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DE60028054T2 - Fibroblasten-wachstumsfaktor-19 (fgf-19) nukleinsäure und polypeptide und verfahren zu deren verwendung für behandlung von fettleibigkeit - Google Patents

Fibroblasten-wachstumsfaktor-19 (fgf-19) nukleinsäure und polypeptide und verfahren zu deren verwendung für behandlung von fettleibigkeit Download PDF

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nucleic acid
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A. Timothy San Francisco STEWART
Elizabeth Pacifica TOMLINSON
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Genentech Inc
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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen die Identifikation und Isolierung von DNA und die rekombinante Herstellung neuer Polypeptide, die hierin als Fibroblastenwachstumsfaktor-19- (FGF-19-) Polypeptide bezeichnet werden, sowie Verfahren, Zusammensetzungen und Tests, die solche Polypeptide verwenden, zur therapeutischen Behandlung von Adipositas und zur Herstellung pharmazeutisch aktiver Materialien, die therapeutische und pharmakologische Eigenschaften aufweisen, einschließlich jener, die mit der Behandlung von Adipositas in Verbindung stehen.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Adipositas ist eine chronische Krankheit, die in der modernen Gesellschaft weit verbreitet ist und nicht nur mit einem gesellschaftlichen Phänomen in Verbindung zu bringen ist, sondern auch mit verkürzter Lebenserwartung und zahlreichen medizinischen Problemen, einschließlich abträglicher psychologischer Entwicklung, Fortpflanzungskrankheiten wie polyzystisches Ovarialsyndrom, dermatologischer Erkrankungen wie Infektionen, Krampfadern, Akanthosis nigricans und Ekzeme, Bewegungsintoleranz, Diabetes mellitus, Insulinresistenz, Bluthochdruck, Hypercholesterinämie, Cholelithiasis, Osteoarthritis, orthopädischer Verletzungen, Thromboembolie, Krebs und koronarer Herzkrankheiten. Rissanen et al., British Medical Journal 301, 835–837 (1990).
  • Bestehende Therapien für Adipositas umfassen herkömmliche Diäten und körperliche Betätigung, stark niederkalorische Diäten, Verhaltenstherapie, Pharmakotherapie mit Appetitzüglern, wärmeerzeugenden Wirkstoffen, Nahrungsmittelabsorptionsinhibitoren, mechanische Vorrichtungen wie Kieferverdrahtung, Bauchbinden und -ballons sowie chirurgische Eingriffe. Jung & Chong, Clinical Endocrinology 35, 11–20 (1991); Bray, Am. J. Clin. Nutr. 55, 538S–544S (1992). Fasten mittels proteinarmer modifizierter Ernährung erwies sich als wirksam zur Gewichtsreduktion bei Jugendlichen. Lee et al., Clin. Pediatr. 31, 234–236 (April 1992). Eine Einschränkung der Kalorienaufnahme als eine Behandlung von Adipositas führt zum Katabolismus von Körperproteinspeichern und ruft ein negatives Stickstoffgleichgewicht hervor. Ernährungspläne mit Proteinergänzungen wurden so als ein Mittel zur Reduktion des Stickstoffverlusts während eingeschränkter Kalorienaufnahme immer populärer. Da solche Diäten nur zu bescheidener Stickstoffeinsparung führen, gibt es einen Bedarf an einer wirksameren Weise zur Erhaltung der fettfreien Körpermasse und der Proteinspeicher. Darüber hinaus würde die Behandlung von Adipositas verbessert werden, wenn solch ein Ernährungsprogramm auch zu einem rascheren Verlust von Körperfett führen würde. Verschiedene Ansätze für solche Behandlungsmethoden umfassen jene, die von Weintraub & Bray, Med. Clinics N. Amer. 73, 237 (1989); Bray, Nutrition Reviews 49, 33 (1991), erläutert wurden.
  • Angesichts des weitverbreiteten Auftretens von Adipositas in unserer Gesellschaft und der damit verbundenen schwerwiegenden Konsequenzen, wie zuvor erläutert, könnte jeglicher therapeutische Wirkstoff, der zur Reduktion des Körpergewicht fettleibiger Personen beitragen könnte, eine außerordentlich positive Wirkung auf deren Gesundheit haben. Auf dem Gebiet der Erfindung gibt es einen Bedarf an einem Wirkstoff, der das Gesamtkörpergewicht fettleibiger Patienten hin zu ihrem idealen Körpergewicht reduziert, ohne signifikante negative Nebenwirkungen zu haben, und der dem an Adipositas erkrankten Patienten auch hilft, das Gewicht auf dem reduzierten Niveau zu halten.
  • Es ist daher wünschenswert, einen Behandlungsplan bereitzustellen, der dazu dienlich ist, das Körpergewicht von fettleibigen Personen auf ein normales, ideales Körpergewicht zurückzubringen.
  • Weiters ist es wünschenswert, eine Therapie für Adipositas bereitzustellen, die in der Aufrechterhaltung des reduzierten Körpergewichts über eine längere Zeitspanne hinweg resultiert.
  • Auch ist es wünschenswert, Adipositas vorzubeugen und, nachdem die Therapie begonnen wurde, den Fortschritt von Erkrankungen aufzuhalten oder das Einsetzen dieser zu unterbinden, die Konsequenzen von Adipositas oder sekundäre Erschei nungen zu dieser Krankheit sind, wie beispielsweise Arteriosklerose und polyzystisches Ovarialsyndrom.
  • Solche Behandlungsverfahren und damit verbundene Zusammensetzungen werden hierin bereitgestellt. Ebenfalls hierin offenbart werden Proteine und Nucleinsäuren sowie Verfahren zum Screenen auf Modulatoren dieser. Andere hierin bereitgestellte Verfahren, Behandlungen und Zusammensetzungen werden Fachleuten ersichtlich sein.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Es wurde ein cDNA-Klon (hierin als DNA49435-1219 bezeichnet) identifiziert, der für ein Polypeptid kodiert, das eine gewisse Sequenzähnlichkeit mit Elementen der Familie der Fibroblastenwachstumsfaktoren aufweist und in der vorliegenden Anmeldung als "Fibroblastenwachstumsfaktor-19" (FGF-19) bezeichnet wird.
  • Die Erfindung stellt die Verwendung von FGF-19 und von für FGF-19 kodierender Nucleinsäure bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung verschiedener, in den Ansprüchen definierter Leiden bereit.
  • Das isolierte Nucleinsäuremolekül kann eine Nucleotidsequenz mit zumindest etwa 80% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 81% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 82% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 83% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 84% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 85% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 86% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 87% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 88% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 89% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 90% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 91% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 92% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 93% Nucleinsäuresequenzi dentität, alternativ dazu zumindest etwa 94% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 95% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 96% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 97% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 98% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 99% Nucleinsäuresequenzidentität, zu (a) einem DNA-Molekül, das für ein FGF-19-Polypeptid mit der Sequenz der Aminosäurereste von 1 oder X oder 23 ± 5 bis 216 (Grenzen eingeschlossen) aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) kodiert, oder zu (b) dem Komplement des DNA-Moleküls aus (a) umfassen, worin X = 17 bis 27 ist.
  • Das isolierte Nucleinsäuremolekül kann (a) eine Nucleotidsequenz, die für ein FGF-19-Polypeptid mit der Sequenz der Aminosäurereste von 1 oder X oder 23 ± 5 bis 216 (Grenzen eingeschlossen) aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) kodiert, oder (b) das Komplement der Nucleotidsequenz aus (a) umfassen, worin X = 17 bis 27 ist.
  • Das isolierte Nucleinsäuremolekül kann eine Nucleotidsequenz mit zumindest etwa 80% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 81% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 82% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 83% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 84% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 85% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 86% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 87% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 88% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 89% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 90% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 91% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 92% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 93% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 94% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 95% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 96% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 97% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 98% Nucleinsäurese quenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 99% Nucleinsäuresequenzidentität, zu (a) einem DNA-Molekül mit der Sequenz der Nucleotide von etwa 464 oder etwa 530 bis etwa 1111 (Grenzen eingeschlossen) aus 1 (Seq.-ID Nr. 1) oder zu (b) dem Komplement des DNA-Moleküls aus (a) umfassen.
  • Das isolierte Nucleinsäuremolekül kann (a) die Nucleotidsequenz von etwa 464 oder etwa 530 bis etwa 1111 (Grenzen eingeschlossen) aus 1 (Seq.-ID Nr. 1) oder (b) das Komplement der Nucleotidsequenz aus (a) umfassen.
  • Das isolierte Nucleinsäuremolekül kann eine Nucleotidsequenz mit zumindest etwa 80% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 81% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 82% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 83% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 84% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 85% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 86% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 87% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 88% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 89% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 90% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 91% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 92% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 93% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 94% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 95% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 96% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 97% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 98% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 99% Nucleinsäuresequenzidentität, zu (a) einem DNA-Molekül, das für dasselbe reife Polypeptid kodiert, für das die menschliche Protein-cDNA kodiert, die bei der ATCC am 21. November 1997 unter der ATCC-Hinterlegungs-Nr. 209480 (DNA49435-1219) hinterlegt wurde, oder zu (b) dem Komplement des DNA-Moleküls aus (a) umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das isolierte Nucleinsäuremolekül (a) eine Nucleotidsequenz, die für dasselbe reife Polypeptid kodiert, für das die menschliche Protein-cDNA kodiert, die bei der ATCC am 21. November 1997 unter der ATCC-Hinterlegungs-Nr. 209480 (DNA49435-1219) hinterlegt wurde, oder (b) das Komplement der Nucleotidsequenz aus (a).
  • Das isolierte Nucleinsäuremolekül kann eine Nucleotidsequenz mit zumindest etwa 80% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 81% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 82% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 83% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 84% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 85% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 86% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 87% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 88% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 89% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 90% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 91% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 92% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 93% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 94% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 95% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 96% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 97% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 98% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 99% Nucleinsäuresequenzidentität, zu (a) der Polypeptid-Kodiersequenz voller Länge der menschlichen Protein-cDNA, die bei der ATCC am 21. November 1997 unter der ATCC-Hinterlegungs-Nr. 209480 (DNA49435-1219) hinterlegt wurde, oder (b) dem Komplement der Nucleotidsequenz aus (a) umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das isolierte Nucleinsäuremolekül (a) die Polypeptid-Kodiersequenz voller Länge der DNA, die bei der ATCC am 21. November 1997 unter der ATCC-Hinterlegungs-Nr. 209480 (DNA49435-1219) hinterlegt wurde, oder (b) das Komplement der Nucleotidsequenz aus (a).
  • Das isolierte Nucleinsäuremolekül, das für ein aktives FGF-19-Polypeptid wie nachstehend definiert kodiert, kann eine Nucleotidsequenz umfassen, die an das Kom plement einer Nucleinsäuresequenz hybridisiert, die für die Aminosäuren 1 oder X oder 23 ± 5 bis 216 (Grenzen eingeschlossen) aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) kodiert, worin X = 17 bis 27 ist. Vorzugsweise tritt Hybridisierung unter stringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen ein.
  • Das isolierte Nucleinsäuremolekül, das für ein aktives FGF-19-Polypeptid wie nachstehend definiert kodiert, kann eine Nucleotidsequenz umfassen, die an das Komplement der Nucleinsäuresequenz zwischen etwa den Nucleotiden 464 oder etwa 530 bis etwa 1111 (Grenzen eingeschlossen) aus 1 (Seq.-ID Nr. 1) hybridisiert. Vorzugsweise tritt Hybridisierung unter stringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen ein.
  • Das isolierte Nucleinsäuremolekül kann (a) eine Nucleotidsequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das verglichen mit der Aminosäuresequenz der Reste 1 oder X oder 23 ± 5 bis 216 (Grenzen eingeschlossen) aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) zumindest etwa 80% Positive, alternativ dazu zumindest etwa 81% Positive, alternativ dazu zumindest etwa 82% Positive, alternativ dazu zumindest etwa 83% Positive, alternativ dazu zumindest etwa 84% Positive, alternativ dazu zumindest etwa 85% Positive, alternativ dazu zumindest etwa 86% Positive, alternativ dazu zumindest etwa 87% Positive, alternativ dazu zumindest etwa 88% Positive, alternativ dazu zumindest etwa 89% Positive, alternativ dazu zumindest etwa 90% Positive, alternativ dazu zumindest etwa 91% Positive, alternativ dazu zumindest etwa 92% Positive, alternativ dazu zumindest etwa 93% Positive, alternativ dazu zumindest etwa 94% Positive, alternativ dazu zumindest etwa 95% Positive, alternativ dazu zumindest etwa 96% Positive, alternativ dazu zumindest etwa 97% Positive, alternativ dazu zumindest etwa 98% Positive, alternativ dazu zumindest etwa 99% Positive verzeichnet, oder (b) das Komplement der Nucleotidsequenz aus (a) umfassen, worin X = 17 bis 27 ist.
  • Das isolierte Nucleinsäuremolekül kann DNA umfassen, die für ein FGF-19-Polypeptid ohne die N-terminale Signalsequenz und/oder das Anfangs-Methionin ko diert, oder kann komplementär zu solch einem kodierenden Nucleinsäuremolekül sein. Vorläufig wurde das Signalpeptid als eines identifiziert, das sich von etwa Aminosäureposition 1 bis etwa Aminosäureposition 22 (Grenzen eingeschlossen) in der Sequenz aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) erstreckt. Es gilt jedoch anzumerken, dass die C-terminale Grenze des Signalpeptids variieren kann, sehr wahrscheinlich jedoch nicht um mehr als etwa 5 Aminosäuren an jeder Seite der C-terminalen Signalpeptidgrenze, wie anfänglich hierin definiert, worin die C-terminale Grenze des Signalpeptids gemäß Kriterien, die auf dem Gebiet der Erfindung zur Identifikation dieses Typs von Aminosäuresequenzelement üblicherweise verwendet werden, identifiziert werden kann (z.B. Nielsen et al., Prot. Eng. 10, 1–6 (1997), und von Heinje et al., Nucl. Acids. Res. 14, 4683–4690 (1986)). Darüber hinaus wurde ebenfalls erkannt, dass in manchen Fällen die Spaltung einer Signalsequenz von einem sekretierten Polypeptid nicht vollständig gleichförmig verläuft und zu mehr als einer sekretierten Spezies führt. Die Verwendung dieser Polypeptide und der Polynucleotide, die für diese kodieren, wird in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen. Als solches erstreckt sich das Signalpeptid des in 2 gezeigten FGF-19-Polypeptids (Seq.-ID Nr. 2) für die Zwecke der vorliegenden Anmeldung von den Aminosäuren 1 bis X aus 2 (Seq.-ID Nr. 2), worin X jede beliebige Aminosäure von 17 bis 27 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) ist. Daher umfassen reife Formen des FGF-19-Polypeptids, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, jene, die die Aminosäuren X bis 216 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) umfassen, worin X jede beliebige Aminosäure von 17 bis 27 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) ist, sowie Varianten davon, wie nachstehend beschrieben wird. Isolierte Nucleinsäuremoleküle, die für diese Polypeptide kodieren, werden ebenfalls in Betracht gezogen.
  • Ebenfalls hierin wird ein Vektor, der eine für FGF-19 oder seine Varianten kodierende Nucleotidsequenz umfasst, offenbart. Der Vektor kann jedes beliebige der hierin zuvor identifizierten isolierten Nucleinsäuremoleküle umfassen.
  • Eine Wirtszelle, die solch einen Vektor umfasst, ist ebenfalls hierin offenbart. Die Wirtszellen können beispielsweise CHO-Zellen, E. coli, Baculovirus-infizierte Insektenzellen oder Hefe sein. Ein Verfahren zur Herstellung von FGF-19-Polypeptiden wird weiters offenbart und umfasst das Kultivieren von Wirtszellen unter Bedingungen, die für die Expression von FGF-19 geeignet sind, und das Gewinnen von FGF-19 aus der Zellkultur.
  • Das FGF-19-Polypeptid kann isoliertes Nativsequenz-FGF-19-Polypeptid sein, das in manchen Ausführungsformen eine Aminosäuresequenz umfasst, die die Reste von 1 oder X oder 23 ± 5 bis 216 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) umfasst, worin X = 17 bis 27 ist.
  • Das FGF-19-Polypeptid kann ein isoliertes FGF-19-Polypeptid sein, das eine Aminosäuresequenz mit zumindest etwa 80% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 81% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 82% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 83% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 84% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 85% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 86% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 87% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 88% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 89% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 90% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 91% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 92% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 93% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 94% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 95% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 96% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 97% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 98% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 99% Aminosäuresequenzidentität, zur Sequenz der Aminosäurereste von 1 oder X oder 23 ± 5 bis 216 (Grenzen eingeschlossen) aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) umfasst, worin X = 17 bis 27 ist.
  • Das FGF-19-Polypeptid kann ein isoliertes FGF-19-Polypeptid sein, das eine Aminosäuresequenz mit zumindest etwa 80% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 81% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 82% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 83% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 84% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 85% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 86% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 87% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 88% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 89% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 90% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 91% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 92% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 93% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 94% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 95% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 96% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 97% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 98% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 99% Aminosäuresequenzidentität, zu einer Aminosäuresequenz, für die die menschliche Protein-cDNA kodiert, die bei der ATCC am 21. November 1997 unter der ATCC-Hinterlegungs-Nr. 209480 (DNA49435-1219) hinterlegt wurde, umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das isolierte FGF-19-Polypeptid eine Aminosäuresequenz, für die die menschliche Protein-cDNA kodiert, die bei der ATCC am 21. November 1997 unter der ATCC-Hinterlegungs-Nr. 209480 (DNA49435-1219) hinterlegt wurde.
  • Das FGF-19-Polypeptid kann ein isoliertes FGF-19-Polypeptid sein, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die im Vergleich mit der Aminosäuresequenz der Reste von 1 oder X oder 23 ± 5 bis 216 (Grenzen eingeschlossen) aus 2 (Seq.-ID Nr. 2), worin X = 17 bis 27 ist, zumindest etwa 80% Positive, alternativ dazu zumindest etwa 81% Positive, alternativ dazu zumindest etwa 82% Positive, alternativ dazu zumindest etwa 83% Positive, alternativ dazu zumindest etwa 84% Positive, alternativ dazu zumindest etwa 85% Positive, alternativ dazu zumindest etwa 86% Positive, alternativ dazu zumindest etwa 87% Positive, alternativ dazu zumindest etwa 88% Positive, alternativ dazu zumindest etwa 89% Positive, alternativ dazu zumindest etwa 90% Positive, alternativ dazu zumindest etwa 91% Positive, alternativ dazu zumindest etwa 92% Positive, alternativ dazu zumindest etwa 93% Positive, alternativ dazu zumindest etwa 94% Positive, alternativ dazu zumindest etwa 95% Positive, alternativ dazu zumindest etwa 96% Positive, alternativ dazu zumindest etwa 97% Positive, alternativ dazu zumindest etwa 98% Positive, alternativ dazu zumindest etwa 99% Positive, verzeichnet.
  • Das FGF-19-Polypeptid kann ein isoliertes FGF-19-Polypeptid ohne die N-terminale Signalsequenz und/oder das Anfangs-Methionin sein und wird von einer Nucleotidsequenz kodiert, die für solch eine Aminosäuresequenz wie hierin zuvor beschrieben kodiert. Verfahren zur Herstellung dieses Polypeptids werden ebenfalls hierin beschrieben, worin diese Verfahren das Kultivieren einer Wirtszelle, die einen Vektor umfasst, der das geeignete kodierende Nucleinsäuremolekül umfasst, unter Bedingungen, die zur Expression des FGF-19-Polypeptids geeignet sind, und die Gewinnung des FGF-19-Polypeptids aus der Zellkultur umfasst.
  • Das FGF-19-Polypeptid kann ein isoliertes FGF-19-Polypeptid sein, das die Sequenz der Aminosäurereste von 1 oder X oder 23 ± 5 bis 216 (Grenzen eingeschlossen) aus 2 (Seq.-ID Nr. 2), worin X = 17 bis 27 ist, oder ein Fragment davon, wie in den Ansprüchen definiert, das biologisch aktiv ist, umfasst, worin die Identifikation von FGF-19-Polypeptidfragmenten, die über biologische Aktivität verfügen, routinemäßig unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt sind, erfolgen kann. Vorzugsweise behält das FGF-19-Fragment eine qualitative biologische Aktivität eines nativen FGF-19-Polypeptids bei, einschließlich der Fähigkeit, Adipositas therapeutisch zu behandeln.
  • Das FGF-19-Polypeptid kann ein Polypeptid sein, das durch (i) Hybridisieren eines Test-DNA-Moleküls unter stringenten Bedingungen mit (a) einem DNA-Molekül, das für ein FGF-19-Polypeptid mit der Sequenz der Aminosäurereste von 1 oder X oder 23 ± 5 bis 216 (Grenzen eingeschlossen) aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) kodiert, worin X = 17 bis 27 ist, oder (b) dem Komplement des DNA-Moleküls aus (a) und, sofern das Test-DNA-Molekül zumindest etwa 80% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 81% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 82% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 83% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 84% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 85% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 86% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 87% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 88% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 89% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 90% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 91% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 92% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 93% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 94% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 95% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 96% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 97% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 98% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 99% Nucleinsäuresequenzidentität zu (a) oder (b) aufweist, (ii) Kultivieren einer Wirtszelle, die das Test-DNA-Molekül umfasst, unter Bedingungen, die zur Expression des Polypeptids geeignet sind, und (iii) Gewinnen des Polypeptids aus der Zellkultur hergestellt wird.
  • In einer Ausführungsform wird ein wie in den Ansprüchen definiertes Verfahren zum Screenen eines bioaktiven Mittels, das in der Lage ist, an FGF-19 zu binden, bereitgestellt. In einem Aspekt umfasst das Verfahren das Zusetzen eines bioaktiven Kandidatenmittels zu einer Probe von FGF-19 und das Feststellen von Bindung dieses Kandidatenmittels an FGF-19, worin Bindung auf ein bioaktives Mittel hinweist, das in der Lage ist, FGF-19 zu binden.
  • Darüber hinaus wird hierin ein Verfahren, wie in den Ansprüchen definiert, zum Screenen auf ein bioaktives Mittel, das in der Lage ist, die Aktivität von FGF-19 zu modulieren, bereitgestellt. In einer Ausführungsform wird ein Verfahren bereitgestellt, das die Schritte des Zusetzens eines bioaktiven Kandidatenmittels zu einer Probe von FGF-19 und des Feststellens einer Veränderung der biologischen Aktivität von FGF-19 umfasst, worin eine Veränderung auf ein bioaktives Mittel hinweist, das in der Lage ist, die Aktivität von FGF-19 zu modulieren. In einer Ausführungsform entspricht die FGF-19-Aktivität der reduzierten Aufnahme von Glucose in die Zellen. In einer anderen Ausführungsform entspricht die FGF-19-Aktivität der erhöhten Leptin-Freisetzung aus den Zellen. In einer bevorzugten Ausführungsform entspricht die FGF-19-Aktivität der reduzierten Aufnahme von Glucose und erhöhten Leptin-Freisetzung aus den Zellen. Vorzugsweise sind die Zellen Adipozyten. In wiederum einer anderen Ausführungsform entspricht die FGF-19-Aktivität der erhöhten Oxidation von Lipiden und Kohlenhydraten. Vorzugsweise sind die Zellen Leber- oder Muskelzellen.
  • In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird, wie in den Ansprüchen definiert, ein Verfahren zur Induktion von Leptin-Freisetzung aus Zellen, vorzugsweise aus Adipozyten, bereitgestellt. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren das Verabreichen von FGF-19 an Zellen in einer wirksamen Menge, um Leptin-Freisetzung zu induzieren.
  • In den hierin bereitgestellten Verfahren kann FGF-19 als eine Nucleinsäure, die FGF-19 exprimiert, oder in Proteinform verabreicht werden. Wie nachstehend noch näher beschrieben wird, kann FGF-19 über Infusion oder in einer Retard-Formulierung verabreicht werden.
  • Ebenfalls hierin bereitgestellt wird ein wie in den Ansprüchen definiertes Verfahren zur Induktion einer Reduktion der Glucose-Aufnahme in Zellen, vorzugsweise in Adipozyten. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren das Verabreichen von FGF-19 an Zellen in einer wirksamen Menge, um eine Reduktion der Glucose-Aufnahme zu erzielen.
  • In wiederum einem anderen Aspekt der Erfindung werden, wie in den Ansprüchen definiert, FGF-19 und Nucleinsäure zur Herstellung eines Medikaments zu Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung von Adipositas oder von Leiden, die mit A dipositas in Verbindung stehen, wie beispielsweise kardiovaskuläre Erkrankungen, an einer Person verwendet.
  • Ebenfalls werden, wie in den Ansprüchen definiert, FGF-19 und Nucleinsäure zur Herstellung eines Medikaments zu Verwendung bei der Reduktion der Gesamtkörpermasse einer Person verwendet. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Adipositas (der übermäßige Fettgehalt) einer Person reduziert.
  • Darüber hinaus werden, wie in den Ansprüchen definiert, FGF-19 und Nucleinsäure zur Herstellung eines Medikaments zu Verwendung bei der Reduktion der Konzentration von zumindest einem von Triglyceriden und freien Fettsäuren in einer Person oder zur Steigerung der Stoffwechselrate in einer Person verwendet.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt die Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 1) einer cDNA, die eine Nucleotidsequenz (Nucleotide 464–1111) enthält, die für Nativsequenz-FGF-19 kodiert, worin die Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 1) ein hierin als "DNA49435-1219" bezeichneter Klon ist. Ebenfalls dargestellt sind in Fettdruck und unterstrichen die Positionen der jeweiligen Start- und Stoppcodons.
  • 2 zeigt die Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) eines Nativsequenz-FGF-19-Polypeptids, das aus der Kodiersequenz aus Seq.-ID Nr. 1 stammt. Ebenfalls gezeigt sind die ungefähren Positionen verschiedener anderer wichtiger Polypeptiddomänen.
  • Die 3A und 3B zeigen Balkendiagramme, die darstellen, dass transgene MLC-FGF-19-Mäuse weniger als ihre nicht-transgenen Wurfgeschwister wiegen (3A) und geringere Leptinkonzentrationen im Blutkreislauf aufweisen (3B). 3A zeigt das Gewicht von transgenen FGF-19-Mäusen (volle Balken) und nicht-transgenen (Wildtyp-) Wurfgeschwistern (gepunktete Balken) im Alter von 6 Wochen bei beliebiger Fütterung (ganz links), nach 6 und 24 h Fasten und 24 h nach Ende einer 24-stündigen Fastenzeit (ganz rechts). 3B zeigt die Seren derselben Grup pen von Mäusen, wie sie in 3A dargestellt sind, in einem Leptintest (senkrechte Balke).
  • Die 4A–4D sind Balkendiagramme, die zeigen, dass transgene FGF-19-Mäuse erhöhte Nahrungsmittelaufnahme und Urinproduktion zeigen, jedoch einen normalen Hämatokritwert aufweisen. Eine Gruppe von Mäusen wurde bezüglich ihrer Nahrungsaufnahme bei beliebiger Fütterung und 24 h nach Abschluss der 24-stündigen Fastenzeit (4A), ihrer Wasseraufnahme (4B), ihrer Urinabgabe (4C) und ihres Hämatokritwertes (4D) beobachtet, worin die Resultate für die transgenen FGF-19-Mäuse in jedem Diagramm durch die vollen Balken und die Resultate für die Wildtypmäuse durch die gepunkteten Balken dargestellt sind.
  • 5 ist ein Balkendiagramm, das zeigt, dass transgene FGF-19-Mäuse eine erhöhte Rate an Sauerstoffverbrauch aufweisen. Der Sauerstoffverbrauch wird für transgene FGF-19-Mäuse (volle Balken) und für Wildtypmäuse (gepunktete Balken) während der beiden Zyklen (Dunkel- und Hellzyklus), nach einer 24-stündigen Fastenzeit und 24 h nach Abschluss der 24-stündigen Fastenzeit gezeigt.
  • Die 6A und 6B sind Balkendiagramme, die zeigen, dass transgene FGF-19-Mäuse (volle schwarze Balken) im Vergleich zu Wildtypmäusen (gepunktete Balken) reduzierte Triglyceride (6A) und freie Fettsäuren (6B) aufweisen.
  • Die 7A und 7B sind Balkendiagramme, die zeigen, dass die Verabreichung einer Infusion von FGF-19 an nicht-transgene Mäuse (volle schwarze Balken) im Vergleich zu Mäusen, denen eine Infusion mit einem Vehikel ohne FGF-19 verabreicht wurde, (gestreifte bzw. gepunktete Balken) zu einer Steigerung der Nahrungsmittelaufnahme (7A) und zu einer Steigerung des Sauerstoffverbrauchs (7B), worin "n" für Nacht und "d" für Tag steht, führt.
  • Die 8A und 8B sind Balkendiagramme, die aufzeigen, dass FGF-19 Leptin-Freisetzung aus Adipozyten steigert (8A) und Glucose-Aufnahme durch Adipozyten senkt (8B).
  • 9 ist ein Balkendiagramm, das das Fettpolstergewicht von transgenen FGF-19-Mäusen (gestreifte Balken) oder Wildtypmäusen (volle schwarze Balken), die jeweils auf Hochfettdiät (HFD) gesetzt wurden, über der Zeit darstellt, worin entlang der horizontalen Achse, beginnend auf der linken Seite, die Resultate nach sechs Wochen für epididymale Werte (HFD Ep) und dann für retriperitoneale mit perirenalen Werten (HFD RP/PR) und dann nach 10 Wochen für epididymale und dann für retrioperitoneale mit perirenalen Werten gezeigt sind.
  • 10 ist ein Balkendiagramm, das die Glucoseverträglichkeit von transgenen FGF-19-Mäusen (gestreifte Balken) oder Wildtypmäusen (volle schwarze Balken) über der Zeit (beide Gruppen zehn Wochen lang auf Hochfettdiäten gesetzt) zeigt.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • I. Definitionen
  • Die Bezeichnungen "FGF-19-Polypeptid", "FGF-19-Protein" und "FGF-19" umfassen, wenn sie hierin verwendet werden, Nativsequenz-FGF-19 und FGF-19-Polypeptidvarianten (die hierin noch näher definiert werden). Das FGF-19-Polypeptid kann aus zahlreichen verschiedenen Quellen, wie beispielsweise aus menschlichen Gewebetypen oder aus einer anderen Quelle, isoliert oder mittels Rekombinations- und/oder Syntheseverfahren hergestellt werden.
  • Ein "Nativsequenz-FGF-19" umfasst ein Polypeptid mit derselben Aminosäuresequenz wie FGF-19, das aus der Natur stammt. Solches Nativsequenz-FGF-19 kann aus der Natur isoliert oder kann mittels Rekombinations- und/oder Syntheseverfahren hergestellt werden. Die Bezeichnung "Nativsequenz-FGF-19" umfasst insbesondere natürlich vorkommende, trunkierte oder sekretierte Formen (z.B. eine Sequenz der extrazellulären Domäne), natürlich vorkommende Varianten (z.B. alternativ gespleißte Formen) und natürlich vorkommende allelische Varianten des FGF-19. In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Nativsequenz-FGF-19 ein reifes Nativ sequenz-FGF-19 oder Nativsequenz-FGF-19 voller Länge, das die Aminosäuren 1 bis 216 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) umfasst. Es ist auch denkbar und möglich, dass, während für das in 2 offenbarte FGF-19-Polypeptid (Seq.-ID Nr. 2) gezeigt wird, dass es mit dem Methioninrest beginnt, der hierin als Aminosäureposition 1 bezeichnet ist, ein anderer Methioninrest, der entweder stromauf oder stromab von Aminosäureposition 1 in 2 (Seq.-ID Nr. 2) angeordnet ist, als Start-Aminosäurerest für das FGF-19-Polypeptid verwendet werden kann.
  • "FGF-19-Polypeptidvariante" bezeichnet ein aktives FGF-19-Polypeptid wie nachstehend definiert mit zumindest etwa 80% Aminosäuresequenzidentität mit der Aminosäuresequenz (a) der Reste 1 oder 23 ± 5 bis 216 des in 2 gezeigten FGF-19-Polypeptids (Seq.-ID Nr. 2), (b) der Reste X bis 216 des in 2 gezeigten FGF-19-Polypeptids (Seq.-ID Nr. 2), worin X jeder beliebige Aminosäurerest von 17 bis 27 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) ist, oder (c) eines anderen spezifisch abgeleiteten Fragments der in 2 gezeigten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2). Solche FGF-19-Polypeptidvarianten umfassen beispielsweise FGF-19-Polypeptide, in denen ein oder mehrere Aminosäurereste, am N- und/oder C-Terminus sowie innerhalb einer oder mehrerer innerer Domänen, der in 2 gezeigten Sequenz (Seq.-ID Nr. 2) zugesetzt oder deletiert werden. Üblicherweise weist eine FGF-19-Polypeptidvariante zumindest etwa 80% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 81% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 82% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 83% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 84% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 85% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 86% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 87% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 88% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 89% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 90% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 91% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 92% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 93% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 94% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 95% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zu mindest etwa 96% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 97% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 98% Aminosäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 99% Aminosäuresequenzidentität, mit (a) den Resten 1 oder 23 ± 5 bis 216 des in 2 gezeigten FGF-19-Polypeptids (Seq.-ID Nr. 2), (b) den Resten X bis 216 des in 2 gezeigten FGF-19-Polypeptids (Seq.-ID Nr. 2), worin X jeder beliebige Aminosäurerest von 17 bis 27 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) ist, oder (c) einem anderen, spezifisch abgeleiteten Fragment der in 2 gezeigten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) auf. FGF-19-Polypeptidevarianten umfassen nicht die native FGF-19-Polypeptidsequenz. Üblicherweise weisen FGF-19-Polypeptidvarianten eine Länge von zumindest etwa 10 Aminosäuren, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 20 Aminosäuren, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 30 Aminosäuren, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 40 Aminosäuren, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 50 Aminosäuren, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 60 Aminosäuren, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 70 Aminosäuren, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 80 Aminosäuren, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 90 Aminosäuren, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 100 Aminosäuren, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 150 Aminosäuren, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 200 Aminosäuren, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 300 Aminosäuren, oder mehr auf.
  • "Prozent- (%) Aminosäuresequenzidentität" in Bezug auf die hierin identifizierten FGF-19-Polypeptidsequenzen ist als der Prozentsatz an Aminosäureresten in einer Kandidatensequenz definiert, die mit den Aminosäureresten in der spezifischen FGF-19-Sequenz nach Abgleichen der Sequenzen und Einführen von Lücken, sofern zur Erreichung maximaler prozentueller Sequenzidentität erforderlich, und ohne Berücksichtigung irgendwelcher konservativer Substitutionen als Teil der Sequenzidentität identisch sind. Abgleichen zum Zwecke der Bestimmung der prozentuellen Aminosäuresequenzidentität kann auf verschiedene Arten erreicht werden, die innerhalb des Gebiets der Erfindung liegen, beispielsweise unter Verwendung von allgemein erhältlichen Computerprogrammen wie z.B. BLAST-, BLAST-2-, ALIGN- oder Megalign-Software (DNASTAR). Fachleute können geeignete Parameter zur Messung von Abgleichung bestimmen, einschließlich sämtlicher Algorithmen, die erforderlich sind, um maximale Abgleichung über die volle Länge der zu vergleichenden Sequenzen zu erreichen. Für die vorliegenden Zwecke jedoch werden % Aminosäuresequenzidentitätswerte unter Verwendung des Computerprogramms zum Sequenzvergleich ALIGN-2 ermittelt, worin der vollständige Quellcode für das ALIGN-2-Programm nachstehend in Tabelle 1 bereitgestellt ist. Das ALIGN-2-Computerprogramm zum Sequenzvergleich wurde von Genentech, Inc., entworfen, und der in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigte Quellcode wurde mit Benutzerunterlagen im U.S. Copyright Office, Washington D. C., 20559, eingereicht, wo er unter der U.S.-Copyright-Registrierungsnummer TXU510087 registriert ist. Das ALIGN-2-Programm ist über Genentech, Inc., South San Francisco, Kalifornien, öffentlich erhältlich oder kann aus dem in der nachstehenden Tabelle 1 bereitgestellten Quellcode kompiliert werden. Das ALIGN-2-Programm sollte zur Verwendung auf einem UNIX-Betriebssystem, vorzugsweise digital UNIX V4.OD, kompiliert werden. Alle Sequenzvergleichsparameter sind durch das ALIGN-2-Programm festgesetzt und variieren nicht.
  • Für die vorliegenden Zwecke wird die % Aminosäuresequenzidentität einer bestimmten Aminosäuresequenz A zu, mit oder gegen eine bestimmte Aminosäuresequenz B (was alternativ auch als eine bestimmte Aminosäuresequenz A beschrieben werden kann, die eine bestimmte % Aminosäuresequenzidentität zu, mit oder gegen eine bestimmte Aminosäuresequenz B hat oder umfasst) wie folgt berechnet:
    100 mal den Bruch X/Y
    worin X die Anzahl an Aminosäureresten ist, die durch das Sequenzabgleichungsprogramm ALIGN-2 in dieser Abgleichung des Programms von A und B als identische Übereinstimmungen verzeichnet wurden, und Y die Gesamtanzahl an Aminosäureresten in B ist. Es wird verstanden werden, dass, sofern die Länge der Aminosäuresequenz A mit der Länge der Aminosäuresequenz B nicht übereinstimmt, die % Aminosäuresequenzidentität von A zu B nicht gleich der % Aminosäuresequenzidentität von B zu A ist. Als Beispiele für % Aminosäuresequenzidentität-Berechnungen zeigen Tabelle 2 und 3, wie die % Aminosäuresequenzidentität der Aminosäurese quenz, die als "Vergleichsprotein" bezeichnet wird, zur Aminosäuresequenz, die als "PRO" bezeichnet wird, berechnet wird.
  • Außer spezifisch anders festgehalten, werden alle hierin verwendeten % Aminosäuresequenzidentitätswerte wie oben beschrieben unter Verwendung des ALIGN-2-Sequenzvergleich-Computerprogramms erhalten. % Aminosäuresequenzidentitätswerte können jedoch auch unter Verwendung des Sequenzvergleichprogramms NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25, 3389–3402 (1997)) bestimmt werden. Das NCBI-BLAST2-Sequenzvergleichprogramm kann unter httpa/www.ncbi.nlm.nih.gov heruntergeladen werden oder ist sonst beim National Institute of Health, Bethesda, MD, erhältlich. NCBI-BLAST2 verwendet mehrere Suchparameter, worin alle dieser Suchparameter auf Standardwerte eingestellt sind, einschließlich beispielsweise unmask = yes, strand = all, expected occurrences = 10, minimum low complexity length = 15/5, multi-pass e-value = 0,01, constant for multi-pass = 25, dropoff for final gapped alignment = 25 und scoring matrix = BLOSUM62.
  • In Situationen, in denen NCBI-BLAST2 für Aminosäuresequenzvergleiche verwendet wird, wird die % Aminosäuresequenzidentität einer bestimmten Aminosäuresequenz A zu, mit oder gegen eine bestimmte Aminosäuresequenz B (was alternativ auch als eine bestimmte Aminosäuresequenz A beschrieben werden kann, die eine bestimmte % Aminosäuresequenzidentität zu, mit oder gegen eine bestimmte Aminosäuresequenz B hat oder umfasst) wie folgt berechnet:
    100 mal den Bruch X/Y
    worin X für die Anzahl an Aminosäureresten steht, die als identische Übereinstimmungen des Sequenzabgleichungsprogramms NCBI-BLAST2 in der Programmabgleichung von A und B verzeichnet werden, und worin Y für die Gesamtzahl an Aminosäureresten in B steht. Es wird verständlich sein, dass, sofern die Länge von Aminosäuresequenz A nicht der Länge von Aminosäuresequenz B entspricht, die % Aminosäuresequenzidentität von A zu B nicht gleich der % Aminosäuresequenzidentität von B zu A ist.
  • "FGF-19-Polynucleotidvariante" oder "FGF-19-Nucleinsäuresequenzvariante" bezeichnet ein Nucleinsäuremolekül, das für ein aktives FGF-19-Polypeptid wie nachstehend definiert kodiert und das zumindest etwa 80% Nucleinsäuresequenzidentität mit entweder (a) einer Nucleinsäuresequenz, die für die Reste 1 oder 23 ± 5 bis 216 des in 2 gezeigten FGF-19-Polypeptids (Seq.-ID Nr. 2) kodiert, (b) einer Nucleinsäuresequenz, die für die Aminosäuren X bis 216 des in 2 gezeigten FGF-19-Polypeptids (Seq.-ID Nr. 2), worin X jeder beliebige Aminosäurerest von 17 bis 27 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) ist, kodiert, oder (c) einer Nucleinsäuresequenz, die für ein anderes, spezifisch abgeleitetes Fragment der in 2 gezeigten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) kodiert, aufweist. Üblicherweise hat eine FGF-19-Polynucleotidvariante zumindest etwa 80% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 81% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 82% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 83% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 84% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 85% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 86% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 87% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 88% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 89% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 90% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 91% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 92% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 93% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 94% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 95% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 96% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 97% Nucleinsäuresequenzidentität, alternativ dazu zumindest etwa 98% Nucleinsäuresequenzidentität und wiederum alternativ dazu zumindest etwa 99% Nucleinsäuresequenzidentität, mit (a) einer Nucleinsäuresequenz, die für die Reste 1 oder 23 ± 5 bis 216 des in 2 gezeigten FGF-19-Polypeptids (Seq.-ID Nr. 2) kodiert, (b) einer Nucleinsäuresequenz, die für die Aminosäuren X bis 216 des in 2 gezeigten FGF-19-Polypeptids (Seq.-ID Nr. 2), worin X jeder beliebige Aminosäurerest von 17 bis 27 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) ist, ko diert, oder (c) einer Nucleinsäuresequenz, die für ein anderes, spezifisch abgeleitetes Fragment der in 2 gezeigten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) kodiert. FGF-19-Polynucleotidvarianten umfassen nicht die native FGF-19-Nucleotidsequenz.
  • Üblicherweise weisen FGF-19-Polynucleotidvarianten eine Länge von zumindest etwa 30 Nucleotiden, alternativ dazu zumindest eine Länge von zumindest etwa 60 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 90 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 120 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 150 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 180 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 210 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 240 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 270 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 300 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 450 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 600 Nucleotiden, alternativ dazu eine Länge von zumindest etwa 900 Nucleotiden, oder mehr auf.
  • "Prozent (%) Nucleinsäuresequenzidentität" in Bezug auf hierin identifizierte, FGF-19-kodierende Nulceinsäuresequenzen ist als der Prozentsatz an Nucleotiden in einer Kandidatensequenz definiert, die mit den Nucleotiden in einer für FGF-19-Polypeptid kodierenden Nucleinsäuresequenz, nach Abgleichen der Sequenzen und Einführen von Lücken, sofern zur Erreichung maximaler Prozent-Sequenzidentität erforderlich, identisch sind. Abgleichung zum Zweck der Bestimmung von Prozent-Nucleinsäuresequenzidentität kann auf verschiedene Weisen erreicht werden, die in den Bereich des Gebiets der Erfindung fallen, beispielsweise unter Verwendung öffentlich erhältlicher Computersoftware wie BLAST, BLAST-2, ALIGN oder Megalign-Software (DNASTAR). Fachleute können geeignete Parameter zur Bestimmung des Abgleichs festlegen, einschließlich jeglicher Algorithmen, die erforderlich sind, um maximalen Abgleich über die volle Länge der zu vergleichenden Sequenzen zu erreichen. Für die Zwecke hierin jedoch werden % Nucleinsäuresequenzidentitätswerte unter Verwendung des Sequenzvergleich-Computerprogramms ALIGN-2 ermittelt, worin der vollständige Quellcode für das ALIGN-2-Programm nachstehend in Tabelle 1 bereitgestellt ist. Das ALIGN-2-Sequenzvergleich-Computerprogramm wurde von Genentech, Inc., entwickelt, und der nachstehend in Tabelle 1 gezeigte Quellcode wurde mit Benutzerunterlagen im U.S. Copyright Office, Washington D. C., 20559, eingereicht, wo er unter der U.S.-Copyright-Registrierungsnummer TXU510087 registriert ist. Das ALIGN-2-Programm ist über Genentech, Inc., South San Francisco, Kalifornien, öffentlich erhältlich oder kann aus dem in der nachstehenden Tabelle 1 bereitgestellten Quellcode kompiliert werden. Das ALIGN-2-Programm sollte zur Verwendung auf einem UNIX-Betriebssystem, vorzugsweise digital UNIX V4.OD, kompiliert werden. Alle Sequenzvergleichsparameter sind durch das ALIGN-2-Programm festgesetzt und variieren nicht.
  • Für die Zwecke hierin wird die % Nucleinsäuresequenzidentität einer bestimmten Nucleinsäuresequenz C zu, mit oder gegen eine bestimmte Nucleinsäuresequenz D (was alternativ auch als eine bestimmte Nucleinsäuresequenz C beschrieben werden kann, die eine bestimmte % Nucleinsäuresequenzidentität zu, mit oder gegen eine bestimmte Nucleinsäuresequenz D hat oder umfasst) wie folgt berechnet:
    100 mal den Bruch W/Z
    worin W die Anzahl an Nucleotiden ist, die als identische Übereinstimmungen durch das Sequenzabgleichungsprogramm ALIGN-2 in der Programmabgleichung von C und D verzeichnet sind, und worin Z die Gesamtzahl an Nucleotiden in D ist. Es wird verstanden werden, dass, sofern die Länge von Nucleinsäuresequenz C nicht der Länge von Nucleinsäuresequenz D entspricht, die % Nucleinsäuresequenzidentität von C zu D nicht gleich der % Nucleinsäuresequenzidentität von D zu C ist. Als Beispiele für % Nucleinsäuresequenzidentitäts-Berechnungen zeigen die Tabellen 4 und 5, wie die % Nucleinsäuresequenzidentität der Nucleinsäuresequenz, die als "Vergleichs-DNA" bezeichnet wird, zur Nucleinsäuresequenz, die als "PRO-DNA" bezeichnet ist, berechnet wird.
  • Außer spezifisch anders festgehalten, werden alle hierin verwendeten % Nucleinsäuresequenzidentitätswerte wie oben beschrieben unter Verwendung des ALIGN-2-Sequenzvergleich-Computerprogramms erhalten. % Nucleinsäuresequenzidentitäts werte können jedoch auch unter Verwendung des Sequenzvergleichprogramms NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25, 3389–3402 (1997)) bestimmt werden. Das NCBI-BLAST2-Sequenzvergleichprogramm kann von der Adresse http://www.ncbi.nlm.nih.gov heruntergeladen oder sonst beim National Institute of Health, Bethesda, MD, erhalten werden. NCBI-BLAST2 verwendet mehrere Suchparameter, worin alle diese Suchparameter auf Standardwerte eingestellt sind, einschließlich beispielsweise unmask = yes, strand = all, expected occurrences = 10, minimum low complexity length = 15/5, multi-pass e-value = 0,01, constant for multi-pass = 25, dropoff for final gapped alignment = 25 und scoring matrix = BLOSUM62.
  • In Situationen, in denen NCBI-BLAST2 für Sequenzvergleiche verwendet wird, wird die % Nucleinsäuresequenzidentität einer bestimmten Nucleinsäuresequenz C zu, mit oder gegen eine bestimmte Nucleinsäuresequenz D (was alternativ auch als eine bestimmte Nucleinsäuresequenz C beschrieben werden kann, die eine bestimmte % Nucleinsäuresequenzidentität zu, mit oder gegen eine bestimmte Nucleinsäuresequenz D hat oder umfasst) wie folgt berechnet:
    100 mal den Bruch W/Z
    worin W für die Anzahl an Nucleotiden steht, die als identische Übereinstimmungen durch das Sequenzabgleichprogramm NCBI-BLAST2 in der Programmabgleichung von C und D verzeichnet wurden, und worin Z für die Gesamtzahl an Nucleotiden in D steht. Es wird verstanden werden, dass, sofern die Länge von Nucleinsäuresequenz C nicht gleich der Länge von Nucleinsäuresequenz D ist, die % Nucleinsäuresequenzidentität von C zu D nicht der % Nucleinsäuresequenzidentität von D zu C entspricht.
  • In anderen Ausführungsformen sind FGF-19-Polynucleotidvarianten Nucleinsäuremoleküle, die für ein aktives FGF-19-Polypeptid kodieren und die in der Lage sind, sich, vorzugsweise unter stringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen, an Nucleotidsequenzen zu hybridisieren, die für das in 2 gezeigte Volllängen-FGF-19-Polypeptid (Seq.-ID Nr. 2) kodieren. FGF-19- 19-Polypeptid (Seq.-ID Nr. 2) kodieren. FGF-19-Polypeptidvarianten können jene sein, für die eine FGF-19-Polynucleotidvariante kodiert.
  • Die Bezeichnung "Positive" im Zusammenhang mit den Aminosäuresequenzidentitätsvergleichen, die wie zuvor beschrieben durchgeführt werden, schließt Aminosäurereste in den verglichenen Sequenzen ein, die nicht identisch sind, jedoch ähnliche Eigenschaften aufweisen. Aminosäurereste, die einen positiven Wert bezogen auf einen Aminosäurerest von Interesse verzeichnen, sind jene, die entweder identisch mit dem Aminosäurerest von Interesse sind oder eine bevorzugte Substitution (wie nachstehend in Tabelle 6 definiert) des Aminosäurerests von Interesse sind.
  • Für die Zwecke hierin wird der %-Wert von Positiven einer gegeben Aminosäuresequenz A zu, mit oder gegen eine gegebene Aminosäuresequenz B (was alternativ auch als eine bestimmte Aminosäuresequenz A beschrieben werden kann, die einen bestimmten % Positive zu, mit oder gegen eine bestimmte Aminosäuresequenz B hat oder umfasst) wie folgt berechnet:
    100 mal den Bruch X/Y
    worin X für die Anzahl an Aminosäureresten steht, die einen positiven Wert wie oben definiert durch das Sequenzabgleichprogramm ALIGN-2 in der Programmabgleichung von A zu B verzeichnen, und worin Y für die Gesamtzahl an Aminosäureresten in B steht. Es wird verstanden werden, dass, sofern die Länge der Aminosäuresequenz A mit der Länge der Aminosäuresequenz B nicht übereinstimmt, die % Positive von A zu B nicht gleich den % an Positiven von B zu A ist.
  • "Isoliert", sofern verwendet, um die verschiedenen, hierin offenbarten Polypeptide zu beschreiben, bezeichnet ein Polypeptid, das identifiziert und aus einer Komponente aus seiner natürlichen Umgebung abgetrennt und/oder gewonnen wurde. Vorzugsweise ist das isolierte Polypeptid frei von Assoziationen mit allen Komponenten, mit denen es in der Natur assoziiert ist. Verunreinigende Komponenten seiner natürlichen Umgebung sind Materialien, die typischerweise diagnostische oder therapeuti sche Verwendungen für das Polypeptid stören würden und können Enzyme, Hormone und andere proteinhältige oder nicht-proteinhältige Gelöststoffe einbinden. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Polypeptid (1) bis zu einem ausreichenden Grad gereinigt, um zumindest 15 Reste von N-terminaler oder innerer Aminosäuresequenz durch Verwendung eines Zentrifugenröhrchensequenzierers zu erhalten, oder (2) durch SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden oder reduzierenden Bedingungen mittels Coomassie-Blau- oder, vorzugsweise Silberfärbung bis zur Homogenität gereinigt. Isoliertes Polypeptid schließt Polypeptid in situ innerhalb rekombinanter Zellen ein, da zumindest eine Komponente der natürlichen Umgebung des FGF-19-Polypeptids nicht vorhanden ist. Üblicherweise wird isoliertes Polypeptid durch zumindest einen Reinigungsschritt hergestellt.
  • Ein "isoliertes" Nucleinsäuremolekül, das für ein FGF-19-Polypeptid kodiert, ist ein Nucleinsäuremolekül, das identifiziert und aus zumindest einem verunreinigenden Nucleinsäuremolekül getrennt wird, mit dem es normalerweise in der natürlichen Quelle der für das FGF-19-Polypeptid kodierenden Nucleinsäure assoziiert ist. Vorzugsweise ist das isolierte Nucleinsäuremolekül frei von Assoziation mit jeglichen Komponenten, mit denen es in der Natur assoziiert ist. Ein isoliertes, für FGF-19-Polypeptid kodierendes Nucleinsäuremolekül liegt in einer anderen Form oder Beschaffenheit vor als es in der Natur zu finden ist. Isolierte Nucleinsäuremoleküle werden daher von dem für FGF-19-Polypeptid kodierenden Nucleinsäuremolekül, wie es in natürlichen Zellen existiert, unterschieden. Ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, das für ein FGF-19-Polypeptid kodiert, schließt jedoch für FGF-19-Polypeptid kodierende Nucleinsäuremoleküle ein, die in Zellen enthalten sind, welche üblicherweise FGF-19 exprimieren, wobei sich beispielsweise das Nucleinsäuremolekül an einer anderen chromosomalen Stelle befindet als in natürlichen Zellen.
  • Die Bezeichnung "Kontrollsequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die zur Expression einer operabel gebundenen Kodiersequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus erforderlich sind. Die Kontrollsequenzen, die beispielsweise für Prokaryoten geeignet sind, schließen einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz, und eine Ribosombindungsstelle ein. Eukaryotische Zellen sind bekannt dafür, Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer zu verwenden.
  • Nucleinsäure ist "operabel gebunden" wenn sie in eine funktionelle Beziehung mit einer anderen Nucleinsäuresequenz gebracht wird. Beispielsweise ist DNA für eine Präsequenz oder einen Sekretionsleader operabel an DNA für ein Polypeptid gebunden, wenn sie als ein Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids teilnimmt; ein Promotor oder ein Enhancer ist operabel an eine Kodiersequenz gebunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosombindungsstelle ist operabel an eine Kodiersequenz gebunden, wenn sie so positioniert ist, dass sie Translation unterstützt. Im Allgemeinen bedeutet "operabel gebunden", dass die DNA-Sequenzen, die verbunden sind, zusammenhängend sind und, im Fall eines Sekretionsleaders, zusammenhängend und in Lesephase sind. Enhancer müssen jedoch nicht zusammenhängend sein. Bindung erfolgt durch Ligation an passenden Restriktionsstellen. Bestehen solche Stellen nicht, so werden die synthetischen Oligonucleotidadaptoren oder -linker gemäß herkömmlichen Praktiken verwendet.
  • Die Bezeichnung "Antikörper" wird im weitesten Sinn verwendet und deckt insbesondere beispielsweise einzelne monoklonale Anti-FGF-19-Antikörper (einschließlich Agonisten, Antagonisten und neutralisierende Antikörper), Anti-FGF-19-Antikörperzusammensetzungen mit polyepitopischer Spezifität, einkettige Anti-FGF-19-Antikörper und Fragmente von Anti-FGF-19-Antikörpern ab (siehe unten). Die Bezeichnung "monoklonaler Antikörper" wie hierin verwendet bezieht sich auf einen Antikörper, der aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern gewonnen wurde, d.h. dass die einzelnen Antikörper, aus denen die Population besteht, identisch sind, unter Ausnahme möglicher, natürlich vorkommender Mutationen, die in geringen Mengen vorhanden sein können.
  • "Stringenz" von Hybridisierungsreaktionen können Fachleute leicht bestimmen und beruht im Allgemeinen auf einer empirischen Berechnung, die von Sondenlänge, Waschtemperatur und Salzkonzentration abhängt. Im Allgemeinen erfordern längere Sonden höhere Temperaturen für korrektes Anellieren, während kürzere Sonden niedrigere Temperaturen erfordern. Hybridisierung im Allgemeinen hängt von der Fähigkeit denaturierter DNA ab, neuerlich zu anellieren, wenn komplementäre Stränge in einer Umgebung unter ihrer Schmelztemperatur vorhanden sind. Je höher der Grad an erwünschter Homogenität zwischen der Sonde und der hybridisierbaren Sequenz ist, desto höher ist auch die relative Temperatur, die verwendet werden kann. Als Resultat folgt, dass höhere relative Temperaturen dazu neigen würden, die Reaktionsbedingungen stringenter zu gestalten, während niedrigere Temperaturen dies weniger verlangen würden. Für zusätzliche Details und Erklärungen zur Stringenz von Hybridisierungsreaktionen siehe Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995).
  • "Stringente Bedingungen" oder "Bedingungen hoher Stringenz" wie hierin definiert können als jene Bedingungen identifiziert werden, die: (1) geringe Ionenstärke und hohe Temperaturen für das Waschen verwenden, beispielsweise 0,015 M Natriumchlorid/0,0015 M Natriumcitrat/0,1% Natriumdodecylsulfat bei 50°C; (2) während der Hybridisierung ein denaturierendes Mittel verwenden, wie beispielsweise Formamid, z.B. 50 Vol.-% Formamid mit 0,1% Rinderserumalbumin/0,1% Ficoll/0,1% Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 mit 750 mM Natriumchlorid, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C; oder (3) 50% Formamid, 5 × SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 0,1% Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardts Lösung, beschallte Lachssperma-DNA (50 μg/ml), 0,1 SDS und 10% Dextransulfat bei 42°C, mit Waschschritten bei 42°C in 0,2 × SSC (Natriumchlorid/Natriumcitrat) und 50% Formamid bei 55°C, gefolgt von einem Waschschritt bei hoher Stringenz bestehend aus 0,1 × SSC, das EDTA enthält, bei 55°C, verwenden.
  • "Moderat stringente Bedingungen" können wie von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press (1989), beschrieben definiert werden und schließen die Verwendung von Waschlösung und Hybridisierungsbedingungen (z.B. Temperatur, Ionenstärke und % SDS) ein, die weniger stringent sind als jene, die zuvor beschrieben wurden. Ein Beispiel für moderat stringente Bedingungen ist Übernacht-Inkubation bei 37°C in einer Lösung, umfassend: 20% Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardts Lösung, 10% Dextransulfat und 20 mg/ml denaturierte gescherte Lachssperma-DNA; gefolgt von Waschen der Filter in 1 × SSC bei etwa 37–50°C. Fachleute werden erkennen, wie Temperatur, Ionenstärke usw. nach Erfordernis einzustellen sind, um Faktoren wie Sondenlänge und dergleichen anzupassen.
  • Die Bezeichnung "epitopmarkiert", wenn hierin verwendet, bezieht sich auf ein Hybridpolypeptid, das ein an ein "Markierungs-Polypeptid" fusioniertes FGF-19-Polypeptid umfasst. Das Markierungs-Polypeptid weist genug Reste auf, um ein Epitop bereitzustellen, gegen das ein Antikörper hergestellt werden kann, ist jedoch auch ausreichend kurz, dass es die Aktivität des Polypeptids, an das es fusioniert ist, nicht stört. Das Markierungs-Polypeptid ist vorzugsweise auch eher einmalig, sodass der Antikörper mit anderen Epitopen im Wesentlichen nicht kreuzreagiert. Geeignete Markierungs-Polypeptide haben im Allgemeinen zumindest sechs Aminosäurenreste und üblicherweise zwischen etwa 8 und 50 Aminosäurereste (vorzugsweise zwischen etwa 10 und 20 Aminosäurereste).
  • Wie hierin verwendet bezieht sich die Bezeichnung "Immunoadhäsin" auf antikörperähnliche Moleküle, die die Bindungsspezifität eines heterologen Proteins (eines "Adhäsins") mit den Effektorfunktionen von konstanten Immunglobulindomänen kombinieren. Strukturell gesehen umfassen die Immunoadhäsine eine Fusion zwischen einer Aminosäuresequenz mit der erwünschten Bindungsspezifität, die sich von der Antigenerkennungs- und -bindungsstelle eines Antikörpers unterscheidet (d.h. "heterolog" ist), und einer Immunglobulin-Konstantdomänensequenz. Der Adhäsinteil eines Immunoadhäsinmoleküls ist typischerweise eine zusammenhängende Aminosäuresequenz, die zumindest die Bindungsstelle eines Rezeptors oder eines Liganden umfasst. Die Immunglobulin-Konstantdomänensequenz im Immunoadhäsin kann aus einem Immunglobulin wie z.B. IgG-1-, IgG-2-, IgG-3- oder IgG-4-Subtypen, IgA (einschließlich IgA-1 und IgA-2), IgE, IgD oder IgM erhalten werden.
  • "Aktiv" oder "Aktivität" für die Zwecke hierin bezieht sich auf Form(en) von FGF-19, das/die eine biologische und/oder eine immunologische Aktivität von nativem oder natürlich auftretendem FGF-19 in sich trägt/tragen, worin sich "biologische" Aktivität auf eine biologische Funktion (entweder inhibitorisch oder stimulatorisch) bezieht, die durch ein natives oder natürlich vorkommendes FGF-19 verursacht wird und nicht die Fähigkeit ist, die Produktion eines Antikörpers gegen ein antigenes Epitop zu induzieren, das von einem nativen oder natürlich vorkommenden FGF-19 aufgewiesen wird, und eine "immunologische" Aktivität bezieht sich auf die Fähigkeit, die Produktion eines Antikörpers gegen ein antigenes Epitop zu induzieren, das von einem nativen oder natürlich vorkommenden FGF-19 aufgewiesen wird. Eine bevorzugte biologische Aktivität umfasst eine oder mehrere beliebige der folgenden Aktivitäten: Steigerung des Stoffwechsels (oder der Stoffwechselrate) in einer Person, Reduktion des Körpergewichts einer Person, Reduktion von Adipositas in einer Person, Verringerung der Glucose-Aufnahme in die Fettzellen, Steigerung von Leptin-Freisetzung aus Fettzellen, Verringerung von Triglyceriden in einer Person und Verringerung von freien Fettsäuren in einer Person: Es wird verstanden werden, dass manche der Aktivitäten von FGF-19 direkt durch FGF-19 induziert werden und manche indirekt induziert werden, wobei jedoch alle Aktivitäten das Resultat der Gegenwart von FGF-19 sind und in Abwesenheit von FGF-19 nicht vorhanden sein würden.
  • Die Bezeichnung "Antagonist" wird im weitesten Sinne verwendet und schließt jedes beliebige Molekül ein, das eine biologische Aktivität eines nativen, hierin offenbarten FGF-19-Polypeptids teilweise oder gänzlich blockiert, hemmt oder neutralisiert. Auf ähnliche Weise wird die Bezeichnung "Agonist" im weitesten Sinn verwendet und schließt jedes beliebige Molekül ein, das eine biologische Aktivität eines hierin offenbarten, nativen FGF-19-Polypeptids nachahmt. Geeignete Agonisten- oder Antagonistenmoleküle umfassen insbesondere Agonisten- oder Antagonistenantikörper oder -Antikörperfragmente, Fragmente oder Aminosäuresequenzvarianten von nativen FGF-19-Polypeptiden, Peptiden, kleinen organischen Molekülen usw. Verfahren zur Identifikation von Agonisten oder Antagonisten eines FGF-19-Polypeptids können das Kontaktieren eines FGF-19-Polypeptids mit einem Kandidatenagonisten- oder -antagonistenmolekül und das Messen einer nachweisbaren Veränderung einer oder mehrerer biologischer Aktivitäten, die normalerweise mit dem FGF-19-Polypeptid assoziiert werden, umfassen.
  • "Behandlung" bezieht sich sowohl auf therapeutische Behandlung als auch auf prophylaktische oder präventive Maßnahmen, worin das Ziel die Prävention oder Verlangsamung (Abschwächung) des betreffenden pathologischen Leidens oder der Störung ist. Jene, die solch einer Behandlung bedürfen, schließen jene ein, die bereits erkrankt sind, als auch jene, die eine Neigung zeigen, diese Erkrankung zu erleiden, oder jene, in denen es die Erkrankung zu unterbinden gilt.
  • "Chronische" Verabreichung bezieht sich im Gegensatz zu einem akuten Modus auf die Verabreichung des Mittels/der Mittel auf kontinuierliche Weise, um die anfängliche therapeutische Wirkung (Aktivität) über eine längere Zeitspanne aufrechtzuerhalten. "Diskontinuierliche" Verabreichung ist eine Behandlung, die nicht in Serie ohne Unterbrechung erfolgt, sondern eher auf zyklische Weise durchgeführt wird.
  • "Säugetier" für die Zwecke der Behandlung bezieht sich auf jedes beliebige Tier, das als Säugetier klassifiziert ist, einschließlich Mensch, Haus- und Nutztiere, Zoo-, Sport- und Haustiere, wie beispielsweise Hunde, Katzen, Rinder, Pferde, Schafe, Schweine, Ziegen, Kaninchen usw. Vorzugsweise ist das Säugetier ein Mensch.
  • "Invidium" bezieht sich auf jede beliebige Person, vorzugsweise ein Säugetier, noch bevorzugter ein Mensch.
  • "Adipositas" bezieht sich auf eine Erkrankung, bei der ein Säugetier einen Body Mass Index (BMI), der als Gewicht (kg) pro Größe2 (m) berechnet wird, von mindestens 25,9 aufweist. Üblicherweise haben normalgewichtige Personen einen BMI von 19,9 bis weniger als 25,9. Die Adipositas, um die es hierin geht, kann auf jede beliebige Ursache zurückzuführen sein, genetisch oder durch Lebensumstände bedingt. Beispiele für Erkrankungen, die in Adipositas resultieren können oder die Ursache für Adipositas sein können, umfassen übermäßiges Essen und Bulimie, polyzystisches Ovarialsyndrom, Kraniopharyngeom, das Prader-Labhart-Willi-Syndrom, das Fröh lich-Syndrom, Typ-II-Diabetes, Wachstumshormon-defiziente Patienten, normale Varianten von Kleinwüchsigkeit, das Turner-Syndrom und andere pathologische Leiden, die reduzierte Stoffwechselaktivität oder einen herabgesetzten Energieverbrauch im Ruhezustand, ausgedrückt als ein Prozentsatz der gesamten fettfreien Körpermasse, aufweisen, z.B. Kinder mit akuter Lymphoblastenleukämie.
  • "Mit Adipositas in Verbindung stehende Leiden" beziehen sich auf Leiden, die das Resultat von Adipositas sind oder durch diese hervorgerufen werden, wie beispielsweise dermatologische Erkrankungen wie Infektionen, Krampfadern, Akanthosis nigricans und Ekzeme, Bewegungsintoleranz, Diabetes mellitus, Insulinresistenz, Bluthochdruck, Hypercholesterinämie, Cholelithiasis, Osteoarthritis, orthopädische Verletzungen, Thromboembolie, Krebs und kardiovaskuläre Erkrankungen einschließlich koronarer (oder kardiovaskulärer) Herzkrankheiten, insbesondere jene kardiovaskulären Leiden, die mit hohen Konzentrationen an Triglyceriden und freien Fettsäuren in einer Person assoziiert sind.
  • Verabreichung "in Kombination mit" einem oder mehreren therapeutischen Mitteln schließt simultane (gleichzeitige) und aufeinander folgende Verabreichung in jeder beliebigen Reihenfolge ein.
  • "Träger" wie hierin verwendet schließen pharmazeutisch annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren ein, die gegenüber der Zelle oder dem Säugetier, die/das ihnen ausgesetzt wird, bei den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nichttoxisch sind. Häufig ist der physiologisch annehmbare Träger eine wässrige, pH-gepufferte Lösung. Beispiele für physiologisch annehmbare Träger umfassen Puffer wie z.B. Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidanzien einschließlich Ascorbinsäure; niedermolekulares Polypeptid (mit weniger als etwa 10 Resten); Proteine, wie z.B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere wie z.B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren wie z.B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner wie z.B. EDTA; Zuckeralkohole wie z.B. Mannit oder Sorbit; salzbildende Gegenionen wie z.B. Natrium; und/oder nichtionische Tenside wie z.B. TWEENTM, Polyethylenglykol (PEG) und PLURONICSTM.
  • "Antikörperfragmente" umfassen einen Abschnitt eines intakten Antikörpers, vorzugsweise die Antigenbindungs- oder variable Region des intakten Antikörpers. Beispiele für Antikörperfragmente umfassen Fab-, Fab'-, F(ab')2- und Fv-Fragmente; Diabodies; lineare Antikörper (Zapata et al., Protein Eng. 8(10), 1057–1062 (1995)); einkettige Antikörpermoleküle; und multispezifische Antikörper, gebildet aus Antikörperfragmenten.
  • Papainverdau von Antikörpern produziert zwei identische Antigenbindungsfragmente, genannt "Fab"-Fragmente, jeweils mit einer einzelnen Antigen-Bindungsstelle und einem verbleibenden "Fc"-Fragment, eine Bezeichnung, die die Fähigkeit widerspiegelt, leicht zu kristallisieren. Pepsinbehandlung ergibt ein F(ab')2-Fragment, das zwei Antigen-kombinierende Stellen aufweist und dennoch zur Vernetzung von Antigen in der Lage ist.
  • "Fv" ist das minimale Antikörperfragment, das eine vollständige Antigenerkennungs- und -bindungsstelle aufweist. Diese Region besteht aus einem Dimer einer variablen Schwer- und einer variablen Leichtkettendomäne in enger, nicht-kovalenter Assoziation. In dieser Konfiguration erfolgt eine Wechselwirkung zwischen den drei CDRs jeder variablen Domäne zur Definition einer Antigen-Bindungsstelle an der Oberfläche des VH-VL-Dimers. Gemeinsam verleihen die sechs CDRs dem Antikörper Antigen-Bindungsspezifität. Jedoch weist sogar eine einzelne variable Domäne (oder die Hälfte eines Fv, das nur drei CDRs umfasst, die für ein Antigen spezifisch sind) die Fähigkeit auf, Antigen zu erkennen und zu binden, dies jedoch bei einer geringeren Affinität als die gesamte Bindungsstelle.
  • Das Fab-Fragment enthält auch die konstante Domäne der leichten Kette und die erste konstante Domäne (CH1) der schweren Kette. Fab-Fragmente unterscheiden sich von Fab'-Fragmenten durch die Addition einiger weniger Reste am Carboxy-Terminus der Schwerketten-CH1-Domäne, einschließlich eines oder mehrerer Cysteine aus der Antikörper-Gelenksregion. Fab'-SH ist hierin die Bezeichnung für Fab', in dem der/die Cysteinrest(e) der konstanten Domänen eine freie Thiolgruppe aufweist/aufweisen. F(ab')2-Antikörperfragmente wurden ursprünglich als Paare von Fab'-Fragmenten produziert, die Gelenks-Cysteine zwischen sich aufwiesen. Auch andere chemische Bindungen sind für Antikörperfragmente bekannt.
  • Die "leichten Ketten" von Antikörpern (Immunglobulinen) aus jeder beliebigen Wirbeltierspezies können einem oder zwei eindeutig unterscheidbaren Typen, genannt kappa und lambda, basierend auf den Aminosäuresequenzen ihrer konstanten Domänen zugeordnet werden.
  • Je nach Aminosäuresequenz der konstanten Domäne ihrer schweren Ketten können Immunglobuline verschiedenen Klassen zugeordnet werden. Es gibt fünf Hauptklassen von Immunglobulinen: IgA, IgD, IgE, IgG und IgM, und mehrere von diesen können weiter in Unterklassen (Isotypen) unterteilt werden, z.B.: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA und IgA2.
  • "Einkettige Fv"- oder "sFv"-Antikörperfragmente umfassen die VH- und VL-Domänen des Antikörpers, worin diese Domänen in einer einzigen Polypeptidkette vorhanden sind. Vorzugsweise umfasst das Fv-Polypeptid weiters einen Polypeptidlinker zwischen den VH- und VL-Domänen, was dem sFv die Möglichkeit gibt, die erwünschte Struktur für Antigenbindung zu bilden. Einen Überblick zum Thema sFv liefert Pluckthun in The Pannacology of Monoclonal Antibodies, Bd. 113, Rosenburg & Moore (Hrsg.), Springer-Verlag, New York, 269–315 (1994).
  • Die Bezeichnung "Diabodies" bezieht sich auf kleine Antikörperfragmente mit zwei Antigen-Bindungsstellen, worin die Fragmente eine variable Schwerkettendomäne (VH) verbunden mit einer variablen Leichtkettendomäne (VL) in derselben Polypeptidkette (VH-VL) umfassen. Unter Verwendung eines Linkers, der zu kurz ist, um Paarung zwischen den zwei Domänen an derselben Kette zu ermöglichen, werden die Domänen gezwungen, mit den komplementären Domänen einer anderen Kette Paare zu bilden und zwei Antigen-Bindungsstellen zu schaffen. Diabodies werden aus führlicher beispielsweise in der EP 404.097 ; der WO 93/11161; und in Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444–6448 (1993), beschrieben.
  • Ein "isolierter" Antikörper ist einer, der identifiziert und aus einer Komponente seiner natürlichen Umgebung getrennt und/oder gewonnen wurde. Verunreinigende Komponenten seiner natürlichen Umgebung sind Materialien, die diagnostische oder therapeutische Verwendungen für den Antikörper stören würden und können Enzyme, Hormone und andere proteinhältige oder nicht-proteinhältige Gelöststoffe einbinden. In bevorzugten Ausführungsformen wird der Antikörper (1) zu einer Reinheit von über 95 Gew.-% des Antikörpers, bestimmt durch das Lowry-Verfahren, und am meisten bevorzugt zu einer Reinheit von über 99 Gew.-%, (2) zu einem ausreichenden Grad, um zumindest 15 Reste von N-terminaler oder innerer Aminosäuresequenz mittels eines Zentrifugenröhrchensequenzierers zu erhalten, oder (3) bis zur Homogenität mittels SDS-PAGE unter reduzierenden oder nichtreduzierenden Bedingungen mittels Coomassie-Blau- oder, vorzugsweise, Silberfärbung gereinigt. Isolierter Antikörper schließt den Antikörper in situ innerhalb rekombinanter Zellen ein, da zumindest eine Komponente der natürlichen Umgebung des Antikörpers nicht vorhanden ist. Üblicherweise wird ein isolierter Antikörper jedoch durch zumindest einen Reinigungsschritt hergestellt.
  • Das Wort "Markierung", sofern hierin verwendet, bezieht sich auf eine nachweisbare Verbindung oder Zusammensetzung, die direkt oder indirekt an den Antikörper konjugiert ist, um einen "markierten" Antikörper zu bilden. Die Markierung kann durch sich selbst nachweisbar sein (z.B. Radioisotopmarkierungen oder fluoreszierende Markierungen) oder kann, im Fall einer enzymatischen Markierung, chemische Änderung einer Substratverbindung oder -zusammensetzung katalysieren, die wiederum nachweisbar ist.
  • Unter "Festphase" wird eine nichtwässrige Matrix verstanden, an die der Antikörper der vorliegenden Erfindung anhaften kann. Beispiele für Festphasen, die hierzu gehören, schließen jene ein, die teilweise oder vollständig aus Glas (z.B. Controlled Pore Glass), Polysacchariden (z.B. Agarose), Polyacrylamiden, Polystyrol, Polyvinylal kohol und Siliconen gebildet sind. In bestimmten Ausführungsformen, je nach Kontext, kann die Festphase den Well einer Testplatte umfassen, in anderen ist sie eine Reinigungssäule (z.B. eine Affinitätschromatographiesäule). Diese Bezeichnung umfasst auch eine diskontinuierliche Festphase aus einzelnen Teilchen, wie z.B. jene, die um US-Patent Nr. 4.275.149 beschrieben werden.
  • Ein "Liposom" ist ein kleines Vesikel, das sich aus verschiedenen Typen an Lipiden, Phospholipiden und/oder Tensid zusammensetzt und zur Zufuhr eines Wirkstoffs (wie z.B. eines FGF-19-Polypeptids oder Antikörpers dazu) zu einem Säugetier nützlich ist. Die Komponenten des Liposoms sind üblicherweise in einer zweischichtigen Formation angeordnet, ähnlich der Lipidanordnung biologischer Membranen.
  • Ein "kleines Molekül" ist hierin als ein Molekül definiert, das ein Molekulargewicht von unter etwa 500 Da aufweist. Tabelle 1
    Figure 00370001
    Tabelle 1 (Fortsetzung)
    Figure 00380001
    Tabelle 1 (Fortsetzung)
    Figure 00390001
    Tabelle 1 (Fortsetzung)
    Figure 00400001
    Tabelle 1 (Fortsetzung)
    Figure 00410001
    Tabelle 1 (Fortsetzung)
    Figure 00420001
    Tabelle 1 (Fortsetzung)
    Figure 00430001
    Tabelle 1 (Fortsetzung)
    Figure 00440001
    Tabelle 1 (Fortsetzung)
    Figure 00450001
    Tabelle 1 (Fortsetzung)
    Figure 00460001
    Tabelle 1 (Fortsetzung)
    Figure 00470001
    Tabelle 1 (Fortsetzung)
    Figure 00480001
    Tabelle 1 (Fortsetzung)
    Figure 00490001
    Tabelle 1 (Fortsetzung)
    Figure 00500001
    Tabelle 1 (Fortsetzung)
    Figure 00510001
    Tabelle 1 (Fortsetzung)
    Figure 00520001
    Tabelle 1 (Fortsetzung)
    Figure 00530001
    Tabelle 2
    Figure 00540001
    % Aminosäuresequenzidentität =
    (die Anzahl identisch übereinstimmender Aminosäurereste zwischen den zwei Polypeptidsequenzen wie durch ALIGN-2 bestimmt) dividiert durch (die Gesamtzahl an Aminosäureresten des PRO-Polypeptids) =
    5 dividiert durch 15 = 33,3% Tabelle 3
    Figure 00540002
    % Aminosäuresequenzidentität =
    (die Anzahl identisch übereinstimmender Aminosäurereste zwischen den zwei Polypeptidsequenzen wie durch ALIGN-2 bestimmt) dividiert durch (die Gesamtzahl an Aminosäureresten des PRO-Polypeptids) =
    5 dividiert durch 10 = 50% Tabelle 4
    Figure 00540003
    % Nucleinsäuresequenzidentität =
    (die Anzahl identisch übereinstimmender Nucleotide zwischen den zwei Nucleinsäuresequenzen wie durch ALIGN-2 bestimmt) dividiert durch (die Gesamtzahl an Nucleotiden der PRO-DNA-Nucleinsäuresequenz) =
    6 dividiert durch 14 = 42,9% Tabelle 5
    Figure 00550001
    % Nucleinsäuresequenzidentität =
    (die Anzahl identisch übereinstimmender Nucleotide zwischen den zwei Nucleinsäuresequenzen wie durch ALIGN-2 bestimmt) dividiert durch (die Gesamtzahl an Nucleotiden der PRO-DNA-Nucleinsäuresequenz) =
    4 dividiert durch 12 = 33,3%
  • II. Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung
  • A. Volllängen-FGF-19-Polypeptide
  • Das vorliegende Dokument offenbart isolierte Nucleotidsequenzen, die für Polypeptide kodieren, die in der vorliegenden Anmeldung als FGF-19 (oder auch UNQ334) bezeichnet werden. Insbesondere wurden cDNAs, die für ein FGF-19-Polypeptide kodieren, identifiziert und isoliert, wie näher in den nachstehenden Beispiele offenbart wird. Es gilt anzumerken, dass Proteine, die in getrennten Expressionsdurchgängen produziert wurden, unterschiedliche PRO-Nummern verliehen bekommen können, dass jedoch die UNQ-Nummer für jede bestimmte DNA und das kodierte Protein einmalig ist und nicht geändert wird. Zur einfachen und verständlichen Darstellung werden in der vorliegenden Beschreibung das Protein, für das DNA49435-1219 kodiert, sowie weitere native Homologe und Varianten, die in der obigen Definition von FGF-19 (manchmal auch als PRO533 bezeichnet) eingebunden sind, als "FGF-19" bezeichnet, und zwar unabhängig von ihrem Ursprung oder der Art der Herstellung.
  • Wie in den Beispielen nachstehend offenbart, wurde ein cDNA-Klon, der hierin als DNA49435-1219 bezeichnet wird, bei der ATCC hinterlegt. Die tatsächliche Nucleotidsequenz dieses Klons kann von Fachleuten durch Sequenzieren des hinterlegten Klons mittels Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung Standard sind, leicht bestimmt werden. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz kann aus der Nucleotidsequenz mittels Standardverfahren bestimmt werden. Für das hierin beschriebene FGF-19-Polypeptide und die kodierende Nucleinsäure konnten die Anmelder das identifizieren, was als der Leseraster angenommen wird, wie er am besten mit der zu dem Zeitpunkt zur Verfügung stehenden Sequenzinformation identifizierbar war.
  • Unter Verwendung des ALIGN-2-Sequenzabgleich-Computerprogramms, auf das bereits oben verwiesen wurde, wurde erkannt, dass das Nativsequenz-FGF-19 voller Länge (gezeigt in 2 und Seq.-ID Nr. 2) eine gewisse Aminosäuresequenzidentität mit AF007268_1 aufweist. Folglich wird zur Zeit angenommen, dass das in der vorliegenden Anmeldung offenbarte FGF-19-Polypeptid ein neu identifiziertes Mitglied der Fibroblastenwachstumsfaktor-Proteinfamilie ist und eine oder mehrere biologische und/oder immunologische Aktivitäten oder Eigenschaften besitzt, die für diese Proteinfamilie typisch ist bzw. sind.
  • B. FGF-19-Varianten
  • Zusätzlich zu den hierin beschriebenen Volllängen-Nativsequenz-FGF-19-Polypeptiden wird erwogen, dass FGF-19-Varianten hergestellt werden können. FGF-19-Varianten können durch Einführen geeigneter Nucleotidänderungen in die FGF-19-DNA und/oder durch Synthese des erwünschten FGF-19-Polypeptids hergestellt werden. Fachleuten wird bekannt sein, dass Aminosäureänderungen posttranslationale Prozesse des FGF-19 verändern können, beispielsweise Änderung der Anzahl oder Position von Glykosylierungsstellen oder Ändern der Membranverankerungs-Eigenschaften.
  • Variationen im nativen Volllängensequenz-FGF-19 oder in verschiedenen Domänen des hierin beschriebenen FGF-19 können gemacht werden, beispielsweise unter Verwendung aller Verfahren und Richtlinien für konservative und nicht-konservative Mutationen, die beispielsweise im US-Patent Nr. 5.364.934 beschrieben werden. Variationen können eine Substitution, Deletion oder Insertion von einem oder mehrerer Codons sein, die für das FGF-19 kodieren, die im Vergleich mit dem Nativsequenz-FGF-19 zu einer Änderung der Aminosäuresequenz des FGF-19 führen. Gegebenenfalls erfolgt diese Variation durch Substitution von zumindest einer Aminosäure mit jeder anderen Aminosäure in einer oder mehreren Domänen des FGF-19. Hilfestellung bei der Bestimmung, welcher Aminosäurerest insertiert, substituiert oder deletiert werden kann, ohne die erwünschte Aktivität negativ zu beeinflussen, kann durch Vergleichen der Sequenz des FGF-19 mit jener von homologen bekannten Proteinmolekülen und durch Minimieren der Anzahl an Aminosäuresequenzänderungen in Regionen hoher Homologie gefunden werden. Aminosäuresubstitutionen können durch Ersetzen einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen strukturellen und/oder chemischen Eigenschaften, beispielsweise durch Ersetzen eines Leucins mit einem Serin, d.h. durch konservative Aminosäureersetzungen, entstehen. Insertionen oder Deletionen können gegebenenfalls im Bereich von etwa 1 bis 5 Aminosäuren liegen. Die zugelassene Variation kann durch systematisches Durchführen von Insertionen, Deletionen oder Substitutionen von Aminosäuren in die Sequenz und Testen der resultierenden Varianten auf Aktivität, die die Volllängen- oder reife native Sequenz zeigt, bestimmt werden.
  • FGF-19-Polypeptidfragmente werden hierin offenbart. Solche Fragmente können am N-Terminus oder C-Terminus trunkiert sein, oder ihnen können, beispielsweise im Vergleich zu einem Volllängennativprotein, innen gelegene Reste fehlen. Bestimmten Fragmenten fehlen Aminosäurereste, die für eine erwünschte biologische Aktivität des FGF-19-Polypeptids nicht essenziell sind.
  • FGF-19-Fragmente können durch jede beliebige Anzahl an herkömmlichen Verfahren hergestellt werden. Erwünschte Peptidfragmente können chemisch synthetisiert werden. Ein alternativer Ansatz umfasst die Bildung von FGF-19-Fragmenten durch enzymatischen Verdau, z.B. durch Behandlung des Proteins mit einem Enzym, das bekannt dafür ist, Proteine an Stellen zu spalten, die durch bestimmte Aminosäurereste definiert sind, oder durch Verdau der DNA mit geeigneten Restriktionsenzymen und Isolieren des erwünschten Fragments. Wiederum ein anderes nützliches Verfahren umfasst das Isolieren und Amplifizieren eines DNA-Fragments, das für ein erwünschtes Polypeptidfragment kodiert, durch Polymerasekettenreaktion (PCR). Oligonucleotide, die die erwünschten Termini des DNA-Fragments definieren, werden an den 5'- und 3'-Primern in der PCR verwendet. Vorzugsweise teilen FGF-19-Polypeptidfragmente zumindest eine biologische und/oder immunologische Aktivität mit dem in 2 gezeigten, nativen FGF-19-Polypeptid (Seq.-ID Nr. 2).
  • In besonderen Ausführungsformen sind konservative Substitutionen von Interesse in Tabelle 6 unter der Überschrift "Bevorzugte Substitutionen" gezeigt. Resultieren solche Substitutionen in einer Veränderung der biologischen Aktivität, so werden mehr substanzielle Veränderungen, die in Tabelle 6 als "Beispielhafte Substitutionen" bezeichnet sind oder wie nachstehend unter Verweis auf Aminosäureklassen noch näher beschrieben wird, eingeführt und die Produkte gescreent.
  • Tabelle 6
    Figure 00580001
  • Figure 00590001
  • Wesentliche Modifikationen in Funktion oder immunologischer Identität des FGF-19-Polypeptids erfolgen durch Selektieren von Substitutionen, die sich in ihrer Wirkung auf die Aufrechterhaltung (a) der Struktur der Polypeptidhauptkette im Bereich der Substitution, beispielsweise in Form einer Faltblatt- oder Helixkonformation, (b) der Ladung oder Hydrophobizität des Moleküls an der Target-Stelle oder (c) des Volumens der Seitenkette signifikant unterscheiden. Natürlich vorkommende Reste werden auf Grundlage gemeinsamer Seitenketteneigenschaften in die folgenden Gruppen aufgeteilt:
    • (1) hydrophob: Norleucin, met, ala, val, leu, ile;
    • (2) neutral hydrophil: cys, ser, thr;
    • (3) sauer: asp, glu;
    • (4) basisch: asn, gln, his, lys, arg;
    • (5) Reste, die Kettenausrichtung beeinflussen: gly, pro; und
    • (6) aromatisch: trp, tyr, phe.
  • Nicht-konservative Substitutionen erfordern den Austausch eine Mitglieds einer dieser Klassen gegen eine andere Klasse. Solche substituierten Reste können auch in die konservativen Substitutionsstellen oder, noch bevorzugter, in die verbleibenden (nicht-konservierten) Stellen eingeführt werden.
  • Die Variationen können unter Verwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren, wie beispielsweise Oligonucleotid-vermittelte (ortsgerichtete) Mutagenese, Alaninscanning und PCR-Mutagenese, gebildet werden. Ortsgerichtete Mutagenese [Carter et al., Nucl. Acids Res. 13, 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res. 10, 6487 (1987)], Kassettenmutagenese [Wells et al., Gene 34, 315 (1985)], Restriktionsselektionsmutagenese [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA 317, 415 (1986)] oder andere bekannte Verfahren können an der klonierten DNA durchgeführt werden, um die FGF-19-DNA-Variante zu bilden.
  • Scanning-Aminosäureanalyse kann auch verwendet werden, um eine oder mehrere Aminosäuren entlang einer zusammenhängenden Sequenz zu identifizieren. Zu den bevorzugten Scanning-Aminosäuren zählen relativ kleine, neutrale Aminosäuren. Solche Aminosäuren schließen Alanin, Glycin, Serin und Cystein ein. Alanin ist typischerweise eine bevorzugte Scanning-Aminosäure in dieser Gruppe, da es die Seitenkette über den beta-Kohlenstoff hinaus eliminiert und weniger wahrscheinlich die Hauptkettenkonformation der Variante verändert [Cunningham & Wells, Science 244, 1081–1085 (1989)]. Typischerweise wird ebenso Alanin bevorzugt, da es die häufigste Aminosäure ist. Weiters wird es häufig sowohl an verborgenen als auch an freiliegenden Positionen gefunden [Creighton, The Proteins (W. H. Freeman & Co., N. Y.); Chothia, J. Mol. Biol. 150, 1 (1976)]. Ergibt Alaninsubstitution keine adäquaten Mengen an Varianten, so kann eine isosterische Aminosäure verwendet werden.
  • C. Modifikationen von FGF-19
  • Kovalente Modifikationen von FGF-19 sind in den Schutzumfang dieser Erfindung eingebunden. Ein Typ von kovalenter Modifikation umfasst das Umsetzen gerichteter Aminosäurereste eines FGF-19-Polypeptids mit einem organischen derivatisierenden Mittel, das in der Lage ist, mit ausgewählten Seitenketten oder den N- oder C-terminalen Resten des FGF-19 zu reagieren. Derivatisierung mit bifunktionellen Mit teln ist nützlich, beispielsweise zum Vernetzen von FGF-19 mit einer wasserunlöslichen Trägermatrix oder -oberfläche zur Verwendung im Verfahren zur Reinigung von Anti-FGF-19-Antikörpern und umgekehrt. Üblicherweise verwendete Vernetzer umfassen z.B. 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, beispielsweise Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionelle Imidoester, einschließlich Disuccinimidylester, wie z.B. 3,3'-Dithiobis(succinimidylpropionat), bifunktionelle Maleinimide wie z.B. Bis-N-maleinimido-1,8-octan, und Mittel wie z.B. Methyl-3-[p-azidophenyl)dithio]propioimidat.
  • Andere Modifikationen umfassen Deamidierung von Glutaminyl- und Asparaginylresten zu den entsprechenden Glutamyl- bzw. Aspartylresten, Hydroxylierung von Prolin und Lysin, Phosphorylierung von Hydroxygruppen von Seryl- oder Threonylresten, Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidin-Seitenketten [T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 79–86 (1983)], Acetylierung des N-terminalen Amins und Amidierung jeder beliebigen C-terminalen Carboxygruppe.
  • Eine andere Art kovalenter Modifikation des FGF-19-Polypeptids, die in den Schutzumfang dieser Erfindung fällt, umfasst das Ändern des nativen Glykosylierungsmusters des Polypeptids. "Ändern des nativen Glykosylierungsmusters" bedeutet für die vorliegenden Zwecke die Deletion von einer oder mehreren Kohlenhydratgruppierungen, die in Nativsequenz-FGF-19 zu finden sind (entweder durch Entfernen der zugrundeliegenden Glykosylierungsstelle oder durch Deletion der Glykosylierung durch chemische und/oder enzymatische Mittel), und/oder das Addieren einer oder mehrerer Glykosylierungsstellen, die im Nativsequenz-FGF-19 nicht zu finden sind. Darüber hinaus bindet diese Bezeichnung auch qualitative Änderungen an der Glykosylierung der nativen Proteine ein, einschließlich einer Änderung der Beschaffenheit und der Anteile der verschiedenen vorhandenen Kohlenhydratgruppierungen.
  • Das Hinzufügen von Glykosylierungsstellen zum FGF-19-Polypeptid kann durch Ändern der Aminosäuresequenz erfolgen. Die Änderung kann beispielsweise durch die Addition von oder die Substitution durch einen oder mehrere Serin- oder Threonin reste zum oder am Nativsequenz-FGF-19 (für O-gebundene Glykosylierungsstellen) durchgeführt werden. Die FGF-19-Aminosäuresequenz kann gegebenenfalls durch Änderungen auf DNA-Niveau geändert werden, insbesondere durch Mutation der DNA, die für das FGF-19-Polypeptid kodiert, an präselektierten Basen, sodass Codons gebildet werden, die in die erwünschten Aminosäuren translatieren.
  • Ein anderes Mittel zur Steigerung der Anzahl an Kohlenhydratgruppierungen am FGF-19-Polypeptid ist chemisches oder enzymatisches Binden von Glykosiden an das Polypeptid. Solche Verfahren werden auf dem Gebiet der Erfindung, z.B. in der WO 87/05330, veröffentlicht am 11. September 1987, und in Aplin & Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., 259–306 (1981), beschrieben.
  • Das Entfernen von Kohlenhydratgruppierungen, die am FGF-19-Polypeptid vorhanden sind, kann chemisch oder enzymatisch oder durch Mutationssubstitutionen von Codons, die für Aminosäurereste kodieren, die als Targets für Glykosylierung dienen, durchgeführt werden. Chemische Deglykosylierungsverfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und werden beispielsweise von Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259, 52 (1987), und von Edge et al., Anal. Biochem. 118, 131 (1981), beschrieben. Enzymatische Spaltung von Kohlenhydratgruppierungen an Polypeptiden kann durch die Verwendung einer Vielzahl an Endo- und Exo-Glykosidasen erreicht werden, wie von Thotakura et al. in: Meth. Enzymol. 138, 350 (1987), beschrieben wird.
  • Eine andere Art von kovalenter Modifikation von FGF-19 umfasst das Binden des FGF-19-Polypeptids an eines einer Vielzahl nicht-proteinhältiger Polymere, z.B. Polyethylenglykol (PEG), Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylene, auf die Art und Weise, die in den US-Patenten Nr. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 oder 4.179.337 beschrieben wird.
  • Das FGF-19 der vorliegenden Erfindung kann auch auf eine Weise modifiziert werden, dass ein Hybridmolekül gebildet wird, das FGF-19, fusioniert an ein anderes heterologes Polypeptid oder eine andere heterologe Aminosäuresequenz, umfasst.
  • In einer Ausführungsform umfasst solch ein Hybridmolekül eine Fusion des FGF-19 mit einem Markierungspolypeptid, das ein Epitop bereitstellt, an das sich ein Anti-Markierungs-Antikörper selektiv binden kann. Die Epitopmarkierung wird im Allgemeinen an den Amino- oder Carboxyterminus des FGF-19 platziert. Die Gegenwart solcher Epitop-markierter Formen des FGF-19 kann unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Markierungs-Polypeptid nachgewiesen werden. Die Bereitstellung der Epitopmarkierung ermöglicht es somit auch, dass das FGF-19 leicht mittels Affinitätsreinigung unter Verwendung eines Anti-Markierungs-Antikörpers oder eines anderen Typs von Affinitätsmatrize, die sich an die Epitopmarkierung bindet, gereinigt werden kann. Verschiedene Markierungspolypeptide und ihre jeweiligen Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Beispiele umfassen Poly-Histidin- (poly-his-) oder Poly-Histidin-Glycin- (poly-his-gly-) Markierungen; das flu-NA-Markierungspolypeptid und seinen Antikörper 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol. 8, 2159-2165 (1988)]; die c-myc-Markierung und die Antikörper 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 und 9E10 hierzu [Evan et al., Molecular and Cellular Biology 5, 3610–3616 (1985)]; und die Herpes-Simplex-Virus-Glykoprotein-D- (-gD-) Markierung und ihren Antikörper [Paborsky et al., Protein Engineering 3(6), 547–553 (1990)]. Andere Markierungspolypeptide umfassen das Flag-Peptid [Hopp et al., BioTechnology 6, 1204–1210 (1988)]; das KT3-Epitoppeptid [Martin et al., Science 255, 192–194 (1992)]; ein α-Tubulinepitoppeptid [Skinner et al., J. Biol. Chem. 266, 15163–15166 (1991)]; und die T7-Gen-10-Proteinpeptidmarkierung [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6393–6397 (1990)].
  • In einer alternativen Ausführungsform kann das Hybridmolekül eine Fusion des FGF-19 mit einem Immunglobulin oder einer bestimmten Region eines Immunglobulins umfassen. Für eine zweiwertige Form des Hybridmoleküls (auch als ein "Immunoadhäsin" bezeichnet) könnte solch eine Fusion zur Fc-Region eines IgG-Moleküls gebildet sein. Die Ig-Fusionen umfassen vorzugsweise die Substitution einer löslichen Form (Transmembrandomäne deletiert oder inaktiviert) eines FGF-19-Polypeptids anstelle von zumindest einer variablen Region innerhalb eines Ig-Moleküls. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die Immunglobulinfusion die Gelenks-, CH2- und CH3- oder die Gelenks-, CH1-, CH2- und CH3-Regionen eines IgG1-Moleküls. Für weitere Information zur Herstellung von Immunglobulinfusionen siehe auch US-Patent Nr. 5.428.130, ausgegeben am 27. Juni 1995.
  • D. Herstellung von FGF-19
  • Die nachstehende Beschreibung betrifft vorrangig die Herstellung von FGF-19 durch Kultivieren von Zellen, die mit einem FGF-19-Nucleinsäure-hältigen Vektor transformiert oder transfiziert sind. Natürlich wird erwogen, dass alternative Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, zur Herstellung von FGF-19 verwendet werden können. Beispielsweise kann die FGF-19-Sequenz oder Teile davon durch direkte Peptidsynthese unter Verwendung von Festphasenverfahren hergestellt werden [siehe z.B. Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149–2154 (1963)]. In-vitro-Proteinsynthese kann unter Verwendung manueller oder automatisierter Verfahren durchgeführt werden. Automatisierte Synthese kann beispielsweise unter Verwendung eines Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers erfolgen. Verschiedene Teile des FGF-19 können separat chemisch synthetisiert und mittels chemischer oder enzymatischer Verfahren kombiniert werden, um das Volllängen-FGF-19 zu bilden.
  • 1. Isolation von für FGF-19 kodierender DNA
  • DNA, die für FGF-19 kodiert, kann aus einer cDNA-Bibliothek gewonnen werden, die aus Gewebe hergestellt wird, von dem angenommen wird, dass es die FGF-19-mRNA aufweist und diese auf einem nachweisbaren Niveau exprimiert. Demgemäß kann menschliche FGF-19-DNA leicht aus einer cDNA-Bibliothek gewonnen werden, die aus menschlichem Gewebe hergestellt wird, wie es auch in den Beispielen beschrieben ist. Das für FGF-19 kodierende Gen kann auch aus einer genomischen Bibliothek oder mittels bekannter synthetischer Verfahren (z.B. automatisierter Nucleinsäuresynthese) gewonnen werden.
  • Bibliotheken können mit Sonden (wie Antikörpern gegen das FGF-19 oder Oligonucleotide mit zumindest etwa 20–80 Basen) gescreent werden, deren Zweck es ist, das Gen von Interesse oder das durch dieses Gen kodierte Protein zu identifizieren. Screening der cDNA- oder der genomischen Bibliothek mit der ausgewählten Sonde kann unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt werden, die z.B. in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), beschrieben sind. Ein alternatives Mittel zum Isolieren des für FGF-19 kodierenden Gens ist die Verwendung der PCR-Methode [Sambrook et al., s.o.; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1995))].
  • Die nachstehenden Beispiele beschreiben Verfahren zum Screenen einer cDNA-Bibliothek. Die als Sonden ausgewählten Oligonucleotidsequenzen sollten eine ausreichende Länge aufweisen und ausreichend eindeutig sein, sodass falsche Positive minimiert werden. Das Oligonucleotid ist vorzugsweise so markiert, dass es durch Hybridisierung an DNA in der zu screenenden Bibliothek nachgewiesen werden kann. Markierungsverfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und umfassen die Verwendung von radioaktiven Markierungen wie z.B. von 32P-markiertem ATP, Biotinylierung oder Enzymmarkierung. Hybridisierungsbedingungen, einschließlich moderater Stringenz und hoher Stringenz, sind in Sambrook et al., s.o., beschrieben.
  • Sequenzen, die in solchen Bibliotheks-Screening-Verfahren identifiziert werden, können mit anderen bekannten Sequenzen, die in öffentlichen Datenbanken wie z.B. GenBank oder anderen privaten Sequenzdatenbanken hinterlegt und zugänglich sind, verglichen und abgeglichen werden. Sequenzidentität (entweder auf Niveau der Aminosäuren oder der Nucleotide) innerhalb definierter Regionen des Moleküls oder über die gesamte Volllängensequenz hinweg kann mittels auf dem Gebiet bekannter Verfahren und wie hierin beschrieben bestimmt werden.
  • Nucleinsäure mit Protein-kodierender Sequenz kann durch Screenen ausgewählter cDNA- oder genomischer Bibliotheken unter Verwendung der hierin zum ersten Mal offenbarten abgeleiteten Aminosäuresequenz und, sofern erforderlich, unter Verwendung herkömmlicher Primerextensionsverfahren wie in Sambrook et al., s.o., beschrieben, um Vorläufer und Verarbeitungs-Zwischenprodukte von mRNA zu detektieren, die eventuell nicht in cDNA revers-transkribiert worden sind, erhalten werden.
  • 2. Selektion und Transformation von Wirtszellen
  • Wirtszellen werden mit Expressions- oder Kloniervektoren, die hierin zur FGF-19-Produktion beschrieben werden, transfiziert oder transformiert und in herkömmlichem Nährmedium kultiviert, das zum Induzieren von Promotoren, zur Selektion von Transformanten oder Amplifikation der Gene, die für die erwünschten Sequenzen kodieren, geeignet modifiziert ist. Die Kulturbedingungen, wie z.B. Medium, Temperatur, pH und dergleichen, können von Fachleuten ohne übermäßiges Experimentieren ausgewählt werden. Im Allgemeinen können Prinzipien, Arbeitsvorschriften und praktische Techniken zur Maximierung der Produktivität von Zellkulturen in Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler (Hrsg.), IRL Press (1991), und in Sambrook et al., s.o., gefunden werden.
  • Verfahren zur eukaryotischen Zelltransfektion und prokaryotischen Zelltransformation sind durchschnittlichen Fachleuten bekannt, z.B. CaCl2-Verfahren, CaPO4-Verfahren, Liposom-vermitteltes Verfahren und Elektroporation. Je nach verwendeten Wirtszellen erfolgt die Transformation unter Verwendung von Standardverfahren, die für die entsprechenden Zellen geeignet sind. Die Calciumbehandlung mittels Calciumchlorid, wie in Sambrook et al., s.o., beschrieben, oder Elektroporation wird im Allgemeinen für Prokaryoten verwendet. Infektion mit Agrobacterium tumefaciens wird zur Transformation bestimmter Pflanzenzellen verwendet, wie Shaw et al., Gene 23, 315 (1983), und die WO 89/05859, veröffentlicht am 29. Juni 1989, beschreiben. Für Säugetierzellen ohne solche Zellwände kann das Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren von Graham & van der Eb, Virology 52, 456–457 (1978), verwendet werden. Allgemeine Aspekte von Säugetierzellen-Wirtssystemtransfektionen werden im US-Patent Nr. 4.399.216 beschrieben. Transformationen in Hefe werden typischerweise gemäß dem Verfahren von Van Solingen et al., J. Bact. 130, 946 (1977), und Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76, 3829 (1979), durchgeführt. Es können jedoch auch andere Verfahren zum Einführen von DNA in Zellen, wie beispielsweise Kernmikroinjektion, Elektroporation, bakterielle Protoplastenfusion mit intakten Zellen, oder Polykationen, z.B. Polybren, Polyornithin, verwendet werden. Für verschiedene Verfahren zur Transformation von Säugetierzellen siehe Keown et al., Methods in Enzymology 185, 527–537 (1990), und Mansour et al., Nature 336, 348–352 (1988).
  • Geeignete Wirtszellen zum Klonieren oder Exprimieren der DNA in die bzw. den Vektoren hierin schließen Prokaryoten-, Hefe-, oder höhere Eukaryotenzellen ein. Geeignete Prokaryoten umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Eubakterien, wie z.B. gram-negative oder gram-positive Organismen, beispielsweise Enterobacteriaceae wie z.B. E. coli. Verschiedene E.-coli-Stämme sind öffentlich erhältlich, wie z.B. E.-coli-K12-Stamm MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); E.-coli-Stamm W3110 (ATCC 27.325) und K5 772 (ATCC 53.635). Andere geeignete prokaryotische Wirtszellen umfassen Enterobacteriaceae wie Escherichia, z.B. E, coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, z.B. Salmonella typhimurium, Serratia, z.B. Serratia marcescans, und Shigella sowie Bacilli wie z.B. B. subtilis und B. licheniformis (z.B. B. licheniformis 41 P, offenbart in DD 266.710 , veröffentlicht am 12. April 1989), Pseudomonas, wie z.B. P. aeruginosa, und Streptomyces. Diese Beispiele stellen eine Veranschaulichung und keine Einschränkung dar. Stamm W3110 ist ein besonders bevorzugter Wirt oder Ausgangswirt, da er ein üblicher Wirtstamm für Fermentationen von Rekombinations-DNA-Produkten ist. Vorzugsweise sekretiert die Wirtszelle minimale Mengen an proteolytischen Enzymen. Beispielsweise kann Stamm W3110 modifiziert werden, um in den Genen, die für die zum Wirt endogenen Proteine kodieren, eine genetische Mutation zu bewirken, wobei Beispiele für solche Wirte E. coli-W3110-Stamm 1A2, der den vollständigen Genotyp tonA aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 9E4, der den vollständigen Genotyp tonA ptr3 aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 27C7 (ATCC 55.244), der den vollständigen Genotyp tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kanr aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 37D6, der den vollständigen Genotyp tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7ilvG kanr aufweist; E.-coli-W3110-Stamm 40B4, der Stamm 37D6 mit einer nicht Kanamycin-resistenten degP-Deletionsmutation ist; und ein E.-coli-Stamm mit mutierter periplasmatischer Protease, offenbart im US-Patent Nr. 4.946.783, ausgegeben am 7. August 1990, sind. Alternativ dazu sind In-vitro-Klonierverfahren, z.B. PCR oder andere Nucleinsäure-Polymerasereaktionen, geeignet.
  • Zusätzlich zu Prokaryoten sind eukaryotische Mikroben wie beispielsweise Fadenpilze oder Hefe geeignete Klonier- oder Expressionswirte für FGF-19-kodierende Vektoren. Saccharomyces cerevisiae ist ein üblicherweise verwendeter, nieder-eukaryotischer Wirtsmikroorganismus. Andere umfassen Schizosaccharomyces pombe (Beach & Nurse, Nature 290, 140 (1981); EP 139.383 , veröffentlicht am 2. Mai 1985); Kluyveromyces-Wirte (US-Patent Nr. 4.943.529; Fleer et al., Bio/Technology 9, 968–975 (1991)) wie z.B. K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol. 154(2), 737–742 (1983)), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al., Bio/Technology 8, 135 (1990)), K. thermotolerans und K. marxianus; yarrowia ( EP 402.226 ); Pichia pastoris ( EP 183.070 ; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28, 265–278 (1988)); Candida; Trichoderma reesia ( EP 244.234 ); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5259–5263 (1979)); Schwanniomyces wie z.B. Schwanniomyces occidentalis ( EP 394.538 , veröffentlicht am 31. Oktober 1990); und Fadenpilze wie z.B. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357, veröffentlicht am 10. Jänner 1991) und Aspergillus-Wirte wie z.B. A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 284–289 (1983); Tilburn et al., Gene 26, 205–221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1470–1474 (1984)) und A. niger (Kelly & Hynes, EMBO J. 4, 475–479 (1985)). Methylotrophe Hefen sind hierin geeignet und umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Hefe, die in der Lage ist, auf Methanol zu wachsen, ausgewählt aus den Gattungen von Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis und Rhodotorula. Eine Liste spezifischer Spezies, die für diese Klasse von Hefe beispielhaft sind, ist in C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982), zu finden.
  • Geeignete Wirtszellen für die Expression glykosylierter FGF-19 werden von multizellulären Organismen abgeleitet. Beispiele für Wirbellosenzellen umfassen Insektenzellen wie z.B. Drosophila S2 und Spodoptera Sf9 sowie Pflanzenzellen. Beispiele für nützliche Säugetierwirtszelllinien umfassen Chinahamster-Eierstock- (CHO-) und COS-Zellen. Spezifischere Beispiele umfassen Affennieren-CV1-Linie, transformiert durch SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); menschliche embryonale Nierenlinie (293 oder 293-Zellen, subkloniert zum Wachstum in Suspensionskultur, Graham et al., J. Gen Virol. 36, 59 (1977)); Chinahamster-Eierstockzellen/-DNFR (CHO, Urlaub & Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)); Maus-Sertolizellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243–251 (1980)); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); und Maus-Brusttumor (MMT 060562, ATCC CCL51). Es wird erachtet, dass die Auswahl der geeigneten Wirtszelle in den Bereich der Erfindung fällt.
  • 3. Auswahl und Verwendung eines replizierbaren Vektors
  • Die Nucleinsäure (z.B. cDNA oder genomische DNA), die für FGF-19 kodiert, kann zum Klonieren (Amplifikation der DNA) oder zur Expression in einen replizierbaren Vektor insertiert werden. Verschiedene Vektoren sind öffentlich erhältlich. Der Vektor kann beispielsweise in Form eines Plasmids, Cosmids, viralen Partikels oder Phagen vorliegen. Die geeignete Nucleinsäuresequenz kann in den Vektor mittels zahlreicher verschiedener Verfahren insertiert werden. Im Allgemeinen wird DNA in (eine) geeignete Restriktionsendonucleasestelle(n) mittels auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Verfahren insertiert. Vektorkomponenten umfassen im Allgemeinen, sind jedoch nicht beschränkt auf, eine oder mehrere Signalsequenzen, einen Replikationsursprung, ein oder mehrere Markergene, ein Enhancer-Element, einen Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz. Bei der Konstruktion geeigneter Vektoren, die eine oder mehrere dieser Komponenten enthalten, werden herkömmliche Ligationsverfahren eingesetzt, die Fachleuten bekannt sind.
  • Das FGF-19 kann rekombinant nicht nur direkt, sondern auch als ein Fusionspolypeptid mit einem heterologen Polypeptid hergestellt werden, das eine Signalsequenz oder ein anderes Polypeptid mit einer spezifischen Spaltungsstelle am N-Terminus des reifen Proteins oder Polypeptids sein kann. Im Allgemeinen kann die Signalsequenz eine Komponente des Vektors oder kann ein Teil der für FGF-19 kodierenden DNA sein, die in den Vektor insertiert wird. Die Signalsequenz kann eine prokaryotische Signalsequenz, ausgewählt beispielsweise aus der aus alkalischer Phosphatase, Penicillinase, Ipp oder wärmestabilen Enterotoxin-II-Leadern bestehenden Gruppe, sein. Zur Hefesekretion kann die Signalsequenz z.B. der Hefe-Invertasefeader, Alpha-Faktorleader (einschließlich Saccharomyces- und Kluyveromyces-α-Faktorleader, wobei Letzterer im US-Patent Nr. 5.010.182 beschrieben wird) oder saure Phosphataseleader, der C.-albicans-Glucoamylaseleader ( EP 362.179 , veröffentlicht am 4. April 1990) oder das in der WO 90/13646, veröffentlicht am 15. November 1990, beschriebene Signal sein. Zur Säugetierzellexpression können Säugetiersignalsequenzen verwendet werden, um Sekretion des Proteins zu steuern, wie beispielsweise Signalsequenzen aus sekretierten Polypeptiden derselben oder einer verwandten Spezies sowie virale Sekretionsleader.
  • Sowohl Expressions- als auch Kloniervektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz, die es ermöglicht, dass sich der Vektor in einer oder mehreren der sekretierten Wirtszellen repliziert. Solche Sequenzen sind für zahlreiche verschiedene Bakterien, Hefen und Viren bekannt. Der Replikationsursprung aus dem Plasmid pBR322 ist für die meisten gram-negativen Bakterien geeignet, der 2 μ-Plasmidursprung ist für Hefe geeignet, und verschiedene vitale Ursprünge (SV40, Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) sind für Kloniervektoren in Säugetierzellen nützlich.
  • Expressions- und Kloniervektoren enthalten typischerweise ein Selektionsgen, das auch als selektierbarer Marker bezeichnet wird. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine, die (a) Resistenz gegenüber Antibiotika oder anderen Toxinen, z.B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin, verleihen, (b) auxotrophe Mängel beheben oder (c) essenzielle Nährstoffe, die aus komplexem Medium nicht erhältlich sind, z.B. das für D-Alaninracemase für Bacilli kodierende Gen, zuführen.
  • Ein Beispiel für geeignete selektierbare Marker für Säugetierzellen sind jene, die die Identifikation von Zellen ermöglichen, die in der Lage sind, die für FGF-19 kodierende Nucleinsäure aufzunehmen, wie z.B. DHFR oder Thymidinkinase. Eine geeignete Wirtszelle ist, sofern Wildtyp-DHFR verwendet wird, die CHO-Zelllinie, der DHFR-Aktivität fehlt und die wie von Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980), beschrieben hergestellt und vermehrt wird. Ein geeignetes Selektionsgen zur Verwendung in Hefe ist das trp1-Gen, das im Hefeplasmid YRp7 vorhanden ist [Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); Tschemper et al., Gene 10, 157 (1980)]. Das trp1-Gen liefert einen Selektionsmarker für einen mutierten Hefestamm, dem die Fähigkeit fehlt, in Tryptophan zu wachsen, beispielsweise ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1 [Jones, Genetics 85, 12 (1977)].
  • Expressions- und Kloniervektoren enthalten üblicherweise einen Promotor, der operabel an die für FGF-19 kodierende Nucleinsäuresequenz gebunden ist, um mRNA-Synthese zu steuern. Promotoren, die durch zahlreiche verschiedene potenzielle Wirtszellen erkannt werden, sind bekannt. Promotoren, die zur Verwendung mit prokaryotischen Wirten geeignet sind, umfassen die β-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme [Chang et al., Nature 275, 615 (1978); Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)], alkalische Phosphatase, ein Tryptophan- (trp-) Promotorsystem [Goeddel, Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980); EP 36.776 ] und Hybridpromotoren wie z.B. den tac-Promotor (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21–25 (1983)]. Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen enthalten auch eine Shine-Dalgarno- (S. D.-) Sequenz, die operabel an die für FGF-19 kodierende DNA gebunden ist.
  • Beispiele für geeignete Promotorsequenzen zur Verwendung mit Hefewirten umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase [Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)] oder andere glykolytische Enzyme [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968); Holland, Biochemistry 17, 4900 (1978)] wie z.B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phasphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase.
  • Andere Hefepromotoren, die induzierbare Promotoren sind und den zusätzlichen Vorteil haben, dass ihre Transkription durch Wachstumsbedingungen gesteuert wird, sind die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, degradative Enzyme, die mit Stickstoffmetabolismus assoziiert sind, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase und Enzyme, die für Maltose- und Galactoseverwendung verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei Hefeexpression werden näher in EP 73.657 beschrieben.
  • FGF-19-Transkription aus Vektoren in Säugetier-Wirtszellen wird beispielsweise durch Promotoren gesteuert, die aus den Genomen von Viren wie z.B. Polyomavirus, Geflügelpockenvirus ( UK 2.211.504 , veröffentlicht am 5. Juli 1989), Adenovirus (wie z.B. Adenovirus 2), Rinderpapillomavirus, Vogel-Sarkomvirus, Zytomegalie-Virus, einem Retrovirus, Hepatitis-B-Virus und Affenvirus 40 (SV40), aus heterologen Säugetierpromotoren, z.B. dem Actinpromotor oder einem Immunglobulinpromotor, und aus Hitzeschock-Promotoren gewonnen werden, vorausgesetzt, solche Promotoren sind mit den Wirtszellsystemen kompatibel.
  • Transkription einer DNA, die für das FGF-19 kodiert, durch höhere Eukaryoten kann durch Insertieren einer Enhancersequenz in den Vektor gesteigert werden. Enhancer sind cis-wirkende Elemente von DNA, üblicherweise etwa mit 10 bis 300 bp, die auf einen Promotor so wirken, dass seine Transkription gesteigert wird. Zahlreiche Enhancersequenzen sind aus Säugetiergenen bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin). Typischerweise wird jedoch ein Enhancer aus einem eukaryotischen Zellvirus verwendet. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer an der späten Seite des Replikationsursprungs (bp 100–270), den frühen Zytomegalie-Virus-Promotorenhancer, den Polyoma-Enhancer an der späten Seite des Replikationsursprungs und Adenovirus-Enhancer. Der Enhancer kann in den Vektor an einer Position 5' oder 3' zur FGF-19-Kodiersequenz gespleißt werden, wird jedoch vorzugsweise an einer Stelle 5' vom Promotor angeordnet.
  • Expressionsvektoren, die in eukaryotischen Wirtszellen (Hefe-, Pilz-, Insekten-, Pflanzen-, Tier-, Mensch- oder kernhaltigen Zellen aus anderen multizellulären Organismen) verwendet werden, enthalten auch Sequenzen, die zum Abschluss von Transkription und zur Stabilisierung der mRNA erforderlich sind. Solche Sequenzen sind üblicherweise aus den untranslatierten 5'-, und gegebenenfalls 3'-, Regionen eukaryotischer oder viraler DNAs oder cDNAs erhältlich. Diese Regionen enthalten Nucleotidsegmente, die als polyadenylierte Fragmente im untranslatierten Abschnitt der für FGF-19 kodierenden mRNA transkribiert werden.
  • Weitere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die zur Adaption an die Synthese von FGF-19 in rekombinanter Wirbeltierzellkultur geeignet sind, werden in Gething et al., Nature 293, 620–625 (1981); Mantei et al., Nature 281, 40–46 (1979); EP 117.060 ; und EP 117.058 beschrieben.
  • 4. Detektion von Genamplifikation/expression
  • Genamplifikation und/oder -expression kann basierend auf den hierin bereitgestellten Sequenzen in einer Probe direkt gemessen werden, z.B. durch herkömmliches Southern-Blotting, Northern-Blotting zur Quantifizierung der Transkription von mRNA [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201–5205 (1980)], Dot-Blotting (DNA-Analyse) oder In-situ-Hybridisierung unter Verwendung einer geeigneten markierten Sonde. Alternativ dazu können Antikörper verwendet werden, die spezifische Duplices, einschließlich DNA-Duplices, RNA-Duplices und DNA-RNA-Hybridduplices oder DNA-Proteinduplices, erkennen. Die Antikörper wiederum können markiert sein, und der Test kann durchgeführt werden, wenn der Duplex an eine Oberfläche gebunden ist, sodass bei Bildung von Duplex an der Oberfläche die Gegenwart von Antikörper, der an den Duplex gebunden ist, nachgewiesen werden kann.
  • Genexpression kann alternativ dazu durch immunologische Verfahren, wie beispielsweise immunhistochemisches Färben von Zellen oder Gewebeschnitten und Tests von Zellkultur oder Körperflüssigkeiten, gemessen werden, um die Expression von Genprodukt direkt zu quantifizieren. Antikörper, die für immunhistochemisches Färben und/oder Testen von Probenflüssigkeiten nützlich sind, können entweder monoklonal oder polyklonal sein und können in jedem beliebigen Säugetier hergestellt werden. Auf einfache Weise können die Antikörper gegen ein Nativsequenz-FGF-19-Polypeptid oder gegen ein synthetisches Peptid, basierend auf den hierin bereitgestellten DNA-Sequenzen, oder gegen exogene Sequenz, fusioniert an FGF-19-DNA und für ein spezifisches Antikörperepitop kodierend, hergestellt werden.
  • 5. Reinigung von Polypeptid
  • Formen von FGF-19 können aus Kulturmedium oder aus Wirtszelllysaten gewonnen werden. Sofern membrangebunden, kann es unter Verwendung einer geeigneten Tensidlösung (z.B. Triton-X 100) oder durch enzymatische Spaltung aus der Membran freigesetzt werden. Zellen, die zur Expression von FGF-19 verwendet werden, können mittels verschiedener physikalischer oder chemischer Mittel, wie z.B. Gefrier-Auftau-Zyklieren, Beschallung, mechanischer Aufbruch oder Zelllysemittel, aufgeschlossen werden.
  • Es kann erwünscht sein, FGF-19 aus rekombinanten Zellproteinen oder Polypeptiden zu reinigen. Die folgenden Verfahren sind Beispiele für geeignete Reinigungsverfahren: Fraktionierung an einer Ionenaustauschsäule; Ethanolfällung; Umkehrphasen-HPLC; Chromatographie an Siliciumdioxid oder an einem Kationenaustauschharz wie z.B. DEAE; Chromatofokussierung; SDS-PAGE; Ammoniumsulfatfällung; Gelfiltration unter Verwendung von beispielsweise Sephadex G-75; Protein-A-Sepharose-Säulen zur Entfernung von Verunreinigungen wie IgG; und Metallchelator-Säulen zur Bindung von Epitop-markierten Formen des FGF-19. Verschiedene Verfahren von Proteinreinigung können verwendet werden, und solche Verfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und beispielsweise in Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982), beschrieben. Der/Die ausgewählte(n) Reinigungsschritt(e) hängen beispielsweise von der Beschaffenheit des verwendeten Herstellungsverfahrens und dem bestimmten hergestellten FGF-19 ab.
  • E. Verwendung von FGF-19
  • Nucleotidsequenzen (oder ihr Komplement), die für FGF-19 kodieren, haben verschiedene Anwendungsbereiche auf dem Gebiet der Molekularbiologie, einschließlich Verwendungen als Hybridisierungssonden, beim Chromosom- und Genkartieren und bei der Bildung von Antisense-RNA und -DNA. FGF-19-Nucleinsäure ist auch zur Herstellung von FGF-19-Polypeptiden durch die hierin beschriebenen Rekombinationsverfahren nützlich.
  • Das Volllängen-Nativsequenz-FGF-19-Gen (Seq.-ID Nr. 1) oder Teile davon können als Hybridisierungssonden für eine cDNA-Bibliothek zur Isolierung der Volllängen-FGF-19-cDNA oder zur Isolierung wiederum anderer cDNAs (beispielsweise jener, die für natürlich vorkommende Varianten von FGF-19 oder für FGF-19 aus anderen Spezies kodieren), die eine erwünschte Sequenzidentität zur in 1 offenbarten FGF-19-Sequenz (Seq.-ID Nr. 1) aufweisen, verwendet werden. Gegebenenfalls beträgt die Länge der Sonden etwa 20 bis etwa 50 Basen. Die Hybridisierungssonden können von zumindest teilweise neuen Regionen der Nucleotidsequenz aus Seq.-ID Nr. 1 abgeleitet sein, worin jene Regionen ohne übermäßiges Experimentieren bestimmt werden können, oder von genomischen Sequenzen einschließlich Promotoren, Enhancerelementen und Intronen von Nativsequenz-FGF-19. Ein Screening-Verfahren umfasst beispielsweise das Isolieren der Kodierregion des FGF-19-Gens unter Verwendung der bekannten DNA-Sequenz, um eine selektierte Sonde von etwa 40 Basen zu synthetisieren. Hybridisierungssonden können durch zahlreiche verschiedene Markierungen markiert werden, einschließlich Radionucleotide wie z.B. 32P oder 35S oder enzymatische Markierungen wie z.B. alkalische Phosphatase, gebunden an die Sonde über Avidin/Biotin-Bindungssysteme. Markierte Sonden mit einer Sequenz, die zu jener des FGF-19-Gens der vorliegenden Erfindung komplementär ist, können zum Screenen von Bibliotheken menschlicher cDNA, genomischer DNA oder mRNA verwendet werden, um zu bestimmen, an welche Mitglieder solcher Bibliotheken die Sonde hybridisiert. Hybridisierungsverfahren sind in den nachstehenden Beispielen näher beschrieben.
  • Jede beliebige EST-Sequenz, die in der vorliegenden Anmeldung offenbart ist, kann in ähnlicher Weise unter Einsatz der hierin offenbarten Verfahren als Sonde verwendet werden.
  • Andere nützliche Fragmente der FGF-19-Nucleinsäuren sind Antisense- oder Sense-Oligonucleotide, umfassend eine einzelsträngige Nucleinsäuresequenz (entweder RNA oder DNA), die in der Lage sind, an Target-FGF-19-mRNA- (Sense) oder -FGF-19-DNA- (Antisense) Sequenzen zu binden. Antisense- oder Sense-Oligonucleotide gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen ein Fragment der Kodierregion von FGF-19-DNA. Solch ein Fragment umfasst im Allgemeinen zumindest etwa 14 Nucleotide, vorzugsweise von etwa 14 bis 30 Nucleotide. Die Fähigkeit, ein Antisense- oder ein Sense-Oligonucleotid auf Grundlage einer cDNA-Sequenz, die für ein bestimmtes Protein kodiert, abzuleiten, wird beispielsweise in Stein & Cohen (Cancer Res. 48, 2659 (1988)) und in van der Krol et al. (BioTechniques 6, 958 (1988)) beschrieben.
  • Bindung von Antisense- oder Sense-Oligonucleotiden an Target-Nucleinsäuresequenzen führt zur Bildung von Duplices, die Transkription oder Translation der Targetsequenz durch ein oder mehrere Mittel blockieren, einschließlich gesteigerten Abbaus der Duplices, frühzeitiger Termination von Transkription oder Translation, oder durch andere Mittel. Somit können die Antisense-Oligonucleotide verwendet werden, um Expression von FGF-19-Proteinen zu blockieren. Antisense- oder Sense-Oligonucleotide umfassen weiters Oligonucleotide mit modifizierten Zucker-Phosphodiester-Hauptketten (oder mit anderen Zuckerbindungen, wie jene, die in der WO 91/06629 beschrieben sind), worin solche Zuckerbindungen gegenüber endogenen Nucleasen resistent sind. Solche Oligonucleotide mit resistenten Zuckerbindungen sind in vivo stabil (d.h. sind in der Lage, gegen enzymatischen Abbau resistent zu sein), behalten jedoch Sequenzspezifität bei, um in der Lage zu sein, Target-Nucleotidsequenzen zu binden.
  • Andere Beispiele für Sense- oder Antisense-Oligonucleotide umfassen jene Oligonucleotide, die kovalent an organische Gruppierungen, wie jene, die in der WO 90/10048 beschrieben sind, und andere Gruppierungen, die Affinität des Oligonucleotids gegenüber einer Target-Nucleinsäuresequenz steigern, wie z.B. Poly-(L-Lysin), gebunden sind. Darüber hinaus können interkalierende Agenzien, wie z.B. Ellipticin, und alkylierende Mittel oder Metallkomplexe an Sense- oder Antisense-Oligonucleotide gebunden werden, um Bindungsspezifitäten des Antisense- oder Sense-Oligonucleotids für die Target-Nucleotidsequenz zu modifizieren.
  • Antisense- oder Sense-Oligonucleotide können mittels jedes beliebigen Gentransferverfahrens in eine Zelle eingeführt werden, die die Target-Nucleinsäuresequenz enthält, einschließlich beispielsweise CaPO4-vermittelte DNA-Transfektion, Elektroporation oder unter Verwendung von Gentransfervektoren wie z.B. Epstein-Barr-Virus. In einem bevorzugten Verfahren wird ein Antisense- oder Sense-Oligonucleotid in einen geeigneten retroviralen Vektor insertiert. Eine Zelle, die die Target-Nucleinsäuresequenz enthält, wird entweder in vivo oder ex vivo mit dem rekombinanten retroviralen Vektor kontaktiert. Geeignete retrovirale Vektoren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, jene, die aus dem Maus-Retrovirus M-MuLV, aus N2 (ein Retrovirus, das aus M-MuLV abgeleitet ist) oder aus den Doppelkopievektoren, die als DCT5A, DCT5B und DCT5C bezeichnet sind (siehe die WO 90/13641), abgeleitet sind.
  • Sense- oder Antisense-Oligonucleotide können auch in eine Zelle, die die Target-Nucleotidsequenz enthält, durch Bildung eines Konjugats mit einem Ligandenbindungsmolekül wie in der WO 91/04753 beschrieben eingeführt werden. Geeignete Ligandenbindungsmoleküle umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Zelloberflächenrezeptoren, Wachstumsfaktoren, andere Cytokine oder andere Liganden, die sich an Zelloberflächenrezeptoren binden. Vorzugsweise stört die Konjugation des Ligandenbindungsmoleküls die Fähigkeit des Ligandenbindungsmoleküls, sich an sein entsprechendes Molekül oder seinen entsprechenden Rezeptor zu binden oder den Eintritt von Sense- oder Antisense-Oligonucleotid oder seiner konjugierten Version in die Zelle zu blockieren, nicht wesentlich.
  • Alternativ dazu kann ein Sense- oder ein Antisense-Oligonucleotid in eine Zelle, die die Target-Nucleinsäuresequenz enthält, durch Bildung eines Oligonucleotid-Lipid- Komplexes wie in der WO 90/10448 beschrieben eingeführt werden. Der Sense- oder Antisense-Oligonucleotid-Lipid-Komplex wird vorzugsweise innerhalb der Zelle durch eine endogene Lipase dissoziiert.
  • Die Sonden können auch in PCR-Verfahren verwendet werden, um einen Pool an Sequenzen zur Identifikation von nah verwandten FGF-19-Kodiersequenzen zu bilden.
  • Nucleotidsequenzen, die für ein FGF-19 kodieren, können auch verwendet werden, um Hybridisierungssonden zum Kartieren des Gens, das für das FGF-19 kodiert, und zur genetischen Analyse von Personen mit genetischen Erkrankungen zu konstruieren. Die hierin bereitgestellten Nucleotidsequenzen können unter Verwendung bekannter Verfahren, wie z.B. In-situ-Hybridisierung, Bindungsanalyse gegen bekannte chromosomale Marker und Hybridisierungs-Screenen mit Bibliotheken, zu einem Chromosom und spezifischen Regionen eines Chromosoms kartiert werden.
  • Kodieren die Kodiersequenzen für FGF-19 für ein Protein, das sich an ein anderes Protein bindet (beispielsweise, wenn das FGF-19 ein Rezeptor ist), so kann das FGF-19 in Tests zur Identifikation der anderen Proteine oder Moleküle verwendet werden, die in die Bindungswechselwirkung involviert sind. Mittels solcher Verfahren können Inhibitoren der Rezeptor/Liganden-Bindungswechselwirkung identifiziert werden. Proteine, die in solche Bindungswechselwirkungen eingebunden sind, können auch verwendet werden, um auf Peptid oder niedermolekulare Inhibitoren oder Agonisten der Bindungswechselwirkung zu screenen. Das Rezeptor-FGF-19 kann auch verwendet werden, um korrelative(n) Liganden zu isolieren. Screening-Tests können entworfen werden, um Leitverbindungen zu finden, die die biologische Aktivität eines nativen FGF-19 oder eines Rezeptors für FGF-19 nachahmen. Solche Screening-Tests umfassen Tests, die zu High-Throughput-Screening von chemischen Bibliotheken zugänglich sind, was sie besonders geeignet zur Identifikation von niedermolekularen Wirkstoffkandidaten macht. In Betracht gezogene kleine Moleküle schließen synthetische organische oder anorganische Verbindungen ein. Die Tests können in zahlreichen verschiedenen Formaten durchgeführt werden, einschließlich Protein- Protein-Bindungstests, biochemischer Screening-Tests, Immuntests und zellbasierter Tests, die auf dem Gebiet der Erfindung gut beschrieben sind.
  • Nucleinsäuren, die für FGF-19 oder seine modifizierten Formen kodieren, können auch verwendet werden, um entweder transgene Tiere oder "Knock-out"-Tiere zu bilden, die wiederum nützlich für die Entwicklung und das Screenen von therapeutisch nützlichen Reagenzien sind. Ein transgenes Tier (z.B. eine Maus oder eine Ratte) ist ein Tier, das Zellen aufweist, die ein Transgen enthalten, wobei dieses Transgen in das Tier oder in einen Vorfahren des Tiers in einem pränatalen, z.B. einem embryonalen, Stadium eingeführt wurde. Ein Transgen ist eine DNA, die in das Genom einer Zelle integriert ist, aus der sich ein transgenes Tier entwickelt. In einer Ausführungsform kann cDNA, die für FGF-19 kodiert, verwendet werden, um genomische DNA, die für FGF-19 kodiert, gemäß bekannten Verfahren und die zur Bildung von transgenen Tieren verwendeten genomischen Sequenzen zu klonieren, wobei diese Tiere Zellen enthalten, welche DNA, die für FGF-19 kodiert, exprimieren. Verfahren zur Bildung von transgenen Tieren, insbesondere von Tieren wie Mäusen oder Ratten, sind auf dem Gebiet der Erfindung bereits Routine und werden beispielsweise in den US-Patenten Nr. 4.736.866 und 4.870.009 beschrieben. Typischerweise würden bestimmte Zellen zur FGF-19-Transgen-Inkorporation mit gewebespezifischen Enhancern als Target dienen. Transgene Tiere, die eine Kopie eines für FGF-19 kodierenden Transgens enthalten, das in die Keimlinie des Tieres in einem embryonalen Stadium eingeführt wurde, können verwendet werden, um die Wirkung von gesteigerter Expression von für FGF-19 kodierender DNA zu untersuchen. Solche Tiere können als Testtiere für Reagenzien verwendet werden, von denen angenommen wird, dass sie Schutz vor beispielsweise pathologischen Leiden, die mit seiner Überexpression assoziiert sind, verleihen. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung wird ein Tier mit dem Reagens behandelt, und eine reduzierte Häufigkeit des pathologischen Leidens im Vergleich zu nicht behandelten Tieren, die das Transgen in sich tragen, würde auf eine mögliche therapeutische Wirkung bezüglich des pathologischen Leidens hinweisen.
  • Alternativ dazu können nicht-menschliche Homologe von FGF-19 verwendet werden, um ein FGF-19-"Knock-out"-Tier zu konstruieren, das ein defektes oder verändertes, für FGF-19 kodierendes Gen als ein Resultat homologer Rekombination zwischen dem endogenen, für FGF-19 kodierenden Gen und geänderter genomischer, für FGF-19 kodierender genomischer DNA, eingeführt in einen embryonalen Stammzelle des Tiers, aufweist. Beispielsweise kann für FGF-19 kodierende cDNA verwendet werden, um für FGF-19 kodierende genomische DNA gemäß den bekannten Verfahren zu klonieren. Ein Abschnitt der genomischen, für FGF-19 kodierenden DNA kann deletiert oder durch ein anderes Gen ersetzt werden, wie beispielsweise durch ein Gen, das für einen selektierbaren Marker kodiert, der verwendet werden kann, um Integration zu überwachen. Typischerweise werden mehrere kb unveränderter flankierender DNA (sowohl an den 5'- als auch 3'-Enden) in den Vektor eingebunden [siehe z.B. Thomas & Capecchi, Cell 51, 503 (1987), für eine Beschreibung homologer Rekombinationsvektoren]. Der Vektor wird in eine embryonale Stammzellenlinie (z.B. durch Elektroporation) eingeführt, und Zellen, in denen sich die eingeführte DNA mit der endogenen DNA homolog rekombiniert hat, werden ausgewählt [siehe z.B. Li et al., Cell 69, 915 (1992)]. Die ausgewählten Zellen werden dann in eine Blastozyste eines Tiers (z.B. einer Maus oder Ratte) injiziert, um Aggregationschimären zu bilden [siehe z.B. Bradley in: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson (Hrsg.) (IRL, Oxford, 1987), 113–152]. Ein Hybridembryo kann dann in ein geeignetes, scheinschwangeres weibliches Ammentier implantiert und ausgetragen werden, um ein "Knock-out"-Tier zu schaffen. Nachkommenschaft, die die homolog rekombinierte DNA in ihren Keimzellen trägt, kann mittels Standardverfahren identifiziert werden und kann verwendet werden, um Tiere zu züchten, in denen alle Zellen des Tiers die homolog rekombinierte DNA enthalten. Knockout-Tiere können beispielsweise aufgrund ihrer Fähigkeit, Abwehr gegen bestimmte pathologische Leiden aufzubauen, sowie aufgrund ihrer Entwicklung pathologischer Leiden wegen des fehlenden FGF-19-Polypeptids charakterisiert werden.
  • Nucleinsäure, die für die FGF-19-Polypeptide kodiert, kann auch zur Verwendung bei Gentherapie geeignet sein. Bei Gentherapieanwendungen werden Gene in Zellen eingeführt, um In-vivo-Synthese eines therapeutisch wirksamen genetischen Pro dukts, beispielsweise zum Ersatz eines defekten Gens, zu erreichen. "Gentherapie" schließt sowohl herkömmliche Gentherapie ein, in der eine langanhaltende Wirkung durch eine einzelne Behandlung erreicht wird, als auch die Verabreichung von gentherapeutischen Mitteln, die einmalige oder wiederholte Verabreichung einer therapeutisch wirksamen DNA oder mRNA umfasst. Antisense-RNAs und -DNAs können als therapeutische Agenzien zum Blockieren der Expression bestimmter Gene in vivo verwendet werden. Es konnte bereits gezeigt werden, dass kurze Antisense-Oligonucleotide in Zellen eingeführt werden können, wo sie trotz geringer intrazellulärer Konzentrationen, die durch ihre eingeschränkte Aufnahme durch die Zellmembran verursacht wird, als Inhibitoren wirken (Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4143–4146 (1986)). Die Oligonucleotide können modifiziert werden, um ihre Aufnahme zu steigern, z.B. durch Substituieren ihrer negativ geladenen Phosphodiestergruppen durch ungeladene Gruppen.
  • Es gibt zahlreiche verschiedene Verfahren, die zum Einführen von Nucleinsäuren in lebensfähige Zellen verfügbar sind. Die Verfahren variieren je nachdem, ob die Nucleinsäure in vitro in kultivierte Zellen oder in vivo in die Zellen des beabsichtigten Wirts transferiert werden. Verfahren, die für den Transfer von Nucleinsäure in Säugetierzellen in vitro geeignet sind, umfassen die Verwendung von Liposomen, Elektroporation, Mikroinjektion, Zellfusion, DEAE-Dextran, das Calciumphosphat-Fällungsverfahren usw. Die zur Zeit bevorzugten In-vivo-Gentransferverfahren umfassen Transfektion über virale (typischerweise retrovirale) Vektoren und virale Hüllprotein-Liposomen-vermittelte Transfektion (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205–210 (1993)). In manchen Situationen ist es wünschenswert, die Nucleinsäurequelle mit einem Mittel bereitzustellen, das auf die Targetzellen gerichtet ist, wie beispielsweise mit einem Antikörper, der für ein Zelloberflächenmembranprotein oder für die Targetzelle spezifisch ist, mit einem Liganden für einen Rezeptor auf der Targetzelle usw. Werden Liposomen verwendet, so können Proteine, die sich an ein mit Endozytose assoziiertes Zelloberflächenmembranprotein binden, zum Targeting und/oder zur Erleichterung der Aufnahme verwendet werden, z.B. Capsidproteine oder Fragmente davon, die für einen bestimmten Zelltyp tropisch sind, Antikörper für Proteine, die beim Zyklieren Internalisierung erfahren, oder Proteine, die auf intrazelluläre Lo kalisierung gerichtet sind und intrazelluläre Halbwertszeit verlängern. Das Verfahren zu Rezeptor-vermittelter Endozytose wird beispielsweise von Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429–4432 (1987); und von Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410–3414 (1990), beschrieben. Ein Überblick zu Genmarkierungs- und Gentherapie-Arbeitsvorschriften wird in Anderson et al., Science 256, 808–813 (1992), geliefert.
  • Die hierin beschriebenen FGF-19-Polypeptide können auch als Molekulargewichtsmarker im Rahmen von Elektrophorese eingesetzt werden.
  • Die hierin beschriebenen, für die FGF-19-Polypeptide kodierenden Nucleinsäuremoleküle oder Fragmente davon sind zur Chromosomenidentifikation nützlich. In dieser Hinsicht besteht ein permanenter Bedarf daran, neue Chromosomenmarker zu identifizieren, da, basierend auf aktuellen Sequenzdaten, relativ wenig Chromosommarkierungs-Reagenzien bis heute erhältlich sind. Jedes FGF-19-Nucleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung kann als ein Chromosomenmarker verwendet werden.
  • Die FGF-19-Polypeptide und Nucleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung können auch zur Gewebetypisierung verwendet werden, worin die FGF-19-Polypeptide der vorliegenden Erfindung in einem Gewebe differenziell im Vergleich zu einem anderen exprimiert werden können. FGF-19-Nucleinsäuremoleküle finden Verwendung bei der Herstellung von Sonden für PCR, Northern-Analyse, Southern-Analyse und Western-Analyse.
  • Die hierin beschriebenen FGF-19-Polypeptide und Modulatoren davon können auch als therapeutische Mittel verwendet werden. Die FGF-19-Polypeptide und Modulatoren davon der vorliegenden Erfindung können gemäß bekannten Verfahren zur Herstellung pharmazeutisch nützlicher Zusammensetzungen formuliert werden, wobei das FGF-19-Produkt hiervon in einer Beimischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägervehikel kombiniert wird. Therapeutische Formulierungen werden zur Lagerung durch Vermischen des aktiven Bestandteils mit dem erwünschten Reinheitsgrad mit optionalen physiologisch annehmbaren Trägern, Exzipienten oder Stabilisatoren (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflage, A. Osol (Hrsg.) (1980)) in Form von lyophilisierten Formulierungen oder wässrigen Lösungen hergestellt. Annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren sind für Rezipienten bei den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch und umfassen Puffer wie z.B. Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidanzien einschließlich Ascorbinsäure; niedermolekulare Polypeptide (mit weniger als etwa 10 Resten); Proteine wie z.B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere wie z.B. Polyvinylpyrrolidon, Aminosäuren wie z.B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner wie EDTA; Zuckeralkohole wie z.B. Mannit oder Sorbit; salzbildende Gegenionen wie beispielsweise Natrium; und/oder nichtionische Tenside wie TWEENTM, PLURONICSTM oder PEG.
  • Die zur In-vivo-Verabreichung zu verwendenden Formulierungen müssen steril sein. Dies wird leicht mittels Filtration durch sterile Filtrationsmembranen vor oder nach Gefriertrocknung und Wiederherstellung erreicht.
  • Therapeutische Zusammensetzungen hierin werden im Allgemeinen in einen Behälter mit einer sterilen Zugangsöffnung, beispielsweise in einen intravenösen Lösungsbeutel oder eine Phiole mit einem Septum, das mit einer subkutanen Injektionsnadel durchstochen werden kann, gegeben.
  • Die Art der Verabreichung entspricht bekannten Verfahren, z.B. Injektion oder Infusion auf intravenösem, intraperitonealem, intrazerebralem, intramuskulärem, intraokularem, intraarteriellem oder intraläsionalem Weg, topische Verabreichung oder mittels eines Retardsystems.
  • Dosierungen und erwünschte Wirkstoffkonzentrationen pharmazeutischer Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können je nach bestimmter beabsichtigter Verwendung variieren. Die Festlegung der geeigneten Dosierung oder Art der Verabreichung fällt in den Wissensbereich eines gewöhnlichen Arztes. Tierexperimente liefern verlässliche Bezugswerte für die Bestimmung wirksamer Dosen zur Behandlung von Menschen. Die Umrechnung von wirksamen Dosen zwischen verschiedenen Spezies kann gemäß den Prinzipien, die von J. Mordenti und W. Chappell, "The use of interspecies scaling in toxicokinetics", in: Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al. (Hrsg.), Pergamon Press, New York, 42–96 (1989), festgelegt wurden, erfolgen.
  • Wird In-vivo-Verabreichung eines FGF-19-Polypeptids oder eines Agonisten oder Antagonisten davon verwendet, so können normale Dosierungsmengen von etwa 10 ng/kg bis zu 100 mg/kg Säugetierkörpergewicht oder mehr pro Tag, vorzugsweise von etwa 1 μg/kg/Tag bis zu 10 mg/kg/Tag, je nach Art der Verabreichung variieren. Leitfäden zu den bestimmten Dosierungen und Verabreichungsverfahren werden in der Literatur bereitgestellt; siehe z.B. die US-Patente Nr. 4.657.760; 5.206.344 oder 5.225.212. Es wird vorausgesetzt, dass verschiedene Formulierungen für verschiedene Behandlungsverbindungen und verschiedene Erkrankungen wirksam sind, dass die Verabreichung, die beispielsweise für ein Organ oder Gewebe bestimmt ist, eine andere Art der Verabreichung erforderlich machen kann als die Verabreichung an ein anderes Organ oder Gewebe.
  • Ist Retard-Verabreichung eines FGF-19-Polypeptids oder -Modulators in einer Formulierung mit Freisetzungseigenschaften erwünscht, die zur Behandlung jeder beliebigen Erkrankung oder jedes beliebigen Leidens geeignet sind, die oder das Verabreichung des FGF-19-Polypeptids oder -Modulators erfordert, so wird Mikroeinkapselung erwogen. Mikroeinkapselung von rekombinanten Proteinen für verzögerte Freisetzung wurde mit menschlichem Wachstumshormon (rhGH), Interferon- (rhIFN-), Interleukin-2 und MN rgp120 bereits erfolgreich durchgeführt. Johnson et al., Nat. Med. 2, 795–799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther. 27, 1221–1223 (1993); Hora et al., Bio/Technology 8, 755–758 (1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems", in: Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell & Newman (Hrsg.), Plenum Press: New York, 439–462 (1995); WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; und das US-Patent Nr. 5.654.010.
  • Die Retard-Formulierungen dieser Proteine wurden unter Verwendung von Poly-Milch-Coglykolsäure- (PLGA-) Polymer aufgrund seiner Biokompatibilität und seinen umfassenden biologisch abbaubaren Eigenschaften entwickelt. Die Abbauprodukte von PLGA, Milch- und Glykolsäure, können im menschlichen Körper rasch entsorgt werden. Darüber hinaus kann die Abbaubarkeit dieses Polymers je nach seinem Molekulargewicht und seiner Zusammensetzung von Monaten bis hin zu Jahren eingestellt werden. Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer", in: M. Chasin & R. Langer (Hrsg.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems, Marcel Oekker, New York, 1–41 (1990).
  • Die hierin bereitgestellten, FGF-19 umfassenden therapeutischen Mittel und Zusammensetzungen können in zahlreichen Anwendungen verwendet werden. Die Anwendungen umfassen das Behandeln einer Person, die an Adipositas oder einem mit Adipositas assoziierten Leiden erkrankt ist. In einem Aspekt wird FGF-19 einer Person, die dieser Behandlung bedarf, in einer zur Behandlung des Leidens wirksamen Menge verabreicht. Vorzugsweise ist das Leiden eines, das der Erzielung zumindest eines der folgenden Aspekte bedarf: eine Steigerung des Stoffwechsels, eine Reduktion des Körpergewichts, eine Reduktion des Körperfetts, eine Verringerung von Triglyceriden, eine Verringerung von freien Fettsäuren, eine Steigerung der Glucose-Freisetzung aus Fettzellen und/oder eine Steigerung der Leptin-Freisetzung aus Fettzellen. Jeder dieser Parameter kann mittels Standardverfahren gemessen werden, beispielsweise durch Messen des Sauerstoffverbrauchs, um die Stoffwechselrate zu bestimmen, unter Verwendung von Einstufungstabellen, um das Gewicht zu bestimmen, und durch Messen der Größe, um den Fettanteil zu bestimmen. Darüber hinaus kann die Gegenwart und Menge von Triglyceriden, freien Fettsäuren, Glucose und Leptin mittels Standardverfahren bestimmt werden. Jeder dieser Parameter wird nachstehend in den spezifischen Beispielen erläutert.
  • FGF-19 und Zusammensetzungen, die FGF-19 umfassen, sind vorzugsweise zur Verwendung in vivo bestimmt. Die Verabreichung kann jedoch auch, wie nachstehend erläutert, in vitro stattfinden, wie beispielsweise in den Verfahren, die nachstehend für das Screenen auf Modulatoren von FGF-19 beschrieben werden. Es gilt je doch zu bedenken, dass Modulatoren von FGF-19 auch durch die Verwendung von Tiermodellen und Proben aus Patienten identifiziert werden können.
  • Diese Erfindung umfasst Verfahren zum Screenen von Verbindungen, um jene zu identifizieren, die das FGF-19-Polypeptid nachahmen oder unterstützen (Agonisten) oder die Wirkung des FGF-19-Polypeptids unterbinden oder hemmen (Antagonisten). Agonisten und Antagonisten werden hierin als Modulatoren bezeichnet. Screeningtests für Antagonisten-Wirkstoffkandidaten werden entworfen, um Verbindungen zu identifizieren, die sich an die FGF-19-Polypeptide binden oder mit ihnen Komplexe bilden, für die die hierin identifizierten Gene kodieren, oder die sonst die Wechselwirkung der kodierten Polypeptide mit anderen zellulären Proteinen stören. Solche Screeningtests umfassen Tests, die für High-Throughput-Screenen von chemischen Bibliotheken zugänglich sind, wodurch sie sich besonders gut zur Identifikation niedermolekularer Wirkstoffkandidaten eignen.
  • Die Tests können in zahlreichen verschiedenen Formaten durchgeführt werden, einschließlich Protein-Protein-Bindungstests, biochemischer Screeningtests, Immuntests und zellbasierter Tests, die auf dem Gebiet der Erfindung eingehend beschrieben sind.
  • Alle Tests für Antagonisten gleichen sich darin, dass sie das Kontaktieren des Wirkstoffkandidaten mit einem FGF-19-Polypeptid, für das eine hierin identifizierte Nucleinsäure kodiert, unter Bedingungen und eine ausreichende Zeit lang erfordert, um diese zwei Komponenten in Wechselwirkung zu setzen.
  • Bei Bindungstests manifestiert sich die Wechselwirkung in Form einer Bindung, und der gebildete Komplex kann im Reaktionsgemisch isoliert oder nachgewiesen werden. In einer bestimmten Ausführungsform wird das durch das hierin identifizierte Gen kodierte FGF-19-Polypeptid oder der Wirkstoffkandidat an einer festen Phase, z.B. einer Mikrotiterplatte, durch kovalente oder nicht-kovalente Bindungen immobilisiert. Nicht-kovalente Bindung erfolgt im Allgemeinen durch Beschichten der festen Oberfläche mit einer Lösung des FGF-19-Polypeptids und Trocknen. Alternativ dazu kann ein immobilisierten Antikörper, z.B. ein monoklonaler Antikörper, der für das zu immobilisierende FGF-19-Polypeptid spezifisch ist, verwendet werden, um es an einer festen Oberfläche zu verankern. Der Test wird durch Zusetzen der nicht-immobilisierten Komponente, die mit einer nachweisbaren Markierung markiert werden kann, zur immobilisierten Komponente, z.B. der beschichteten Oberfläche, die die verankerte Komponente aufweist, durchgeführt. Sobald die Reaktion abgeschlossen ist, werden die nicht umgesetzten Komponenten z.B. durch Waschen entfernt, und die an der festen Oberfläche verankerten Komplexe werden nachgewiesen. Trägt die ursprünglich nicht-immobilisierte Komponente eine nachweisbare Markierung, so weist die Detektion von an der Oberfläche immobilisierter Markierung darauf hin, dass Komplexbildung stattgefunden hatte. Trägt die ursprünglich nicht-immobilisierte Komponente keine Markierung, kann Komplexbildung beispielsweise durch Verwendung eines markierten Antikörpers, der den immobilisierten Komplex spezifisch bindet, nachgewiesen werden.
  • Zeigt die Kandidatenverbindung mit einem bestimmten FGF-19-Polypeptid, für das das hierin identifizierte Gen kodiert, Wechselwirkung, bindet sich jedoch nicht daran, so kann ihre Wechselwirkung mit diesem Polypeptid mittels zur Detektion von Protein-Protein-Wechselwirkungen bekannter Verfahren getestet werden. Solche Tests umfassen herkömmliche Ansätze, wie z.B. Vernetzung, Co-Immunfällung und Co-Reinigung mittels Gradienten oder chromatographischer Säulen. Darüber hinaus können Protein-Protein-Wechselwirkungen unter Verwendung eines auf Hefe basierenden genetischen Systems beobachtet werden, das von Fields & Mitarbeitern (Fields & Song, Nature (London) 340, 245–246 (1989)); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578–9582 (1991)), beschrieben wurde, wie von Chevray & Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789–5793 (1991), offenbart. Zahlreiche Transkriptionsaktivatoren, wie z.B. Hefe GAL4, bestehen aus zwei physikalisch getrennten modularen Domänen, wobei die eine als die DNA-Bindungsdomäne und die andere als die Transkriptions-Aktivierungsdomäne agiert. Das in den obigen Veröffentlichungen beschriebene Hefeexpressionssystem (im Allgemeinen als das "Zweihybridsystem" bezeichnet) profitiert von dieser Eigenschaft und verwendet zwei Hybridproteine, eines, in dem das Targetprotein an die DNA-Bindungsdomäne von GAL4 fusioniert ist, und ein zweites, in dem Kandidaten-Aktivierungsproteine an die Aktivierungsdomäne fusioniert sind. Die Expression von einem GAL1-lacZ-Reportergen unter der Kontrolle eines GAL4-aktivierten Promotors hängt von der Wiederherstellung von GAL4-Aktivität über Protein-Protein-Wechselwirkung ab. Kolonien, die wechselwirkende Polypeptide enthalten, werden mit einem chromogenen Substrat für β-Galactosidase nachgewiesen. Ein vollständiges Set (MATCHMAKERTM) zur Identifikation von Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen zwei spezifischen Proteinen unter Verwendung des Zweihybridverfahrens ist im Handel bei Clontech erhältlich. Dieses System kann auch ausgedehnt werden, um Proteindomänen zu kartieren, die in spezifische Protein-Wechselwirkungen involviert sind, sowie Aminosäurereste, die für diese Wechselwirkungen maßgeblich sind, genau zu lokalisieren.
  • Verbindungen, die Wechselwirkungen eines Gens, das für ein hierin identifiziertes FGF-19-Polypeptid kodiert, und anderer intra- oder extrazellulärer Komponenten stören, können wie folgt getestet werden: üblicherweise wird ein Reaktionsgemisch hergestellt, das das Produkt des Gens und der intra- oder extrazellulären Komponente unter solchen Bedingungen und über eine bestimmte Zeitspanne hinweg enthält, die Wechselwirkung und Bindung der zwei Produkte ermöglicht. Um die Fähigkeit einer Kandidatenverbindung zu testen, Bindung zu hemmen, wird die Reaktion in Abwesenheit und in Gegenwart der Testverbindung durchgeführt. Weiters kann ein Placebo zu einem dritten Reaktionsgemisch zugesetzt werden, das als positive Kontrolle dient. Die Bindung (Komplexbildung) zwischen der Testverbindung und der intra- oder extrazellulären Komponente, die im Gemisch vorhanden sind, wird wie zuvor beschrieben beobachtet. Die Bildung eines Komplexes in der/den Kontrollreaktion(en), jedoch nicht im Reaktionsgemisch, das die Testverbindung enthält, weist darauf hin, dass die Testverbindung die Wechselwirkung der Testverbindung und ihres Reaktionspartners stört.
  • Um auf Antagonisten zu testen, kann das FGF-19-Polypeptid gemeinsam mit der auf eine bestimmte Aktivität zu screenenden Verbindung zu einer Zelle zugesetzt werden, und die Fähigkeit der Verbindung, die Aktivität von Interesse in Gegenwart des FGF-19-Polypetpids zu hemmen, weist darauf hin, dass die Verbindung ein Antago nist gegenüber dem FGF-19-Polypeptid ist. Alternativ dazu können Antagonisten durch Kombinieren des FGF-19-Polypeptids und eines potenziellen Antagonisten mit membrangebundenen FGF-19-Polypeptidrezeptoren oder rekombinanten Rezeptoren unter für einen Konkurrenzhemmungstest geeigneten Bedingungen nachgewiesen werden. Das FGF-19-Polypeptid kann markiert werden, beispielsweise durch Radioaktivität, sodass die Anzahl an FGF-19-Polypeptidmolekülen, die an den Rezeptor gebunden sind, verwendet werden kann, um die Wirksamkeit des potenziellen Antagonisten zu bestimmen. Das für den Rezeptor kodierende Gen kann durch zahlreiche verschiedene Verfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, beispielsweise durch Liganden-Panning und FACS-Sortieren, identifiziert werden. Coligan et al., Current Protocols in Immun. 1(2), Kapitel 5 (1991). Vorzugsweise wird Expressionsklonieren verwendet, wobei polyadenylierte RNA aus einer Zelle hergestellt wird, die auf ein FGF-19-Polypeptid reagiert, und eine cDNA-Bibliothek, die aus dieser RNA hergestellt wird, in Pools aufgeteilt und verwendet wird, um COS-Zellen oder andere Zellen zu transfizieren, die auf das FGF-19-Polypeptid nicht reagieren. Transfizierte Zellen, die auf Glasobjektträgern gezüchtet werden, werden markiertem FGF-19-Polypeptid ausgesetzt. Das FGF-19-Polypetpid kann durch zahlreiche verschiedene Mittel markiert sein, einschließlich Iodierung oder Einschluss einer Erkennungsstelle für eine ortsspezifische Proteinkinase. Nach Fixierung und Inkubation werden die Objektträger autoradiographischer Analyse unterzogen. Positive Pools werden identifiziert, und Sub-Pools werden unter Verwendung eines interaktiven Sub-Pooling- und Re-Screening-Verfahrens hergestellt und neu transfiziert, was schließlich einen einzelnen Klon ergibt, der für den mutmaßlichen Rezeptor kodiert.
  • Als ein alternativer Ansatz für Rezeptoridentifikation kann markiertes FGF-19-Polypeptid mittels Photoaffinität mit Zellmembran oder mit Extraktpräparaten, die das Rezeptormolekül exprimieren, verbunden werden. Vernetztes Material wird durch PAGE aufgelöst, und ein Röntgenfilm wird damit belichtet. Der markierte Komplex, der den Rezeptor enthält, kann ausgeschnitten, in Peptidfragmente aufgelöst und Protein-Mikrosequenzieren unterzogen werden. Die mittels Mikrosequenzierens gewonnene Aminosäuresequenz würde dann verwendet werden, um eine Reihe von degenerierten Oligonucleotid-Sonden zu entwerfen, um eine cDNA-Bibliothek zu screenen und hierdruch das für den mutmaßlichen Rezeptor kodierende Gen zu identifizieren.
  • In einem anderen Test für Antagonisten werden Säugetierzellen oder ein Membranpräparat, das den Rezeptor exprimiert, mit markiertem FGF-19-Polypeptid in Gegenwart der Kandidatenverbindung inkubiert. Die Fähigkeit der Verbindung, diese Wechselwirkung zu fördern oder zu blockieren, kann dann gemessen werden.
  • Spezifischere Beispiele für potenzielle Antagonisten umfassen ein Oligonucleotid, das sich an die Fusionen von Immunglobulin mit FGF-19-Polypeptid bindet, und insbesondere Antikörper einschließlich, ohne dadurch eine Einschränkung darzustellen, poly- und monoklonaler Antikörper und Antikörperfragmente, einkettiger Antikörper, anti-idiotypischer Antikörper und chimärer oder humanisierter Versionen solcher Antikörper oder Fragmente sowie menschlicher Antikörper und Antikörperfragmente. Alternativ dazu kann ein potentieller Antagonist ein nahe verwandtes Protein, beispielsweise eine mutierte Form des FGF-19-Polypeptids, das den Rezeptor erkennt, jedoch keine Wirkung verleiht, sein und dabei die Wirkung des FGF-19-Polypeptids kompetitiv hemmen.
  • In einer Ausführungsform hierin wird bei der Durchführung von Konkurrenzbindungstests FGF-Rezeptor 4 oder ein Antikörper gegen FGF-19 als Konkurrent verwendet.
  • Ein anderer potenzieller FGF-19-Polypeptidantagonist ist ein Antisense-RNA- oder -DNA-Konstrukt, hergestellt unter Verwendung von Antisense-Technologie, worin z.B. ein Antisense-RNA- oder -DNA-Molekül so wirkt, dass es die Translation von mRNA durch Hybridisieren an Target-mRNA und Unterbinden von Proteintranslation blockiert. Antisense-Technologie kann verwendet werden, um Genexpression durch Tripelhelix-Bildung oder durch Antisense-DNA oder -RNA zu steuern, wobei beide Verfahren auf Bindung eines Polynucleotids an DNA oder RNA basieren. Beispielsweise wird der 5'-Kodierabschnitt der Polynucleotidsequenz, die für die reifen FGF-19-Polypeptide hierin kodiert, verwendet, um ein Antisense-RNA-Oligonucleotid mit einer Länge von etwa 10 bis 40 Basenpaare zu entwerfen. Ein DNA-Oligonucleotid wird so entworfen, dass es komplementär zu einer Region des Gens ist, das in Transkription eingebunden ist (Tripelhelix – siehe Lee et al., Nucl. Acids. Res. 6, 3073 (1979); Cooney et al., Science 241, 456 (1988); Dervan et al., Science 251, 1360 (1990), wodurch Transkription und die Produktion des FGF-19-Polypeptids unterbunden werden. Das Antisense-RNA-Oligonucleotid hybridisiert an die mRNA in vivo und blockiert Translation des mRNA-Moleküls zum FGF-19-Polypeptid (Antisense – Okano, Neurochem. 56, 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press: Boca Raton, FL (1988)). Die zuvor beschriebenen Oligonucleotide können auch Zellen zugeführt werden, sodass die Antisense-RNA oder -DNA in vivo exprimiert werden kann, um Produktion des FGF-19-Polypeptids zu hemmen. Wird Antisense-DNA verwendet, so werden Oligodesoxyribonucleotide, die von der Translationsstartstelle, z.B. zwischen den Positionen von etwa –10 und +10 der Targetgen-Nucleotidsequenz, abstammen, bevorzugt.
  • Potenzielle Antagonisten umfassen kleine Moleküle, die sich an die aktive Stelle, die Rezeptorbindungsstelle oder den Wachstumsfaktor oder eine andere relevante Bindungsstelle des FGF-19-Polypeptids binden, wodurch die normale biologische Aktivität des FGF-19-Polypeptids blockiert wird. Beispiele für kleine Moleküle umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, kleine Peptide oder peptidähnliche Moleküle, vorzugsweise lösliche Peptide, und synthetische, organische oder anorganische Nicht-peptidyl-Verbindungen.
  • Ribozyme sind enzymatische RNA-Moleküle, die in der Lage sind, die spezifische Spaltung von RNA zu katalysieren. Ribozyme wirken durch sequenzspezifische Hybridisierung an die komplementäre Target-RNA, gefolgt von endonucleolytischer Spaltung. Spezifische Ribozym-Spaltungsstellen innerhalb eines potenziellen RNA-Targets können durch bekannte Verfahren identifiziert werden. Für nähere Details siehe z.B. Rossi, Current Biology 5, 469–471 (1994), und die PCT-Veröffentlichung Nr. WO 97/33551 (veröffentlicht am 18. September 1997).
  • Nucleinsäuremoleküle in Tripelhelix-Formation, die verwendet werden, um Transkription zu hemmen, sollten einzelsträngig und aus Desoxynucleotiden zusammengesetzt sein. Die Basenzusammensetzung dieser Oligonucleotide ist so bestimmt, dass sie Tripelhelix-Formation gemäß den Hoogsteen-Basenpaarungsregeln fördert, die im Allgemeinen relativ große Abschnitte mit Purinen oder Pyrimidinen an einem Strang eines Duplex erfordern. Für nähere Details siehe z.B. die PCT-Veröffentlichung Nr. WO 97/33551, s.o.
  • Diese kleinen Moleküle können durch einen oder mehrere der Screeningtests, die hierin erläutert werden, und/oder durch irgendein anderes Screeningverfahren, das Fachleuten bekannt ist, identifiziert werden.
  • Es gilt anzumerken, dass alle hierin bereitgestellten Tests verwendet werden können, um zahlreiche verschiedene, bioaktive Kandidatenmittel zu screenen. Die Bezeichnung "bioaktives Kandidatenmittel", "Kandidatenmittel" oder "Wirkstoffkandidat", oder grammatische Entsprechungen davon, wie hierin verwendet beschreibt jedes beliebige Molekül, z.B. Protein, Oligopeptid, kleines organisches Molekül, Polysaccharid, Polynucleotid, Purinanalogon und dergleichen, das es auf bioaktive Mittel zu testen gilt, die in der Lage sind, entweder den zellulären Aktivitätsphänotyp oder die Expression einer FGF-19-Sequenz, einschließlich Nucleinsäuresequenzen und Proteinsequenzen, direkt oder indirekt zu verändern.
  • Kandidatenmittel können zahlreiche chemische Klassen umfassen, auch wenn sie typischerweise organische Moleküle sind, vorzugsweise kleine organische Verbindungen mit einem Molekulargewicht von mehr als 100 und weniger als etwa 2.500 Dalton (Da). Kleine Moleküle werden hierin ferner als jene definiert, die ein Molekulargewicht von zwischen 50 und 2.000 Da aufweisen. In einer anderen Ausführungsform weisen kleine Moleküle ein Molekulargewicht von weniger als 1.500 oder weniger als 1.200 oder weniger als 1.000 oder weniger als 750 oder weniger als 500 Da auf. In einer Ausführungsform weist ein kleines Molekül wie hierin verwendet ein Molekulargewicht von etwa 100 bis 200 Da auf. Kandidatenmittel umfassen funktionelle Gruppen, die für strukturelle Wechselwirkung mit Proteinen, insbesondere für Wasserstoffbindung, erforderlich sind und umfassen typischerweise zumindest eine Amin-, Carbonyl-, Hydroxyl- oder Carboxylgruppe, vorzugsweise zumindest zwei der funktionellen chemischen Gruppen. Die Kandidatenmittel umfassen häufig zyklische Kohlenstoff- oder heterozyklische Strukturen und/oder aromatische oder polyaromatische Strukturen, die mit einer oder mehreren der oben genannten, funktionellen Gruppen substituiert sind. Kandidatenmittel sind auch unter Biomolekülen umfassend Peptide, Saccharide, Fettsäuren, Steroide, Purine, Pyrimidine, Derivate, strukturelle Analoga oder Kombinationen davon zu finden. Besonders bevorzugt sind Peptide.
  • Kandidatenmittel werden aus zahlreichen verschiedenen Quellen, einschließlich Bibliotheken synthetischer oder natürlicher Verbindungen, gewonnen. Zahlreiche Mittel sind beispielsweise für die zufällige und gerichtete Synthese einer Vielzahl an organischen Verbindungen und Biomolekülen, einschließlich der Expression randomisierter Oligonucleotide, verfügbar. Alternativ dazu sind Bibliotheken natürlicher Verbindungen in der Form von Bakterien-, Pilz-, Pflanzen- und Tierextrakten erhältlich oder leicht herzustellen. Darüber hinaus können natürliche oder synthetisch hergestellte Bibliotheken und Verbindungen leicht durch herkömmliche chemische, physikalische und biochemische Mittel modifiziert werden. Bekannte pharmakologische Mittel können zur Bildung struktureller Analoga gerichteten oder zufälligen chemischen Modifikationen, wie z.B. Acylierung, Alkylierung, Veresterung oder Amidierung, unterzogen werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die bioaktiven Kandidatenmittel Proteine. Unter "Protein" werden hierin zumindest zwei kovalent gebundene Aminosäuren verstanden, was Proteine, Polypeptide, Oligopeptide und Peptide umfasst. Das Protein kann aus natürlich vorkommenden Aminosäuren und Peptidbindungen oder aus synthetischen, peptidomimetischen Strukturen bestehen. Somit bezeichnet "Aminosäure" oder "Peptidrest", wie hierin verwendet, sowohl natürlich vorkommende als auch synthetische Aminosäuren. Homophenylalanin, Citrullin und Norleucin werden beispielsweise für die Zwecke der vorliegenden Erfindung als Aminosäuren betrachtet. "Aminosäure" umfasst auch Iminosäurereste wie Prolin und Hydroxyprolin. Die Seitenketten können entweder in (R)- oder (S)-Konfiguration vorliegen. In der bevorzug ten Ausführungsform liegen die Aminosäure in der (S)- oder L-Konfiguration vor. Sofern nicht-natürlich vorkommende Seitenketten verwendet werden, können Nicht-Aminosäuresubstituenten verwendet werden, beispielsweise, um In-vivo-Abbau zu unterbinden oder zu verzögern.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die bioaktiven Kandidatenmittel natürlich vorkommende Proteine oder Fragmente von natürlich vorkommenden Proteinen. Somit können beispielsweise Zellextrakte, die Proteine enthalten, oder zufällige oder gerichtete Verdaue von proteinartigen Zellextrakten verwendet werden. Auf diese Weise können Bibliotheken von prokaryotischen und eukaryotischen Proteinen zum Screening in den Verfahren der Erfindung hergestellt werden. In dieser Ausführungsform besonders bevorzugt werden Bibliotheken von Bakterien-, Pilz-, Virus- und Säugetierproteinen, wobei Letztere bevorzugt werden und menschliche Proteine besonders bevorzugt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die bioaktiven Kandidatenmittel Peptide mit einer Länge von etwa 5 bis etwa 30 Aminosäuren, wobei etwa 5 bis etwa 20 Aminosäuren bevorzugt und etwa 7 bis etwa 15 Aminosäuren besonders bevorzugt werden. Die Peptide können Verdaue von natürlich vorkommenden Proteinen, wie zuvor erwähnt, zufällige Peptide oder "vorbestimmte" zufällige Peptide sein. Unter "randomisiert" oder grammatischen Entsprechungen davon wird verstanden, dass jede Nucleinsäure und jedes Peptid aus im Wesentlichen zufälligen Nucleotiden bzw. Aminosäuren besteht. Da diese zufälligen Peptide (oder Nucleinsäuren, die nachstehend noch erläutert werden) im Allgemeinen chemisch synthetisiert werden, können sie jedes beliebige Nucleotid oder jede beliebige Aminosäure an jeder Position inkorporieren. Das Syntheseverfahren kann so entworfen sein, dass es randomisierte Proteine oder Nucleinsäuren hervorbringt, um die Bildung aller oder der meisten möglichen Kombinationen über die Länge der Sequenz zu ermöglichen und somit eine Bibliothek randomisierter, bioaktiver, proteinartiger Kandidatenmitel zu erstellen.
  • In einer Ausführungsform ist die Bibliothek vollständig randomisiert und weist an keiner Position Sequenzpräferenzen oder Konstanten auf. In einer bevorzugten Ausfüh rungsform ist die Bibliothek vorbestimmt. Das bedeutet, dass manche Position innerhalb der Sequenz entweder konstant gehalten oder aus einer limitierten Anzahl an Möglichkeiten ausgewählt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Nucleotide oder Aminosäurereste beispielsweise innerhalb einer definierten Klasse, beispielsweise jener hydrophober Aminosäuren, hydrophiler Reste, sterisch vorbestimmter (entweder kleiner oder großer) Reste, randomisiert, um Nucleinsäure-Bindungsdomänen, Cysteine für Vernetzung, Proline für SH-3-Domänen, Serine, Threonine, Tyrosine oder Histidine für Phosphorylierungsstellen und dergleichen, oder Purine usw. zu schaffen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die bioaktiven Kandidatenmittel Nucleinsäuren. Unter "Nucleinsäure" oder "Oligonucleotid" oder grammatischen Entsprechungen hierin werden zumindest zwei kovalent aneinander gebundene Nucleotide verstanden. Eine Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung enthält im Allgemeinen Phosphodiesterbindungen, obwohl in manchen Klassen, wie nachstehend erläutert, auch Nucleinsäureanaloga eingebunden sind, die alternierende Hauptketten aufweisen können, umfassend beispielsweise Phosphoramid (Beaucage et al., Tetrahedron 49(10), 1925 (1993), und darin zitierte Verweise; Letsinger, J. Org. Chem. 35, 3800 (1970); Sprinzl et al., Eur. J. Biochem. 81, 579 (1977)); Letsinger et al., Nucl. Acids Res. 14, 3487 (1986); Sawai et al., Chem. Lett. 805 (1984); Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110, 4470 (1988); und Pauwels et al., Chemica Scripta 26, 141 (1986)), Thiophosphat (Mag et al., Nucleic Acids Res. 19, 1437 (1991); und US-Patent Nr. 5.644.048), Dithiophosphat (Briu et al., J. Am. Chem. Soc. 111, 2321 (1989)), O-Methylphosphoramidit-Bindungen (siehe Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press) und Peptid-Nucleinsäure-Hauptketten und -Bindungen (siehe Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114, 1895 (1992); Meier et al., Chem. Int. Ed. Eng. 31, 1008 (1992); Nielsen, Nature 365, 566 (1993); Carlsson et al., Nature 380, 207 (1996), die alle hierin durch Verweis aufgenommen sind). Andere analoge Nucleinsäuren umfassen jene mit positiven Hauptketten (Denpcy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 6097 (1995)); nicht-ionische Hauptketten (US-Patent Nr. 5.386.023; 5.637.684; 5.602.240; 5.216.141 und 4.469.863; Kiedrowshi et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English 30, 423 (1991); Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110, 4470 (1988); Letsinger et al., Nucleoside & Nucleotide 13, 1597 (1994); Kapitel 2 und 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Y. S. Sanghui & P. Dan Cook (Hrsg.); Mesmaeker et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4, 395 (1994); Jeffs et al., J. Biomolecular NMR 34, 17 (1994); Tetrahedron Lett. 37, 743 (1996)) und Nicht-Ribose-Hauptketten, einschließlich jener, die in den US-Patenten Nr. 5.235.033 und 5.034.506 sowie in den Kapiteln 6 und 7 der ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Y. S. Sanghui & P. Dan Cook (Hrsg.), beschrieben werden. Nucleinsäuren, die einen oder mehrere carbozyklische Zucker enthalten, fallen ebenfalls in den Bereich der Definition von Nucleinsäuren (siehe Jenkins et al., Chem. Soc. Rev., 169–176 (1995)). Mehrere Nucleinsäureanaloga werden in Rawls, C & E News, 35 (2. Juni 1997), beschrieben. Alle dieser Verweise sind hierin ausdrücklich durch Verweis aufgenommen. Diese Modifikationen der Ribosephosphat-Hauptkette können durchgeführt werden, um die Addition zusätzlicher Gruppierungen wie Markierungen zu erleichtern oder um die Stabilität und Halbwertszeit solcher Moleküle in physiologischen Umgebungen zu steigern. Darüber hinaus können Gemische von natürlich vorkommenden Nucleinsäuren und Analoga hergestellt werden. Alternativ dazu können Gemische verschiedener Nucleinsäureanaloga und Gemische von natürlich vorkommenden Nucleinsäuren und Analoga hergestellt werden. Die Nucleinsäuren können, wie angegeben, einzelsträngig oder doppelsträngig sein oder können Teile von sowohl doppelsträngiger oder einzelsträngiger Sequenz enthalten. Die Nucleinsäure kann DNA, sowohl genomische DNA als auch cDNA, RNA oder ein Hybrid sein, worin die Nucleinsäure jede beliebige Kombination von Desoxyribonucleotiden und Ribonucleotiden und jede beliebige Kombination von Basen, einschließlich Uracil, Adenin, Thymin, Cytosin, Guanin, Inosin, Xanthanin, Hypoxanthanin, Isocytosin, Isoguanin usw., enthält.
  • Wie zuvor allgemein für Proteine beschrieben, können bioaktive Kandidaten-Nucleinsäure-Kandidatenmittel natürlich vorkommende Nucleinsäuren, zufällige Nucleinsäuren oder "vorbestimmte" zufällige Nucleinsäuren sein. Verdaue von prokaryotischen oder eukaryotischen Genomen können beispielsweise, wie bereits oben für die Proteine erwähnt wurde, verwendet werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die bioaktiven Kandidatenmittel organische chemische Gruppierungen, von denen zahlreiche in der Literatur zu finden sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform können, wie zuvor erwähnt, Screens an einzelnen Genen und Genprodukten (Proteinen) durchgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wurde das Gen oder Protein, wie nachstehend in den Beispielen beschrieben, als ein differenziell exprimiertes Gen identifiziert, das mit bestimmten Geweben und somit bestimmten Leiden, die mit jenen Geweben in Verbindung stehen, assoziiert ist. Somit werden in einer Ausführungsform Screens entworfen, um zuerst Kandidatenmittel zu finden, die sich an FGF-19 binden können, und diese Mittel können in Tests verwendet werden, die die Fähigkeit des Kandidatenmittels bewerten, FGF-19-Aktivität zu modulieren. Somit gibt es zahlreiche verschiedene Tests, die durchgeführt werden können.
  • Ein Screening auf Mittel, die die Aktivität von FGF-19 modulieren, kann ebenfalls durchgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen Verfahren zum Screenen auf ein bioaktives Mittel, das in der Lage ist, die Aktivität von FGF-19 zu modulieren, die Schritte des Zusetzens eines bioaktiven Kandidatenmittels zu einer Probe von FGF-19 und des Bestimmens einer Veränderung der biologischen Aktivität von FGF-19. "Modulation der Aktivität von FGF-19" umfasst eine Steigerung der Aktivität, eine Senkung der Aktivität oder eine Änderung des Typs oder der Art der vorhandenen Aktivität. Somit sollte sich in dieser Ausführungsform das Kandidatenmittel sowohl an FGF-19 binden (auch wenn dies nicht erforderlich sein kann) als auch seine biologische oder biochemische Aktivität wie hierin definiert verändern. Die Verfahren umfassen sowohl In-vitro-Screeningverfahren, wie sie bereits oben allgemein erläutert wurden, als auch In-vivo-Screening von Zellen auf Veränderungen der Gegenwart, Expression, Verteilung, Aktivität oder Menge von FGF-19.
  • Somit umfassen in dieser Ausführungsform die Verfahren das Kombinieren einer Probe und eines bioaktiven Kandidatenmittels und das Evaluieren der Wirkung auf FGF-19-Aktivität. Unter "FGF-19-Proteinaktivität" oder grammatischen Entsprechun gen wird hierin zumindest eine der biologischen Aktivitäten von FGF-19-Protein, wie zuvor beschrieben, verstanden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Aktivität des FGF-19-Proteins gesteigert; in einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird die Aktivität des FGF-19-Proteins reduziert. Somit werden bioaktive Mittel, die Antagonisten sind, in manchen Ausführungsformen bevorzugt, und bioaktive Mittel, die Agonisten sind, in anderen Ausführungsformen bevorzugt.
  • In einem Aspekt der Erfindung werden Zellen, die FGF-19-Sequenzen enthalten, in Wirkstoff-Screeningtests durch Bewerten der Wirkung von Wirkstoffkandidaten auf FGF-19 verwendet. Zelltypen umfassen normale Zellen, Tumorzellen und Adipozyten.
  • Verfahren zum Testen von FGF-19-Aktivität wie Veränderungen der Glucose-Aufnahme, der Leptin-Freisetzung, des Stoffwechsels, der Konzentrationen an Triglyceriden und freien Fettsäuren, des Körpergewichts und des Körperfetts sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und werden nachstehend in den Beispielen erläutert.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Verfahren das Zusetzen eines bioaktiven Kandidatenmittels, wie zuvor definiert, zu einer Zelle, die FGF-19 umfasst. Bevorzugte Zelltypen umfassen beinahe jede Zelle. Die Zellen enthalten eine Nucleinsäure, vorzugsweise eine rekombinante, die für ein FGF-19-Protein kodiert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Bibliothek von Kandidatenmittel an zahlreichen Zellen getestet.
  • In einem Aspekt werden die Tests in der Gegenwart oder Abwesenheit von oder vor oder nach der Aussetzung gegenüber physiologischen Signalen, z.B. Hormonen, Antikörpern, Peptiden, Antigenen, Cytokinen, Wachstumsfaktoren, Aktionspotentialen, pharmakologischen Mitteln einschließlich Chemotherapeutika, Strahlung, Kanzerogenen oder anderen Zellen (d.h. Zell-Zell-Kontakte), bewertet. In einem anderen Bei spiel werden die Bestimmungen zu verschiedenen Zeitpunkten des Zellzyklusprozesses vorgenommen.
  • Die hierin bereitgestellten FGF-19-Sequenzen können auch in Diagnoseverfahren verwendet werden. Überexpression von FGF-19 kann auf eine abnormal hohe Stoffwechselrate hinweisen, und Unterexpression kann ein Hinweis auf eine Neigung zu Adipositas sein. Darüber hinaus kann eine Probe aus einem Patienten auf mutiertes oder funktionsgestörtes FGF-19 analysiert werden. Im Allgemeinen umfassen solche Verfahren das Vergleichen einer Probe aus einem Patienten und das Vergleichen von FGF-19-Expression mit jener einer Kontrolle.
  • F. Anti-FGF-19-Antikörper
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiters Anti-FGF-19-Antikörper bereit. Beispiele für solche Antikörper schließen polyklonale, monoklonale, humanisierte, bispezifische und heterokonjugierte Antikörper ein.
  • 1. Polyklonale Antikörper
  • Die Anti-FGF-19-Antikörper können polyklonale Antikörper umfassen. Verfahren zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern sind Fachleuten bekannt. Polyklonale Antikörper können in einem Säugetier, beispielsweise durch eine oder mehrere Injektionen eines immunisierenden Mittels und, sofern erwünscht, eines Adjuvans, gezüchtet werden. Typischerweise wird das immunisierende Mittel und/oder das Adjuvans dem Säugetier durch multiple subkutane oder intraperitoneale Injektionen injiziert. Das immunisierende Mittel kann das FGF-19-Polypeptid oder ein Fusionsprotein davon umfassen. Es kann nützlich sein, das immunisierende Mittel an ein Protein zu konjugieren, das dafür bekannt ist, im zu immunisierenden Tier immunogen zu sein. Beispiele für solche immunogenen Proteine umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin, Serumalbumin, Rinderthyroglobulin und Sojabohnentrypsininhibitor. Beispiele für Adjuvanzien, die verwendet werden können, umfassen komplettes Freundsches Adjuvans und MPL-TDM-Adjuvans (Mo nophosphoryl-Lipid A, synthetisches Trehalosedicorynomycolat). Die Arbeitsvorschrift zur Immunisierung kann von Fachleuten ohne übermäßiges Experimentieren ausgewählt werden.
  • 2. Monoklonale Antikörper
  • Die Anti-FGF-19-Antikörper können alternativ zu polyklonalen Antikörpern monoklonale Antikörper sein. Monoklonale Antikörper können unter Verwendung von Hybridomverfahren, wie beispielsweise jenen, die von Kohler & Milstein, Nature 356, 495 (1975), beschrieben werden, hergestellt werden. In einem Hybridomverfahren wird eine Maus, ein Hamster oder ein anderes geeignetes Wirttier typischerweise mit einem immunisierenden Mittel immunisiert, um Lymphozyten hervorzubringen, die Antikörper produzieren oder zu produzieren in der Lage sind, die sich spezifisch an das immunisierende Mittel binden. Alternativ dazu können die Lymphozyten in vitro immunisiert werden.
  • Das immunisierende Mittel umfasst typischerweise das FGF-19-Polypeptid oder ein Fusionsprotein davon. Im Allgemeinen werden entweder Lymphozyten des peripheren Bluts ("PBLs"), sofern Zellen menschlichen Ursprungs erwünscht sind, oder Milzzellen oder Lymphknotenzellen verwendet, sofern nicht-menschliche Säugetierquellen erwünscht sind. Die Lymphozyten werden dann mit einer sich unbegrenzt vermehrenden Zelllinie unter Verwendung eines geeigneten Fusionsmittels, wie z.B. Polyethylenglykol, fusioniert, um eine Hybridomzelle zu bilden [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 59–103 (1986)]. Sich unbegrenzt vermehrende Zelllinien sind üblicherweise transformierte Säugetierzellen, insbesondere Myelomzellen von Nagetieren, Rindern und Menschen. Üblicherweise werden Ratten- oder Mausmyelomzelllinien verwendet. Die Hybridomzellen können in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert werden, das vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthält, die das Wachstum oder Überleben der nicht fusionierten, sich unbegrenzt vermehrenden Zellen hemmen. Fehlt beispielsweise den Ausgangszellen das Enzym Hypoxanthinguaninphosphoribosyltransferase (HGPRT oder HPRT), so umfasst das Kulturmedium für die Hybridome typischerweise Hypo xanthin, Aminopterin und Thymidin ("HAT-Medium"), Substanzen, die das Wachstum von HGPRT-defizienten Zellen unterbindet.
  • Bevorzugte, sich unbegrenzt vermehrende Zelllinien sind jene, die wirksam fusionieren, die stabile hochgradige Expression von Antikörper durch die ausgewählten, Antikörper produzierenden Zellen fördern und die auf ein Medium wie beispielsweise HAT-Medium empfindlich sind. Noch bevorzugtere, sich unbegrenzt vermehrende Zelllinien sind Maus-Myelomlinien, die beispielsweise beim Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Kalifornien, und bei der American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, erhalten werden können. Menschliche Myelom- und Maus-Mensch-Heteromyelomzelllinien wurden auch für die Herstellung von menschlichen monoklonalen Antikörpern beschrieben [Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, 51–63 (1987).
  • Das Kulturmedium, in dem die Hybridomzellen kultiviert werden, kann dann auf die Gegenwart von monoklonalen Antikörpern, die gegen FGF-19 gerichtet sind, getestet werden. Vorzugsweise wird die Bindungsspezifität von monoklonalen Antikörpern, die durch die Hybridomzellen produziert werden, durch Immunfällung oder durch einen In-vitro-Bindungstest, wie beispielsweise Radioimmuntest (RIA) oder enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung (ELISA), bestimmt. Solche Verfahren und Tests sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Die Bindungsaffinität des monoklonalen Antikörpers kann beispielsweise durch die Scatchard-Analyse von Munson & Pollard, Anal. Biochem. 107, 220 (1980), bestimmt werden.
  • Nachdem die erwünschten Hybridomzellen identifiziert wurden, können die Klone durch Grenzverdünnungsverfahren subkloniert und mittels herkömmlicher Verfahren gezüchtet werden [Goding, s.o.]. Geeignete Kulturmedien für diesen Zweck umfassen beispielsweise Dulbecco's Modified Eagle's Medium und RPMI-1640-Medium. Alternativ dazu können die Hybridomzellen in vivo als Aszites in einem Säugetier gezüchtet werden.
  • Die monoklonalen Antikörper, die durch die Subklone sekretiert werden, können aus dem Kulturmedium oder der Ascitesflüssigkeit durch herkömmliche Immunglobulinreinigungsverfahren, wie beispielsweise Protein-A-Sepharose, Hydroxylapatitchromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie, isoliert oder gereinigt werden.
  • Die monoklonalen Antikörper können auch durch DNA-Rekombinationsverfahren, wie jenen, die im US-Patent Nr. 4.816.567 beschrieben werden, hergestellt werden. DNA, die für die monoklonalen Antikörper der Erfindung kodiert, kann leicht isoliert und unter Verwendung herkömmlicher Verfahren (z.B. unter Verwendung von Oligonucleotidsonden, die in der Lage sind, sich spezifisch an Gene zu binden, die für die schweren und leichten Ketten von Maus-Antikörper kodieren) sequenziert werden. Die Hybridomzellen der Erfindung dienen als eine bevorzugte Quelle für solche DNA. Nachdem sie isoliert wurde, kann die DNA in Expressionsvektoren platziert werden, die dann in Wirtszellen wie beispielsweise Affen-COS-Zellen, Chinahamster-Eierstock- (CHO-) Zellen oder Myelomzellen transfiziert werden, die sonst kein Immunglobulinprotein produzieren, um die Synthese von monoklonalen Antikörpern in den rekombinanten Wirtszellen zu erreichen. Die DNA kann auchbeispielsweise durch Substituieren der Kodiersequenz für menschliche Schwer- und Leichtketten-Konstantdomänen anstelle der homologen Maus-Sequenzen [US-Patent Nr. 4.816.567; Morrison et al., s.o.] oder durch kovalentes Binden der gesamten oder eines Teils der Kodiersequenz für ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid an die Immunglobulin-Kodiersequenz modifiziert werden. Solch ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid kann anstelle der konstanten Domänen eines Antikörpers der Erfindung oder anstelle der variablen Domänen einer Antigen-Bindungsstelle eines Antikörpers der Erfindung eingesetzt werden, um einen zweiwertigen Hybridantikörper zu bilden.
  • Die Antikörper können einwertige Antikörper sein. Verfahren zur Herstellung einwertiger Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Beispielsweise umfasst ein Verfahren rekombinante Expression von Immunglobulin-Leichtkette und modifizierter Schwerkette. Die Schwerkette ist im Allgemeinen an einem beliebigen Punkt in der Fc-Region trunkiert, sodass Schwerketten-Vernetzung unterbunden wird. Al ternativ dazu werden die relevanten Cysteinreste durch einen anderen Aminosäurerest substituiert oder werden deletiert, um Vernetzung zu unterbinden.
  • In-vitro-Verfahren sind auch zur Herstellung einwertiger Antikörper geeignet. Verdau von Antikörpern zur Produktion von Fragmenten davon, vorzugsweise Fab-Fragmenten, kann gemäß herkömmlichen Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, durchgeführt werden.
  • 3. Menschliche und humanisierte Antikörper
  • Die Anti-FGF-19-Antikörper der Erfindung können weiters humanisierte Antikörper oder menschliche Antikörper umfassen. Humanisierte Formen von nicht-menschlichen (z.B. Maus-) Antikörpern sind chimäre Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon (wie z.B. Fv, Fab, Fab', F(ab')2 oder andere Antigen-bindende Subsequenzen von Antikörpern), die eine Mindest-Sequenz, abgeleitet aus nicht-menschlichem Immunglobulin, enthalten. Humanisierte Antikörper umfassen menschliche Immunglobuline (Akzeptorantikörper), in denen Reste aus einer komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) des Akzeptors durch Reste aus einer CDR einer nicht-menschlichen Spezies (Donorantikörper) wie Maus, Ratte oder Kaninchen mit der erwünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt werden. In manchen Fällen werden Fv-Gerüstreste des menschlichen Immunglobulins durch entsprechende nicht-menschliche Reste ersetzt. Humanisierte Antikörper können auch Reste umfassen, die weder im Akzeptorantikörper noch in den importierten CDR- oder Gerüstsequenzen zu finden sind. Im Allgemeinen umfasst der humanisierte Antikörper im Wesentlichen die gesamte von zumindest einer, und typischerweise zwei, variablen Domänen, in denen alle oder im Wesentlichen alle der CDR-Regionen jenen eines nicht-menschlichen Immunglobulins entsprechen und alle oder im Wesentlichen alle der FR-Regionen jene einer menschlichen Immunglobulin-Consensussequenz sind. Die humanisierten Antikörper umfassen im besten Fall auch zumindest einen Abschnitt einer konstanten Immunglobulinregion (Fc), typischerweise jenen eines menschlichen Immunglobulins [Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323–329 (1988); und Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593–596 (1992)].
  • Verfahren zur Humanisierung nicht-menschlicher Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Im Allgemeinen weist ein humanisierter Antikörper einen oder mehrere Aminosäurereste auf, die in ihn aus einer Quelle eingeführt wurden, die nicht-menschlich ist. Diese nicht-menschlichen Aminosäurereste werden oft als "Import"-Reste bezeichnet, die typischerweise aus einer variablen "Import"-Domäne genommen werden. Humanisierung kann im Wesentlichen gemäß dem Verfahren von Winter und Mitarbeiter [Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323–327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534–1536 (1988)] durch Substituieren von Nagetier-CDRs- oder -CDR-Sequenzen anstelle der entsprechenden Sequenzen eines menschlichen Antikörpers durchgeführt werden. Demgemäß sind solche "humanisierten" Antikörper Hybridantikörper (US-Patent Nr. 4.816.567), worin wesentlich weniger als eine intakte menschliche variable Domäne durch die entsprechende Sequenz aus einer nicht-menschlichen Spezies substituiert wurde. In der Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise menschliche Antikörper, in denen manche CDR-Reste und möglicherweise manche FR-Reste durch Reste aus analogen Stellen in Nagetierantikörpern ersetzt sind.
  • Menschliche Antikörper können auch unter Verwendung verschiedener Techniken, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, einschließlich Phagendisplay-Bibliotheken [Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227, 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 (1991)] hergestellt werden. Die Verfahren von Cole et al. und Boerner et al. sind auch zur Herstellung von menschlichen monoklonalen Antikörpern geeignet [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, S. 77 (1985), und Boerner et al., J. Immunol. 147(1), 86–95 (1991)]. Demähnlich können menschliche Antikörper durch Einführen menschlicher Immunglobulinloci in transgene Tiere, z.B. Mäuse, in denen die endogenen Immunglobulingene teilweise oder vollständig deaktiviert wurden, hergestellt werden. Bei Provokation wird menschliche Antikörperproduktion beobachtet, die jener in allen Aspekten sehr stark ähnlich ist, die in Menschen selbst beobachtet wurde, einschließlich Genneuanordnung, Anord nung und Antikörperrepertoire. Dieser Ansatz wird beispielsweise in den US-Patenten Nr. 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016 und den folgenden wissenschaftlichen Publikationen beschrieben: Marks et al., Bio/Technology 10, 779–783 (1992); Lonberg et al., Nature 368, 856–859 (1994); Morrison, Nature 368, 812–813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845–851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg & Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13, 65–93 (1995).
  • 4. Bispezifische Antikörper
  • Bispezifische Antikörper sind monoklonale, vorzugsweise menschliche oder humanisierte, Antikörper, die Bindungsspezifitäten für zumindest zwei verschiedene Antigene aufweisen. Im vorliegenden Fall ist eine der Bindungsspezifitäten für das FGF-19, die andere ist für jedes beliebige andere Antigen, und vorzugsweise für ein(en) Zelloberflächen-Protein oder -Rezeptor oder eine Rezeptoruntereinheit.
  • Verfahren zur Herstellung bispezifischer Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Herkömmlicherweise basiert die Produktion von bispezifischen Antikörpern auf der Co-Expression von zwei Immunglobulin-Schwerketten/Leichtketten-Paaren, worin die zwei schweren Ketten unterschiedliche Spezifitäten aufweisen [Milstein & Cuello, Nature 305, 537–539 (1983)]. Aufgrund der zufälligen Auswahl an Immunglobulinschwer- und -feichtketten produzieren diese Hybridome (Quadrome) ein potenzielles Gemisch von zehn verschiedenen Antikörpermolekülen, von denen nur eines die korrekte bispezifische Struktur aufweist. Die Reinigung des korrekten Moleküls erfolgt üblicherweise durch Affinitätschromatographieschritte. Ähnliche Verfahren sind in der WO 93/08829, veröffentlicht am 13. Mai 1993, und in Traunecker et al., EMBO J. 10, 3655–3659 (1991), offenbart.
  • Variable Antikörperdomänen mit den erwünschten Bindungsspezifitäten (Antikörper-Antigen-Kombinationsstellen) können an Immunglobulinkonstantdomänen-Sequenzen fusioniert werden. Die Fusion erfolgt vorzugsweise mit einer Immunglobulin-Schwerkettenkonstantdomäne, umfassend zumindest einen Teil der Gelenks-, CH2- und CH3-Regionen. Es wird bevorzugt, dass die erste Schwerketten-Konstantregion (CH1) die Stelle enthält, die für Leichtkettenbindung, vorhanden in zumindest einer der Fusionen, erforderlich ist. DNAs, die für die Immunglobulin-Schwerkettenfusionen und, sofern erwünscht, für die Immunglobulin-Leichtkette kodieren, werden in getrennte Expressionsvektoren insertiert und werden in geeignete Wirtsorganismen co-transfiziert. Für nähere Details zur Herstellung von bispezifischen Antikörpern siehe beispielsweise Suresh et al., Methods in Enzymology 121, 210 (1986).
  • Gemäß einem anderen Ansatz, der in der WO 96/27011 beschrieben wird, kann die Grenzfläche zwischen einem Paar von Antikörpermolekülen bearbeitet werden, um den Prozentsatz an Heterodimeren, die aus rekombinanter Zellkultur gewonnen werden, zu maximieren. Die bevorzugte Grenzfläche umfasst zumindest einen Teil der CH3-Region einer konstanten Antikörperdomäne. In diesem Verfahren werden eine oder mehr kurze Aminosäureseitenketten von der Grenzfläche des ersten Antikörpermoleküls durch längere Seitenketten (z.B. Tyrosin oder Tryptophan) ersetzt. Kompensations-"Hohlräume" von identischer oder ähnlicher Größe wie die lange(n) Seitenkette(n) werden an der Grenzfläche des zweiten Antikörpermoleküls durch Ersetzen der langen Aminosäureseitenketten durch kürzere (z.B. Alanin oder Threonin) geschaffen. Dies liefert einen Mechanismus zur Steigerung der Ausbeute des Heterodimers im Vergleich zu unerwünschten Endprodukten wie beispielsweise Homodimeren.
  • Bispezifische Antikörper können als Volllängenantikörper oder Antikörperfragmente (z.B. bispezifische F(ab')2-Antikörper) hergestellt werden. Verfahren zur Herstellung bispezifischer Antikörper aus Antikörperfragmenten wurden in der Literatur bereits beschrieben. Beispielsweise können bispezifische Antikörper unter Verwendung chemischer Bindung hergestellt werden. Brennan et al., Science 229, 81 (1985), beschreiben ein Verfahren, worin intakte Antikörper proteolytisch gespaltet werden, um F(ab')2-Fragmente zu bilden. Diese Fragmente werden in Gegenwart des Dithiol-Komplexbildners Natriumarsenit reduziert, um vicinale Dithiole zu stabilisieren und intermolekulare Disulfidbildung zu unterbinden. Die gebildeten Fab'-Fragmente werden dann zu Thionitrobenzoat- (TNB-) Derivaten umgesetzt. Eines der Fab'-TNB-Derivate wird dann zum Fab'-Thiol durch Reduktion mit Mercaptoethylamin rekonvertiert und mit einer äquimolaren Menge des anderen Fab'-TNB-Derivats vermischt, um den bispezifischen Antikörper zu bilden. Die produzierten bispezifischen Antikörper können als Mittel für die selektive Immobilisierung von Enzymen verwendet werden.
  • Fab'-Fragmente können direkt aus E. coli gewonnen und chemisch gebunden werden, um bispezifische Antikörper zu bilden. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175, 217–225 (1992), beschreiben die Produktion eines vollständig humanisierten bispezifischen F(ab')2-Antikörper-Moleküls. Jedes Fab'-Fragment wurde separat aus E. coli sekretiert und gerichteter chemischer Bindung in vitro unterzogen, um den bispezifischen Antikörper zu bilden. Der so gebildete bispezifische Antikörper war in der Lage, sich an Zellen zu binden, die den ErbB2-Rezeptor überexprimierten, sowie an normale menschliche T-Zellen, und konnte die lytische Aktivität menschlicher zytotoxischer Lymphozyten gegen menschliche Brusttumortargets steigern.
  • Verschiedene Techniken zur Herstellung und Isolation bispezifischer Antikörperfragmente direkt aus rekombinanten Zellkulturen wurden auch beschrieben. Beispielsweise wurden bispezifische Antikörper unter Verwendung von Leucin-Zipper hergestellt. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5), 1547–1553 (1992). Die Leucin-Zipper-Peptide aus den Fos- und Jun-Proteinen wurden an die Fab'-Abschnitte von zwei verschiedenen Antikörpern durch Genfusion gebunden. Die Antikörper-Homodimere wurden an der Gelenksregion reduziert, um Monomere zu bilden, und dann reoxidiert, um die Antikörper-Heterodimere zu bilden. Dieses Verfahren kann auch zur Herstellung von Antikörper-Homodimeren verwendet werden. Die von Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444–6448 (1993), beschriebene "Diabody"-Technologie stellt einen alternativen Mechanismus zur Herstellung bispezifischer Antikörperfragmente bereit. Die Fragmente umfassen eine variable Schwerkettendomäne (VH), die über einen Linker an eine variable Leichtkettendomäne (VL) gebunden ist, der zu kurz ist, um Paarung zwischen den zwei Domänen an derselben Kette zu ermöglichen. Demgemäß werden die VH- und VL-Domänen eines Fragments gezwungen, Paare mit den komplementären VL- und VH-Domänen eines anderen Fragments zu bilden, wodurch zwei Antigen-Bindungsstellen gebildet werden. Auch eine andere Vorgehensweise zur Herstellung bispezifischer Antikörperfragmente durch die Verwendung von einkettigen Fv- (sFv-) Dimeren wurde bereits beschrieben. Siehe Gruber et al., J. Immunol. 152, 5368 (1994).
  • Antikörper mit mehr als zwei Wertigkeiten werden ebenfalls erwogen. Beispielsweise können trispezifische Antikörper hergestellt werden. Tutt et al., J. Immunol. 147, 60 (1991).
  • Beispielhafte bispezifische Antikörper können sich an zwei verschiedene Epitope an einem gegebenen FGF-19-Polypeptid der vorliegenden Erfindung binden. Alternativ dazu kann ein Anti-FGF-19-Polypeptidarm mit einem Arm kombiniert werden, der sich an ein Trigger-Molekül an einem Leukozyten wie beispielsweise ein T-Zellrezeptormolekül (z.B. CD2, CD3, CD28 oder B7) oder Fc-Rezeptoren für IgG (FcγR), wie z.B. FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) und FcγRIII (CD16), bindet, sodass zelluläre Abwehrmechanismen auf die Zelle fokussiert werden, die das bestimmte FGF-19-Polypeptid exprimiert. Bispezifische Antikörper können auch verwendet werden, um zytotoxische Mittel zu Zellen lokalisieren, die ein bestimmtes FGF-19-Polypeptid exprimieren. Diese Antikörper besitzen einen FGF-19-Bindungsarm und einen Arm, der ein zytotoxisches Mittel oder einen Radionuclidchelatbildner bindet, wie z.B. EOTUBE, DPTA, DOTA oder TETA. Ein anderer bispezifischer Antikörper von Interesse bindet das FGF-19-Polypeptid und bindet weiters Gewebefaktor (tissue factor, TF).
  • 5. Heterokonjugierte Antikörper
  • Heterokonjugierte Antikörper liegen auch im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung. Heterokonjugierte Antikörper setzen sich aus zwei kovalent gebundenen Antikörpern zusammen. Solche Antikörper wurden beispielsweise vorgeschlagen, um Immunsystemzellen auf unerwünschte Zellen zu richten [US-Patent Nr. 4.676.980] sowie zur Behandlung von HIV-Infektion [WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089 ]. Es wird erwogen, dass die Antikörper in vitro unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Gebiet der synthetischen Proteinchemie bekannt sind, hergestellt werden können, einschließlich jener, die Vernetzungsmittel einbinden. Beispielsweise können Immunotoxine unter Verwendung einer Disulfid-Austauschreaktion oder durch Bildung einer Thioetherbindung konstruiert werden. Beispiele für geeignete Reagenzien für diesen Zweck umfassen Iminothiolat und Methyl-4-mercaptobutyrimidat sowie jene Reagenzien, die beispielsweise im US-Patent Nr. 4.676.980 offenbart sind.
  • 6. Effektorfunktionsbearbeitung
  • Es kann wünschenswert sein, den Antikörper der Erfindung hinsichtlich der Effektorfunktion zu modifizieren, um z.B. die Wirksamkeit des Antikörpers bei der Behandlung von Krebs zu steigern. Beispielsweise können ein oder mehrere Cysteinreste in die Fc-Region eingeführt werden, wodurch die Bildung von Disulfidbindungen zwischen den Ketten in dieser Region ermöglicht wird. Der so gebildete homodimere Antikörper kann verbesserte Internalisierungsfähigkeit und/oder gesteigertes komplementvermitteltes Zelltöten und antikörpervermittelte zelluläre Zytotoxizität (ADCC) aufweisen. Siehe Caron et al., J. Exp. Med. 176, 1191–1195 (1992), und Shopes, J. Immunol. 148, 2918–2922 (1992). Homodimere Antikörper mit gesteigerter Anti-Tumor-Aktivität können auch unter Verwendung heterobifunktioneller Vernetzer hergestellt werden, wie in Wolff et al., Cancer Research 53, 2560–2565 (1993), beschrieben wird. Alternativ dazu kann ein Antikörper so bearbeitet werden, dass er duale Fc-Regionen aufweist und dadurch über gesteigerte Komplementlyse- und ADCC-Fähigkeiten verfügen kann. Siehe Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3, 219–230 (1989).
  • 7. Immunkonjugate
  • Die Erfindung betrifft auch Immunkonjugate, die einen Antikörper umfassen, der an ein zytotoxisches Mittel wie beispielsweise ein chemotherapeutisches Mittel, Toxin (z.B. ein enzymatisch aktives Toxin oder ein Toxin bakteriellen, pflanzlichen oder tierischen Ursprungs oder auch von Pilzen oder Fragmente davon) oder an ein radioaktives Isotop (d.h. ein Radiokonjugat) konjugiert ist.
  • Chemotherapeutische Mittel, die zur Herstellung solcher Immunkonjugate nützlich sind, wurden oben beschrieben. Enzymatisch aktive Toxine und Fragmente davon, die verwendet werden können, umfassen Diphtherie-A-Kette, nichtbindende aktive Fragmente von Diphtherietoxin, Exotoxin-A-Kette (aus Pseudomonas aeruginosa), Ricin-A-Kette, Abrin-A-Kette, Modeccin-A-Kette, alpha-Sarcin, Aleurites-fordii-Proteine, Dianthin-Proteine, Phytolaca-americana-Proteine (PAPI, PAPII und PAP-S), Momordica-charantia-Inhibitor, Curcin, Crotin, Sapaonaria-officinalis-Inhibitor, Gelonin, Mitogellin, Restrictocin, Phenomycin, Enomycin und die Tricothecene. Zahlreiche verschiedene Radionuclide sind zur Herstellung von radiokonjugierten Antikörpern erhältlich. Beispiele umfassen 212Bi, 131I, 131In, 90Y und 186Re.
  • Konjugate des Antikörpers und des zytotoxischen Mittels werden unter Verwendung zahlreicher verschiedener bifunktioneller Proteinbindungsmittel wie z.B. N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionat (SPDP), Iminothiolan (IT), bifunktionellen Derivaten von Imidoestern (wie z.B. Dimethyladipimidat-HCl), aktiver Ester (wie z.B. Disuccinimidylsuberat), Aldehyden (wie Glutaraldehyd), Bisazido-Verbindungen (wie z.B. Bis(p-azidobenzoyl)hexandiamin), Bisdiazonium-Derivaten (wie z.B. Bis(p-diazoniumbenzoyl)ethylendiamin), Diisocyanaten (wie Toluol-2,6-diisocyanat) und bis-aktiven Fluorverbindungen (wie z.B. 1,5-Difluor-2,4-dinitrobenzol) hergestellt. Beispielsweise kann ein Ricinimmunotoxin wie in Vitetta et al., Science 238, 1098 (1987), beschrieben hergestellt werden. C-14-markierte 1-Isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylentriaminpentaessigsäure (MX-DTPA) ist ein beispielhafter Chelatbildner zur Konjugation von Radionucleotid an den Antikörper. Siehe die WO 94/11026.
  • In einer anderen Ausführungsform kann der Antikörper an einen "Rezeptor" (wie Streptavidin) zur Verwendung bei Tumor-Pretargeting konjugiert werden, worin das Antikörper-Rezeptor-Konjugat dem Patienten verabreicht wird, gefolgt von der Entfernung ungebundenen Konjugats aus dem Blutkreislauf unter Verwendung eines Klärungsmittels und der anschließenden Verabreichung eines "Liganden" (z.B. Avidin), der an ein zytotoxisches Mittel (z.B. ein Radionucleotid) konjugiert ist.
  • 8. Immunoliposomen
  • Die hierin offenbarten Antikörper können auch als Immunoliposomen formuliert werden. Liposomen, die den Antikörper enthalten, werden durch auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren hergestellt, wie sie beispielsweise in Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030 (1980); und den US-Patenten Nr. 4.485.045 und 4.544.545 beschrieben werden. Liposomen mit gesteigerter Zirkulationsdauer sind im US-Patent Nr. 5.013.556 offenbart.
  • Besonders nützliche Liposomen können durch das Umkehrphasenverdampfungsverfahren mit einer Lipidzusammensetzung, die Phosphatidylcholin, Cholesterin und PEG-derivatisiertes Phosphatidylethanolamin (PEG-PE) umfasst, hergestellt werden. Liposomen werden durch Filter von definierter Porengröße filtriert, um Liposomen mit dem erwünschten Durchmesser zu ergeben. Fab'-Fragmente des Antikörpers der vorliegenden Erfindung können an die Liposomen wie in Martin et al., J. Biol. Chem. 257, 286–288 (1982), beschrieben mittels einer Disulfid-Austauschreaktion konjugiert werden. Ein chemotherapeutisches Mittel (wie beispielsweise Doxorubicin) ist gegebenenfalls im Liposom enthalten. Siehe Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19), 1484 (1989).
  • 9. Pharmazeutische Zusammensetzungen von Antikörpern
  • Antikörper, die sich spezifisch an ein hierin identifiziertes FGF-19-Polypeptid binden, sowie andere Moleküle, die durch die zuvor offenbarten Screeningtests identifiziert wurden, können zur Behandlung von verschiedenen Erkrankungen in Form von pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden.
  • Ist das FGF-19-Polypeptid intrazellulär und werden ganze Antikörper als Inhibitoren verwendet, werden internalisierende Antikörper bevorzugt. Es können jedoch auch Lipofektionen oder Liposomen verwendet werden, um den Antikörper oder ein Antikörperfragment in Zellen bereitzustellen. Werden Antikörperfragmente verwendet, so wird das kleinste Inhibitionsfragment, das sich spezifisch an die Bindungsdomäne des Targetproteins bindet, bevorzugt. Beispielsweise können auf Grundlage der Sequenzen der variablen Regionen eines Antikörpers Peptidmoleküle entworfen werden, die die Fähigkeit beibehalten, die Target-Proteinsequenz zu binden. Solche Peptide können chemisch synthetisiert und/oder durch DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden. Siehe z.B. Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889–7893 (1993). Die Formulierung hierin kann auch mehr alsnur eine aktive Verbindung als für die bestimmte zu behandelnde Indikation erforderlich ist enthalten, vorzugsweise jene mit komplementären Aktivitäten, die sich gegenseitig nicht negativ beeinflussen. Alternativ oder zusätzlich dazu kann die Zusammensetzung ein Mittel umfassen, das ihre Funktion steigert, wie beispielsweise ein zytotoxisches Mittel, ein chemotherapeutisches Mittel oder ein wachstumshemmendes Mittel. Solche Moleküle sind geeigneterweise in Kombination vorhanden, und dies in Mengen, die für die beabsichtigten Zwecke wirksam sind.
  • Die aktiven Bestandteile können auch in Mikrokapseln eingekapselt werden, beispielsweise durch Koazervierungsverfahren oder durch Grenzflächenpolymerisation, z.B. in Hydroxymethylcellulose- oder Gelatine-Mikrokapseln bzw. Poly(methylmethacrylat)-Mikrokapseln, in kolloidale Wirkstoffzufuhrsysteme (z.B. Liposome, Albuminmikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nanopartikeln und Nanokapseln) oder in Makroemulsionen. Solche Verfahren sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, s.o., offenbart.
  • Die Formulierungen, die zur In-vivo-Verabreichung verwendet werden, müssen steril sein. Dies kann leicht mittels Filtration durch sterile Filtermembranen erreicht werden.
  • Es können Retardpräparate hergestellt werden. Geeignete Beispiele für Retardpräparate umfassen semipermeable Matrizen von festen hydrophoben Polymeren, die den Antikörper enthalten, wobei die Matrizen in Form von Formstücken, z.B. Filmen oder Mikrokapseln, vorliegen. Beispiele für Retard-Matrizen umfassen Polyester, Hydrogele (z.B. Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) oder Poly(vinylalkohol)), Polylactide (US-Patent Nr. 3.773.919), Copolymere von L-Glutaminsäure und γ-Ethyl-L-glutamat, nicht abbaubares Ethylenvinylacetat, abbaubare Milchsäure-Glykolsäure-Copolymere wie z.B. LUPRON DEPOTTM (injizierbare Mikrokügelchen, zusammengesetzt aus Milch-Glykolsäure-Copolymer und Leuprolidacetat) und Poly-D-(–)-3-hydroxybuttersäure. Während Polymere wie z.B. Ethylenvinylacetat und Milchsäure-Glykolsäure die Freisetzung von Molekülen über eine Zeitspanne von 100 Tagen ermöglichen, setzen bestimmte Hydrogele Proteine über kürzere Zeitspannen hinweg frei. Verbleiben eingekapselte Antikörperüber eine längere Zeit im Körper, so können sie als ein Resultat von Aussetzung gegenüber Feuchtigkeit bei 37°C denaturieren oder aggregieren, was zu einem Verlust von biologischer Aktivität und möglichen Veränderungen der Immunogenität führen kann. Je nach vorliegendem Mechanismus können rationale Vorgehensweisen zur Stabilisierung entwickelt werden. Stellt der Aggregationsmechanismus beispielsweise intermolekulare S-S-Bindungsbildung durch Thiodisulfidaustausch dar, so kann Stabilisierung durch Modifikation von Sulfhydrylresten, Lyophilisierung aus sauren Lösungen, Steuerung des Feuchtigkeitsgehalts, Verwendung geeigneter Additive und Entwicklung spezifischer Polymermatrizenzusammensetzungen erreicht werden.
  • G. Verwendungen für Anti-FGF-19-Antikörper
  • Die Anti-FGF-19-Antikörper der Erfindung haben verschiedene Einsatzbereiche. Beispielsweise können Anti-FGF-19-Antikörper in Diagnosetests für FGF-19, z.B. zur Detektion seiner Expression in spezifischen Zellen, Geweben oder Serum, verwendet werden. Verschiedene Diagnosetestverfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, können verwendet werden, wie beispielsweise Konkurrenzbindungstests, direkte oder indirekte Sandwichtests und Immunfällungstests, die entweder in heterogenen oder in homogenen Phasen durchgeführt werden [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., 147–158 (1987)]. Die in Diagnosetests verwendeten Antikörper können mit einer nachweisbaren Gruppierung markiert werden. Die nachweisbare Gruppierung sollte in der Lage sein, entweder direkt oder indirekt ein nachweisbares Signal abzugeben. Beispielsweise kann die nachweisbare Gruppierung ein Radioisotop, wie z.B. 3H, 14C, 32P, 35S oder 125I, eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Verbindung, wie z.B. Fluoresceinisothiocya nat, Rhodamin oder Luciferin, oder ein Enzym, wie z.B. alkalische Phosphatase, β-Galactosidase oder Meerrettichperoxidase, sein. Jedes beliebige Verfahren, das auf dem Gebiet der Erfindung zur Konjugation des Antikörpers an die nachweisbare Gruppierung bekannt ist, kann verwendet werden, einschließlich jener Verfahren, die von Hunter et al., Nature 144, 945 (1962); David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981); und Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982), beschrieben werden.
  • Anti-FGF-19-Antikörper sind auch zur Affinitätsreinigung von FGF-19 aus rekombinanter Zellkultur oder natürlichen Quellen nützlich. In diesem Verfahren werden die Antikörper gegen FGF-19 an einem geeigneten Träger, wie z.B. Sephadexharz oder Filterpapier, unter Verwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren immobilisiert. Der immobilisierte Antikörper wird dann mit einer Probe kontaktiert, die das zu reinigende FGF-19 enthält, und hiernach wird der Träger mit einem geeigneten Lösungsmittel gewaschen, das im Wesentlichen das gesamte Material in der Probe unter Ausnahme des FGF-19, das an den immobilisierten Antikörper gebunden ist, entfernt. Schließlich wird der Träger mit einem anderen geeigneten Lösungsmittel gewaschen, der das FGF-19 vom Antikörper freisetzt.
  • Die folgenden Beispiele werden ausschließlich als Veranschaulichung bereitgestellt und sollen den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung in keiner Weise einschränken.
  • BEISPIELE
  • Im Handel erhältliche Reagenzien, auf die in den Beispielen verwiesen wird, wurden, außer anders angemerkt, gemäß den Vorschriften der Hersteller verwendet. Die Quelle jener Zellen, die in den folgenden Beispielen und in der gesamten Beschreibung durch ATCC-Zugriffsnummern identifiziert werden, ist die American Type Culture Collection, Manassas, VA.
  • BEISPIEL 1
  • Isolierung von cDNA-Klonen, die für ein menschliches FGF-19 kodieren
  • Die EST-Sequenz der Zugriffsnummer AF007268, ein muriner Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF-15), wurde verwendet, um verschiedene öffentliche EST-Datenbanken (z.B. GenBank, Dayhoff usw.) zu durchsuchen. Die Suche wurde unter Verwendung des Computerprogramms BLAST oder BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266, 460–480 (1996)) in Form eines Vergleichs der ECD-Proteinsequenzen mit einer 6-Raster-Translation der EST-Sequenzen durchgeführt. Die Suche führte zu einem Treffer mit der GenBank EST AA220994, die als der neuronale STRATAGENE-NT2-Vorläufer 937230 identifiziert wurde. Die Sequenz von AA220994 wird hierin auch als DNA47412 bezeichnet.
  • Auf Grundlage der DNA47412-Sequenz wurden Oligonucleotide synthetisiert: 1) um mittels PCR eine cDNA-Bibliothek zu identifizieren, die die Sequenz von Interesse enthielt, und 2) zur Verwendung als Sonden, um einen Klon der Volllängen-Kodiersequenz für FGF-19 zu isolieren. Vorwärts- und Rückwärts-PCR-Primer weisen im Allgemeinen 20 bis 30 Nucleotide auf und sind oft so beschaffen, dass sie ein PCR-Produkt mit einer Länge von etwa 100–1.000 bp ergeben. Die Sondensequenzen weisen typischerweise eine Länge von 40–55 bp auf. In manchen Fällen werden zusätzliche Oligonucleotide synthetisiert, wenn die Consensussequenz länger als etwa 1–1,5 kbp ist. Um mehrere Bibliotheken auf einen Volllängenklon zu screenen, wurde DNA aus den Bibliotheken durch PCR-Amplifikation, wie von Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, s.o., beschrieben, mit dem PCR-Primerpaar gescreent. Eine positive Bibliothek wurde dann verwendet, um unter Verwendung des Sonden-Oligonucleotids und eines der Primerpaare Klone zu isolieren, die für das Gen von Interesse kodieren.
  • Die folgenden PCR-Primer (vorwärts und revers) wurden synthetisiert:
    Vorwärts-PCR-Primer 5'-ATCCGCCCAGATGGCTACAATGTGTA-3' (Seq.-ID Nr. 3), und
    Reverser PCR-Primer 5'-CCAGTCCGGTGACAAGCCCAAA-3' (Seq.-ID Nr. 4).
  • Darüber hinaus wurde eine synthetische Oligonucleotid-Hybridisierungssonde aus der DNA47412-Sequenz synthetisiert, die die folgende Nucleotidsequenz aufwies:
    Hybridisierungssonde 5'-GCCTCCCGGTCTCCCTGAGCAGTGCCAAACAGCGGCAGTGTA-3' (Seq.-ID Nr. 5).
  • RNA zur Konstruktion der cDNA-Bibliotheken wurde aus menschlichem fötalem Retinagewebe isoliert. Die zur Isolierung der cDNA-Klone verwendeten cDNA-Bibliotheken wurden mittels Standardverfahren unter Verwendung von handelsüblichen Reagenzien wie beispielsweise jenen von Invitrogen, San Diego, CA, konstruiert. Die cDNA wurde mit Oligo-dT, das eine NotI-Stelle enthielt, geprimt, mit dem stumpfen Ende an hemikinasierte SalI-Adaptoren gebunden, mit NotI gespalten, in geeigneter Weise durch Gelelektrophorese der Größe nach klassiert und in einer definierten Ausrichtung in einen geeigneten Kloniervektor (wie z.B. pRKB oder pRKD; pRKSB ist ein Vorläufer von pRKSD, der die SfiI-Stelle nicht enthält; siehe Holmes et al., Sciences 253, 1278–1280 (1991)) in die einmaligen XhoI- und NotI-Stellen kloniert.
  • DNA-Sequenzieren der wie zuvor beschrieben isolierten Klone ergab die DNA-Sequenz voller Länge für FGF-19-Polypeptid (hierin bezeichnet als DNA49435-1219 (1, Seq.-ID Nr. 1)) und die abgeleitete Proteinsequenz für dieses FGF-19-Polypeptid.
  • Der oben identifizierte Volllängen-Klon enthielt einen einzelnen offenen Leseraster mit einer eindeutigen Translationsstartstelle an Nucleotidpositionen 464–466 und ein Stoppsignal an Nucleotidpositionen 1112–1114 (1, Seq.-ID Nr. 1). Der vorhergesagte Polypeptidvorläufer ist 216 Aminosäuren lang, weist ein berechnetes Molekulargewicht von etwa 24.003 Da und einen geschätzten pI von etwa 6,99 auf. Analyse der in 2 gezeigten FGF-19-Sequenz voller Länge (Seq.-ID Nr. 2) beweist die Gegenwart zahlreicher wichtiger Polypeptiddomänen, wie in 2 gezeigt, worin die für jene wichtigen Polypeptiddomänen angegeben Positionen wie zuvor beschrieben nur ungefähre Angaben sind. Chromosomkartierung beweist, dass sich die für FGF- 19 kodierende Nucleinsäure an Chromosom 11q13.1, Bande q13.1, in Menschen kartiert. Der Klon DNA49435-1219 wurde bei der ATCC am 21. November 1997 hinterlegt und bekam die ATCC-Hinterlegungs-Nr. 209480 zugeteilt.
  • Eine Analyse der Dayhoff-Datenbank (Version 35.45 SwissProt 35) unter Verwendung der ALIGN-2-Sequenzabgleichanalyse der in 2 gezeigten Volllängensequenz (Seq.-ID Nr. 2) bewies die Sequenzidentität zwischen der FGF-19-Aminosäuresequenz und den folgenden Dayhoff-Sequenzen: AF007268_1, S54407, P_W52596, FGF2_ XENLA, P_W53793, AB002097_1, P_R27966, HSU67918_1, S23595 und P_R70824.
  • BEISPIEL 2
  • Verwendung von FGF-19 als eine Hybridisierungssonde
  • Das folgende Verfahren beschreibt die Verwendung einer für FGF-19 kodierenden Nucleotidsequenz als Hybridisierungssonde.
  • DNA, die die Kodiersequenz von Volllängen- oder reifem FGF-19 umfasst, wird als eine Sonde zum Screenen auf homologe DNAs (wie jene, die für natürlich vorkommende Varianten von FGF-19 kodieren) in cDNA-Bibliotheken aus menschlichem Gewebe oder genomischen Bibliotheken aus menschlichem Gewebe verwendet.
  • Hybridisieren und Waschen von Filtern, die beide Bibliotheks-DNAs enthalten, erfolgt unter den folgenden hochstringenten Bedingungen. Hybridisierung von radioaktiv markierter, von FGF-19 abgeleiteter Sonde an die Filter erfolgt in einer Lösung von 50% Formamid, 5 × SSC, 0,1% SDS, 0,1% Natriumpyrophosphat, 50 mM Natriumphosphat, pH 6,8, 2 × Denhardts Lösung und 10% Dextransulfat bei 42°C 20 Stunden lang. Waschen der Filter erfolgt in einer wässrigen Lösung von 0,1 × SSC und 0,1% SDS bei 42°C.
  • DNAs mit einer erwünschten Sequenzidentität mit der DNA, die für Volllängen-Nativsequenz-FGF-19 kodiert, kann dann unter Verwendung von herkömmlichen Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, identifiziert werden.
  • BEISPIEL 3
  • Expression von FGF-19 in E. coli
  • Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung einer unglykosylierten Form von FGF-19 durch rekombinante Expression in E. coli.
  • Die für FGF-19 kodierende DNA-Sequenz wird anfänglich unter Verwendung von selektierten PCR-Primern amplifiziert. Die Primer sollten Restriktionsenzymstellen enthalten, die den Restriktionsenzymstellen am ausgewählten Expressionsvektor entsprechen. Zahlreiche verschiedene Expressionsvektoren können verwendet werden. Ein Beispiel für einen geeigneten Vektor ist pBR322 (abgeleitet von E. coli; siehe Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977)), der Gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz enthält. Der Vektor wird mit Restriktionsenzym verdaut und dephosphoryliert. Die PCR-amplifizierten Sequenzen werden dann in den Vektor ligiert. Der Vektor umfasst vorzugsweise Sequenzen, die für ein antibiotisches Resistenzgen kodieren, einen trp-Promotor, einen Polyhis-Leader (einschließlich der ersten sechs STII-Codons, Poly-his-Sequenz und Enterokinase-Spaltungsstelle), die FGF-19-Kodierregion, λ-Transkriptionsterminator und ein argU-Gen.
  • Das Ligationsgemisch wird dann verwendet, um einen ausgewählten E.-coli-Stamm unter Verwendung der in Sambrook et al., s.o., beschriebenen Verfahren zu transformieren. Transformanten werden durch ihrer Fähigkeit identifiziert, auf LB-Platten zu wachsen, und antibiotische resistente Kolonien werden dann ausgewählt. Plasmid-DNA kann isoliert und durch Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzieren bestätigt werden.
  • Ausgewählte Klone können über Nacht in flüssigem Kulturmedium wie beispielsweise LB-Nährmedium, ergänzt mit Antibiotika, gezüchtet werden. Die Übernacht-Kultur kann in weiterer Folge verwendet werden, um eine Kultur größeren Ausmaßes zu inokulieren. Die Zellen werden dann bis zu einer erwünschten optischen Dichte gezüchtet, währenddessen der Expressionspromotor aktiviert wird.
  • Nach dem Kultivieren der Zellen über mehrere weitere Stunden hinweg können die Zellen durch Zentrifugation geerntet werden. Das durch die Zentrifugation erhaltene Zellpellet kann unter Verwendung verschiedener, auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Mittel solubilisiert werden, und das solubilisierte FGF-19-Protein kann dann unter Verwendung einer Metallchelatbildnersäule unter Bedingungen, die feste Bindung des Proteins ermöglichen, gereinigt werden.
  • FGF-19 kann in E. coli in einer poly-His-markierten Form unter Verwendung des folgenden Verfahrens exprimiert werden. Die für FGF-19 kodierende DNA wird anfänglich unter Verwendung selektierter PCR-Primer amplifiziert. Die Primer enthalten Restriktionsenzymstellen, die den Restriktionsenzymstellen am ausgewählten Expressionsvektor entsprechen, sowie andere nützliche Sequenzen, die für wirksame und zuverlässige Translationsinitiation, rasche Reinigung an einer Metallchelatbildungssäule und proteolytische Entfernung mit Enterokinase sorgen. Die PCR-amplifizierten, poly-His-markierten Sequenzen werden dann in einen Expressionsvektor ligiert, der verwendet wird, um einen E.-coli-Wirt, basierend auf Stamm 52 (W3110 fuhA(tonA) Ion galE rpoHts(htpRts) clpP(laclq)), zu transformieren. Transformanten werden zuerst in LB, das 50 mg/ml Carbenicillin enthält, bei 30°C unter Schütteln gezüchtet, bis eine O.D.600 von 3–5 erreicht ist. Kulturen werden dann 50- bis 100fach in CRAP-Medium (hergestellt durch Vermischen von 3,57 g (NH4)2SO4, 0,71 g Natriumcitrat·2H2O, 1,07 g KCl, 5,36 gDifco Hefeextrakt, 5,36 g Sheffield-Hycase SF in 500 ml Wasser sowie 110 mM MPOS, pH 7,3, 0,55% (Gew./Vol.) Glucose und 7 mM MgSO4) verdünnt und etwa 20–30 Stunden lang bei 30°C unter Schütteln gezüchtet. Proben werden dann entnommen, um Expression durch SDS-PAGE-Analyse zu überprüfen, und der Hauptteil der Kultur wird zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Zellpellets werden bis zur Reinigung und Neufaltung eingefroren.
  • E.-coli-Paste aus 0,5- bis 1-l-Fermentationen (6–10 g Pellets) wird in 10 Volumina (Gew./Vol.) in 7 M Guanidin, 20 mM Tris, pH 8 (Puffer) resuspendiert. Festes Natriumsulfit und Natriumtetrathiosulfat werden zugesetzt, um Endkonzentrationen von 0,1 M bzw. 0,02 M zu erreichen, und die Lösung wird über Nacht bei 4°C gerührt. Dieser Schritt führt zu einem denaturierten Protein, in dem alle Cysteinreste durch Sulfitolisierung blockiert sind. Die Lösung wird bei 40.000 U/min in einer Beckman-Ultrazentrifuge 30 min lang zentrifugiert. Der Überstand wird mit 3–5 Volumina Metallchelatsäulenpuffer (6 M Guanidin, 20 mM Tris, pH 7,4) verdünnt und durch 0,22-μm-Filter zur Klärung filtriert. Der geklärte Extrakt wird auf eine 5-ml-Qiagen-Ni-NTA-Metallchelatsäule geladen, die in Metallchelatsäulepuffer äquilibriert wurde. Die Säule wird mit zusätzlichem Puffer gewaschen, der 50 mM Imidazol (Calbiochem, Utrol-Gütegrad), pH 7,4, enthält. Das Protein wird mit Puffer, der 250 mM Imidazol enthält, eluiert. Die das erwünschte Protein enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und bei 4°C gelagert. Die Proteinkonzentration wird durch sein Absorptionsvermögen bei 280 nm unter Verwendung des berechneten Extinktionskoeffizienten basierend auf seiner Aminosäuresequenz geschätzt.
  • Die Proteine werden durch Verdünnen der Probe langsam in frisch hergestellten Neufaltungspuffer, der aus 20 mM Tris, pH 8,6, 0,3 M NaCl, 2,5 M Harnstoff, 5 mM Cystein, 20 mM Glycin und 1 mM EDTA besteht, neu gefaltet. Neufaltungsvolumina werden so ausgewählt, dass die Endproteinkonzentration zwischen 50 und 100 μg/ml liegt. Die Neufaltungslösung wird sanft bei 4°C 12–36 Stunden lang gerührt. Die Neufaltungsreaktion wird durch den Zusatz von TFA zu einer Endkonzentration von 0,4% (pH etwa 3) gequencht. Vor weiterer Reinigung des Proteins wird die Lösung durch ein 0,22-μm-Filter filtriert, und Acetonitril wird zur Erreichung einer 2–10%igen Endkonzentration zugesetzt. Das neugefaltete Protein wird an einer Poros-R1/H-Umkehrphasensäule unter Verwendung eines mobilen Puffers von 0,1% TFA mittels Elution mit einem Acetonitril-Gradienten von 10 bis 80% chromatographiert. Aliquoten von Fraktionen mit A280-Absorption werden an SDS-Polyacrylamidgelen analysiert, und Fraktionen, die homogenes neugefaltetes Protein enthalten, werden gesammelt. Im Allgemeinen werden die korrekt gefalteten Spezies der meisten Proteine bei den niedrigsten Konzentrationen von Acetonitril eluiert, da diese Speziesmit ih rem hydrophoben Inneren am kompaktesten und vor Wechselwirkung mit dem Umkehrphasenharz geschützt sind. Aggregierte Spezies werden üblicherweise bei höheren Acetonitrilkonzentrationen eluiert. Zusätzlich zum Auflösen fehlgefalteter Formen von Proteinen aus der erwünschten Form entfernt der Umkehrphasenschritt auch Endotoxin aus den Proben.
  • Fraktionen, die das erwünschte gefaltete FGF-19-Polypeptid enthalten, werden gesammelt, und das Acetonitril wird unter Verwendung eines sanften Stickstoffstroms, der auf die Lösung gerichtet ist, entfernt. Proteine werden in 20 mM Hepes, pH 6,8, mit 0,14 M Natriumchlorid und 4% Mannit durch Dialyse oder durch Gelfiltration unter Verwendung von G25-Superfine-Harzen (Pharmacia), äquilibriert im Formulierungspuffer, formuliert und steril filtriert.
  • BEISPIEL 4
  • Expression von FGF-19 in Säugetierzellen
  • Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung einer potenziell glykosylierten Form von FGF-19 durch rekombinante Expression in Säugetierzellen.
  • Der Vektor pRK5 (siehe die EP 307.247 , veröffentlicht am 15. März 1989) wird als der Expressionsvektor verwendet. Gegebenenfalls wird die FGF-19-DNA in pRK5 mit ausgewählten Restriktionsenzymen ligiert, um Insertion der FGF-19-DNA unter Verwendung von Ligationsverfahren, wie sie in Sambrook et al., s.o., beschrieben werden, zu ermöglichen. Der resultierende Vektor wird als pRK5-FGF-19 bezeichnet.
  • In einer Ausführungsform können die ausgewählten Wirtszellen 293-Zellen sein. Menschliche 293-Zellen (ATCC CCL 1573) werden bis zur Konfluenz in Gewebekulturplatten in Medium wie z.B. DMEM, ergänzt mit fötalem Kälberserum und gegebenenfalls Nährstoffkomponenten und/oder Antibiotika, gezüchtet. Etwa 10 μg pRK5-FGF-19-DNA werden mit etwa 1 μg DNA, die für das VA-RNA-Gen kodiert [Thimmappaya et al., Cell 31, 543 (1982)], vermischt und in 500 μl von 1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, 0,227 M CaCl2 aufgelöst. Zu diesem Gemisch werden 500 μl von 50 mM HEPES (pH 7,35), 280 mM NaCl, 1,5 mM NaPO4 zugetropft, und ein Niederschlag wird 10 min lang bei 25°C bilden gelassen. Der Niederschlag wird suspendiert, zu den 293-Zellen zugesetzt und etwa vier Stunden lang bei 37°C absetzen gelassen. Das Kulturmedium wird abgesaugt, und 2 ml von 20% Glycerin in PBS werden 30 Sekunden lang zugesetzt. Die 293-Zellen werden dann mit serumfreiem Medium gewaschen, frisches Medium wird zugesetzt, und die Zellen werden etwa 5 Tage lang inkubiert.
  • Etwa 24 Stunden nach den Transfektionen wird das Kulturmedium entfernt und durch Kulturmedium (alleine) oder Kulturmedium, das 200 μCi/ml 35S-Cystein und 200 μCi/ml 35S-Methionin enthält, ersetzt. Nach einer 12-stündigen Inkubation wird das konditionierte Medium gesammelt, an einem Zentrifugenfilter eingeengt und auf ein 15%iges SDS-Gel geladen. Das bearbeitete Gel kann getrocknet werden, und ein Film kann damit eine ausgewählte Zeitspanne lang belichtet werden, um die Gegenwart von FGF-19-Polypeptid aufzuzeigen. Die Kulturen, die transfizierte Zellen enthalten, können weiterer Inkubation (in serumfreiem Medium) unterzogen werden, und das Medium wird in ausgewählten Biotests getestet.
  • In einem alternativen Verfahren kann FGF-19 in 293-Zellen unter Verwendung des Dextransulfatverfahrens, das von Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 12, 7575 (1981), beschrieben wird, vorübergehend eingeführt werden. 293-Zellen werden in einem Zentrifugenkolben bis zu maximaler Dichte gezüchtet, und 700 μg pRK5-FGF-19-DNA werden zugesetzt. Die Zellen werden zuerst aus dem Zentrifugenkolben durch Zentrifugieren eingeengt und mit PBS gewaschen. Das DNA-Dextran-Präzipitat wird am Zellpellet vier Stunden lang inkubiert. Die Zellen werden mit 20% Glycerin 90 Sekunden lang behandelt, mit Gewebekulturmedium gewaschen und neuerlich in den Zentrifugenkolben, der Gewebekulturmedium, 5 μg/ml Rinderinsulin und 0,1 μg/ml Rindertransferrin enthält, eingeführt. Nach etwa vier Tagen wird das konditionierte Medium zentrifugiert und filtriert, um Zellen und Zelltrümmer zu entfernen. Die Probe, die exprimiertes FGF-19 enthält, kann dann eingeengt und mittels jedes beliebigen Verfahrens wie z.B. Dialyse und/oder Säulenchromatographie gereinigt werden.
  • In einer anderen Ausführungsform kann FGF-19 in CHO-Zellen exprimiert werden. Das pRK5-FGF-19 kann unter Verwendung bekannter Reagenzien wie beispielsweise CaPO4 oder DEAE-Dextran in CHO-Zellen transfiziert werden. Wie zuvor beschrieben können die Zellkulturen inkubiert und das Medium durch Kulturmedium (alleine) oder Medium, das eine radioaktive Markierung wie z.B. 35S-Methionin enthält, ersetzt werden. Nach Bestimmen der Gegenwart von FGF-19-Polypeptid kann das Kulturmedium durch serumfreies Medium ersetzt werden. Vorzugsweise werden die Kulturen etwa 6 Tage lang inkubiert, und dann wird das konditionierte Medium geerntet. Das das exprimierte FGF-19 enthaltende Medium kann dann konzentriert und durch jedes ausgewählte Verfahren gereinigt werden.
  • Epitop-markiertes FGF-19 kann auch in Wirts-CHO-Zellen exprimiert werden. Das FGF-19 kann aus dem pRK5-Vektor subkloniert werden. Das Subklon-Insert kann PCR unterzogen werden, um in Raster mit einer ausgewählten Epitopmarkierung wie beispielsweise einer poly-his-Markierung in einen Baculovirus-Expressionsvektor zu fusionieren. Das poly-His-markierte FGF-19-Insert kann dann in einen SV40-gesteuerten Vektor subkloniert werden, der einen Selektionsmarker wie z.B. DHFR zur Selektion stabiler Klone enthält. Schließlich können die CHO-Zellen (wie zuvor beschrieben) mit dem SV40-gesteuerten Vektor transfiziert werden. Es kann eine Markierung wie zuvor beschrieben angebracht werden, um Expression zu überprüfen. Das Kulturmedium, das das exprimierte poly-His-markierte FGF-19 enthält, kann dann eingeengt und durch jedes ausgewählte Verfahren wie z.B. durch Ni2+-Chelataffinitätschromatographie gereinigt werden.
  • FGF-19 kann auch in CHO- und/oder COS-Zellen durch ein Verfahren zur vorübergehenden Expression oder in CHO-Zellen durch ein anderes Verfahren zur stabilen Expression exprimiert werden.
  • Stabile Expression in CHO-Zellen wird unter Verwendung des folgenden Verfahrens durchgeführt. Die Proteine werden als ein IgG-Konstrukt (Immunoadhäsin) exprimiert, in dem die Kodiersequenzen für die löslichen Formen (z.B. extrazelluläre Domänen) der jeweiligen Proteine an eine IgG1-Konstantregionensequenz, die die Ge lenks-, CH2 und CH2-Domänen enthält und/oder eine poly-His-markierte Form ist, fusioniert werden.
  • Nach PCR-Amplifikation werden die jeweiligen DNAs in einem CHO-Expressionsvektor unter Verwendung herkömmlicher Verfahren wie in Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley & Sons (1997), beschrieben subkloniert. CHO-Expressionsvektoren werden so konstruiert, dass sie kompatible Restriktionsstellen 5' und 3' der DNA von Interesse aufweisen, um leichtes Verschieben von cDNAs zu ermöglichen. Der Vektor, der für Expression in CHO-Zellen verwendet wird, ist wie in Lucas et al., Nucl. Acids Res. 24(9), 1774–1779 (1996), beschrieben und verwendet den frühen SV40-Promotor/Enhancer, um Expression der cDNA von Interesse und von Dihydrofolatreductase (DHFR) zu steuern. DHFR-Expression ermöglicht Selektion für stabile Aufrechterhaltung des Plasmids nach erfolgter Transfektion.
  • 12 μg der erwünschten Plasmid-DNA werden in etwa 10 Millionen CHO-Zellen unter Verwendung von im Handel erhältlichen Transfektionsreagenzien Superfect® (Qiagen), Dosper® oder Fugene® (Boehringer Mannheim) eingeführt. Die Zellen werden wie in Lucas et al., s.o., beschrieben gezüchtet. Etwa 3 × 107 Zellen werde in einer Ampulle für weitere Züchtung und Herstellung wie nachstehend beschrieben eingefroren.
  • Die die Plasmid-DNA enthaltenden Ampullen werden durch Platzieren in ein Wasserbad aufgetaut und durch Verwirbeln vermischt. Die Inhalte werden in ein Zentrifugenröhrchen pipettiert, das 10 ml Medium enthält, und werden bei 1.000 U/min 5 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wird abgesaugt, und die Zellen werden in 10 ml selektivem Medium (0,2-μm-filtriertes PS20 mit 5% 0,2-μm-diafiltriertes fötales Rinderserum) resuspendiert. Die Zellen werden dann in einer 100-ml-Zentrifuge, die 90 ml selektives Medium enthält, aliquotiert. Nach 1–2 Tagen werden die Zellen in eine 250-ml-Zentrifuge, gefüllt mit 150 ml selektivem Wachstumsmedium, übertragen und bei 37°C inkubiert. Nach weiteren 2–3 Tagen werden 250-ml-, 500-ml- und 2.000-ml-Zentrifugen mit 3 × 105 Zellen/ml beimpft. Das Zellmedium wird durch frisches Medium durch Zentrifugieren und Resuspension in Produktionsmedium ausgetauscht. Obwohl jedes geeignete CHO-Medium verwendet werden kann, kann hier ein Produktionsmedium, das im US-Patent Nr. 5.122.469, ausgegeben am 16. Juni 1992, beschrieben wird, verwendet werden. Eine 3-l-Produktionszentrifuge wird bei einer Konzentration von 1,2 × 106 Zellen/ml beimpft. An Tag 0 wird der Zellanzahl-pH bestimmt. An Tag 1 werden der Zentrifuge Proben entnommen, und Hindurchperlenlassen von filtrierter Luft wird begonnen. An Tag 2 werden der Zentrifuge Proben entnommen, die Temperatur wird auf 33°C geändert, und 30 ml von 500 g/l Glucose und 0,6 ml von 10%igem Antischaummittel (z.B. 35%ige Polydimethylsiloxanemulsion, Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion) werden genommen. Im Laufe der Produktion wird der pH sofern erforderlich eingestellt, um ihn auf etwa 7,2 zu halten. Nach 10 Tagen, oder sobald die Lebensfähigkeit auf unter 70% abgefallen ist, wird die Zellkultur durch Zentrifugieren und Filtrieren durch ein 0,22-μm-Filter geerntet. Das Filtrat wurde entweder bei 4°C gelagert oder sofort auf Säulen zur Reinigung geladen.
  • Für die poly-His-markierten Konstrukte wurden die Proteine unter Verwendung einer Ni-NTA-Säule (Qiagen) gereinigt. Vor der Reinigung wird Imidazol zu dem konditionierten Medium zu einer Konzentration von 5 mM zugesetzt. Das konditionierte Medium wird auf eine 6-ml-Ni-NTA-Säule, äquilibriert in 20 mM Hepes-Puffer, pH 7,4, der 0,3 M NaCl und 5 mM Imidazol enthält, bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 4–5 ml/min bei 4°C gepumpt. Nach dem Laden wird die Säule mit zusätzlichem Äquilibrierungspuffer gewaschen, und das Protein wird mit Äquilibrierungspuffer, der 0,25 M Imidazol enthält, eluiert. Das hochgereinigte Protein wird daraufhin in einen Ladepuffer, der 10 mM Hepes, 0,14 M NaCl und 4% Mannit, pH 6,8, enthält, mit einer 25-ml-G25-Superfine-Säule (Pharmacia) entsalzt und bei –80°C gelagert.
  • (Fc-hältige) Immunoadhäsin-Konstrukte werden aus dem konditionierten Medium wie folgt gereinigt. Das konditionierte Medium wird auf eine 5-ml-Protein-A-Säule (Pharmacia) gepumpt, die in 20 mM Na-Phosphatpuffer, pH 6,8, äquilibriert wurde. Nach dem Laden wird die Säule ausführlich mit Äquilibrierungspuffer gewaschen, bevor mit 100 mM Zitronensäure, pH 3,5, eluiert wird. Das eluierte Protein wird unverzüglich durch Sammeln von 1-ml-Fraktionen in Röhrchen, die 275 μl von 1 M Tris-Puffer, pH 9, enthält, neutralisiert. Das hochgereinigte Protein wird daraufhin in Ladepuffer wie zuvor für die poly-His-markierten Proteine beschrieben entsalzt. Die Homogenität wird durch SDS-Polyacrylamidgele und durch Sequenzieren N-terminaler Aminosäuren durch Edman-Abbau bewertet.
  • BEISPIEL 5
  • Expression von FGF-19 in Hefe
  • Das folgende Verfahren beschreibt rekombinante Expression von FGF-19 in Hefe.
  • Zuerst werden Hefe-Expressionsvektoren zur intrazellulären Produktion oder Sekretion von FGF-19 aus dem ADH2/GAPDH-Promotor konstruiert. DNA, die für FGF-19 und den Promotor kodiert, wird in geeignete Restriktionsenzymstellen im selektierten Plasmid insertiert, um intrazelluläre Expression von FGF-19 zu steuern. Zur Sekretion kann für FGF-19 kodierende DNA zusammen mit DNA, die für den ADH2/GAPDH-Promotor, ein natives FGF-19-Signalpeptid oder ein anderes Säugetier-Signalpeptid kodiert, oder beispielsweise einer Hefe-α-Faktor- oder -Invertase-Sekretionssignal/Leadersequenz und Linkersequenzen (sofern erforderlich) zur Expression von FGF-19 in das selektierte Plasmid kloniert werden.
  • Hefezellen, wie z.B. Hefestamm AB110, können dann mit den zuvor beschriebenen Expressionsplasmiden transformiert und in ausgewähltem Fermentationsmediumkultiviert werden. Die Überstände transformierter Hefe können durch Fällen mit 10% Trichloressigsäure und durch Trennen durch SDS-PAGE, gefolgt von Färben der Gele mit Coomassie-Blaufärbung, analysiert werden.
  • Rekombinantes FGF-19 kann daraufhin isoliert und durch Entfernen der Hefezellen aus dem Fermentationsmedium durch Zentrifugieren und anschließendes Einengen des Mediums unter Verwendung ausgewählter Patronenfilter gereinigt werden. Das FGF-19-hältige Konzentrat kann weiters unter Verwendung ausgewählter Säulenchromatographieharze gereinigt werden.
  • BEISPIEL 6
  • Expression von FGF-19 in mit Baculovirus infizierten Insektenzellen
  • Das folgende Verfahren beschreibt rekombinante Expression von FGF-19 in mit Baculovirus infizierten Insektenzellen.
  • Die für FGF-19 kodierende Sequenz wird stromab einer Epitopmarkierung, die in einem Baculovirus-Expressionsvektor enthalten ist, fusioniert. Solche Epitop-Markierungen umfassen poly-Nis-Markierungen und Immunglobulinmarkierungen (wie Fc-Regionen von IgG). Zahlreiche verschiedene Plasmide können verwendet werden, einschließlich Plasmiden, die aus im Handel erhältlichen Plasmiden wie z.B. pVL1393 (Novagen) stammen. Kurz zusammengefasst wird die für FGF-19 kodierende Sequenz oder der erwünschte Abschnitt der Kodiersequenz von FGF-19, wie z.B. die Sequenz, die für die extrazelluläre Domäne eines Transmembranproteins kodiert, oder die Sequenz, die für das reife Protein kodiert, sofern das Protein extrazellulär ist, durch PCR mit Primern, die zu den 5'- und 3'-Regionen komplementär sind, amplifiziert. Der 5'-Primer kann flankierende (selektierte) Restriktionsenzymstellen inkorporieren. Das Produkt wird dann mit jenen ausgewählten Restriktionsenzymen verdaut und in den Expressionsvektor subkloniert.
  • Rekombinantes Baculovirus wird durch Co-Transfektion des obigen Plasmids und BaculoGoldTM-Virus-DNA (Pharmingen) in Spodoptera-frugiperda- ("Sf9"-) Zellen (ATCC CRL 1711) unter Verwendung von Lipofectin (im Handel bei GIBCO-BRL erhältlich) hergestellt. Nach 4–5 Tagen Inkubation bei 28°C werden die freigesetzten Viren geerntet und zur weiteren Amplifikation verwendet. Virale Infektion und Proteinexpression werden wie von O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994), beschrieben durchgeführt.
  • Exprimiertes poly-His-markiertes FGF-19 kann dann, beispielsweise durch Ni2+-Chelataffinitätschromatographie, wie folgt gereinigt werden. Extrakte werden aus rekombinanten, virusinfizierten Sf9-Zellen wie von Rupert et al., Nature 362, 175–179 (1993), beschrieben hergestellt. Kurz zusammengefasst werden Sf9-Zellen gewaschen, in Beschallungspuffer (25 ml Hepes, pH 7,9; 12,5 mM MgCl2; 0,1 mM EDTA; 10% Glycerin, 0,1% NP-40; 0,4 M KCl) resuspendiert und zweimal 20 Sekunden lang auf Eis beschallt. Die beschallten Produkte werden durch Zentrifugation geklärt, und der Überstand wird 50fach in Ladepuffer (50 mM Phosphat, 300 mM NaCl, 10% Glycerin, pH 7,8) verdünnt und durch ein 0,45-μm-Filter filtriert. Eine Ni2+-NTA-Agarosesäule (im Handel bei Qiagen erhältlich) wird mit einem Bettvolumen von 5 ml hergestellt, mit 25 ml Wasser gewaschen und mit 25 ml Ladepuffer äquilibriert. Der filtrierte Zellextrakt wird auf die Säule bei 0,5 ml proMinute geladen. Die Säule wird mit Ladepuffer zu A280-Basislinie gewaschen, ein Punkt, an dem Fraktionssammlung gestartet wird. Als Nächstes wird die Säule mit einem sekundären Waschpuffer (50 mM Phosphat; 300 mM NaCl, 10% Glycerin, pH 6,0) gewaschen, der nicht spezifisch gebundenes Protein eluiert. Nach neuerlichem Erreichen der A280-Basislinie wird die Säule mit einem 0- bis 500-mM-Imidazolgradienten im sekundären Waschpuffer entwickelt. 1-ml-Fraktionen werden gesammelt und durch SDS-PAGE und Silberfärbung oder Western-Blot mit Ni2+-NTA konjugiert an alkalische Phosphatase (Qiagen) analysiert. Fraktionen, die das eluierte His10-markierte FGF-19 enthalten, werden gesammelt und gegen Ladepuffer dialysiert.
  • Alternativ dazu kann Reinigung des IgG-markierten (oder Fc-markierten) FGF-19 unter Verwendung bekannter Chromatographieverfahren, einschließlich beispielsweise Protein-A- oder Protein-G-Säulenchromatographie, durchgeführt werden.
  • BEISPIEL 7
  • Herstellung von Antikörpern, die FGF-19 binden
  • Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung monoklonaler Antikörper, die sich spezifisch an FGF-19 binden können.
  • Verfahren zur Herstellung der monoklonalen Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und werden beispielsweise in Goding, s.o., beschrieben. Immunogene, die verwendet werden können, umfassen gereinigtes FGF-19, Fusionsproteine, die FGF-19 enthalten, und Zellen, die rekombinantes FGF-19 an der Zelloberfläche exprimieren. Die Auswahl des Immunogens können Fachleute ohne übermäßiges Experimentieren treffen.
  • Mäuse, wie z.B. Balb/c, werden mit dem FGF-19-Immunogen immunisiert, das in komplettem Freundschem Adjuvans emulgiert und subkutan oder intraperitoneal in einer Menge von 1 bis 100 μg injiziert wird. Alternativ dazu wird das Immunogen in MPL-TDM-Adjuvans (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) emulgiert und in die Fußballen der Hinterläufe der Tiere injiziert. Die immunisierten Mäuse werden dann 10 bis 12 Tage später mit zusätzlichem Immunogen, das im ausgewählten Adjuvans emulgiert ist, geboostet. Hiernach können die Mäuse auch für mehrere Wochen mit zusätzlichen Immunisierungsinjektionen geboostet werden. Serumproben können den Mäusen durch retroorbitale Blutabnahme zum Testen mittels ELISA-Tests zur Detektion von Anti-FGF-19-Antikörpern in periodisch Abständen entnommen werden.
  • Nachdem ein geeigneter Antikörpertiter nachgewiesen wurde, kann den Tieren mit "positiven" Antikörperwerten eine letzte intravenöse Injektion von FGF-19 verabreicht werden. Drei oder vier Tage später werden die Mäuse getötet und die Milzzellen geerntet. Die Milzzellen werden dann an eine selektierte Mausmyelomzelllinie wie z.B. P3X63AgU.1, die bei der ATCC, Nr. CRL 1597, erhältlich ist, (unter Verwendung von 35% Polyethylenglykol) fusioniert. Die Fusionen bilden Hybridomzellen, die dann in 96-Well-Gewebekulturplatten, welche HAT- (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) Medium enthalten, ausplattiert werden, um Proliferation von nicht-fusionierten Zellen, Myelomhybriden und Milzzellhybriden zu hemmen.
  • Die Hybridomzellen werden in einem ELISA auf Reaktivität gegen FGF-19 gescreent. Bestimmung von "positiven" Hybridomzellen, die die erwünschten monoklonalen Antikörper gegen FGF-19 sekretieren, liegt im Bereich der Erfindung.
  • Die positiven Hybridomzellen können intraperitoneal in syngenetische Balb/c-Mäuse injiziert werden, um Ascites zu produzieren, die die monoklonalen Anti-FGF-19-Antikörper enthalten. Alternativ dazu können die Hybridomzellen in Gewebekulturkolben oder Rollflaschen gezüchtet werden. Reinigung der monoklonalen Antikörper, die in Ascites produziert werden, kann unter Verwendung von Ammoniumsulfatfällung, gefolgt von Gelausschlusschromatographie, erfolgen. Alternativ dazu kann Affinitätschromatographie basierend auf Bindung von Antikörper an Protein A oder Protein G verwendet werden.
  • BEISPIEL 8
  • Reinigung von FGF-19-Polypeptiden unter Verwendung spezifischer Antikörper
  • Native oder rekombinante FGF-19-Polypeptide können mittels zahlreicher verschiedener Verfahren zur Proteinreinigung, die auf dem Gebiet der Erfindung Standard sind, gereinigt werden. Beispielsweise wird pro-FGF-19-Polypeptid, reifes FGF-19-Polypeptid oder prä-FGF-19-Polypeptid mittels Immunaffinitätschromatographie unter Verwendung von Antikörpern, die für das FGF-19-Polypeptid von Interesse spezifisch sind, gereinigt. Im Allgemeinen wird eine Immunaffinitätssäule durch kovalentes Binden des anti-FGF-19-Polypeptidantikörpers an ein aktiviertes Chromatographieharz konstruiert.
  • Polyklonale Immunglobuline werden aus Immunseren entweder durch Fällung mit Ammoniumsulfat oder durch Reinigung an immobilisiertem Protein A (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N. J.) hergestellt. In ähnlicher Weise werden monoklonale Antikörper aus Maus-Ascitesflüssigkeit durch Ammoniumsulfatfällung oder durch Chromatographie an immobilisiertem Protein A hergestellt. Teilweise gereinigtes Immunglobulin wird kovalent an ein Chromatographieharz wie z.B. CnBr-aktivierte SEPHAROSETM (Pharmacia LKB Biotechnology) gebunden. Der Antikörper wird an das Harz gebunden, das Harz wird blockiert, und das Derivatharz wird gemäß den Anweisungen des Herstellers gewaschen.
  • Solch eine Immunaffinitätssäule wird zur Reinigung von FGF-19-Polypeptid durch Herstellung einer Fraktion von Zellen, die FGF-19-Polypeptid in einer löslichen Form enthält, verwendet. Dieses Präparat wird durch Solubilisierung der ganzen Zelle oder einer subzellulären Fraktion, die durch differenzielles Zentrifugieren durch den Zusatz von Detergens oder mittels anderer Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, erhalten wurde, abgeleitet. Alternativ dazu kann lösliches FGF-19-Polypeptid, das eine Signalsequenz enthält, in nützlicher Menge in das Medium sekretiert werden, in dem die Zellen gezüchtet werden.
  • Ein lösliches FGF-19-Polypeptid-hältiges Präparat wird über eine Immunaffinitätssäule geführt, und die Säule wird unter Bedingungen gewaschen, die die präferenzielle Absorption von FGF-19-Polypeptid ermöglichen (z.B. Puffer mit hoher Ionenstärke in Gegenwart von Detergens). Dann wird die Säule unter Bedingungen eluiert, die Antikörper/FGF-19-Polypeptid-Bindung aufbrechen (z.B. ein Puffer mit niedrigem pH wie etwa pH 2–3 oder eine hohe Konzentration eines Chaotrops wie z.B. Harnstoff oder Thiocyanation), und FGF-19-Polypeptid wird gesammelt.
  • BEISPIEL 9
  • Wirkstoff-Screenen
  • Diese Erfindung ist besonders nützlich zum Screenen von Verbindungen unter Verwendung von FGF-19-Polypeptiden oder Bindungsfragmenten davon im Rahmen eines von zahlreichen verschiedenen Screeningverfahren. Das FGF-19-Polypeptid oder -Fragment, das in solch einem Test verwendet wird, kann entweder frei in Lösung, fixiert an einen festen Träger, an einer Zelloberfläche getragen oder intrazellulär angeordnet sein. Ein Verfahren zum Wirkstoff-Screenen verwendet eukaryotische oder prokaryotische Wirtszellen, die mit rekombinanten Nucleinsäuren, die das FGF-19-Polypeptid oder -Fragment exprimieren, stabil transformiert sind. Wirkstoffe werden gegen solche transformierten Zellen in Konkurrenzbindungstests gescreent. Solche Zellen, entweder in lebensfähiger oder in fixierter Form, können für herkömmliche Bindungstests verwendet werden. Es kann beispielsweise die Bildung von Komplexen zwischen FGF-19-Polypeptid oder einem -Fragment und dem zu testenden Mittel gemessen werden. Alternativ dazu kann die Abnahme von Komplexbildung zwischen dem FGF-19-Polypeptid und seiner Targetzelle oder seinen Targetrezeptoren untersucht werden, die durch das zu testende Mittel verursacht wird.
  • Somit stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Screenen auf Wirkstoffe oder auf beliebige andere Mittel bereit, die mit FGF-19-Polypeptid assoziierte Erkrankungen oder Leiden beeinflussen können. Diese Verfahren umfassen das Kontaktieren solch eines Mittels mit einem FGF-19-Polypeptid oder Fragment davon und das Testen (I) auf die Gegenwart eines Komplexes zwischen dem Mittel und dem FGF-19-Polypeptid oder -Fragment oder (II) auf die Gegenwart eines Komplexes zwischen dem FGF-19-Polypeptid oder -Fragment und der Zelle mittels auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Verfahren. In solchen Konkurrenzbindungstests wird das FGF-19-Polypeptid oder -Fragment typischerweise markiert. Nach geeigneter Inkubation wird freies FGF-19-Polypeptid oder -Fragment von dem, das in gebundener Form vorliegt, getrennt, und die Menge an freier oder nicht komplexierter Markierung stellt ein Maß für die Fähigkeit des bestimmten Mittels dar, sich an FGF-19-Polypeptid zu binden oder den FGF-19-Polypeptid/Zell-Komplex zu stören.
  • Ein anderes Verfahren zum Wirkstoff-Screenen sorgt für Screenen mit hohem Durchsatz von Verbindungen mit geeigneter Bindungsaffinität an ein Polypeptid und wird in der WO 84/03564, veröffentlicht am 13. September 1984, detailliert beschrieben. Kurz zusammengefasst wird eine große Anzahl an verschiedenen Testverbindungen kleiner Peptide an einem festen Substrat, wie z.B. an Kunststoffstiften oder einer anderen Oberfläche, synthetisiert. Nachdem sie auf ein FGF-19-Polypeptid aufgetragen wurden, werden Peptidtestverbindungen mit FGF-19-Polypeptid umgesetzt und gewaschen. Gebundenes FGF-19-Polypeptid wird mittels auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Verfahren nachgewiesen. Gereinigtes FGF-19-Polypeptid kann zur Verwendung in den zuvor genannten Wirkstoff-Screening-Verfahren auch direkt auf Platten beschichtet werden. Darüber hinaus können nicht-neutralisierende Antikörper verwendet werden, um das Peptid einzufangen und es am festen Träger zu immobilisieren.
  • Diese Erfindung erwägt auch die Verwendung von kompetitiven Wirkstoff-Screeningtests, in denen neutralisierende Antikörper, die in der Lage sind, FGF-19-Polypeptid zu binden, spezifisch mit einer Testverbindung um Bindung an FGF-19-Polypeptid oder Fragmenten davon konkurrieren. Auf diese Weise können die Antikörper verwendet werden, um die Gegenwart jedes beliebigen Peptids nachzuweisen, das mit FGF-19-Polypeptid eine oder mehrere antigene Determinanten gemeinsam hat.
  • BEISPIEL 10
  • Rationales Wirkstoffdesign
  • Das Ziel von rationalem Wirkstoffdesign ist die Herstellung struktureller Analoga von biologisch aktivem Polypeptid von Interesse (z.B. von einem FGF-19-Polypeptid) oder von kleinen Molekülen, mit denen sie wechselwirken, z.B. Agonisten, Antagonisten oder Inhibitoren. Jedes dieser Beispiele kann verwendet werden, um Wirkstoffe zu entwerten, die aktivere oder stabilere Formen des FGF-19-Polypeptids sind oder die die Funktion des FGF-19-Polypeptids in vivo verstärken oder stören (vgl. Hodgson, Bio/Technology 9, 19–21 (1991)).
  • In einem Ansatz wird die dreidimensionale Struktur des FGF-19-Polypeptids oder eines FGF-19-Polypeptid-Inhibitor-Komplexes durch Röntgenkristallographie, durch Computermodellierung oder, was am häufigsten vorkommt, durch eine Kombination der zwei Ansätze bestimmt. Sowohl die Form als auch die Ladungen des FGF-19-Polypeptids müssen bestimmt werden, um die Struktur erkennen zu können und um (eine) aktive Stelle(n) des Moleküls zu identifizieren. Weniger häufig können nützliche Informationen hinsichtlich der Struktur des FGF-19-Polypeptids durch Modellieren auf Grundlage der Struktur homologer Proteine gewonnen werden. In beiden Fällen wird relevante strukturelle Information verwendet, um analoge FGF-19-Polypeptid-ähnliche Moleküle zu entwerfen oder um wirksame Inhibitoren zu identifizieren. Nützliche Beispiele für rationales Wirkstoffdesign können Moleküle umfassen, die verbesserte Aktivität oder Stabilität aufweisen, wie von Braxton & Wells, Biochemistry 31, 7796–7801 (1992), gezeigt wird, oder die als Inhibitoren, Agonisten oder Antagonisten von nativen Peptiden wirken, wie von Athauda et al., J. Biochem. 113, 742–746 (1993), gezeigt wird.
  • Auch ist es möglich, einen Target-spezifischen Antikörper zu isolieren, der wie zuvor beschrieben durch funktionelle Tests selektiert wird, und dann seine Kristallstruktur aufzuklären. Dieser Ansatz ergibt im Prinzip ein Pharmakor, auf Grundlage dessen Wirkstoffdesign vollzogen werden kann. Es ist möglich, Proteinkristallographie ganz zu umgehen, indem anti-idiotypische Antikörper (anti-ids) zu einem funktionellen, pharmakologisch aktiven Antikörper gebildet werden. Es wird erwartet, dass, als ein Spiegelbild eines Spiegelbildes, die Bindungsstelle der anti-ids analog zu dem Originalrezeptor ist. Der anti-id könnte dann verwendet werden, um Peptide aus Banken chemisch oder biologisch hergestellter Peptide zu identifizieren und zu isolieren. Die isolierten Peptide würden dann als der Pharmakor wirken.
  • Durch die vorliegende Erfindung können ausreichende Mengen des FGF-19-Polypeptids verfügbar gemacht werden, um solche analytischen Studien wie z.B. Röntgenkristallographie durchzuführen. Darüber hinaus liefert die Kenntnis der hierin bereitgestellten FGF-19-Polypeptid-Aminosäuresequenz einen Leitfaden für jene, die Computermodellierungsverfahren anstelle von oder zusätzlich zu Röntgenkristallographie verwenden.
  • BEISPIEL 11
  • Untersuchung von Gewicht, Legtinkonzentration, Nahrungsmittelaufnahme Urinabgabe, Sauerstoffverbrauch und der Konzentrationen von Triglyceriden und freien Fettsäuren in transgenen FGF-19-Mäusen
  • Wie hierin beschrieben wurde FGF-19 als ein Mitglied einer immer größer werdenden Familie von sekretierten Proteinen, die mit Fibroblastenwachstumsfaktor verwandt sind, neu identifiziert. Für FGF-19 wurde hierin erkannt, dass es mit FGF-Rezeptor 4 wechselwirkt und nicht als ein Mitogen zu wirken scheint. Um die Funktionen dieses Proteins näher zu untersuchen, wurden transgene Mäuse gezüchtet, die menschliches FGF-19 exprimieren.
  • Insbesondere wurde die für menschliches FGF-19 kodierende cDNA in ein Plasmid kloniert, das den Promotor für Myosin-Leichtkette enthält. Dieser Promotor ist für muskelspezifische Transkription des Transgens ausreichend. Ein Spleißakzeptor und ein Spleißdonor wurden ebenfalls 5' zur FGF-19-cDNA eingebunden, um das Expressionsniveau zu erhöhen, und ein Spleißdonor und Spleißakzeptor mit einem Poly-A-Additionssignal wurden 3' zur FGF-19-cDNA eingebunden, um das Transkriptionsniveau zu erhöhen und um eine Transkriptionsterminationsstelle bereitzustellen.
  • Die den MLC-Promotor umfassende DNA, der 5'-Spleißakzeptor und -donor, die FGF-19-cDNA und der 3'-Spleißakzeptor und -donor sowie die Transkriptionsterminationsstelle (das Transgen) wurden aus den Bakterienvektorsequenzen unter Verwendung geeigneter Restriktionsenzyme freigesetzt und nach Größenfraktionierung an Agarosegelen gereinigt. Die gereinigte DNA wurde in einen Vorkern befruchteter Mäuseeizellen injiziert, und transgene Mäuse wurden wie beschrieben gebildet und identifiziert (Genetic Modification of Animals; Tim Stewart; in: Exploring Genetic Mechanisms, 565–598 (1997), M. Singer & P. Perg (Hrsg.); University Science Books; Sausalito, Kalifornien). Die Mäuse waren zum Zeitpunkt der Abnahme der Messwerte, wie unten beschrieben, für Wasseraufnahme, Nahrungsmittelaufnahme, Urinabgabe und Hämatokritwert sechs Wochen alt. Die Messungen der Konzentrationen von Leptin, Triglyceriden und freien Fettsäuren wurden an denselben Tieren im Alter von acht Wochen durchgeführt.
  • Wie die nachstehend erläuterten Resultate zeigen, wiesen diese Mäuse eine erhöhte Nahrungsmittelaufnahme und eine erhöhte Stoffwechselrate auf, wofür das Ausmaß des Sauerstoffverbrauchs als Beweis steht. Trotz der erhöhten Nahrungsmittelaufnahme wiegen diese Mäuse signifikant weniger als ihre nicht-transgenen Wurfgeschwister. Dieses reduzierte Körpergewicht scheint eine Folge von verringerter Adipositas zu sein, da Leptin, das eng mit Fettgewebemasse in Menschen und Nagetieren in Zusammenhang steht, in den transgenen Mäusen in reduzierter Konzentration vorhanden ist. Was diese Beobachtung weiters unterstützt, ist die Tatsache, dass die transgenen Mäuse normales lineares Wachstum aufweisen, wie durch Messungen der Länge von der Schnauze bis zum Steiß gezeigt wird. Sie sind bezüglich Körper temperatur, Körper (Knochenlänge) und Blutwerten normal. Parallel zur erhöhten Nahrungsmittelaufnahme ist bei den transgenen Mäusen auch erhöhte Urinabgabe zu beobachten. Da die Mäuse nicht mehr zu trinken scheinen und, wie durch einen normalen Hämatokritwert gezeigt werden kann, auch nicht dehydratisiert sind, kann die höhere Urinabgabe aus dem Stoffwechsel der erhöhten Nahrungszufuhr resultieren. Da FGF-19 Adipositas senkt, ohne weder die Muskelmasse noch lange Knochenstrukturen zu verändern, erweist sich FGF-19 als ein wirksames Therapeutikum zur Behandlung von Adipositas und damit assoziierten Leiden.
  • Genauer beschrieben wurden die transgenen MLC-FGF-19-Mäuse zu verschiedenen Zeitpunkten unter verschiedenen Fasten- und Fütterbedingungen gewogen. Die Gruppe weiblicher transgener FGF-19-Mäuse und ihre nicht-transgenen Wurfgeschwister wurde im Alter von sechs Wochen bei beliebiger Fütterung und nach 6- und 24-stündigem Fasten sowie 24 h nach Abschluss einer 24-stündigen Fastenzeit gewogen. Wie in 3A gezeigt wogen die transgenen FGF-19-Mäuse (volle Säulen) unter allen Bedingungen weniger als ihre nicht-transgenen Wildtyp-Wurfgeschwister (gepunktete Säulen).
  • 3B zeigt die Seren derselben Gruppen von Mäusen, die in 3A dargestellt sind, die auf Leptin getestet wurden. Die reduzierte Leptinkonzentration in den transgenen FGF-19-Mäusen stimmt mit den geringeren Körpergewichten (3A) überein, die auf verringerte Adipositas zurückzuführen sind.
  • Eine Gruppe von 6 Wochen alten, transgenen Mäusen wurde bezüglich ihrer Nahrungsmittelaufnahme (4A), Wasseraufnahme (4B), Urinabgabe (4C) und ihres Hämatokritwerts (4D) beobachtet. Wie aus den Fig. ersichtlich ist, nehmen die transgenen FGF-19-Mäuse (volle Säulen) mehr Nahrung als ihre Wildtyp-Wurfgeschwister auf, trinken jedoch nicht mehr. Auch wenn die Wasseraufnahme nicht verändert ist, produzieren die transgenen Mäuse mehr Urin (4C). Trotz der höheren Urinabgabe scheinen die transgenen Mäuse nicht dehydratisiert zu sein, wofür der normale Hämatokritwert als Beweis steht (4D).
  • Das reduzierte Körpergewicht (3) bei gleichzeitiger erhöhter Nahrungsmittelaufnahme (4) könnte durch eine Steigerung der Stoffwechselrate erklärt werden. Die Stoffwechselrate wurde durch Messen des Sauerstoffverbrauchs bestimmt. Wie in 5 gezeigt, weisen die transgenen FGF-19-Mäuse eine erhöhte Stoffwechselrate während beider Lichtzyklen auf, wobei der eine einer 24-stündigen Fastenzeit folgte und der andere 24 h nach Abschluss einer 24-stündigen Fastenzeit stattfand.
  • Adipositas und erhöhte Konzentrationen an Triglyceriden und freien Fettsäuren sind Risikofaktoren für kardiovaskuläre Erkrankungen. Da FGF-19 einen der Risikofaktoren für kardiovaskuläre Erkrankungen (Adipositas, 3) reduziert, wurde nun untersucht, ob FGF-19 auch andere Risikofaktoren reduzieren könnte. Wie in 6 ersichtlich ist, ist die Konzentration an Triglyceriden und freien Fettsäuren (FFA) in den transgenen FGF-19-Mäusen ebenfalls geringer.
  • BEISPIEL 12
  • FGF-19-Infusion führt zu einer Steigerung der Nahrungsmittelaufnahme und zu einer Steigerung des Sauerstoffverbrauchs
  • Um zu bestätigen, dass die in den transgenen FGF-19-Mäusen beobachteten Wirkungen durch das FGF-19-Protein hervorgerufen worden waren, wurde Gruppen von nicht-transgenen FvB-Mäusen rekombinantes FGF-19 (1 mg/kg/Tag, iv), bereitgestellt durch eine osmotisch betriebene, implantierte Pumpe, über Infusion verabreicht. Wie in den 7A–B gezeigt, führt die Verabreichung von rekombinantem menschlichem FGF-19 im Vergleich zu Mäusen, denen nur der Träger alleine verabreicht worden war, zu einer Steigerung der Nahrungsmittelaufnahme. Darüber hinaus führt die FGF-19-Infusion zu einer erhöhten Stoffwechselrate, wie durch den Sauerstoffverbrauch gemessen wurde.
  • BEISPIEL 13
  • FGF-19 senkt die Glucose-Aufnahme und steigert die Freisetzung von Leptin aus Adipozyten
  • Um den Mechanismus, durch den FGF-19 den Stoffwechsel verändert, näher zu untersuchen, wurde rekombinantes menschliches FGF-19 zu Kulturen von primären Ratten-Adipozyten zugesetzt, und die Glucose-Aufnahme und Leptin-Freisetzung durch die Zellen wurde gemessen. Wie in den 8A–B gezeigt, steigert FGF-19 die Freisetzung von Leptin aus und reduziert die Aufnahme von Glucose in primäre(n) Ratten-Adipozyten.
  • BEISPIEL 14
  • Untersuchung von Glucose-Verträglichkeit und Fettpolstergewichten an transgenen FGF-19-Mäusen, die mit Hochfettdiäten gefüttert wurden
  • Im Allgemeinen nehmen Mäuse (und Menschen) bei einer Hochfettdiät an Gewicht und Adipositas zu und werden entweder Glucose-intolerant oder diabetisch. Um zu untersuchen, ob die Aussetzung gegenüber FGF-19 eine Auswirkung auf die Adipositas und Glucose-Unverträglichkeit zeigt, wurden Gruppen der transgenen Mäuse und ihrer nicht-transgenen Wurfgeschwister (desselben Alters und Geschlechts) auf eine Hochfettdiät gesetzt, wie sie von Rebuffe-Scrive et al., Metabolism, Bd. 42, Nr. 11, 1405–1409 (1993), und Surwit et al., Metabolism, Bd. 44, Nr. 5, 645–651 (1995), beschrieben wird, mit der Änderung, dass der Natriumgehalt bezogen auf das normale Futter normalisiert wurde (die Diäten wurden von Research Diets Inc. hergestellt, Katalog-Nr. D12330N).
  • Nach zehn Wochen mit normaler Maus-Fütterung oder der Hochfettdiät wurden die Mäuse (weibliche transgene Tiere und ihre nicht-transgenen Wurfgeschwister) einem Glucose-Toleranztest unterzogen. Hierbei wurde jeder Maus intraperitoneal 1,0 mg Glucose pro kg Körpergewicht injiziert, und die Konzentration von Glucose, die im Blut vorhanden war, wurde in bestimmten Intervallen nach der Injektion gemessen. Das Diagramm in 10 zeigt die Glucosekonzentrationen in den Mäusen und ver anschaulicht, dass 8/9 der weiblichen, nicht-transgenen Mäuse, denen die Hochfettdiät gefüttert wurde, als diabetisch definiert werden müssen (2-h-Glucosekonzentrationen über 200 mg/dl; (World Book of Diabetes in Practice, Bd. 3, L. P. Krall (Hrsg.), Elsevier)), während 0/5 der transgenen Mäuse, denen eine vergleichbare Diät gefüttert wurde, als diabetisch zu betrachten sind.
  • Den männlichen Mäusen, denen die Hochfettdiät gefüttert wurde, wurden nach 6 oder 10 Wochen Diät getötet, und die Adipositas wurde durch Messen der Gewichte der spezifischen Fettdepots bestimmt. Wie in 9 gezeigt, waren die transgenen Mäuse, denen eine Hochfettdiät gefüttert wurde, signifikant weniger fett als die nicht-transgenen Wurfgeschwister.
  • Hinterlegung von Material
  • Die folgenden Materialien wurden bei der American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, USA, (ATCC) hinterlegt:
  • Figure 01390001
  • Diese Hinterlegung erfolgte gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrages über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren und den darunter gültigen Bestimmungen (Budapester Vertrag). Dies sichert die Erhaltung einer lebensfähigen Kultur der Hinterlegung 30 Jahre lang ab dem Zeitpunkt der Hinterlegung. Die Hinterlegungen werden von der ATCC gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrages und gemäß einem Abkommen zwischen Genentech, Inc., und ATCC verfügbar gemacht, das permanente und uneingeschränkte Verfügbarkeit der Nachkommenschaft der Kultur der Hinterlegung für die Öffentlichkeit bei Ausgabe des betreffenden US-Patents oder bei Offenlegung für die Öffentlichkeit entweder der US- oder einer ausländischen Patentanmeldung, je nachdem, was zuerst kommt, garantiert und das die Verfügbarkeit der Nachkommenschaft für jemanden, der durch den Präsident des Patentamtes der Vereinigten Staaten hierzu gemäß 35 USC § 122 und den dazu gültigen Bestimmungen (einschließlich 37 CFR § 1.14 unter besonderem Verweis auf 886 OG 638) befugt ist, sicherstellt.
  • Der Abtretungsempfänger der vorliegenden Anmeldung hat sich einverstanden erklärt, dass, sofern eine Kultur der hinterlegten Materialien, die unter geeigneten Bedingungen kultiviert wurde, sterben oder verloren gehen oder zerstört werden sollte, die Materialien unverzüglich nach Benachrichtigung durch neue derselben Art ersetzt werden. Verfügbarkeit des hinterlegten Materials ist nicht als eine Lizenz zur Ausführung der Erfindung in Widerspruch mit den unter der Behörde einer beliebigen Regierung gemäß ihrer Patentgesetze garantierten Rechte zu verstehen.
  • Die obige schriftliche Beschreibung wird als ausreichend erachtet, um Fachleuten die Möglichkeit zu geben, die Erfindung durchzuführen. Die vorliegende Erfindung soll in ihrem Schutzumfang durch das hinterlegte Konstrukt nicht als eingeschränkt gelten, da die hinterlegte Ausführungsform einzig als Veranschaulichung bestimmter Aspekte der Erfindung zu verstehen ist, und anderer Konstrukte, die funktionell äquivalent sind, liegen ebenfalls im Schutzumfang dieser Erfindung, wie er in den Ansprüchen definiert ist. Die Hinterlegung des hierin offenbarten Materials stellt weder ein Eingeständnis dar, dass die hierin enthaltene schriftliche Beschreibung inadäquat sei, die praktische Durchführung irgendeines Aspektes der Erfindung, einschließlich der besten Ausführungsform davon, zu ermöglichen, noch ist sie als eine Einschränkung des Schutzumfangs der Ansprüche zu den spezifischen Veranschaulichungen, die sie darstellt, zu verstehen. Schließlich werden Fachleuten auf Grundlage der obigen Beschreibung verschiedene Modifikationen, zusätzlich zu jenen, die hierin gezeigt und beschrieben wurden, ersichtlich sein und liegen ebenfalls im Schutzumfang der beiliegenden Ansprüche.
  • Sequenzprotokoll
    Figure 01410001
  • Figure 01420001
  • Figure 01430001
  • Figure 01440001

Claims (15)

  1. Verwendung eines FGF-19-Polypeptids oder einer Nucleinsäure, die für ein FGF-19-Polypeptid kodiert, zur Herstellung eines Medikaments, worin das Medikament: (a) zur Behandlung von Obesitas oder einem mit Obesitas in Verbindung stehenden Leiden, oder (b) zur Reduktion des gesamten Körpergewichts einer Person und/oder zur Reduktion des Fettanteils in einer Person, oder (c) zur Verringerung der Konzentration von zumindest einem von Triglyceriden und freien Fettsäuren in einer Person, oder (d) zur Steigerung der Stoffwechselrate in einer Person, oder (e) zur Induktion von Leptin-Freisetzung aus Fettzellen oder (f) zur Induktion einer Verringerung der Glucoseaufnahme in Fettzellen konzipiert ist, worin das FGF-19-Polypeptid: (i) die Sequenz der Aminosäurereste 1 oder X oder 23 ± 5 bis 216 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) oder ein biologisch aktives Fragment der in 2 gezeigten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) umfasst, oder (ii) eine Aminosäuresequenz umfasst, für die die menschliche Protein-cDNA kodiert, die unter der Zugriffsnummer ATCC 209480 hinterlegt ist, oder (iii) aus der Aminosäuresequenz aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) ohne die N-terminale Signalsequenz und/oder das Anfangs-Methionin besteht, oder (iv) zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit der Aminosäuresequenz der Reste 1 oder X oder 23 ± 5 bis 216 der Aminosäuresequenz aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) oder mit einem Fragment der Aminosäuresequenz aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) aufweist und biologisch aktiv ist, oder (v) zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit der Aminosäuresequenz aufweist, für die die menschliche Protein-cDNA, die unter der Zugriffsnummer ATCC 209480 hinterlegt ist, kodiert, und biologisch aktiv ist, und worin X = 17 bis 27 ist und die biologische Aktivität eine oder mehrere der folgenden Aktivitäten ist: (1) Steigerung des Stoffwechsels oder der Stoffwechselrate in einer Person; (2) Reduktion des Körpergewichts einer Person; (3) Reduktion von Adipositas in einer Person; (4) Verringerung von Glucoseaufnahme in die Fettzellen; (5) Steigerung von Leptin-Freisetzung aus Fettzellen; (6) Verringerung von Triglyceriden in einer Person; und (7) Verringerung von freien Fettsäuren in einer Person.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, worin der Identitätsgrad zumindest 85% beträgt.
  3. Verwendung nach Anspruch 2, worin der Identitätsgrad zumindest 90% beträgt.
  4. Verwendung nach Anspruch 3, worin der Identitätsgrad zumindest 95% beträgt.
  5. Verwendung nach Anspruch 1, worin das FGF-19-Polypeptid: (i) die Sequenz der Aminosäurereste 1 oder X oder 23 ± 5 bis 216 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) oder ein biologisch aktives Fragment davon umfasst, oder (ii) eine Aminosäuresequenz umfasst, für die die menschliche Protein-cDNA kodiert, die unter der Zugriffsnummer ATCC 209480 hinterlegt ist, oder (iii) aus der Aminosäuresequenz aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) ohne die N-terminale Signalsequenz und/oder das Anfangs-Methionin besteht.
  6. Verwendung nach Anspruch 1, worin das FGF-19-Polypeptid: (i) die Sequenz der Aminosäurereste 1 oder X oder 23 ± 5 bis 216 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) umfasst, oder (ii) eine Aminosäuresequenz umfasst, für die die menschliche Protein-cDNA kodiert, die unter der Zugriffsnummer ATCC 209480 hinterlegt ist, oder (iii) aus der Aminosäuresequenz aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) ohne die N-terminale Signalsequenz und/oder das Anfangs-Methionin besteht.
  7. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die Signalsequenz aus den Aminosäureresten 1 bis 22 ± 5 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) besteht.
  8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin X = 23 ist.
  9. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das FGF-19-Polypeptid eine Länge von zumindest 50 Aminosäuren aufweist.
  10. Verwendung nach Anspruch 9, worin das FGF-19-Polypeptid eine Länge von zumindest 100 Aminosäuren aufweist.
  11. Verwendung nach Anspruch 9, worin das FGF-19-Polypeptid eine Länge von zumindest 150 Aminosäuren aufweist.
  12. Verwendung nach Anspruch 9, worin das FGF-19-Polypeptid eine Länge von zumindest 200 Aminosäuren aufweist.
  13. In-vitro- oder Ex-vivo-Verfahren zur Induktion von Leptin-Freisetzung aus Fettzellen, umfassend die Verabreichung eines FGF-19-Polypeptids oder einer Nucleinsäure, die für ein FGF-19-Polypeptid kodiert, an die Zellen in einer Menge, die wirksam Leptin-Freisetzung induziert, worin das FGF-19-Polypeptid wie in einem der Ansprüche 1 bis 12 definiert ist.
  14. In-vitro- oder Ex-vivo-Verfahren zur Induktion einer Verringerung der Glucoseaufnahme in Fettzellen, umfassend die Verabreichung eines FGF-19-Polypeptids oder einer Nucleinsäure, die für ein FGF-19-Polypeptid kodiert, an die Zellen in einer Menge, die wirksam eine Verringerung der Glucoseaufnahme induziert, worin das FGF-19-Polypeptid wie in einem der Ansprüche 1 bis 12 definiert ist.
  15. Verfahren zum Screenen auf ein bioaktives Mittel, das in der Lage ist, die Aktivität eines FGF-19-Polypeptids zu modulieren, die folgenden Schritte umfassend: (a) das Zusetzen eines vermutlichen bioaktiven Mittels zu einer Probe eines FGF-19-Polypeptids; und (b) das Bestimmen einer Änderung der biologischen Aktivität des FGF-19-Polypeptids, worin eine Änderung auf ein bioaktives Mittel hinweist, das in der Lage ist, die Aktivität von FGF-19-Polypeptid zu modulieren, und worin die biologische Aktivität entweder: (i) verringerte Aufnahme von Glucose in Fettzellen und/oder gesteigerte Leptin-Freisetzung aus Fettzellen; oder (ii) gesteigerte Oxidation von Lipiden und Kohlenhydraten ist, und worin das FGF-19-Polypeptid wie in einem der Ansprüche 1 bis 12 definiert ist.
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