DE60018545T2

DE60018545T2 - Zusammensetzung zur Behandlung von degenerativen Gelenkerkrankungen

Info

Publication number: DE60018545T2
Application number: DE60018545T
Authority: DE
Inventors: Francesco Della Valle; Federica Della Valle
Original assignee: Innovet Italia SRL
Current assignee: Innovet Italia SRL
Priority date: 2000-01-20
Filing date: 2000-01-20
Publication date: 2006-04-06
Anticipated expiration: 2020-01-21
Also published as: EP1118332B1; ATE290400T1; EP1118332A1; ES2239582T3; DE60018545D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft tierärztliche und pharmazeutische Zusammensetzungen, die zur Vorbeugung und/oder begleitenden Behandlung von degenerativen Gelenkerkrankungen in Menschen und Tieren sowie Erkrankungen, die mit Schmerzen in den periartikulären Haltestrukturen (Muskeln, Sehnen, Bänder) einhergehen, verwendet werden können.
Viele paraphysiologische und pathologische Krankheitszustände bei Hunden, und insbesondere bei alternden Hunden, machen anfällig für degenerative Gelenkerkrankungen, die als DJD's bekannt sind (Mortarello et al., Veterinaria, 1 (Suppl.): 1–40, 1999).
Vom paraphysiologischen Standpunkt haben einige Rassen eine Prädisposition, DJD zu entwickeln, und zwar in dem Sinne, dass Hunde großer und sehr großer Rassen viel anfälliger für Gelenkerkrankungen sind, wegen der unterschiedlichen Entwicklung des Knochen- und Knorpelgewebes im Vergleich zum Muskelbändergewebe, das sich viel langsamer entwickelt (Grandjean et al., Rec. Med. Vet., 172: 519–530, 1996). Ebenso wie die Prädisposition der Rassen gibt es auch eine bestimmte Prädisposition, die mit der Lebensweise zusammenhängt. Hunde, die vital sind und/oder bei sportlichen Aktivitäten eingesetzt werden, können eine Überbelastung der Gelenkfläche erleiden, die mit mechanischer und/oder oxidativer Schädigung der Haltestrukturen des Gelenks, einschließlich einer Dehnung von Muskeln und Bändern, einhergeht.
Schließlich gibt es eine lange Liste von pathologischen Zuständen, die alle diejenigen klinischen Entwicklungszustände einschließt, die für DJD anfällig machen, und kürzlich mit dem Begriff DOD (developmental orthopaedic disease, = entwickelte orthopädische Erkrankung) bezeichnet wurden (Richardson et al., Vet. Clin. of North Am.: Small Animal Practice 28: 115–135, 1998), und die zahlreiche entwickelte Gelenkerkrankungen einschließen, die beispielsweise die Schulter (OCD), den Ellbogen (z.B. OCD, UAP, FCP), das Handwurzelgelenk (RCC, Hyperextension), das Knie (OCD, Dislokation der Kniescheibe, X-Bein), den Knöchel oder das Sprunggelenk (OCD, Klumpfuß, seitliche Verdrehung), den Fuß (z.B. Sesambeinkrankheit) und die Hüfte (Dysplasie, Legg-Calvé-Perthes-Krankheit) beeinträchtigen (Thomson et al., Australian Vet. J., 72(10), 1995; Mitsuoka et al., Arthroscopy, 14(6): 630–633, 1998; Alexander, Vet. Clin. of North Am.: Small Animal Practice, 22(3): 503–511, 1992; Cardinet et al., JAVMA, 210(10): 1466–1473, 1997; Fluckiger et al., Zentralbl. Veterinärmed. A., 45(5): 199–207, 1998; Langenbach et al., J. Am. Vet. Med. Assoc., 213(10): 1439–1443, 1998).
Es sollte erwähnt werden, dass die oben aufgeführten pathologischen Zustände nicht nur für Hunde spezifisch sind, sondern auch Pferde und andere Tiere sowie auch Menschen beeinträchtigen.
Es wurde festgestellt, dass die vorbeugende oder therapeutische Behandlung arthritischer Symptome nicht ausschließlich auf knorpelschützende Maßnahmen beschränkt sein kann, sondern auch auf eine Optimierung und/oder Wiederherstellung der Haltefunktionalität der periartikulären weichen Gewebe, sowie an erster Stelle der Muskeln und Bänder zielen sollte, welche zusammen als Myo-Sehnen-Bänder-morphofunktionelle Einheiten (MTL-MPUs) definiert werden können.
Die periartikulären Haltestrukturen (Muskeln, Sehnen, Bänder) spielen tatsächlich eine primäre Rolle bei der homogenen Verteilung der Last auf das Gelenk und somit beim Schutz vor der Auslösung und/oder dem Fortschreiten der degenerativen Phänomene. Häufig sind diese Strukturen jedoch nicht ausreichend wirksam beim Verringern oder Dämpfen der Last, die auf dem Knorpel lastet. Dies kann auf viele Gründe zurückzuführen sein, wie beispielsweise:

– "Verschleiß"-Schädigung der weichen Gewebe aufgrund von übermäßigen Kampf-/Sportaktivitäten oder Alterung;
– Verzögerung der Myo-Bänderreifung, die für Jungtiere großer Rassen typisch ist;
– Fettleibigkeit, zu der Jungtiere mittelkleiner Rassen aufgrund von vorzeitiger Reifung des Fettgewebes neigen;
– Mikrotrauma im Zusammenhang mit physikalischer Aktivität (traumatische Belastung des Knorpels);
– Lockerung der Bänder, die häufig mit den DOD's einhergeht;
– Muskelatrophie auf Grund von Dysplasieschmerz;
– Kreuzbandriss, wie er für große Rassen typisch ist.

Dies führt zu einem Bedarf an der Bereitstellung von Behandlungen, die die Gelenkregion als Ganzes schützen und/oder deren Gleichgewicht wiederherstellen können, statt nur auf eine einzelne Komponente beschränkt zu sein.
Knorpelschutz, den man seit einigen Jahren als Eingriff kennt, der den Gelenkknorpel vor degenerativer Schädigung im Zusammenhang mit Arthrose schützen kann, stellt einen Äquilibrierungsansatz dar, da er die Biosynthese(Anabolismus)-Wege der Knorpelzellen stimulieren kann und gleichzeitig die Abbau(Katabolismus)-Wege inhibiert, die für die Knorpeldegeneration verantwortlich sind (Burkhardt et al., Sem. Arth. Rheum., 17 (Suppl. 1): 3–34, 1987). Klinisch ist ein Knorpelschutzmittel als eine Substanz definiert, die das Fortschreiten der hauptsächlichen radiologischen Anzeichen der degenerativen Gelenkerkrankung verlangsamen und dem Auftreten neuer Arthritissymptome vorbeugen kann.
Unter den Substanzen mit knorpelschützenden Eigenschaften galt zeitweilig dem Chondroitinsulfat (CS) besondere Aufmerksamkeit. Als Mucopolysaccharid, das auf der Knorpelebene sehr konzentriert ist, wo es das hauptsächliche Glykosaminoglykan (GAG) bildet, das in den Matrix-Proteoglykanen (PG's) vorliegt, erleidet das CS unangenehme qualitative und quantitative Veränderungen im Verlauf der arthritischen Degeneration. Gerechtfertigt ist seine Ver wendung als knorpelschützendes Mittel nicht nur durch die Tatsache, dass es das Hauptausgangsprodukt für die Synthese von Proteoglykanen ist, sondern auch wegen seiner pro-anabolischen Wirkungen, da es die Synthese von GAG's und Kollagen stimulieren und die Matrix-Makromoleküle vor (enzymatischem und nicht-enzymatischem) Abbau schützen kann, den sie während einer Arthrose erleiden (Bassler et al., Int. J. of Tissue Reac., 14: 231–241, 1992).
Mit seiner biologischen Wirkung auf die Wiederherstellung des Gleichgewichts zwischen den Aktivitäten der Synthese und dem metabolischen Abbau der Knorpelzellen vereint CS physikochemische und pharmakokinetische Eigenschaften, die eine vorteilhafte therapeutische Anwendung nahelegen.
Die Verwendung spezieller Fraktionen mit niedrigen Molmassen (mittlere Molmasse von 5000–10000 Dalton), aber mit einem Sulfatierungsgrad, der physiologisch mit dem des endogenen CS übereinstimmt, bewirkt tatsächlich nicht nur eine hohe Absorption und eine selektive Konzentration auf der Gelenkebene, sondern bewirkt auch eine maximale Stimulation der Gewebewiederherstellungsfähigkeiten. Es wurde auch festgestellt, dass die Eliminierung von CS-Molekülen mit Molmassen kleiner oder gleich 3000 Dalton zu einem erheblichen Vorteil führt, nämlich dass ein unerwünschter knorpelauflösender Effekt, der mit diesen Molekülen einhergeht, vermieden wird.
DL-α-Liponsäure (ALA), die auch als Thiooctansäure bekannt und chemisch als 1,2-Dithiolano-3-pentansäure definiert ist, ist ein Disulfidderivat der Oktansäure, von dem seit Jahrzehnten bekannt ist, dass es eine entscheidende prosthetische Gruppe verschiedener Zellenzymsysteme ist, die insbesondere am Pyruvatoxidations"weg", am Zitronensäurezyklus und am Metabolismus von Aminosäuren (Abbau und Biosynthese) beteiligt sind (Bustamente et al., Free Radical Biol. and Ned., 24: 1023–1039, 1998).
ALA als solche oder in ihrer reduzierten Form (DHLA, Dihydroliponsäure) ist ein starkes Antioxidationsmittel, da sie als "Radikalfänger" gegenüber zahlreichen freien Radikalen (reaktiven Sauerstoffspezies, = ROS (reactive oxygen species)) aktiv ist, wie beispielsweise dem Singulettsauerstoff, dem Hydroxylradikal, der Hypochlorigen Säure (HOCl), Stickstoffmonoxid und Peroxy nitrit. Diese Antioxidationswirkung wird auch durch die physikochemischen Eigenschaften der Verbindung verstärkt, die sie zu einer Substanz machen, die sowohl in der wässrigen Phase als auch der Lipidphase löslich ist.
Nach Reduktion zu DHLA ist ALA auch in der Lage, zur nicht-enzymatischen Erneuerung von entscheidend wichtigen endogenen Antioxidationsmitteln, wie beispielsweise reduziertem Glutathion (GSH), beizutragen. Sie stimuliert auch die intrazelluläre Synthese von GSH und erhöht so deren endogene Reserven.
Das Problem, das die Grundlage der vorliegenden Erfindung bildet, ist die Bereitstellung einer neuartigen Behandlung von degenerativen Gelenkerkrankungen, sowohl bei Tieren als auch bei Menschen.
Der vorgeschlagene Ansatz beinhaltet, nicht nur an den Gelenken, sondern an der gesamten periartikulären Fläche einzugreifen, d.h. an den Myo-Sehnen-Bänder-morphofunktionellen Einheiten (MTL-MPUs).
Gelöst wird dieses Problem durch eine Zusammensetzung, wie sie in den anhängigen Ansprüchen beschrieben ist.
Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung umfasst ein Gemisch aus Chondroitinsulfaten und einem wirksamen Bestandteil, ausgewählt aus DL-α-Liponsäure, einem pharmazeutisch geeigneten Salz, Ester oder Amid davon, oder einem optischen Isomer davon, in einem Gewichtsverhältnis Chondroitinsulfat/wirksamer Bestandteil, das von 50:1 bis 1:2, und vorzugsweise von 10:1 bis 1:1 variabel ist. Es wurde festgestellt, dass diese Zusammensetzung besonders nützlich ist bei der Behandlung von Krankheitszuständen, die die MTL-MFU beeinträchtigen, und zwar auf Grund der synergistischen Wirkung von Chondroitinsulfat, das insbesondere an den Gelenken wirkt, und von DL-α-Liponsäure, die sowohl an den Gelenken als auch an den periartikulären Geweben wirkt.
Die verwendeten Chondroitinsulfate sind normalerweise ein Gemisch aus Chondroitin-4- und -6-sulfaten mit einem Sulfatierungsgrad pro Disaccharid zwischen 0,60 und 1.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist das Chondroitinsulfat eine spezielle Molekülfraktion mit einer mittleren Molmasse zwischen 5000 und 10000 Dalton, die frei ist von Chondroitinsulfaten mit Molmassen kleiner oder gleich 3000 Dalton. Diese Molekülfraktionen von Chondroitinsulfaten haben einen Sulfatierungsgrad pro Disaccharid zwischen 0,75 und 1, und einen Proteingehalt von weniger als 1,5%, und vorzugsweise zwischen 0,05% und 1,2%. Wie nachstehend beschrieben wird, können die oben genannten Molekülfraktionen von Chondroitinsulfaten durch Reinigung von kommerziellem Chondroitinsulfat hergestellt werden.
DL-α-Liponsäure kann als solche oder in Form eines Salzes verwendet werden, wie beispielsweise als Salz mit einem Alkali- oder Erdalkalimetall, vorzugsweise als Natriumsalz. Alternativ kann ein pharmazeutisch geeigneter Ester oder ein Amid von ALA, vorzugsweise DL-α-Liponsäureamid, verwendet werden. Die D-optischen Isomere (die natürlich vorkommende Form) oder die L-optischen Isomere von Liponsäure können für die Zwecke der vorliegenden Erfindung auch verwendet werden.
Liponsäure und ihre Derivate sind kommerzielle Produkte oder können nach Verfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt sind, aus kommerziellen Produkten hergestellt werden.
Wie nachstehend weiter beschrieben wird, kann die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung auch pharmazeutisch geeignete Trägersubstanzen umfassen, die gemäß dem Typ der Formulierung und dem gewünschten Verabreichungsverfahren ausgewählt werden.
Darüber hinaus kann die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung weiterhin eine oder mehrere aktive Substanzen enthalten, die ausgewählt sind aus:

– einem Aminozucker, vorzugsweise Glucosamin,
– einem Mangansalz, vorzugsweise Manganascorbat,
– einem Antioxidationsmittel, ausgewählt aus Vitamin E, Vitamin C und Flavonoiden.

Falls vorhanden, liegt der Aminozucker vorzugsweise in einem Gewichtsverhältnis zwischen 1:1 und 4:1, bezogen auf das Chondroitinsulfat, vor.
Falls vorhanden, liegt das Mangansalz vorzugsweise in einem Gewichtsverhältnis zwischen 1:3 und 1:10, bezogen auf das Chondroitinsulfat, vor.
Falls vorhanden, liegt das Vitamin E vorzugsweise in einem Gewichtsverhältnis zwischen 1:7 und 1:3, bezogen auf das Chondroitinsulfat, vor.
Falls vorhanden, liegt das Vitamin C vorzugsweise in einem Gewichtsverhältnis zwischen 1:10 und 1:1, bezogen auf das Chondroitinsulfat, vor.
Falls vorhanden, liegt das Flavonoid, bei dem es sich vorzugsweise um Quercetin oder Rutin handelt, vorzugsweise in einem Gewichtsverhältnis zwischen 1:5 und 1:1, bezogen auf das Chondroitinsulfat, vor.
Zusammen mit dem Chondroitinsulfat ist der Aminozucker ein Substrat für die Synthese von Kollagenen und Proteoglykanen.
Mangan ist ein Kofaktor der Glykosyltransferasen und spielt somit eine wichtige Rolle in der Synthese von Glykosaminglykanen.
Die Antioxidationsmittel unterstützen die Liponsäure bei ihrer Wirkung, oxidative Schäden auf der Gelenkebene zu beheben.
Wie gesagt, kann Liponsäure sowohl auf der Gelenkebene als auch auf der Ebene der Skelettmuskulatur wirken, was den vorgeschlagenen neuartigen Therapieansatz für die MTL-MFU kennzeichnet.
Biologische und klinische Beispiele
A - BEWERTUNG DER KNORPELSCHÜTZENDEN WIRKUNG VERSCHIEDENER MOLEKÜLFRAKTIONEN VON CHONDROITINSULFAT "IN VITRO"
Verfahren und Materialien
Kulturen von differenzierten Hunde-Gelenkknorpelzellen wurden nach dem für menschliche Knorpelzellen beschriebenen Verfahren von Bassler verwendet (Bassler et al., In Vitro, 22, 113, 1986; Bassler et al., Biochem. Pharmacol., 37, 1939, 1988).
Der Gelenkknorpel wurde mittels Arthroskopie aus den Kniegelenken von 7 Jahre alten, männlichen Deutschen Schäferhunden mit 35 kg Gewicht entnommen, die im rechten Hinterbein lahmten und die im Alter von sechs Jahren einen früheren Anfall von vorübergehendem Lahmen erlitten hatten.
Der Knorpel wurde sofort 24 Stunden lang mit 1 mg/ml Kollagenase aus histolytischem Clostridium (Fluka Cod. 27680) in Natriumcarbonat/-hydrogencarbonat-Puffer bei pH 7,4 digeriert.
Die Zellen wurden mit einer Rate von 10⁶ auf 2 ml Kulturmedium als Kultur angesetzt und bei 37°C in einer Atmosphäre aus 95% Luft und 5% CO₂ rotiert (100 Umdrehungen/Minute).
Man ließ die Zellen 8 Tage lang wachsen. Die Zugabe der zu testenden Molekülfraktionen von Chondroitinsulfat – die mit einer Konzentration von 10 mg/ml in Natriumcarbonat/-hydrogencarbonat-Puffer bei pH 7,4 gelöst waren – erfolgte am vierten Tag, so dass man mit einem Zeitraum von 4 Tagen Inkubation der Fraktionen, die mit den Zellen getestet werden sollten, rechnen konnte.
Es wurden die folgenden Verbindungen getestet:

a) eine Molekülfraktion von Chondroitinsulfat mit einer mittleren Molmasse von weniger als 5000 Dalton (Verbindung D);
b) eine Molekülfraktion von Chondroitinsulfat mit einer mittleren Molmasse zwischen 5000 und 10000 Dalton (Verbindung B);
c) eine Molekülfraktion von Chondroitinsulfat mit einer Molmasse zwischen 10000 und 20000 Dalton (Verbindung C);
d) eine Molekülfraktion von Chondroitinsulfat mit einer Molmasse von mehr als 20000 Dalton (Verbindung E).

Als Parameter für die knorpelschützende Aktivität wurde die kollagenolytische Aktivität unter Verwendung eines NEN-KIT (NEK-016 von NEN Corp.) gemessen und als Produktion von löslichen radioaktiven Fragmenten, die durch Zentrifugieren schnell von unverdauten Kollagenfibrillen abgetrennt wurden, quantitativ bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Während die Molekülfraktion von Chondroitinsulfat mit einer mittleren Molmasse von weniger als 5000 Dalton eine extrem hohe kollagenolytische Aktivität aufwies, wie es aus den gezeigten Daten ersichtlich ist, zeigten die höheren Molekülfraktionen diese Aktivität in geringerem Ausmaß. Insbesondere war die Molekülfraktion zwischen 5000 und 10000 Dalton, aus der die CS-Moleküle mit Molmassen kleiner oder gleich 3000 Dalton nach dem unten beschriebenen Verfahren abgetrennt worden waren, durch eine niedrigere kollagenolytische Aktivität charakterisiert und stellt somit die bevorzugte Fraktion dar.
B - KLINISCHE BEWERTUNG DER KOMBINATION AUS MOLEKÜLFRAKTIONEN VON CHONDROITINSULFAT UND DL-α-LIPONSÄURE AUF DIE GESAMTE GELENKFUNKTIONALITÄT IN HUNDEN
Verfahren und Materialien
Um die Gelenkfunktionalität als Ganzes und die Auswirkung verschiedener Behandlungen in vivo zu bewerten, wurde ein kombiniertes Verfahren aus klinischer Untersuchung, instrumenteller Untersuchung und biochemischer Untersuchung angewendet und auf große, im allgemeinen erwachsene Hunde angewendet, die eine degenerative Gelenkerkrankung (DJD) als Folge von Kreuzbandriss, Dislokation der Kniescheibe oder X-Bein hatten.
Das angewendete Verfahren umfasste die folgenden Untersuchungen:

(i) klinische Untersuchung des Schmerzes beim Abtasten, wie beschrieben von Bouck (G.R. Bouck et al., Veterinary and Comparative Orthopaedic Trau matology, 8, 177–83, 1995). Die verwendete Bewertungsskala ging von 1 bis 4 und bedeutete: 1 = kein Schmerz beim Abtasten 2 = leichter Schmerz beim Abtasten 3 = mäßiger Schmerz beim Abtasten 4 = starker Schmerz beim Abtasten
(ii) klinische Untersuchung, um das Ausmaß des Muskeltonus (Quadrizepsmuskeln) mit Hilfe der "Likert-Skala" zu bewerten, wie beschrieben von Innes (J.F. Innes et al., Journal of Small Animal Practice, 39, 325–332, 1998). Die verwendete Bewertungsskala ging von 0 bis 3 und bedeutete: 0 = normaler Tonus 1 = leichte Atonie 2 = mäßige Atonie 3 = starke Atonie
(iii) instrumentelle Untersuchung mittels Messung des Ausmaßes der Osteophytenbildung durch XR-radiographische Untersuchung, wie beschrieben von Bouck (G.R. Bouck et al., Veterinary and Comparative Orthopaedic Traumatology, 8, 177–83, 1995). Die verwendete Bewertungsskala ging von 1 bis 4 und bedeutete: 1 = keine Osteophyten vorhanden 2 = minimale und lokalisierte Bildung von Osteophyten 3 = mäßige Bildung von Osteophyten an mehreren Gelenkstellen 4 = starke Osteophytenbildung, die das gesamte Gelenk beeinträchtigt
(iv) zytologische Untersuchung der Gelenkschmiere mittels Messung der Zellliniencharakteristiken des Entzündungsphänomens; insbesondere Messung der Leukozytenzahl pro Liter Gelenkschmiere, wie beschrieben von Gibson (N.R. Gibson et al., The Veterinary Record, April 24, 463–465, 1999), wurde gewählt. Die Werte wurden ausgedrückt als Anzahl der Zellen pro Liter Gelenkschmiere mit einem Wert von weniger als 3×10⁹ Zellen/Liter bei normalen Patienten.

Die Bewertungen wurden an großen Hunden unterschiedlicher Rassen durchgeführt, die zwischen 3 Monaten und 7 Jahren alt waren, und die nicht weniger als 2 Monate am rechten oder linken Hinterbein lahmten, und zwar auf Grund von DJD als Folge von Kreuzbandriss, Dislokation der Kniescheibe (bei Jungtieren) oder X-Bein (bei Jungtieren). Die behandelten Fälle sind in Tabelle II zusammengefasst.
Tabelle II
Die Behandlungen wurden über einen Zeitraum von 40 Tagen bei täglicher Verabreichung des Medikaments durch den Mund durchgeführt.
Die Bewertungen wurden zum Zeitpunkt Null(t₀) und am vierzigsten Tag (t₄₀) durchgeführt.
Die Wirksamkeit der folgenden Zusammensetzungen wurde nach dem vorgewählten Verfahren bewertet:
Zusammensetzung A: eine Kombination aus einer speziellen Molekülfraktion von Chondroitinsulfat, gekennzeichnet durch eine mittlere Molmasse zwischen 5000 und 10000 Dalton (Verbindung B) und DL-α-Liponsäure. Die Tabletten enthielten jeweils:

Verbindung B 150 mg

DL-α-Liponsäure 20 mg

aufgefüllt mit Trägersubstanzen bis auf 700 mg
Zusammensetzung B: eine Kombination aus einer speziellen Molekülfraktion von Chondroitinsulfat, gekennzeichnet durch eine mittlere Molmasse von mehr als 20000 Dalton (Verbindung E) und DL-α-Liponsäure. Die Tabletten enthielten jeweils:

Verbindung E 150 mg

DL-α-Liponsäure 20 mg

aufgefüllt mit Trägersubstanzen bis auf 700 mg
Zusammensetzung C: eine Zusammensetzung auf Phenylbutazonbasis in Tablettenform. Die Tabletten enthielten jeweils:

Phenylbutazon 50 mg

aufgefüllt mit Trägersubstanzen bis auf 700 mg
Zusammensetzung D: eine Kombination aus einer speziellen Molekülfraktion von Chondroitinsulfat, gekennzeichnet durch eine mittlere Molmasse zwischen 5000 und 10000 Dalton (Verbindung B), aber ohne DL-α-Liponsäure.
Die Tabletten enthielten jeweils:

Verbindung B 150 mg

aufgefüllt mit Trägersubstanzen bis auf 700 mg
Die Ergebnisse der klinischen Tests sind in Tabelle III zusammengefasst:
Tabelle III
Wie aus den in Tabelle III gezeigten Daten ersichtlich ist, hatten die Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung (Zusammensetzungen A und B) wesentliche Vorteile sowohl im Vergleich mit Phenylbutazon (Zusammensetzung C), das eine tatsächliche entzündungshemmende Wirkung hat, als auch im Vergleich mit einer Zusammensetzung, die Chondroitinsulfat allein enthält (Zusammensetzung D). Die Zusammensetzungen der Erfindung, insbesondere Zusammensetzung A, die Chondroitinsulfat mit einer mittleren Molmasse zwischen 5000 und 10000 Dalton enthielt, waren die Einzigen, die eine Wirkung auf Muskelatonie zeigten, und sie stellen somit eine echte Lösung des oben genannten Problems dar, d.h. die Notwendigkeit, auf die Myo-Sehnen-Bänder-morphofunktionelle Einheit (MTL-MPU) als Ganzes einzuwirken.
Aus den Daten in der Tabelle ist auch ersichtlich, dass Zusammensetzung A im Atonietest eine etwas ausgeprägtere Wirkung hat als Zusammensetzung B. Wenn man berücksichtigt, dass beide Zusammensetzungen die gleiche Menge DL-α-Liponsäure enthalten, dass der einzige Unterschied die Molekülfraktion des Chondroitinsulfats ist, und dass letzteres nicht die Muskelatonie beeinflussen kann (vgl. Zusammensetzung D), kann das Ergebnis nur durch einen synergistischen Effekt zwischen den beiden aktiven Bestandteilen der Zusammensetzung erklärt werden.
Die Verwendung von Molekülfraktionen von CS in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, bei denen – nach dem nachstehend beschriebenen Reinigungsverfahren – Moleküle mit Molmassen von mehr als 30000 Dalton eliminiert wurden, und die darüber hinaus frei sind von Fraktionen unter 3000 Dalton, verstärkt besonders die knorpelschützende Wirkung.
Auf der Grundlage dessen, was oben gezeigt wurde, ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung eine Molekülfraktion von Chondroitinsulfat, die eine mittlere Molmasse von 5000–10000 Dalton hat, welche frei ist von Chondroitinsulfat-Molekülen mit Molmassen kleiner oder gleich 3000 Dalton, und wahlweise frei ist von Chondroitinsulfat-Molekülen mit Molmassen größer oder gleich 30000 Dalton, sowie deren Verwendung zur Herstellung eines Medikaments oder eines Nahrungsergänzungsmittels mit knorpelschützender Wirkung zur Anwendung bei Menschen und Tieren.
Ein zweiter weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines aktiven Bestandteils, ausgewählt aus DL-α-Liponsäure oder einem pharmazeutisch geeigneten Salz, Ester oder Amid davon, oder einem optischen Isomer davon, zur Herstellung eines Medikaments oder eines Nahrungsergänzungsmittels zur Anwendung bei Menschen und Tieren zur Behandlung von Muskelatonie im Zusammenhang mit degenerativen Gelenkerkrankungen.

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele pharmazeutischer Zusammensetzungen weiter beschrieben. In den Beispielen ist Verbindung A die Molekülfraktion von Chondroitinsulfat zwischen 10000 und 35000 Dalton, Verbindung B die Fraktion von Chondroitinsulfat zwischen 5000 und 10000 Dalton, frei von CS mit Molmassen kleiner oder gleich 3000 Dalton und von CS mit Molmassen größer oder gleich 30000 Dalton, und Verbindung C die Fraktion von CS zwischen 10000 und 20000 Dalton. Beispiel 1 - Ampullen zur Injektion

Verbindung B	100 mg
DL-α-Liponsäureamid	25 mg
Natriumchlorid	17 mg
aufgefüllt mit Wasser für Injektionen	bis auf 2 ml

Beispiel 2 - lyophilisierte Ampullen

Verbindung C	50 mg
Glucosaminhydrochlorid	100 mg
DL-α-Liponsäure, Natriumsalz	30 mg
Mannit	80 mg
Jede Lösungsmittelampulle enthält: aufgefüllt mit Wasser für Injektionen	bis auf 2 ml

Beispiel 3 - Tabletten

Verbindung A	150 mg
DL-α-Liponsäure	20 mg
Lactose	100 mg
Maisstärke	70 mg
Talkum	8 mg
Magnesiumstearat	4 mg
Carboxymethylcellulose	8 mg

Beispiel 4 - Tabletten

Verbindung A	250 mg
DL-α-Liponsäure	35 mg
DL-α-Tocopherolacetat	50 mg
Lactose	150 mg
mikrokristalline Cellulose	100 mg
Talkum	12 mg
Magnesiumstearat	7 mg

Beispiel 5 - ölige Kapseln

Verbindung B	25 mg
Verbindung C	25 mg
DL-α-Liponsäure, mikronisiert	50 mg
Glucosaminsulfat	150 mg
Maisöl	150 mg
Gelatine FU	70 mg
Glycerin FU	30 mg
Titandioxid (E171)	0,5 mg
Erythrosin (E127)	1 mg

Natürlich können auch andere pharmazeutische Zusammensetzungen bereitgestellt werden, die ein Gemisch aus aktiven Bestandteilen gemäß der vorliegenden Erfindung zusammen mit pharmazeutisch geeigneten Trägersubstanzen enthalten. Diese Zusammensetzungen können in Form von Kapseln, Tabletten, Pulvern und Pillen sowie magenresistenten Formulierungen zu oralen Verabreichung vorliegen, und können auch durch vorhergehende Anwendung von Mikroverkapselungs-, Liposomeinschluss- und Mizellenbildungstechniken hergestellt werden. Für örtliche Anwendungen, einschließlich dem transdermalen Verfahren, können Formulierungen in Form von Zäpfchen, Mikroklistieren, Cremes, Salben, Sprays, Gelen, Tupfern, Verbänden unterschiedlicher Konsistenzen und Pflastern verwendet werden. Alle möglichen Formen, die pharmazeutisch für die verschiedenen Verabreichungsverfahren angezeigt sind, können auch mit Trägersubstanzen oder nach technischen Verfahren hergestellt werden, die für die Herstellung von Medikamenten mit schneller Freisetzung oder mit langsamer Freisetzung geeignet sind.
Die Dosierungen zur Verwendung der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung variieren je nach Verabreichungsverfahren, Schwere der Krankheit und dem Allgemeinzustand des Patienten. Die zu erwartenden Dosierungen bei Menschen liegen in jedem Fall zwischen 50 mg/Tag und 1000 mg/Tag Chondroitinsulfat über einen Zeitraum von 1 bis 6 Monaten ununterbrochener Verabreichung. Bei Tieren, insbesondere bei Hunden, betragen diese therapeutischen Dosierungen 10 mg/Tag bis 500 mg/Tag Chondroitinsulfat. Je nach Schwere des Krankheitszustands kann die Behandlung in mehreren Zyklen wiederholt werden. Je nach Schwere des Krankheitszustands und der physischen Kondition des Patienten kann der Arzt spezielle Dosierungen und Behandlungsmethoden bereitstellen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der Molekülfraktionen von Chondroitinsulfat, oben als Verbindungen A, B, C, D und E bezeichnet, mit einem hohen Reinheitsgrad, und insbesondere ein Verfahren zur Herstellung der Molekülfraktion von Chondroitinsulfat, die eine Molmasse zwischen 5000 und 10000 Dalton hat und frei ist von Chondroitinsulfat-Molekülen mit Molmassen kleiner oder gleich 3000 Dalton (Verbindung B).
Dieses Verfahren beginnt mit kommerziellem Chondroitinsulfat, vorzugsweise aus Schweinen, mit einer mittleren Molmasse zwischen 20000 und 40000 Dalton, einem Prozentgehalt an nicht-sulfatiertem Disaccharid zwischen 2% und 10%, einem Prozentgehalt an Disaccharid-4-sulfat zwischen 50% und 80%, einem Prozentgehalt an Disaccharid-6-sulfat zwischen 15% und 40% und einem Sulfatierungsgrad pro Disaccharid zwischen 0,60 und 1.
Dieses Ausgangsprodukt wird zunächst in einer basischen wässrigen Lösung aufgelöst; die Lösung wird in einem Autoklaven 30 Minuten lang bei einem Druck zwischen 1 und 1,2 atm auf eine Temperatur zwischen 110°C und 150°C, vorzugsweise zwischen 121°C und 135°C erhitzt, rasch auf Raumtemperatur abgekühlt, neutralisiert und über Celite filtriert. Die so erhaltene klare Lösung wird durch eine 1 μm-Membran filtriert und in Aceton gegossen. Anschließend wird der Niederschlag durch Filtrieren und Zentrifugieren abgetrennt und getrocknet. Das erhaltene Produkt (Verbindung A) hat die folgenden analytischen Daten:

mittlere Molmasse 10000–35000 Dalton

Sulfatierungsgrad pro Disaccharid 0,75 – 1

Proteingehalt <1,5%
Die oben hergestellte Verbindung A wird in Wasser gelöst, und die Lösung wird über eine 3000-NMWL-(nominal molecular weight limit, = nominelle Molmassengrenze)-Molekularsiebmembran bei konstantem Volumen ultrafiltriert. Wenn ein Volumen gleich dem 3,5-fachen des ursprünglichen Volumens ultrafiltriert ist, wird das Filtrat verworfen (falls gewünscht, kann die enthaltene Molekülfraktion durch Ausfällen in Aceton und Trocknen zurückgewonnen werden; diese Fraktion stellt Verbindung D dar); die auf dem Filter zurückbleibende Lösung wird erneut bei konstantem Volumen durch eine 10000-NMWL-Molekularsiebmembran ultrafiltriert. Wenn ein Volumen gleich dem Doppelten des ursprünglichen Volumens ultrafiltriert ist, wird das Filtrat konzentriert, anschließend in Aceton ausgefällt, und der Niederschlag abgetrennt und getrocknet. Es wird ein Produkt (Verbindung B) mit den folgenden analytischen Daten erhalten:

mittlere Molmasse 5000–10000 Dalton

Sulfatierungsgrad pro Disaccharid 0,75 – 1

Proteingehalt <1,5%
Eine fundamentale Eigenschaft der so erhaltenen Verbindung B ist, dass sie frei ist von CS-Molekülen mit Molmassen kleiner oder gleich 3000 Dalton. Dieses Ergebnis wird durch die Verwendung einer 3000-NMWL-Molekularsiebmembran erzielt.
Die Lösung, die auf der 10000-NMWL-Membran zurückbleibt, wird einer Ultrafiltration und Konzentration auf einer 30000-NMWL-Molekularsiebmembran unterzogen. Wenn ein Volumen gleich dem Doppelten des ursprünglichen Volumens ultrafiltriert ist (konstante Zugabe von 1 Volumen Wasser im Verlauf der Ultrafiltration), wird die Lösung, die die Membran durchlaufen hat, konzentriert und dann in Aceton ausgefällt. Der Niederschlag wird abgetrennt und getrocknet, was ein Produkt (Verbindung C) mit den folgenden analytischen Daten liefert:

mittlere Molmasse 10000–20000 Dalton

Sulfatierungsgrad pro Disaccharid 0,75 – 1

Proteingehalt <1,5%
Die so erhaltene Verbindung C enthält keine Chondroitinsulfat-Moleküle mit Molmassen größer oder gleich 30000 Dalton, und dies ermöglicht die Herstellung eines Wirkstoffs, bei dem die knorpelschützende Aktivität maximiert ist.
Das auf dem Filter zurückbleibende Produkt wird abgetrennt; falls gewünscht, kann die enthaltene Molekülfraktion durch Ausfällen in Aceton und Trocknen zurückgewonnen werden.
Eine mögliche Variante des oben beschriebenen Verfahrens beinhaltet, dass die Lösung, die auf der 3000-NMWL-Molekularsiebmembran zurückbleibt, direkt der Ultrafiltration bei konstantem Volumen auf einer 30000-Dalton-Molekularsiebmembran unterworfen wird. In diesem Fall erhält man eine Molekülfraktion (Verbindung F) mit einer mittleren Molmasse zwischen 5000 und 20000 Dalton, die frei ist von Chondroitinsulfat-Molekülen mit Molmassen kleiner oder gleich 3000 Dalton und von Chondroitinsulfat-Molekülen mit Molmassen größer oder gleich 30000 Dalton. Diese Variante des Verfahrens kann ökonomisch vorteilhaft sein, da sie die Rückgewinnung einer großen Produktfraktion ermöglicht, ohne dass dies zu drastischen Einbußen bei der pharmakologischen Aktivität führt.
Die analytische Charakterisierung der verschiedenen Molekülfraktionen von Chondroitinsulfat wurde nach den folgenden analytischen Verfahren durchgeführt.
Die mittlere Molmasse wurde mittels Molekularsiebchromatographie (HPSEC) gemäß dem von N. Volpi und L. Bolognini, J. Chromatogr., 630, 390–396 (1993), beschriebenen Verfahren bestimmt.
Der Prozentgehalt an Disacchariden wurde gemäß dem von N. Volpi, I. Sandri und T. Venturelli, Carbohydr. Res. 279, 193–200 (1995), beschriebenen Verfahren durch HPLC-Chromatographie an starkem Anionenaustauscher nach Behandlung der Chondroitinsulfat-Molekülfraktionen mit bakterieller Lyase bestimmt.
Der Sulfatierungsgrad wurde mittels Ionenaustauschchromatographie (SAX-HPLC) gemäß dem von T. Imanari et al., J. Chromatogr., 720, 275–293 (1996), beschriebenen Verfahren bestimmt.
Der Prozentgehalt an Protein wurde mittels Spektrophotometrie gemäß dem von O.H. Lowry et al., J. Biol. Chem. 193, 265 (1951), beschriebenen Verfahren, modifiziert von G.L. Peterson, Methods in Enzymology 91, 95 (1983), bestimmt.
Das oben erläuterte Verfahren wird durch die folgenden Herstellungsbeispiele weiter beschrieben, in denen auch die Abtrennung von Fraktion E beschrieben wird.
Beispiel A - Herstellung von Verbindung A
100 g kommerzielles Chondroitinsulfat (in Form des Natriumsalzes) aus Schweinen, das die oben genannten analytischen Daten hatte, wurde unter Rühren in 1 Liter einer 1N wässrigen Natriumhydroxidlösung aufgelöst. Die so erhaltene trübe Lösung wurde in einem Dampfautoklaven 30 Minuten lang bei 1 atm auf 121°C erhitzt, anschließend sehr schnell auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 1N Salzsäurelösung auf pH 7,2 neutralisiert. Die trübe Lösung wurde dann über eine Celite-Schicht filtriert, um eine klare, schwach strohfarbene Flüssigkeit zu erhalten. Die anschließende Filtration wurde unter Druck auf einer Membran mit einem Filtrationsgrad von 1 μm durchgeführt (eine Millipore PO-LYGARD-CT 01 Polypropylen-Kartusche und ein Differenzdruck zwischen 3 und 3,5 bar wurden verwendet). Die so erhaltene vollständig klare Lösung wurde bei Raumtemperatur unter Rühren in 5 Liter wasserfreies Aceton gegossen. Es wurde noch 2 Stunden langsam gerührt, wodurch ein flockiger, weißer Niederschlag entstand, der sich leicht absetzte. Der Niederschlag wurde durch Filtration gewonnen und anschließend unter Vakuum getrocknet. 95 g der Verbindung A, die mit den oben genannten analytischen Daten übereinstimmte, wurden erhalten.
Beispiel B - Herstellung von Verbindung B
Eine 10%-ige wässrige Lösung von Verbindung A, hergestellt wie in Beispiel A, wurde durch eine Polypropylen-Kartusche mit einem Filtrationsgrad von 100 μm (eine Millipore POLYGARD-CT 99-Kartusche) vorfiltriert und dann einer Ultrafiltration bei konstantem Volumen auf einer regenerierten 3000-NMWL-Molekularsieb-Cellulosemembran unterworfen (es wurden Millipore PLBC-Membranen verwendet, die auf Millipore PELLICON-Modulen mit tangentialem Fluss vormontiert waren). Das Verfahren wurde bei einer Temperatur zwischen 20 und 25°C unter Verwendung eines Differenzdrucks von 6 bar durchgeführt, der mit einer peristaltischen Pumpe (einer Millipore EASY-LOAD-Pumpe) eingestellt wurde. Die Pumpe war so montiert, dass sie die Lösung, die ultrafiltriert werden sollte, aus dem Behälter ziehen konnte, in dem weiter gerührt wurde und in den ein Volumen Wasser eingelassen wurde, das gleich dem des Ultrafiltrats war. Wenn ein Volumen gleich dem 3,5-fachen des ursprünglichen Volumens ultrafiltriert war, wurde das Filtrat verworfen (oder weiter behandelt, wie in Beispiel D beschrieben), und die auf der Membran verbliebene Lösung wurde einer Ultrafiltration bei konstantem Volumen auf einer regenerierten 10000-NMWL-Molekularsieb-Cellulosemembran unterworfen (es wurden Millipore PLCGC-Membranen verwendet, die auf Millipore PELLICON-Modulen mit tangentialem Fluss vormontiert waren). Auch in diesem Fall wurde die Ultrafiltration bei einer Temperatur zwischen 20 und 25°C unter Verwendung eines Differenzdrucks von 6 bar durchgeführt, der mit der oben beschriebenen Apparatur eingestellt wurde. Wenn ein Volumen gleich dem Doppelten des ursprünglichen Volumens ultrafiltriert war, wurde die Lösung, die die Membran durchlaufen hatte, auf die Hälfte ihres Volumens konzentriert und durch Eingießen in 5 Volumen wasserfreies Aceton unter Rühren bei Raumtemperatur ausgefällt. Es wurde noch 2 Stunden langsam gerührt, wodurch ein flockiger, weißer Niederschlag entstand, der sich leicht absetzte. Der Niederschlag wurde durch Filtration gewonnen und anschließend unter Vakuum getrocknet. 60 g der Verbindung B mit den oben genannten analytischen Daten wurden erhalten.
Beispiel C - Herstellung von Verbindung C
Die auf der 10000-NMWL-Membran bei der Herstellung in Beispiel B verbliebene Lösung wurde einer weiteren Ultrafiltration bei konstantem Volumen auf einer regenerierten 30000-NMWL-Molekularsieb-Cellulosemembran unterworfen (es wurde eine Millipore PLCTK-Membran verwendet, die auf Millipore PELLICON-Modulen mit tangentialem Fluss vormontiert war). Auch in diesem Fall wurde das Verfahren bei einer Temperatur zwischen 20 und 25°C unter Verwendung eines Differenzdrucks von 6 bar durchgeführt, der mit der oben beschriebenen Apparatur eingestellt wurde. Wenn ein Volumen gleich dem Doppelten des ursprünglichen Volumens ultrafiltriert war, wurde die ultrafiltrierte Lösung auf die Hälfte ihres Volumens konzentriert und durch Eingießen in 5 Volumen wasserfreies Aceton unter Rühren bei Raumtemperatur ausgefällt. Es wurde noch 2 Stunden langsam gerührt, wodurch ein flockiger, weißer Niederschlag entstand, der sich leicht absetzte. Der Niederschlag wurde durch Filtration gewonnen und anschließend unter Vakuum getrocknet. 20 g der Verbindung C mit den oben genannten analytischen Daten wurden erhalten.
Beispiel D - Herstellung von Verbindung D
Die durch die 3000-NMWL-Membran (Herstellung in Beispiel B) ultrafiltrierte Lösung wurde in kleinen Mengen auf die Hälfte ihres Volumens konzentriert und in 5 Volumen wasserfreiem Aceton ausgefällt. Es wurde noch 2 Stunden langsam gerührt, wodurch ein flockiger, weißer Niederschlag entstand, der sich leicht absetzte. Der Niederschlag wurde durch Filtration gewonnen und anschließend unter Vakuum getrocknet.
Beispiel E - Herstellung von Verbindung E
Die auf der 30000-NMWL-Membran bei der Herstellung in Beispiel C verbliebene Lösung wurde auf die Hälfte ihres Volumens konzentriert und in 5 Volumen wasserfreiem Aceton ausgefällt. Es wurde noch 2 Stunden langsam gerührt, wodurch ein flockiger, weißer Niederschlag entstand, der sich leicht absetzte. Der Niederschlag wurde durch Filtration gewonnen und anschließend unter Vakuum getrocknet. 10 g der Verbindung E mit einer Molmasse über 20000 Dalton wurden erhalten.

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Gemisch aus Chondroitinsulfaten und einem wirksamen Bestandteil, ausgewählt aus DL-α-Liponsäure, einem pharmazeutisch geeigneten Salz, Ester oder Amid davon, oder einem optischen Isomer davon, dadurch gekennzeichnet, dass das Gemisch aus Chondroitinsulfaten eine Molekülfraktion ist, die eine mittlere Molmasse zwischen 5000 und 10000 Dalton hat und frei ist von Chondroitinsulfaten mit einer Molmasse kleiner oder gleich 3000 Dalton.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Chondroitinsulfat und der wirksame Bestandteil in einem Chondroitinsulfat/wirksamer Bestandteil-Gewichtsverhältnis vorliegen, das von 50:1 bis 1:2 variabel ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, worin das Gewichtsverhältnis zwischen Chondroitinsulfat und dem wirksamen Bestandteil zwischen 10:1 und 1:1 liegt.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Chondroitinsulfat ein Gemisch ist aus Chondroitin-4-sulfat in einem Verhältnis, das zwischen 50 und 80 Gew.-% variiert, und Chondroitin-6-sulfat in einem Verhältnis, das zwischen 15 und 40 Gew.-% variiert, und das einen Sulfatierungsgrad pro Disaccharid von 0,60 bis 1 und einen Prozentgehalt an nichtgeschwefeltem Disaccharid zwischen 2% und 10% hat.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Chondroitinsulfat einen Sulfatierungsgrad pro Disaccharid zwischen 0,75 und 1 und einen Proteingehalt von weniger als 1,5 Gew.-% hat.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, worin der Proteingehalt zwischen 0,05 und 1,2 Gew.-% liegt.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin der wirksame Bestandteil DL-α-Liponsäure oder deren Salz mit einem Alkalimetall oder einem Erdalkalimetall ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, worin das Salz der DL-α-Liponsäure ein Natriumsalz ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, umfassend zusätzlich eine oder mehrere Substanzen, die ausgewählt sind aus: – einem Aminozucker – einem Mangansalz – einem Antioxidationsmittel.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, worin der Aminozucker Glucosamin in einem Gewichtsverhältnis zwischen 1:1 und 4:1, bezogen auf das Chondroitinsulfat, ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 9 oder Anspruch 10, worin das Mangansalz Manganascorbat in einem Gewichtsverhältnis zwischen 1:3 und 1:10, bezogen auf das Chondroitinsulfat, ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 bis 11, worin das Antioxidationsmittel Vitamin E in einem Gewichtsverhältnis zwischen 1:7 und 1:3, bezogen auf das Chondroitinsulfat, ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 bis 11, worin das Antioxidationsmittel Vitamin C in einem Gewichtsverhältnis zwischen 1:10 und 1:1, bezogen auf das Chondroitinsulfat, ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 bis 11, worin das Antioxidationsmittel ein Flavonoid, vorzugsweise Quercetin oder Rutin, in einem Gewichtsverhältnis zwischen 1:5 und 1:1, bezogen auf das Chondroitinsulfat, ist.
Verwendung einer Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 zur Herstellung eines Medikaments oder Nahrungsergänzungsmittels zur ärztlichen oder tierärztlichen Verwendung bei der Behandlung von degenerativen Gelenkerkrankungen.
Molekülfraktion von Chondroitinsulfat mit einer mittleren Molmasse zwischen 5000 und 10000 Dalton, worin die Molekülfraktion dadurch gekennzeichnet ist, dass sie frei ist von Chondroitinsulfatmolekülen mit Molmassen kleiner oder gleich 3000 Dalton.
Verwendung der Molekülfraktion nach Anspruch 16 zur Herstellung eines Medikaments oder Nahrungsergänzungsmittels mit knorpelschützender Wirkung zur ärztlichen oder tierärztlichen Verwendung.
Verfahren zur Herstellung der Chondroitinsulfatfraktion nach Anspruch 16 aus kommerziellem Chondroitinsulfat, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Auflösen des kommerziellen Chondroitinsulfats in einer basischen, wässrigen Lösung und Erhitzen der Lösung bei einem Druck von 1 bis 1,2 atm auf eine Temperatur von 110 bis 150°C; (b) Abkühlen der in Schritt (a) erhaltenen Lösung auf Raumtemperatur, Neutralisieren, Filtrieren bis zur Klärung und Ausfällen der klaren Lösung in Aceton, wodurch eine Verbindung A mit einer mittleren Molmasse von 10000–35000 Dalton, einem Sulfatierungsgrad pro Disaccharid von 0,75–1 und einem Proteingehalt von <1,5% erhalten wird; (c) Auflösen der in Schritt (b) erhaltenen Verbindung A in Wasser und Ultrafiltration der Lösung bei konstantem Volumen über eine 3000 NMWL-Molekularsiebmembran, wobei ein Volumen gleich dem 3,5-fachen des Anfangsvolumens ultrafiltriert wird, (d) Ultrafiltration der in Schritt (c) über dem Filter verbleibenden Lösung bei konstantem Volumen über eine 10000 NMWL-Molekularsiebmembran, wobei ein Volumen gleich dem Doppelten des Anfangsvolumens ultrafiltriert wird, (e) Ausfällen des in Schritt (d) erhaltenen Filtrats mit Aceton, wahlweise nach Konzentrieren, wodurch eine Verbindung B mit einer mittleren Molmasse von 5000–10000 Dalton, einem Sulfatierungsgrad pro Disaccharid von 0,75–1 und einem Proteingehalt von <1,5% erhalten wird, wobei die Verbindung B frei ist von Chondroitinsulfatmolekülen mit Molmassen kleiner oder gleich 3000 Dalton.
Verfahren nach Anspruch 18, bei dem das kommerzielle Chondroitinsulfat aus Schweinen stammt und eine mittlere Molmasse von 20000 bis 40000 Dalton hat.
Verfahren nach Anspruch 18 oder Anspruch 19, bei dem die Lösung des kommerziellen Chondroitinsulfats in Schritt (a) 30 Minuten lang auf 121 bis 135°C erhitzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20, bei dem die Flitration der in Schritt (a) erhaltenen Lösung über Celite und/oder eine 1 μm-Membran durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 21, wobei das Verfahren weiterhin die folgenden Schritte umfasst: (f) Ultrafiltration der über der 10000 NMWL-Membran verbleibenden Lösung in Schritt (d) bei konstantem Volumen über eine 30000 NMWL-Molekularsiebmembran, wobei ein Volumen gleich dem Doppelten des Anfangsvolumens ultrafiltriert wird, (g) Ausfällen des in Schritt (f) erhaltenen Filtrats mit Aceton, wahlweise nach Konzentrieren, wodurch eine Verbindung C mit einer mittleren Molmasse von 10000–20000 Dalton, einem Sulfatierungsgrad pro Disaccharid von 0,75–1 und einem Proteingehalt von <1,5% erhalten wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 21, bei dem die Ultrafiltration bei konstantem Volumen in Schritt (d) über eine 30000 NMWL-Molekularsiebmembran durchgeführt wird, wodurch nach dem Schritt (e) eine Verbindung F mit einer mittleren Molmasse von 5000–20000 Dalton, einem Sulfatierungsgrad pro Disaccharid von 0,75–1 und einem Proteingehalt von <1,5% erhalten wird, wobei die Verbindung F frei ist von Chondroitinsulfatmolekülen mit Molmassen kleiner oder gleich 3000 Dalton sowie von Chondroitinsulfatmolekülen mit Molmassen grösser oder gleich 30000 Dalton.