DE60033665T2

DE60033665T2 - Gemusterte Polymeroberflächen geeignet für Biokonjugationen und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE60033665T2
Application number: DE60033665T
Authority: DE
Inventors: Holger Klapproth; Gerhard Wagner
Original assignee: TDK Micronas GmbH
Current assignee: TDK Micronas GmbH
Priority date: 2000-10-31
Filing date: 2000-10-31
Publication date: 2007-10-31
Anticipated expiration: 2020-11-01
Also published as: EP1202062B1; AU2002212351A1; WO2002037110A1; ATE355526T1; EP1202062A1; US20040096849A1; JP4205944B2; JP2004513344A; DE60033665D1

Description

Aufgrund der stetig wachsenden Bedeutung von Mikrotechniken in einer breiten Vielfalt von wissenschaftlichen Anwendungen bleibt die Entwicklung von Systemen, die die Wechselwirkung von Molekülen mit Oberflächen ermöglichen, ein entscheidender Punkt. Derartige Wechselwirkungen schließen die Möglichkeit des Entfernens von spezifischen Molekülen aus einer Probe, z.B. zum Erleichtern ihrer Analyse/ihres Nachweises, aber auch das Bilden von Molekülen auf einer Oberfläche ein, wodurch das Stattfinden von anschließenden Reaktionen ermöglicht wird. Diese Prinzipien der Immoblisierung von Molekülen können in Sensor- oder chromatographischen Systemen oder zur Bereitstellung von modifizierten Oberflächen im Allgemeinen angewandt werden.
In den letzten Jahren gab es zahlreiche Vorgehensweisen zum Fertigen von Sensorchips, die auf selbst aufbauenden Monoschichten (SAM's) von bifunktionellen Molekülen (so genannten Linkern) basieren, die direkt oder indirekt Probenmoleküle an die Sensoroberfläche kuppeln. Typischerweise tragen diese bifunktionellen Moleküle oder Linker eine Silan- oder Thiol/Disulfideinheit zum Erzielen einer Bindung mit der anorganischen Oberfläche und eine zusätzliche funktionelle Gruppe (z.B. Amino- oder Epoxidgruppen), die mit Probenmolekülen Wechselwirken, die häufig in biologischen Proben in Form eines Oligonukleotids, eines Proteins oder eines Polysaccharids usw. enthalten sind (vgl. z.B. Chrisey, Lee und O'Ferrell in Nucleic Acids Research 1996, Band 24, S. 3031-3039 Gray, Case-Green, Fell, Dobson und Southern in Langmuir 1997, Band 13, S. 2833-2842 und weitere darin angeführte Verweise). Aus technischen Gründen müssen diese Sensorchips des Stands der Technik zum Bemustern ebene Oberflächen aufweisen.
Während die Bildung einer direkten Bindung zwischen der bifunktionellen Verbindung und dem Probenmolekül möglich ist, Wechselwirken die Probenmoleküle nicht unbedingt mit den die Monoschicht bildenden Kupplern. Alternativ dazu können geeignete immobilisierte Biomoleküle selbst als Sonden für den Nachweis von Probenmolekülen wirken. Derartige Sondenmoleküle können gleichermaßen über eine Reaktion mit den freien funktionellen Gruppen der Monoschicht immobilisiert werden. Insbesondere, wenn Biomoleküle als Sondenmoleküle verwendet werden, verbessert deren Gegenwart deutlich die Spezifität der Wechselwirkung der Probenmoleküle mit der modifizierten Oberfläche. Zum Beispiel können die Monoschichten von bifunktionellen Molekülen in Fällen, in welchen die schnelle Analyse einer Probe von DNA-Fragmenten oder -Molekülen erforderlich ist, zuerst mit synthetischen Oligonukleotiden in Kontakt gebracht werden, die folglich immobilisiert werden. Anschließend wird die Hybridisierung von spezifischen Molekülen, wie kompatible Stränge von einer Probe, z.B. über Fluoreszenzmikroskopie, falls farbstoffmarkierte Probenmoleküle verwendet werden, nachgewiesen.
Obwohl diese Techniken für diesen Zweck gut etabliert sind, ist die Anwendung von Standardnachweisverfahren insbesondere in Fällen, in welchen der Oberflächenbereich, der zum Nachweis von einem spezifischen Typ von Probenmolekülen verfügbar ist, eingeschränkt ist, z.B. wenn eine Vielfalt von Molekülen in einem parallelen Prozess zu analysieren ist, problematisch, da die Monoschichten in ihrer Pfropfdichte beschränkt sind. Zum Beispiel mussten, da die Anzahl von hybridisierten Doppelsträngen pro Oberflächeneinheit eines Sensors nicht leicht erhöht werden kann, geeignete Detektoren sehr hohe Anforderungen in Bezug auf deren Empfindlichkeit erfüllen. Folglich kann der minimale Oberflächenbereich auf einem Sensor, der zum Nachweis von einem Oligonukleotidtyp nötig ist, nicht leicht reduziert werden.
Darüberhinaus kann die maximale Dichte, d.h. ein Proben- oder Sondenmolekül pro funktionelle Gruppe der Kuppler, nur schwer erzielt werden, da aufgrund der sterischen Hinderung auf der zweidimensional verlängerten Monoschicht nur eine Fraktion der funktionellen Gruppen mit Proben- oder Sondenmolekülen reagieren kann. Folglich ist die Gesamtpfropfdichte gering und normalerweise nicht gut definiert.
Ähnliche Probleme in Bezug auf die beschränkte Anzahl von Reaktionsstellen pro Oberflächeneinheit können in anderen Anwendungen auftreten, in welchen es erwünscht ist, eine erhöhte Menge an Molekülen auf einer Oberfläche zu immobilisieren.
Verschiedene Vorgehensweisen wurden durchgeführt, um die vorstehend umrissenen Probleme zu bewältigen. Im Hinblick auf die Analyse von Oligonukleotiden wurde versucht, die Pfropfdichte auf der Oberfläche unter Verwendung von Oligomeren oder Polymeren zu erhöhen, die einen Oligonukleotidstrang (oder eine funktionelle Gruppe für seine Anlagerung) zusammen mit einer geeigneten Gruppe, die die Bindung dieser Oligomere oder Polymere an der Oberfläche des Sensorchips ermöglichen, tragen. Aufgrund der erhöhten Flexibilität der oligomeren oder polymeren Ketten kann eine größere Fraktion der bifunktionellen Oligomer- oder Polymermoleküle, die an die Oberfläche gekuppelt werden, Oligonukleotidsondenmoleküle immobilisieren.
Jedoch ist die Gesamtoligonukleotidpfropfdichte nicht deutlich erhöht, da die Pfropfdichte der bifunktionellen oligomeren oder polymeren Moleküle auf der Oberfläche beschränkt ist. Dies ist eine Folge der Tatsache, dass der Selbstaufbau der Oligomere oder Polymere aus kinetischen Gründen behindert ist, da, nachdem erst einmal die Sensoroberfläche mit derartigen Molekülen bedeckt ist, sich weitere Polymere gegen einen Konzentrationsgradienten verteilen müssen, um die Oberfläche zu erreichen.
Eine andere Vorgehensweise für die vorstehend erwähnten selbst aufbauenden Monoschichten von bifunktionellen Molekülen zur Immobilisierung ist die Verwendung von Netzwerken zur DNA-Analyse. Ein Nachteil liegt darin, dass diese Netzwerke an die Sensoroberfläche nicht gekuppelt werden und nicht strukturiert sind, d.h. keine gemusterten Arrays bilden. Darüberhinaus besteht, da die Netzwerke im verwendeten Hybridisierungsmedium quellbar sein müssen, das Risiko, dass das Netzwerk von der Oberfläche abgelöst wird.
Ein weiterer allgemeiner Nachteil oder ein weiteres allgemeines Problem der Vorgehensweisen des Stands der Technik liegt darin, dass der Bereich von geeigneten Oberflächen auf diejenigen Oberflächen, für welche kovalent bindende bifunktionelle Linkersysteme bekannt sind, beschränkt ist.
Darüberhinaus können, da bemusterungsaktive Oberflächen zur Biokonjugation häufig durch Drucktechniken durchgeführt werden, nur Substrate mit einer ebenen Oberfläche verwendet werden. Für nicht ebene Oberflächen ist es sogar mit Tintenstrahldruckvorgängen nicht zufrieden stellend möglich, ein genaues und reproduzierbares Muster zu erhalten, insbesondere wenn eine hohe räumliche Auflösung erwünscht oder nötig ist.
Zudem ist das Heraufsetzen der Herstellung von gemusterten aktiven Oberflächen zur Biokonjugation ohne weiteres Aufheben nicht möglich. Die verschiedenen durchzuführenden Schritte benötigen für eine automatische Hochdurchsatzproduktion anspruchsvollere Apparaturen oder Herstellungsanlagen. Tatsächlich werden gemusterte aktive Oberflächen zur Biokonjugation aus praktischen Gründen bis jetzt chargenweise mit allen Problemen in Hinblick auf die Reproduzierbarkeit zwischen den Chargen hergestellt.
Demzufolge ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, das die groß angelegte Herstellung von gemusterten aktiven Oberflächen zur Biokonjugation ermöglicht, wobei die Anzahl an Molekülen, die pro Oberflächeneinheit wechselwirken, verglichen mit herkömmlichen Monoschichten von bifunktionellen Molekülen deutlich erhöht ist und wobei die Dichte von verfügbaren Wechselwirkungsstellen höher als diejenige ist, die aus der Reaktion von bifunktionellen Polymeren oder Oligomeren mit der Oberfläche erhalten werden, und wobei das Verfahren auf ein beliebiges bestimmtes Oberflächenmaterial oder eine beliebige bestimmte Gestalt nicht beschränkt ist.
Die Erfindung betrifft folglich ein Verfahren zur groß angelegten Herstellung einer gemusterten aktiven Oberfläche zur Biokonjugation, umfassend die Schritte:

(a) Herstellen eines selbsttragenden Films eines polyfunktionellen Polymernetzwerks, umfassend eine Anordnung von vernetzten Polymerunterketten, wobei jede Polymerunterkette eine Vielzahl an identischen von unterschiedlichen Wiederholungseinheiten umfasst, die eine oder mehrere funktionelle Gruppen tragen, die eine Wechselwirkung des Polymers mit einem oder mehreren Sondenmolekülen ermöglichen,
(b) Versehen des selbsttragenden Films mit gemusterten Arrays aus dem einen oder den mehreren Sondenmolekülen über eine Wechselwirkung mit den funktionellen Gruppen,
(c) Fixieren des selbsttragenden Films auf einer festen Oberfläche,
(d) wobei die funktionellen Gruppen des polyfunktionellen Polymernetzwerks ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Carbonsäuren, Maleinimiden, N-Hydroxysuccinimiden, Epoxiden, Isothiocyanaten, Isocyanaten, Aziden, NHS-Ester, Glycidylester, Acryl- oder Methacrylsäure-N-hydroxysucciniminen, N-Methacryloyl-6-aminopropansäurehydroxysuccinimidester, N-Methacryloyl-6-aminocapronsäurehydroxysuccinimidester oder Acryl- oder Methacrylsäureglycidylestern.

Vorteilhafterweise und folglich bevorzugt umfassen die Polymerunterketten des polyfunktionellen Polymernetzwerks Segmente, die das Polymernetzwerk wasserquellbar machen, wobei z.B. die Wasserquellbarkeit durch Monomere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Acrylsäure, Methacrylsäure, Dimethylacrylamid und Vinylpyrrolidon bereitgestellt wird.
Zur Herstellung der vernetzten Polymerunterketten des polyfunktionellen Polymernetzwerks können z.B. Bisacrylate, Bismethacrylate oder Bisacrylamide als Initiator verwendet werden. Es sollte angemerkt werden, dass es keine speziellen Beschränkungen in Anbetracht des Vernetzers gibt, und dass beliebige herkömmliche Vernetzer verwendet werden können.
Die funktionellen Gruppen des polyfunktionellen Polymernetzwerks können z.B. ausgewählt sein aus Carbonsäuren, Maleinimiden, N-Hydroxysuccinimiden, Epoxiden, Isothiocyanaten, Isocyanaten oder Aziden.
Vorteilhafterweise und folglich bevorzugt kann jedes der Sondenmoleküle, die mit den funktionellen Gruppen des polyfunktionellen Polymernetzwerks Wechselwirken, ein Partner eines spezifisch wechselwirkenden Systems von komplementär bindenden Partnern sein.
Zum Beispiel kann das spezifisch wechselwirkende System von komplementär bindenden Partnern auf der Basis der Wechselwirkung von Nukleinsäure/komplementärer Nukleinsäure, Peptidnukleinsäure/Nukleinsäure, Enzym/Substrat, Rezeptor/Effektor, Lectin/Zucker, Antikörper/Antigen, Avidin/Biotin oder Streptavidin/Biotin sein. Es sollte klar sein, dass die „Maschen" des polyfunktionellen Polymernetzwerks breit genug sind, um einen uneingeschränkten Zugang der jeweiligen komplementären Bindungspartner zu ermöglichen. Dieser uneingeschränkte Zugang wird auch durch die Wasserquellbarkeit des Netzwerks unterstützt.
In Schritt (c) des wie vorstehend definierten erfinderischen Verfahrens kann das Fixieren des selbsttragenden Films auf der festen Oberfläche z.B. unter Verwendung eines herkömmlichen reaktiven Klebstoffs oder eines beliebigen herkömmlichen bifunktionellen Linkersystems durchgeführt werden, das eine oder mehrere funktionelle Gruppen, die zum kovalenten Binden des Linkersystems an der festen Oberfläche geeignet ist, und eine oder mehrere funktionelle Gruppen zum kovalenten Binden des polyfunktionellen Polymernetzwerks an das kovalent gebundene Linkersystem umfasst.
Ein geeigneter reaktiver Klebstoff ist z.B. ein herkömmlicher Acrylklebstoff. Es sollte in diesem Zusammenhang angemerkt werden, dass es keine besonderen Beschränkungen im Hinblick auf den Klebstoff gibt, vorausgesetzt, dass der fixierte selbsttragende Film von der festen Oberfläche unter den vorgegebenen Reaktionsbedingungen z.B. zur Hybridisierung der Sonden- und Probenoligonukleotiden nicht abgelöst wird.
Ein geeignetes bifunktionelles Linkersystem umfasst z.B. ein Halogensilan, ein Alkoxysilan, ein Acyloxysilan, ein Aminosilan, eine Disulfid- oder eine Thiol gruppe zur kovalenten Bindung des Linkersystems an eine feste Oberfläche.
Ferner umfasst das bifunktionelle Linkersystem eine Gruppe zur kovalenten Bindung des polyfunktionellen Polymernetzwerks an das kovalent gebundene Linkersystem z.B. eine photoreaktive Gruppe wie Gruppen, die aus aromatischen Ketonen oder schwefelhaltigen aromatischen Ketonen, z.B. aromatischen β-Ketosulfiden, aromatischen β-Ketosulfoxiden oder aromatischen β-Ketosulfonen bestehen oder diese enthalten.
Spezifische Beispiele für die photoreaktive Gruppe sind eine Anthrathiongruppe oder ein Derivat davon, eine Anthrachinongruppe oder ein Derivat davon, eine Benzophenongruppe oder ein Derivat davon. Eine Benzophenongruppe ist bevorzugt.
Die feste Oberfläche zum Fixieren des selbsttragenden Films ist nicht besonders beschränkt und kann aus jedem beliebigen Material hergestellt sein. Beispiele sind eine Metall- oder Halbmetalloberfläche, eine Metalloxid- oder Halbmetalloxidoberfläche oder eine Polymeroberfläche. Darüber hinaus kann die Oberfläche beliebige Maße und Gestalten aufweisen und ist auf eine spezifische Oberflächengeometrie wie ebene Oberflächen nicht beschränkt. Zum Beispiel kann die Oberfläche eben oder nicht eben, z.B. konvex oder konkav sein, und selbst Prismen oder Kügelchen können verwendet werden.
In einer anderen Ausführungsform des erfinderischen Verfahrens wird der selbsttragende Film auf einem polyfunktionellen Polymernetzwerk in Schritt (a) auf einer Oberfläche eines Trägerfilms gebildet und in Schritt (c) der Trägerfilm auf der festen Oberfläche mit der anderen Oberfläche fixiert. Es gibt keine Beschränkungen in Bezug auf den Trägerfilm, d.h. jeder beliebige herkömmliche Polymerfilm kann verwendet werden, und es sollte angemerkt werden, dass die Ver wendung eines Trägerfilms absolut optional ist. Die mechanische Stärke des selbsttragenden Films ist ausreichend hoch, um eine günstige Handhabung z.B. zum Übertragen des Films auf die feste Oberfläche zum Fixieren zu ermöglichen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfinderischen Verfahrens wird der selbsttragende Film wahlweise auf einem Trägerfilm in einem weiteren Schritt nach Schritt (b) in Lagen oder ein Endlosband mit einem gewünschten Format geschnitten und kann in dieser Form und in jeder beliebigen Menge bis zur Verwendung stabil gelagert werden. Das Band kann vorzugsweise weiter wahlweise auf eine Trommel aufgewickelt werden.
Ein besonderer Vorteil eines derartigen „Endloschips" in Bandform auf einer Trommel liegt darin, dass mit einer einfachen Apparatur der „Endloschip" automatisch und mit hohem Durchsatz auf Substrate unter Bereitstellen der festen Oberfläche überführt und fixiert werden kann. Zum Beispiel können die Substrate in einem vorgegebenen Format, z.B. im Glasmikroskopobjektträger und bedeckt mit einer Schicht aus einem Klebstoff oder z.B. einem photoreaktiven bifunktionalen Linkersystem der Apparatur mit Hilfe eines Förderbands oder eines gleichwertigen Transportmittels zugeführt werden. In der Apparatur wird der „Endloschip" abgewickelt, in eine geeignete Länge geschnitten und auf der Oberfläche z.B. unter Verwendung einer geeigneten Zufuhrwalze und unter Anwendung von Wärme oder Ultraviolettstrahlung fixiert. Geeignete Produktionsanlagen für diesen Zweck sind entweder auf dem Fachgebiet bekannt, z.B. zum Laminieren einer Folie auf einen Buchumschlag, oder können leicht zum Durchführen des erfinderischen Verfahrens angepasst werden. Ein besonderer Vorteil des „Endloschips" liegt darin, dass er durch den Endverbraucher (durch einfaches Schneiden dessen in die korrekte Gestalt) auf jede beliebige gewünschte oder vorgegebene Chiplesergeometrie angepasst werden kann.
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung detaillierter und nur zur Veranschaulichung erklärt. Die Beispiele sollen nicht als irgendeine Beschränkung des wie in den beiliegenden Ansprüchen definierten Umfangs der Erfindung angesehen werden.
Der Begriff „Wechselwirkung", wie in dieser Patentbeschreibung verwendet, schließt die Bildung von kovalenten Bindungen sowie Anziehungsionen- und van-der-Waal's-Kräfte und Wasserstoffbindungen ein. Die jeweilige funktionelle Einheit im polyfunktionellen Polymernetzwerk oder in den Sondenmolekülen, die den Typ der Wechselwirkung definiert, wird gemäß der gewünschten Anwendung der gemusterten aktiven Oberfläche zur Biokonjugation, die bereitzustellen ist, ausgewählt.
Der Ausdruck „Immobilisieren" wird hier nachstehend zur Wechselwirkung von Molekülen mit dem polyfunktionellen Polymernetzwerk unter Erhalt der Bildung einer Bindung, die unter den ausgewählten Bedingungen dauerhaft ist, verwendet. Zum Beispiel werden Sondenmoleküle durch das polyfunktionelle Netzwerk während deren Aufbringung auf eine Sensoroberfläche immobilisiert. Jedoch kann durch Verändern von Bedingungen (z.B. pH-Wert, Zugabe von spezifischen Spaltmitteln) eine Immobilisierung manchmal umgekehrt werden.
Der Begriff „Probenmolekül" soll hier für Moleküle verwendet werden, die in einer Probe vorliegen und sich vorübergehend oder dauerhaft an das polyfunktionelle Netzwerk kuppeln. Es gibt zwei allgemeine Prinzipien für eine Wechselwirkung des polyfunktionellen Netzwerks mit den Probenmolekülen. In einer ersten Ausführungsform sind die funktionellen Gruppen, die im polyfunktionellen Netzwerk umfasst sind, derart ausgewählt, dass eine direkte Wechselwirkung der Ketten mit den Probenmolekülen ermöglicht wird. In einer zweiten Ausführungsform werden die Sondenmoleküle an den funktionellen Gruppen des polyfunktionellen Netzwerks immobilisiert, und eine Wechselwirkung findet zwischen diesen Sondenmolekülen und den Probenmolekülen statt.
Geeignete Sondenmoleküle sind Moleküle, die zumindest bifunktionell sind, sodass nach deren Kupplung an das polyfunktionelle Polymernetzwerk neue Wechselwirkungsstellen im polyfunktionellen Netzwerk vorliegen, die eine Wechselwirkung mit Probenmolekülen ermöglichen. Vorzugsweise stellen die Sondenmoleküle hoch spezifische Wechselwirkungsstellen für die Probenmoleküle bereit. Sie können von natürlichen oder nicht natürlichen Quellen abgeleitet sein. Besonders bevorzugte Sondenmoleküle sind Biomoleküle wie Nukleinsäuren, einschließlich DNA, RNA oder PNA (Peptidnukleinsäure), besonders bevorzugt Oligonukleotide oder Aptamere, Polysaccharide, Proteine, einschließlich Glycosidmodifizierter Proteine oder Antikörper, Enzyme, Cytokine, Chemokine, Peptidhormone oder Antibiotika und Peptide. Zum Gewährleisten einer ausreichenden Stabilität, z.B. während einer Sensoranwendung, werden die Probenmoleküle vorzugsweise an das polyfunktionelle Polymernetzwerk kovalent gebunden. Es sollte angemerkt werden, dass die Sondenmoleküle gleich oder unterschiedlich sein können. Im letzteren Fall ist der parallele Nachweis einer Mehrzahl von Probenmolekülen möglich.
Die Einbringung von verzweigten Polymeren in das Netzwerk ist, falls gewünscht, möglich. In einigen Fällen ist die Zugabe von Comonomeren, die ein Zuschneiden der physikalischen Eigenschaften des Netzwerks je nach der gewünschten Anwendung ermöglichen, geeignet.
Die Mindestbestandteile des Netzwerks sind die funktionalisierten Wiederholungseinheiten und die Vernetzungseinheiten. Für die funktionalisierten Wiederholungseinheiten enthalten die Unterketten des Polymernetzwerks Wiederholungseinheiten, die mindestens eine der funktionellen Gruppen tragen, die mit Proben- oder Sondenmolekülen wechselwirken können. Jedoch kann, um dem polyfunktionellen Polymernetzwerk bestimmte vorteilhafte Eigenschaften zu verleihen, ein Copolymer, das aus diesen Monomeren mit spezifischen funktionellen Gruppen zur Wechselwirkung mit Proben- oder Sondenmolekülen gebildet ist (hier nachstehend als „funktionalisierte Monomere" bezeichnet) zusammen mit anderen Comonomeren verwendet werden.
Zum Beispiel wird die Reaktion der Proben- oder Sondenmoleküle mit dem polyfunktionellen Polymernetzwerk deutlich vereinfacht, wenn das polyfunktionelle Polymernetzwerk im Lösungsmittel, das diese Moleküle enthält, quellbar ist, sodass Comonomere vorzugsweise ausgewählt werden sollten, die eine starke Wechselwirkung mit dem fraglichen Lösungsmittel zeigen. Dies kann unter Verwendung von Comonomeren erzielt werden, die die Quellbarkeit des Netzwerks verbessern. Da in einer am meisten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Biomoleküle, die normalerweise in wässrigen Lösungen vorliegen, mit dem polyfunktionellen Polymernetzwerk wechselwirken, ist das polyfunktionelle Polymernetzwerk vorzugsweise wasserquellbar.
Folglich können z.B. ein oder mehrere Comonomere verwendet werden, die polar oder sogar in Wasser löslich sind, wenn ein Homopolymer von funktionalisierten Monomeren keine ausreichende Wechselwirkung mit Wasser zeigt, um eine schnelle Reaktion der nachzuweisenden Moleküle mit den funktionellen Gruppen zu ermöglichen. Beide Monomertypen, funktionalisiert sowie Comonomere, enthalten vorzugsweise eine C-C-Doppelbindung, die in einer Radikalpolymerisationsreaktion reagieren kann. Beispiele für geeignete Comonomere, die ein wasserquellbares Polymer ergeben, sind Acrylsäure, Methacrylsäure und Derivate davon, z.B. Ester und Amide von diesen Säuren mit Alkoholen oder Aminen, die vorzugsweise 1 bis 12 Kohlenstoffatome umfassen.
Allgemeine Beispiele für diese Gruppe von Monomeren sind Hydroxyethylmethacrylat, Acrylamid und Dimethylacrylamid. Ein anderes geeignetes Monomer ist Vinylpyrrolidon. Es ist auch möglich, Monomere zu verwenden, die zuerst wasserunlösliche Polymere ergeben, die dann in wasserlösliche Derivate überführt werden können. Ein geeignetes Beispiel für diese Gruppe von Polymeren ist Polyvinylalkohol, der z.B. durch Verseifung von Polyvinylacetat erhalten werden kann.
Wird ein Copolymer verwendet, wird das Verhältnis von Comonomeren zu funktionalisierten Monomeren vor dem Polymerisationsverfahren bestimmt, um die Zusammensetzung der erhaltenen Polymerketten des polyfunktionellen Polymernetzwerks zu definieren. Vorzugsweise liegt das Verhältnis der Comonomere zu den funktionalisierten Monomeren im Bereich von 50/1 bis 1/1, stärker bevorzugt von 20/1 bis 2/1.
Die funktionellen Gruppen, die nötig sind, um eine Wechselwirkung des polyfunktionellen Polymernetzwerks mit Proben- oder Sondenmolekülen zu ermöglichen, liegen vorzugsweise in Seitenketten der Polymerunterketten des polyfunktionellen Polymernetzwerks vor. Eine „Vielzahl" von funktionellen Gruppen, die in Polymerunterketten des polyfunktionellen Polymernetzwerks der vorliegenden Erfindung umfasst sind, bedeuten mindestens zwei, jedoch vorzugsweise mehr als zwei Gruppen pro Molekülunterkette. Da die betreffenden funktionellen Gruppen vorzugsweise in Wiederholungseinheiten umfasst sind, die die Polymerunterketten des polyfunktionellen Polymernetzwerks bilden, kann deren Anzahl bis zu mehreren Tausend, z.B. bis zu 10.000 dieser Gruppen, die in einer einzelnen Unterkette vorliegen, je nach der Größe des zu immobilisierenden Sonden- oder Probenmoleküls betragen. Vorzugsweise umfasst jede Kette 20 bis 1.000 dieser funktionellen Gruppen.
Geeignete funktionalisierte Wiederholungseinheiten, die in den Polymerunterketten des polyfunktionellen Polymernetzwerks vorliegen, sind diejenigen Wiederholungseinheiten, die eine polymerisierbare C-C-Doppelbindung sowie eine weitere funktionelle Einheit, die am Polymerisationsverfahren nicht teilnimmt, umfassen. Vorzugsweise wird diese funktionelle Gruppe mit den Hauptpolymerunterketten des polyfunktionellen Polymernetzwerks über eine C₂-C₁₀-, stärker bevorzugt C₃-C₇-Alkylkette als Abstandhalter verknüpft.
Die Abstandhaltermoleküle können ein Teil der funktionalisierten Monomere sein. Geeignete Monomere für diese Vorgehensweise schließen Acryl- und Methacrylsäureester oder -amide von C₂-C₁₀-Alkoholen oder C₂-C₁₀-Aminen ein. Um als Abstandhalter zu dienen, tragen diese Alkohole oder Amine eine zusätzliche funktionelle Gruppe an dem Ende, das gegenüber demjenigen liegt, das die Ester- oder Amidbindung enthält. Diese funktionelle Gruppe stellt entweder diejenige dar, die zur Wechselwirkung mit den Proben- oder Sondenmolekülen nötig ist, oder kann zu einer geeigneten funktionellen Gruppe in einem weiteren Schritt umgewandelt werden.
Alternativ dazu ist es auch möglich, diese Abstandhaltermoleküle an geeignete reaktive Segmente in den Polymerunterketten des polyfunktionellen Polymernetzwerks nach dessen Bildung anzulagern. In diesem Fall müssen reaktive Monomere während der Polymerisation wie Acryl- oder Methacrylsäurechloride oder reaktive Ester davon wie N-Hydroxysuccinimid oder andere Monomere, z.B. Maleinsäureanhydrid vorliegen. Diese bevorzugten reaktiven Monomere können kovalente Bindungen an den bifunktionellen Alkoholen oder Aminen bilden, die als Abstandhalter verwendet werden können.
Die Monomere, die die Abstandhaltereinheit tragen, können aus dem jeweiligen Acryl- oder Methacrylsäurechlorid oder -anhydrid an der ω-Amino- oder Hydroxycarbonsäure leicht synthetisiert werden. Das erhaltene Produkt kann unter Verwendung z.B. von N-Hydroxysuccinimid zu dem aktiven Esterderivat umgewandelt werden. Ein detailliertes Verfahren zur Synthese von einigen Beispielen derartiger Monomere ist in der Literatur, z.B. in H.-G. Batz, J. Koldehoff, Macromol. Chem. 177 (1976) 683 zu finden.
Wie vorstehend umrissen ist es möglich, reaktive Monomere zu verwenden, die die Polymerunterketten des polyfunktionellen Polymernetzwerks direkt ergeben. Alternativ dazu können Monomere ausgewählt werden, die einen Vorläufer der auf der endgültigen Oberfläche zu verwendenden funktionellen Gruppe, z.B. ein Säurechlorid oder ein Säureanhydrid tragen. Sie können anschließend zu reaktiven Gruppen, z.B. NHS-Ester- oder Glycidylestergruppen umgewandelt werden, die eine Wechselwirkung des polyfunktionellen Polymernetzwerks mit Proben- oder Sondenmolekülen unter den gewünschten Bedingungen ermöglichen.
Folglich sind alle polymerisierbaren Monomere für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignet, sofern sie mit funktionellen Gruppen, die zum Ermöglichen einer Wechselwirkung des polyfunktionellen Polymernetzwerks mit den Probenmolekülen oder Sondenmolekülen nötig sind, kombiniert werden können oder diese umfassen.
Funktionelle Gruppen, die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind vorzugsweise gemäß den Molekülen ausgewählt, mit welchen eine Wechselwirkung zu erzielen ist. Die Wechselwirkung kann auf einen einzelnen Probenmolekültyp oder auf eine Vielfalt von Probenmolekülen gerichtet sein. Da eine wichtige Anwendung der vor liegenden Erfindung der Nachweis von spezifischen Molekülen in biologischen Proben ist, wechselwirken die funktionellen Gruppen, die im polyfunktionellen Polymernetzwerk vorliegen, vorzugsweise mit natürlichen oder synthetischen Biomolekülen, die mit den Molekülen in biologischen Proben spezifisch wechselwirken, was zu deren Nachweis führt. Geeignete funktionelle Einheiten können vorzugsweise mit Nukleinsäuren oder Derivaten davon, wie DNA, RNA oder PNA, z.B. Oligonukleotiden oder Aptameren, Polysacchariden, Proteinen, einschließlich Glycosid-modifizierten Proteinen oder Antikörpern, Enzymen, Cytokinen, Chemokinen, Peptidhormonen oder Antibiotika oder Peptiden oder markierten Derivaten davon reagieren.
Darüber hinaus ist es möglich, die Kupplungsreaktion zwischen den nachzuweisenden Molekülen oder den synthetischen Oligonukleotiden und dem polyfunktionellen Polymernetzwerk unter Bedingungen durchzuführen, die für die Proben- oder Sondenmoleküle nicht schädlich sind. Demzufolge sollte die Reaktion in einer Nukleinsäuresensoranwendung in einer wässrigen Lösung durchgeführt werden, und die Temperatur sollte nicht über 95 °C ansteigen.
Auch sollte die Kupplungsreaktion mit einer vernünftigen Geschwindigkeit verlaufen, sodass der Nachweis vorzugsweise in weniger als 24 Stunden ohne das Erfordernis von extremen pH-Werten in der Lösung erzielt werden kann. Für die Immobilisierung von synthetischen Oligonukleotideinzelsträngen sollte der pH-Wert im Bereich zwischen 7 und 11, vorzugsweise 7 bis 10 liegen. Während der Hybridisierungsreaktion der Nukleinsäureprobenmoleküle mit den Sondenmolekülen müssen die Bindung zwischen der funktionellen Gruppe und dem synthetischen Oligonukleotideinzelstrang sowie das Fixieren des polyfunktionellen Polymernetzwerks an dem Substrat Temperaturen von mehr als 65 °C und einen pH-Wert von 6-9 standhalten können. In Fällen, in welchen DNA als Probenmolekül verwendet wird, können die Temperaturen bis zu etwa 95 °C erhöht werden, um eine Auftrennung der DNA-Stränge zu bewirken, was zur Hybridisierung nötig ist.
Da die meisten der Sondenmoleküle, insbesondere in biologischen oder medizinischen Anwendungen sterisch ungehinderte nukleophile Einheiten umfassen, umfassen bevorzugte Wechselwirkungen mit dem polyfunktionellen Polymernetzwerk nukleophile Substitutions- oder Additionsreaktionen, die zu einer kovalenten Bindung zwischen den Polymerketten und den Proben- oder Sondenmolekülen führen. Zum Beispiel werden synthetische Oligonukleotide gewöhnlich mit einer freien Aminogruppe an einem Ende (5' oder 3') versehen. Folglich stellen beispielhafte funktionelle Gruppen z.B. eine reaktive Doppelbindung, ein Equivalent für eine Doppelbindung (wie z.B. eine Epoxygruppe) oder eine reaktive austretende Gruppe ein. Jedoch können auch ionische oder van-der-Waals-Kräfte sowie Wasserstoffbindungen zum Kuppeln von Probenmolekülen an das polyfunktionelle Polymernetzwerk verwendet werden, falls die funktionellen Gruppen entsprechend ausgewählt werden.
Bevorzugte funktionelle Gruppen können aus der Fachliteratur in Bezug auf die zu immobilisierenden Molekülklassen und gemäß anderen Anforderungen (Reaktionszeit, Temperatur, pH-Wert), wie vorstehend beschrieben, ausgewählt werden. Eine allgemeine Liste ist z.B. im Textbuch „Bioconjugate Techniques" von G. T. Hermanson, Academic Press, 1996 zu finden. Im Falle der Anlagerung von Oligonukleotiden mit endständigen Aminogruppen sind Beispiele für geeignete Gruppen so genannte aktive oder reaktive Ester wie N-Hydroxysuccinimide (NHS-Ester), Epoxide, vorzugsweise Glycidylderivate, Isothiocyanate, Isocyanate, Azide, Carbonsäuregruppen oder Maleinimide.
Als bevorzugte funktionelle Monomere, die direkt zu polyfunktionellen Polymerunterketten des poly funktionellen Polymernetzwerks führen, können die folgenden Verbindungen für die Zwecke der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden:

• Acryl- oder Methacrylsäure-N-hydroxysuccinimide,
• N-Methacryloyl-6-aminopropansäurehydroxysuccinimidester,
• N-Methacryloyl-6-aminocapronsäurehydroxysuccinimidester oder
• Acryl- oder Methacrylsäureglycidylester.

Je nach der Anwendung besteht die Möglichkeit des Versehens der Polymerunterketten des polyfunktionellen Polymernetzwerks mit einer Kombination von zwei oder mehreren unterschiedlichen funktionellen Gruppen, z.B. durch Durchführen der zu den Polymerunterketten führenden Polymerisation in Gegenwart von verschiedenen Typen von funktionalisierten Monomeren. Alternativ dazu können die funktionellen Gruppen identisch sein.
Die Polymerunterketten des polyfunktionellen Polymernetzwerks können z.B. über eine Kettenreaktion hergestellt werden und gleichzeitig vernetzt werden. Während Radikalmechanismen aus praktischen Gründen bevorzugt sind, ist die Anwendung von Ionen- oder anderen Polymerisationstechniken ebenfalls möglich.
Wird ein wärmeinitiierter Radikalmechanismus verwendet, können z.B. Peroxogruppen oder Azogruppen, die Polymerisationsinitiatoren enthalten, verwendet werden. Aromatische Ketone wie Benzoin-, Benzil- oder Benzophenonderivate können vorzugsweise als Polymerisationsinitiatoren verwendet werden, wenn die Polymere durch photochemische Initiierung gebildet werden. Aromatische Ketone, die Schwefel umfassen, können, falls gewünscht, gleichermaßen verwendet werden um die geeignete Wellenlänge zur Photoinitiierung auf einen längeren Wellenlängenbereich zu verschieben. Als Beispiele können hier aromatische β-Ketosulfide, aromatische β-Ketosulfoxide oder aromatische β-Ketosulfone erwähnt werden. Es ist klar, dass dieselben oder unterschiedliche Initiatoren im Polymerisationsgemisch verwendet werden können.
Die funktionellen Gruppen, die in den bifunktionellen Linkern umfasst sind, die in einer Ausführungsform des erfinderischen Verfahrens zum Oberflächenfixieren verwendet werden, müssen auf die verwendete Oberfläche angepasst sein. Für Metalloxide können insbesondere Siliciumoxidoberflächen (aufgedampfte oder gesputterte SiO_x-Schichten, SiO₂-Oberflächen von Siliciumwafern, Glas, Quarz), Chlorsilaneinheiten oder Alkoxysilane verwendet werden. Thiol- oder Disulfidgruppen können zum Fixieren an Goldoberflächen eingesetzt werden. Silane sind gewöhnlich aufgrund ihrer erhöhten Stabilität auf Oberflächen bevorzugt. Jedoch ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung – und dies ist ein deutlicher Vorteil – nicht auf anorganische Oberflächen beschränkt. Jede beliebige Oberfläche, besonders erwünscht organische Polymeroberflächen, können als Substrat zum Tragen des polyfunktionellen Polymernetzwerks verwendet werden. Beispiele für geeignete organische Polymere sind Cycloolefincopolymere (COCs), Poly(Methylmethacrylat) (PMMA, Plexiglas), Polystyrol, Polyethylen oder Polypropylen. Ein geeignetes COC ist z.B. von Ticona unter der Markenbezeichnung „Topas" erhältlich.
Bevorzugte Beispiele für geeignete Vernetzer sind: Bisacrylate, Bismethacrylate, z.B. Oligo-Ethylenglykolbismethacrylate wie Ethylenglykolbismethacrylat und Bisacrylamide, z.B. Ethylendiaminbisacrylamid.
Nach Initiierung der Polymerisationsreaktion, vorzugsweise durch einen Erwärmungsschritt (Wärmeinitiierung) oder Bestrahlung (Photoinitiierung) in Gegenwart von polymerisierbaren funktionalisierten Monomeren und Vernetzern können Polymerunterketten gebildet werden und werden gleichzeitig vernetzt. Die Polymerisation kann unter auf dem Fachgebiet bekannten Standardreaktionsbedingungen durchgeführt werden.
Da es möglich ist, derartige Parameter wie Vernetzungsdichte und Quellverhalten genau zu steuern, ist es möglich, die Eigenschaften des jeweiligen polyfunktionellen Polymernetzwerks auf eine Vielfalt von Anwendungen anzupassen. Durch Einstellen der Reaktionsbedingungen können Netzwerke mit Dicken im Bereich von wenigen Nanometern bis zu einigen Millimetern oder noch mehr hergestellt werden. Es ist auch möglich, die Eigenschaften des erhaltenen polyfunktionellen Polymernetzwerks z.B. in Bezug auf die Zugänglichkeit der funktionellen Gruppen für anschließend gekuppelte Sonden- oder Probenmoleküle, die in deren Größe und Struktur deutlich variieren können, abzustimmen.
Es sollte dafür gesorgt werden, nicht umgesetzte Monomere sowie nicht gebundene oder vernetzte Polymerketten mit geeigneten Lösungsmitteln nach der Polymerisation zu entfernen.
Gemäß einem alternativen Verfahren werden in einem ersten Schritt lange Polymerketten mit geeigneten funktionellen Gruppen synthetisiert, gefolgt von Vernetzen des Letzteren.
Das Bilden von gemusterten Arrays des polyfunktionellen Polymernetzwerks ist durch verschiedene Mittel möglich. Ein Weg sind photolithographische Standardverfahren, die entweder nach der Polymerisation (Photoablösung der Polymere durch Masken), vor diesem Schritt (Photozersetzung oder Photoablösung der Initiatormonoschichtmasken) oder während der Polymerisation mit Hilfe von Photopolymerisation durch Masken angewandt werden können. Andere mögliche Techniken zur Bildung von gemusterten polyfunktionellen Polymernetzwerken sind Mikrokontaktdruck oder verwandte Verfahren, die während der Polymerisation angewandt werden können. Schließlich können Tintenstrahltechniken oder andere Mikroplott-Verfahren zum Bilden von gemusterten polyfunktionellen Polymernetzwerken verwendet werden. Unter Verwendung beliebiger dieser Techniken können Oberflächenstrukturen mit Maßen im Mikrometerbereich gebildet werden. Der hochparallele Modus der Signalbildung und eine deutliche Verbesserung in der Integration von analytischen Daten ist ein viel versprechendes Merkmal von derartigen Techniken, die demgemäß die Optimierung von automatischen analytischen Prozeduren ermöglichen.
Für den Nachweis einer erfolgreichen Immobilisierung von Proben- oder Sondenmolekülen auf einem polyfunktionellen Polymernetzwerk kann eine Vielfalt von Techniken angewandt werden. Insbesondere wurde gefunden, dass sich die polyfunktionellen Polymernetzwerke einer deutlichen Abnahme in ihrer Dicke unterziehen, was mit geeigneten Verfahren z.B. Ellipsometrie nachgewiesen werden kann. Massenempfindliche Verfahren können ebenfalls angewandt werden.
Sind Nukleinsäuren, z.B. Oligonukleotide mit einer gewünschten Nukleotidsequenz oder DNA-Moleküle in einer biologischen Probe zu analysieren, können synthetische Oligonukleotideinzelstränge mit dem polyfunktionellen Polymernetzwerk umgesetzt werden. Die Reaktion wird unter hoher Feuchtigkeit, vorzugsweise in einer gepufferten wässrigen Lösung durchgeführt. Die Reaktionstemperatur kann über Raumtemperatur erhöht werden, sofern sie für die Oligonukleotide nicht schädlich ist. Bevorzugte Temperaturen liegen im Bereich von 40-60 °C. In dieser Anwendung können eine Vielzahl von identischen synthetischen Oligonukleotidsträngen oder ein Gemisch von unterschiedlichen Strängen verwendet werden. Werden unterschiedliche Stränge verwendet, sollten deren Sequenzen vorzugsweise bekannt sein.
Bevor die so hergestellte Oberfläche bei einer Hybridisierungsreaktion verwendet wird, werden nicht umge setzte funktionelle Gruppen über Addition von geeigneten nukleophilen, vorzugsweise C₁-C₄-Aminen wie einfachen primären Alkylaminen (z.B. Propyl- oder Butylamin), sekundären Aminen (Diethylamin) oder Aminosäuren (Glycin) deaktiviert.
Nach der Aussetzung einem Gemisch von Oligonukleotideinzelsträngen, z.B. wie erhalten aus PCR, die markiert sind, zeigen nur diejenigen Oberflächenbereiche, die synthetische Stränge als Sondenkomplementär zum PCR-Produkt bereitstellen, ein nachweisbares Signal beim Scannen aufgrund der Hybridisierung. Zum Erleichtern des parallelen Nachweises von verschiedenen Oligonukleotidsequenzen können Drucktechniken verwendet werden, die die Auftrennung der Sensoroberfläche in Bereiche ermöglichen, in welchen verschiedene Typen von synthetischen Oligonukleotidsonden der Testlösung zur Verfügung gestellt werden.
Der Begriff „Hybridisierung" kann wie hier verwendet stringente oder nicht-stringente Bedingungen betreffen. Falls nicht weiter spezifiziert sind die Bedingungen vorzugsweise nicht-stringent. Die Hybridisierungsbedingungen können gemäß herkömmlichen Protokollen, die z.B. in Sambrook, „Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory N. Y. (1989), Ausubel, „Current Protocols in Molecular Biology", Green Publishing Associates und Wiley Interscience, N. Y. (1989), oder Higgins und Hames (Hrsg.) „Nukleic acid hybridization, a practical approach" IRL Press Oxford, Washington DC, (1985) beschrieben sind, eingerichtet werden. Die Einstellung von Bedingungen wird weithin dem Fachmann überlassen und ist gemäß den auf dem Fachgebiet beschriebenen Protokollen zu bestimmen. Folglich erfordert der Nachweis von nur spezifisch hybridisierenden Sequenzen gewöhnlich stringente Hybridisierungs- und Waschbedingungen wie z.B. 0,1 × SSC, 0,1 % SDS bei 65 °C. Beispielhafte nicht-stringente Bedingungen zum Nachweis von homologen oder nicht exakt komplementären Sequenzen können auf 6 × SSC, 1 % SDS bei 65 °C eingestellt werden. Wie weiterhin bekannt, bilden die Länge der Sonde und die Zusammensetzung der Nukleinsäure, die zu bestimmen ist, weitere Parameter der Hybridisierungsbedingungen.
Die zu analysierenden Nukleinsäuren können von einer DNA-Bibliothek oder einer genomischen Bibliothek, einschließlich synthetischen und halbsynthetischen Nukleinsäurebibliotheken stammen. Vorzugsweise umfasst die Nukleinsäurebibliothek Oligonukleotide.
Zum Erleichtern ihres Nachweises in einem immobilisierten Zustand sollten die Nukleinsäuremoleküle vorzugsweise markiert sein. Geeignete Markierungen schließen radioaktive, fluoreszierende, phosphoreszierende, biolumineszierende oder chemolumineszierende Markierungen, ein Enzym, einen Antikörper oder ein funktionelles Fragment oder funktionelles Derivat davon, Biotin, Avidin oder Streptavidin ein.
Antikörper können polyclonale, monoclonale, chimere oder einkettige Antikörper oder funktionelle Fragmente oder Derivate derartiger Antikörper einschließen, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Die allgemeine Methodik zur Herstellung von Antikörpern ist weithin bekannt und wurde z.B. in Köhler und Milstein, Nature 256 (1975), 494 beschrieben und ist in J. G. R. Hurrel, Hrsg., „Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications", CRC Press Inc., Boco Raron, FL (1982) erörtert. Ruch ist das Verfahren, gelehrt von L. T. Mimms et al., Virology 176 (1990), 604-619, anwendbar. Wie vorstehend angegeben, bedeutet der Begriff „Antikörper" hier monoclonale oder polyclonale Antikörper. Funktionelle Antikörperfragmente oder -derivate stellen dieselbe Spezifität wie die ursprünglichen Antikörper bereit und umfassen F(ab')₂, Fab, Fv oder scFv-Fragmente siehe z.B. Harlow und Lane, „Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press 1988, Cold Spring Harbor, N. Y. Vorzugsweise ist der hier verwendete Antikörper ein monoclonaler Antikörper. Weiterhin können die Derivate durch Peptidomimetica hergestellt werden. Derartige Herstellungsverfahren sind auf dem Fachgebiet weithin bekannt und können durch den Fachmann ohne weiteres Aufheben angewandt werden.
Je nach den angewandten Markierungsverfahren kann der Nachweis durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren, z.B. durch Laserabtasten oder die Verwendung von CCD-Kameras bewirkt werden.
Auch anwendbar sind Verfahren, in welchen der Nachweis indirekt bewirkt wird. Ein Beispiel für einen derartigen indirekten Nachweis ist die Verwendung eines sekundär markierten Antikörpers, der gegen eine erste Verbindung gerichtet ist, wie ein Antikörper, der sich an das biologische Molekül (Probenmolekül) von Interesse bindet.
Eine Regenerierung der Sensoroberflächen nach dem Stattfinden der Immobilisierung ist möglich, jedoch sind einzelne Verwendungen bevorzugt, um die Qualität der Ergebnisse zu gewährleisten.
Mit den polyfunktionellen Polymernetzwerken können unterschiedliche Typen von Proben mit einer erhöhten Präzision und/oder einer reduzierten Notwendigkeit von Raum in Serien- sowie Parallelnachweisverfahren analysiert werden. Die Sensoroberflächen, an welche die polyfunktionellen Polymernetzwerke durch das erfindungsgemäße Verfahren fixiert wurden, können deshalb in diagnostischen Instrumenten oder anderen medizinischen Anwendungen, z.B. für den Nachweis von Bestandteilen in physiologischen Fluida wie Blut, Serum, Speichel usw. dienen.
Der Offenbarungsinhalt der in der gesamten Patentbeschreibung genannten Dokumente ist hier unter Bezugnahme eingebracht.
Die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden in den folgenden Punkten weiter veranschaulicht.
Ein bevorzugtes Verfahren zum Nachweis von Probennukleinsäuremolekülen vorzugsweise von Einzelstrang-Nukleinsäuremolekülen unter Verwendung einer gemusterten aktiven Oberfläche zur Biokonjugation, hergestellt durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung, umfasst die Schritte:
Stattfindenlassen einer Hybridisierungsreaktion zwischen den Oligonukleotideinzelsträngen unter Bildung des gemusterten Arrays des selbsttragenden Films und der Probennukleinsäuremoleküle,
Entfernen der nicht hybridisierten Nukleinsäuremoleküle in einem Waschschritt und
Nachweisen der hybridisierten Nukleinsäuremoleküle, vorzugsweise fluorometrisch.
Im Folgenden ist die Erfindung detaillierter in Bezug auf Beispiele offenbart. Jedoch sollen die beschriebenen spezifischen Formen oder bevorzugten Ausführungsformen in jeder Hinsicht nur als Veranschaulichung und nicht beschränkend angesehen werden, wobei der Umfang der Erfindung eher durch die beiliegenden Ansprüche als durch die folgende Beschreibung angegeben wird, und alle Änderungen, die in die Bedeutung und den Bereich der Equivalenz der Ansprüche fallen, sollen deshalb hier umfasst sein.
Beispiele
Synthese eines funktionalisierten Monomers
Als ein Beispiel wird die Synthese von N-Methacryloyl-6-aminocapronsäurehydroxysuccinimidester beschrieben. Der Reaktionsweg ist nachstehend dargestellt. Die Indizes i-iii in dieser Figur beziehen sich auf die Beschreibung der verschiedenen Schritte im Text.

i) Eine Lösung von 13,2 g 6-Aminocapronsäure und 20 g NaHCO₃ in 100 ml Wasser und 50 ml 1,4-Dioxan wurde langsam einer Lösung von 10,3 ml Methacrylsäurechlorid in 50 ml 1,4-Dioxan zugesetzt. Die Lösung wurde über Nacht gerührt. Dann wurden 50 ml Wasser zugesetzt, und das Gemisch wurde dreimal mit Ethylacetatportionen von 100 ml Ethylacetat gewaschen. Die Wasserschicht wurde mit verdünnter Salzsäure angesäuert (pH 2) und dann mit drei Ethylacetatportionen von 100 ml extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden über Na₂SO₄ getrocknet, auf ein Volumen von etwa 50 ml eingeengt und zu 350 ml kaltem Hexan zugesetzt. Dieses Gemisch wurde auf –20 °C abgekühlt, und das Produkt trennte sich langsam über Nacht als weiße Kristalle ab (Ausbeute ca. 14 g).
ii) Eine Lösung von 14 g der Säure in 300 ml Methylenchlorid wurde auf 5 °C abgekühlt, und 8,2 g N-Hydroxysuccinimid (NHS) und 14,6 g N,N-Dicyclohexylcarbodiimid wurden zugesetzt. Das Gemisch wurde bei 5 °C über Nacht gehalten. Der Niederschlag (Dicyclohexylharnstoff) wurde abfiltriert und das Lösungsmittel abgedampft. Während diesem Schritt wurde auch zusätzlicher Harnstoff, der in einigen Fällen abgetrennt wurde, abfiltriert. Das Rohprodukt wurde aus Isopropanol umkristallisiert, um etwa 15 g des NHS-Estermonomers zu erhalten.

Bildung eines polyfunktionellen Polymernetzwerks
Eine die folgenden Inhaltstoffe umfassende Lösung wurde verwendet:
40 Mol-% N,N-Dimethylacrylamid (für das wasserquellbare Basispolymer),
10 Mol-% N-Methacryloyl-6-aminocapronsäurehydroxysuccinimidester (für die funktionalisierten Wiederholungseinheiten),
5 Mol-% Ethylenglykolbismethacrylat (für die Vernetzungseinheiten),
1 Mol-% Azobisisobutyronitril (als Initiator),
Rest (auf 100 Mol-%) Ethanol.
Nach Erwärmen auf 70 °C wurde die Polymerisation für eine Dauer von 10 Stunden durchgeführt. Anschließend wurde das erhaltene Polymernetzwerk mit Ethanol gewaschen und auf einen Mikroskopobjektträger, bedeckt mit einer Schicht aus einem bifunktionellen Silanlinker auf Benzophenonbasis überführt und auf der Oberfläche durch Bestrahlung mit Ultraviolettstrahlung (500 Watt Hg-Lampe von Oriel, 5 bis 45 min Bestrahlungszeit, mit einem zweifarbigen Filter bei 320 bis 420 nm oder einem Filterabschnitt bei 320 nm) fixiert.
Nachweis von Oligonukleotidsträngen
Die erhaltene Oberfläche wurde 1 nl einer 10 μM Oligonukleotidlösung ausgesetzt, und man ließ die Kupplungsreaktion bei etwa 40-50 °C für eine Dauer von zwei Stunden in einer wässrigen Lösung verlaufen.
Das synthetische Oligonukleotid war 5-aminomodifiziert, und die Lösung war mit 100 mM Natriumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 8,0 gepuffert. Nach der Kupplungsreaktion wurde die Sensoroberfläche mit dem Natriumphosphatpuffer gespült. Zum Definieren der räumlichen Ausdehnung der spezifischen Oligonukleotidtypen auf der Sensoroberfläche zum Parallelnachweis wurde der Reaktant auf das polyfunktionelle Polymernetzwerk gedruckt.
Man ließ die so hergestellte Oberfläche mit einem Cy5-markierten PCR-Produkt in einem Puffer aus 2 × SSC, 10 Dextransulfat und 50 % Formamid für eine Dauer von 12 Stunden bei 28 °C reagieren. Der DNA-Gehalt betrug 100 ng DNA/80 μl Probe. Nach dem Stattfinden der Hybridisierungsreaktion wurde die Oberfläche in SSC-Puffer gewaschen und das Ergebnis fluorometrisch über Laseraktivierung mit einer CCD-Kamera nachgewiesen. Ein Fluoreszenzsignal konnte nur für diejenigen Bereiche nachgewiesen werden, die zu dem PCR-Produkt komplementäre synthetische Oligonukleotide trugen.

Claims

Verfahren zur groß angelegten Herstellung von gemusterten aktiven Oberflächen zur Biokonjugation umfassend die Schritte: (a) Herstellen eines selbsttragenden Films eines polyfunktionellen Polymernetzwerks, umfassend eine Anordnung von vernetzten Polymerunterketten, wobei jede Polymerunterkette eine Vielzahl an identischen von unterschiedlichen Wiederholungseinheiten umfasst, die eine oder mehrere funktionelle Gruppen tragen, die eine Wechselwirkung des Polymers mit einem oder mehreren Sondenmolekülen ermöglichen, (b) Versehen des selbsttragenden Films mit gemusterten Arrays aus dem einen oder den mehreren Sondenmolekülen über eine Wechselwirkung mit den funktionellen Gruppen, (c) Fixieren des selbsttragenden Films auf einer festen Oberfläche und (d) wobei die funktionellen Gruppen des polyfunktionellen Polymernetzwerks ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Carbonsäuren, Maleinimiden, N-Hydroxysuccinimiden, Epoxiden, Isothiocyanaten, Isocyanaten, Aziden, NHS-Ester, Glycidylester, Acryl- oder Methacrylsäure-N-hydroxysuccinimiden, N-Methacryloyl-6-aminopropansäurehydroxysuccinimidester, N-Methacryloyl-6-aminocapronsäurehydroxysuccinimidester oder Acryl- oder Methacrylsäureglycidylestern.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Polymerunterketten Segmente umfassen, die das Polymernetzwerk wasserquellbar machen.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Wasserquellbarkeit durch Monomere bereitgestellt wird, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Acrylsäure, Methacrylsäure, Dimethylacrylamid und Vinylpyrrolidon.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei zum Herstellen der vernetzten Polymerunterketten ein Vernetzer, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bisacrylaten, Bismethacrylaten und Bisacrylamiden verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei jedes der Sondenmoleküle ein Partner eines spezifisch wechselwirkenden Systems von komplementär bindenden Partnern ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das spezifisch wechselwirkende System von komplementär bindenden Partnern auf der Basis der Wechselwirkung von Nukleinsäure/komplementärer Nukleinsäure, Peptidnukleinsäure/Nukleinsäure, Enzym/Substrat, Rezeptor/Effektor, Lectin/Zucker, Antikörper/Antigen, Avidin/Biotin oder Streptavidin/Biotin erfolgt.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei in Schritt (c) das Fixieren an der festen Oberfläche unter Verwendung eines reaktiven Klebstoffs oder eines bifunktionellen Linkersystems durchgeführt wird, das eine oder mehrere Gruppen, die zum kovalenten Binden des Linkersystems an der festen Oberfläche und eine oder mehrere funktionelle Gruppen zum kovalenten Binden des polyfunktionellen Polymernetzwerks an dem kovalent gebundenen Linkersystem geeignet sind, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Linkersystem ein Halogensilan, ein Alkoxysilan, ein Acyloxysilan, ein Aminosilan, ein Disulfid oder eine Thiolgruppe umfasst.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Linkersystem eine photoreaktive Gruppe umfasst.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die photoreaktive Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus aromatischen Ketonen und schwefelhaltigen aromatischen Ketonen.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die photoreaktive Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Anthrathiongruppe oder einem Derivat davon, einer Anthrahinongruppe oder einem Derivat davon, einer Benzophenongruppe oder einem Derivat davon.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die feste Oberfläche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Metall- oder Halbmetalloberfläche, einer Metalloxid- oder Halbmetalloxidoberfläche und einer Polymeroberfläche.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei in Schritt (a) der selbsttragende Film eines polyfunktionellen Polymernetzwerks auf einer Oberfläche eines Trägerfilms gebildet wird und in Schritt (c) der Trägerfilm auf der festen Oberfläche mit der anderen Oberfläche fixiert wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei in einem weiteren Schritt nach Schritt (b) der selbsttragende Film in Lagen oder ein Endlos band mit einem gewünschten Format geschnitten wird, wobei das Band weiter wahlweise auf eine Trommel aufgewickelt werden kann.
Gemusterte aktive Oberfläche zur Biokonjugation, erhalten durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15.
Gemusterte aktive Oberfläche nach Anspruch 15, die eben oder nicht eben ist.
Gemusterte aktive Oberfläche nach Anspruch 16, die eben und ein Teil eines Sensorchips ist.
Medizinisches oder diagnostisches Instrument, umfassend eine gemusterte aktive Oberfläche nach einem der Ansprüche 15 bis 17.