DE60027387T2

DE60027387T2 - Substrat mit immobilisierten Nukleinsäuren

Info

Publication number: DE60027387T2
Application number: DE60027387T
Authority: DE
Inventors: c/o Nisshinbo Industries Naoki Chiba-shi Kimura; c/o Nisshinbo Industries Namiko Chiba-shi Shiohata
Original assignee: Nisshinbo Industries Inc; Nisshin Spinning Co Ltd
Current assignee: Nisshinbo Holdings Inc
Priority date: 1999-11-29
Filing date: 2000-11-15
Publication date: 2007-01-11
Anticipated expiration: 2020-11-16
Also published as: DE60027387D1; EP1104687A2; US6498245B2; JP2001149060A; EP1104687B1; US20010003649A1; EP1104687A3; CA2325278A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Substrat mit immobilisierten Nukleinsäuren. Genauer bezieht es sich auf ein Substrat mit immobilisierten Nukleinsäuren, das Nukleinsäuren effizient auf einfache Weise auf einem Träger immobilisieren kann, ebenso wie auf ein Herstellungsverfahren dafür und ein Analyseverfahren unter seiner Verwendung.
Beschreibung des Standes der Technik
Als Verfahren zur Herstellung von Substraten mit immobilisierten Nukleinsäuren, die einen Träger umfassen, auf dem die Nukleinsäuren usw. immobilisiert sind, die für DNS-Sonden usw. verwendet werden, werden hauptsächlich die beiden folgenden Arten von Verfahren verwendet:

(1) Verfahren zum Immobilisieren von Nukleinsäuren mittels physikalischer Adsorption unter Verwendung eines Basismaterials, das mit Poly-L-Lysin etc. beschichtet ist, als Träger (Internationale Patentveröffentlichung WO95/35505 A1 und
(2) Verfahren der Synthese von DNS auf einem Basismaterial (WO97/10365).

Unter den vorgenannten Verfahren hat jedoch das in der Internationalen Patentveröffentlichung mit der Nummer 10-503841/1998 auf japanisch beschriebene den Nachteil, dass dann, wenn unter Verwendung dieses Verfahrens eine Hybridisierung durchgeführt wird, Nukleinsäuren vom Substrat insbesondere während der Arbeitsschritte abgelöst werden und als Folge die Nachweisempfindlichkeit verringert sein kann und die Ergebnisse unterschiedlich sein können, was eine geringe Reproduzierbarkeit verursacht. Weiterhin leidet dieses Verfahren auch unter dem Nachteil, dass eine kurzkettige Nukleinsäure wie etwa ein 50-mer oder kürzer wie z.B. Oligomere nicht effizient immobilisiert werden können, obwohl mittels dieses Verfahrens langkettige Nukleinsäuren immobilisiert werden können.
Weiterhin erfordert das in WO97/10365 beschriebene Verfahren einen äußerst speziellen Apparat und äußerst spezielle Reagenzien, weil DNS auf einem Basismaterial synthetisiert wird. Damit ist es kein Verfahren, das einfach von jedermann durchgeführt werden kann. Darüber hinaus leidet es unter dem Nachteil, dass die Nukleinsäuren, die synthetisiert werden können, auf diejenigen, die 25-mer oder kürzer sind, begrenzt sind.
WO98/55593 offenbart ein Verfahren zur Immobilisierung von Nukleinsäuremolekülen an eine feste Phase, bei dem das Molekül, das zum Binden der Nukleinsäure an die feste Phase verwendet wird, ein Glycidoxialkylsilan oder ein Mercaptoalkylsilan ist. US 5981734 bezieht sich auf ein Verfahren zur Immobilisierung von Nukleinsäuren auf ein Gelsubstrat unter Verwendung eines bifunktionellen Aktivierungsagens auf der Grundlage von Glutaraldehyd. Macdougall et al (Biochem. J. (1980) 191, 855–858) offenbart DNS-Immobilisierung mittels eines aromatischen Linkers mit zwei alkylierenden Gruppen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wurde angesichts der vorgenannten Probleme erreicht und es ist ihr Gegenstand, Substrate mit immobilisierten Nukleinsäuren zur Verfügung zu stellen, auf denen die Nukleinsäuren fest haftend in punktartigen Bereichen mit geringen Abmessungen ohne Hinblick auf die Kettenlänge der Nukleinsäuren immobilisiert sind, was erlaubt, die Nukleinsäuren effizient und auf einfache Weise auf ein Basismaterial zu bringen, und die mit einem einfachen Apparat hergestellt werden können.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben herausgefunden, dass dann, wenn die Nukleinsäuren auf einem Träger immobilisiert werden, der eine Basismaterial tragende Verbindung mit einer alkylierenden Gruppe umfasst, mittels der alkylierenden Gruppe die Nukleinsäuren fest haftend auf dem Träger in Bereichen feiner Punkte ohne Bezug auf die Kettenlänge der Nukleinsäuren immobilisiert werden können und der vorgenannte Gegenstand erreicht werden kann. So erzielten sie die vorliegende Erfindung.
Das heißt, dass die vorliegende Erfindung Substrate mit immobilisierten Nukleinsäuren, Träger zur Immobilisierung von Nukleinsäuren, Verfahren zur Herstellung eines Trägers zur Immobilisierung von Nukleinsäuren, Verfahren zur Herstellung eines Substrates mit immobilisierten Nukleinsäuren und Verfahren zum Nachweis einer Nukleinsäure wie in den beigefügten Ansprüchen beschrieben, zur Verfügung stellt.
Genaue Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Im Folgenden werden Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung im Detail beschrieben.
<1> Träger
Der für das erfindungsgemäße Substrat mit immobilisierten Nukleinsäuren verwendete Träger ist ein Träger zur Immobilisierung von Nukleinsäuren und umfasst ein Basismaterial und ein vom Basismaterial getragenes Stickstoffyperit, wobei das Stickstoffyperit lediglich eine alkylierende Gruppe hat (welches im Folgenden auch als „Alkylierungsreagens" bezeichnet werden kann).
(1) Basismaterial
Das für die vorliegende Erfindung verwendete Basismaterial dient als Träger für den vorgenannten Träger und ist nicht besonders eingeschränkt, solange es im Wesentlichen aus einem Basismaterial besteht, das in einem Lösemittel unlöslich ist und bei gewöhnlicher Temperatur oder einem Bereich darum (0–100°C) als Feststoff oder Gel vorliegt. Die Definition, dass das Basismaterial in einem Lösemittel im Wesentlichen unlöslich ist, heißt dass das Basismaterial in unterschiedlichen wässrigen und organischen Lösemitteln unlöslich ist, die für die Verfahrensschritte verwendet werden, bei denen das Alkylierungsreagens auf das Basismaterial aufgebracht wird, um vom Basismaterial wie im Folgenden beschrieben getragen zu werden, und dann die Nukleinsäuren darauf immobilisiert werden, so dass es als Träger wirkt, und dann das Substrat als DNS-Sonde oder Ähnliches verwendet wird.
Spezifische Beispiele für das Material, aus dem das Trägerbasismaterial besteht, schließen Kunststoffe, anorganische Polymere, Metalle, natürliche Polymere, Keramiken, etc. ein.
Spezifische Beispiele für die Kunststoffe schließen Polyethylen, Polystyrol, Polycarbonat, Polypropylen, Polyamid, Phenolharz, Epoxiharz, Polycarbodiimidharz, Polyvinylchlorid, Polyvinylidenfluorid, fluoriertes Polyethylen, Polyimid, Acrylharz usw. ein. Spezifische Beispiele für anorganische Polymere schließen Glas, Kristall, Kohle, Silicagel, Graphit usw. ein. Spezifische Beispiele für Metalle schließen Gold, Platin, Silber, Kupfer, Eisen, Aluminium, magnetische Verbindungen, paramagnetische Verbindungen, Apatit usw. ein. Beispiele für natürlich vorkommende Polymere schließen Cellulose, Chitin, Chitosan, Alginsäure, Derivate davon, usw. ein.
Spezifische Beispiele für Keramiken schließen Aluminiumoxid, Siliziumoxid, Siliziumcarbid, Siliziumnitrid, Borcarbid, usw. ein.
Das vorgenannte Basismaterial kann in Form von z.B. Filmen, Platten, Fasern oder Ähnlichen vorliegen und seine Größe ist nicht besonders eingeschränkt.
(2) Stickstoffyperit mit einer Alkylierungsgruppe
Die für die vorliegende Erfindung verwendete Alkylierungsgruppe ist eine Gruppe, die eine Alkylgruppe mittels einer Substitutionsreaktion oder einer Alkylierungsreaktion in eine andere Verbindung einführt. Stickstoffyperit mit einer alkylierenden Gruppe ist eines, das als ein Alkylierungsreagens verwendet wird. Stickstoffyperite können mittels der in den US-Patenten 2,141,090, 5,273,991, 5,387,707, usw. offenbarten Verfahren hergestellt werden.
Spezifische Beispiele für die Stickstoffyperite schließen halogeniertes Alkyl-N-alkylaminobenzol, halogeniertes Alkoxi-N-alkylaminobenzol, halogeniertes Alkyl-N-alkoxiaminobenzol, halogeniertes Alkoxi-N-alkoxiaminobenzol, halogeniertes Alkylphenylaminobenzol, halogeniertes Alkoxi-N-sulfonylalkylbenzol, halogeniertes Alkyl-N-sulfonylalkoxiaminobenzol, halogeniertes Alkyl-N-carboxialkylaminobenzol, halogeniertes Alkoxi-N-carboxialkylaminobenzol, halogeniertes Alkoxi-N-carboxialkoxiaminobenzol usw. ein.
Die vorgenannten Stickstoffyperite können eine andere funktionelle Gruppe oder ein anderes Atom als Substituenten haben, so dass sie mit dem Basismaterial oder mit einer Polymerverbindung eine kovalente Bindung eingehen können, um die alkylierende Gruppe auf dem Basismaterial physikalisch zu immobilisieren. Spezifische Beispiele für solche Substituenten schließen z.B. funktionelle Gruppen wie die Hydroxylgruppe, Halogenatome, halogenierte Alkylgruppen, halogenierte Acylgruppen, halogenierte Allylgruppen, Acylgruppen, Allylgruppen, Carboxylgruppen, Sulfoxylgruppen, Phosphoniumgruppen, Ketone, Aldehyde, Isocyanatgruppen, Isothiocyanatgruppen, Carbodiimidgruppen, Thiolgruppen und Aminogruppen ein.
Die Position des vorgenanten Substituenten kann irgendeine Position sein, die die Alkylierungsreaktion durch den Stickstoffyperit nicht inhibiert. Im Speziellen kann er an einer Position sein, die von der Position des Alkylierungsreagenses, das an der Alkylierungsreaktion beteiligt ist, und der Position des tertiären Stickstoffatoms verschieden ist. Der Substituent ist vorzugsweise an einem aromatischen Ring eingeführt.
(3) Träger
Der erfindungsgemäße Träger zur Immobilisierung von Nukleinsäuren umfasst das vorgenannte Basismaterial und das vorgenannte, vom Basismaterial getragene Alkylierungsreagens. Der Begriff „tragen", der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bedeutet, dass das Alkylierungsreagens nicht nennenswert vom Basismaterial in verschiedenen Lösemitteln wie wasserlöslichen Lösemitteln und organischen Lösemitteln freigesetzt wird, die verwendet werden, wenn die Nukleinsäuren auf dem Träger immobilisiert werden, wenn das Substrat mit immobilisierten Nukleinsäuren als DNS-Sonde etc. oder Ähnliches verwendet wird.
Was den für die vorliegende Erfindung verwendeten Träger betrifft, kann das vorgenannte Alkylierungsreagens einfach mittels der Nutzung physikalischer Haftung gehalten werden, oder es kann chemisch über kovalente Bindungen gehalten werden, solange es auf dem vorgenannten Basismaterial gehalten wird. Jedoch wird beim in der vorliegenden Erfindung verwendeten Träger das Alkylierungsreagens vorzugsweise über kovalente Bindungen vom Basismaterial gehalten.
Weiterhin kann das Alkylierungsreagens je nach Notwendigkeit auf der gesamten Oberfläche des Basismaterials oder auf einem Teil davon getragen werden.
Wenn das vorgenannte Alkylierungsreagens durch physikalische Haftung auf dem Basismaterial gehalten wird, kann eine Verbindung verwendet werden, die eine Polymerverbindung umfasst, an die das Alkylierungsreagens kovalent gebunden ist, welche im Folgenden auch als „die das Alkylierungsreagens tragende Polymerverbindung" bezeichnet werden kann. Obwohl das das Alkylierungsreagens tragende Polymer nicht besonders eingeschränkt ist, solange es eine Verbindung ist, die das an die Polymerverbindung gebundene Alkylierungsreagens umfasst, hat die das Alkylierungsreagens tragende Polymerverbindung vorzugsweise ein Molekulargewicht im Bereich von 500 bis 1000 000.
Die vom Basismaterial mittels physikalischer Adhäsion gehaltene, das Alkylierungsreagens tragende Polymerverbindung hat vorzugsweise 2 bis 2000 Alkylierungsreagensmoleküle im Polymermolekül, unabhängig von seiner Art. Wenn die Anzahl der Moleküle des Alkylierungsreagenses, die die das Alkylierungsreagens tragende Polymerverbindung hat, geringer als 2, z.B. 1 ist, verfügt sie nicht über die Fähigkeit, Nukleinsäuren zu immobilisieren. Im Gegensatz dazu kann dann, wenn die Anzahl der Moleküle des Alkylierungsreagenses zu stark über dem vorgenannten Bereich liegt, seine Viskosität zu hoch werden oder es kann nicht in Lösung gebracht werden, und so können seine Handhabungseigenschaften beim Aufbringen auf das Basismaterial verschlechtert sein, obwohl es unter Umständen keine unbefriedigende Performance als Produkt aufweist.
Ein solches, ein Alkylierungsreagens tragendes Polymer zeigt starke Haftung am vorgenannten Basismaterial und wird mittels dieser Haftumg auf dem Basismaterial gehalten. Eine typische Form der ein Alkylierungsreagens tragenden Polymerverbindung, die mittels physikalischer Haftung auf dem Basismaterial gehalten wird, ist eine beschichteter Film.
Das Verfahren zur Herstellung der vorgenannten ein Alkylierungsreagens tragenden Polymerverbindung, die auf dem Basismaterial in Form eines beschichteten Films gehalten wird, kann ein bekanntes Verfahren sein, z.B. Sprayen, Eintauchen, Auftragen mit einer Bürste, Aufstempeln, Abschieden aus der Gasphase, Beschichten unter Verwendung eines Filmbeschichtungsgerätes usw.
Nun wird der das Alkylierungsreagens über kovalente Bindungen tragende Träger erklärt.
Das durch kovalente Bindungen getragene Alkylierungsreagens kann irgendeines der vorgenannten sein. Das Alkylierungsreagens, das der Träger über kovalente Bindungen an seinem Basismaterial trägt, hat vorzugsweise 3 bis 300 alkylierende Gruppen im Molekül. Wenn die Anzahl alkylierender Gruppen 3 bis 300 beträgt, kann eine ausreichende Fähigkeit zur Immobilisierung von Nukleinsäuren erzielt werden, und die Lösung kann eine geeignete Viskosität aufweisen und ist so im Hinblick auf ihre Handhabung bevorzugt.
Um einen Träger zu erhalten, der das vorgenannte Stickstoffyperit trägt, das die alkylierende Gruppe über kovalente Bindung an der Oberfläche des Basismaterials gebunden hat, und der im Folgenden auch als „Träger mit kovalenten Bindungen" bezeichnet werden kann, kann z.B. ein Alkylierungsreagens mit einer alkylierenden Gruppe zur Immobilisierung von Nukleinsäuren bei der Verwendung in einem Träger und weiterhin mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen zur Ausbildung kovalenter Bindungen mit der Oberfläche des Basismaterials kovalent mit den funktionellen Gruppen des Basismaterials, das auf seiner Oberfläche funktionelle Gruppen aufweist, die mit den funktionellen Gruppen des Alkylierungsreagenses mittels eines geeigneten Verfahrens kovalent gebunden werden können, gebunden sein.
Genauer kann der Träger mit kovalenten Bindungen z.B. dadurch erhalten werden, dass Stickstoffyperit mit einer alkylierenden Gruppe und einer weiteren funktionellen Gruppe, die keine alkylierende Gruppe ist, dazu gebracht wird, mit den funktionellen Gruppen kovalent an die Oberfläche des Basismaterials mit den funktionellen Gruppen, die mit den funktionellen Gruppen, die keine alkylierenden Gruppen sind, kovalent gebunden werden können, zu binden, während die alkylierenden Gruppen des Stickstoffyperit übrig bleiben.
Als das zur Herstellung des Trägers, der kovalent mit dem Alkylierungsreagens gebunden sein kann, verwendete Stickstoffyperit mit einer alkylierenden Gruppe und einer oder mehreren weiteren funktionellen Gruppen, die keine alkylierenden Gruppen sind, können spezifisch unter den oben unter (2) genannten Alkylierungsreagenzien Verbindungen genannt werden, die eine alkylierende Gruppe und eine oder mehrere funktionelle Gruppen, die keine alkylierenden Gruppen sind, haben. Weiterhin ist es auch möglich, eine Verbindung zu verwenden, die aus irgendeinem der oben unter (2) genannten Alkylierungsreagenzien besteht und mit den vorgenannten funktionellen Gruppen zur Ausbildung einer kovalenten Bindung mittels eines geeigneten Verfahrens eingeführt wurde, um den vorgenannten Träger mit kovalenten Bindungen zu erhalten.
Das Verfahren zum Einführen solcher funktioneller Gruppen in das Alkylierungsreagens kann ein konventionelles bekanntes Verfahren sein.
Die Position, in der die funktionelle Gruppe zur Ausbildung der kovalenten Bindung eingeführt wird, ist nicht besonders eingeschränkt, solange die Alkylierungsreaktion durch das Alkylierungsreagens nicht inhibiert wird. Jedoch ist die funktionelle Gruppe vorzugsweise an einem aromatischen Ring eingeführt, wenn das vorgenannte Alkylierungsreagens ein Stickstoffyperit ist.
Als Basismaterial mit funktionellen Gruppen an seiner Oberfläche, das mit den funktionellen Gruppen, die das vorgenannte Stickstoffyperit besitzt und die keine alkylierenden Gruppen sind, kovalent gebunden werden kann, kann z.B. das Basismaterial, das oben in (1) erklärt wurde, genannt werden, bei dem die funktionellen Gruppen, die an seiner Oberfläche kovalente Bindungen herstellen können, eingeführt sind.
Die einzuführende funktionelle Gruppe ist nicht besonders eingeschränkt, solange sie eine funktionelle Gruppe ist, die mit der funktionellen Gruppe, die keine alkylierende Gruppe ist, kovalent gebunden werden kann. Spezifische Beispiele dafür schließen, die Hydroxylgruppe, Iminogruppe, Aminogruppe, Carboxylgruppe, Carbodiimidgruppe, Aldehydgruppe usw. ein. Diese funktionellen Gruppen können geeignet in Abhängigkeit von den funktionellen Gruppen des vorgenannten Alkylierungsreagens, das die kovalente Bindung bildet, ausgewählt werden und an der Oberfläche des Basismaterials eingeführt werden.
Was das Verfahren zum Einführen solcher funktioneller Gruppen an die Oberfläche des Basismaterials betrifft, kann ein geeignetes Verfahren in Abhängigkeit vom Material des Basismaterials, der einzuführenden funktionellen Gruppe usw. ausgewählt werden. Weiterhin kann die funktionelle Gruppe an der ganzen Oberfläche des Basismaterials eingeführt werden oder nur an einem Teil davon.
Wenn Aminogruppen an der ganzen Oberfläche eines Basismaterials aus Glas eingeführt werden soll, kann z.B. das Basismaterial in eine Lösung, die durch Lösen eines amino-substituierten Organoalkoxisilans wie 3-Aminopropyltriethoxisilan in einem geeigneten Lösemittel hergestellt wurde, etwa 2 bis 3 Stunden lang bei einer Temperatur von 70 bis 80°C eingetaucht werden. Dann kann das Basismaterial aus der Lösung genommen werden, mit Wasser zum Entfernen der Lösung gewaschen werden und mittels 4 bis 5 stündigem Erhitzen auf 100 bis 120°C getrocknet werden. Weiterhin ist es auch möglich, die Aminogruppe des vorgenannten 3-Aminopropyltriethoxisilans und die von der alkylierenden Gruppe des Alkylierungreagenses verschiedene funktionelle Gruppe mit einander unter Verwendung eines geeigneten Lösemittels reagieren zu lassen, so dass das Alkylierungsreagens direkt an der Oberfläche des Basismaterials aus Glas eingeführt wird.
Auch in den Fällen, in denen von Aminogruppen verschiedene funktionelle Gruppe an einem Glassubstrat eingeführt werden, oder in denen funktionelle Gruppen an einem Material, dass nicht aus Glas besteht, eingeführt werden, ist es eine gewöhnlich verwendete übliche Methode, dass unterschiedliche funktionelle Gruppen an den Oberflächen der verschiedenen Materialien, die oben bei der Erklärung des Basismaterials erwähnt wurden, eingeführt werden, und Verfahren dafür sind bekannt. Daher können auch in diesen Fällen funktionelle Gruppen an den Oberflächen von Basismaterialien unter Verwendung solcher bekannter Verfahren eingeführt werden.
Weiterhin schließen die oben unter (1) erwähnten Basismaterialien diejenigen Kunststoff-Basismaterialien ein, die bereits solche funktionellen Gruppen, wie sie oben erwähnt werden, an der Oberfläche des Basismaterials haben. In einem solchen Fall können diese Materialien so wie sie sind zur Herstellung der vorgenannten Träger mit kovalenten Bindungen verwendet werden, ohne funktionelle Gruppen auf der Oberfläche des Basismaterialien einzuführen. Weiterhin können solche Kunststoff-Basismaterialien auch zur Herstellung des Trägers verwendet werden, nachdem weitere funktionelle Gruppen auf ihnen eingeführt wurden.
Um den für die vorliegende Erfindung verwendeten Träger mit kovalenten Bindungen herzustellen, lässt man unter geeigneten Bedingungen einen Stickstoffyperit mit einer alkylierenden Gruppe und einer oder mehreren funktionellen Gruppen, die keine alkylierenden Gruppen sind, mit einem Basismaterial an dessen Oberfläche sich funktionelle Gruppen befinden, die mit den funktionellen Gruppen, die keine alkylierenden Gruppen sind, eine kovalente Bindung eingehen können, miteinander reagieren, so dass der Stickstoffyperit mit den funktionellen Gruppen an der Oberfläche des Basismaterials kovalent gebunden ist, wobei die alkylierende Gruppe des Stickstoffyperits übrig bleibt. Das heißt, wenn der Stickstoffyperit eine alkylierende Gruppe und eine oder mehrere funktionelle Gruppen, die keine alkylierenden Gruppen sind, hat, kann die Reaktion unter solchen Bedingungen durchgeführt, dass die funktionellen Gruppen, die keine alkylierenden Gruppen sind, eine kovalente Bindung bilden sollten.
Der wie oben beschrieben erhaltene Träger zum Immobilisieren von Nukleinsäuren, der das Basismaterial und den vom Basismaterial getragenen Stickstoffyperit einer alkylierenden Gruppe umfasst, kann Nukleinsäuren unterschiedlicher Art und Größe unter Nutzung der Reaktivität der alkylierenden Gruppen des Stickstoffyperits, der eine alkylierende Gruppe hat, fest immobilisieren.
Speziell hat der Träger, der für das erfindungsgemäße Substrat mit immobilisierten Nukleinsäuren verwendet wird, eine durch die folgende allgemeine Formel (i) repräsentierte Struktur: M-R_n-G (i)
In der Formel (i) repräsentiert M den vorgenannten Stickstoffyperit mit der alkylierenden Gruppe, und eigentlich eine Gruppe mit einem kovalent bindenden Teil zum Binden mit dem vorgenannten Basismaterial oder der Polymerverbindung. Wie oben beschrieben, liegt die kovalente Bindung vorteilhafterweise an einem aromatischen Ring vor.
R repräsentiert eine zweiwertige funktionelle Gruppe, die ausgewählt wird unter -NH-, -CH₂-, NHCO-, -CONH-, -O-, -N(R¹), (wobei R¹ eine normale, cyclische oder verzweigte, gesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen oder eine ungesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen repräsentiert),
(wobei R² und R³ voneinander unabhängig ein Wasserstoffatom, eine normale oder verzweigte, gesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen oder eine ungesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, eine Cycloalkylgruppe, eine Arylgruppe oder eine Aralkylgruppe, die einen oder mehrere Substituenten haben kann, repräsentieren. Wenn jedoch einer der Reste R² und R³ ein Wasserstoffatom repräsentiert, repräsentiert der andere eine normale oder verzweigte gesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen oder eine ungesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, eine Cycloalkylgruppe, eine Arylgruppe oder eine Aralkylgruppe, die einen oder mehrere Substituenten haben kann. Alternativ können R² und R³ aneinander gebunden sein und eine Stockstoff enthaltende heterocyclische Gruppe bilden, die ein Sauerstoffatom enthalten kann), -COO-, -OCO-, NHSO₂-, -NHC(S)NH-, -SO₂NH-, usw. n repräsentiert eine ganze Zahl von 0 bis 20. Wenn R aus zwei oder mehr Gruppen besteht, können sie identisch oder voneinander verschieden sein.
R ist eine Gruppe, die als Ergebnis einer kovalenten Bindung zwischen einer funktionellen, von der alkylierenden Gruppe des vorgenannten Stickstoffyperits mit einer alkylierenden Gruppe und einer oder mehreren funktionellen Gruppen, die keine alkylierenden Gruppen sind, verschiedenen Gruppe und einer funktionellen Gruppe des vorgenannten Basismaterials mit funktionellen Gruppen, die mit der von der alkylierenden Gruppe des Stickstoffyperits verschiedenen Gruppe eine kovalente Bindung eingehen kann, gebildet wird. R kann eine oder mehrere andere funktionelle Gruppen enthalten, die vorab in das Alkylierungsreagens eingeführt wurden, oder eine oder mehrere andere funktionelle Gruppen, die in das Basismaterial eingeführt wurden, die nicht direkt an der vorgenannten kovalenten Bindung beteiligt sind.
G repräsentiert das Basismaterial oder die Polymerverbindung. Wenn das vorgenannte Alkylierungsreagens am Basismaterial mittels physikalischer Adhäsion getragen wird, repräsentiert G die Polymerverbindung und diese Polymerverbindung haftet am Basismaterial und ergibt einen Träger.
<2> Substrat mit immobilisierten Nukleinsäuren
Im erfindungsgemäßen Substrat mit immobilisierten Nukleinsäuren werden identische oder unterschiedliche Nukleinsäuren in einer Vielzahl von punktartigen Gebieten auf dem Träger immobilisiert, welcher das Basismaterial und das über die alkylierende Gruppe auf dem Basismaterial getragene Alkylierungsreagens umfasst.
Beim erfindungsgemäßen Substrat mit immobilisierten Nukleinsäuren bedeutet die Definition, dass Nukleinsäuren in punktartigen Gebieten immobilisiert sind, dass die Gebiete, auf denen die Nukleinsäuren immobilisiert sind, hinreichend kleiner als der Größe des Trägers entspricht, und zwar in einem Maß, dass eine Vielzahl von Stellen mit immobilisierten Nukleinsäuren zur Verfügung gestellt werden kann. Die Form der Punkte ist nicht besonders eingeschränkt und wird in Abhängigkeit von der Art des Gebrauchs, dem Gebrauchszweck, usw. des Substrats mit immobilisierten Nukleinsäuren willkürlich ausgewählt.
Die punktartigen Stellen mit immobilisierten Aminosäuren des erfindungsgemäßen Substrats mit immobilisierten Nukleinsäuren sind z.B. solche mit einer annähernd kreisförmigen Form und einem Durchmesser von etwa 10–3000 μm. Was die Größe der Punkte betrifft, ist der Durchmesser bevorzugter etwa 50–2000 μm, weiter bevorzugt etwa 100–1500 μm. Der Begriff „annähernd kreisförmige Form" ist nicht auf rund beschränkt, sondern schließt Formen ein, die analog Kreisen sind, wie z.B. ovale Formen ohne bestimmte Einschränkungen. Durchmesser von ovalen Formen, z.B. bedeutet einen Durchschnittswert der größeren Achse und der kleineren Achse.
Was die Größe der oben genannten Punkte betrifft, kann der Nachweis dann, wenn der Durchmesser kleiner als 10 μm, schwierig werden, während dann, wenn der Durchmesser über 3000 μm beträgt, es schwierig werden kann, eine mäßige Anzahl von Punkten pro Einheitsfläche zu sichern. Daher ist im Hinblick auf die Erleichterung des Nachweises, das zur Verfügungstellen einer erwünschten Anzahl von Punkten pro Einheitsfläche, usw. vorteilhaft, die Größe der Punkte innerhalb des vorgenannten Bereichs herzustellen.
Die Anzahl der punktartigen Stellen mit immobilisierten Nukleinsäuren des erfindungsgemäßen Substrats mit immobilisierten Nukleinsäuren ist nicht besonders eingeschränkt und wird in Abhängigkeit von der Art des Gebrauchs, dem Gebrauchszweck, usw. des Substrats mit immobilisierten Nukleinsäuren ausgewählt. Jedoch kann die Anzahl der Stellen mit immobilisierten Nukleinsäuren z.B. genauer ungefähr 10–10 000, bevorzugter ungefähr 50–350 pro 1 cm² des Substrats mit immobilisierten Nukleinsäuren betragen. Die geometrische Anordnung der punktartigen Stellen mit immobilisierten Nukleinsäuren des erfindungsgemäßen Substrats mit immobilisierten Nukleinsäuren kann auch geeignet in Abhängigkeit von der Art des Gebrauchs, dem Gebrauchszweck, usw. des Substrats mit immobilisierten Nukleinsäuren ausgewählt werden.
Was die Nukleinsäuren betrifft, die auf dem erfindungsgemäßen Substrat mit immobilisierten Nukleinsäuren immobilisiert werden sollen, können natürliche DNS oder synthetische DNS (einschließlich Oligonukleotide) und RNS (einschließlich Oligonukleotide) ohne irgendeine besondere Einschränkung genannt werden. Die zu immobilisierenden Nukleinsäuren können aus Einzelsträngen oder Doppelsträngen bestehen. Entsprechend der vorliegenden Erfindung werden solche Nukleinsäuren, die eine funktionelle Gruppe haben, die Reaktivität mit der alkylierenden Gruppe zeigt, gewöhnlich als die vorgenannten Nukleinsäuren verwendet. Die in den punktartigen Gebieten des erfindungsgemäßen Substrats mit immobilisierten Nukleinsäuren immobilisierten Nukleinsäuren können identisch oder voneinander verschieden sein. Wenn unterschiedliche Nukleinsäuren verwendet werden, kann die geometrische Anordnung dieser Nukleinsäuren, usw., in Abhängigkeit von der Art des Gebrauchs, dem Gebrauchszweck, usw. des Substrats mit immobilisierten Nukleinsäuren, das erhalten werden soll, geeignet ausgewählt werden.
Um solche Nukleinsäuren in punktartigen Formen auf dem Träger zu immobilisieren, können geringe Mengen Nukleinsäuren in punktartiger Form einer erwünschten Größe auf Abschnitten des Basismaterials, das das Alkylierungsreagens trägt, unter geeigneten Bedingungen zur Verfügung gestellt werden, so dass das Alkylierungsreagens und die Nukleinsäure miteinander in Kontakt gebracht werden müssen, um die Reaktion zwischen ihnen auszulösen. Als Ergebnis der Reaktion der alkylierende Gruppe des auf dem Basismaterial getragenen Alkylierungsreagens und einer Aminogruppe, Iminogruppe oder Ähnlichem der Nukleinsäuren, sind die Nukleinsäuren und das Alkylierungsreagens kovalent gebunden. Wenn vorher Thiolgruppen in die Nukleinsäuren eingeführt worden sind, wird die kovalente Bindung auch durch die Reaktion der vorgenannten alkylierenden Gruppe und der Thiolgruppe gebildet. Als Ergebnis sind die Nukleinsäuren auf dem Träger immobilisiert.
Speziell werden Nukleinsäuren gewöhlich in Wasser oder einem Puffer enthalten zur Verfügung gestellt, so dass die Aktivität der zu immobilisierenden Nukleinsäuren während des Kontakts und der Reaktion zwischen beiden erhalten bleiben sollte. Im Allgemeinen beträgt die Temperatur für den Kontakt vorzugsweise 0–100°C, so dass die Aktivität der zu immobilisierenden Nukleinsäuren nicht verloren gehen sollte.
Mittel, um kleine Mengen von Nukleinsäuren gewöhnlich in Form von Wasser oder einem Puffer, in dem die Nukleinsäuren enthalten sind, in punktartigen Gebieten auf dem Träger zur Verfügung zu stellen, schließen das Verfahren der Verwendung eines Dosiergerätes, Verfahren der Verwendung einer Nadel, Verfahren der Verwendung einer Blasendüse usw. ein. Jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht auf diese beschränkt. Vorrichtungen zum zur Verfügungstellen kleiner Mengen von Lösungen mittels der vorgenannten Verfahren sind kommerziell erhältlich und können für die vorliegende Erfindung verwendet werden.
Wenn Analysen unter Verwendung des erfindungsgemäßen Substrats mit immobilisierten Nukleinsäuren durchgeführt werden, wird das Substrat mit immobilisierten Nukleinsäuren oft mit Nukleinsäuren in Kontakt gebracht, die sich von den vorgenannten immobilisierten Nukleinsäuren unterscheiden, usw. Daher werden, um zu verhindern, dass andere als die immobilisierten Nukleinsäuren usw. nichtspezifisch mit nicht abreagierten alkylierenden Gruppen des von Träger getragenen Alkylierungsreagens binden, nachdem die Nukleinsäuren in punktartigen Bereichen auf dem Träger so wie zuvor beschrieben, immobilisiert wurden, freie alkylierende Gruppen vorzugsweise geblockt, indem sie mit einer Überschussmenge an Rinderserumalbumin (BSA), Casein, Lachsspermien-DNS oder Ähnlichem in Kontakt gebracht werden.
In dem wie oben beschrieben erhaltenen erfindungsgemäßen Substrat mit immobilisierten Nukleinsäuren werden die Nukleinsäuren sehr fest auf dem Träger gehalten und sie werden selbst durch Waschverfahren nicht gelöst, wie sie breit bei der Hybridisierung usw. angewandt werden (Waschverfahren unter Verwendung oberflächenaktiver Substanzen). Wenn eine Analyse unter Verwendung des Substrats mit immobilisierten Nukleinsäuren durchgeführt wird, kann die Analyse mit hervorragender Reproduzierbarkeit und Quantifizierbarkeit durchgeführt werden. Weiterhin können deshalb, weil das erfindungsgemäße Substrat mit immobilisierten Nukleinsäuren Nukleinsäuren ohne Hinblick auf die Anzahl und die Länge der Ketten immobilisieren kann, mit dem selben Substrat unterschiedliche Nukleinsäuren gleichzeitig gehandhabt werden. Darauf basierend kann das erfindungsgemäße Substrat mit immobilisierten Nukleinsäuren als DNS-Sonde usw. für Technologien zur Bestimmung von Nukleotidsequenzen mittels Hybridisierung unter Verwendung einer großen Anzahl von Nukleinsäuren, z.B. beim SBH-Verfahren (Sequenzierung mittels Hybridisierung), SHOM-Verfahren (Sequenzierung mittels Hybridisierung mit einer Oligonukleotidmatrix) usw. mit hervorragender Leistungsfähigkeit verwendet werden.
Beispiele
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung mit Bezug auf die folgenden Beispiele erklärt.
<Herstellungsbeispiel>
(1) Herstellung des Alkylierungsreagenses
Hydroxiethylmethylanilin (20 g) wurde nach und nach zu Phosphoroxichlorid (22,3 g) bei 45°C gegeben und bei 90°C eine Stunde lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf 0°C abgekühlt, dann wurde nach und nach ein Gemisch (87,3 g) N-Methylformanilid, Phosphoroxichlorid und Benzol (1:1:0,5) zugegeben und bei 35°C 3 Stunden lang gerührt. Dieses Reaktionsgemisch wurde durch Zugabe von Eis gekühlt, durch Zugabe von 4 N Natriumhydroxid neutralisiert und dann mit Benzol extrahiert. Der Extrakt wurde aufkonzentriert und mittels Silikagelchromatographie (Entwicklungslösemittel: Toluol) gereinigt, um p-N-Chlorethyl-N-methylaminobenzylaldehyd zu erhalten. Dessen NMR-Spektrum ist unten angegeben.
[Daten des NMR-Spektrums]

¹H-NMR (CDCl₃): δ = 3,10 (s, 3H), δ = 3,65 (m, 2H), δ = 3,75 (m, 2H), δ = 6,70 (d, 2H), δ = 7,75 (d, 2H), δ = 9,75 (s, 1 H)

(2) Herstellung von aminierten Objektträgern
Eine 10% (v/v)-Lösung 3-Aminopropyltriethoxiethoxisilan in Ethanol (20 mL) wurde zu destilliertem Wasser (180 mL) gegeben und ausreichend gerührt. Das Gemisch wurde durch Zusatz von 6 N HCl auf pH 3 bis 4 eingestellt und 15 Objektträger wurden im Gemisch eingetaucht und bei 75°C 2 Stunden lang wärmebehandelt. Nach Abschluss der Wärmebehandlung wurden die Objektträger aus der Lösung geholt, ausreichend mit destilliertem Wasser gespült und bei 115°C 4 stunden lang wärmebehandelt, um aminierte Objektträger zu erhalten.
<Beispiel>
(1) Herstellung von Objektträgern, die ein Alkylierungsreagens tragen
Das im oberen Herstellungsbeispiel (1) erhaltene Alkylierungsreagens (1,25 g) wurde in Methanol gelöst (25 mL), nach und nach wurde Natriumborhydridcyanid zugegeben und gerührt. Dann wurden 5 Stück der im Herstellungsbeispiel (2) erhaltenen Objektträger in die Lösung getaucht und die Lösung wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Diese Objektträger wurden in Methanol (500 mL) gewaschen und das Methanol wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde bei 37°C 30 Minuten lang getrocknet, um Alkylierungsreagens tragende Objektträger zu erhalten.
(2) Immobilisierung von Nukleinsäuren auf einem ein Alkylierungsreagens tragendem Objektträger
Ein Oligonukleotid mit der in SEQ ID Nr.: 1 gezeigten Nukleotidsequenz (21-mer) wurde in 2 M NaCl zu einer Konzentration von 100 ng/μL gelöst, um eine DNS-Lösung zu erhalten. Unter Verwendung von SPBIO (Hitachi Software Engineering Co., Ltd.), wurde die DNS-Lösung punktartig auf 500 Bereiche in vorbestimmten Positionen auf dem das Alkylierungsreagens tragenden Objektträger, der oben unter (1) erhalten worden war, aufgetragen. Dieser wurde in einen Trockner gegeben und bei 37°C 15 Minuten lang getrocknet. Dann wurde der Objektträger in Puffer A getaucht (0,2 M Natriumchlorid, 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5), 0.05% Triton X-100), der 3% BSA (Rinderserumalbumin) enthielt und bei 37°C 15 Minuten lang getrocknet. Anschließend wurde der Objektträger mit TE-Puffer gewaschen (10 mM Tris-HCl (pH 7,2), 1 mM EDTA) und bei 37°C 15 Minuten lang getrocknet, so dass ein Objektträger mit immobilisiertem Alkylierungsreagens erhalten wurde, an dem die Doppelstrang-DNS immobilisiert war.
(3) Hybridisierung
Als Sonde zum Hybridisierungsnachweis wurde ein Oligonukleotid mit einer Oligonukleotidsequenz verwendet, die zur Nukleotidsequenz der vorgenannten SEQ ID Nr.: 1 komplementär war, die mit Biotin markiert war.
Auf die Bereiche mit immobilisierter DNS des vorgenannten Objektträgers wurden jeweils 30 μL einer Hybridisierungslösung gegeben [3 × SSC (SSC: 1,5 M NaCl, 0,15 M Natriumcitrat), 10% Dextran, 1 pmol biotinylierte Sonde] und über Nacht auf einem Wasserbad bei 42°C erwärmt.
(4) Posthybridisierung
Nach der Hybridisierung wurde die Hybridisierungslösung sanft vom Objektträger abgezogen und der Objektträger wurde einer Posthybrisidierungswäsche unter der folgenden Bedingung unterzogen, um nicht spezifisch absorbierte Sonde zu entfernen.
[Posthybridisierungswaschlösung und Bedingungen]

Erster Schritt: 2 × SSC, 1% SDS; Raumtemperatur, 5 Minuten, zweimal
Zweiter Schritt: 0,2 × SSC, 1% SDS; 40°C, 5 Minuten, zweimal
Dritter Schritt: 2 × SSC; Raumtemperatur, 5 Minuten einmal

(5) Nachweis der Hybridisierung
Nach dem vorgenannten Posthybridisierungswaschen wurde der Objektträger mittels 30 minütigem Eintauchen bei Raumtemperatur in einen 3% BSA enthaltenden Puffer A (500 mL) geblockt. Dann wurde er in 45 mL einer Lösung von Streptavidin-alkalisches Phosphatase-Konjugat getaucht (Gibco BRL, hergestellt mittels 2000 fachem Verdünnen der Stammlösung mit einem 3% BAS enthaltende Puffer A) und man ließ bei Raumtemperatur 30 Minuten lang reagieren. Dann wurde der Objektträger in Puffer A (50 mL) getaucht und bei Raumtemperatur 5 Minuten lang stehen gelassen. Dieser Vorgang wurde zweimal wiederholt, um nicht an das Biotin gebundenes Konjugat zu entfernen.
Dann wurde der Objektträger einmal mit Puffer B (30 mL) gewaschen. Schließlich wurde er in einer Substrat-Lösung gebadet (20 mL Puffer B, 18 μL 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosophat-Lösung (BCIP-Lösung), 36 μL Nitroblau-Tetrazolium-Lösung (NBT-Lösung) und bei Raumtemperatur drei Stunden lang stehen gelassen, so dass sich die Reaktion der Farbentwicklung vollziehen konnte. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.
[Zusammensetzung von Puffer A]

0,2 M NaCl
0,1 M Tris-HCl (pH 7,5)
0,05% Triton X-100

[Zusammensetzung von Puffer B]

0,1 M NaCl
0,1 M. Tris-HCl (pH 9,5)

<Vergleichsbeispiel>
(1) Immobilisierung von Nukleinsäure an einem mit Poly-L-Lysin beschichtetem Objektträger
Ein Oligonukleotid mit der in SEQ ID Nr.: 1 gezeigten Nukleotidsequenz (21-mer) wurde in 0,2 × SSC zu einer Konzentration von 100 ng/μL gelöst, um eine DNS-Lösung zu erhalten. Unter Verwendung von SPBIO (Hitachi Software Engineering Co., Ltd.), wurde die DNS-Lösung punktartig auf 500 Bereiche in vorbestimmten Positionen auf einen mit Poly-L-Lysin beschichteten Objektträger (Sigma) aufgegeben. Dieser wurde in eine Kammer gegeben und man lies zwei Stunden lang bei Raumtemperatur reagieren. Anschließend wurde in einem Vakuumtrockner zwei Stunden lang bei 80°C getrocknet. Der Objektträger wurde mit 0,1% SDS gewaschen, dann 10 Minuten lang in eine Blockierungslösung bei Raumtemperatur getaucht (1 g Succinanhydrid, 100 mL N-Methylpyrrolidin, 100 mL 0,2 M Natriumborat (pH 8,0)) und vier Mal mit destilliertem Wasser gewaschen, so dass ein mit Poly-L-Lysin beschichteter Objektträger erhalten wurde, an dem die Nukleinsäure immobilisiert war.
(2) Hybrisidierung
Die Hybridisierung wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel (2) durchgeführt, außer dass der im Vergleichsbeispiel (1) hergestellte Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger statt des das Alkylierungsreagens tragenden Objektträgers verwendet wurde.
(3) Posthybridisierung
Der Objektträger wurde auf die selbe Weise wie im Beispiel (3) behandelt, außer dass der im Vergleichsbeispiel (2) hergestellte Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger statt des das Alkylierungsreagens tragenden Objektträgers verwendet wurde.
(4) Nachweis der Hybridisierung
Die Hybridisierung wurde auf dieselbe Weise wie im Beispiel (4) nachgewiesen, außer dass der im Vergleichsbeispiel (3) hergestellte Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger statt des das Alkylierungsreagens tragenden Objektträgers verwendet wurde. Tabelle 1 Signaldetektion

O:: Das Signal erschien einheitlich und klar
Δ:: Ein Teil des Signals erschien ungleichmäßig oder unklar
x:: Der Großteil des Signals erschien ungleichmäßig oder unklar

Aus den in Tabelle 1 dargestellten Ergebnissen ist ersichtlich, dass entsprechend der erfindungsgemäßen Verfahrens zum Nachweis von Nukleinsäuren, der Nachweis von Nukleinsäuren als ein klares Signal mit hoher Empfindlichkeit auftritt.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung wird ein Substrat mit immobilisierten Nukleinsäuren zur Verfügung gestellt, auf dem DNS stabil immobilisiert ist. Weil das erfindungsgemäße Substrat Nukleinsäuren ohne nachteilige Einschränkungen bezüglich der Anteil oder Größe ihrer Ketten immobilisieren kann, können mit demselben Basismaterial gleichzeitig verschiedene Nukleinsäuren gehandhabt werden. Weiterhin zeigt das erfindungsgemäße Substrat hervorragende Lagerungseigenschaften, weil es stabil gegen Licht, Wärme, Luftfeuchtigkeit usw. ist.
Darüber hinaus kann es ein Substrat mit immobilisierten Nukleinsäuren sein, das bei der Verwendung als DNS-Sonde oder Ähnlichem effizient ist und hervorragende Reproduzierbarkeit und Quantifizierungsmöglichkeiten hat, weil die Nukleinsäuren mit einer kovalenten Bindung fest mit dem Träger gebunden sind.

Claims

Substrat mit immobilisierten Nukleinsäuren mit einem Träger und identischen oder unterschiedlichen Nukleinsäuren, die eine funktionelle Gruppe aufweisen, die Reaktivität mit Stickstoffyperiten zeigt, wobei der Träger ein Basismaterial und ein vom Basismaterial getragenes Stickstoffyperit mit lediglich einer alkylierenden Gruppe umfasst, und wobei zunächst das Stickstoffyperit mit lediglich einer alkylierenden Gruppe vom Basismaterial getragen wird und dann die Nukleinsäuren an einer Vielzahl punktartiger Gebiete auf dem Träger über kovalente Bindungen zwischen der funktionellen Gruppe und der alkylierenden Gruppe immobilisiert werden.
Substrat mit immobilisierten Nukleinsäuren nach Anspruch 1, wobei der Träger die durch die folgende allgemeine Formel (I) dargestellte Struktur hat: M-R_n-G (I)[in der Formel stellt M das Stickstoffyperit mit lediglich einer alkylierenden Gruppe dar, R eine ausgewählte funktionelle Gruppe, die aus der von -NH-, -CH₂-, -NHCO-, -CONH-, -O-, -S-, -N(R¹)- (R¹ stellt eine normale, cyclische oder verzweigte, gesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe mit 1–20 Kohlenstoffatomen oder eine ungesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe mit 1–20 Kohlenstoffatomen dar),
(R² und R³ stellen unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, eine normale oder verzweigte gesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe mit 1–20 Kohlenstoffatomen oder eine ungesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe mit 1–20 Kohlenstoffatomen, eine Cycloalkylgruppe, eine Arylgruppe oder eine Aralkylgruppe, die einen oder mehrere Substituenten aufweisen kann, dar, wobei unter der Voraussetzung, dass eine der Gruppen R² und R³ ein Wasserstoffatom darstellt, die andere eine normale oder verzweigte gesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe mit 1–20 Kohlenstoffatomen oder eine ungesättigte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe mit 1–20 Kohlenstoffatomen, eine Cycloalkylgruppe, eine Arylgruppe oder eine Aralkylgruppe, die einen oder mehrere Substituenten aufweisen kann, darstellt, R² und R³ können auch aneinander gebunden sein und eine Stickstoff enthaltende, heterocyclische Gruppe bilden, die ein Sauerstoffatom enthalten kann), -COO-, -OCO-, -NHSO₂-, -NHC(S)NH- und -SO₂NH- gebildeten Gruppe gewählt wird; n eine ganze Zahl zwischen 0 und 20, wenn mehr als zwei R-Gruppen existieren, können sie identisch oder voneinander verschieden sein; und G das Basismaterial oder ein Polymer, das am Basismaterial haftet].
Träger zum Immobilisieren von Nukleinsäuren, der ein Basismaterial und ein vom Basismaterial getragenes Stickstoffyperit umfasst, wobei das Stickstoffyperit lediglich eine alkylierende Gruppe hat.
Verfahren zur Herstellung eines Trägers zum Immobilisieren von Nukleinsäuren, der ein Basismaterial und ein vom Basismaterial getragenes Stickstoffyperit umfasst, wobei das Stickstoffyperit lediglich eine alkylierende Gruppe hat, das eine Stufe umfasst, in der das Stickstoffyperit mit einer alkylierenden Gruppe und einer funktionellen Gruppe, die keine alkylierende Gruppe ist, kovalent mit einer funktionellen Gruppe an der Oberfläche des Basismaterials, das die funktionelle Gruppe aufweist, die mit derjenigen funktionellen Gruppe des Stickstoffyperits, die nicht die alkylierende Gruppe ist, kovalent gebunden werden kann, gebunden wird, während die alkylierende Gruppe des Stickstoffyperits unumgesetzt bleibt.
Verfahren zur Herstellung eines Substrats mit immobilisierten Nukleinsäuren, das eine Stufe umfasst, in der die Nukleinsäuren mit einem Träger zum Immobilisieren von Nukleinsäuren in Kontakt gebracht werden, wobei der Träger ein Basismaterial und vom Basismaterial getragenes Stickstoffyperit umfasst und das Stickstoffyperit nur eine alkylierende Gruppe hat.
Verfahren zum Nachweis einer Nukleinsäure durch Hybridisierung unter Verwendung einer mit einer Markersubstanz markierten Nukleinsäure, wobei das Substrat mit immobilisierten Nukleinsäuren nach irgendeinem der Ansprüche 1 oder 2 verwendet wird.