden, bei der gag entweder kovalent oder nichtkovalent mit einem interessierenden Zielprotein fusioniert und in eine Menge von Zellen eingeführt werden kann, die entweder eine Menge von cDNA-Fusionen oder endogene Proteine, die potentiell für Partner codieren, die mit dem interessierenden, mit gag fusionierten Zielmolekül Wechselwirken können, exprimieren. Wenn diese Wechselwirkung spezifisch und von erheblicher Affinität ist, dann können Wechselwirkungspartner in die VLPs eingebaut und anschließend angereichert und mit biochemischen Standardverfahren gereinigt werden. Diese Methode bietet als Reinigungsstrategie mehrere Vorteile; die Überexpression einiger rekombinanter Proteine in Zellen kann zu einer erhöhten Toxizität gegenüber der Wirtszelle führen. Wenn Zellen das rekombinante Protein kontinuierlich in VLPs einbauen, die kontinuierlich aus den Zellen freigesetzt werden, liegt das fragliche rekombinante Protein in der Zelle in einer niedrigeren Konzentration vor, was die toxischen Wirkungen reduzieren kann. Aufgrund der Tatsache, dass die Zielproteine im Vergleich zu anderen kontaminierenden Proteinen (die im Vergleich zu ganzen Zellen in niedrigeren Konzentrationen vorliegen) spezifisch in die VLPs eingebaut werden, reichert die VLP-Strategie das interessiertende Zielmolekül in einem Schritt an.
Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung
Mit der VLP-Technologie gemäß der Erfindung wurden einzigartige Assay-Systeme entwickelt, die auf zellartigen Partikeln basieren, wodurch eine native zelluläre Umgebung bereitgestellt wird, die Fallgruben von zellulären Assays aber vermieden werden. Aus Zellen freigesetzte VLPs enthalten z. B. funktionelle GPCRs, die in eine Zellmembran integriert sind. VLPs, die klein, ziemlich homogene Partikel sind, deren Verhalten demjenigen von individuellen Molekülen ähnlich ist, sind eine perfekte biologische Entsprechung für vorzugsweise konfokale Einzelmolekül-Nachweisprogramme. Ein VLP trägt bis zu 100 Moleküle eines Ziels – wie ein spezifisches GPCR –, was eine gleichzeitige Anreicherung des entsprechenden Ziels und eine Verstärkung der Ablesung ergibt. VLPs sind ein Mittel für die Einstufen-Herstellung, Konzentration und Reinigung eines Ziels und fungieren zusätzlich dazu als stabiles Speicherungssystem. Die VLP-Technologie stellt eine bisher unbekannte Geschwindigkeit der Anpassung von Assays auf Zellbasis für das Screening bereit. Diese Geschwindigkeit, die mit derjenigen vergleichbar ist, die typischerweise mit einem löslichen Rezeptor oder biochemischen Assays erreicht wird, ist mit einer verbesserten Robustheit und Genauigkeit der gebildeten Daten verbunden.
Vorteile der VLP-Assay-Technologie gemäß der vorliegenden Erfindung sind die Folgenden:

– Kassetten-basierter Assay-Aufbau → schnelle Assay-Entwicklung
– hohe Konzentration an Zielmolekül → erhöhte Ableseintensität
– selektiver Zieleinbau/Zieleinkapselung → geringer Hintergrund und hohe Präzision
– native zelluläre Assay-Umgebung → funktionelle Analyse von Transmembran Rezeptoren wie GPCR
– induzierbare Ziel-VLP-Produktion → Ziel auf Anforderung
– Ziel-Produktion, -Konzentration und -Reinigung in einem einzigen Schritt → schnelle und einfache Assay-Arbeitsweisen
– homogenes Assay-System → Misch-und Mess-Arbeitsweise
– hochempfindlich → großer dynamischer Bereich Mittelwertbildung über eine repräsentative Zellpopulation pro Datenpunkt → geringe Anzahl an falschen Positiven/Negativen
– miniaturisierte Assay-Formate → spart kostbare Verbindungen und Reagenzien
– stabiles Lagerungssystem für Ziele → leichte erneute Durchmusterungsfähigkeit
– Anwendung konfokaler Nachweistechnologien, vorzugsweise Fluoreszenz-Technologien → hohe Leistungsfähigkeit des Screening

Die Technologie hat die Fähigkeit, Proteine physiologisch von ansonsten geringer Konzentration in einer Zelle oder in dem entsprechenden Zellkulturmedium zu konzentrieren und gleichzeitig einen bestimmten interessierenden Molekültyp um Größenordnungen, verglichen mit anderen Zell-Bestandteilen, aus einer ansonsten sehr komplexen Matrix anzureichern.
Schwache oder niedrigaffine Wechselwirkungen zwischen Proteinen oder anderen Molekülen spielen in zellulären Signalvorgängen eine wichtige Rolle. Diese Typen von Wechselwirkungen werden häufig durch die Aufrechterhaltung einer lokal hohen Konzentration der wechselwirkenden Partner in subzellulären Komponenten, Partikeln oder Membrandomänen ermöglicht. Ein Vorteil der Methode gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Erhaltung der lokal hohen in-vivo-Konzentrationen von wechselwirkenden Molekülen während der Freisetzung der virusartigen Partikel in das Zellkulturmedium.
Wenn man annimmt, dass das interessierende Protein in einer Kopienzahl von 1000 pro eukaryotische Zelle exprimiert wird, dann ist deren entsprechende Konzentration in dem Zellvolumen von etwa 1 pI etwa 1 nM. Bei höheren Zelldichten von 1000 Zellen pro μl in dem Medium ist die Konzentration etwa 1 pM in der gesamten Probe. Wenn solche Proteine jedoch auf Teilchen eines Durchmessers von 1000 nm in Kopienzahlen von etwa 100 pro Partikel exprimiert werden, ist ihre lokale Konzentration auf etwa 1 mM erhöht. VLPs, die in das Medium durch Exocytose, Lyse, Knospung oder einen verwandten Mechanismus abgegeben werden, können leicht auf 10 pM konzentriert werden, was bedeutet, dass das interessierende Protein etwa 10 nM ausmacht, gerade so wie die physiologische Konzentration in einer Zelle. Mit der Technologie gemäß der vorliegenden Erfindung können Zielmoleküle wie GPCRs auf der Oberfläche oder in homogenen VLPs konzentriert werden, was eine Signalverstärkung in Bezug auf die Ablesetechniken ergibt (z. B. konfokale Fluoreszenz-Messungen).
Das Verfahren kann auch verwendet werden, um Moleküle mit zellulärer Toxizität anzuzeigen, wie Innenkanäle oder Moleküle mit einer hohen Tendenz zur Aggregation, Denaturierung oder Ausfällung in Erzeugerzellen. Das synthetisierte Produkt wird kontinuierlich aus Zellen exportiert, wodurch die Anhäufung auf Mengen verhindert wird, die für die Zelle toxisch sind.
Die kontinuierliche oder induzierte Produktion dieser VLPs ermöglicht es, kinetische Assays während langen Zeitspannen der In-Vitro-Kultivierung von Zellen durchzuführen.
VLP-Reagenzien oder -Wirkstoffe können leicht und zweckmäßig während langer Zeitspannen ohne messbaren Verlust an biologischer Aktivität aufbewahrt werden.
Die Auswahl von Antikörper-erzeugenden Zellen und die Herstellung von Antikörper- und Fab-erzeugenden VLPs ist gemäß der vorliegenden Erfindung möglich geworden.
Das System kann auf die Untersuchung geregelter Protein-Protein-Wechselwirkungen in Signalübertragungswegen angewendet werden. Signalübertragungswege werden oft durch selektive Protein-Protein-Wechselwirkungen geregelt, die als Ziele für die therapeutische Wechselwirkung angesehen werden könne, wobei die Affinität der Wechselwirkung durch Folgendes geregelt wird:

– Proteininduktion
– selektive Proteasespaltung/differentielle Spaltung
– mRNA-Verarbeitung/Reifung
– Phosphorylierung/Dephosphorylierung
– elektrophysiologische Steuerung
– Myristoylierung, Glycosylierung und andere Modifikationen.

Obwohl es schwierig ist, in innerzelluläre Protein-Protein-Wechselwirkungen einzugreifen, und zwar aufgrund großer Bereiche von Protein-Protein-Wechsel- Wirkungen, können die regelnden Schritte, die die richtige Konstitution und Konformation einer wechselwirkenden Partners ausmachen, Gegenstand einer effektiven therapeutischen Intervention sein, z. B. durch Kinase-Hemmer.
Das hierin beschriebene Verfahren bezieht sich auf ein zellbasiertes funktionelles Assay-System, das die richtige Ausgabe der innerzellulären Protein-Protein-Wechselwirkung angibt. Die effektive Protein-Protein-Wechselwirkung unter physiologischen Bedingungen wird durch VLPs angezeigt. Ein wechselwirkender Partner wird z. B. durch die erfindungsgemäße Technik mit dem Gag-Signalprotein verknüpft. Das voraussichtlich wechselwirkende Protein wird exprimiert und innerzellulär als eine direkte Fusion markiert oder auf einem nichtkovalenten Weg an einem nachweisbaren Marker, z. B. ein fluoreszentes Protein oder Peptid, markiert. Wenn beide Partner oder ein wechselwirkender Partner durch das oben erwähnte regulatorische Modifikationssystem richtig verarbeitet werden, treten beide Proteine physiologisch in Wechselwirkung, werden verpackt und aus der Zelle exportiert. Die Verteilung der Markierung der VLPs oder die Ration von markierten oder nichtmarkierten VLPs gibt einen Hinweis über den Funktionalitätszustand des modifizierenden Zellsystems. Diese Art des Nachweis hat den Vorteil, dass das Signal linear über den Effekt der Regulierung berichtet und den Zustand "einfriert", sobald das VLP in das Medium freigesetzt wird.
Eine Abänderung dieses Nachweissystems kann für den Nachweis von Verarbeitungsschritten für sezernierte Proteine angewendet werden, die nicht eingekapselt werden. Ein Beispiel für ein solches Nachweissystem bezieht sich auf die Sekretion von C-terminal unterschiedlich verarbeiteten Peptiden, wie Aβ40, Aβ42, die durch zwei unterschiedliche Typen von Sekretase-Aktivitäten erzeugt werden. Beide Peptide können N-terminal mit der modifizierten Signalsequenz verknüpft werden, wie sie für Außenmembran-Rezeptoren beschrieben ist, oder mit einem extrazellulären C-Terminus verknüpft werden, der durch ein Protein bereitgestellt wird, das mit einer Signalsequenz verknüpft ist. Mit unterschiedlich markierten Antikörpern, die die zwei C-Termini-Varianten der Aβ-Peptide erkennen, können die freigesetzten VLPs analysiert werden, um die Differenzaktivitäten beide Sekretase-Aktivitäten zu messen.
Die folgenden Zeichnungen bilden einen Teil der vorliegenden Beschreibung und sind eingeschlossen, um weiterhin bestimmte Aspekte der Erfindung zu demonstrieren. Die Erfindung kann unter Bezugnahme auf eine oder mehrere dieser Zeichnungen in Kombination mit der ausführlichen Beschreibung von speziellen, hierin präsentierten Ausführungsformen verstanden werden.
1 ist eine diagrammartige Darstellung des Prinzips von VLP, das aus Wirtszellen durch Knospung austritt. Eine Anordnung von Retroviren erfolgt durch einen Knospungsvorgang an der Zellplasmamembran. Untersuchungen mit verschiedenen Retroviren haben gezeigt, dass das Gag-Polyprotein, das in Abwesenheit von anderen viralen Komponenten exprimiert wird, für die Partikelbildung und die Knospung an der Zelloberfläche selbstgenügsam ist, wie in dieser Figur gezeigt wird. Es wurde berichtet, dass der aminoterminale Bereich des Gag-Vorläufers ein Zielsignal für den Transport zur Zelloberfläche und Membranbindung ist, die für ein Virus-Zusammenfügen notwendig ist.
2 zeigt eine diagrammartige Darstellung des Prinzips der VLP-Einkapselung von Zielmolekülen (Nicht-Membran-assoziiert). Die Spezifität des Einbaus des entsprechenden Zielproteins in das Kapsid der VLPs ist das Ergebnis entweder einer starken spezifischen Wechselwirkung eines molekularen Peptid-Tags, der kovalent an den C-Terminus des Signal Proteins (Gag) gebunden ist, mit einem komplementären spezifischen Peptid-Tag, der mit dem interessierenden Ziel assoziiert ist, oder einer direkten kovalenten Fusion des Gag-Proteins mit dem interessierenden Zielprotein/Peptid. Das Gag-Tag-Fusionsprotein wird in einem Zellsystem mit dem entsprechenden interessierenden Molekül coexprimiert, das auch einen spezifischen Peptid-Tag entweder in dem Molekül oder am N- oder C-Terminus trägt. Die Expression des modifizierten Gag-Proteins in den entsprechenden Wirtszellen ergibt eine Anhäufung des Gag-Proteins an der Plasmamembran aufgrund von Signalen, die in dem N-terminalen Teil des Gag-Proteins vorliegen. Hohe Konzentrationen dieses Proteins an der Plasmamembran ergeben einen Knospungsvorgang, in dem VLPs in das extrazelluläre Milieu freigesetzt werden. Wenn das Zielprotein, das den komplementären Tag trägt, in der gleichen Zelle exprimiert wird und in den intrazellulären Kompartimenten konzentriert wird, dann ergibt die spezifische Wechselwirkung mit dem markierten Gag-Protein den gemeinsamen Transport des Ziels zur Plasmamembran und den anschließenden Einbau in die freigesetzten VLPs.
3 zeigt eine diagrammartige Darstellung des Prinzips der VLP-Anzeige für Zielmoleküle, die mit der Plasmamembran assoziiert sind (in diesem Fall G-Protein-gekopplete Rezeptoren). Die Spezifität des Einbaus des entsprechenden Zielproteins in die Hülle der VLPs ist das Ergebnis entweder einer starken spezifischen Wechselwirkung eines molekularen Peptid-Tags, der an den C-Terminus des Signal Proteins (Gag) kovalent gebunden ist, mit einem komplementären spezifischen Peptid-Tag, der mit dem interessierenden Ziel assoziiert ist, oder der direkten kovalenten Fusion des Gag-Proteins mit dem interessierenden Zielprotein/Peptid. Das Gag-Fusionsprotein wird in einem Zellsystem mit dem entsprechenden interessierenden Molekül coexprimiert, das auch einen spezifischen Peptid-Tag entweder im Molekül oder an dem N- oder C-Terminus trägt. Die Expression des modifizierten Gag-Proteins in den entsprechenden Wirtszellen ergibt eine Anhäufung des Gag-Proteins an der Plasmamembran wegen der Signale, die in dem N-terminalen Anteil des Gag-Proteins vorliegen. Hohe Konzentrationen dieses Proteins an der Plasmamembran ergeben einen Knospungsvorgang, in dem VLPs in das extrazelluläre Milieu freigesetzt werden. Wenn das Zielprotein, das den komplementären Tag trägt, in der gleichen Zelle exprimiert wird und entweder in intrazellulären Kompartiments der Zelle oder vorzugsweise in hoher Konzentration in der Plasmamembran konzentriert wird, dann ergibt die spezifische Wechselwirkung mit dem markierten Gag-Protein den anschließenden Einbau in die freigesetzten VLPs.
4 zeigt das Prinzips der VLP-Anzeige für ein Membran-eingebautes Protein, das eine einzige Transmembran-umspannende Domäne enthält, wie durch den humanen epidermalen Wachstumsfaktor(EGF)-Rezeptor (EGFR) veranschaulicht wird. Das Modellsystem verwendet ein Zielmolekül, das ein einziges Trans membran-umspannendes Segment und insbesondere den humanen EGF-Rezeptor enthält, der modifiziert wurde, um eine spezifische superspiralisierte α-Helix-Sequenz am Carboxyl-Terminus des Proteins zu exprimieren, in diesem Fall die K-Spirale. Die Co-Expression eines K-Spiralen-markierten EGF-Rezeptors (Ziel) mit E-Spiralen-markiertem Gag (Signal) in Wirtszellen würde die Freisetzung der VLPs ergeben, die den humanen EGF-Rezeptor enthalten, der in die Membranhülle der entsprechenden Partikel integriert ist.
5 zeigt eine Western-Blut-Analyse des humanen EGF-Rezeptors (EGFR), der auf der Oberfläche von VLPs exprimiert ist, die aus Wirtszellen freigesetzt wurden, welche das markierte Signal und Zielmoleküle coexprimieren. In diesem Versuch wurden Sf9-Zellen 48 Stunden lang mit rekombinantem Virus infiziert, das das Signal-Gag-E-Spiralen-Protein und/oder das Ziel-EGFR-K-Spiralen-Protein exprimiert. Eine konstante Quantität an Virus für das Ziel (EGFR) wurde während des gesamten Versuchs (m. o. i. 10) verwendet und unterschiedliche Mengen an Signal-Gag-Virus wurden zum Co-Infizieren der Zellen (m. o. i. 10-0,1) verwendet. Die Zellkultur-Überstände wurden geerntet, und die VLPs wurden 30 Minuten lang bei 4°C mit 100000 g pelletisiert. Das sich ergebende Pellet wurde erneut in PBS suspendiert, und ein Aliquot wurde auf SDS PAGE abgetrennt und geblottet. Die sich ergebenden Blots wurden mit Antikörpern sondiert, die gegen das Signal (Gag, obere Platte) und das Ziel (EGFR, untere Platte) gerichtet sind. Die Ergebnisse zeigen die Co-Segregation von Gag und EGFR in die freigesetzten VLPs.

Spur Nr. 1. EGFR-K-Spiralen-Virus m. o. i. 10. Gag-E-Spiralen-Virus m. o. i. 10.
Spur Nr. 2. EGFR-K-Spiralen-Virus m. o. i. 10. Gag-E-Spiralen-Virus m. o. i. 5
Spur Nr. 3. EGFR-K-Spiralen-Virus m. o. i. 10. Gag-E-Spiralen-Virus m. o. i. 1.
Spur Nr. 4. EGFR-K-Spiralen-Virus m. o. i. 10. Gag-E-Spiralen-Virus m. o. i. 0,1.
Spur Nr. 5. Gag-E-Spiralen-Virus m. o. i. 10 Spur Nr. 6. EGFR-K-Spiralen-Virus m. o. i. 10

6 zeigt eine Rezeptor-Bindungsanalyse des humanen EGF-Rezeptors, der auf Membranvesikeln und auf der Oberfläche von VLPs exprimiert wird, die aus Wirtszellen freigesetzt sind, welche das markierte Signal und Zielmoleküle coexprimieren. In diesem Versuch wurden SF9-Zellen 48 Stunden lang mit rekombinantem Virus infiziert, das das Signal-Gag-E-Spiralen-Protein und/oder das Ziel-EGFR-K-Spiralen-Protein exprimiert. Eine konstante Quantität an Virus für das Ziel (EGFR) wurde während des gesamten Versuchs (m. o. i. 10) verwendet und unterschiedliche Mengen an Signal-Gag-Virus wurden zum Co-Infizieren der Zellen (m. o. i. 10-0,1) verwendet. Die Zellkultur-Überstände wurden geerntet, und die VLPs wurden 30 Minuten lang bei 4°C mit 100000 g pelletisiert. Das sich ergebende Pellet wurde erneut in PBS suspendiert, und ein Aliquot wurde auf die Bindung von TAMRA-markiertem EGF analysiert. Der Ligand TAMRA-markiertes EGF (L) wurde mit aus A431-Zellen hergestellten Vesikeln (V) oder mit VLPs, die aus Sf9-Zellen stammen, die Gag-E-Spirale und den mit K-Spirale markierten EGF-Rezeptor coexprimieren, in Gegenwart oder Abwesenheit von 1 μM EGF inkubiert (C). Der an Vesikel oder VLPs gebundene fluoreszente Ligand wurde durch FIDA analysiert (Einzelheiten bei Materialien und Methoden). Die Ergebnisse zeigen die Expression von funktionellen EGF-Rezeptormolekülen auf der Oberfläche der freigesetzten VLPs. Der Einschub zeigt die Ergebnisse des EGFR-Bindungsassays unter Verwendung der Vesikel-Herstellung aus den A431-Zellen, wie in 1–3 in diesem Diagramm gezeigt ist, aber auf einer unterschiedlichen Skala für Prozent (%) an gebundenem Ligand ausgedrückt ist.

Nr. 1: L		+V
Nr. 2: L	+C	+V
Nr. 3: L
Nr. 4: L		+VLP (vergleiche Fig. 5, Spur 2)
Nr. 5: L	+C	+VLP (vergleiche Fig. 5, Spur 2)
Nr. 6: L		+VLP (vergleiche Fig. 5, Spur 4)
Nr. 7: L	+C	+VLP (vergleiche Fig. 5, Spur 4)
Nr. 8: L		+VLP (vergleiche Fig. 5, Spur 5)
Nr. 9: L	+C	+VLP (vergleiche Fig. 5, Spur 5)
Nr. 10: L		(siehe Nr. 3)

7 zeigt eine VLP-Anzeige-Strategie für ein Membran-eingebautes Protein, das mehrere Transmembran-umspanende Domänen enthält, wie durch den humanen Endothelin-A-Rezeptor veranschaulicht wird. Das Modellsystem verwendet ein Zielmolekül, das mehrere Transmembran-umspanende Segmente und insbesondere den humanen Endothelin-A-Rezeptors (ET_A-Rezeptor) als Vertreter der G-Protein-gekoppelten Rezeptorfamilie (GPCR) enthält, der modifiziert wurde, um eine spezifische superspiralisierte α-Helix-Sequenz am Carboxyl-Terminus des Proteins zu exprimieren, in diesem Fall die E-Spirale. Die Coexpression eines E-Spiralen-markierten ET_A-Rezeptors (Ziel) mit K-Spiralen-markiertem Gag (Signal) in Wirtszellen würde die Freisetzung von VLPS ergeben, die den humanen ET_A-Rezeptor enthalten, der in die Membranhülle der entsprechenden Partikel integriert ist.
8 zeigt eine Western-Blot-Analyse des humanen Endothelin-A-Rezeptors, der auf der Oberfläche von VLPS exprimiert ist, die aus Wirtszellen freigesetzt wurden, die das markierte Signal und Zielmoleküle coexprimieren. In diesem Versuch wurden Sf9-Zellen 48 Stunden lang mit rekombinantem Virus infiziert, das das Signal-Gag-K-Spiral-Protein und/oder das Ziel-ET_A-Rezeptor-E-Spiralen-Protein exprimiert. Eine konstante Quantität an Virus für das Ziel (ET_A-Rezeptor) wurde während des gesamten Versuchs (m. o. i. 10) verwendet und unterschiedliche Mengen an Signal-Gag-Virus wurden zum Co-Infizieren der Zellen (m. o. i. 10-0,1) verwendet. Die Zellkultur-Überstände wurden geerntet, und die VLPS wurden 30 Minuten lang bei 4°C mit 100000 g pelletisiert. Das sich ergebende Pellet wurde erneut in PBS suspendiert, und ein Aliquot wurde auf SDS PAGE abgetrennt und geblottet. Die sich ergebenden Blots wurden mit Antikörpern sondiert, die gegen das Signal (Gag, untere Platte) und das Ziel (ET_A-Rezeptor, obere Platte) gerichtet sind. Die Ergebnisse zeigen die Co-Segregation von Gag und ET_A-Rezeptor in die freigesetzten VLPs.

Spur Nr. 1: ET_A-Rezeptor-E-Spiralen(Klon Nr. 18)-Virus m. o. i. 10 Gag-K-Spiralen-Virus m. o. i. 10
Spur Nr. 2: ET_A-Rezeptor-E-Spiralen(Klon Nr. 18)-Virus m. o. i. 10 Gag-K-Spiralen-Virus m. o. i. 5
Spur Nr. 3: ET_A-Rezeptor-E-Spiralen(Klon Nr. 18)-Virus m. o. i. 10 Gag-K-Spiralen-Virus m. o. i. 1
Spur Nr. 4: ET_A-Rezeptor-E-Spiralen(Klon Nr. 18)-Virus m. o. i. 10 Gag-K-Spiralen-Virus m. o. i. 0,1
Spur Nr. 5: Gag-K-Spiralen-Virus m. o. i. 10
Spur Nr. 6: ET_A-Rezeptor-E-Spiralen(Klon Nr. 18)-Virus m. o. i. 10
Spur Nr. 7: ET_A-Rezeptor-E-Spiralen(Klon Nr. 20)-Virus m. o. i. 10 Gag-K-Spiralen-Virus m. o. i. 10
Spur Nr. 8: ET_A-Rezeptor-E-Spiralen(Klon Nr. 20)-Virus m. o. i. 10 Gag-K-Spiralen-Virus m. o. i. 5
Spur Nr. 9: ET_A-Rezeptor-E-Spiralen(Klon Nr. 20)-Virus m. o. i. 10 Gag-K-Spiralen-Virus m. o. i. 1
Spur Nr. 10: ET_A-Rezeptor-E-Spiralen(Klon Nr. 20)-Virus m. o. i. 10 Gag-K-Spiralen-Virus m. o. i. 0,1
Spur Nr. 11 Gag-K-Spiralen-Virus m. o. i. 10
Spur Nr. 12: ET_A-Rezeptor-E-Spiralen(Klon Nr. 20)-Virus m. o. i. 10

9 zeigt eine Rezeptor-Bindungsanalyse des humanen ET_A, das auf Membranvesikeln und auf der Oberfläche von VLPs exprimiert ist, die aus Wirtszellen freigesetzt wurden, welche das markierte Signal und Zielmolekül coexprimieren.

In diesem Versuch wurden SF9-Zellen 48 Stunden lang mit rekombinantem Virus infiziert, das das Signal-Gag-K-Spiralen-Protein und/oder das Ziel-ET_A-Rezeptor-E-Spiralen-Protein exprimiert. Eine konstante Quantität an Virus für das Ziel (ET_A-Rezeptor) wurde während des gesamten Versuchs (m. o. i. 10) verwendet und unterschiedliche Mengen an Signal-Gag-Virus wurden zum Co-Infizieren der Zellen (m. o. i. 10-0,1) verwendet. Die Zellkultur-Überstände wurden geerntet, und die VLPs wurden 30 Minuten lang bei 4°C mit 100000 g pelletisiert. Das sich ergebende Pellet wurde erneut in PBS suspendiert, und ein Aliquot wurde auf die Bindung von TAMRA-markiertem Endothelin-1 analysiert. Der Ligand TAMRA-markiertes Endothelin-1 (L) wurde mit Vesikeln (V), die aus rekombinanten CHO-Zellen hergestellt wurden, welche den ET_A-Rezeptor exprimieren, oder mit VLPs, die aus Sf9-Zellen stammen, die Gag-K-Spirale und den mit der Flag und E-Spirale markierten ET_A-Rezeptor coexprimieren, in Gegenwart oder Abwesenheit von 1 μM Endothelin-1 inkubiert (C). Der an Vesikel oder VLPs gebundene fluoreszente Ligand wurde durch FIDA analysiert (Einzelheiten bei Materialien und Methoden). Der Einschub zeigt die Vesikel-basierte Bindungsanalyse, die auf einer unterschiedlichen Skala dargestellt ist, in Bezug auf den Prozentgehalt an gebundenem Ligand. Die Daten entsprechen den Proben 1–3 auf den großen Diagramm. Die Ergebnisse zeigen die Expression von funktionellen ET_A-Rezeptormolekülen auf der Oberfläche der freigesetzten VLPs.

Nr. 1: L		+V
Nr. 2: L	+C	+V
Nr. 3: L
Nr. 4: L		+VLP (vergleiche Fig. 8, Spur 1)
Nr. 5: L	+C	+VLP (vergleiche Fig. 8, Spur 1)
Nr. 6: L		+VLP (vergleiche Fig. 8, Spur 2)
Nr. 7: L	+C	+VLP (vergleiche Fig. 8, Spur 2)
Nr. 8: L		+VLP (vergleiche Fig. 8, Spur 5)
Nr. 9: L	+C	+VLP (vergleiche Fig. 8, Spur 5)

10 zeigt die Spezifität des humanen ET_A-Rezeptors auf Membranvesikeln und VLPs. TAMRA-markiertes Endothelin-1 (L) wurde mit VLPs, die aus SF9-Zellen stammen, die Gag-K-Spirale und den mit E-Spirale markierten ET_A-Rezeptor coexprimieren, in Gegenwart oder Abwesenheit von 1 μM Endothelin-1 (ET-1) oder big-Endothelin-1 (Big ET-1) oder Somatostatin-14 (SRIF-14) inkubiert. Der fluoreszente Ligand, der an Vesikel oder VLPs gebunden ist, wurde durch FIDA analysiert (Einzelheiten unter Materialien und Methoden).

Nr. 1: L		+VLP (vergleiche Fig. 8, Spur 1)
Nr. 2: L	+ET-1	+VLP (vergleiche Fig. 8, Spur 1)
Nr. 3: L	+Big ET-1	+VLP (vergleiche Fig. 8, Spur 1)
Nr. 4: L	+SRIF-14	+VLP (vergleiche Fig. 8, Spur 1)
Nr. 5: L		+VLP (vergleiche Fig. 8, Spur 2)
Nr. 6: L	+ET-1	+VLP (vergleiche Fig. 8, Spur 2)
Nr. 7: L	+Big ET-1	+VLP (vergleiche Fig. 8, Spur 2)
Nr. 8: L	+SRIF-14	+VLP (vergleiche Fig. 8, Spur 2)
Nr. 9: L		+VLP (vergleiche Fig. 8, Spur 5)
Nr. 10: L	+ET-1	+VLP (vergleiche Fig. 8, Spur 5)
Nr. 11: L	+Big ET-1	+VLP (vergleiche Fig. 8, Spur 5)
Nr. 12: L	+SRIF-14	+VLP (vergleiche Fig. 8, Spur 5)

11 zeigt die VLP-Einkapselung eines Nicht-Membran-assoziierten Ziels für Proteine, die im Cytoplasma gefunden werden, wie durch das EGFP-Molekül (Enhanced GFP molecule) veranschaulicht wird. Das Modellsystem verwendet ein Zielmolekül, das als lösliches Molekül im Cytoplasma von Zellen gefunden wird und nicht auf natürliche Weise mit Membranen assoziiert ist, insbesondere das EGFP-Molekül, das modifiziert wurde, um eine spezifische superspiralisierte α-Helix-Sequenz am Carboxyl-Terminus des Proteins zu exprimieren, in diesem Fall die E-Spirale. Die Coexpression eines E-Spiralen-markierten EGFP (Ziel) mit einem K-Spiralen-markierten Gag (Signal) in Wirtszellen würde die Freisetzung von VLPs ergeben, die das EGFP-Molekül, eingekapselt in der Kapsidstruktur der entsprechenden Partikel, enthalten.
12 zeigt eine Western-Blot-Analyse von EGFP, das in dem Kapsid von VLPS exprimiert wurde, welche aus Wirtszellen freigesetzt wurden, die das markierte Signal und Zielmoleküle coexprimieren. In diesem Versuch wurden Sf9-Zellen 48 Stunden lang mit rekombinantem Virus infiziert, das das Signal-Gag-K-Spiral-Protein und/oder das Ziel-EGFP-E-Spiralen-Protein exprimiert. Eine konstante Quantität an Virus für das Ziel (EGFP) wurde während des gesamten Versuchs (m. o. i. 10) verwendet und unterschiedliche Mengen an Signal-Gag-Virus wurden zum Co-Infizieren der Zellen (m. o. i. 10-0,1) verwendet. Die Zellkultur-Überstände wurden geerntet, und die VLPs wurden 30 Minuten lang bei 4°C mit 100000 g pelletisiert. Das sich ergebende Pellet wurde erneut in PBS suspendiert, und ein Aliquot wurde auf SDS PAGE abgetrennt und geblottet. Die sich ergebenden Blots wurden mit Antikörpern sondiert, die gegen das Signal (Gag) und das Ziel (EGFP) gerichtet sind. Die Ergebnisse zeigen die Co-Segregation von Gag und EGFP in die freigesetzten VLPs.

Spur Nr.1: EGFP-E-Spiralen-Virus m. o. i. 10 Gag-K-Spiralen-Virus m. o. i. 10
Spur Nr. 2: EGFP-E-Spiralen-Virus m. o. i. 10 Gag-K-Spiralen-Virus m. o. i. 5
Spur Nr. 3: EGFP-E-Spiralen-Virus m. o. i. 10 Gag-K-Spiralen-Virus m. o. i. 2,5
Spur Nr. 4: EGFP-E-Spiralen-Virus m. o. i. 10 Gag-K-Spiralen-Virus m. o. i. 1
Spur Nr. 5: EGFP-E-Spiralen-Virus m. o. i. 10 Gag-K-Spiralen-Virus m. o. i. 0,1
Spur Nr. 6: EGFP-E-Spiralen-Virus m. o. i. 10
Spur Nr. 7: Gag-K-Spiralen-Virus m. o. i. 10

13 zeigt den FIDA-Nachweis und die quantitative Analyse von fluoreszenten VLPS, die aus Wirtszellen freigesetzt wurden, die das markierte Signal und Zielmoleküle coexprimieren. In diesem Versuch wurden Sf9-Zellen 48 Stunden lang mit rekombinantem Virus infiziert, das das Signal-Gag-K-Spiral-Protein und/oder das Ziel-EGFP-E-Spiralen-Protein exprimiert. Eine konstante Quantität an Virus für das Ziel (EGFP) wurde während des gesamten Versuchs (m. o. i. 10) verwendet und unterschiedliche Mengen an Signal-Gag-Virus wurden zum Co-Infizieren der Zellen (m. o. i. 10-0,1) verwendet. Die Zellkultur-Überstände wurden durch Filtration geerntet (0,45 μm), und die VLPs wurden 30 Minuten lang bei 4°C mit 100000 g pelletisiert. Das sich ergebende Pellet wurde erneut in PBS suspendiert, und die Mischung wurde durch FIDA (Einzelheiten unter Materialien und Methoden) analysiert. Die VLP-Präparate wurden mit dem Medium verdünnt, aus dem sie pelletisiert wurden (VLP-Überstand). Eine relative Anzahl von Partikeln wurde bestimmt, die der Anzahl der VLP-Partikel in Suspension entspricht.

Nr. 1: unverdünnte VLP-Suspension
Nr. 2: 9 Vol. VLP-Suspension + 1 Vol. VLP-Überstand
Nr. 3: 8 Vol. VLP-Suspension + 2 Vol. VLP-Oberstand
Nr. 4: 7 Vol. VLP-Suspension + 3 Vol. VLP-Überstand
Nr. 5: 6 Vol. VLP-Suspension + 4 Vol. VLP-Überstand
Nr. 6: 5 Vol. VLP-Suspension + 5 Vol. VLP-Überstand
Nr. 7: 4 Vol. VLP-Suspension + 6 Vol. VLP-Überstand
Nr. 8: 3 Vol. VLP-Suspension + 7 Vol. VLP-Überstand
Nr. 9: 2 Vol. VLP-Suspension + 8 Vol. VLP-Überstand
Nr. 10: 1 Vol. VLP-Suspension + 9 Vol. VLP-Überstand
Nr. 11: VLP-Überstand
Nr. 12: steriles Zellkulturmedium

14 zeigt das Prinzip eines VLP-basierten Reporter-Assays zum Nachweis einer Agonist-induzierten Stimulierung eines Rezeptors auf Membranbasis. Die Stimulierung eines Membran-gebundenen Rezeptors oder eines Innenkanals (in dem Diagramm ein GPCR) ergibt die Stimulierung eines zweiten Messenger-Systems, das anschließend diese anregende Information zum Zellkern überträgt. Transkriptionsfaktoren werden aktiviert und binden sich an spezifische DNA-Sequenzen (reagierende Elemente), und dann wird die Transkriptionsaktivierung des entsprechenden Reportergens, das gentechnisch hergestellt wurde, um unter der Kontrolle dieses reagierenden Elements zu stehen, initiiert. Das Translationsprodukt des Reportergens, in diesem Fall ein Gag-EGFP-Fusionsprotein, häuft sich dann in der Zelle und anschließend an der Membranoberfläche der Zelle an. Die Konzentrierung der Gag-EGFP-Fusion an der Plasmamembran induziert die Bildung und Freisetzung von VLPs in das extrazelluläre Medium, wo sie geerntet und anschließend quantifiziert werden können oder wo sie direkt nachgewiesen werden können, z. B. durch konfokale Mikroskopie/Spektroskopie.
15 zeigt den Effekt der Forskolin-induzierten Anhäufung von intrazellulärem cAMP, was die Synthese des Gag-Fusions-Reportergenprodukts ergibt. CHO-Zellen, die mit einem Konstrukt, bestehend aus einem cAMP-reagierenden Element in Verbindung mit einem Thymidinkinasebasal-Promotor (ohne Verstärker), der die Transkription der Reportergenfusion regelt, stabil transfiziert wurden, wurden entweder in Gegenwart oder Abwesenheit von 2 μM Forskolin 24 Stunden lang kultiviert, bevor sie durch Fluoreszenzmikroskopie analysiert wurden. Die obere Reihe jeder Platte stellt die Fluoreszenz dar, die in den Zellen nachweisbar ist, während die untere Reihe in jeder Platte das illuminierte Feld, das durch Fluoreszenz analysiert wurde, darstellt. Jede der Platten stellt eine repräsentative Ansicht aus einer Anzahl von unabhängigen analysierten Kulturen dar.
16 zeigt die FIDA-Analyse des oben demonstrierten Gag-EGFP-Reporter-Assays. CHO-Zellen, die mit einem Konstrukt, bestehend aus einem cAMP-reagierenden Element in Verbindung mit einem Thymidinkinasebasal-Promotor (ohne Verstärker), der die Transkription der Reportergenfusion regelt, stabil transfiziert wurden, wurden entweder in Gegenwart oder Abwesenheit von 2 μM Forskolin 48 Stunden lang kultiviert. Zellkultur-Überstände wurden filtriert (0,45 μm) und durch FIDA analysiert (Einzelheiten unter Materialien und Methoden). Eine relative Anzahl von Partikeln wurde bestimmt, die der Anzahl der VLP-Partikel entspricht, die in das Kulturmedium freigesetzt wurden.

Nr. 1: nicht induziert
Nr. 2: mit 2 μM Forskolin induziert
Nr. 3: nicht induziert
Nr. 4: mit 2 μM Forskolin induziert
Nr. 5: steriles Zellkulturmedium

17 zeigt das Prinzip des VLP-basierten Translokations-Assays. Die Figur beschreibt das Prinzip des Assays, der zur Identifizierung von Sequenzen aus einer Mehrzahl von Sequenzen (cDNA-Bibliothek) verwendet werden kann, die befähigt sind, eine defekte Signalsequenz zu translozieren, die normalerweise die Bildung und Freisetzung von VLPs in das Zellkulturmedium ermöglichen kann. In dem primären Assay-Konzept wird dass defekte Signalmolekül (z. B. Gag, das an der Position zwei nach dem Startkodon mutiert wurde), das nicht befähigt ist, das Signalmolekül zielgerichtet zur Plasmamembran zu lenken, entweder kovalent oder nichtkovalent funktionell mit einem Reportermolekül (in dem Diagramm ein grün-fluoreszierendes Protein) assoziiert. Wenn dieses Hybrid-Molekül aus einem funktionellen Signalmolekül besteht, kann es zur Plasmamembran transloziert werden, und VLPs werden in die extrazelluläre Umgebung freigesetzt, wo sie durch eine Anzahl von Nachweismethoden gemessen und quantifiziert werden können. Wenn das defekte Signalmolekül, das ein Reportermolekülhybrid umfasst, an seinem Amino-Terminus durch Zugabe eines spezifischen Translokationsignals modifiziert wird, das für sezernierte und Membran-assoziierte Polyurethane spezifisch ist, dann wird dieser Translokationsdefekt reduziert und VLPs werden in das extrazelluläre Medium freigesetzt.
18 zeigt das Prinzip des VLP-basierten Protein-Protein-Wechselwirkungs-Assays. Das Diagramm zeigt das Prinzip dieses Assay-Formats, in dem Protein-Protein-Wechselwirkungen, die in den Zellen erfolgen, überwacht werden können. Im ersten Fall umfasst ein funktionelles Signalmolekül (Gag), das die Bildung und Freisetzung von VLPs in das extrazelluläre Medium induzieren kann – entweder auf kovalente oder nichtkovalente Weise – den ersten Partner der interessierenden Protein-Protein-Wechselwirkung. In dem folgenden Fall wird der zweite Partner der interessierenden Protein-Protein-Wechselwirkung entweder kovalent oder nichtkovalent mit einem Reportermolekül verschmolzen/an demselben befestigt, insbesondere – und wie in dem Diagramm gezeigt wird – einem lumineszenten Protein. Wenn der erste und der zweite Partner in Wechselwirkung treten, dann wird ein diese Moleküle einschließender Komplex gebildet, der dann befähigt ist, VLP-Strukturen zu bilden, die anschließend in die extrazelluläre Umgebung freigesetzt werden, wo sie durch eine Anzahl von Methodologien nachgewiesen und quantifiziert werden können. Zur weiteren Analyse der Protein-Protein-Wechselwirkung in situ, werden zu untersuchende Verbindungen auf die Zellen aufgebracht, und wenn sie befähigt sind, die Plasmamembran zu durchqueren und diese Wechselwirkung zu modifizieren, dann wird die Freisetzung von lumineszenten VLPs in die extrazelluläre Umgebung beeinflusst und kann anschließend quantifiziert werden.
19 zeigt eine Western-Blot-Analyse von Proteinen, die intrazellulär exprimiert wurden, als auch von Proteinen, die in VLPs eingebaut sind, welche aus Wirtszellen freigesetzt wurden, die Signalmoleküle und Zielfusionmoleküle coexprimieren. In diesem Versuch wurden Sf9-Zellen vorübergehend mit Konstrukten transfiziert, die entweder eine Gag-Ras-Fusion, Raf voller Länge oder eine Raf-EGFP-Fusion exprimieren. 96 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellkulturüberstände geerntet, und die VLPs wurden 30 Minuten lang bei 4°C mit 100000 g pelletisiert. Die transfizierten Zellen wurde einmal mit PBS gewaschen, bevor sie in 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% NP40, pH 7,8 and Proteaseinhibitoren 20 Minuten lang auf Eis lysiert wurden. Die lysierten Zellen wurden dann 10 Minuten lang bei 10000 g zentrifugiert, und die lösliche Proteinfraktion wurde dann zur SDS-PAGE-Analyse verwendet. Aliquote entwe der der VLPs oder der löslichen Proteinlysate wurden erneut in 2 × SDS-PAGE-Probepuffer (20 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 20 mM DTT, 2% βME, 10 Glycerin) suspendiert und 1 Minute gekocht, um die Proben zu denaturieren. Proteinproben wurden dann auf 12% SDS-PAGE-Gelen gemäß den molekularbiologischen Standardmethoden abgetrennt. Die sich ergebenden Blots wurde mit Antikörpern sondiert, die gegen die Gag-Ras-Fusion (anti-Ras), das Raf voller Länge (anti-Raf) und die Raf-EGFP-Fusion (anti-GFP) gerichtet sind. Die Ergebnisse zeigen die intrazelluläre Coexpression und Co-Segreagation von Gag-Ras und entweder Raf voller Länge oder der Raf-EGFP-Fusion in den freigesetzten VLPs.
A: Proteinanalyse in Sf9-Ganzzellenlysaten

Spur Nr. 1: Coexpression von Raf voller Länge und Raf-EGFP
Spur Nr. 2: Coexpression von Raf voller Länge, Raf-EGFP und Gag-Ras
Spur Nr. 3: Coexpression von Gag-Ras

B: Proteinanalyse von pelletisiertem VLP, das aus transfizierten Zellen freigesetzt wurde

Spur Nr. 1: VLPs, die aus Zellen freigesetzt wurden, die mit Gag-Ras und Raf transfiziert wurden
Spur Nr. 2: VLPs, die aus Zellen freigesetzt wurden, die mit Gag-Ras und Raf voller Länge transfiziert wurden.

Die Ergebnisse zeigen, dass alle der entsprechenden Proteine intrazellulär in nachweisbaren Mengen exprimiert werden und von korrekter Integrität sind. Zudem bauen VLPs, die nach der Coexpression von Gag-Ras und entweder Raf voller Länge oder der Raf-EGFP-Fusion freigesetzt wurden, die Raf/Reporter-proteine ein, und zwar als Ergebnis der Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen den Raf-Molekülen und dem Gag-Ras-Partner, so dass das Prinzip demonstriert wurde.
20 zeigt das Prinzip des VLP-basierten Zell-Zell-Wechselwirkungsassays. Homologe oder heterologe Wechselwirkungen. Die Figur zeigt das Prinzip, das dieses Assay-Format betont. Die zu untersuchenden interaktiven Zelloberflächenmoleküle werden an die Oberfläche von zwei unterschiedlichen VLP-Polulationen gebunden, wobei man die oben beschriebenen Methodologien verwendet. Die sich ergebenden zwei Populationen, die die interessierenden funktionellen Moleküle tragen, werden dann in vorher definierten Verhältnissen vermischt und in Wechselwirkung treten gelassen. Wenn die Wechselwirkung spezifisch ist, dann bilden sich Aggregate, die von nicht-aggregierten VLP-Populationen unterschieden werden können. Verbindungen, die in diese Ziel-Wechselwirkungen eingreifen, werden dann zur Mischung gegeben, und die Dissoziation der Aggregate, verglichen mit Kontrollen, wird dann durch eine Vielfalt von Methodologien quantifiziert, was einen Hinweis auf die Ziel-Ziel-Hemmung gibt.
21 zeigt eine Gesamtübersicht der auf VLP-basierenden Assay-Technologien. Übersicht der Anwendungen für Technologien, die in den vorhergehenden Assay-Formaten beschrieben wurden. Oben beschriebene Assays oder Varianten davon sind in diesem Diagramm aufgeführt, und das entsprechende verwendete VLP-System ist auch symbolisch entweder durch Einbau in die Lipidhülle des freigesetzten VLP (1–3) oder durch Einkapselung in dem freigesetzten VLP (4–6) dargestellt. Assay-Format 1 stellt eine Wechselwirkung von Zelloberfläche-Verbindung dar (wo das Zelloberflächenmolekül ein Rezeptor oder ein Innenkanal sein kann und das Ziel ist), in der das Ziel in die Lipid-Hüllmembran des reifen VLP analog zu seiner normalen Stelle in der Zellplasmamembran eingebaut wird. Die Verbindungen können als externe Moleküle entweder synthetischen Ursprungs oder natürlichen Ursprungs dargestellt werden, die entweder aus Zell/Gewebe-Extrakten oder Molekülen erhalten werden, die aus natürlichen Quellen sezerniert werden. Weiterhin kann die Freisetzung solcher VLPs in das extrazelluläre Medium auch durch die Stimulierung entweder externer Verbindungen oder durch Paracrin- und/oder Autocrin-regelnde Mechanismen vermittelt werden. Zell-Zell-Wechselwirkungen, wie in (2) dargestellt, können unter Verwendung zweier unabhängiger VLP-Präparate, die die interessierenden Zell oberflächenmoleküle tragen (Rezeptor-Ligand, sowohl homologe als auch heterologe Adhäsionsmolekül-Wechselwirkung), analysiert werden. Der Sekretionweg kann auch mit einem auf VLP basierenden Assay (2) analysiert werden, in dem die Einkapselung einer Zielsignalfusion, die zum Retten eines defekten Zielmoleküls befähigt ist, die Bildung und Freisetzung von nachweisbaren VLPs in das extrazelluläre Medium ergibt. Protein-Protein-Wechselwirkungen (3) bilden die Basis eines weiteren auf VLP basierenden Systems, in dem die positive Wechselwirkung von unbekannten/unbekannten, Polypeptid/Peptid-Domänen die Co-Lokalisierung eines Signals und eines Reportermoleküls und die anschließende Freisetzung von chimären nachweisbaren VLPs in das extrazelluläre Medium ergibt. Eine weitere Variation dieses Assays ist die Analyse von Post-Transkriptions/Post-Translations-Assays, in denen die Protein-Protein-Wechselwirkung für ein effizientes Funktionieren wesentlich ist (4–5). In einem weiteren Assay-Format wird eine Signal-Reporter-Fusion, wenn sie unter der Kontrolle eines reagierenden DNA-Elements, z. B. CRE oder ERE, steht, als Antwort auf ein Signal synthetisiert, das dieses Element beeinflusst (Erhöhung der Transkription, verglichen mit nicht-stimulierten Zellen). Die Transkription und anschließende Translation ergibt die Bildung (nach der Einkapselung) und Freisetzung von nachweisbaren VLPs (4). Die abschließende Einkapselung von aktiven Enzymen in VLPs ergibt ein homogenes Präparat von Membran-umhülltem aktiven Protein, dessen Aktivität zu Verbindungen bestimmt werden kann, die nicht nur diese Aktivität beeinflussen können, sondern auch biologische Membranbarrieren durchqueren können.
22 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Dieses Assay-System kann zur Identifizierung von Genprodukten verwendet werden, die in Protein-Protein-Wechselwirkungen in der Zelle eingreifen. Vor der Zugabe der cDNA-Bibliothek exprimiert eine transformierte Zelle die Konstrukte, in denen das Signalmolekül ein kovalent oder nichtkovalent verknüpftes primäres Proteinmolekül der Wahl umfasst, und das Reportermolekül wird mit dem zweiten Proteinmolekül der Wahl kovalent oder nichtkovalent verknüpft. Die Wechselwirkung dieser Proteine ergibt die Freisetzung von nachweisbaren VLPs. Durch Transfektion der Zelle mit einem einzigen oder mehreren cDNA- Molekülen, die zur Expression eines dritten Proteinprodukts befähigt sind, beeinflusst dann dieses zusätzliche Proteinprodukt, wenn es zur Wechselwirkung mit einem der primären oder sekundären Proteinmoleküle befähigt ist, die Freisetzung von nachweisbaren VLPs. Auf diese Weise können Moleküle, die diese Wechselwirkung zwischen dem ersten und zweiten Proteinmolekül beeinflussen können, identifiziert werden. Diese Moleküle können nur in die Bindung zwischen dem ersten und zweiten Proteinmolekül eingreifen, oder sie können sogar neue Bindungspartner für das erste oder das zweite Proteinmolekül darstellen. In diesem Modell ist eine Anzahl von Szenarien eingeschlossen:

a) Die eingeführte cDNA kodiert für ein Protein, das mit dem Proteinmolekül in Wechselwirkung tritt, das mit dem Reportermolekül fusioniert ist, sodass die Wechselwirkung zwischen der Signalfusion und der Reporterfusion gehemmt wird. Das Ergebnis besteht darin, dass VLPs freigesetzt werden, die kein Reportermolekül tragen. Trotzdem können diese VLPs von VLPS unterschieden werden, die das Reportermolekül tragen.
b) Die eingeführte cDNA kodiert für ein Protein, das mit dem untersuchten Proteinmolekül in Wechselwirkung tritt, welches in einem Signalmolekül enthalten ist, wodurch die Wechselwirkung zwischen der Reporterfusion und der Signalfusion gehemmt wird. Das Ergebnis besteht darin, dass VLPs freigesetzt werden, die kein Reportermolekül tragen, aber das eingeführte Genprodukt dieser cDNA einkapseln, dessen Vorliegen oder Aktivität direkt in der freigesetzten Population von VLPs geprüft werden kann. Diese VLPs können auch von VLPS unterschieden werden, die das Reportermolekül tragen.
c) Es gibt keine Wechselwirkung zwischen dem eingeführten cDNA-Produkt und den Signal- oder Reporterfusionsprodukten. Somit wird die Freisetzung von VLPs, die einen nachweisbaren Reporter tragen, nicht behindert.

23 zeigt eine andere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Dieses Assay-System ermöglicht die Identifizierung von Genprodukten, die in Signalkaskaden in der Zelle eingreifen. Eine transformierte Zelllinie exprimiert ein Reporterkonstrukt unter der Kontrolle eines spezifischen Promotors. Wenn die Signalkaskade, die mit diesem Reporter verbunden ist, angeregt wird, dann kann die Freisetzung von VLPs überwacht und quantifiziert werden. Die Transfektion solcher Zellen mit einem einzelnen oder mehreren cDNA-Molekülen, die zur Expression eines Proteinsprodukts befähigt sind, ergibt die Beeinflussung der Freisetzung von VLPs in eine stimulierte Zelle, wenn dieses zusätzliche Proteinprodukt zur Modulation dieses Signaltranduktionswegs befähigt ist. Unterschiedliche Ausgabe-Szenarien sind möglich:

1. Die Wechselwirkung des eingeführten cDNA-Produkts mit einem Element, das in die durch einen Agonisten stimulierte Signaltranduktionskaskade verwickelt ist, ergibt die Aufhebung der Produktion und Freisetzung nachweisbarer VLPs.
2. Die Wechselwirkung des eingeführten cDNA-Produkts mit einem Element, das in die durch einen Agonisten stimulierte Signalkaskade verwickelt ist, ergibt eine Verstärkung der Produktion und Freisetzung nachweisbarer VLPs.

24 zeigt die Wechselwirkung des eingeführten cDNA-Produkts mit einem Element, das in die Signalkaskade verwickelt ist, in Abwesenheit eines Agonisten. Diese Wechselwirkung ergibt eine Stimulierung der Produktion und Freisetzung von VLPs.
25 zeigt das Prinzip der Komplexierung von Molekülen in virusartigen Partikeln. Die Figur zeigt eine Western-Blot-Analyse des endogenen Gs-α-Proteins, das von den Insektenwirtszellen abgeleitet ist und sich in VLPs findet, die den markierten humanen Endothelin-A-Rezeptor exprimieren und von Wirtszellen, die das markierte Signal- und das Zielmolekül exprimieren, freigesetzt werden. In diesem Experiment wurden Sf9-Zellen 48 Stunden lang mit rekombinantem Virus infiziert, das das Signal-Gag-K-Spiralen-Protein und/oder das Ziel-ETAR-E-Spiralen-Protein exprimiert. Zellen wurden mit einer konstanten Menge an Virus für das Zielmolekül (ETAR) und des Gag-Virus (m. o. i. 5 bzw. 2) infiziert. Die Zellkulturüberstände wurden geerntet, und die VLPs wurden 30 Minuten lang bei 4°C mit 100000 × g sedimentiert. Das resultierende Sediment wurde in PBS resuspendiert, und ein Aliquot wurde mit SDS-PAGE aufgetrennt und durch Blotting auf eine Membran übertragen. Der resultierende Blot wurde mit einem gegen das Insekten-Gs-α-G-Protein gerichteten Antikörper sondiert. Die Ergebnisse beweisen die Cosegregation von Gs-α und ETAR in den freigesetzten VLPs.

Spur Nr. 1. 5 μl sedimentierte ETAR-VLPs
Spur Nr. 2. 10 μl sedimentierte ETAR-VLPs
Spur Nr. 3. 15 μl sedimentierte ETAR-VLPs

Materialien und Methoden
Zellkultur
Sf9-Zellen wurden in Graceschem Insektenmedium mit Ergänzungen and 10% Insektenzellenkultur-zertifiziertem FBS bei 27° in einer feuchten Atmosphäre gezüchtet. Zellen wurden entweder in Kunststoffkulturkolben oder Spinner-Kulturgefäßen unterschiedlicher Größen (50–500 ml Kulturvolumen) unter konstantem Rühren kultiviert. Zellen wurden zu Dichten von 1,2 × 10⁶ Zellen/ml wachsen gelassen, bevor eine Subkultivierung bei einer Anfangsdichte von 5 × 10⁵ Zellen/ml erfolgte. Alternativ dazu wurden die Zellen in serumfreien Insektem-Express-Kulturmedium wie oben kultiviert.
CHO-Zellen wurden in DMEM mit Glutamin (2 mM) und 10% FCS bei 37°C in einer Atmosphäre von 5% CO₂ kultiviert. In Kunststoffkulturgefäßen gezüchtete Zellen wurden unter 80% Konfluenz subkultiviert. CHO-Zellen wurden mit einem Konstrukt transfiziert, in dem fünf Wiederholungssequenzen, die einem CRE (CAMP reagierendes Element) entsprechen, das aus dem humanen Somatostatin-Rezeptor-Promoter stammt, zusammen mit einem basalen Thymidinkinase(TK)-Promoter an 5' zu einem MoMuLV Gag-EGFP-Fusionsgen positioniert wurden. Stabile Zelllinien wurden mit G418 (400 ug/ml) ausgewählt, und individuelle Klone wurden mit Forskolin stimuliert (wie nachstehend beschrieben wird), und fluoreszente Klone (verglichen mit nicht-stimulierten Bedingungen) wurden zur weiteren Untersuchung gesammelt. Die Stimulierung von Zellen mit Forskolin (2 μM) wurde in CHO-formuliertem serumfreien Medium ohne Phenol rot durchgeführt. Zellen wurden durch direkte Fluoreszenz unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops mit entsprechenden Filtern analysiert, um die Fluoreszenz nachzuweisen, die durch stimuliert EGFP emittiert wird. Für den VLP-Nachweis wurden die Zellen während variierender Zeitspannen mit Forskolin stimuliert, und die Zellkulturüberstände wurden entfernt und durch einen 0,45 μm-Filter filtriert, bevor sie direkt durch FIDA (Fluoreszenzintensitätsverteilungsanalyse, wie in EPA 99 112 104.7 und 97 945 816.3 beschrieben ist) analysiert werden.
Vorübergehende Expression in Insektenzellen
Sf9-Zellen wurden zu 2 × 10⁶ in Insektem-Express-serumfreiem Medium in einer 60-mm-Schale ausgesät, und die Zellen wurden 2 bis 3 Minuten lang von einer Seite zur anderen vorsichtig hin- und herbewegt, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Nach dieser Inkubation wiesen die Zellen eine Konfluenz von 50–60% auf. Die Zellen wurden ferner wenigstens 15 Minuten lang ohne Hin- und Herbewegung inkubiert, um zu ermöglichen, dass die Zellen vollständig am Boden der Schale kleben, um eine Monoschicht von Zellen zu bilden.
Zur Herstellung jeder Transfektionsmischung wurde ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenrohr verwendet, und die Reagenzien wurden in der folgenden Reihenfolge zugegeben:
1 ml Insekten-Express-Medium (Biowhittaker Corp.)
Plasmidkonstrukt (1 ug/ul in TE, pH 8) 10 μl (10 μg)
Insectin-Plus^TM Liposomen 20 μl (InVitrogene Corp.)
Die Mischung wurde 10 Sekunden lang gründlich und energisch vermischt und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren gelassen. Nach dieser Periode wurde das Medium sorgfältig von den Zellen entfernt, ohne dass die Monoschicht zerriss, und die gesamte Transfektionsmischung wurde tropfenweise in eine 60-mm-Schale gegeben. Die Schalen wurden 4 Stunden lang bei Raumtemperatur auf einer von einer Seite zur Seite schwingenden Plattform inkubiert. Nach der vierstündigen Inkubationsperiode wurden 1–2 ml Insekten-Express zu jeder 60- mm-Schale gegeben, die dann in einen verschlossenen Kunststoffbeutel mit feuchten Papiertüchern gegeben wurden, um eine Verdampfung zu verhindern, und bei 27°C inkubiert. Zellen wurden an einem spezifischen Zeitpunkt nach der Transfektion geerntet.
Produktion von rekombinantem Baculovirus und Virusstämmen mit hohem Titer
Interessierende Gene (Ziel- und Signalmoleküle) wurden zu mehrfachen Klonierungstellen von Standard-Baculovirus-Transfervektoren kloniert, und rekombinante Viruspopulationen wurden auch zu molekularbiologischen Standardarbeitsweisen ausgewählt. Virusstämme mit hohem Titer wurden durch die Infektion von Sf-9-Kulturen mit einer Zelldichte von 1 × 10⁶ Zellen/ml bei einer Multiplizität der Infektion (m. o. i.) von 0,1 hergestellt. Kulturen wurden 72–96 Stunden lang inkubiert, bevor das Virus durch Zentrifugieren der Zellen mit 500 g zum Entfernen von Zelltrümmern geerntet wurde. Der Virusstamm wurde durch einen 0,45 μm-Filter filtriert und in Aliquoten bei 4°C aufbewahrt. Der Virustiter wurde durch Plaque-Titration auf Sf9-Zellen gemäß dem Standardmethoden bestimmt.
Konstruktion von superspiralisierten α-Helix-markierten Zielmolekülen und Signalmolekülen
Zur Induktion der Wechselwirkung der Ziel- und Signalmoleküle wurden zwei Peptidsequenzen, die zur Bildung von superspiralisierten α-Helix-Strukturen befähigt sind, verwendet, von denen gezeigt wurde, dass sie zur Bildung spezifischer Wechselwirkungen untereinander mit hoher Affinität befähigt sind. Die in Frage kommenden Peptidsequenzen waren wie folgt:

1) _NH2-E-V-S-A-L-E-K-_COOH E-Spirale
2) _NH2-K-V-S-A-L-K-E-_COOH K-Spirale

Diese Heptamere wurden als pentamere Wiederholungsequenzen nach Säuger-Rücktranslation und Konkatamerisation der entsprechenden Nucleotidsequenzen konstruiert.

1) 5'-GAG GTG TCC GCC CTG GAGAAG-3' E-Spirale
2) 5'-AAG GTG TCC GCC CTG AAG GAG-3' K-Spirale

Diese entsprechenden Tags wurden vom Rest des Moleküls durch einen kleinen Glycin-Linker abgetrennt:
E-Spiralen-Tag

_NH2-GGGEVSALEKEVSALEKEVSALEKEVSALEKEVSALEK-_COOH

K-Spiralen-Tag

_NH2-GGGKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKE-_COOH

Oligonucleotide, die der heptameren Sequenz entsprechen, mit einer 51 Sequenz, die dem Glycin-Linker entspricht, wurden konstruiert, und das doppelsträngige reassoziierte Produkt wurde durch molekulare Standardverfahren kloniert, und die Sequenz wurde anschließend durch ds-DNA-Sequenzierung verifiziert. Korrekte Sequenzen wurden dann vergrößert und auf die entsprechenden Ziel- und Signalmoleküle an die 3'-Enden des Moleküls gebunden.
Experimentelle Vorschriften
Beispiel Nr. 1 (Gag-K-Spirale/EGFP-E-Spirale)
Western-Blot-Analyse: Rekombinantes Baculovirus, das das Carboxyl-terminale markierte MoMuLV gag Gen (Gag-K-Spirale, Signalmolekül) enthält, und ein EGFP-Molekül mit Carboxyl-Terminus als Schwanz (EGFP-E-Spirale, Zielmolekül) wurden verwendet, um Sf9-Zellen wie folgt zu infizieren. Die Zellen wurden in 35-mm-Schalen in 2 ml Graceschem Insektenmedium mit Ergänzungen und 10% Insektenzellenkultur-zertifiziertem FBS bei 27°C in einer feuchten Atmosphäre mit einer Dichte von 5 × 10⁵ Zellen/ml plattiert. Nachdem die Zellen anhafteten (eine Stunden bei Raumtemperatur), wurde das Medium entfernt, und beide Viren wurden zu dem entsprechenden m. o. i. in einem Gesamtvolumen von 1 ml gegeben. Zellen wurden 48 Stunden lang bei 27°C in einer feuchten Atmosphäre inkubiert. Zellen wurden so geerntet, dass der Zellkulturüberstand sorgfältig entfernt und 5 Minuten bei 4°C und 1000 g zentrifugiert wurde, um Zellen und Trümmer zu entfernen. Der Überstand wurde dekantiert und durch einen 0,45 μm-Filter filtriert. VLPs wurden durch Zentrifugieren des filtrierten Zellkulturüberstandes mit 100000 g während 30 Minuten bei 4°C konzentriert. Pelletisierte VLPs wurden erneut in PBS suspendiert und bei 4°C aufbewahrt. Die infizierten Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen, bevor sie in 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaClo, 1% NP40, pH 7,8 und Protease-Inhibitoren auf Eis während 20 Minuten lysiert wurden. Die lysierten Zellen wurden dann 10 Minuten lang bei 10000 g zentrifugiert, und die lösliche Proteinfraktion wurden dann für eine SDS-PAGE-Analyse verwendet. Aliquote entweder der VLPs oder der löslichen Proteinlysate wurden erneut in 2 × SDS-PAGE-Probenpuffer (20 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 20 mM DTT, 2% βME, 10% Glycerin) suspendiert und 1 Minute lang gekocht, um die Proben zu denaturieren. Proteinproben wurden dann auf 12% SDS-PAGE-Gelen gemäß molekularbiologischen Standartmethoden abgetrennt. Die abgetrennten Proteine wurden dann unter Verwendung einer halbtrockenen Blotting-Apparatur bei 150 mA während einer Stunde in (48 mM Tris, 39 mM Glycin, 20% Methanol, 0,037% SDS) auf PVDF-Membrane übertragen. Blots wurden dann wie folgt verarbeitet. Die Membranen wurden 1 Stunde in einer Blockierlösung (TEST; 20 mM TRIS-HCl, pH 7,6, 137 mM NaCl, 0,05% TWEEN^TM 20, die 0,1% Casein-Hydrolysat enthält) inkubiert. Nach dieser Inkubation wurden die Filter 5 Minuten lang in TEST gewaschen, bevor die Zugabe von 10 ml Blockierlösung erfolgte, die den primären Antikörper enthält, der entweder gegen das Signalmolekül (Kaninchen anti-Gag, abschließende Verdünnung: 1:1000) oder das Zielmolekül (Kaninchen anti-GFP, abschließende Verdünnung: 1:5000) gerichtet ist. Die Filter wurden in dieser Lösung 1 Stunde lang bei Raumtemperatur unter konstantem Rühren inkubiert, bevor sie dreimal 5 Minuten lang mit TEST gewaschen wurden. Denn wurden 10 ml der Blockierlösung, die den Peroxidase-konjugierten sekundären Antikörper (Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper, konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase, 1:2500) enthält, 1 Stunde lang bei Raumtemperatur unter konstantem Rühren mit der Membran inkubiert, bevor dreimal 5 Minuten lang mit TEST gewaschen wurde. Die Filter wurden dann kurz mit destilliertem Wasser gespült und durch Zugabe von ECL-Nachweisreagenzien 1 und 3 und 3% BSA (Endkonzentration) 60 Sekunden lang entwickelt. Die Filter wurden von der Nachweislösung entfernt und zwischen zwei Papiertüchern getrocknet, bevor sie den ECL-Nachweisfilmen ausgesetzt wurden. Die Stärke des Signals war von der Einwirkungszeit abhängig.
FIDA-Analyse
Quantitative Analysis von fluoreszenten VLPs by FIDA
Der Überstand von Sf-9-Zellen, die Gag-K-Spirale und EGFP-E-Spirale coexprimieren, wurde filtriert (0,45 μm) und direkt für die FIDA-Analyse verwendet (a) oder zentrifugiert (100000 g, 4°C, 30 min), um die VLPs zu ernten (b). Der Überstand wurde entfernt und das Pellet erneut in PBS suspendiert. Vor der FIDA-Analyse wurden die Proben durch Beschallung in Gegenwart von 0,01 (v/v) Tween^TM 20 kurz homogenisiert und mit sterilem Zellkulturmedium (a) bzw. PBS (b) verdünnt, das 0,01% (v/v) Tween^TM enthält. Die VLPs wurden durch FIDA unter Verwendung eines Strahlenscanners, wie er in PCT/EP97/ 03022 offenbart ist, und mit Laserlicht von 488 nm für die Anregung analysiert.
Beispiel Nr. 2 (Gag-E-Spirale/EGFR-K-Spirale)
Western-Blot-Analyse
Rekombinantes Baculovirus, das das Carboxyl-terminale markierte MoMuLV gag Gen (Gag-E-Spirale, Signalmolekül) enthält, und ein EGFR-Molekül mit Carboxyl-Terminus als Schwanz (EGFR-K-Spirale, Zielmolekül) wurden verwendet, um Sf9-Zellen wie folgt zu infizieren. Die Zellen wurden in 35-mm-Schalen in 2 ml Graceschem Insektenmedium mit Ergänzungen und 10% Insektenzellenkulturzertifiziertem FBS bei 27°C in einer feuchten Atmosphäre mit einer Dichte von 5 × 10⁵ Zellen/ml plattiert. Nachdem die Zellen anhafteten (eine Stunden bei Raumtemperatur), wurde das Medium entfernt, und beide Viren wurden zu dem entsprechenden m. o. i. in einem Gesamtvolumen von 1 ml gegeben. Zellen wurden 48 Stunden lang bei 27°C in einer feuchten Atmosphäre inkubiert. Zellen wurden so geerntet, dass der Zellkulturüberstand sorgfältig entfernt und 5 Minuten bei 4°C und 1000 g zentrifugiert wurde, um Zellen und Trümmer zu entfernen. Der Überstand wurde dekantiert und durch einen 0,45 μm-Filter filtriert. VLPs wurden durch Zentrifugieren des filtrierten Zellkulturüberstandes mit 100000 g während 30 Minuten bei 4°C konzentriert. Pelletisierte VLPs wurden erneut in PBS suspendiert und bei 4°C aufbewahrt. Die infizierten Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen, bevor sie in 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% NP40, pH 7,8 und Protease-Inhibitoren auf Eis während 20 Minuten lysiert wurden. Die lysierten Zellen wurden dann 10 Minuten lang bei 10000 g zentrifugiert, und die lösliche Proteinfraktion wurde dann für eine SDS-PAGE-Analyse verwendet. Aliquote entweder der VLPs oder der löslichen Proteinlysate wurden erneut in 2 × SDS-PAGE-Probenpuffer (20 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 20 mM DTT, 2% βME, 10% Glycerin) suspendiert und 1 Minute lang gekocht, um die Proben zu denaturieren. Proteinproben wurden dann auf 12% SDS-PAGE-Gelen gemäß molekularbiologischen Standartmethoden abgetrennt. Die abgetrennten Proteine wurden dann unter Verwendung einer halbtrockenen Blotting-Apparatur bei 150 mA während einer Stunde in (48 mM Tris, 39 mM Glycin, 20% Methanol, 0,037% SDS) auf PVDF-Membrane übertragen. Blots wurden dann wie folgt verarbeitet. Die Membranen wurden 1 Stunde in einer Blockierlösung (TEST; 20 mM TRIS-HCl, pH 7,6, 137 mM NaCl, 0,05% TWEEN^TM 20, die 0,1% Casein-Hydrolysat enthält) inkubiert. Nach dieser Inkubation wurden die Filter 5 Minuten lang in TEST gewaschen, bevor die Zugabe von 10 ml Blockierlösung erfolgte, die den primären Antikörper enthält, der entweder gegen das Signalmolekül (Kaninchen-anti-Gag, abschließende Verdünnung: 1:1000) oder das Zielmolekül (Kaninchen-anti-EGFR, abschließende Verdünnung: 1:1000) gerichtet ist. Die Filter wurden in dieser Lösung 1 Stunde lang bei Raumtemperatur unter konstantem Rühren inkubiert, bevor sie dreimal 5 Minuten lang mit TEST gewaschen wurden. Denn wurden 10 ml der Blockierlösung, die den Peroxidase-konjugierten sekundären Antikörper (Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper, konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase, 1:2500) enthält, 1 Stunde lang bei Raumtemperatur unter konstantem Rühren mit der Membran inkubiert, bevor dreimal 5 Minuten lang mit TEST gewaschen wurde. Die Filter wurden dann kurz mit destilliertem Wasser gespült und durch Zugabe von ECL-Nachweisreagenzien 1 und 2 und 3% BSA (Endkonzentration) 60 Sekunden lang entwickelt. Die Filter wurden von der Nachweislösung entfernt und zwischen zwei Papiertüchern getrocknet, bevor sie den ECL-Nachweisfilmen ausgesetzt wurden. Die Stärke des Signals war von der Einwirkungszeit abhängig.
FIDA-Analyse
EGF-Rezeptorbindungsassay und FIDA-Analyse
5 nM TAMRA-markiertes EGF wurde mit aus A431-Zellen hergestellten Membranvesikeln oder mit VLPs, die von Sf9-Zellen stammen, welche Gag-E-Spirale und den EGF-Rezeptor, der mit K-Spirale markiert ist, coexprimieren, in Assay-Puffer [20 mM HEPES, 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM MgCl₂, 1,8 mM CaCl₂, 0,35 g/l NaHCO₃, 1 g/l Glucose, 0,01% (w/v) Pluronic^TM F-127, pH 7,4] in Gegenwart oder Abwesenheit von 1 μM nicht-markiertem EGF inkubiert. Nach einer Inkubation von 30 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Mischung unter Verwendung eines Strahlenscanners und mit Laserlicht von 543 nm für die Anregung durch FIDA analysiert.
Beispiel Nr. 3 (Gag-K-Spirale/ET_A-Rezeptor-E-Spirale)
Western-Blot-Analyse
Rekombinantes Baculovirus, das das Carboxyl-terminale markierte MoMuLV gag Gen (Gag-K-Spirale, Signalmolekül) enthält, und ein ET_A-Rezeptormolekül mit Carboxyl-Terminus als Schwanz (ET_A-Rezeptor-E-Spirale, Zielmolekül) wurden verwendet, um Sf9-Zellen wie folgt zu infizieren. Die Zellen wurden in 35-mm-Schalen in 2 ml Graceschem Insektenmedium mit Ergänzungen und 10 Insektenzellenkultur-zertifiziertem FBS bei 27°C in einer feuchten Atmosphäre mit einer Dichte von 5 × 10⁵ Zellen/ml plattiert. Nachdem die Zellen anhafteten (eine Stunden bei Raumtemperatur), wurde das Medium entfernt, und beide Viren wurden zu dem entsprechenden m. o. i. in einem Gesamtvolumen von 1 ml gegeben. Zellen wurden 48 Stunden lang bei 27°C in einer feuchten Atmosphäre inkubiert. Zellen wurden so geerntet, dass der Zellkulturüberstand sorgfältig entfernt und 5 Minuten bei 4°C und 1000 g zentrifugiert wurde, um Zellen und Trümmer zu entfernen. Der Überstand wurde dekantiert und durch einen 0,45 μm-Filter filtriert. VLPs wurden durch Zentrifugieren des filtrierten Zellkulturüberstandes mit 100000 g während 30 Minuten bei 4°C konzentriert. Pelletisierte VLPs wurden erneut in PBS suspendiert und bei 4°C aufbewahrt. Die infizierten Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen, bevor sie in 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% NP40, pH 7,8 und Protease-Inhibitoren auf Eis während 20 Minuten lysiert wurden. Die lysierten Zellen wurden dann 10 Minuten lang bei 10000 g zentrifugiert, und die lösliche Proteinfraktion wurde dann für eine SDS-PAGE-Analyse verwendet. Aliquote entweder der VLPs oder der löslichen Proteinlysate wurden erneut in 2 × SDS-PAGE-Probenpuffer (20 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 20 mM DTT, 2% βME, 10% Glycerin) suspendiert und 1 Minute lang gekocht, um die Proben zu denaturieren. Proteinproben wurden dann auf 12% SDS-PAGE-Gelen gemäß molekularbiologischen Standartmethoden abgetrennt. Die abgetrennten Proteine wurden dann unter Verwendung einer halbtrockenen Blotting-Apparatur bei 150 mA während einer Stunde in (48 mM Tris, 39 mM Glycin, 20% Methanol, 0,037% SDS) auf PVDF-Membrane übertragen. Blots wurden dann wie folgt verarbeitet. Die Membranen wurden 1 Stunde in einer Blockierlösung (TEST; 20 mM TRIS-HCl, pH 7,6, 137 mM NaCl, 0,05% TWEEN^TM 20, die 0,1% Casein-Hydrolysat enthält) inkubiert. Nach dieser Inkubation wurden die Filter 5 Minuten lang in TEST gewaschen, bevor die Zugabe von 10 ml Blockierlösung erfolgte, die den primären Antikörper enthält, der entweder gegen das Signalmolekül (Kaninchen-anti-Gag, abschließende Verdünnung: 1:1000) oder das Zielmolekül (Kaninchen-anti-ET_A-Rezeptor, abschließende Verdünnung: 1:1000) gerichtet ist. Die Filter wurden in dieser Lösung 1 Stunde lang bei Raumtemperatur unter konstantem Rühren inkubiert, bevor sie dreimal 5 Minuten lang mit TEST gewaschen wurden. Denn wurden 10 ml der Blockierlösung, die den Peroxidase-konjugierten sekundären Antikörper (Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper, konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase, 1:2500) enthält, 1 Stunde lang bei Raumtemperatur unter konstantem Rühren mit der Membran inkubiert, bevor dreimal 5 Minuten lang mit TEST gewaschen wurde. Die Filter wurden dann kurz mit destilliertem Wasser gespült und durch Zugabe von ECL-Nachweisreagenzien 1 und 2 und 3% BSA (Endkonzentration) 60 Sekunden lang entwickelt. Die Filter wurden von der Nachweislösung entfernt und zwischen zwei Papiertüchern getrocknet, bevor sie den ECL-Nachweisfilmen ausgesetzt wurden. Die Stärke des Signals war von der Einwirkungszeit abhängig.
FIDA-Analyse
ET_A-Rezeptorbindungsassay und FIDA-Analyse
2 nM TAMRA-markiertes Endothelin-1 wurde mit Membranvesikeln, die aus den ET_A-Rezeptor exprimierenden rekombinanten CHO-Zellen hergestellt wurden, oder mit VLPs, die von Sf9-Zellen stammen, welche Gag-K-Spirale und den ET_A-Rezeptor, der mit Flag und E-Spirale markiert ist, coexprimieren, in Assay-Puffer [50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM CaCl₂, 0,1% (w/v) BSA, 0,05% Tween^TM 20] in Gegenwart oder Abwesenheit von 1 μM nicht-markiertem Endothelin-1 (konkurrierender Ligand) oder big-Endothelin-1 (nicht-konkurrierender Ligand) oder Somatostatin-14 (nicht-konkurrierender Ligand) inkubiert. Nach einer Inkubation von 30 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Mischung unter Verwendung eines Strahlenscanners und mit Laserlicht von 543 nm für die Anregung durch FIDA analysiert.
Beispiel Nr. 4: Gag-EGFP-Reportersystem
Fluoreszenmikroskopie-Analyse
CHO-Zellen wurden mit einem Konstrukt stabil transfiziert, das das MoMuLV Gag-EGFP-Fusionsgen stromabwärts eines Promoters trägt, der aus einem basalen TK-Promoter besteht, und fünf aufeinanderfolgende CREs, die aus dem humanen Somatostatin-Rezeptor stammen, wurden in DMEM mit Glutamin (2 mM) und 10% FCS und 400 μg/ml G418 bei 37°C in einer CO₂-Atmosphäre von 5% kultiviert. Die Stimulierung der Zellen mit Foskolin (2 μM) wurde in CHO-formuliertem serumfreien Medium ohne Phenolrot durchgeführt. Zellen wurden durch direkte Fluoreszenz unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops mit entsprechenden Filtern analysiert, um Fluoreszenz nachzuweisen, die durch stimuliertes EGFP emittiert wurde. Für den VLP-Nachweis wurden die Zellen während variierender Perioden mit Forskolin stimuliert, und Zellkulturüberstände wurden entfernt und durch ein 0,45-um-Filter filtriert, bevor sie direkt durch FIDA analysiert wurden.
Quantitative Analyse von fluoreszenten VLPs durch FIDA
Der Überstand von CHO-Zellen, die Gag-EGFP-Fusionsgen exprimieren, wurde filtriert (0,45 um) und direkt für die FIDA-Analyse verwendet. Vor der FIDA- Analyse wurden die Proben in Gegenwart von 0,01% (v/v) Tween^TM 20 kurz durch Beschallung homogenisiert. Die VLPs wurden unter Verwendung eines Strahlenscanners und Laserlicht von 488 nm für die Anregung durch FIDA analysiert.
Beispiel Nr. 5: Protein-Protein-Wechselwirkungen: Wechselwirkung von Ras- und Raf-Fusionsproteinen
Sf9-Zellen, die in Insekten-Express-serumfreiem Medium kultiviert wurden, wurden vorübergehend (unter Verwendung eines Transfektionsreagenzes auf Aliposom-Basis, InVitrogen) mit Konstrukten tranfiziert, die entweder die Gag-humane Ras-Fusion, eine humane Volllängen-Raf- oder eine Raf-EGFP-Fusion exprimieren. Nach 96 Stunden wurden die Zellen so geerntet, dass der Zellüberstand sorgfältig entfernt und 5 Minuten bei 4°C und 1000 g zentrifugiert wurde, um Zellen und Trümmer zu entfernen. Der Überstand wurde dekantiert und durch einen 0,45 μm-Filter filtriert. VLPs wurden durch Zentrifugieren des filtrierten Zellkulturüberstandes mit 100000 g während 30 Minuten bei 4°C konzentriert. Pelletisierte VLPs wurden erneut in PBS suspendiert und bei 4°C aufbewahrt. Die infizierten Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen, bevor sie in 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% NP40, pH 7,8 und Protease-Inhibitoren auf Eis während 20 Minuten lysiert wurden. Die lysierten Zellen wurden dann 10 Minuten lang bei 10000 g zentrifugiert, und die lösliche Proteinfraktion wurde dann für eine SDS-PAGE-Analyse verwendet. Aliquote entweder der VLPs oder der löslichen Proteinlysate wurden erneut in 2 × SDS-PAGE-Probenpuffer (20 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 20 mM DTT, 2% βME, 10% Glycerin) suspendiert und 1 Minute lang gekocht, um die Proben zu denaturieren. Proteinproben wurden dann auf 12% SDS-PAGE-Gelen gemäß molekularbiologischen Standartmethoden abgetrennt. Die abgetrennten Proteine wurden dann unter Verwendung einer halbtrockenen Blotting-Apparatur bei 150 mA während einer Stunde in (48 mM Tris, 39 mM Glycin, 20% Methanol, 0,037% SDS) auf PVDF-Membrane übertragen. Blots wurden dann wie folgt verarbeitet. Die Membranen wurden 1 Stunde in einer Blockierlösung (TEST; 20 mM TRIS-HCl, pH 7,6, 137 mM NaCl, 0,05% TWEEN^TM 20, die 0,1% Casein-Hydrolysat enthält) inkubiert. Nach dieser Inkubation wurden die Filter 5 Minuten lang in TEST gewaschen, bevor die Zugabe von 10 ml Blockierlösung erfolgte, die den primären Antikörper enthält, der entweder gegen das Gag-Ras-Fusionsmolekül (Kaninchen-anti-Ras, abschließende Verdünnung: 1:1000), das Raf-Molekül voller Länge (Kaninchen-anti-Raf, abschließende Verdünnung: 1:1000) oder das Raf-EGFP-Fusionsmolekül (Kaninchen-anti-GFP, 1:1000) gerichtet ist. Die Filter wurden in dieser Lösung 1 Stunde lang bei Raumtemperatur unter konstantem Rühren inkubiert, bevor sie dreimal 5 Minuten lang mit TEST gewaschen wurden. Denn wurden 10 ml der Blockierlösung, die den Peroxidase-konjugierten sekundären Antikörper (Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper, konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase, 1:2500) enthält, 1 Stunde lang bei Raumtemperatur unter konstantem Rühren mit der Membran inkubiert, bevor dreimal 5 Minuten lang mit TEST gewaschen wurde. Die Filter wurden dann kurz mit destilliertem Wasser gespült und durch Zugabe von ECL-Nachweisreagenzien 1 und 2 und 3% BSA (Endkonzentration) 60 Sekunden lang entwickelt. Die Filter wurden von der Nachweislösung entfernt und zwischen zwei Papiertüchern getrocknet, bevor sie den ECL-Nachweisfilmen ausgesetzt wurden. Die Stärke des Signals war von der Einwirkungszeit abhängig.
Sequenzprotokoll

Claims

Verfahren zum selektiven Einbauen oder Einkapseln eines proteinartigen Zielmolekülkomplexes, der zwei oder mehr Komponenten umfasst, in einen virusartigen Partikel oder zum physikalischen Assoziieren eines proteinartigen Zielmolekülkomplexes mit einem virusartigen Partikel, indem man Folgendes in Zellen coexprimiert: (i) eine erste Komponente des Zielmolekülkomplexes, wobei die erste Komponente eine erste Aminosäuresequenz und eine zweite Aminosäuresequenz umfasst, wobei die erste Aminosäuresequenz ein Peptid- oder Protein-Tag ist und die zweite Aminosäuresequenz ein Zielprotein ist, das zu dem virusartigen Partikel heterolog ist; und (ii) eine zweite Komponente des Zielmolekülkomplexes; und (iii) Signalmoleküle, die eine erste Aminosäuresequenz und eine zweite Aminosäuresequenz umfassen, wobei die erste Aminosäuresequenz ein Peptid- oder Protein-Tag ist und die zweite Aminosäuresequenz ein Strukturprotein, das von einem gag-Gen von Retroviren codiert wird, oder ein Fragment, Vorläufer oder eine Mutante eines retroviralen Capsidproteins ist, wobei die zweite Aminosäuresequenz den Signalmolekülen die Fähigkeit verleiht, sich zu einem virusartigen Partikel zusammenzufügen und vorzugsweise in eine extrazelluläre Umgebung freigesetzt zu werden; wobei der Peptid- oder Protein-Tag der Signalmoleküle nichtkovalent mit dem Peptid- oder Protein-Tag der ersten Komponente des Zielmolekülkomplexes in Wechselwirkung tritt, so dass der Zielmolekülkomplex in den virusartigen Partikel eingebaut oder eingekapselt oder damit assoziiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die komplexierenden Komponenten des Zielmolekülkomplexes Homodimere oder Heterodimere oder Homooligomere oder Heterooligomere bilden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die virusartigen Partikel durch Exocytose, Lyse oder Knospung durch eine geeignete zelluläre Membran hindurch aus den Zellen freigesetzt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die Knospung durch die Plasmamembran, das Endoplasmatische Retikulum, den Golgi-Apparat oder Zellkernmembranen hindurch erfolgt.
Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 4, wobei der Zielmolekülkomplex Rezeptoren, Innenkanäle, Enzyme, Adhäsionsmoleküle, Komponenten von Membranporen sowie Fragmente oder Derivate oder Untereinheiten oder Untertypen davon umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei der Rezeptor ein cytosolischer Rezeptor oder Zellkernrezeptor ist, der in ein Proteincapsid eines nackten oder umhüllten virusartigen Partikels eingebaut oder eingekapselt oder physikalisch damit assoziiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei der Rezeptor ein Transmembranrezeptor, insbesondere ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor, ist, der durch einen Knospungsvorgang in eine Hülle von virusartigen Partikeln eingebaut wird.
Verfahren gemäß Anspruch 5 bis 7, wobei der Zielmolekülkomplex verschiedene Untertypen eines gegebenen G-Protein-gekoppelten Rezeptors umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 5 bis 8, wobei der Zielmolekülkomplex verschiedene Klassen von G-Protein-gekoppeltem Rezeptor umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 5 bis 9, wobei der Zielmolekülkomplex verschiedene Hilfs-, Neben- oder andere assoziierte Faktoren oder Effektormoleküle, insbesondere G-Proteine, umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 10, wobei der Peptid- oder Protein-Tag der Signalmoleküle durch nichtkovalente Kräfte, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus van-der-Waals-Kräften, elektrostatischen Kräften, Stapelwechselwirkungen, Wasserstoffbrücken und sterischer Passung besteht, mit dem Peptid- oder Protein-Tag der ersten Komponente des Zielmolekülkomplexes in Wechselwirkung tritt.
Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 11, wobei das Signalmolekül durch nichtkovalente physikalische Kräfte mit einer Bindungskonstanten von K_ass ≥ 10^–6 M mit der ersten Komponente des Zielmolekülkomplexes in Wechselwirkung tritt.
Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 12, wobei die Signalmoleküle durch Superspiralen-Peptidwechselwirkungen mit der ersten Komponente des Zielmolekülkomplexes in Wechselwirkung treten.
Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 13, wobei es sich bei dem gag-Gen um Moloney-Maus-Leukämievirus-gag-Pr65 handelt.