DE60029230T2

DE60029230T2 - Dipeptidyl-peptidasen

Info

Publication number: DE60029230T2
Application number: DE60029230T
Authority: DE
Inventors: Anne Catherine Annandale ABBOTT; Douglas Mark Annandale GORELL
Original assignee: University of Sydney
Current assignee: University of Sydney
Priority date: 1999-09-10
Filing date: 2000-09-11
Publication date: 2007-06-06
Anticipated expiration: 2020-09-12
Also published as: DE60029230D1; WO2001019866A1; JP2003509041A; ATE332366T1; ES2269178T3; US20040191826A1; DK1214344T3; EP1214344B1; JP4748908B2; EP1214344A4; US6881564B1; EP1214344A1; US7148338B2; CA2384135A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft eine Dipeptidylpeptidase, ein Nukleinsäuremolekül, das für diese kodiert, und die Verwendung der Peptidase.
STAND DER TECHNIK FÜR DIE ERFINDUNG
Die Genfamilie der Dipeptidylpeptidase-(DPP-)IV-artigen ist eine Familie von Molekülen, die eine verwandte Proteinstruktur und Funktion [1–3] haben. Die Genfamilie umfasst folgende Moleküle: DPPIV (CD26), das Dipeptidylaminopeptidase-artige Protein (DPP6) und das Fibroblastenaktivierungsprotein (FAP) [1, 2, 4, 5]. Ein weiteres mögliches Mitglied ist DPPIV-β [6].
Die Moleküle der Genfamilie der DPPIV-artigen sind Serinproteasen, sie sind Mitglieder der Peptidasefamilie S9b und zusammen mit Prolylendopeptidase (S9a) und Acylaminoacylpeptidase (S9c) sind sie in der Prolyloligopeptidasenfamilie [5, 7] enthalten.
DPPIV und FAP haben beide eine ähnliche Postprolindipeptidylaminopeptidase-Aktivität, jedoch hat, anders als DPPIV, FAP auch eine Gelatinaseaktivität [8, 9].
DPPIV-Substrate umfassen Chemokine wie RANTES, Eotaxin, von Makrophagen abgeleitetes Chemokin und von Stromazellen abgeleiteten Faktor 1, Wachstumsfaktoren wie Glucagon und glucagonartige Peptide 1 und 2, Neuropeptide, einschließlich Neuropeptid Y und Substanz P, und vasoaktive Peptide [10–12].
DPPIV und FAP haben auch eine nicht-katalytische Aktivität, DPPIV bindet Adenosindeaminase und FAP bindet an α₃β₁- und α₅β₁-Integrin [13–14].
Hinsichtlich dieser Aktivitäten ist es wahrscheinlich, dass die Mitglieder der DPPIV-artigen Familie Aufgaben bei der Verarbeitung von Prolin enthaltenden Peptiden in Darm und Niere, Zelladhäsion, dem Peptidstoffwechsel, einschließlich dem Stoffwechsel von Cytokinen, Neuropeptiden, Wachstumsfaktoren und Chemokinen, und in immunologischen Vorgängen, insbesondere der T-Zell-Stimulation [3, 11, 12], haben.
Demzufolge ist es wahrscheinlich, dass die Mitglieder der Familie der DPPIV-artigen am Verlauf von Krankheiten, einschließlich beispielsweise Tumorwachstum und -biologie, Diabetes Typ II, Zirrhose, Autoimmunität, Transplantatabstoßung und HIV-Infektionen, beteiligt sind [3, 15–18].
Es hat sich gezeigt, dass Inhibitoren der DPPIV Arthritis unterdrücken und das Überleben von Fremdherztransplantierten im Tierversuch in vivo [19, 20] verlängern. Es ist berichtet worden, dass einige Inhibitoren der DPPIV eine HIV-Infektion [21] hemmen. Dabei wird vermutet, dass DPPIV-Inhibitoren bei anderen therapeutischen Verwendungen, einschließlich der Behandlung von Durchfall, Wachstumshormondefizit, der Senkung von Glucosespiegeln bei nicht insulinabhängigem Diabetes mellitus und anderen Störungen, an denen eine Glucoseintoleranz beteiligt ist, bei der Verbesserung der Schleimhautregeneration und als Immunsuppressoren [3, 21–24] nützlich sein werden.
Deshalb besteht die Notwendigkeit der Identifizierung von Mitgliedern der DPPIV-artigen Genfamilie, da diese die Identifizierung von (einem) Inhibitor(en) mit Spezifität für ein oder mehrere bestimmte Familienmitglieder erlaubt, die zum Zweck der Behandlung einer Krankheit verabreicht werden können. Alternativ kann das identifizierte Mitglied selbst zur Behandlung einer Krankheit nützlich sein.
In EMBL-Datenbank Acc. Nr. AA417787 befindet sich die Homo-sapiens-cDNA-Klon-Abbildung: 746184 5', die ähnlich ist mit TR:G577284-Dipeptidylpeptidase IV.
In EMBL-Datenbank Acc. Nr. AA278625 befindet sich die Homo-sapiens-cDNA-Klon-Abbildung: 703652 5', die ähnlich ist mit der SW:DPP4_Ratten-P14740-Dipeptidylpeptidase IV.
In EMBL-Datenbank Acc. Nr. AA496257 befindet sich eine Homo-sapiens-cDNA-Klon-Abbildung: 814167 3', die ähnlich ist mit SW:DPP6_humanes P42658-Dipeptidylpeptidase-IV-artiges Protein.
Die Erfindung versucht das weiter oben genannte Bedürfnis zu befriedigen und stellt in einem ersten Merkmal ein Peptid nach Patentanspruch 1 bereit.
Dieses Peptid hat Substratspezifität für die Verbindungen H-Ala-Pro-pNA, H-Gly-Pro-pNA und H-Arg-Pro-pNA. Deshalb ist es eine Prolyloligopeptidase und eine Dipeptidylpeptidase, da es in der Lage ist, die Peptidbindung C-terminal zu Prolin in diesen Verbindungen zu hydrolysieren.
Das Peptid ist homolog mit der humanen DPPIV und, was von Bedeutung ist, es ist Identität zwischen den DPPIV-Sequenzen und SEQ ID Nr. 1 in der DPPIV-Region beobachtet worden, welche die katalytischen Triadenreste und die zwei Glutamatreste der für die DPPIV-Enzymaktivität we sentlichen β-Propeller-Domäne enthält. Die Feststellung der Aminosäuresequenzhomologie bedeutet, dass das Peptid, das die in SEQ ID Nr. 1 gezeigte Aminosäuresequenz besitzt, ein Mitglied der DPPIV-artigen Genfamilie ist. Dementsprechend wurde das Peptid vorläufig als DPPIVL1 bezeichnet und wird jetzt als DPP8 bezeichnet und hierin beschrieben.
Folgende Sequenzen der humanen DPPIV-Aminosäuresequenz sind für die katalytische Aktivität der DPPIV von Bedeutung: (I) Tyr⁶²⁷GlyTrpSerTyrGlyGlyTyrVal, (II) Ala⁷⁰⁷AspAspAsnValHisPhe, (III) Glu⁷³⁸AspHisGlyIleAlaGln und (IV) Tyr²⁰¹ValTyrGluGluVal [25–28]. Wie hierin beschrieben lässt das Alignment der folgenden Sequenzen von DPP8: His⁷³⁶GlyTrpSerTyrGlyGlyTyrLeu, Leu⁸¹⁶AspGluAsnValHisPheAla, Glu⁸⁴⁷ArgHisSerIleArg und Phe²⁵⁵ValLeuGlnGluGluPhe mit den jeweiligen Sequenzen (I) bis (IV) vermuten, dass diese DPP8-Sequenzen der DPP8 wahrscheinlich die katalytische Aktivität verleihen. Somit wird in einem zweiten Merkmal erfindungsgemäß ein Peptid bereitgestellt, das die Aminosäuresequenzen: His⁷³⁶GlyTrpSerTyrGlyGlyTyrLeu, Leu⁸¹⁶AspGluAsnValHisPheAlaHis, Glu⁸⁴⁷ArgHisSerIleArg und Phe²⁵⁵ValLeuGlnGluGluPhe umfasst und welches die Substratspezifität der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz besitzt.
Wie ebenfalls hierin beschrieben wird beobachtet, dass bei Anwendung eines mehrfachen Sequenzalignments DPP8 eine 55%ige Aminosäureähnlichkeit und 32%ige Aminosäureidentität mit einem C.-elegans-Protein hat. Weiterhin ist, wie hierin gezeigt wird, ein Nukleinsäuremolekül, das für DPP8 kodiert, in der Lage, spezifisch mit DPP8-Sequenzen, die sich von nicht-humanen Spezies ableiten, zu hybridisieren. Zusammen legen diese Daten nahe, dass DPP8 in nicht-humanen Spezies exprimiert wird. Somit wird in einem dritten erfindungsgemäßen Merkmal ein Peptid bereitgestellt, das eine mindestens 60%ige Aminosäureidentität mit der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Aminosäuresequenz hat und welches die Substratspezifität der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz hat. Vorzugsweise beträgt die Aminosäureidentität 75%. Besonders bevorzugt beträgt die Aminosäureidentität 95%. Die Aminosäureidentität wird berechnet unter Verwendung der GAP-Software [GCG Version 8, Genetics Computer Group, Madison, WI, USA], wie weiterhin hierin beschrieben. Typischerweise umfasst die nicht-humane DPP8 folgende Sequenzen: His⁷³⁶GlyTrpSerTyrGlyGlyTyrLeu, Leu⁸¹⁶AspGluAsnValHisPheAlaHis, Glu⁸⁴⁷ArgHisSerIleArg und Phe²⁵⁵ValLeuGlnGluGluPhe.
Hinsichtlich der Homologie zwischen den DPPIV- und DPP8-Aminosäuresequenzen wird erwartet, dass diese Sequenzen eine ähnliche Tertiärstruktur haben. Dies bedeutet, dass es wahrscheinlich ist, dass die Tertiärstruktur der DPP8 die siebenblättrige β-Propeller-Domäne und die α/β-Hydrolase-Domäne der DPPIV enthält. Es ist wahrscheinlich, dass diese Strukturen in der DPP8 von den Regionen verliehen werden, die β-Propeller, Gly¹⁸⁰ bis Asp⁶⁰⁶, α/β-Hydrolase, Ser⁶⁰⁷ bis Ile⁸⁸² und etwa 70 bis 100 Reste in der Region Arg³⁹ bis Gln¹⁷⁹ umfassen. Da es bekannt ist, dass die β-Propeller-Domäne die Proteolyse reguliert, die von der katalytischen Triade in der α/β-Hydrolase-Domäne der Prolyloligopeptidase vermittelt wird, wird in [29] vermutet, dass trunkierte Formen von DPP8 produziert werden können, welche die Substratspezifität der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz haben, welche die weiter oben genannten Regionen umfassen (His⁷³⁶GlyTrpSerTyrGlyGlyTyrLeu, Leu⁸¹⁶AspGluAsnValHisPheAlaHis, Glu⁸⁴⁷ArgHisSerIleArg und Phe²⁵⁵ValLeuGlnGluGluPhe), welche der DPP8 die katalytische Spezifität verleihen. Beispiele für trunkierte Formen der DPP8, die hergestellt werden können, sind diejenigen, in welchen die Region, welche die β-Propeller-Domäne verleiht, und die die α/β-Hydrolase-Domäne verleiht, miteinander verspleißt sind. Weitere Beispiele für trunkierte Formen umfassen diejenigen, die von gespleißten Varianten der DPP8-mRNA kodiert werden. Obwohl so, wie hierin beschrieben, die biochemische Charakterisierung von DPP8 zeigt, dass DPP8 aus 882 Aminosäuren besteht und ein Molekulargewicht von etwa 100 kDa hat, ist erkannt worden, dass trunkierte Formen der DPP8, welche die Substratspezifität der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz haben, unter Anwendung von Standardverfahren [30, 31] hergestellt werden können. Somit wird in einem erfindungsgemäßen vierten Merkmal ein Fragment der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz bereitgestellt, das die Substratspezifität der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz hat. Vorzugsweise hat das Fragment eine in SEQ ID Nr. 3, 5 oder 7 gezeigte Aminosäuresequenz.
Wie hierin beschrieben, enthält die in SEQ ID Nr. 1 gezeigte Sequenz keine Konsensus-Sequenz für eine N-verknüpfte Glykosylierung. Deshalb ist es unwahrscheinlich, dass DPP8 mit der N-verknüpften Glykosylierung verbunden ist. In dieser Hinsicht unterscheidet sich DPP8 von den anderen Mitgliedern der DPPIV-artigen Genfamilie, die zwischen 6 und 9 Konsensus-Sequenzen für die N-verknüpfte Glykosylierung enthalten. So ist in einer Ausführungsform ein Asparaginrest in dem Peptid des ersten erfindungsgemäßen Merkmals nicht mit einem Kohlenhydratmolekül verknüpft.
Die Analyse der hier beschriebenen DPP8-Expression zeigt, dass es wahrscheinlich ist, dass DPP8 als ein Zellplasmaprotein exprimiert wird. Die DPP8-Expression unterscheidet sich deshalb von den anderen Mitgliedern der DPPIV-artigen Genfamilie, die auf der Zellplasmamembran oder, anders ausgedrückt, auf der Zelloberflächenmembran exprimiert werden. Somit wird in einer weiteren Ausführungsform das Peptid des ersten erfindungsgemäßen Merkmals nicht auf einer Zelloberflächenmembran einer Zelle exprimiert.
Es ist festgestellt worden, dass DPP8 fusioniert oder, anders ausgedrückt, mit einer weiteren Aminosäuresequenz verknüpft werden kann, um ein Fusionsprotein zu bilden, das die Substratspezifität der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz besitzt. Ein Beispiel für ein Fusionsprotein wird hierin beschrieben, das die in SEQ ID Nr. 1 gezeigte Sequenz umfasst, die mit einer weiteren Aminosäuresequenz verknüpft ist: einer "tag"-Sequenz, die aus einer Aminosäuresequenz besteht, die für das V5-Epitop und ein His-tag kodiert. Ein Beispiel für eine weitere andere Aminosäuresequenz, die mit DPP8 verknüpft werden kann, ist eine Glutathion-S-Transferase-(GST-)Domäne [30]. Ein anderes Beispiel für eine weitere Aminosäuresequenz ist ein Teil von CD8α [8]. Somit wird in einem erfindungsgemäßen Merkmal ein Fusionsprotein bereitgestellt, das die in SEQ ID Nr. 1 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst, die mit einer weiteren Aminosäuresequenz verknüpft ist, wobei das Fusionsprotein die Substratspezifität der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz besitzt.
Weiterhin ist festgestellt worden, dass das Peptid des ersten erfindungsgemäßen Merkmals in einem Polypeptid derart enthalten sein kann, dass das Polypeptid die Substratspezifität von DPP8 besitzt. Das Polypeptid kann beispielsweise für eine Veränderung der Proteasesuszeptibilität von DPP8, wenn es in in-vivo-Verwendungen eingesetzt wird, nützlich sein. Ein Beispiel für ein Polypeptid, das in dieser Hinsicht nützlich sein kann, ist Albu min. Somit ist in einer weiteren Ausführungsform das Peptid des ersten Merkmals in einem Polypeptid enthalten, das die Substratspezifität von DPP8 besitzt.
Wie weiter oben erwähnt, ist die Isolierung und Charakterisierung der DPP8 zur Identifizierung von Inhibitoren der katalytischen DPP8-Aktivität, die für die Behandlung einer Krankheit nützlich sein können, erforderlich. In einem hier beschriebenen Verfahren zur Identifizierung von Inhibitoren der katalytischen DPP8-Aktivität ist identifiziert worden, dass verschiedene Inhibitoren von DPPIV und Serinproteasen, Zink und mimetischen Peptiden, Ala-Pro-Gly und Lys-Pro, aber keine Inhibitoren von Metallproteinasen, Aspartylproteinasen oder Cysteinylproteasen die katalytische DPP8-Aktivität inhibieren. Dementsprechend wird in einem fünften erfindungsgemäßen Merkmal ein Verfahren zur Identifizierung eines Moleküls bereitgestellt, das in der Lage ist, die Spaltung eines Substrats durch DPP8 zu inhibieren, und welches die folgenden Schritte umfasst:

(a) Kontaktieren von DPP8 mit dem Molekül,
(b) Kontaktieren von DPP8 von Stufe (a) mit einem Substrat, das in der Lage ist, von DPP8 gespalten zu werden, unter Bedingungen, die für die Spaltung des Substrats durch DPP8 ausreichend sind, und
(c) Detektieren von nicht durch die DPP8 gespaltenem Substrat, um zu identifizieren, dass das Molekül in der Lage ist, die Spaltung des Substrats durch DPP8 zu inhibieren.

Es ist festgestellt worden, dass, obwohl Inhibitoren von DPP8 auch DPPIV und andere Serinproteasen inhibieren können, wie hierin beschrieben, das Alignment der DPP8- Aminosäuresequenz mit den am engsten verwandten Molekülen (das heißt DPPIV) zeigt, dass die DPP8-Aminosäure, insbesondere in den Regionen, welche die Substratspezifität kontrollieren, anders ist. Dementsprechend wird erwartet, dass es möglich ist, Inhibitoren zu identifizieren, welche die katalytische DPP8-Aktivität spezifisch inhibieren, aber die katalytische Aktivität der Mitglieder der Genfamilie der DPPIV-artigen oder anderer Serinproteasen nicht inhibieren. Somit wird im erfindungsgemäßen sechsten Merkmal ein Verfahnen zur Identifizierung eines Moleküls, das in der Lage ist, die Spaltung eines Substrats durch DPP8 spezifisch zu inhibieren bereitgestellt, das die Schritte umfasst:

(a) Kontaktieren von DPP8 und einer weiteren Protease mit dem Molekül,
(b) Kontaktieren von DPP8 und der weiteren Protease von Schritt (a) mit einem Substrat, das in der Lage ist, von der DPP8 und der weiteren Protease gespalten zu werden, unter Bedingungen, die für die Spaltung des Substrats durch DPP8 und die weitere Protease ausreichend sind, und
(c) Detektieren von nicht durch DPP8, jedoch durch die weitere Protease gespaltenem Substrat, um zu identifizieren, dass das Molekül in der Lage ist, spezifisch die Spaltung des Substrats durch DPP8 zu inhibieren.

Im siebenten erfindungsgemäßen Merkmal wird ein Verfahren zur Senkung oder Inhibierung der katalytischen Aktivität von DPP8 bereitgestellt, das den Schritt des Kontaktierens von DPP8 mit einem Inhibitor der katalytischen Aktivität von DPP8 umfasst. Da verschiedene Inhibitoren der katalytischen Aktivität von DPPIV hier beschrieben wer den, welche die katalytische Aktivität von DPP8 inhibieren, ist festzustellen, dass auch andere Inhibitoren von DPPIV zum Inhibieren der katalytischen Aktivität von DPP8 nützlich sein können. Beispiele für Inhibitoren, die für eine Verwendung im siebenten Merkmal geeignet sind, sind in [21, 32, 33] beschrieben. Andere Inhibitoren, die für das Inhibieren der katalytischen Aktivität von DPP8 nützlich sind, können durch die Verfahren des fünften oder sechsten erfindungsgemäßen Merkmals, die hierin exemplifiziert werden, identifiziert werden.
In einer Ausführungsform wird die katalytische Aktivität von DPP8 in einem Säugetier durch Verabreichen des Inhibitors der katalytischen Aktivität von DPP8 an dieses gesenkt oder inhibiert. Dabei ist festgestellt worden, dass diese Inhibitoren verwendet worden sind, um die katalytische Aktivität von DPPIV in vivo zu senken oder zu inhibieren, und deshalb auch zum Inhibieren der katalytischen Aktivität von DPP8 in vivo verwendet werden können. Beispiele für Inhibitoren, die für diesen Zweck nützlich sind, sind in [21, 32–34] beschrieben.
Vorzugsweise wird die katalytische Aktivität von DPP8 in einem Säugetier zu dem Zweck, in diesem eine Krankheit zu behandeln, gesenkt oder inhibiert. Krankheiten, bei welchen es wahrscheinlich ist, dass sie sich mit einem Inhibitor der katalytischen Aktivität von DPP8 behandeln lassen, sind solche, an welchen Mitglieder der Genfamilie der DPPIV-artigen beteiligt sind [3, 10, 11, 17, 21, 36], einschließlich beispielsweise Neoplasie, Diabetes Typ II, Zirrhose, Autoimmunität, Transplantatabstoßung und HIV-Infektion.
Vorzugsweise ist der Inhibitor für eine Verwendung im siebenten erfindungsgemäßen Merkmal ein solcher, der die Spaltung einer an Prolin angrenzenden C-terminalen Pep tidbindung inhibiert. Wie hierin beschrieben, sind Beispiele für diese Inhibitoren 4-(2-Aminoethyl)benzolsulfonylfluorid, Aprotinin, Benzamidin/HCl, Ala-Pro-Gly, H-Lys-Pro-OH-HCl-Salz und Zinkionen, beispielsweise Zinksulfat oder Zinkchlorid. Besonders bevorzugt ist der Inhibitor ein solcher, der spezifisch die katalytische Aktivität von DPP8 inhibiert und die katalytische Aktivität anderer Serinproteasen, einschließlich beispielsweise DPPIV oder FAP, nicht inhibiert.
Im achten erfindungsgemäßen Merkmal wird ein Verfahren zum Spalten eines Substrats bereitgestellt, welches das Kontaktieren des Substrats mit DPP8 unter Bedingungen umfasst, die für die Spaltung des Substrats durch DPP8 ausreichen, um das Substrat zu spalten. Beispiele für Moleküle, die durch das Verfahren gespaltet werden können, sind H-Ala-Pro-pNA, H-Gly-Pro-pNA und H-Arg-Pro-pNA. Die Bedingungen, die für eine Spaltung des Substrats ausreichen, werden hierin beschrieben. Moleküle, welche durch DPPIV gespalten werden, umfassen RANTES, Eotaxin, von Makrophagen abgeleitetes Chemokin, von Stromazellen abgeleiteten Faktor 1, Glucagon und glucagonartige Peptide 1 und 2, Neuropeptid Y, Substanz P und ein vasoaktives Peptid, von welchen es auch wahrscheinlich ist, dass sie von DPP8 gespaltet werden [11, 12]. In einer Ausführungsform wird das Substrat gespaltet, indem eine an Prolin angrenzende C-terminale Peptidbindung im Substrat gespaltet wird. Die von DPP8 gespaltenen Moleküle können Ala oder Trp, Ser, Gly, Val oder Leu in P1-Position anstelle von Pro [11, 12] haben.
Wie hierin beschrieben, wird die DPP8-Gen-Expression in stimulierten Lymphozyten und Lymphozytenzelllinien aufreguliert, was vermuten lässt, dass DPP8 eine funktionale Rolle in der T-Zellen-Kostimulation und -proliferation haben kann. Es ist deshalb festgestellt worden, dass die Messung der DPP8-Gen-Expression zum Detektieren der T-Zellen-Aktivierung nützlich ist. Somit wird im erfindungsgemäßen neunten Merkmal ein Verfahren zum Detektieren einer aktivierten T-Zelle bereitgestellt, wobei das Verfahren den Schritt des Detektierens des Niveaus der DPP8-Gen-Expression in einer T-Zelle umfasst. In einer Ausführungsform wird das Niveau der DPP8-Gen-Expression durch Messen der Menge der DPP8-mRNA in der Zelle, wie hierin beschrieben wird, detektiert.
Von den Erfindern ist die Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls charakterisiert worden, welches für die in SEQ ID Nr. 1 gezeigte Aminosäuresequenz kodiert. Somit wird im zehnten erfindungsgemäßen Merkmal ein Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, das für die in SEQ ID Nr. 1 gezeigte Aminosäuresequenz kodiert.
Im elften erfindungsgemäßen Merkmal wird ein Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, das aus der in SEQ ID Nr. 2 gezeigten Sequenz besteht.
Wie hierin beschrieben, sind mindestens drei Spleißvarianten der DPP8-RNA, die einen offenen Leserahmen von 2,6 bis 3,1 kb Länge haben, festgestellt worden. Da eine Rahmenverschiebungsmutation oder ein Terminationssignal in der Sequenz dieser Spleißvarianten nicht beobachtet wurde und die Kodierungssequenz von zwei der Spleißvarianten eine Sequenz umfasst, welche für die Aminosäuresequenz kodiert, die mit der katalytischen Aktivität verbunden ist, ist festgestellt worden, dass einige der Peptide, für welche von den Spleißvarianten kodiert wird, wahrscheinlich die Substratspezifität der DPP8 haben. Somit ist in einer Ausführungsform das Nukleinsäuremolekül ein Fragment der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz, das eine Länge von etwa 2,6 bis 3,1 kb hat und für ein Peptid ko diert, das die Substratspezifität der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz besitzt. Vorzugsweise hat das Nukleinsäuremolekül eine Sequenz, die in einer von SEQ ID Nr. 4, 6 und 8 gezeigt ist.
Im zwölften erfindungsgemäßen Merkmal wird ein Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, das in der Lage ist, mit einem Nukleinsäuremolekül, das aus der in SEQ ID Nr. 2 gezeigten Sequenz besteht, unter stringenten Bedingungen zu hybridisieren, und welches für ein Peptid kodiert, das die Substratspezifität der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz hat. Wie von der weiter unten beschriebenen Northern-Blot-Analyse gezeigt, hybridisiert DPP8-mRNA spezifisch mit der in SEQ ID Nr. 2 gezeigten Sequenz nach Waschen in 2 × SSC/1,0% SDS bei 37°C oder nach Waschen in 0,1 × SSC/0,1% SDS bei 50°C. "Stringente Bedingungen" sind Bedingungen, unter welchen das Nukleinsäuremolekül 2 × SSC/1,0% SDS ausgesetzt wird. Vorzugsweise ist das Nukleinsäuremolekül in der Lage, mit einem Molekül, das aus der in SEQ ID Nr. 2 gezeigten Sequenz besteht, unter hochstringenten Bedingungen zu hybridisieren. "Hochstringente Bedingungen" sind Bedingungen, unter welchen das Nukleinsäuremolekül 0,1 × SSC/0,1% SDS bei 50°C ausgesetzt wird.
Wie weiter unten beschrieben, wird von den Erfindern angenommen, dass das Gen, das für DPP8 kodiert, sich auf der Bande q22 auf dem humanen Chromosom 15 befindet. Der Locus des DPP8-Gens unterscheidet sich von den Genen, die für andere Prolyloligopeptidasen kodieren und sich auf Chromosom 2 auf den Banden 2q24.3 und 2q23 oder Chromosom 7 befinden. Somit ist in einer Ausführungsform das Nukleinsäuremolekül ein solches, das in der Lage ist, mit einem Gen zu hybridisieren, das sich auf der Bande q22 auf dem humanen Chromosom 15 befindet.
Es ist festzustellen, dass ein Nukleinsäuremolekül, das für die in SEQ ID Nr. 1 gezeigte Aminosäuresequenz kodiert oder welches die in SEQ ID Nr. 2 gezeigte Sequenz umfasst, hergestellt werden kann, indem das Fragment der Sequenz, die translatiert worden ist, unter Verwendung von Standardverfahren [30, 31] produziert wird.
Somit enthält in einer Ausführungsform das Nukleinsäuremolekül keine 5'- oder 3'-untranslatierten Sequenzen.
Im dreizehnten erfindungsgemäßen Merkmal wird ein Vektor bereitgestellt, der ein Nukleinsäuremolekül des zehnten erfindungsgemäßen Merkmals umfasst. In einer Ausführungsform ist der Vektor in der Lage, in einer COS-7-Zelle, CHO-Zelle bzw. 293T-Zelle oder E. coli zu replizieren. In einer weiteren Ausführungsform wird der Vektor aus der Gruppe ausgewählt, die aus λTripleEx, pTripleEx, pGEM-T Easy Vector, pSecTag2Hygro, pet15b, pEE14.HCMV.gs und pCDNA3.1/V5/His besteht.
Im vierzehnten erfindungsgemäßen Merkmal wird eine Zelle bereitgestellt, die einen Vektor des dreizehnten erfindungsgemäßen Merkmals umfasst. In einer Ausführungsform ist diese Zelle eine E.-coli-Zelle. Vorzugsweise ist E. coli MC1061, DH5α, JM109, BL21DE3 und pLysS. In einer anderen Ausführungsform ist die Zelle eine COS-7-, COS-1-, 293T- oder CHO-Zelle.
Im fünfzehnten erfindungsgemäßen Merkmal wird ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids des ersten erfindungsgemäßen Merkmals bereitgestellt, welches das Halten einer Zelle entsprechend dem vierzehnten erfindungsgemäßen Merkmal unter Bedingungen, die für die Expression des Peptids durch die Zelle ausreichend sind, umfasst. Die Bedingungen, die für die Expression ausreichend sind, werden hierin beschrieben. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren den weiteren Schritt des Isolierens des Peptids.
Im sechzehnten erfindungsgemäßen Merkmal wird ein Peptid bereitgestellt, das durch das Verfahren des fünfzehnten Merkmals hergestellt worden ist.
Im siebzehnten erfindungsgemäßen Merkmal wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, die ein Peptid des ersten erfindungsgemäßen Merkmals und einen pharmazeutisch geeigneten Träger umfasst.
Im achtzehnten erfindungsgemäßen Merkmal wird ein Antikörper bereitgestellt, der in der Lage ist, an ein Peptid entsprechend dem ersten erfindungsgemäßen Merkmal zu binden. Der Antikörper kann hergestellt werden, indem ein Lebewesen mit gereinigter DPP8 oder einem Fragment davon gemäß Standardverfahren [35] immunisiert wird. Wie weiter unten beschrieben, wurde ein Antikörper durch Immunisieren mit vorübergehend transfektierten DPP8⁺-Zellen hergestellt. Es ist festzustellen, dass der Antikörper zum Inhibieren der Aktivität von DPP8 oder zum Detektieren einer erhöhten Genexpression von DPP8 zum Zweck der Identifizierung einer aktivierten T-Zelle nützlich ist. In einer Ausführungsform wird der Antikörper des achten erfindungsgemäßen Merkmals durch eine Hybridomzelle produziert.
Im neunzehnten erfindungsgemäßen Merkmal wird eine Hybridomzelle bereitgestellt, die einen Antikörper des neunzehnten erfindungsgemäßen Merkmals ausscheidet.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1. Klonierungsstrategie zum Isolieren der DPP8-cDNA in voller Länge und der beobachteten alternativen Spleißvarianten von DPP8. Die Darstellung der drei Spleißvarianten ist gezeigt einschließlich des Verlustes der Serinerkennungsstelle durch eine Spleißvariante (T8).
2. Nukleotidsequenz und Aminosäuresequenz der humanen DPP8. Das Nukleotid und die vorhergesagte Ein-Buchstaben-Code-Aminosäuresequenz sind gezeigt. Diese Sequenz zeigt keine mutmaßliche Membranüberspannungsdomäne (abgeleitet aus Hydrophobie-Diagrammen) oder potentielle N-verknüpfte Glykosylierungsstellen. Die mutmaßliche Serinerkennungsstelle und Asparaginsäure und Histidin, welche die katalytische Ser-Asp-His-Triade bilden, sind markiert. Die Basenpaare sind am rechten Rand aufgezählt.
3. Alignment der abgeleiteten Aminosäurerestsequenz von DPP8 mit dem C.-elegans-Homologen von DPP8 und humaner DPPIV. Die Zahl der Aminosäurereste steht am rechten Rand. Die Aminosäurereste, die in allen drei Proteinen gleich sind, befinden sich in Kästchen. Mit Sternchen sind die vermuteten katalytischen Triadenreste und zwei Glutamate der β-Propeller-Domäne, die für die DPPIV-Enzymaktivität wesentlich ist, markiert. Mit der grauen Unterlegung ist die α/β-Hydrolase-Domäne dieser Proteine gekennzeichnet. Volle Dreiecke, die mit Linien verbunden sind, zeigen Beginn und Ende von alternativ gespleißten Transkripten stPBMCdy3-3-10 (durchgezogenen Linien), T8 (Strichellinien) und T21 (durchgezogenen Linien). Das Alignment wurde unter Verwendung des PILEUP-Programms in GCG konstruiert.
4. Northern-Blot-Analyse der DPP8-Expression. Humane mehrfache Gewebe-Northern-Blots (CLONTECH), die 2 μg pro Bande Poly-A*-RNA enthielten, wurden mit einer mit ³²P markierten DPP8-Sonde bei 68°C hybridisiert und bei hoher Stringenz gewaschen. Das Autoradiogramm wurde 1 Tag lang bei –70°C einem BIOMAX-MS-Raster ausgesetzt. Molekulargewichtsmarker sind in den Basenpaaren auf der linken Seite jedes Autoradiogramms angegeben. 4a. Master-RNA-(CLONTECH-)Blot von Poly-A*-RNA wurde mit einer mit ³²P markierten DPP8-Sonde bei 65°C hybridisiert und bei hoher Stringenz gewaschen. Das Autoradiogramm wurde 3 Tage lang bei –70°C einer BIOMAX-MS-Verstärkungsfolie ausgesetzt. DPP8-mRNA wurde in allen untersuchten Geweben detektiert.
5. Chromosomale Lokalisierung der humanen DPP8. Die Metaphase zeigt FISH mit der biotinylisierten DPP8-cDNA-Sonde. Normale männliche Chromosomen, angefärbt mit DAPI. Die Hybridisierungsstellen auf Chromosom 15 sind mit einem Pfeil gekennzeichnet.
6. Western-Blot-Analyse von transfektierten Zelllinien. Analyse von Lysaten stabiler Zelllinien. DPP8-Protein wurde in DPP8/V5/His-stabilen Zelllinien, aber nicht in DPP4- oder nur-Vektor-stabilen Zelllinien gesehen. Die elektrophoretische Mobilität des Proteins wurde nicht verändert, wenn die Proben gekocht wurden. Die Bande mit der größeren Mobilität war wahrscheinlich ein Abbauprodukt der intakten DPP8.
7. DPP8-Enzymaktivität. (A) pH-Abhängigkeit der DPP8-Enzymaktivität. (B) DPP8- und DPPIV-Enzymkinetik. Mittelwerte +/– SA der Veränderung des Absorptionsvermögens pro Minute, multipliziert mit 1000, sind gezeigt. Die Kurve passt zu der vermuteten Michaelis-Menten-Kinetik.
8. RT-PCR-Analyse der DPP8-Expression. PCR-Amplifikationen mit Primern, die entweder für einen Teil der humanen DPP8, der kein abwechselndes Spleißen enthielt, Val416 bis Gly679 (Oberseite eines jeden Gels) oder für Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (G3PDH) (Böden eines jeden Gels) spezifisch waren. (A) Oberseite des Gels, die Banden 1 bis 5 enthalten PCR-Produkte aus nicht stimulierter PBMC-cDNA von fünf Lebewesen. Unterseite des Gels, die Banden 6 bis 11 enthalten PCR-Produkte aus OKT3-stimulierter PBMC-cDNA von sechs Lebewesen. (B) Die PCR-Produkte sind von cDNA aus Lymphozytenzelllinien, Leber oder Plazenta, wie angegeben. Negative Kontrollamplifikationen enthielten ein Reaktionsgemisch, Enzym und kein cDNA-Templat. Jede PCR wurde 35 Zyklen lang durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden auf Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen und mit Ethidiumbromid angefärbt. Die linke Bande eines jeden Gels enthält PUC19, verdaut mit HaeIII als Größenmarker.
9. Northern-Blot-Analyse einer Maus-DPP8-Expression. Ein Maus-Northern-Blot, der 10 μg pro Bande Gesamt-RNA enthielt, wurde mit einer mit ³²P markierten humanen DPP8-Sonde bei 60°C hybridisiert und bei niedriger Stringenz gewaschen. Die autoradiographische Exposition betrug 3 Tage lang bei –70°C mit einer BIOMAX-MS-Verstärkungsfolie.
SPEZIELLE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
BEISPIELE
Allgemeines
Restriktionsenzyme und andere beim Klonieren verwendete Enzyme wurden von Boehringer Mannheim Roche erhalten. Sofern nichts anderes angegeben, wurden molekularbiologische Standardverfahren [31] angewendet.
Ein EST-Klon (GENBANK^TM, Zugangsnummer AA417787) wurde von American Type Culture Collection erhalten. Das DNA-Insert dieses Klons wurde an beiden Strängen unter Anwendung eines automatisierten Sequenzierens in SUPAMAC (Sydney, Australien) sequenziert.
Zellkultur und RNA-Herstellung
Monocyten (PBMCs) aus humanem peripherem Blut wurden durch Ficoll-Hypaque-Dichtegradientenzentrifugieren (Pharmacia, Uppsala, Schweden) aus Blut, das von gesunden Spendern erhalten worden war, isoliert. Die PBMCs wurden in einem AIM-V-Medium (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA), ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, inkubiert und entweder mit 1 μg·ml^–1 Phytohämagglutinin (Wellcome) oder 100 ng·ml^–1 OKT3 (Orthoclone, FL, USA) 72 h lang stimuliert. Die humanen Zelllinien Jurkat, CCRF-CEM, Raji, Daudi und HepG2 wurden sich in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (Trace Biosciences, NSW, Australien), ergänzt mit 10% Rinderfötusserum und 2 mM L-Glutamin, bis zur Konfluenz vermehren gelassen.
Leber- und Plazenta-RNA wurden aus schnell gefrorenem humanem Gewebe, wie in [37] beschrieben, hergestellt. Die RNA wurde jedoch aus PBMCs und Zelllinien unter Verwendung eines RNAeasy kit (Qiagen, Deutschland) hergestellt.
Bioinformatik
Die BLAST-Programme [38] und alle Mehrfachsequenzalignments wurden vom Australian National Genomic Information Service (ANGIS, Sydney, NSW, Australien) durchgeführt. PILEUP (GCG Version 8, Genetics Computer Group, Madison, WI, USA) wurde für die Mehrfachsequenzalignments der Proteine angewendet.
Eine BLAST-Suche wurde in der öffentlichen exprimierten Sequenz-tag-(EST-)Datenbank unter Verwendung der kompletten humanen DPPIV (GenBank^TM-Zugangsnummer X60708) und FAP-(Zugangsnummer U09278)Nukleotidsequenzen als Fragesequenzen durchgeführt. Ein EST-Klon (Zugangsnummer AA417787) wurde von der American Type Culture Collection erhalten. Das DNA-Insert dieses Klons wurde an beiden Strängen unter Anwendung eines automatischen Sequenzierens in SUPAMAC (Sydney, NSW, Australien) sequenziert. Wegen seiner Homologie mit DPPIV wurde dieses neue Gen als Dipeptidylpeptidase 8 (DPP8) bezeichnet.
DPP8-Klonierung
ESTAA417787 wurde verwendet zum Entwerfen von Vorwärts-(caa ata gaa att gac gat cag gtg)- und Rückwärts-(tct tga agg tag tgc aaa aga tgc)DPP8-Primern für die Polymerasekettenreaktion (PCR) aus ESTAA417787. Die PCR-Bedingungen waren wie folgt: 94°C 5 min lang, anschließend 35 Zyklen bei 94°C 1 Minute lang, 55°C 30 s lang und 70°C 1 min lang. Das 484-bp-PCR-Produkt wurde gelgereinigt, mit ³²P-α unter Verwendung von Megaprime Labeling Kit (Amersham Pharmacia Biotech, UK) mar kiert und mit einem Master-RNA-Blot (CLONTECH, Palo Alto, CA, USA) hybridisiert, der Poly A⁺ von 50 Erwachsenen- und Fötusgeweben, immobilisiert in Dots entsprechend den Anweisungen der Hersteller, enthielt. Dieser Master-RNA-Blot wurde auch mit DPP4 mit einer Sonde untersucht, zum Vergleich der mRNA-Gewebe-Expression.
Die Vorwärts- und Rückwärts-DPP8-Primer wurden für die PCR verwendet, um eine humane Plazenta-λ-STRETCH-PLUS-Bibliothek (CLONTECH, Palo Alto, CA, USA) auf das Vorhandensein von DPP8-cDNA in der Bibliothek zu durchmustern. Die Bibliothek wurde dann mit molekularbiologischem Standardverfahren [30, 31] durchmustert. Nach dem Haupt-Screening wurden 23 Klone für ein Neben-Screening ausgewählt, wonach 22 positiv blieben. Für das tertiäre Screening wurden die in λTripleEx enthaltenen Klone in pTriplEx-Plasmide umgewandelt und in BM25.8-E.-coli-Empfängerbakterien transformiert. Die ausgebreiteten Bakterien wurden durchmustert, und es wurde nachgewiesen, dass alle 22 Klone positiv waren. Zwei dieser Klone, T8 und T21, wurden für weitere Untersuchungen ausgewählt.
5' RACE (Schnelle Amplifikation von cDNA-Enden)
Ein 5' RACE Version 2.0 Kit (Gibco BRL, Life Technologies) wurde auf aktivierte T-Zellen (ATC) und Plazenta-RNA, wie in den Anweisungen des Kit vorgeschrieben, angewendet. Die T8-DNA-Sequenz wurde verwendet, um GSP 1 (TCC TTC CTT CAG CAT CAA TC) und GSP2 (CTT AAA AGT GAC TTT AGG ATT TGC TGT ACC) zu entwerfen. 5'-RACE-PCR-Produkte wurden in pGEM-T Easy^®Vector (Promega Co., Madison, WI, USA) kloniert und durch Primer-Laufen sequenziert.
Nachweis der Identität des RACE-Produkts
Reverse-Transkriptase-PCR wurde an ATC-RNA unter Verwendung von DPP8-pr23 (GGA AGA AGA TGC CAG ATC AGC TGG) und DPP8-pr19r (TCC GTG TAT CCT GTA TCA TAG AAG) durchgeführt, um die Verbindung zwischen dem RACE-Produkt und dem EST- und dem Bibliotheksklon zu überspannen. Zwei gelgereinigte Produkte ATCd3-2-1 (1603 bp) und ATC3-3-10 (1077 bp) wurden in pGEM-T Easy^® (Promega Co., Madison, WI, USA) kloniert und sequenziert.
Unterklonierung von DPP8-cDNA in einen pcDNA3.1/V5/His-Expressionsvektor
Das ATC-RACE-Produkt, das ATCd3-2-1(1603 bp)-Verbindungsfragment und der Bibliotheksklon T21 wurden miteinander verbunden und in den Expressionsvektor pcDNA3.1/V5/His A (Invitrogen, Niederlande) kloniert, um eine DPP8-cDNA mit 3,1 kb und einem offenen Leserahmen von 882 aa zu bilden. Das erste Konstrukt wurde unter Anwendung von drei sequentiellen Klonierungsstufen hergestellt. Zunächst wurde ein Eco-RV/Xba-I-Fragment von T21 (enthielt 3'-DPP8, Stopcodon und 3'-untranslatierte Region an DPP8-cDNA) hergestellt und in den Vektor pcDNA3.1/V5/His A, der mit EcoRV/XbaI verdaut worden war, ligiert. Danach wurde ein Eco-RI/Eco-RV-Fragment von ATCd3-2-1 zu diesem mit EcoRI/EcoRV verdautem Konstrukt hinzugefügt. Schließlich wurde das RACE-Produkt mit EcoRI geschnitten und in die Eco-RI-Stelle des vorhergehenden Konstrukts kloniert, um die komplette 3,1 kb DPP8-cDNA zu bilden. Dieses pcDNA3.1-DPP8-Konstrukt exprimierte das Protein ohne einen detektierbaren tag. Zusätzlich wurde das Stopcodon in dem DPP8-Expressionskonstrukt in pcDNA3.1/V5/His V5 unter Anwendung der PCR genetisch verändert, um eine C-terminale Fusion mit dem im Vektor enthaltenen V5 und His-tag zu erzeugen. Dieses Konstrukt wurde als pcDNA3.1-DPP8/V5/His bezeichnet. Die in pcDNA3.1/V5/His subklonierten Expressionskonstrukte wurden durch eine vollständige Sequenzanalyse bestätigt.
DPP8-Genexpression durch Northern Blot
Humane Mehrfach-Gewebe-Northern-Blots (CLONTECH), die 2 μg Poly-A⁺-RNA enthielten, wurden in Express Hybridization solution (CLONTECH) 30 min bei 68°C vorhybridisiert. Sowohl das DPP8-484bp-Produkt als auch das 5'-RACE-ATC-Produkt wurden unter Verwendung eines Megaprime Labeling kit (Amersham Pharmacia Biotech) und [³²P] dCTP (NEN Dupont) radiomarkiert. Nicht eingebaute Markierung wurde unter Verwendung einer NICK-Säule (Amersham Pharmacia Biotech) entfernt und die denaturierte Sonde 2 h lang bei 68°C in Express Hybridization solution inkubiert. Es wurden Waschungen mit hoher Stringenz durchgeführt und Blots über Nacht einem BIOMAX-MS-Film mit einer BIOMAX-MS-Verstärkungsfolie bei –70°C exponiert.
DPP8-Genexpression in Mäusen durch Northern Blot
Ein Northern Blot, der 10 μg gesamte Leber-RNA pro Bande enthielt, wurde unter Anwendung von Standardverfahren [31] hergestellt. Die RNA wurde von männlichen und weiblichen Mäusen von zwei Stämmen, C57B16 und Balb/c, abgeleitet. Der Northern Blot wurde in Express Hybridization solution (CLONTECH, Palo Alto, USA) 1 h lang bei 60°C vorhybridisiert. Eine 2,4 kb humane DPP8-cDNA (PCR-Produkt) wurde unter Verwendung des Megaprime Labeling kit (Amersham Pharmacia Biotech) und [³²P] dCTP (NEN Dupont) radiomarkiert. Nicht eingebaute Markierung wurde unter Verwendung einer NICK-Säule (Amersham Pharmacia Biotech) entfernt und die denaturierte Sonde mit dem Blot über Nacht bei 60°C in Express Hybridization solution inkubiert. Es wurden Wäschen mit niedriger Stringenz (2 × SSC/0,05% SDS 1 h bei 37°C und anschließend 0,1 × SSC/0,1% SDS 30 min lang bei 40°C) durchgeführt und die Blots drei Tage lang einem BIOMAX-MS-Film mit einer BIOMAX-MS-Verstärkungsfolie bei –70°C exponiert.
Expression von DPP8 in Mäuseleber unter Anwendung von rtPCR
Mausleber-RNA wurde unter Verwendung des Superscript II enzyme kit (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), wie bereits beschrieben [42], revers transkribiert. Die cDNA wurde 1 zu 4 verdünnt und in Aliquoten bei –70°C aufbewahrt. Es wurde eine PCR unter Verwendung von Maus-DPP8-pr1F (atg att acc acc cag gaa gcg) als Vorwärtsprimer und Maus-DPP8-pr2R (atc tcc gac atc ttg aaa gtg acc) als Rückwärtsprimer durchgeführt, um Maus-DPP8-mRNA zu detektieren.
Ein μl der verdünnten cDNA wurde in einer 50-μl-PCR-Reaktion amplifiziert, die 0,2 mM dNTPs, 1 μl 50 × Advantage 2 Polymerase Mix (Clontech), 1 × Advantage 2 PCR buffer (Clontech) und 100 ng des jeweiligen Primers enthielt. Die PCR enthielt einen ersten Schritt bei 95°C 1 min lang zur Inaktivierung des tagStart-Antikörpers. Darauf folgten 35 Zyklen, Denaturierung bei 95°C 30% lang, 68°C 1 min lang, gefolgt von einem letzten Schritt bei 68°C 1 min lang. Die amplifizierten Produkte wurden durch Elektrophorese von 10 μl der PCR-Reaktion auf einem 3:1 Nusieve-Gel (FMC Bioproducts, Rockville, MD) plus 0,5 μg/ml Ethidiumbromid in TAE-Puffer (0,04 M Tris-Acetat, 0,001 M EDTA, pH 8,0) analysiert. Das Gel wurde danach unter Anwendung von Standardverfahren [31] mit Southern Blot behandelt. Der Southern Blot wurde 2 h lang bei 60°C mit der 2,4 kb humanen DPP8-cDNA-Sonde hybridisiert, die wie weiter oben beschrieben hergestellt worden war. Es wurden Waschungen bei niedriger Stringenz (2 × SSC/0,05% SDS 1 h lang bei 37°C und anschließend 0,1 × SSC/0,1% SDS 40 min lang bei 50°C) durchgeführt. Der Blot wurde 30 min lang bei Raumtemperatur einem XAR5 Kodakfilm exponiert.
DPP8-Expression durch RT-PCR
Reverse-Transkriptase-PCR wurde mit humaner ATC-RNA, humaner Plazenta-RNA und humaner Leber-RNA unter Verwendung von TED-Primern DPP8/pr3 (GCA CTA CCT TCA AGA AAA CCT TGG) und DPP8/pr20R (TAT GGT ATT GCT GGG TCT CTC AGG) durchgeführt, um ein Produkt mit 293 bp zu ergeben.
Transfektion, Western Blot, Immuncytochemie, Cytochemie und Fließcytometrie
Affennierenfibroblasten-(COS-7-)Zellen (American Type Culture Collection, CRL-1651) wurden sich vermehren gelassen und wie bereits beschrieben [39] transfektiert. Zur Herstellung von stabilen Zelllinien wurde Geneticin (G418, Gibco-BRL) zu dem Medium zugegeben, beginnend 24 h nach der Transfektion. Es wurden COS-Zellextrakte durch Beschallung mit Ultraschall und anschließend durch Differenzialzentrifugieren hergestellt, dabei weder gekocht noch vor SDS/PAGE (10% Gel) reduziert, und auf Nitrocellulose wie bereits beschrieben [40, 9] übertragen. Das Vorhandensein von DPP8, fusioniert mit dem V5-Epitop, wurde unter Verwendung eines Anti-V5-mAb (Invitrogen) detektiert. COS-Zellen-Monoschichten wurden in kaltem Ethanol fixiert, bevor sie mit Anti-V5-mAB [39, 41, 9] angefärbt wurden. Einige Monoschichten wurden in 4% Paraformaldehyd fixiert und mit 0,1% Triton X-100 [35] permeabilisiert und anschließend mit Weizenkeimagglutinin, um den Golgi-Apparat zu markieren, und mit Ziegen-Anti-Maus-IgG, um DPP8 zu markieren, konjugiert mit Alexa Fluor 488 bzw. Alexa Fluor 594 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA), doppelt angefärbt. Fließzytometrie und konfokale Raster mikroskopie unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops Leica TCS-NT sind bereits beschrieben worden [39, 9].
Reinigung von rekombinantem DPP8/V5/His und DPPIV/V5/His
Zellen (1·10⁷), die das jeweilige Protein exprimierten, wurden in einem nativen Puffer (50 mM Natriumphosphat, 300 mM NaCl) mit Ultraschall beschallt und anschließend mit 700 U DNAse 20 min lang bei Raumtemperatur behandelt. DPPIV wurde auf der Zelloberfläche exprimiert, sodass 1% Triton X-100 zum Solubilisieren von DPPIV/V5/His verwendet wurde. Unlösliches Material wurde durch Zentrifugieren entfernt. Der Überstand wurde mit 1 ml Talon^® Metal Affinity Resin (Clontech) entsprechend den Vorschriften des Herstellers für einen Batch/Schwerkraft-Fließvorgang inkubiert. Das Harz wurde mit 50 mM Natriumphosphat, das 300 mM NaCl und 5 mM Imidazol enthielt, gewaschen, und die Proteine wurden unter Verwendung desselben Puffers, der 150 mM Imidazol enthielt, eluiert. Die Enzymaktivität wurde benutzt, um die eluierten Fraktionen zu überwachen.
Enzymassays
Die Enzymassays wurden wie bereits beschrieben [1] durchgeführt. Es wurde entweder ein geklärter Zellextrakt aus 1·10⁴ mit Ultraschall behandelten COS-7-Zellen oder von 1·10⁵ Zellen abgeleitetes gereinigtes Protein mit Substrat in 70 μl Phosphatpuffer, pH 7,4, 30 min lang bei 37°C inkubiert, sofern nichts anderes angegeben. Die spezifischen DPPIV-Substrate, Gly-Pro-Toluolsulfonat, H-Gly-Pro-p-Nitroanilid (NA)/HCl (Sigma, St Louis, MO, USA) und Gly-Pro-7-Amino-4-trifluormethylcumarin (Calbiochem, San Diego, CA, USA) wurden getestet. Weitere getestete Substrate waren H-Ala-Pro-pNA/HCl, H-Arg-Pro-pNA-acetatsalz, H-Lys-Ala-pNA·2HCl, H-Asp-Pro-pNA, H-Ala-Ala-pNA/HCl, H- Ala-Ala-Pro-pNA/HCl, H-Ala-Ala-Phe-pNA, Succinyl-Ala-Pro-pNA, H-Ala-Phe-Pro-pNA und Z-Ala-Pro-p-NA von Bachem (Schweiz). H-Ala-Pro-4-MethoxyβNA/HCl, Z-Lys-Pro-4-MethoxyβNA-formiatsalz, H-Lys-Pro-4-MethoxyβNA/HCl, Z-Ala-Pro-4-MethoxyβNA, H-Gly-Pro-βNA und H-His-Ser-4-MethoxyβNA-acetatsalz (Bachem) wurden auf ihr Vermögen getestet, unfixierte transfektierte Zellen anzufärben. Alle Inhibitoren wurden (siehe Tabelle 2) mit jedem gereinigten Enzym in Phosphatpuffer, pH 7,4, 15 min lang vor Substratzugabe inkubiert. Nach Zugabe von 1 mM H-Ala-Pro-pNA-Substrat zu der gereinigten DPP8 und 1 mM H-Gly-Pro-pNA-Substrat zu der gereinigten PPIV wurden die Proben 60 min lang bei 37°C inkubiert. Alle Enzymassays wurden dreimal durchgeführt.
Chromosomenlokalisierung von DPP8 durch Fluoreszenz in einer in-situ-Hybridisierungs-(FISH-)Analyse
DPP8 wurde unter Verwendung von zwei verschiedenen Sonden, dem DPP8-EST- und dem T8-Klon, lokalisiert. Die Sonden wurden mit Biotin-C¹⁴-dATP Nick-translatiert und in situ auf eine Endkonzentration von 10 ng/μl zu Metaphasen von zwei normalen Männchen hybridisiert. Die FISH-Methode wurde von der vorher beschriebenen [37] insoweit modifiziert, als Chromosomen vor der Analyse sowohl mit Propidiumiodid (als Gegenanfärbung) als auch DAPI (für die Chromosomenidentifizierung) angefärbt wurden. Bilder von Metaphasenpräparaten wurden von einer gekühlten CCD-Kamera unter Verwendung des Cyto Vision Ultra image collection and enhancement system (Applied Imaging International Ltd) aufgenommen. FISH-Signale und die DAPI-Bandenmuster wurden für die Anfertigung der Zeichnung miteinander verschmolzen.
DPP8-Expression in humanen Lymphozyten und Zelllinien
RNA (1 μg) wurde unter Verwendung des Superscript II enzyme kit (Gibco-BRL), wie bereits beschrieben [42], revers transkribiert. Es wurde eine PCR unter Verwendung von DPP8-pr18 (CTGTGACGCCACTAATTATCTATG) als Vorwärtsprimer und DPP8-pr26R (CCTAGAGAGGCTAGGGTATTCAAG) als Rückwärtsprimer durchgeführt, um die DPP8-mRNA mit voller Länge zu detektieren. Das Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase-(G3PDH-)Kontrollprimerset war G3PDH für (ACCACAGTCCATGCCATCAC) und G3PDHrev (TCCACCACCCTGTTGCTGTA), um ein 470-bp-Produkt zu ergeben.
cDNA (verdünnt 1:4, 1 μg) wurde in einem 25-μl-PCR-Gemisch amplifiziert, das enthielt: 0,2 mM dNTPs, 0,125 Einheiten Amplitaq Gold enzyme (Perkin-Elmer), 1 × Puffer II (Perkin-Elmer), 1,5 mM MgCl₂ und 100 ng ml^–1 eines jeden Primers. Die 35-Zyklus-PCR wurde wie folgt durchgeführt: Denaturierung bei 94°C 1 min lang, Primerannelierung bei 55°C 30 s lang und eine Verlängerungsstufe bei 72°C 1 min lang. Die amplifizierten Produkte wurden analysiert durch Elektrophorese eines 15 μl PCR-Gemischs auf einem 3:1 Nusieve-Gel (FMC Bioproducts, Rockville, MD, USA) plus 0,5 μg ml^–1 Ethidiumbromid in Tris/Acetat/EDTA-Puffer (0,04 M Tris/Acetat, 0,001 M EDTA, pH 8,0).
Anti-Peptid-Antikörper
Die folgenden Methoden sind im Current Protocols in Immunology [35] beschrieben. Zur Vorhersage von Antigenität wurden unter Verwendung der Software MacVector zwei Peptide ausgewählt. Diese wurden nach Kundenwunsch synthetisiert (Auspep, Melbourne) und mit Diphtherietoxin (Auspep, Melbourne) konjugiert. Es wurden Kaninchen mit beiden Peptiden immunisiert, und es wurde Serum zum Zeitpunkt Null nach jeder Injektion (IMVS, Adelaide) gesammelt.
Die zwei verwendeten Peptide waren:

Peptidname: TEDDA-N

Sequenz: CTGYTERYMGHPDQNEQG-NH2
Dies ist Aminosäuren 773 bis 789 plus Cys am N-Terminus.

Peptidname: TEDDR-C

Sequenz: GKPYDLQIYPQERHSC-NH2
Dies ist Aminosäuren 836 bis 850 plus Cys am C-Terminus.
Diese Sequenzen wurden dem C-terminalen Teil von DPP8 entnommen.
Monoklonaler Antikörper gegen DPP8
Zu der Antikörperproduktion wurden Standardverfahren angewendet [35]. Es wurden Mäuse immunisiert mit 2·10⁷ lebenden COS-7-Zellen (aus der Niere von Afrikanischen Grünen Meerkatzen), die zuvor vorübergehend mit der DPP8-cDNA in dem pcDNA3-Vektor transfektiert worden waren. Die endgültige Immunisierung erfolgte mit CHO-Zellen (von Eierstöcken chinesischer Hamster), die mit DPP8-cDNA in dem pEE14-Vektor stabil transfektiert worden waren. Milzzellen wurden mit einem Standardfusionspartner, X63Ag8-Myelomzellen, fusioniert. Hybridomen-Kulturüberstände wurden durch Immunperoxidase-Histochemie auf Monoschichten aus der DPP8-transfektierten CHO-Zelllinie unter Verwendung von nicht transfektierten CHO-Zellen als Negativkontrolle getestet. Hybridomen, die eine Antikörperaktivität produzierten, wurden kloniert.
ERGEBNISSE
Molekülklonieren und Sequenzanalyse von DPP8
Das Insert in ATCC EST AA417787 hatte eine Länge von 795 bp und enthielt 527 bp Kodiersequenz, ein TAA-Stopcodon und 258 bp der 3'-nicht-kodierenden Sequenz (1).
Die Hybridisierung des Master-RNA-Blot zeigte, dass das ESTAA417787 umfassende Gen eine ubiquitäre Gewebeexpression mit hohen Expressionsniveaus in Hoden und Plazenta besaß. Basierend auf diesem Expressionsmuster wurde eine Plazenta-cDNA-Bibliothek mit einem 484-bp-PCR-Produkt durchmustert, das durch den Vorwärts- und Rückwärts-DPP8-Primer hergestellt worden war. Die Sequenzhomologieanalyse zeigte, dass nur 2 von 23 Klonen die 5'-Sequenz zu sätzlich zu der Sequenz EST AA417787 enthielten. Diese cDNA-Klone wurden als T8 und T21 bezeichnet und hatten 1669 bp bzw. 1197 bp (1). Zusätzlich zeigte der Vergleich dieser Sequenzen mit EST AA417787, dass der T8-cDNA eine 153-bp-(51aa-)Region fehlte, die in der T21-cDNA und ESTAA417787 vorhanden war. Diese Deletion wird im Verlust des katalytischen Series (GWSYGG) in der T8-cDNA resultieren. Es zeigte sich, dass viele der anderen charakterisierten Klone eine nicht verwandte Sequenz enthielten, die wahrscheinlich Intron-Sequenzen als Ergebnis eines unvollständigen Spleißens waren.
Das 5'-RACE-Verfahren wurde sowohl auf ATC-RNA als auch auf Plazenta-RNA angewendet, um das 5'-Ende des DPP8-Gens zu erhalten. Das RACE-Produkt, das aus aktivierter T-Zell-RNA erhalten worden war, war 0,2 kb größer als das aus der Plazenta-RNA, aber sonst gleich (1). Das erste Methionin innerhalb einer Kozak-Sequenz betrug 214 bp ab dem 5'-Ende des aktivierten T-Zell-RACE-Produkts. Diese 5'-211 bp-Region war zu 70,5% GC-reich und enthielt eine Anzahl potenzieller Promotor- und Verstärkerelemente (Sp1-, Ap1- und ETF-Stellen), und so wurde abgeleitet, dass sie die 5'-benachbarte Region des DPP8-Gens ist. Um die Identität des 5'-RACE-Produkts als das 5'-Ende von DPP8 zu bestätigen, wurde eine RT-PCR durchgeführt, um die Verbindung zwischen dem RRCE-Produkt und dem T8-cDNA-Bibliothek-Klon zu überspannen. Die RT-PCR mit ATC-RNA produzierte zwei Klone ATCd3-2-1 und ATC3-3-10 (1). Verglichen mit T8 und T21 hatten beide Klone eine zusätzliche Insertregion mit 144 bp (48 aa) unmittelbar angrenzend an die Spleißstelle von T8. Die Sequenzhomologieanalyse dieser zusätzlichen Insertregion ergab eine homologe Region, sowohl in dem C.-elegans-Homologen als auch in DPP4. Dies zeigt klar, das der T8- und der T21-Bibliotheks-Klon die Spleißvarianten von DPP8 repräsentieren. Der kleinere Klon ATCd3-3-10 wurde als einer befunden, der die andere Spleißvariante von DPP8 repräsentiert, da er eine 516-bp-Deletion am 5'-Ende enthielt, die in einer Deletion von 175 aa resultieren würde.
Unter Verwendung von dem größeren RACE-Produkt, ATC3-2-1 und dem T21-Bibliotheks-Klon wurde ein DPP8-Klon mit voller Länge geschaffen. Dieser erzeugte eine vermutete DPP8-cDNA mit 3,1 kb (einschließlich 5'- und 3'-untranslatierten Regionen) mit einem offenen Leserahmen von 882 aa für eine weitere Sequenzanalyse und Untersuchung der DPP8-Funktion. Dieses vermutete 882-DPP8-Protein enthielt keine N-verknüpften Glykosylierungsstellen, und die Kyte-Doolittle-Hydrophobie-Analysen zeigten, dass ihm eine Transmembran-Domäne, anders als bei DPP4, FAP und DPP6, fehlte. Somit ist es wahrscheinlich, dass DPP8 ein Zellplasmaprotein (2) ist. Das vorhergesagte DPP8-Protein hatte 51% Aminosäureähnlichkeit und 27% Aminosäureidentität mit humanem DPP4 gemeinsam; die C-Termini dieser Proteine zeigten die größte Homologie (3).
Gewebeverteilung von DPP8, bestimmt durch Master-RNA und Northern Blot
Ein Master-RNA-Blot wurde mit einem 484-nt-PCR-Produkt als Sonde, das durch den Vorwärts- und den Rückwärts-DPP8-Primer, wie weiter oben beschrieben, hergestellt worden war, untersucht. Die mRNA-Gewebe-Expression von DPP8 war in allen humanen adulten und Fötusgeweben ubiquitär. Ein ähnliches ubiquitäres Expressionsmuster wurde beobachtet unter Verwendung von DPP4-cDNA als Sonde (die Daten sind nicht mitgeteilt). Jedoch befanden sich bei visueller Bewertung die größten Expressionsniveaus unter Verwendung der jeweiligen genspezifischen Sonde in verschiedenen Geweben. Die intensivsten Signale unter Verwendung der DPP8-Sonde befanden sich in Hoden, gefolgt von der Plazenta, während die intensivsten Signale unter Verwendung der DPP4-Sonde sich in der Speicheldrüse und der Prostatadrüse, gefolgt von der Plazenta (die Daten sind nicht mitgeteilt) befanden. Die Sonden banden nicht an eine der negativen Kontrollen auf dem Blot.
Es wurde eine Northern-Blot-Analyse mit mRNA durchgeführt, die von verschiedenen humanen Geweben (4) abgeleitet worden war. Die zwei DPP8-spezifischen Sonden zeigten das Vorhandensein von Transkripten in allen untersuchten Geweben an. Ein Transkript mit einer Größe von etwa 3,0 kb, übereinstimmend mit der erwarteten ungefähren Größe der DPP8-Message, wurde nur in den Hoden detektiert. Jedoch waren zwei Transkripte mit 8,0 bzw. 5,0 kb in Hoden, Milz, peripheren Blutleukozyten und Eierstöcken mit hohen Gehalten, in Prostata, Dünndarm und Darmschleimhaut mit mäßigen Gehalten und im Thymus mit niedrigeren Gehalten enthalten. Der Mehrfach-Gewebe-Northern Blot wurde auch mit einer radiomarkierten humanen β- Actin-Sonde durchgeführt und ein übliches 2,0-kb-Transkript in allen Geweben (4) beobachtet.
DPP8-Expression in Mäusen, bestimmt durch Northern Blot und rtPCR
Die humane DPP8-cDNA-Sequenz wurde mit von Mäusen abgeleiteter Leber-RNA kreuzhybridisiert. Der Northern Blot, der die gesamte RNA der Mausleber enthielt, hybridisierte mit einer humanen DPP8-Sonde, was zeigte, dass DPP8-mRNA in Mausleber exprimiert wird (9A). Es waren zwei mRNA-Transkripte von Maus-DPP8 vorhanden. Dies ist ein ähnliches Muster zu demjenigen, das bei humanem DPP8 beobachtet wurde. Diese Transkripte repräsentieren wahrscheinlich verschiedene Längen 5'- und 3'-untranslatierter Regionen des Maus-DPP8-Gens. Das Vorhandensein von DPP8-mRNA in der Mausleber wurde ebenfalls unter Verwendung von rt-PCR gezeigt. Die getesteten Primer erzeugten ein 537 bp-PCR-Produkt. Ein Southern Blot dieses Produktes wies nach, dass das Maus-DPP8 mit humanem DPP8 (9B) kreuzhybridisiert.
Expression und funktionelle Aktivität von DPP8
Um die Funktion des DPP8-Proteins zu bewerten, wurde die DPP8-cDNA mit 3,1 kb und gesamter Länge in die Xba-I-Stelle des pcDNA3.1A/V5/His-Expressionsvektors kloniert, um zwei Konstrukte zu produzieren. Das erste Konstrukt, pcDNA3.1-DPP8, exprimierte das DPP8-Protein von allein, während das zweite Konstrukt, pcDNA3.1-DPP8/V5/His, ein Protein mit dem V5-Epitop exprimierte und His-tag mit dem C-Terminus von DPP8 fusioniert, um die Analyse der Proteinexpression zu erleichtern. Säugetierexpressionskonstrukte wurden stabil in COS-7-Zellen transfektiert und zelluläre Sonikate hergestellt. Übereinstimmend mit dem aus der Aminosäuresequenz vorhergesagten Molekulargewicht wurde ein 100-kDa-Monomer durch Western Blotting stabiler DPP8/V5/His-exprimierender Zellen (6) detektiert. DPP8/V5/His-Protein wurde in dem Zellplasmakompartiment, aber nicht auf der Oberfläche von ethanolfixierten stabilen DPP8/VS/His-exprimierenden COS-Zellen unter Verwendung des Anti-V5-mAb detektiert.
DPP8 ist eine Dipeptidylpeptidase
Die Sequenzhomologie zwischen DPPIV und DPP8 legte funktionelle Ähnlichkeiten nahe, sodass Zelllysate von DPP8-transfektierten Zellen auf Prolin-spezifische Peptidaseaktivität untersucht wurden. DPPIV, exprimiert in COS-7-Zellen mit oder ohne den V5/His-tag, waren positive Kontrollen, und negative Kontrollen umfassten nur-Vektor-transfektierte COS-O7-Zellen. Extrakte von DPP8-transfektierten COS-7-Zellen hydrolysierten H-Ala-Pro-pNA und H-Arg-Pro-pNA, aber nicht H-Gly-Pro-pNA, H-Gly-Arg-pNA, H-Gly-Pro-Toluolsulfonat oder H-Gly-Pro-7-Amino-4-trifluormethylcumarin oberhalb der Niveaus, die von nicht transfektierten COS-7-Zellen (die Daten sind nicht mitgeteilt) gezeigt wurden. Das pH-Optimum der DPP8-Enzymaktivität betrug 7,4 (5A), ähnlich wie das pH-7,8-Optimum der DPPIV-Enzymaktivität [43, 44]. Die DPP8 zeigte wenig Aktivität unterhalb von pH 6,3, was nahelegt, dass dies kein Enzym des Lysosom-/Endosom-Kompartimentes ist. Von allen auf Zellmonoschichten getesteten Substanzen färbte nur Ala-Pro-4MβNA/HCl DPP8-transfektierte COS-Zellen und CHO-Zellen an (die Daten sind nicht mitgeteilt).
Sowohl das gereinigte rekombinante DPP8/V5/His als auch das gereinigte rekombinante DPPIV/V5/His hydrolysierte H-Ala-Pro-pNA, G-Gly-Pro-pNA und H-Arg-Pro-pNA. Die Transfektion mit DPP8 verursacht möglicherweise erhöhte Dipeptidase-, Tripeptidase- und Endopeptidaseaktivitäten, ähnlich wie einen Effekt auf die DPPIV-Transfektion von Melanomzellen [18]. Tatsächlich zeigten unsere Ergebnisse, dass DPP8-transfektierte COS-7-Zellen, aber nicht gereinigtes rekombinantes DPP8, Tripeptidylpeptidaseaktivität bei Verwendung des Substrats H-Ala-Ala-Pro-pNA und Endopeptidaseaktivität unter Verwendung des Substrats Z-Ala-Pro-pNA (Daten nicht mitgeteilt) zeigten. Dies wurde weiter untersucht, und es wurde weder das Tripeptidylpeptidasesubstrat H-Ala-Ala-Phe-pNA oder H-Ala-Phe-Pro-pNA [45] noch das Prolylendopeptidasesubstrat Z-Ala-Pro-pNA oder Succinyl-Ala-Pro-pNA von gereinigter DPP8 gespaltet. Unsere Daten zeigen klar, dass DPP8 eine Dipeptidylpeptidase ist und ihr Tripeptidylpeptidase- oder Endopeptidaseaktivität fehlt.
Der Charakter des katalytischen Mechanismus von DPP8 wurde unter Verwendung verschiedener Inhibitoren weiter untersucht. Die DPP8-Enzymaktivität wurde signifikant von Serinproteinaseinhibitoren inhibiert und war unempfindlich gegenüber den Inhibitoren von Metallproteinasen, Aspartylproteinasen und Cysteinproteinasen. Die DPP8-Enzymaktivität wurde signifikant von Zink inhibiert, das die DPPIV-Enzymaktivität vollständig inhibiert [46]. Die Peptide Ala-Pro-Gly und Lys-Pro ahmen DPP8-Substrate nach und inhibieren wahrscheinlich kompetitiv DPP8.
Chromosomenlokalisierung von DPP8
Für die FISH-Analyse wurden zwei Sonden verwendet, ESTAA417787 und der T8-Klon aus der Plazentabibliothek. Siebzehn Metaphasen aus dem ersten normalen Männchen wurden auf ein Fluoreszenzsignal untersucht. Alle diese Metaphasen zeigten ein Signal auf einem oder beiden Chromatiden von 15 auf der Bande q22 (5). Es wurden ein totaler und 2 unspezifische Hintergrunddots in diesen Metaphasen beobachtet. Ein ähnliches Ergebnis wurde aus der Hybridisierung der Sonde mit 15 Metaphasen aus dem zweiten normalen Männchen (die Daten sind nicht mitgeteilt) erhalten.
Analyse der DPP8-Gen-Expression durch RT-PCR
DPPIV wird von dem meisten Lymphozyten und Lymphozytenzelllinien exprimiert, aber auf aktivierten Lymphozyten [47, 41, 48, 49] aufreguliert. Die verschiedenen Spleißvarianten von DPP8 könnten ein funktionelles Protein nicht kodieren, sodass eine PCR entworfen wurde, um ausschließlich mRNA zu detektieren, die die Sequenz mit der vollen Länge enthielt (1). Bei 35 Zyklen wurde ein Amplifizierungsprodukt mit der erwarteten Größe (783 bp) leicht in OKT3-stimulierten PBMCs (sechs von sechs Lebewesen, 8), aber nicht in nicht stimulierten PBMCs von den meisten Lebewesen (vier von fünf, 8A) beobachtet, was vermuten lässt, dass mehr DPP8-mRNA in aktivierten T-Zellen als in nicht stimulierten PBMCs exprimiert wird. Ähnliche RT-PCR-Daten wurden aus PBMCs erhalten, die mit Phytohämagglutinin stimuliert worden waren (Daten sind nicht mitgeteilt). Zusätzlich wurde DPP8-mRNA in allen untersuchten B- und T-Zelllinien und sowohl in Leber als auch Plazenta (8B) exprimiert.
Anti-Peptid-Antikörper
Die Seren von zwei Kaninchen wurden durch ELISA in Peptid-beschichteten Vertiefungen getestet. Beide Seren banden an beide Peptide, während die Präimmunisierungsserumproben keine spezifische Bindung zeigten. Western Blots mit Zelllinienextrakten, mit mit DPP8-cDNA transfektierte Zelllinien und aktivierten humanen Lymphozyten zeigten, dass ein Kaninchenantiserum an die zwei DPP8-Peptide ein 100-kDa-Band bindet, was die Größe der DPP8 ist (Daten nicht mitgeteilt).
Tabelle 1. K_m- und V_max-Werte für DPP8 und DPPIV
Tabelle 2. Inhibierung der Peptidaseaktivität von DPP8 im Vergleich mit DPPIV. Gewöhnliche Proteinaseinhibitoren von verschiedenen Enzymtypen wurden mit den gereinigten Peptidasen vor dem Versuch mit den Substraten H-Ala-Pro-pNA an DPP8 oder H-Gly-Pro-pNA an DPPIV inkubiert. AEBSF, 4-(2-Aminoethyl)benzolsulfonylfluorid
Diskussion
Wir beschreiben die Klonierung, rekombinante Expression, Biochemie und Gewebeexpression einer neuen humanen DPPIV-verwandten Postprolinpeptidase, die wir als DPP8 bezeichnet haben. DPP8 zeigte eine Dipeptidylaminopeptidaseaktivität, aber keine Tripeptidylpeptidase- oder Endopeptidaseaktivität. Es wurde festgestellt, dass wie DPPIV DPP8 eine signifikante mRNA-Expression in aktivierten T-Zellen aufwies. Deutliche Anzeichen dafür, dass DPP8 ein monomeres, nicht glykosyliertes, lösliches, cytoplasmatisches Protein ist, die Charakteristika von PEP, aber nicht von DPPIV, FAP oder DPP6 sind, wurden von unserer Sequenz und unseren Lokalisierungsdaten geliefert. Die DPPB-Enzymaktivität hatte ein neutrales pH-Optimum, was nahelegt, dass es in dem sauren Lysosom-/Endosom-Kompartiment nicht aktiv ist.
Aufgrund von Homologie mit DPPIV ist DPP8 ein Mitglied der Genfamilie der DPPIV-artigen, ein Mitglied der Prolyloligopeptidasefamilie S9b und ein Mitglied der Enzymfamilie SC. Die Reste in DPP8, die potenziell das Ladungsverbindungssystem bilden, sind Ser739, Asp817 und His849 (2). Die Dipeptidylpeptidaseaktivität von DPP8 und das Fehlen einer detektierbaren Tripeptidylpeptidase- oder Endopeptidaseaktivität durch gereinigte DPP8 unterstützen weiterhin ihren Platz in der S9b-Familie. Weiterhin war die DPP8-Substratspezifität nicht unterscheidbar von derjenigen der strukturell verwandten Peptidasen DPPIV und FAP.
Die Rolle der DPPIV bei humanen Lymphozyten ist unter Verwendung von Enzyminhibitoren [49, 50–54] im Detail untersucht worden. DPPIV-spezifische Inhibitoren unterdrücken sowohl die DNA-Synthese als auch die Cytokinproduktion in vitro [48, 49, 52]. Zusätzlich senken DPPIV-spezifische Inhibitoren die Phorbolmyristatacetat-induzierte Tyrosinphosphorylierung in humanen Lymphozy ten, was eine Rolle der DPPIV-Enzymaktivität bei der Lymphozytenaktivierung nahelegt [54]. In vivo unterdrücken Inhibitoren der DPPIV die Arthritis [20] und verlängern das Überleben von fremden Herztransplantaten im Tierversuch [55]. Das Vermögen der DPP8, DPPIV-Substrate zu spalten, zeigt, dass DPPIV-Inhibitoren auch DPP8 inhibieren können und dass Inhibitorstudien eine weitere Interpretation erfordern können. Tatsächlich kann DPP8 für einige physiologische Funktionen, die bisher DPPIV zugeschrieben worden sind, verantwortlich sein.
FAP und DPPIV sind integrale Membranglykoproteine und erfordern für die katalytische Aktivität eine Dimerisierung [9, 56, 57]. Im Gegensatz dazu sind DPP8 und PEP nicht-glykosylierte Cytosolproteine, die als Monomere katalytisch aktiv sind [58] und Pro-Xaa-Bindungen spalten [43, 59]. Jedoch unterscheidet sich die Substratspezifität von PEP von der von DPP8. PEP ist eine Endopeptidase, die nicht spaltet, wenn ein freies α-Amin N-terminal zu Prolin liegt (beispielsweise spaltet sie nicht H-Ala-Pro). Vor Kurzem haben wir vorgeschlagen, dass die Tertiärstruktur von DPPIV ähnlich derjenigen der PEP insoweit ist, als sie eine siebenblättrige β-Propeller-Domäne und eine α/β-Hydrolase-Domäne [3, 39, 1] hat. Die signifikante Sequenzidentität zwischen DPP8 und DPPIV zeigt, dass die Tertiärstrukturen von DPP8 und DPPIV ähnlich sind. Jedoch enthält DPP8 110 Aminosäuren mehr als DPPIV, sodass sie ein zusätzliches Element der Tertiärstruktur wie ein achtes Propellerblatt haben könnte.
Die engen Beziehungen zwischen DPP8, DPPIV und FAP werden in ihrer Chromosomenlokalisierung widergespiegelt. Während DPPIV und FAP beide auf dem langen Arm von Chromosom 2, 2q24.3 [60] bzw. 2q23 [61] lokalisiert sind, war DPP8 auf 15q22 lokalisiert. Die verwandten Gene DPP6 und PEP sind auf dem Chromosom 7 [62] bzw. 6q22 [63] lokalisiert.
Zwei humane Krankheitsloci sind auf 15q22 kartiert worden. Diese Loci sind ein autosomaler rezessiver Taubheitslocus [64] und eine Form des Bardet-Biedl-Syndroms, Typ 4 [65]. Zwei der klinischen Manifestationen des Bardet-Biedl-Syndroms sind Fettsucht und Diabetes. Attractin [66] und DPPIV spielen eine Rolle bei der Fettsucht [67] bzw. Diabetes [22, 68, 15], und da sich ihre Substratspezifität mit derjenigen von DPP8 überlappt, ist es möglich, dass DPP8 am Bardet-Biedl-Syndrom beteiligt sein kann.
DPPIV wird auf der Oberfläche von T-Zellen exprimiert und ist ein CD26 genanntes kostimulierendes Molekül [3]. CD26-negative Zelllinien haben eine Rest-DPPIV-Enzymaktivität und PBMC hat eine nicht von DPPIV abgeleitete Aktivität gegenüber Ala-Pro-Substraten [69], welche die Existenz von einer oder mehreren anderen Peptidasen mit DPPIV-artiger Aktivität anzeigt. DPPIV-β weist eine Peptidaseaktivität auf, die ähnlich derjenigen von DPPIV ist, ist aber ein 70 bis 80 kDa Zelloberflächenglykoprotein [70] und unterscheidet sich deshalb von DPP8.
Die biologische Bedeutung der drei Spleißvarianten von DPP8, die wir gefunden haben, ist unbekannt. Keine dieser Spleißvarianten resultiert in einer Rahmenverschiebung oder einer vorzeitigen Proteintermination (1). Zwei der Spleißvarianten enthalten alle vorhergesagten katalytischen Triadenreste und produzieren somit potenziell Proteine mit Peptidaseaktivität. Abwechselnde Spleißformen von FAP-mRNA sind auch beobachtet worden [71, 72]. Es ist möglich, dass die Expression von Spleißvarianten zur Regulation der Gehalte an aktiven Proteinen genutzt wer den kann. DPP8-Northern-Blots zeigten eine Anzahl von Transkripten mit unterschiedlicher Größe. Die vorhergesagten Größen von Spleißvarianten von DPP8 reichten von 2,6 bis 3,1 kb, während die großen Transkripte, die in den meisten in den Northern Blots untersuchten Geweben zu sehen waren,
8,5 kb zw. 5,0 kb groß waren. Auf ähnliche Weise weisen zwei andere Mitglieder der Genfamilie der DPPIV-artigen, DPPIV und DPP6, mRNA-Transkripte in Northern Blots auf, die viel größer als die Größe der cDNA [60, 61] sind. Wir schlagen vor, dass die großen Transkripte für DPP8-mRNA und deren Spleißvarianten innerhalb der 5-kb-Bande liegen, während das (die) 8,5-kb-Transkript(e) zusätzlich 5'- und 3'-untranslatierte Sequenzen enthalten können. DPP8 scheint DPPIV insoweit ähnlich zu sein, als sie ein ubiquitäres mRNA-Expressionsmuster durch Northern-Analyse hat, während sie in aktivierten T-Zellen aufreguliert wird. Die Ähnlichkeiten zwischen DPP8 und DPPIV legen nahe, dass DPP8 wie DPPIV eine Rolle bei der T-Zell-Costimulation und -proliferation spielen kann. Die Entwicklung von DPP8-spezifischen Antikörpern oder -inhibitoren wird die Arbeit auf diesem Gebiet erleichtern.
Zusammengefasst ist von uns eine neue humane Dipeptidylaminopeptidase, DPP8, mit strukturellen und funktionellen Ähnlichkeiten mit DPPIV und FAP identifiziert und charakterisiert worden. Bei vielen verschiedenen biologischen Aufgaben, die für DPPIV vermutet werden, insbesondere im Immunsystem, und den Aufgaben von FAP bei Tumorwachstum und Lebererkrankungen wird es interessant sein, die Aufgaben dieses neuen Mitgliedes der Genfamilie der DPPIV-artigen in diesen Systemen zu untersuchen. Weitere Forschungen zum Verständnis dieses neuen Proteins und der Aufklärung von Inhibitoren und physiologischen Substraten werden dabei helfen, die spezifischen Funktionen einzelner Mitglieder dieser Genfamilie zu identifizieren.
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SEQUENCE LISTING

Claims

Peptid, umfassend: (a) eine wie in Sequenz ID Nr. 1 gezeigte Sequenz; oder (b) Aminosäuresequenzen: His⁷³⁶GlyTrpSerTyrGlyGlyTyrLeu; Leu⁸¹⁶AspGluAsnValHisPheAlaHis; Glu⁸⁴⁷ArgHisSerIleArg und Phe²⁵⁵ValLeuGlnGluGluPhe, und das in der Lage ist, eine Peptidbindung C-terminal zu Prolin in irgendeiner der folgenden Verbindungen zu hydrolysieren: H-Ala-Pro-pNA; H-Gly-Pro-pNA; und H-Arg-Pro-pNA; oder (c) eine Sequenz mit wenigstens 60% Identität mit der in Sequenz ID Nr. 1 gezeigten Sequenz und das in der Lage ist, eine Peptidbindung C-terminal zu Prolin in irgendeiner der folgenden Verbindungen zu hydrolysieren: H-Ala-Pro-pNA; H-Gly-Pro-pNA; und H-Arg-Pro-pNA.
Peptid nach Anspruch 1(c), worin die Aminosäureidentität wenigstens 75% beträgt.
Peptid nach Anspruch 1(c), worin die Aminosäureidentität wenigstens 95% beträgt.
Fragment der in Sequenz ID Nr. 1 gezeigten Sequenz, das in der Lage ist, eine Peptidbindung C-terminal zu Prolin in irgendeiner der folgenden Verbindungen zu hydrolysieren: H-Ala-Pro-pNA; H-Gly-Pro-pNA; und H-Arg-Pro-pNA.
Peptid nach Anspruch 1, worin ein Asparaginrest in dem Peptid nicht an ein Kohlenhydratmolekül gekoppelt ist.
Peptid nach Anspruch 1, worin das Peptid nicht auf der Zelloberflächenmembran einer Zelle exprimiert ist.
Fusionsprotein, umfassend die in Sequenz ID Nr. 1 gezeigte Aminosäuresequenz, das in der Lage ist, eine Peptidbindung C-terminal zu Prolin in irgendeiner der folgenden Verbindungen zu hydrolysieren: H-Ala-Pro-pNA; H-Gly-Pro-pNA; und H-Arg-Pro-pNA, wobei das Fusionsprotein mit einer weiteren Aminosäuresequenz gekoppelt ist.
Fusionsprotein nach Anspruch 7, worin die weitere Aminosäuresequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus GST, V5-Epitop und His-Anhang.
Verfahren zum identifizieren eines Moleküls, das in der Lage ist, die Spaltung eines Substrates durch ein Peptid nach Anspruch 1 zu inhibieren, umfassend die folgenden Schritte: (a) Kontaktieren eines Peptids nach Anspruch 1 mit dem Molekül; (b) Kontaktieren des Peptids nach Anspruch 1 von Schritt (a) mit einem Substrat, das in der Lage ist, durch das Peptid nach Anspruch 1 gespaltet zu werden, unter Bedingungen, die für die Spaltung des Substrates durch das Peptid nach Anspruch 1 ausreichend sind; und (c) Detektieren von nicht durch das Peptid nach Anspruch 1 gespaltetem Substrat, um zu identifizieren, dass das Molekül in der Lage ist, die Spaltung des Substrats durch das Peptid nach Anspruch 1 zu inhibieren.
Verfahren zum Identifizieren eines Moleküls, das in der Lage ist, spezifisch die Spaltung eines Substrates durch ein Peptid nach Anspruch 1 zu inhibieren, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Kontaktieren eines Peptids nach Anspruch 1 und einer weiteren Protease mit dem Molekül; (b) Kontaktieren des Peptids nach Anspruch 1 und der weiteren Protease von Schritt (a) mit dem Substrat, das in der Lage ist, von dem Peptid nach Anspruch 1 und der weiteren Protease gespaltet zu werden, unter Bedingungen, die für die Spaltung des Substrates durch das Peptid nach Anspruch 1 und die weitere Protease ausreichend sind; und (c) Detektieren von nicht durch das Peptid nach Anspruch 1, jedoch durch die weitere Protease gespaltetem Substrat, um zu identifizieren, dass das Molekül in der Lage ist, spezifisch die Spaltung des Substrates durch ein Peptid nach Anspruch 1 zu inhibieren.
Verfahren zum Reduzieren oder Inhibieren der katalytischen Aktivität eines Peptids nach Anspruch 1, wobei das Verfahren den Schritt des Kontaktierens eines Peptids nach Anspruch 1 mit einem Inhibitor der katalytischen Aktivität eines Peptids nach Anspruch 1 umfasst.
Verfahren zum Spalten eines Substrates, umfassend den Schritt des Kontaktierens des Substrates mit einem Peptid nach Anspruch 1 unter Bedingungen, die für die Spaltung des Substrates durch das Peptid nach Anspruch 1 ausreichend sind.
Verfahren zum Detektieren einer aktivierten T-Zelle, wobei das Verfahren den Schritt des Messens des Spiegels eines Peptids nach Anspruch 1 in einer T-Zelle umfasst.
Verfahren nach Anspruch 13, worin der Spiegel eines Peptids nach Anspruch 1 durch Detektieren der Menge an RNS, die ein Peptid nach Anspruch 1 kodiert, detektiert wird.
Nukleinsäuremolekül, das: (a) eines wie in Sequenz ID Nr. 1 gezeigte Sequenz kodiert; oder (b) aus einer wie in Sequenz ID Nr. 2 gezeigten Sequenz besteht; oder (c) in der Lage ist, mit einem Nukleinsäuremolekül, bestehend aus der in Sequenz ID Nr. 2 gezeigten Sequenz unter stringenten Bedingungen zu hybridisieren, und das ein Peptid kodiert, welches in der Lage ist, eine Peptidbindung C-terminal zu Prolin in irgendeiner der folgenden Verbindungen zu hydrolysieren: H-Ala-Pro-pNA; H-Gly-Pro-pNA; und H-Arg-Pro-pNA.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 15(c), worin das Molekül in der Lage ist, unter stringenten Bedingungen zu hybridisieren.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 15, das keine 5'- oder 3'-untranslatierten Regionen enthält.
Fragment eines Nukleinsäuremoleküls, bestehend aus der in Sequenz ID Nr. 2 gezeigten Sequenz, das ein Peptid kodiert, welches in der Lage ist, eine Peptidbindung C-terminal zu Prolin in irgendeiner der folgenden Verbindungen zu hydrolysieren: H-Ala-Pro-pNA; H-Gly-Pro-pNA; und H-Arg-Pro-pNA.
Fragment nach Anspruch 18, das aus irgendeiner der in Sequenz ID Nr. 4, 6 oder 8 gezeigten Sequenz besteht.
Vektor, umfassend ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 15.
Zelle, umfassend einen Vektor nach Anspruch 20.
Zusammensetzung, umfassend ein Peptid nach Anspruch 1.
Antikörper, der in der Lage ist, an ein Peptid nach Anspruch 1 zu binden.
Antikörper nach Anspruch 23, der durch eine Hybridomzelle produziert wird.
Hybridomzelle, die in der Lage ist, einen Antikörper nach Anspruch 24 zu machen.