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Hintergrund
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Die
vorliegende Erfindung befasst sich mit dem Prozess der Blutgerinnung,
welchem eine extrem komplizierte Serie von Interaktionen zugrunde
liegt und der allgemein als die Gerinnungskaskade bekannt ist, und der
gut beschrieben ist in Thrombosis and Hemorrhage, Sec. Ed., 1998,
publiziert von Williams und Wilkins. Er schließt eine Serie von sequentiellen,
proteolytischen Abläufen,
welche zur Gerinnung hin gerichtet sind, und eine komplementäre Serie
von hemmenden Abläufen,
die an der Beendigung oder der Hemmung der Gerinnung beteiligt sind,
ein. Für
ein besseres Verständnis
dieser Erfindung zeigt 1 einen Teil der Blutgerinnungskaskade.
Die Aktivierung der Blutgerinnung läuft auf verschiedenen Wegen
ab, von denen zwei, der intrinsische und der extrinsische Weg, dargestellt
werden. Diese konvergieren und formen einen gemeinsamen Weg, welcher
zur Gerinnselbildung führt.
Blutgerinnungsfaktoren sind inaktive Zymogene oder inaktive Kofaktoren,
die, sobald sie durch eine aktive Protease gespalten werden, aktiviert
werden (mit einem „a" angezeigt), und
der Reihe nach das nächste
Zymogen oder den Vorläufer
eines Kofaktors in der Kaskade aktivieren.
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Im
extrinsischen Weg exponiert verletztes Gewebe den Gewebefaktor (Tissue
factor), der den Faktor VII zu der aktivierten Form VIIa aktiviert.
Der Gewebefaktor und der Faktor VIIa bilden einen Komplex, welcher den
Faktor X, im gemeinsamen Weg, aktiviert.
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Im
intrinsischen Weg werden negativ geladene Oberflächen exponiert und wirken auf
den Faktor XII und Prekallikrein in der Blutbahn. Faktor XII wird
aktiviert zu Faktor XIIa, welcher Faktor XI zu Faktor XIa aktiviert.
Faktor XIa aktiviert Faktor IX zu Faktor IXa. Faktor IXa, Faktor
Villa, Phospholipide und freie Kalziumionen sind für die Bildung
des Tenase-Komplexes erforderlich, welcher Faktor X aktiviert.
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Faktor
Xa, Faktor Va, Phospholipide und freie Kalziumionen sind für die Bildung
des ProthrombinaseKomplexes erforderlich, mit dem sich diese Erfindung
insbesondere befasst, und, der Prothrombin zu Thrombin aktiviert.
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Thrombin
ist das Schlüsselenzym
der Gerinnung und ist mit vielen positiven und negativen Rückkopplungseffekten
und auch mit dem eigentlichen Gerinnselbildungsprozess des Blutes
verbunden. Positive Feedbacks umfassen die Aktivierung der Faktoren
V, VIII und XI. Negative Feedbacks umfassen die Aktivierung von Protein
C in Anwesenheit von Thrombomodulin. Der Gerinnungsprozess umfasst
auch die Spaltung von Fibrinogen zu Fibrin und die Aktivierung der
Thrombozyten.
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Eine
Anzahl von endogen hemmenden Wechselwirkungen sind wichtig und werden
in der Figur kursiv und mit unterbrochenen Linien dargestellt.
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Demnach
inhibiert Antithrombin, ein Inhibitor mit einem relativ breiten
Spektrum, dessen Aktivität
stark durch Heparine, Heparinoide und Glycosaminoglycane verstärkt wird,
Faktor Xa, Thrombin, Faktor XIa und Faktor XIIa.
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Heparin-Kofaktor
II ist ein spezifischerer endogener Inhibitor, welcher an Thrombin
bindet, und dessen Aktivität
auch durch Heparin und zusätzlich
durch Dermatansulfat beschleunigt wird. Aktiviertes Protein C inaktiviert
Faktor Villa und FaktorVa. Der Tissue-Factor-Pathway-Inhibitor (TFPI)
inhibiert Faktor Xa und den Gewebefaktor/Faktor VIIa Komplex auf
eine von Faktor Xa abhängige
Weise.
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Ein
angemessenes Gleichgewicht zwischen aktivierenden und hemmenden
Faktoren ist für
eine physiologische Funktion des Gerinnungssystems erforderlich.
Unter gewissen Umständen,
wie zum Beispiel bei Hämophilie
oder Lupus, fehlen essentielle Faktoren, oder Stoffe (Antikoagulantien)
sind vorhanden, die störend
auf das Gerinnungssystem einwirken.
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Auch
Substanzen tierischer Herkunft können
mit Gerinnungsfaktoren interferieren. Hirudin zum Beispiel, ein
Protein aus der Speicheidrüse
des medizinischen Blutegels, ist ein sehr potenter Thrombininhibitor. Proteine
von Schlangengiften können
gewisse Faktoren simulieren und führen zur Gerinnung und Gerinnselbildung.
Insbesondere aktivieren einige Schlangengifte Faktor X und/oder
Faktor V und können
in in vitro Tests für
Antikoagulantien verwendet werden.
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Die
Abhängigkeit
der Bildung des Prothrombinase- und des Tenase-Komplexes von der
Anwesenheit von freien Kalziumionen erlaubt eine vorübergehende
Antikoagulation, zum Beispiel mit Zitrat (oder anderen ionischen
Komplexbildnern), von einer Blutprobe. Dies erlaubt den Transport
und das Zentrifugieren einer Probe ohne dass sie koaguliert, und
erlaubt auch die Durchführung
gewisser analytischer Reaktionen ohne die Bildung der genannten
Komplexe.
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Anschließende Zugabe
von Kalziumionen kann in Anwesenheit von Phospholipiden sofort die
Aktivierung von Prothrombin zu Thrombin stimulieren.
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Oft
ist es erforderlich das Blut mit Substanzen zu behandeln, die einen koagulierenden
(bei Blutungskomplikationen) oder antikoaguherenden Effekt aufweisen
(für die
Prävention
oder die Behandlung von thrombotischen Komplikationen und während Eingriffen,
bei weichen Blut mit künstlichem
Material in Kontakt kommt, wie z.B. bei einem extrakorporalen Blutkreislauf).
Eine erfolgreiche Langzeit-Antikoagulation ist mit Vitamin K Antagonisten
möglich,
wie zum Beispiel Warfarin oder anderen von Cumarin abgeleiteten,
oralen Antikoagulantien. Diese Substanzen führen zu einer verminderten
Gerinnungsaktivität
des Blutes, da sie mit der Bildung gewisser Gerinnungsfaktoren interferieren.
Da diese nicht bereits gebildete Gerinnungsfaktoren inhibieren, brauchen
sie mehrere Tage, bis eine stabile Antikoagulation erreicht wird.
In vielen Situationen ist eine rasche Antikoagulation erforderlich.
Eine Strategie, um eine Antikoagulation in Patienten zu erreichen,
ist die direkte oder indirekte Hemmung von aktivierten Koaguiationsfaktoren.
Die Inhibition von gewissen Faktoren kann durch Gebrauch von Heparinen
oder Heparinoiden erreicht werden, welche Antithrombin und! oder
Heparin-Kofaktor II vom Plasma beanspruchen, und durch den Gebrauch
von direkten, natürlichen
oder synthetischen Inhibitoren von Faktor IIa (Thrombin) und Xa
(zum Beispiel Hirudin, Argatroban, Zecken-Antikoagulans).
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Alle
diese Substanzen zielen hauptsächlich
auf aktivierten Faktor X (FXa) und/oder Thrombin. Es ist wichtig,
eine angemessene Antikoagulationsintensität zu benützen, da zu hohe und auch unangebracht
zu tiefe Antikoagulation zu Verlust von Organgewebe oder sogar zum
Tod eines Patienten führen
kann.
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Einige
Antikoagulantien, wie zum Beispiel unfraktioniertes Heparin (UFH),
besitzen sehr variable pharmakokinetische Eigenschaften und deren
Verwendung erfordert das Überwachen
des Patientenzustandes. Dabei wird Plasma des behandelten Patienten
getestet und – falls
nötig – wird die
individuelle Dosierung der Antikoagulantien angepasst.
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Andere
Strategien der Gerinnungshemmung, wie die Verwendung von niedermolekularen
Heparinen (LMWH), benötigen
routinemäßig kein
Monitoring der Antikoagulationswirkung, da deren Pharmakokinetik
normalerweise weniger variabel ist. LMWHs enthalten nur einen Teil
der Glycosaminoglycan-Heparinkette, sind weniger aktiv als UFH und
häufig
werden sie als sicherer in der Anwendung betrachtet. Auch mit den
LMWHs sind in gewissen Fällen
Laborresultate für
das Monitoring der Medikamentenwirkung zwingend erforderlich – zum Beispiel
bei Blutungskomplikationen während
einer Antikoagulations-Behandlung, vermutete oder manifestierte
Verschlechterung der Medikamenten-Clearance (zum Beispiel bei Nierenfehlfunktion),
unübliche Pharmakokinetik
(zum Beispiel bei Kindern oder sehr übergewichtigen Patienten) oder
vermuteter oder potentieller Über-
oder Unterdosierung.
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Die
Verlängerung
der Gerinnung ist von der Konzentration des Antikoagulans in der
Probe abhängig. Die
Europäische
Pharmakopöe-Kommission
wendet eine Standard-Wirksamkeitsbestimmung
der Anti-Faktor Xa Aktivität
(aXa) für
LMWHs an.
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Bekannte Gerinnungsbestimmungen
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Methoden
zur Bestimmung der Wirkung auf die Blutgerinnung und/oder Konzentration
im Blut oder Plasma von direkten oder indirekten Inhibitoren von
aktivierten Gerinnungsfaktoren umfassen: (a) Die Messung der Inhibition
von Gerinnungsfaktoren (zum Beispiel Flla und FXa) unter der Verwendung
von Analysen mit chromogenen Substraten und (b) Die so genannten „Gerinnungsmethoden', zum Beispiel die
aPTT (aktivierte partielle Thromboplastinzeit), die ACT (aktivierten
Gerinnunszeit), die TT (Thrombinzeit), die ECT (Ecarin-Gerinnungszeit)
und den Heptest®.
Die Gerinnungsmethoden sind dadurch charakterisiert, dass die Gerinnung
auf verschiedene Arten aktiviert wird und die Zeit von der Aktivierung
bis zur Detektion des Gerinnsels in der Probe gemessen wird. Die
Gerinnungszeit kann mittels einer Kalibrationskurve, die mit geeigneten
Kalibrationsreagenzien erstellt wird, direkt in Konzentrationseinheiten
umgerechnet werden.
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Analyse des Anti-Faktor-Xa
und Anti-Faktor-IIa mittels chromogener Substrate
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Üblicherweise
wird eine Plasmaprobe zu einem Reagenz hinzugefügt, das eine definierte Menge
Faktor ha oder Faktor Xa enthält
(in gewissen Tests wird auch Antithrombin hinzugefügt). Während einer
Inkubationsphase wird Faktor Xa/IIa teilweise durch das Antikoagulans
inaktiviert oder durch Bildung von Komplexen des Antikoagulans mit
endogenem oder exogenem Antithrombin. Ein chromogenes Substrat wird
hinzugefügt und
durch verbliebenen Faktor Xa/IIa degradiert (abgebaut), so dass
die optische Dichte verstärkt
wird und optisch detektiert werden kann. Mittels einer Kalibrierungskurve
wird die Anti-Faktor-Xa/IIa Aktivität oder die AntikoagulansKonzentration
ermittelt.
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Diese
Methoden erlauben die spezifische Bestimmung von Antikoagulans- Konzentrationen.
Allerdings sind diese Methoden relativ teuer und erfordern spezialisierte
Instrumente und sind daher in der klinischen Praxis nicht weit verbreitet.
Zudem wird die Interaktion des Antikoagulans mit dem Gerinnungssystem
des Patienten nicht ermittelt und die in viva Situation wird somit
nicht direkt wiedergegeben.
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Die Bestimmung der aPTT
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Eine
Blut- oder (gebräuchlicher)
eine Plasmaprobe wird zu einem Reagenz hinzugefügt, das einen Kontaktaktivator
(häufig
Substanzen mit negativ geladenen Oberflächen – wie Ellagsäure, Cehite
oder Kaohin) und Phospholipide enthält; diese Mischung wird 2–10 Minuten
in Abwesenheit von Kalziumionen inkubiert. Die Zeit, zwischen der
Zugabe von Ca2+ bis zur Detektion der Fibrin-Bildung,
ist die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aPTT).
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Die
aPTT Bestimmung hat die Vorteile, dass es sich hier um einen breit
verfügbaren
Test handelt, die Gerinnungsmethode einfach ist und bereits eine
grosse Erfahrung im Überwachen
der Antikoagulans-Therapie besteht. Obwohl die aPTT eine relativ
schlecht standardisierte Methode ist, wird sie häufig für das Überwachen von unfraktioniertem
Heparin (UFH) verwendet, wohingegen LMWH nicht mit diesem Test überwacht
werden kann, wegen dessen niedriger Empfindlichkeit. Zusätzlich zu
der tiefen Sensitivität
gegenüber
LMWH, leidet der Test unter der nicht linearen Dosis-Wirkungsabhängigkeit
bei direkten Thrombininhibitoren wie Hirudin, der zu hohen Sensitivität für UFH, der
schlechten Standardisierung von verschiedenen Instrumenten, Reagenzien und
selbst von verschiedenen Chargen des gleichen Reagenz. Auch die
Dosis-Wirkungs-Kurve für
Heparin ist nicht linear Hinsichtlich des Mechanismus des aPTT Test,
muss festgehalten werden, dass die Initiierung der Gerinnung durch
die Kontaktaktivierung (die so genannte Kontaktphase) nicht ein
Teil des physiologischen, hemostatischen Weges im Körper darstellt.
Die Kontaktphase ist schwierig zu standardisieren, dies ist einer
der Gründe
für die
sehr schlechte Standardisierung des Tests, Viele Faktoren nehmen
an der Gerinnungsaktivierung im aPTT Test teil (XII, XI, VIII, IX,
X, V, II), während
die Hemmung der Faktoren X und II der Hauptweg der Antikoagulans-Therapie
mit der Benutzung von Heparin, Heparinoiden und direkten Inhibitoren
zu sein scheint.
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Aus
diesen Gründen
ergibt der Test weder eine sehr realistische Abschätzung der
erzielten Antikoagulation im Patienten, noch bestimmt sie die Antikoagulation
mit einer angemessenen Spezifität
der antikoagulatorischen Behandlung. Zusätzlich reagiert der Test auch
sensitiv auf die Anwesenheit von Lupus Antikoagulans.
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Die Bestimmung der ECT
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Der
Ecarin Clotting Time (ECT) oder Ecarin-Gerinnungszeit Test ist ein
auf Gerinnung basierender Test zur Überwachung der Wirkung von
direkten Antithrombin Reagenzien, Ecarin, eine gereinigte Protease aus
dem Schlangengift von Echis carinatus, wandelt Prothrombin in Meizothrombin
(einen Vorläufer
von Thrombin) um, und führt
zu einem Gerinnungsendpunkt in zitriertem Vollblut (Citratblut)
und Plasma. Antithrombin-Reagenzien (Thrombinhemmer) wie Hirudin
binden Meizothrombin und verlängern
die Ecarin-Gerinnungszeit. Tiefe Prothrombinspiegel im Probeplasma
beeinträchtigen
die Ecarin-Gerinnungszeit Tests stark.
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Die Bestimmung der ACT
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Diese
Methode besteht im Prinzip aus der Zugabe von Blut zu Kaolin oder
Celite und dem Messen des Zeitintervalls bis zur Fibrinbildung in
der Probe. Diese Methode ist weit verbreitet. Sie ist eine Point
of Care Methode mit einer kurzen Durchführungszeit und einem grossen
Messbereich, der die Überwachung
von hohen Heparindosierungen während
kardiovaskulären
Eingriffen erlaubt.
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Die
Bestimmung der ACT hat viele Einschränkungen: Eine schwache Korrelation
zur Gerinnungshemmer-Konzentration (bestimmt mit chromogener Substratanalyse),
geringe Sensitivität
für tiefe
Heparinkonzentrationen (bis zu 0.7 U UFH/ml für eine normale ACT), niedrige
Sensitivität
für LMWH,
lange Gerinnungszeiten und eine sehr starke Abhängigkeit von patienteneigenen
Gerinnungsfaktoren. Es gibt nur eine schlechte Standardisierung
der verschiedenen klinisch verwendeten ACT-Methoden.
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Die Bestimmung der Thrombinzeit
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Die
Methode besteht darin, dass eine bestimmte Menge Thrombin zur Plasmaprobe
hinzugefügt
wird und das Zeitintervall bis zur Detektion eines Gerinnsels gemessen
wird.
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Diese
Methode besitzt den Vorteil, dass spezifisch die Thrombinhemmung
gemessen wird. Obwohl dieser einfache Test die direkte Messung der
Anti-Thrombinaktivität
im Plasma erlaubt, ist der Test nicht weit verbreitet, auf Grund
der geringen Verlässlichkeit
und schlechten Standardisierung. Zusätzlich kann die Hemmung des
Faktors Xa nicht ermittelt werden. Die enge Messbreite ist stark
abhängig
von der hinzugefügten Thrombinkonzentration,
und verschiedene Resultate können
erhalten werden in Abhängigkeit
von der Thrombinkonzentration, der Spezies, der Anwesenheit von
Kalzium, und dem Volumenverhältnis
von Thrombin zu Probe.
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Der Heparintest gemäß Yin (vorgestellt
1973)
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Grundsätzlich basiert
dieser Test auf der Inkubation von zitriertem Plasma mit bovinem
Faktor Xa. Nach einer bestimmten Inkubationszeit wird ein Reagenz
mit Phospholipiden und bovinem Plasma hinzugefügt und anschliessend wird mit
einer Kalziumchloridlösung
rekalzifiziert. Dieser Test erlaubt eine sensitive Bestimmung von
LMWH und UFH mit einer Gerinnungsmethode. Allerdings umfasst der
Test eine relativ komplizierte 3-Schritt-Methode und benötigt bovines
Plasma (dies kann die realistische Abschätzung des gerinnungshemmenden
Effektes einschränken).
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Heptest® (Variante
des Yin Tests (vorgestellt 1987))
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Dieser
Test, beschrieben in US Patent 4,946,775 besteht im Prinzip aus
der Inkubation einer Plasmaprobe oder Blutprobe mit Faktor Xa. Nach
einer bestimmten Inkubationszeit wird ein Reagenz mit Kalziumchlorid,
Phospholipiden und einer bovinen Plasmafraktion hinzugefügt; und
die Zeit bis zur Detektion der Gerinnung gemessen. Die bovine Plasmafraktion
ist gemäss
dem Hersteller reich an Faktor V und Fibrinogen, während sie
arm an Prothrombin und anderen Gerinnungsfaktoren ist, sodass sie
nicht von selbst gerinnen kann. Wie der Originaltest von Yin bietet
diese Methode eine sensitive Bestimmung von LMWH und UFH mit einem relativ
einfachen Gerinnungstest. Allerdings hat der Heptest® eine
geringe Sensitivität
für direkte
Thrombininhibitoren wie Hirudin; eine hohe Standardisierung der
bovinen Plasmafraktion ist zwingend erforderlich; die Wirkung der
bovinen Plasmafraktion auf das Patienten-Gerinnungssystem ist nicht
absolut bestimmt, und die Durchführung
auf optischen Bestimmungsgeräten
kann ein Problem darstellen, da das optische Signal nicht aussagekräftig ist – wie ersichtlich
werden wird. Obwohl der Heptest® eine
einfache Methode ist, wird er nicht sehr weit verbreitet angewendet.
Die Chemie und Pharmakologie von Heparin und den oben erwähnten Tests werden
in Thrombosis and Hemorrhage (Siehe oben), und „Kandrotas, R.J., Heparin
Pharmacokinetics and Pharmacodynamios, Ciln. Pharmacokinet., Vol.
22, 1992, Seiten 359–374" beschrieben. Obwohl
die meisten bekannten Tests mit Flüssigreagenzien durchgeführt werden,
wurden Systeme vor allem für
Point of Care Anwendungen entwickelt, die die Reagenzien in trockenem
Zustand zur Verfügung
stellen. Beispiele solcher Systeme werden in den US Patenten 4756884,
4861712, 5059525, 5110727 und 5300779 und EP-A-680727 beschrieben.
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Die
vorliegende Erfindung zielt darauf, einen einfachen und verlässlichen
hämatologischen
Test anzubieten, der sensitiv und anpassungsfähig in der Sensitivität ist, die Überwachung
von verschiedenen Antikoagulantien ermöglicht, insbesondere LMWH,
UFH, Heparinoide, Dermatansulfat, natürliche oder synthetische Inhibitoren
von Faktor Xa und Inhibitoren von Faktor-IIa wie Argatroban oder
Hirudin, und in einer bevorzugten Form eine stabile Basislinie ergibt,
wenn mit optischen Koagulometern gearbeitet wird. Wie ersichtlich
werden wird, ermöglicht
diese Erfindung zusätzlich
zur Überwachung
der Gerinnungshemmung viele weitere Anwendungen. Hiernach werden
folgende Definitionen verwendet:
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Blut-Gerinnungspotential
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Generell
gesagt bedeutet das Gerinnungs- oder Koagulationspotential die Fähigkeit
von Patientenblut, zu gerinnen, oder genauer, die Fähigkeit
Gerinnungsfaktoren zu aktivieren oder zu inhibieren.
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Dies
wird der Einfachheit halber in dieser Beschreibung als ein Wert
definiert, der anhand von Vergleichen, Verhältnissen, zu einem Normalwert
oder Standard, für
die Fähigkeit
einer Probe steht (zum Beispiel von menschlichem Vollblut oder Plasma
oder von anderen Körperflüssigkeiten
von Säugetieren,
die Blut oder Plasma enthalten), bis zur Bildung von Thrombin oder
eines Gerinnsels zu koagulieren. Dieser Wert kann durch messen der
Zeit, beginnend von der Induktion der Gerinnung, ermittelt werden
(zum Beispiel nach Zugabe zur Probe von einem oder mehreren
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Gerinnungsbeschleunigern
wie Phospholipiden oder Kalziumionen). Wie auch immer ein Wert,
der auf das Koagulationsspotential hindeutet, kann ein indirekt
gemessener (oder abgeleiteter) Wert sein, wie z.B. ein Indikatorwert
von einem hinzugefügten
analytischen Agens (z.B. ein chromogenes Substrat), Dies kann einen Wert
ergeben für
z.B. die Aktivität
einer Komponente wie Faktor Xa (welcher Prothrombin zu Thrombin
aktiviert) oder für
die Aktivität
von Thrombin.
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Gerinnungsbeschleuniger
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Dieser
ist definiert als ein Material oder eine Substanz oder ein Gemisch,
der die Bildungsrate von Thrombin stark beschleunigt. Vorzugsweise
ist es eine Substanz, die die Gruppe der Substanzen vervollständigt, die
für die
Bildung des Prothrombinase-Komplexes notwendig sind. Demnach katalysiert
der vollständig zusammengesetzte
Prothrombinase-Komplex die Thrombinbildung um 300,000-mal effizienter
als Faktor Xa alleine. Zusätzlich
zu Faktor Va und Faktor Xa erfordert der Prothrombinasekomplex die
Anwesenheit von Phospholipiden (oder Blutplättchen) und Kalziumionen (ersatzweise
auch andere Ionen).
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Analytischer Hilfsstoff
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Dieser
ist definiert als ein Mittel, das zum Reaktionssystem hinzugefügt wird – z.B. zu
einer Probe vor, oder normalerweise nach einem Verfahren, um die
beobachtbare oder andernfalls nachweisbare Aktivität in geeigneter
Weise darzustellen. Ein chromogenes Substrat ist ein allgemein verwendeter,
analytischer Hilfsstoff: Ein Peptid mit unterschiedlichen, chromophoren
Gruppen, welche freigesetzt werden, sobald z.B. Faktor Xa und/oder
Thrombin auf das Substrat wirken. Solche Substanzen können spezifisch
für die
Aktivitätsbestimmung
von Faktor Xa, oder für
die Detektion der Thrombinbildung entwickelt werden. Die Verwendung
von Peptidsubstraten wird in „Witt,
Irene, Test systems willi synthetic peptide substrates in haemostaseology.
Eur J din Chem Clin Biochem. 199 1; 29(6): 355–74. Seiten 355–374" beschrieben.
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Huisse
et aL, Thrombosis Res. 1986; 44(1), Seiten 11–22, beschreiben Untersuchungen
in Patientenblut mit abnormalem Prothrombin. In einem Teil der Untersuchungen
wurde eine aufgereinigte Patientenprobe mit einer Mischung von Faktor
Xa und Va und zusätzlich
mit einer Mischung von Faktor Xa und dem Gift von Echis carinatus
(nicht Russell's
Viper) inkubiert. Es werden keine Routineanalysen in Vollblut oder
zitriertem Blut beschrieben.
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Van
Rijin et al., Biochemistrty. 1984; 23(20): Seiten 4557–64" beschreiben eine
Untersuchung des Effektes von Faktor Va und Phospholipiden auf die
Bildung des „Enzym-Substrat-Komplex". In dieser Untersuchung
beschreiben sie die Inkubation von humanem Serumalbumin mit Faktor
Xa +/– Faktor
Va. Es werden keine Routineanalysen in Vollblut oder zitriertem
Blut beschrieben.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Entsprechend
einem ersten Aspekt liefert diese Erfindung einen hämatologischen
Test, mit dem das Gerinnungspotential einer Körperflüssigkeit ausgewählt aus
Vollblut resp. Citratblut (oder anderweitig vorübergehend antikoaguliertem
Blut) oder Plasma getestet wird, wobei die Probe der Körperflüssigkeit
mit einer Menge an Aktivierungsreagenz zur Reaktion gebracht wird,
wobei nötigenfalls
die Gerinnung durch Beigabe eines oder mehrerer Gerinnungsbeschleuniger
ausgelöst
wird und ein Wert für
das Gerinnungspotential ermittelt wird.
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Das
genannte Reagenz enthält
in Kombination:
- (a) eine vorbestimmte Menge
an Faktor Xa oder eine hämatologisch äquivalente
Mutante dieses Faktors und
- (b) eine vorbestimmte Menge an Faktor Va, eine hämatologisch äquivalente
Mutante dieses Faktors, oder ein Enzym, welches endogenen Faktor
V aktiviert.
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Obwohl
normalerweise für
das Aktivierungsreagenz eine wässrige
Pufferlösung
als Medium verwendet wird, ist die Verwendung eines Puffers nicht
immer erforderlich. Die bevorzugten Tests, die beschrieben werden,
werden mit Proben einer definierten Menge (z.B. Gewicht oder Volumen)
an Blut oder Plasma durchgeführt.
Diese Erfindung ist auch auf Point of Care-Systemen anwendbar, die
nicht notwendigerweise eine genau definierte Probenmenge benötigen. Ein
Beispiel eines solchen Point of Care-Systemes stellt der CoaguCheck® von
Roche Diagnostics, Mannheim, dar. Der erforderte Wert kann durch
Messung der Zeit, die eine definierte Probemenge bis zum Einsetzen
einer direkt oder indirekt detektierbaren Gerinnung benötigt, erfolgen
(z.B. unter Verwendung eines optischen oder mechanischen Koagulometers,
oder wahlweise durch Zusatz eines analytischen Hilfsstoffes zur
behandelten Probe, der ein detektierbares Signal liefert). Der analytische
Hilfsstoff kann ein synthetisches Substrat sein, das spezifisch
für die
Messung der Thrombinaktivität
oder der Faktor-Xa-Aktivität
ist und die Detektion der betreffenden Aktivität erlaubt.
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Obwohl
chromogene Substrate besser bekannt sind und normalerweise vorzuziehen
sind, kann auch ein Substrat verwendet werden, das fluorogene, amperogene
oder luminogene Eigenschaften hat. Der benötigte Wert kann auch durch
die Zugabe von Partikeln zum Reaktionssystem, die während der
Gerinnung ein mechanisches, magnetisches oder elektrisches Verhalten
aufweisen und eine geeignete Detektion des Verhaltens ermöglichen,
bestimmt werden.
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Um
das Gerinnungspotential zu bestimmen wird üblicherweise der Wert, der
mit der genannten definierten Probemenge erhalten wird, mit Werten
von einem oder mehreren Standards oder Referenzproben verglichen.
Die Referenzprobe kann eine vergleichbare Probe einer normalen Körperflüssigkeit
sein (z.B. Blut, Plasma oder eine Probe, die Blut oder Plasma enthält). Der
Test kann für
die Bestimmung einer Blutgerinnungskomponente oder eines Behandlungszusatzes
einer Körperflüssigkeitsprobe,
enthaltend eine vorgegebene Menge an menschlichem oder tierischem
Blut oder Plasma, verwendet werden, wobei das Gerinnungspotential
mit demjenigen einer oder mehrer Standards verglichen wird.
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Das
Gerinnungspotential kann verglichen werden mit dem Gerinnungspotential
einer vergleichbaren Probe einer normalen Körperflüssigkeit und/oder mit einer
vergleichbaren Probe einer Körperflüssigkeit,
in der die gesuchte Komponente (oder Zusatz) fehlt, oder die einen
bestimmten Überschuss
dieser Komponente (oder Zusatz) enthält.
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In
einem bevorzugten Test wird der besagte Wert durch folgende Nachweise
ermittelt:
- (i) die Zeit von einer solchen Zugabe
bis zum Einsetzen der Gerinnung
- (ii) die Zeit von einer solchen Zugabe bis zum Nachweis von
freier Thrombinaktivität
- (iii) die Thrombinaktivität
- (iv) die Faktor-Xa-Aktivität
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Vorzugsweise
beinhaltet das Aktivierungsreagenz eine definierte Menge an natürlichen
oder synthetischen Phospholipiden oder Blutplättchen und die Methode schliesst
die Zugabe eines Gerinnungsbeschleunigers zum Reaktionssystem ein,
welcher eine vorbestimmt Menge Kalziumionen (oder funktional äquivalente Ionen)
enthält.
Vorzugsweise werden Kalziumionen als Gerinnungsbeschleuniger verwendet.
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Phospholipide,
vorzugsweise eine definierte Menge, werden normalerweise in einer
Anfangsphase hinzugefügt
(z.B. im Aktivierungsreagenz und! oder vor einem Inkubationsschritt),
obwohl die Erfindung eine mögliche
Verwendung von Phospholipiden als Beschleuniger einschließt. In einem
solchen Fall können Kalziumionen
mit dem Aktivierungsreagenz hinzugefügt werden. Der Test wird vorzugsweise
mit menschlichem Plasma durchgeführt,
kann aber auch mit menschlichem Vollblut, tierischem Blut oder tierischem
Plasma durchgeführt
werden. Im bevorzugten Test wird vorzugsweise Plasma oder Vollblut
menschlicher Herkunft verwendet, wobei das Kalzium gebunden wurde,
damit sich kein Prothrombinase-Komplex
bildet bevor die Gerinnung durch die Zugabe von Kalziumionen oder
anderen Gerinnungsbeschleunigern initiiert wird. Angenommen wird,
dass bevor sich der Prothrombinase-Komplex etabliert oder zusammenfügt der im
erfinderischen Test hinzugefügte
Faktor Xa progressiv durch vorhandene Antikoagulantien, die gegen
Faktor Xa wirken, inaktiviert wird.
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Sobald
sich der Prothrombinase-Komplex etabliert hat, ist Faktor Xa vor
jeglicher weiteren Inaktivierung geschützt und die endgültige Aktivität kann auf
stabile Weise gemessen werden. Der Test in dieser Erfindung ist
vor allem für
die Überwachung
des Effektes auf die Patientenblutgerinnung verwendbar, der durch
die Dosierung eines Gerinnungshemmer hervorgerufen wird, insbesondere
durch natürliche
oder synthetische FaktorXa-Inhibitoren und/oder Thrombin (Faktor
IIa)-Inhibitoren sowie im speziellen unfraktioniertes Heparin (UFH),
niedermolekulares Heparin (LMWH), Dermatansulfat, Argatroban, modifiziertes
Hirudin und Hirudin. Der Test kann für die Überwachung des Effektes auf
die Patientenblutgerinnung, der durch die Dosierung eines Antikörpers gegen
eine oder mehrere Blutgerinnungskomponenten entsteht oder für die Bestimmung
der Blutgerinnungspotentials eines Patienten, der einen möglichen
Mangel oder Überfluss
eines oder mehrer Blutgerinnungskomponenten hat (z.B. Gerinnungsfaktoren,
welche gerinnungshemmende oder gerinnungsfördernde Enzyme oder Proenzyme
sein können)
verwendet werden.
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Er
kann für
die Bestimmung des Blutgerinnungspotentials von Vollblut oder Plasma
verwendet werden, das einen möglichen
Antikörper
gegen eine oder mehrere Blutkomponenten beinhaltet (z.B. Lupus-Antikoagulans).
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Als
Quelle für
das genannte Enzym, das endogenen Faktor V aktiviert, ist bevorzugt
ein Schlangengift zu verwenden, das eine Faktor-V-aktivierende Komponente
enthält,
und das frei von Faktor-X-aktivierenden Komponenten ist. Die bevorzugte
Quelle für
den Faktor-V-Aktivator ist das Schlangengift von Russell's Viper (RVV-V).
Dies ist beschrieben in Tokunaga et al., The factor V activating
enzyme (RVV-V) from Russel's
viper venom. J Biol Chem. 1988; 263(33): Seiten 17471–17481.
Das Enzym kann bei der Firma Pentapharm AG in Basel erworben werden.
Andere Schlangengifte, (die angemessen aufbereitet worden sind,
um die Faktor-X-aktivierende
Komponente zu entfernen), sind Schlangengifte von Vipera lebetina,
von Bothrops Spezies, von Akgistrodon Spezies und von Echis Spezies.
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Eine
bevorzugte Methode umfasst folgende Schritte:
Mischen einer
Probe von Körperflüssigkeiten
mit einer bestimmten Menge Aktivierungsreagenz, die Inkubation der
Mischung, die Zugabe eines besagten Beschleunigers (und eventuell
eines analytischen Hilfsmittels) und die Bestimmung eines Wertes,
der das Gerinnungspotential wiedergibt.
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Insbesondere
umfasst der bevorzugte Test folgende Schritte:
- i.
Herstellung eines Aktivierungsreagenz mit folgendem Inhalt: eine
vorbestimmte Menge von 0.01 bis 10 nkat/ml (0.0053–5.3 mg/ml)
an Faktor Xa, eine vorbestimmte Menge von 0.05 bis 10 (bevorzugt
5) U/ml an RVV-V, und (gegebenenfalls) einer vorbestimmten Menge
von 1 bis 200 μg/ml
an Phospholipiden, in einer wässrigen
Pufferlösung
mit 10 bis 200 mM Tris/HCl, 0.6 bis 1.2% g/v NaCl und 0.01 bis 1.0%
g/v Albumin,
- ii. Mischen einer bestimmten Menge von 1 bis 100 μl plättchenarmen
Plasmas, dessen Kalzium mit Zitrat oder anderweitig abgebunden ist,
mit einer vorbestimmten Menge von 1 bis 100 μl Aktivierungsreagenz,
- iii. Inkubation der Mischung,
- iv. Zugabe einer bestimmten Menge von 10 bis 100 μl CaCl2 in einer Konzentration von 2 bis 200 mM
(vorzugsweise 100 mM),
- v. Gegebenenfalls Zugabe eines analytischen Hilfsstoffes, welcher
zu einem messbaren Wert führt
und
- vi. Bestimmung des genannten Wertes.
-
Die
Pufferlösung
hat vorzugsweise einen pH-Wert zwischen 6 und 10, vorzugsweise zwischen
6 und 9, noch besser 7 und 8 und idealerweise einen pH Wert von
7.4.
-
Vorzugsweise
umfasst die Methode folgende Schritte:
- i. Herstellung
eines Aktivierungsreagenz mit folgendem Inhalt:
0.4 nkat/ml
(0.021 mg/ml) Faktor Xa,
4 U/ml RVV-V, und
50 μg/ml Phospholipide
aus Kaninchenhirn-Kephalin,
in einer wässrigen Pufferlösung mit
50 mM Tris/HCl, 0–9%
g/v NaCl und 0.5% g/v Albumin bei einem pH-Wert von 7.4
- ii. Mischen von 50 μl
citrierten, plättchenarmen
Plasmas mit 50 μl
Aktivierungsreagenz, Inkubation der Mischung während 3 Minuten bei 37°C,
- iv. Zugabe von 50 μl
CaCl2 in einer Konzentration von 25 mM,
- v. gegebenenfalls Zugabe eines analytischen Hilfsstoffes, welcher
zu einem messbaren Wert führt
und
- vi. Bestimmung des genannten Wertes.
-
Während der
Inkubationsschritt normalerweise angewendet wird, kann in einer
Modifikation des Tests – wie
er oben beschrieben wird – zur
Messung hoher Konzentrationen von Heparin und ähnlichen Antikoagulantien,
der Inkubationsschritt weggelassen werden. Ein bevorzugter Test
dieser Art umfasst folgende Schritte:
- i. Herstellung
eines Aktivierungsreagenz mit folgendem Inhalt:
0.2 nkat/ml
(0.011 mg/ml) Faktor Xa,
2 U/ml RVV-V, und
25 μl/ml Phospholipiden
aus Kaninchenhirn-Kephalin,
in einer wässrigen Pufferlösung mit
25 mM Tris/HCl, 0.45% g/v NaCl, 0.25% g/v Albumin und 12.5 mM CaCl2 bei einem pH-Wert von 7.4,
- ii. Mischung von 50 μl
plättchenarmem
Plasma mit 100 μl
Aktivierungsreagenz, gegebenenfalls Zugabe eines analytischen Hilfsstoffes,
welcher zu einem messbaren Wert führt und
- iv. Bestimmung des genannten Wertes.
-
Vorzugsweise
wird der genannte Wert über
die Zeitmessung von der Zugabe des CaCl2 bis
zum Beginn der Gerinnung über
ein optisches Koagulometer bestimmt.
-
In
einem Test zur Bestimmung der Anwesenheit und/oder Konzentration
eines vermuteten gerinnungsfördernden
oder gerinnungshemmenden Bestandteils in einer Plasmaprobe, kann
die Plasmaprobe mit Plasma, welches nur bezüglich des vermuteten, gerinnungsfördernden
oder gerinnungshemmenden Bestandteils abgereichert ist, verdünnt werden,
und der bestimmte Wert kann mit demjenigen verglichen werden, der
mit abgereichertem und/oder normalem Plasma bestimmt wird.
-
Eine
Plasmaprobe kann auch mit Normalplasma, einer Plasmafraktion, einem
oder mehreren einzelnen Gerinnungsfaktoren verdünnt werden, um den Einfluss
von Matrixeffekten zu reduzieren und um die Abhängigkeit von Plasmagerinnungsfaktoren
zu minimieren, Das Plasma kann auch mit Substanzen versetzt werden,
die Heparin oder heparinähnliche
Substanzen inaktivieren, um die Spezifität zur Bestimmung von nicht
heparinartigen Antikoagulantien zu erhöhen. Der Test kann in einer
Plasmaprobe ausgeführt
werden, welche mit einer Substanz behandelt wurde, die einen oder
mehrere Gerinnungsfaktoren aktiviert oder inaktiviert.
-
Die
Erfindung schließt
weiter auch die Verwendung eines Kits in Blutgerinnungstests – wie oben
beschrieben – ein.
Das Kit enthält
in Kombination:
- (i) ein Aktivierungsreagenz,
wie es oben definiert ist oder getrennte Bestandteile davon,
- (ii) Kontroll- und! oder Kalibratorproben und
- (iii) ein oder mehrere optionale Zubehörteile ausgewählt aus
einer wässrigen
Lösung
von Kalzium oder einem äquivalenten
Salz von ausgewiesener Konzentration, ein analytisches Hilfsmittel,
Normalplasma, eine oder mehrere Plasmafraktionen, einen oder mehrere
Gerinnungsfaktoren, Wasser und! oder eine oder mehrere Pufferlösungen oder äquivalente
Lyophilisate davon. Vorzugsweise enthält das analytische Hilfsmittel
eine oder mehrere Lösungen
oder Lyophilisate von synthetischen Substraten zur Bestimmung von Thrombin
und/oder Faktor Xa.
-
Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
-
Bevorzugte
Formen der Erfindung werden hiernach unter Bezugnahme auf die beiliegenden:
Zeichnungen
beschrieben:
-
1 ist
ein Diagramm, das – wie
oben beschrieben – die
Blutgerinnungskaskade darstellt,
-
2 ist
eine Graphik, die typische Dosis-Wirkungskurven für LMWH,
UFH und Hirudin in einem Heptest® beschreibt,
-
3 ist
eine Graphik, die optische Signalkurven zeigt, die sich bei einem
typischen Heptest® ergeben,
-
4 ist
ein Diagramm, welches das Prinzip des vorliegenden Tests beschreibt,
-
5 ist
eine Graphik – ähnlich zu 2 – die typische
Dosis-Wirkungskurven in einem Test für LMWH, UFH und Hirudin gemäß der vorliegenden
Erfindung beschreibt,
-
6 ist
eine Graphik – ähnlich zu 3 – die optische
Signalkurven zeigt, die sich in einem Test gemäß der vorliegenden Erfindung
ergeben,
-
7 ist
eine Graphik, die den Effekt der Zugabe von zusätzlichen Mengen an Faktor Xa
zeigt
-
8 ist
eine Graphik, die den Effekt des Auslassens eines Inkubationsschrittes
zeigt,
-
9 ist
eine Graphik, die Resultate zeigt, die für einen oral antikoagulierten
Patienten durch die Anwendung des erfinderischen Tests und des Heptest® erhalten
wurden.
-
10 ist
eine Graphik, die die Korrelation von Versuchen mit der vorliegenden
Erfindung und Versuchen nach dem anti-Faktor-Xa-Prinzip zeigt; diese
wurden mit Freiwilligen durchgeführt,
die mit LMWH behandelt wurden.
-
11a, 11b, 11c sind Graphiken, die ähnlich zu 5,
die Durchführung
mit Trockenreagenzien zeigen,
-
12 ist
ein Diagramm zur Darstellung eines Kapillarsystemgerätes, und
-
13 ist
eine Darstellung einer unterschiedlichen Form eines Kapillarsystemgerätes.
-
Bevorzugte Formen der
Erfindung
-
2 zeigt
für den
Vergleich mit der Erfindung die Dosis-Wirkungskurve des Heptests® mit
den gebräuchlichen
Gerinnungshemmern LMWH, UFH und mit rekombinantem Hirudin (r-Hirudin)
in normalem, menschlichen Referenzplasma. Diese Figur demonstriert
die relativ schlechte Empfindlichkeit des Heptests® für direkte
Thrombininhibitoren, im diesem Fall Hirudin.
-
3 zeigt
optische Signale des Heptests® auf einem Behring Coagulation
System (BCS) Mikrokoagulometer bei einer Wellenlänge von 405 nm. Die Basislinie
der kombinierten Probe (Zitratplasma zubereitet wie in der Heptest®-Verpackung
empfohlen) ist nicht stabil.
-
Eine
Abnahme der Absorption erlaubt die exakte Bestimmung des Beginns
der Gerinnselbildung nicht. Die ganze Reaktionskurve zeigt Störungen,
welche einen negativen Einfluss auf die Genauigkeit haben können. Dies
ist ein Nachteil, sobald moderne automatische Koagulometer für die Endpunktbestimmung
verwendet werden.
-
Ein
bevorzugter Test gemäß der Erfindung
erlaubt die Bestimmung des Gerinnungspotentials von Proben unter
der Verwendung einer Gerinnungsmethode, die auf der Benutzung von
zwei, bevorzugt drei, Aktivierungsreagenzien in definierten Konzentrationen
basiert und zusammen mit Kalziumionen, die üblicherweise den Beginn der
Gerinnung einleiten, verwendet wird.
-
Obwohl
diese Methode analog dem Yin-Test und dem Heptest® auf
der Bildung eines Prothrombinase-Komplexes auf Phospholipiden beruht,
konnten viele oder die meisten der erwähnten Nachteile beseitigt werden,
einschließlich
den schlechten optischen Signalen – wie beschrieben und in 3 aufgezeigt.
Für die relevanten
Konzentrationsbereiche und in der klinischen Praxis ist diese neue
Methode sensitiv für
UFH, LMWH, Hirudin und andere direkte oder indirekte Faktor Xa-
und! oder Thrombininhibitoren.
-
Außerdem bietet
der Test ein sehr stabiles optisches Signal.
-
Um
in der bevorzugten Methode den Test durchzuführen, wird eine Blut- oder
Plasmaprobe (wobei Kalziumionen abwesend oder komplexiert oder gebunden
sind – z.B.
durch Zitrierung), mit einer definierten Menge Faktor Xa, Phospholipiden
und einem Faktor V aktivierenden Enzym inkubiert, vorzugsweise mit
einem speziell dazu vorbereiteten Aktivierungsreagenz, Nach einer
Inkubationsperiode wird die Probe/Reagenzmischung rekalzifiziert,
mit z.B. CaCl2 und die Zeit bis zur Gerinnselbildung
(Gerinnungszeit) wird beobachtet und aufgezeichnet. Zum Vergleich
mit 1 zeigt 4 den Aktivierungsprozess
in einem Diagramm. Bestandteile des Aktivierungsreagenzes sind in
fettgedruckten Buchstaben ersichtlich. Die Aktivierung beruht auf
der Etablierung eines Prothrombinasekomplexes, bestehend aus einer
bestimmten Menge an Faktor Xa, patienteneigenem Faktor V, der durch
eine bestimmte Menge Faktor-V-Aktivator aus dem Gift von Russell
Viper (RVV-V) aktiviert wird, Phospholipiden und CaCl2.
Die Rekalzifizierung von zitriertem Blut oder Plasma wird benötigt um das
Zusammenführen
des Prothrombinasekomplexes auf der Phospholipidoberfläche zu vollenden
wodurch der Gerinnungsablauf beginnt.
-
Im
Gegensatz zu vorherigen Methoden wie dem Yin Test, in dem der Faktor
Va durch die positive Feedback-Aktivierung bei der Thrombinformation
generiert wird, verwendet die erfinderische Methode einen thrombinunabhängigen Schritt
für die
sofortige und vollständige
Aktivierung des Faktors V zu Faktor Va in der Probe.
-
In
einer Modifikation können Überschüsse von
Faktor V und/oder anderen Faktoren hinzugefügt werden um das Testsystem
unabhängig
von Aktivitätsänderungen
dieses Faktors zu machen. Die hinzugefügten Faktoren können einfach
Plasma oder Plasmafraktionen sein. Gereinigte oder rekombinante
Faktoren oder Faktoren, die geeignete Mutationen aufweisen, können verwendet
werden.
-
Beispiel 1
-
Herstellung
des Aktivierungsreagenz
-
Ein
Aktivierungsreagenz mit folgender Zusammensetzung wurde zubereitet:
| NaCl
in wässriger
Lösung | 09%
g/v |
| Tris/HCL
Puffer, pH 7.41 | 50
mM |
| Albumin2 | 0.5%
g/v |
| Faktor
Xa (FXa)3 | 0.4
nkat/ml (0.021 mg/ml) |
| Faktor
V Aktivator (RW-V)4 | |
| aus
dem Gift der Russell Viper | 4
U/ml |
| Phospholipide5 | 50 μg/ml |
-
Testvorgehen
-
50 μl zitriertes,
blutplättchenarmes
Plasma wurden mit 50 μl
Aktivierungsreagenz gemischt und verschiedene Mengen an LMWH6, UFH7 und r-Hirudin8 wurden hinzugefügt um Testproben herzustellen.
Die Proben wurden 180 Sekunden bei 37°C inkubiert. Zu jeder Probe
wurden 50 μl
25 mM CaCl2 Lösung hinzugefügt und die
Gerinnungszeit werden auf einem optischen Koagulometer BCS (DADE-Behring)
gemessen.
-
Die
Resultate sind in 5 in Form von Antikoagulans-Konzentrationen
gezeigt.
-
Beim
Vergleich von 5 mit 2 wird ersichtlich,
dass gegenüber
dem Heptest' eine
hohe Sensitivitätssteigerung
um fast einen Faktor 2 erreicht wird. Im Gegensatz zum Heptest® ist
der erfinderische Test auch sehr sensitiv für Hirudin. Die optischen Signale
des Tests werden in 6 gezeigt. Auf dem Behring Coagulation
System wird eine sehr stabile Basislinie bei einer Wellenlänge von
405 nm erreicht wie dies zum Vergleich in 3 zu sehen
ist, und bei Gerinnungsbeginn ist ein scharfer Anstieg der Trübung vorhanden.
-
Die
Signale sind sehr beweiskräftig
und weisen einen tiefen Störungsgrad
auf. Daher kann erwartet werden, dass der Test auf verschiedenen
Instrumenten mit optischer oder mechanischer Detektion des Gerinnungsbeginns
einfach adaptiert werden kann.
-
- 1. Sigma, München
- 2. Humanes Serumalbumin von Centeon, Marburg
- 3. FXa von Chromogenix, Essen
- 4. Pentapharm AG, Basel
- 5. Kaninchenhirnkephalin von Pentapharm AG, Basel
- 6. WHO-Standard LMWH von Chromogenix, Essen
- 7. Unfraktioniertes Heparin von B Braun-Melsungen, Melsungen
- 8. Rekombinantes Hirudin (Lepirudin® von
Hoechst Marrion Roussel, Bad Soden) Referenzplasma wurde von Immuno,
Wien bezogen und wie vorgeschrieben rekonstituiert.
-
Beispiel 2
-
Änderung der Faktor Xa Konzentration
-
Unerwartet
wurde gefunden, dass durch ändern
der hinzugefügten
Faktor Xa Konzentration, die Sensitivität des Aktivierungsprozesses über weite
Bereiche angepasst werden konnte.
-
Vorgehen
-
Das
Vorgehen wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt mit der Ausnahme, dass
die Aktivierungsreagenzien mit verschiedenen Konzentrationen an
Faktor Xa (FXa) von 0.1 bis 1.6 nkat/ml vorbereitet wurden und die Testproben
mit 0, 0.5 und 1 U/ml LMWH versetzt wurden. Die Resultate werden
in 7 gezeigt. Unerwartete, gute Signale wurden auch
mit reduzierten Konzentrationen an Faktor Xa erhalten und eine stabile
Basislinie wird auch mit heparinisierten Proben erreicht.
-
Diese
Entdeckung ermöglicht
Tests, die für
ein breites Spektrum an unbekannten AntikoagulansKonzentrationen
bestimmt sind, und eine Vielfalt an verschiedenen Anwendungen sind
möglich,
dazu gehören:
- a) Tests für
die Inaktivierung von Faktor Xa und Thrombin, wobei die Bestimmung
der Thrombinaktivität
mittels Substraten (z.B. chromogene Substrate) erfolgt, welche detektierbare
Signale für
Thrombin ergeben.
- b) Tests für
die Inaktivierung von Faktor V durch die Zugabe von aktiviertem
Protein C oder durch das Aktivieren von endogenem Protein C mittels
geeigneter Enzyme (z.B. Protac® oder Thrombinf Thrombomodulin).
- c) Tests für
andere Unbekannte wie Aktivatoren, Inhibitoren oder Substrate, welche
ein detektierbares Signal mit Faktor Xa oder Thrombin ergeben.
-
Beispiel 3
-
Änderung
der Inkubationszeit
-
Es
wurde auch gefunden, dass das Durchführen der Aktivierungsphase
ohne einen Inkubationsschritt zu einem erweiterten Messbereich – speziell
für unfraktioniertes
Heparin – führt. Dies
ist wertvoll für
die Bestimmung von hohen Antikoagulans-Konzentrationen.
-
Herstellung
des Aktivierungsreagenz
-
Das
Aktivierungsreagenz aus Beispiel 1 wurde mit einem gleichen Volumen
an 0.025 M Kalziumchlorid Lösung
verdünnt
um ein Reagenz herzustellen, welches folgende Eigenschaften besitzt:
| NaCl
in wässriger
Lösung | 0.45%
glv |
| Tris/HCL
Puffer, pH 7.4 | 25
mM |
| Albumin | 0.25%
g/v |
| Faktor
Xa (FXa) | 0.2
nkat/ml (0.011 mg/ml) |
| Faktor
V Aktivator (RVV-V) | |
| aus
dem Gift der Russell Viper | 2
U/ml |
| Phospholipide | 25 μg/ml |
| CaCl2 | 12.5
mM |
-
Vorgehen
-
50 μl Probe aus
zitriertem plättchenarmem
Plasma mit verschiedenen Mengen an LMWH, UFH oder r-Hirudin wurden
mit 100 μl
Aktivierungsreagenz gemischt und die Zeit bis zu Gerinnungsbeginn
wurde wie in Beispiel 1 gemessen. Die Resultate, die in 8 gezeigt
werden, weisen einen grossen Messbereich auf mit besonders guten
Resultaten für
UFH.
-
Beispiel 4
-
Oral antikoagulierter
Patient
-
Analysen
von Patientenproben mit reduzierter Faktorenaktivität ergaben
nach Behandlung mit Zusätzen
(z.B. orale Antikoagulantien) im neuen Test einen viel tieferen
additiven Effekt von Faktorenmangel und Antikoagulans als im Heptest®.
Dies kann im neuen Vorgehen durch die starke direkte Aktivierung
von Faktor V bedingt sein, da eine mögliche Verzögerung der thrombinvermittelten
Faktor-V- Aktivierung
minimiert wird, sobald die Thrombinbildung selbst durch eine reduzierte
Faktorenaktivität
verzögert
eintritt. Daher kann unter solchen Umständen mit dem neuen Test die
Antikoagulans-Konzentration verlässlicher
bestimmt werden.
-
In
diesem Beispiel wurden Proben vorbereitet, die von Blut eines Patienten
stammten, das mit einem oralen Antikoagulans behandelt wurde, das
eine international normalisierte Ratio (INR) von 3.2 aufwies. Zurzeit
verwendete orale Antikoagulantien sind Kumarin-Derivate wie Warfarin.
Dies sind kompetitive Inhibitoren des Vitamins K bei der Gamma-Carboxylierung
von Vitamin-Kabhängigen
Gerinnungsfaktoren, sodass primär nur
die jeweiligen Carboxyproteine gebildet werden, welche die kalziumbindende
Fähigkeit
nicht haben. Die Aktivität
dieser Faktoren ist reduziert. Die Proben enthielten 0, 0.25, und
0.5 anti-Xa (aXa) Einheiten hinzugefügtes LMWH. Die Proben wurden
mit dem Heptest® und
mit dem Vorgehen durchgeführt,
das im Beispiel 1 beschrieben ist. Die graphische Darstellung der
Resultate ist in 9 zu finden. Die oralen Antikoagulantien hatten
im erfinderischen Test wenig oder keinen Einfluss auf die LMWH-Aktivität während im
Heptest® ein
großer
Unterschied ersichtlich wurde.
-
Beispiel 5
-
Verwendung
eines chromogenen Substrates
-
Das
folgende Vorgehen kann verwendet werden:
50 μl zitriertes,
frisch gefrorenes Plasma mit verschiedenen Mengen an LMWH, UFH und
r-Hirudin (siehe Beispiel 1) wird mit 87.4 μl Aktivierungsreagenz (siehe
Beispiel 1) 5 Minuten bei 37°C
inkubiert. Anschließend
wird eine die Reaktion beschleunigende Lösung hinzugefügt, diese
enthält:
| Tris/HCl
Puffer, 50 mM in 0.9% g/v NaCl, pH 7.4 | 562.5 μl |
| Pefabloc®FG,10
mg/ml in 0.9% g/v NaCl | 100.0 μl |
| CaCl2, 25 mM | 100.0 μl |
| Chromogenes
Substrat für
Thrombin, 4 mM in Wasser | 100.0 μl |
-
Die
Lösungen
werden gemischt und die Änderung
der optischen Dichte wird nach 5 Minuten Inkubation bei 37°C bei 405
nm gemessen.
-
Beispiel 6
-
Vergleich
des erfinderischen Tests mit einem anti-Faktor-Xa Test
-
Der
erfinderische Test wurde mit einem anti-Faktor-Xa Aktivitätstest unter
der Verwendung eines chromogenen Substrates verglichen.
-
30
Proben von mit LMWH-behandelten Freiwilligen wurden nach dem beschriebenen
Vorgehen in Beispiel 1, und der „Anti-Xa"-Bestimmung (antifactor Xa activity
assay) von Chromogenix (Mölndal,
Schweden), nach Herstellervorschrift getestet. Wie in der 10 dargestellt
zeigen die Resultate eine gute Korrelation.
-
Verwendung
von Trockenreagenzien
-
Das
folgende Beispiel stellt dar, dass das Aktivierungsreagenz dieser
Erfindung nach Lyophilisation oder Lufttrocknung einzelner Proben
rekonstituiert werden kann und in sehr kleinen Mengen für Point-of-Care Anwendungen
benutzt werden kann.
-
Beispiel 7
-
Zubereitung
des Aktivierungsreagenz
-
Ein
Aktivierungsreagenz mit folgender Zusammensetzung wurde vorbereitet:
| NaCl
in wässriger
Lösung | 0.9%
g/v |
| Tris/HCL
Puffer, pH 7.41 | 50
mM |
| Glycin2 | 1.0%
g/v |
| Faktor
Xa (FXa)3 | 0.4
nkat/ml (0.021 mg/ml) |
| Faktor
V Aktivator (RVV-V)4 | |
| aus
dem Gift der Russell Viper | 4
U/ml |
| Phospholipide5 | 50 μg/ml |
-
Portionen
von 1 ml wurden in Vials abgefüllt
und lyophilisiert oder 50 μl
Aktivierungsreagenz wurden in Küvetten
für den
KC4 Micro Koagulometer überführt und
24 h luftgetrocknet.
-
Testvorgehen
-
50 μl zitriertes,
plättchenarmes
Plasma wurden mit 50 μl
Aktivierungsreagenz gemischt, das nach Lyophilisation mit Wasser
rekonstituiert wurde, und verschiedene Mengen an LMWH6,
UFH7 und rHirudin8 werden
hinzugefügt
um Testproben herzustellen.
-
Für einen
Vergleich wurden 50 μl
Wasser zum luftgetrockneten Reagenz hinzugefügt und mit 50 μl zitriertem,
plättchenarmem
Plasma und verschiedenen Mengen an LMWH, UFH und r-Hirudin gemischt
um Testproben herzustellen. Die Proben wurden 180 Sekunden bei 37°C inkubiert.
Zu jeder Probe wurden anschließend
50 μl 25
mM CaCl2 Lösung hinzugefügt und die
Gerinnungszeit wurde auf einem KC4 Micro Koagulometer gemessen.
-
Die
Resultate in den 11a–11c zeigen – bezogen
auf die Antikoagulantien –,
dass der Test mit auf verschiedene Weise getrockneten Reagenzien
einfach durchgeführt
werden kann, je nach Trocknungsmethode können geringfügige Unterschiede
in der Durchführung
des Tests entstehen.
- 1. Sigma, Buchs, Schweiz
- 2. Sigma, Buchs, Schweiz
- 3. FXa, IL, Mailand, Italien
- 4. RVV-V, Pentapharm AG, Basel, Schweiz
- 5. Kaninchenhirnkephalin, Pentapharm AG, Basel, Schweiz
- 6. WHO-Standard LMWH, NIBSC, Potters Bar, UK
- 7. WHO-Standard UH, NIBSC, Potters Bar, UK
- 8. Rekombinantes Hirudin, Pentapharm AG, Basel, Schweiz Referenzplasma
wurde von Immuno, Wien, bezogen und wie vorgeschrieben rekonstituiert.
-
Point of Care Anwendungen
-
In
vielen Situationen müssen
Gerinnungsanalysen patientennah (Point of Care) durchgeführt werden ohne
die Probe ins Notfalllabor transportieren zu müssen. Die Vorteile einer Point
of Care-Analyse umfassen folgende Aspekte:
Kurze Durchlaufzeit,
falls keine oder wenig Zeit für
den Transport der Probe zur Verfügung
steht. Dies kann zu schnellen überwachungsabhängigen therapeutischen
Entscheidungen führen.
Der Transport einer Probe zu einem Notfalllabor kann sehr teuer
sein, vor allem nachts, falls nur wenige Proben analysiert werden
müssen. Selbsttests
durch den Patienten sind möglich.
-
Auf
dem Markt sind verschiedene Point of Care-Methoden erhältlich.
Für die
Analyse der Antikoagulation sind die PT (Prothrombinzeit), die aPTT
(aktivierte partielle Thromboplastinzeit), die ACT (Activated Clotting
Time) und ähnliche
Methoden verfügbar,
sowie auch neue Ansätze
für die
Bestimmung von Heparin.
-
Die
aPTT als Point of Care-Test hat die gleichen Einschränkungen
wie die aPTT Bestimmungen im Labor: Nicht lineare Dosis-Wirkungskurven
für UFH
und Hirudin, niedrige Sensitivität
für LMWH
und grosse Variation zwischen den verschiedenen verfügbaren Methoden.
PT-Tests haben ähnliche
Nachteile.
-
Die
ACT beruht hauptsächlich
auf der Zugabe von Substanzen mit stark negativ geladenen Oberflächen (normalerweise
Kaolin oder Celite) zu nicht antikoaguliertem Blut. Nachteile der
ACT sind die fehlende Genauigkeit, die schlechte Korrelation der
ACT-Werte in Bezug auf unfraktioniertes Heparin oder Hirudin, lange
Messzeiten und die großen
Unterschiede zwischen den verschiedenen käuflichen Methoden.
-
Zusätzlich ist
die Sensitivität
der ACT für
LMWH sehr tief.
-
Ein
anderer Ansatz ist die ACT-basierende Protamin-Titration: Protaminsulfat
antagonisiert unfraktioniertes Heparin. 1 U unfraktioniertes Heparin
wird durch 1 U Protaminsulfat antagonisiert. Sobald Protamin im Überschuss
hinzugegeben wird, wird die ACT dosisabhängig verlängert. Daher wird bei der Analyse
einer heparinisierten Probe Protamin in steigenden Konzentrationen
zur ACT-Bestimmung zugegeben, wobei die kürzesten Gerinnungszeiten bedeuten,
dass die zugegebene Menge Protamin der Heparinkonzentration in der Probe
am besten entspricht.
-
In
der Protamin Titrationsbestimmung von Medtronic (Bull et al., Anesthesiology.
1975 Sep; 43(3): Seiten 346–353)
wird eine Kartusche mit 6 Kammern eingesetzt, welche den ACT Aktivator
und verschiedene Konzentrationen an Protamin enthält, In diesen
Kammern werden separate ACT Bestimmungen durchgeführt und
die Heparinkonzentration wird ermittelt.
-
Einschränkungen
dieser Methode sind:
-
Die
Methode ist nur für
die Überwachung
von UFH anwendbar. Hirudin wird nicht durch Protamin antagonisiert,
und da der Test auf der ACT basiert, ist er für die Überwachung von niedermolekularem
Heparin nicht anwendbar. Für
die Analyse einer Probe sind mehrere Bestimmungen erforderlich und
mehrere Kartuschen sind für
die Kontrolle von verschiedenen Konzentrationen von Heparin notwendig.
-
Viele
Veröffentlichungen
beschreiben Point of Care-Apparate mit Reaktionskammern, die durch
Kapillaren getrennt sind. So kann Probenmaterial wie Blut oder andere
Körperflüssigkeiten
die Kammern in genau bestimmten Mengen füllen, wobei die Kammern mit
vorbestimmten Mengen an Reagenz gefüllt sein können. Auf diese Weise kann
die genaue Abmessung des Probematerials vermieden werden (z.B. US
Patente 4.756.884, 5.300.779 (Biotrack), 5.110.727 (Cardiovascular).
Ein grosses Quellenverzeichnis, das die Verwendung der CoaguChek® Vorrichtung
betrifft, ist auf der Webpage von Roche Diagnostics GmbH einsehbar.
-
Wie
beschrieben in, van den Besselaar et al. Multicenter evaluation
of a new capillaty blood prothrombin time monitoring system Blood
Coagul Fibrinolysis. 1995 Dec; 6(8): Seiten 726–732 besitzt die Vorrichtung einen
Testträger ähnlich der 11 des US Patentes 5.110.727, Für die Verwendung
in einem PT Test (beschrieben in „Oberhardt et al, Dry reagent
technology for rapid, convenient measurements of blood coagulation and
fibrinolysis. Clin Chem. 1991 Apr; 37(4): Seiten 520–526) enthält der Träger Eisenoxid-Partikel
gemischt mit getrocknetem Kaninchenhirn-Thromboplastin in einer Reaktionskammer
(oder „Reaktionszone'), die durch eine
Kapillare mit einer offenen Einlasskammer (oder „Zone für die Probenapplikation") verbunden ist.
Eine Blutprobe von einem gestochenen Finger wird in die Einlasskammer
gegeben und das Blut wird aufgrund der Kapillarkräfte in die
Reaktionskammer gezogen. Der Kontakt mit dem Thromboplastin löst die Gerinnungskaskade
aus. Die Eisenoxidpartikel werden durch Magneten, wobei eines ein
Pulsieren verursacht, gezwungen sich senkrecht aufzurichten. Eine
Photozelle registriert das Pulsiermuster, welches abnimmt und schlussendlich
zum Stillstand kommt, sobald die Bildung der Fibrinmatrix erfolgt
ist.
-
Ähnliche
Vorrichtungen auf dem Markt sind der TAS® (Thrombolytic
Assessment System) Analyzer von Cardiovascular Diagnostics Inc.,
der Coumatrak® von
Biotrack Inc., und der CoagAMate® von
Organon Teknika Inc.
-
Zusammenfassend
gibt es bei den patientennahen Bestimmungsmethoden keinen universellen
und einfachen Überwachungstest
für die
Analyse von UFH, LMWH und Hirudin.
-
Wir
haben gefunden, dass durch die Aktivierung der Koagulation in Übereinstimmung
mit der Methode dieser Erfindung, z.B. durch eine Kombination von
FaktorXa und einem Enzym, das Faktor V aktiviert, wie RVV-V, verbesserte
Tests für
die Point of Care-Analyse von Antikoagulantien entworfen werden
können.
-
Diese
Tests können
auch direkt mit Vollblut durchgeführt werden, sodass kein Zentrifugationsschritt erforderlich
ist.
-
Daher
ist diese Erfindung einschließlich
eines hämatologischen
Point of Care-Test, bei dem das Aktivierungsreagenz, wie oben beschrieben,
an einer oder mehreren Reaktionstellen in der Testapparatur positioniert
ist, und eine zu testende Probe mit Körperflüssigkeit (z.B. Vollblut oder
zitriertes Blut) an der Einlassposition (z.B. eine offene Kammer)
der besagten Apparatur so angebracht wird, dass sie mit dem Aktivierungsreagenz
(z.B. via Kapillare) reagieren kann und ein Wert bestimmt wird,
der das Gerinnungspotential der Körperflüssigkeit wiedergibt.
-
Vorzugsweise
ist das Aktivierungsreagenz in getrockneter (vorzugsweise lyophilisierter)
Form vorhanden und wird durch die genannte Körperflüssigkeit aufgelöst, um eine
wässrige
Lösung
zu bilden.
-
Die
Erfindung schließt
auch einen Kit ein, um einen hämatologischen
Point of Care-Test
wie oben beschrieben durchzuführen,
enthaltend folgende Bestandteile:
- (a) Ein Testgerät mit mindestens
einer Reaktionsposition
- (b) Ein Aktivierungsreagenz (oder getrennte Bestandteile davon)
zur Anbringung auf besagter Reaktionsposition
- (c) Eine Einlassposition in Verbindung mit der besagten Reaktionsposition,
auf der eine Probe der zu testenden Körperflüssigkeit aufgebracht werden
kann, damit sie mit dem Aktivierungsreagenz in Berührung kommen
und mit diesem reagieren kann,
wobei das besagte Reagenz:
- (i) eine vorbestimmt Menge an Faktor Xa oder eine hämatologisch äquivalente
Mutante davon und
- (ii) eine vordefinierte Menge an Faktor Va, eine hämatologisch äquivalente
Mutante davon oder ein Enzym, das endogenen Faktor V aktiviert,
enthält,
wobei
das Aktivierungsreagenz in trockenem Zustand ist und so angeordnet
ist, dass es von der besagten Körperflüssigkeit
in eine wässrige
Lösung
gebracht wird.
-
Vorzugsweise
liegt das Aktivierungsreagenz an einer oder mehreren Reaktionspositionen
in getrockneter oder lyophilisierter Form vor.
-
Vorzugsweise
ist die besagte Reaktionsstelle definiert als eine Reaktionskammer
mit vorbestimmtem Volumen, und die Aktivierungsreagenzprobe hat
ein vorbestimmtes Gewicht, sodass mit der Probe der Körperflüssigkeit
eine wässrige
Lösung
mit vorbestimmter Konzentration entsteht.
-
Die
besagte Testapparatur kann zwei oder mehrere untereinander verbundene
Reaktionskammern umfassen (z.B. durch Kapillaren), wobei die Körperflüssigkeit
auf diese Weise dazu gebracht wird, nacheinander mit den Reagenzien
in den jeweiligen Kammern zu reagieren. Daher kann die besagte Körperflüssigkeit mit
FXa und RVV-V in
einer ersten Reaktionskammer und mit CaCl2 (oder
einem äquivalenten
Salz) in einer zweiten Reaktionskammer reagieren. Die Reagenzien
werden vorzugsweise in situ durch Lyophilisation getrocknet.
-
Allerdings
können
auch andere Trocknungsmethoden angewendet werden wie Trocknung bei
Raumtemperatur, Vakuumtrocknung, Trocknung mit Trockenmitteln, konvektives
Trocknen oder andere Trocknungsmethoden. Beschichten der Kammerwand
mit dem trockenen Reagenz reduziert das Ablösen des Reagenzes durch Schütteln, ist
aber nicht erforderlich. Die getrockneten oder wässrigen Reagenzien können auf
Matrizen wie Schwämmen
oder Vlies fixiert oder mikroverkapselt werden.
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Obwohl
die beiden erforderlichen Komponenten des Aktivierungsreagenzes
vorzugsweise zusammen positioniert werden, können sie auch in einer gleichwertigen
Weise in verschiedenen Kammern positioniert werden, welche die Probe
der Reihe nach durchläuft.
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Die
folgenden Beispiele beziehen sich auf die 12 und 13 welche
Kapillartestsysteme in Diagrammform zeigen. Der Hinweis auf Herstellmethoden
solcher Kapillarsysteme ist bei den vorher erwähnten US Patenten 4.756.884,
5,110.727, 5.300.779 und z.B. bei 2a des
US Patentes 5.300.779 zu finden.
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Beispiel 8
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Unbehandeltes
Vollblut
-
Eine
nicht-antikoagulierte, frisch gewonnene Vollblutprobe wird in die
Einlasskammer 1 des Kapillartestsystemes platziert, welches in 12 gezeigt
wird.
-
Genügend Blut
wird durch Kapillarkräfte
entlang der Kapillare 3 in die Reagenzkammer 2 gezogen, wobei diese
gefüllt
wird. Die Menge an Blut, die mit dem Reagenz reagiert, ist durch
die Größe der Reagenzkammer
gegeben und es besteht keine Notwendigkeit die Probe genau abzumessen.
Kammer 2 ist mit dem Aktivierungsreagenz beschichtet einschließlich FXa
und RVV-V in getrocknetem, vorzugsweise lyophilisiertem Zustand,
Nun löst
die Blutprobe das Reagenz und wird dadurch aktiviert. Die Gerinnung
kann optisch in der Kammer 2 oder an einem Punkt entlang der Ausgangskapillare
4 detektiert werden, wahlweise durch die Zugabe einer zusätzlichen
Substanz (z.B. chromogene Substrate, fluorogene Substrate, amperogene
Substrate oder paramagnetische Partikel). Durch Änderung der hinzugegebenen
FXa Konzentration können
die Sensitivität
und die Messbreite, die erforderlich ist, eingestellt werden.
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Die
Reaktion, die zur Gerinnung der Probe führt, umfasst die Hemmung des
zugegebenen FXa durch Antithrombin alleine, Antithrombin-UFH- oder
Antithrombin-LMWH-Komplexe,
Aktivierung von FV durch den hinzugefügten RVV-V, Bildung des Prothrombinasekomplexes
auf endogenen Phospholipidstrukturen (insbesondere Plättchenoberflächen), und
anschließend
die Bildung von freiem Thrombin. Obwohl die Reaktionen im flüssigen Zustand
stattfinden, können
die Reagenzien in der Reagenzienkammer in flüssigem und trockenem Zustand
vorliegen. Falls die Reagenzien in der Kammer in trockenem Zustand
vorliegen, werden diese durch die Probe gelöst. Dies kann dadurch ermöglicht werden,
dass Substanzen vor Lyophilisation oder anderen Trocknungsprozessen
zum Reagenz hinzugefügt
werden.
-
Verglichen
mit Flüssigreagenzien
kann der Hauptvorteil der Verwendung von Trockenreagenzien die längere Stabilität der Kartuschen
sein. Allerdings kann bei der Verwendung von Flüssigreagenzien die Stabilität durch
Puffern der Reagenzien bei einem geeigneten pH-Wert optimiert werden.
Sobald die Probe zugegeben wird, stabilisiert die Pufferkapazität die Probe
bei einem optimalen pH-Wert nahe bei 7.4. Bei Verwendung einer tiefen
Pufferkapazität
des Reagenzes, z.B. 2 mM, kann die Probe selbst den pH-Wert der
Reaktion einfach anpassen.
-
Beispiel 9: Zitrierte
Blutprobe, Einschrittreaktion
-
Eine
Mischung von FXa, RVV-V und CaCl2 wird,
vorzugsweise in getrockneter Form, z.B. lyophilisiert, in die Reagenzkammer
2 platziert (siehe 12) und eine Probe zitriertes
Blut wird in den Einlass von Kammer 1 eingeführt. Die Probe tritt entlang
der Kapillare 3 in die Kammer 2 ein und wird gleichzeitig rekalzifiziert,
sobald diese mit FXa und RVV-V in Kontakt kommt und löst. Die
Gerinnung kann wie im Beispiel 8 detektiert werden. Um die Sensitivität des Tests
zu reduzieren und dadurch die Messbreite zu vergrößern, können Phospholipide
zur Reagenzmischung hinzugefügt
werden. In diesem Fall werden im Reagenz Komplexe aus Phospholipiden
und FXa gebildet, die durch freies Kalzium vermittelt werden, dies
reduziert die Fähigkeit
von Antithrombin in der Probe hinzugefügten FXa zu inhibieren.
-
Dies
kann für
die Entwicklung von Point of Care-Tests für sehr hohe Mengen von Heparin
angewendet werden, z.B. bei der Überwachung
von Heparin-Therapien während
der offenen Herzchirurgie.
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Beispiel 10: Zitrierte
Blutprobe, Zweischritt-Reaktion
-
Eine
zitrierte Blutprobe wird in die Einlasskammer Ia des Gerätes (13)
transferiert. Das Probenmaterial fließt aufgrund der Kapillarkräfte entlang
der Kapillare 5 zu Kammer 2a, welche mit getrocknetem FXa und RW-V
beschichtet ist. Aktiviertes Probenmaterial wird wiederum aufgrund
der Kapillarkräfte
in die Kammer 3 gezogen, die mit getrocknetem CaCl2 beschichtet
ist. In der Reagenzkammer 3 wird die Probe durch den Kontakt mit
CaCl2 rekalzifiziert. In diesem Beispiel
ist die Konzentration besser standardisiert, da ein definierteres
Probenvolumen die Reagenzien berührt.
Die Inkubationszeit der Probe mit FXa und RVV-V hängt von der
Länge der
Kapillare 6 ab, welche die beiden Reagenzkammern verbindet, und
von der Geschwindigkeit der Proben-! Reagenz-Mischung durch die
Kapillare, wobei dies durch den Durchmesser der Kapillare definiert wird.
Die Inkubation der zitrierten Probe mit FXa und RVV-V in Abwesenheit
von freien Kalziumionen führt
zu höherer
Sensitivität
des Tests gegenüber
der anti-Faktor-Xa Aktivität
als in den zwei vorhergehenden Beispielen. Dies beruht darauf, dass
FXa, wenn es mit Phospholipidoberflächen inklusive Plättchenoberflächen assoziiert
ist, gegenüber
der Hemmung durch Antithrombin geschützt ist. Die Assoziation von
FXa zu Phospholipidoberflächen
wird durch freie Kalziumionen und den Carboxylgruppen der FXa-Moleküle vermittelt,
welche bei der Biosynthese in der Leber Vitamin K abhängig sind.
Bei Abwesenheit von freien Kalziumionen können die FXa-Moleküle durch
die Antithrombin-Heparin-Komplexe gehemmt werden. Die Sensitivität des Testes
kann bezüglich
der FXa Aktivität
je nach Anforderungen – durch
die Länge
der Kapillare 6, die zwischen den beiden Reagenzkammern liegt, angepasst
werden.
-
Variationen
-
Das
Aktivator-Reagenz und das Vorgehen bei der Aktivierung führen zu
zahlreichen Variationen der Tests und anderer Anwendungen. Insbesondere
kann das Vorgehen verändert
werden, um in einer unbekannten Probe nach einer der beschriebenen
Wirksubstanzen zu testen. Einige Variationen werden unten erläutert.
-
1. Variationen, die den
Beginn der Blutgerinnung erfassen
-
- i) Die Thrombinbildung kann durch die Zugabe
eines synthetischen Substrates, das für diesen Zweck geeignet ist,
erfasst werden. Das Substrat kann chromogene, fluorogene, amperogene,
luminogene oder andere messbare Eigenschaften besitzen. Das Substrat
kann z.B. durch Thrombin gespalten werden und dadurch eine detektierbare
Gruppe freisetzen.
- ii) Bekannte Detektionsmethoden können für die Messung der Viskosität, Elastizität, Fliesseigenschaften, Gerinnselresonanz,
Bewegung von Erythrozyten oder des Verhaltens von zugefügten Objekten
(z.B. Partikel, welche ihr Verhalten nach Gerinnungsbeginn ändern) verwendet
werden. Zum Beispiel kann die Osszilation von hinzugefügten magnetischen
Partikeln gemessen werden, oder die mechanischen Charakteristika
der zugefügten
Partikel.
- iii) Schnelle immunologische Detektionsvorgehen mit Thrombin-spezifischen
Antikörpern
können
angewendet werden, z.B. in Verbindung mit Plasmonresonanz oder ähnlichen
Techniken.
-
2. Variationen, die FXa
beinhalten
-
Anstelle
der Probe eine definierten Menge an FXa von boviner, menschlicher
oder anderer Herkunft hinzuzufügen,
kann eine Substanz verwendet werden, die endogenen FXa aktiviert
oder eine Substanz mit ähnlicher
Funktion, analog FXa, z.B. Mutanten von FXa, Schlangengiftenzyme,
oder Faktor X-aktivierende Cysteinproteinase aus Tumorzellen.
-
3. Variationen, die FV
beinhalten
-
Anstelle
FV im Plasma oder in einer anderen Quelle endogen durch die Zugabe
von RVV-V oder von Faktor-V-Aktivatoren von weiteren Schlangengiften
(z.B. Akgistrodon Spezies, Bothrops Spezies, Vipera lebetina, Echis
Spezies) oder von alternativ aktivierenden Substanzen zu aktivieren,
können
gewisse Anwendungen schon aktiviertes FV oder eine Substanz mit ähnlicher
Funktion wie FV z.B eine Mutante von FV verwendet werden.
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4. Variationen, die Phospholipide
beinhalten
-
Gewisse
Anwendungen können
andere Quellen von Phospholipiden verwenden, z. B.:
- i) Der Beitrag zur Gerinnung von patienteneignen Phospholipidstrukturen
könnte
bestimmt werden, z.B. unter der Verwendung einer Probe, in der Plättchen anwesend
sind.
- ii) Phospholipide können
durch die Verwendung einer Zweischrittmethode getestet werden, wobei
bei einem Schritt die unbekannten Phospholipide hinzugefügt werden.
- iii) Falls nötig
kann die Phospholipidkonzentration angepasst werden, um die mögliche Interferenz
von Lupus Antikoagulans oder Antiphospholipidantikörpern zu
minimieren.
-
Die
Phospholipide können
von menschlicher, tierischer, pflanzlicher oder synthetischer Herkunft
sein oder eine Mischung davon.
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5. Variationen, die die
Antikoagulantien involvieren
-
Durch
die Zugabe von Substanzen, welche Heparin inaktivieren (z.B. Protamin,
Heparinase oder Polybren) kann das Testverfahren spezifisch für heparinunabhängige Inhibitoren
von Faktor X, II oder Faktor V gemacht werden.
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6. Variationen, die das
Plasma betreffen
-
Die
Methode kann mit der Zugabe von Plasma, Plasmafraktionen oder einzelnen
Faktoren durchgeführt
werden, um Faktorenmangel auszugleichen und um den Test empfindlicher
oder weniger empfindlich für gewisse
Mechanismen zu machen. Solche zugefügten Substanzen können z.B.
enthalten:
- i) Humanes Normalplasma, oder Plasmafraktionen,
oder Einzelfaktoren, oder ähnliche
Mutanten
- ii) Bovines (oder anderes tierisches) normales Plasma, oder
Plasmafraktionen, oder Einzelfaktoren, oder ähnliche Mutanten
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7. Variationen, die andere
Faktoren umfassen
-
Die
Methode kann mit der Zugabe von synthetischen Substraten, Aktivatoren
oder Inhibitoren aller oder ausgewählter Kombinationen der Faktoren
II, IIa, V, Va, X und Xa durchgeführt werden.
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Schlussfolgerung
-
Abschliessend
zusammengefasst beinhaltet die vorliegende Erfindung einen einfachen
Plasmagerinnungstest, der auf definierten, griffbereiten und einfach
zu stabilisierenden Bestandteilen beruht. Die Resultate zeigen lineare
Dosis- Wirkungsbeziehungen
für LMWH,
UFH und Hirudin. Diese sehr guten Dosis-Wirkungsbeziehungen scheinen auf die
Bestimmung von Anti-Faktor-IIa und AntiFaktor-Xa Aktivität zu beruhen,
und diese Bestimmung ist unabhängig
von frühen
Stufen der Gerinnungskaskade und unabhängig von der FV Aktivierung
durch Thrombin (durch die Gerinnungsfaktoren der Probe generiert)
während
der Einleitung der Gerinnung.
-
Im
Gegensatz zu Methoden, die Prothrombin durch Prothrombinaktivatoren
von Schlangengiften aktivieren (z.B. die ECT-Methode für die Bestimmung
von Hirudin) benutzt die vorliegende Methode den physiologischen
Pfad der Prothrombinaktivierung (mit Faktor Xa, Faktor Va, Phospholipiden
und Kalziumionen). Bei der Bestimmung von physiologisch relevanten
Gerinnungsmechanismen und Prozessen ist dies von Vorteil.
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Die
Anpassung der neuen Methode auf verschiedene Gerinnungsgeräte unter
der Verwendung von Standardvorgehen einer aPTT und PT wird durch
das gute optische Signal, die hohe Genauigkeit, die kurzen Messzeiten
und die Bedienungsfreundlichkeit ermöglicht.
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Vergleicht
man Resultate der neuen Methode, die auf einem vorgeformten Prothrombinase-Komplex beruht,
mit Resultaten vom Heptest',
der vor dem Inkubationsschritt nur FXa verwendet, weisen die zwei
Tests signifikante Unterschiede auf.
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Der
Heptest® hatte – verglichen
mit dem erfinderischen Test – längere Gerinnungszeiten
mit LMWHProben und seine Sensitivität war etwas tiefer für UFH und
grundlegend tiefer für
Hirudin. Verglichen mit dem Heptest® basiert
die neue Methode auf einer definierten physiologischen Grundlage,
sie benötigt
keine bovine Plasmafraktion, sie aktiviert Faktor V unabhängig von
Thrombin, hat ein verbessertes optisches Signal und hat eine hohe
Sensitivität
für Hirudin.
Daher kann sie nicht nur für
die Überwachung
von UFH und LMWH verwendet werden, sondern auch für die Überwachung
von Hirudin mit dem gleichen Reagenz in den relevanten Konzentrationsbereichen.
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Im
Gegensatz zur Erfindung, beinhaltet der Russell Viper Venom Zeittest
(time assay), die Aktivierung durch Gift von Faktor X und die Aktivierung
von Faktor V, dies führt
zu verschiedenen FXa Konzentrationen – abhängig von der Faktor X Konzentration
des Patienten. In dieser Erfindung wird durch die Verwendung einer definierten
FXa Aktivität
eine genauer definierte Aktivierung erreicht. Letztendlich bietet
diese Erfindung eine Methode an, welche einen einfachen Test für die Überwachung
von LMWH, Heparinoiden, Hirudinen und UFH erlaubt und auf einem
einfachen Prinzip basiert.
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Eine
Vielfalt an weiteren Tests ist möglich,
falls der Aktivierungsvorgang mit Substanzen kombiniert wird, welche
Prozesse aktivieren oder hemmen, die die Faktoren V, X oder II direkt
oder indirekt beeinflussen (z.B. das Protein C System) oder falls
Indikatorsubstrate verwendet werden.