DE60017900T2

DE60017900T2 - Herstellung von dreidimensionalem vaskularisierten gewebe mittels der verwendung von zweidimensionalen mikrohergestellten formen

Info

Publication number: DE60017900T2
Application number: DE60017900T
Authority: DE
Inventors: P. Joseph VACANTI; Jeffrey T. Borenstein; Dr. Homer PIEN; Brian T. Cunnungham
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: Charles Stark Draper Laboratory Inc; General Hospital Corp
Priority date: 1999-04-30
Filing date: 2000-04-28
Publication date: 2006-04-06
Anticipated expiration: 2020-04-29
Also published as: JP2002542883A; US20030003575A1; WO2000066036A3; AU4805500A; DE60017900D1; AU772484B2; CA2370781A1; EP1187909A2; EP1187909B1; US20070148139A1; ATE288478T1; WO2000066036A2; US6455311B1

Description

Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Gebiete der Organtransplantation und der Chirurgie und nicht das neue Gebiet des Gewebeaufbaus. Spezieller betrifft sie ein neues Verfahren und Materialien zur Erzeugung von Geweben, die eine Blutgefäßzufuhr und eine Zufuhr anderer komplexer Komponenten, wie einer Nervenzufuhr, eines Drainagesystems oder des lymphatischen Systems.
Organtransplantation, wie sie derzeit praktiziert wird, wurde eine hauptsächlich lebensrettende Therapie für Patienten, die von Krankheiten befallen sind, welche legenswichtige Organe zerstören einschließlich des Herzens, der Leber, der Lungen, der Niere und des Darms. Die Knappheit von Organen jedoch, die für Transplantation benötigt werden, wurde kritisch und ständig schlechter. Gleichermaßen erreicht jedes größere Gebiet rekonstruktiver Chirurgie die gleiche Barriere der Gewebeknappheit. Orthopädische Chirurgie, Gefäßchirurgie, Herzchirurgie, allgemeine Chirurgie, Neurochirurgie und die anderen alle haben Teil an diesem fundamentalen Problem. Daher leiden als Ergebnis zahllose Patienten.
Über die letzten zwölf Jahre hinweg bringt das Gebiet die Erfahrung von Ärzten, Lebenswissenschaftlern und Ingenieuren zusammen, um Probleme der Erzeugung neuer Gewebe für Transplantation und chirurgische Rekonstruktion zu lösen. Der anfängliche Zugang zu diesem Problem wurde in den 1980ern beschrieben. Yannas und Burke (Bell, et al., Science, 221, 1052 (1981); Burke et al., Ann Surg 194, 413 (1981) (beschriebene Methoden, um neue Gewebe in vivo durch Einpflanzung nicht lebender Materialien zu erzeugen, wie von modifizierten Kollagenen, die mit Zellen beimpft werden, um eine gelenkte Regenerierung von Gewebe, wie Haut, zu fördern. Vacanti und Langer (Langer und Vacanti Science 260, 920 (1993); Vacanti, et al., Materials Research Society 252, 367 (1992)) beschrieben synthetische Fasermatrizen, zu welchen gewebespezifische Zellen in vitro zugegeben wurden. Die Matrizen sind äußerst porös und erlauben eine Massenüberführung zu den Zellen in vitro und nach der Implantation in vivo. Nach der Implantation wachsen neue Blutgefäße in die Vorrichtungen, um ein neues mit Gefäßen angereichertes Gewebe zu erzeugen. Die relativ lange Zeit zur Angiogenese begrenzt jedoch die Größe des neu gebildeten Gewebes.
Das Gebiet des Gewebeaufbaus ist nunmehr ausgereift und unterliegt explosionsartigem Wachstum. Siehe beispielsweise Vacanti und Langer, Lancet 354, 32 (1999); Langer und Vacanti Science 260, 920 (1993); Rennie, J. ed. Special report: The promise of tissue engineering. Scientific American 280, 37 (1999); und Lysaght, et al., Tissue Eng 4, 231 (1998). Fast jedes Gewebe und Organ des Körpers wurden untersucht. Viele gewebeaufbauende Technologien für menschlichen Gebrauch sind verfügbar. Siehe Lysaght, et al., Tissue Eng 4, 231 (1998); Bell, et al., Science 221, 1052 (1981); Burke, et al., Ann Surg 194, 413 (1981); Compton, et al., Laboratory Investigation 60, 600 (1989); Parenteau, et al., Journal of Cellular Biochemistry 45, 24 (1991); Parenteau, et al., Biotechnology and Bioengineering 52, 3 (1996); Purdue, et al., J. Burn Care Rehab 18, 52 (1997); Hansbrough und Franco, Clinical Plastic Surg 25, 407 (1998); Vacanti, et al., Materials Research Society 252, 367 (1992).
Mit der Zeit wurden mehrere Techniken, neues lebendes Gewebe aufzubauen, untersucht. Die Technologien schließen die Verwendung von Wachstumsfaktoren, um die Wundenreparatur und -regenerierung zu stimulieren, Techniken gelenkter Geweberegenerierung unter Verwendung nicht lebender Materialien zur Lenkung neuer Gewebeentwicklung, Zelltransplantation und Zelltransplantation auf Matrizen ein. In jüngerer Zeit führte ein neues Verständnis in der Stammzellenbiologie zu Studien von Populationen primordialer Zellen, Stammzellen oder embryonaler Stammzellen zur Verwendung in gewebeaufbauenden Versuchen.
Bis heute beruhten alle Wege beim Gewebeaufbau auf dem Einwachsen von Blutgefäßen in Einrichtungen mit aufgebautem Gewebe, um eine dauerhafte Vaskularisation zu erreichen. Diese Strategie wurde für viele Gewebe gut ausgearbeitet. Sie schlägt jedoch fehl bei dicken komplexen Geweben, wie lebensfähigen Organen einschließlich Leber, Niere und Herz. Techniken unter Verwendung dreidimensionaler Drucktechnologie zur Erreichung geordneter Bereiche von Kanälen wurden beschrieben, um eine Lösung dieses Problems zu beginnen. Siehe beispielsweise Griffith, et al., Ann NY Acad Sci 831, 382 (1997); Langer und Vacanti JP Sci Am 280, 62 (1999).
Parallel zu diesen Vorteilen hat das rasch auftauchende Gebiet der mikroelektromechanischen Systeme (MEMS) einen weiten Anwendungsbereich auf Gebieten so unterschiedlich wie Automobile, Trägheitslenkung und -navigation, Mikrooptik, chemisches und biologisches Abfühlen und jüngst biomedizinischer Aufbau, Langer und Vacanti Sci Am 280, 62(1999); McWhorter, et al., „Micromachining and Trends for the Twenty-First-Century", in Handbook of Microlithography, Micromachining and Microfabrication, ed. P. Rai-Choudhury, (Bellinghamn, WA, SPIE Press, 1997). Mikrofabrikationsverfahren für MEMS repräsentieren eine Ausdehnung von Halbleiterplatinen-Verfahrenstechnologie, die ursprünglich für die Industrie integraler Schaltungen (IC) entwickelt wurde. Die Steuerung von Merkmalen abwärts zu dem Untermikronwert erfolgt routinemäßig bei der IC-Verarbeitung von elektrischen Schaltkreiselementen. Die MEMS-Technologie überträgt diesen Kontrollwert in mechanische Strukturen auf Längenskalen, die von weniger als 1 Mikron auf mehr als 1 cm vergrößern. Standardmassenmikrobearbeitung ermöglicht Muster willkürlicher Geometrie zu Platinen unter Verwen dung einer Reihe subtraktiver Ätzmethoden zu bedrucken. Dreidimensionale Strukturen können durch Übereinanderliegen dieser Verfahrensstufen unter Verwendung genauer Ausrichtungstechniken realisiert werden. Mehrere Gruppen (Kourepenis, et al., „Performance of MEMS Inertial Sensors,", Proc. AIAA GN&C Conference, Boston, MA; 1998; Griffith, et al., Annals ofBiomed. Eng. 26, (1998); Folch, et al., Biotechnology Progress, 14, 388 (1998) haben diese äußerst präzisen Siliciumanordnungen verwendet, um Zellverhalten zu kontrollieren und Genexpression und Zelloberflächenwechselwirkungen zu studieren. Dieser Versuch ist jedoch im wesentlichen eine zweidimensionale Technologie und es wurde nicht ersichtlich, daß er an die Erzeugung dicker, dreidimensionaler Gewebe angepaßt werden könnte.
Der Stand der Technik wird durch die WO-A-96/40002 von Massachusetts Institute of Technology berücksichtigt, die ein dreidimensionales Druckverfahren als eine Reihe von Schichten aufbaut. Dieses Verfahren verwendet Polymerpulver in Schichten, die durch Polymerbindemittel gebunden werden, deren Geometrie durch computerunterstütztes Design und ebensolche Herstellung diktiert wird. Diese Technik erlaubt definierte interne Architekturen, die verzweigte Anordnungen von Kanälen einschließen konnten, die eine Gefäßzufuhr nachahmen. Diese Technik ist jedoch durch die Charakteristiken und Chemie der einzelnen Polymere begrenzt. Auch begrenzt sie ernsthaft die Typen von herzustellendem Gewebe. Polymerwände erlauben nicht, daß das Plasma ausgetauscht wird, was bei den Alveolkapillarwänden der Lunge erforderlich ist.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren und Materialien zur Erzeugung komplexer lebender vaskularisierter Gewebe für Organ- und Gewebeersatz zu bekommen, besonders für komplizierte und/oder dicke Strukturen, wie Lebergewebe.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein Verfahren und Materialien zur Erzeugung von komplexem, vaskularisierendem lebendem Gewebe in drei Dimensionen aus einer zweidimensionalen mikrohergestellten Form wurden entwickelt. Die Methode schloß ein, daß eine zweidimensionale Oberfläche mit einer Verzweigungsstruktur, die in die Oberfläche eingeätzt war, erzeugt wurde. Das Muster beginnt mit einem oder mit mehreren großen Kanälen, die sich nach und nach zu einer großen Anordnung von Kanälen verzweigen, die so klein wie einzelne Kapillaren sind und dann zu einem oder zu mehreren großen Kanälen konvergieren. Die geätzte Oberfläche dient als Templat in einer Form, die mit der geätzten Oberfläche für die Zirkulation eines einzelnen Gewebes oder Organs gebildet wird. Lebende vaskuläre Zellen werden dann auf der Form ausgesät, wo sie lebende vaskuläre Kanäle auf der Basis des in die Form eingeätzten Musters bilden. Wenn sie geformt und durch ihre eigene Matrize gehalten werden, wird das obere Ende der Form entfernt. Die speziellen Zellen des Organs oder Gewebes werden dann der geätzten Oberfläche zugegeben, wo sie anhaften und sich unter Bildung eines dünnen, vaskularisierten Gewebebo gens vermehren. Das Gewebe kann dann leicht von der Form unter Verwendung von Techniken angehoben werden, wie mit einem Fließmittelfluß und anderen tragenden Materialien, wenn erforderlich. Das Gewebe kann dann systematisch gefaltet und zu einer dreidimensionalen vaskularisierten Struktur verdichtet werden. Diese Struktur kann dann in Tiere oder Patienten implantiert werden, indem man die Blutgefäße direkt mit dem Fluß in die Vorrichtung und aus der Vorrichtung verbindet. Unmittelbare Perfusion von sauerstoffangereichertem Blut erfolgt, was ein Überleben und Funktionieren der gesamten lebenden Masse erlaubt.
Die Gestaltung der verzweigten Kanäle kann durch eine Reihe von Einrichtungen konstruiert werden, wie beispielsweise durch Bruchteilmathematik, die durch Computer in zweidimensionale Anordnungen von Verzweigungen umgewandelt wird und dann auf den Platinen eingeätzt wird. Auch Computer können aus lebenden oder konservierten Organ- oder Gewebeproben dreidimensionale vaskuläre Kanäle in zweidimensionale Muster umwandeln und dann bei der Rückumwandlung zu einer dreidimensionalen lebenden vaskularisierten Struktur beitragen. Techniken für die Herstellung der Formen schließen Techniken zur Herstellung von Computerchips und Mikrofabrikationstechnologien ein. Andere Technologien schließen Lasertechniken ein. Die zweidimensionale Oberfläche der Form kann auch so variiert werden, daß das Falten und Verdichten unterstützt wird. Beispielsweise kann die Oberfläche aus der ebenen in die gefaltete Form überführt werden. Sie kann auch zu mehrfachen konvergierenden Platten gestapelt werden. Sie könnte krummlinig sein oder vielfache Vorsprünge haben.
Unterschiedliche Gewebetypen oder mehrschichtige Gewebe des gleichen Typs können in Nachbarschaft zueinander plaziert werden, bevor sie gefaltet und verdichtet werden, um komplexere oder größere Strukturen zu erzeugen. Beispielsweise kann ein Röhrensystem auf einem vaskulären System als Schicht aufgebracht werden, um glomeruläre Gewebe und Sammelröhren für Nieren herzustellen. Gallenleiterröhren können über vaskularisierte Leber- oder Hepatozytgewebe gelegt werden, um Gallenleiterdrainagesysteme zu erzeugen. Alveol- oder Luftweggewebe können auf Lungenkapillaren plaziert werden, um neues Lungengewebe zu erzeugen. Nerven oder lymphatische Gewebe können unter Verwendung von Variationen dieser gleichen allgemeinen Techniken zugefügt werden. Die zweidimensionale Oberfläche der Form kann auch variiert werden, um das Falten und Verdichten zu unterstützen. Beispielsweise kann die Oberfläche aus einem ebenen Gebilde in eine Faltwand umgewandelt werden. Sie kann zu Mehrfachbedeckungsplatten gestapelt werden. Sie könnte auch krummlinig sein oder mehrfache Projektionen aufweisen.
Beispiele von Geweben und Organen, die unter Verwendung dieser Methoden hergestellt werden können, sind etwa, doch nicht ausschließlich, Organe, die derzeit transplantiert werden, wie Herz, Leber, Lunge, Niere und Darm. Andere Gewebe, wie Muskel, Knochen und Brustgewebe könnten auch aufgebaut werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1a ist eine schematische Darstellung des Verfahrens zur Herstellung eines verzweigten Musters auf einem Siliciumsubstrat. 1b ist eine detailliertere schematische Darstellung des Verfahrens zur Herstellung einer komplizierteren Struktur mit Kanälen variierender Tiefe.
2a ist eine schematische Darstellung einer geätzten Oberfläche, die Verzweigungsstruktur mit Verzweigungen von einem einzelnen Einlaß und anschließendem Konvergieren zurück zu einem einzelnen Auslaß zeigt. Die 2b und 2c sowie 2d sind schematisch dargestellte Querschnittansichten unterschiedlicher geätzter Kanäle in der Oberfläche von 2a.
3a–g sind schematische Darstellungen von Mehrfachgewebeschichten, die unter Bildung zweidimensionaler Strukturen zusammengefügt sind.
4a, b und c sind schematische Darstellungen des Verfahrens zur Herstellung einer Gewebeschicht.
5 ist eine schematische Darstellung eines zusammengesetzten komplexen Gewebes oder Organs, das durch das Verfahren der 4a–c gebildet wurde.
6 zeigt, wie das Organ von 5 mit einem Fluid durch Anastomose des Einlasses und des Auslasses verbunden werden kann.
7 ist eine schematische Darstellung des Musters, das unter Verwendung eines induktiv gekoppelten (IPC)-Systems erhalten werden kann.
8 ist eine schematische Darstellung des Verfahrens zur Herstellung von U-förmigen Kanälen in Siliciumplättchen.
9a zeigt das vaskuläre verzweigte Netzwerkbild, das für Silicium- und Pyrexplättchen für mikromaschinelle Behandlung (9a), verwendet wird, 9b zeigt die optische Mikrographie oder ein Teil des kapillaren Netzwerks, das in das Siliciumplättchen unter Verwendung des Verfahrens, das in 7 gezeigt ist, eingeätzt wurde, und 9c ist ein Scan-Elektronmikrograph des anisotropen Ätzverfahrens, welches zur Bildung verwinkelter Seitenwandkanäle verwendet wird.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Infolge der Schwierigkeiten des Standes der Technik wurde ein Weg entwickelt, ein vollständiges vaskuläres System 10 der aufgebauten Struktur vor dem Implantieren zu bekommen, auf dem Mikroherstellungstechniken, wie dreidimensionales Drucken, um eine geordnete Anordnung von Verzweigungskanälen in einem Substrat zu bekommen, das aus einem Material, wie Silicium oder einem biologisch verträglichen Polymer bestand, welche dann mit Zellen beimpft wurden. Eine vollständige Verzweigungsvaskulärzirkulation wird in zwei Abmessungen auf der Oberfläche von Silicium unter Verwendung einer Mikroherstellung durchgeführt. Die vasku läre Zirkulation wird dann von der Siliciumform abgehoben und zu einer kompakten dreidimensionalen Struktur gefaltet oder gerollt.
Mikroherstellungstechnologie wurde in wichtigen Untersuchungen in der Zell- und Entwicklungsbiologie angewendet, um komplexe biologische signalgebende Vorfälle, die an der Grenzfläche der Zellmembran und der Oberfläche, wie beschrieben, beispielsweise durch Kane, et al., Biomaterials 20, 2363 (1999), auftreten, zu verstehen. Sie wurde auch bei der Gewebeherstellung zur Führung des Zellverhaltens und der Formation kleiner Gewebeeinheiten verwendet, wie von Grifflih, et al., Annals of Biomed. Eng., 26 (1988) beschrieben ist. Wie durch Beispiel 1 demonstriert, wurde nun eine kohärente Struktur über einen breiten Bereich gewonnen, die die Wirksamkeit dieser Methode für den Gewebeaufbau für die Konstruktion komplexer und/oder dicker Strukturen, wie der Leber, demonstriert. Die in dem Beispiel konstruierte Vorrichtung enthält Kanäle, die als ein einzelner Einlaßkanal mit einem Durchmesser von 500 Mikron enden, wobei Verzweigung über vier Generationen vorliegt, die einem geometrischen Vergrößerungsgesetz folgen, welches die Kanalbreite für jede nachfolgende Generation halbiert, eine Gruppe von Kapillarkanälen mit 10 Mikron Durchmesser bildet und dann nacheinander die Verzweigungen zurückführt, bis zu einer einzelnen Auslaufvene. Lebende Endothelzellen, die in diese Kanäle eingesät wurden und mit einem Strom von geeigneten Nährstoffen und Gasen versehen sind, werden die Kanäle unter Bildung von Blutgefäßen auskleiden. In Beispiel 2 wurde demonstriert, daß Zellen, die auf Oberflächen von Silicium und Pyrex ausgesät wurden, eine Matrize ablegen, und Gewebebögen der ursprünglichen Zelltype entweder hepatisch oder endothel bilden. Diese Bögen können von der Oberfläche abgeschält und zu dreidimensionalen Gewebeeinheiten ausgebildet werden. In der Wirkung hat die Silicium- oder Pyrexplatine diejenige einer Form für die Ausbildung von Gewebe.
Diese Beispiele demonstrieren, daß Mikroherstellungstechnologie so angepaßt werden kann, daß sie die Notwendigkeiten der Bildung von lebendem Gewebe erfaßt. Die Energie der Technik liegt in ihrer Steuerung über extrem kurze Abstände. Die Auflösung ist in der Größenordnung von 0,1 Mikron von Punkt zu Punkt. Diese Präzision fügt neue Höhenwerte der Steuerung der Fähigkeit hinzu, neue Gewebebildung zu gestalten und zu leiten. Beispielsweise können Oberflächen mit Untermikron-Nuten oder -Zahnungen bedruckt werden, und Ecken können abgerundet, abgewinkelt oder schart mit dieser gleichen Submikronpräzision hergestellt werden. Geometrische Steuerung an dieser Skala kann einen kräftigen Schlag auf die Zellanhaftung durch Mechanismen bekommen, wie durch Berührungsführung, wie von Den Braber, et al., J. Biomed. Mater. Res. 40, 291 (1998) beschrieben ist. Diese Technologie überwindet die Probleme mit dem Stand der Technik, der auf sehr dünne Strukturen begrenzt war, da Gestaltungen auf die Oberfläche der Siliciumplatinen eingeengt waren. Eine Verwendung der Platine als eine zeitweilige Form, anschließendes Anheben des Gewebes von der Platine und Falten des Gewebes in einen dreidimensionalen Raum überwindet diese Beschränkung.
Wie hier beschrieben, werden komplizierte Gewebe durch Laminieren dünner vaskularisierter Gewebeschichten, um dickere Gewebestrukturen oder kompliziertere Organäquivalente zu bilden, gewonnen. Die dünnen vaskularisierten Gewebeschichten werden dadurch gebildet, daß

(1) eine Form mit einem komplizierten Muster von Kanälen, die in wenigstens einer Oberfläche ausgebildet sind und in die Zellen ausgesät werden können,
(2) die vaskulären (Endothel) Zellen in die Kanäle ausgesät werden,
(3) die vaskulären Zellen unter Bedingungen gezüchtet werden, bis sie Vaskularisation bilden,
(4) eine andere Type oder andere Typen von Zellen auf oder in die Form derart eingesät, daß ein Gewebe gebildet wird, welches die Vaskularisation einschließt,
(5) die vaskularisierte Gewebeschicht entfernt wird und
(6) mehrere Schichten der vaskularisierten Gewebeschichten miteinander vereinigt werden, bis die erwünschte komplizierte Struktur (oder das Organäquivalent) gebildet ist.

Diese Struktur kann dann implantiert werden und die Vaskularisation, wenn sie geeignet gestaltet ist, in die vorhandene Vaskularisation anastomisiert werden, um eine unmittelbare Blutzufuhr für das implantierte Organ äquivalent zu bekommen.
Formen für die Herstellung dünner vaskularisierter Gewebeschichten
Materialien für die Bildung von Formen
Die Herstellung der Platinenformen beginnt durch Auswahl eines geeigneten Substrates. Irgendeines aus einer Vielzahl von Materialien kann benutzt werden, um die Oberflächen zu bilden, auf welchen die Verzweigungsstrukturen geformt oder geätzt werden können. Diese schließen „inerte" Materialien, wie Silikon, Polymere, wie Polyethylenvinylacetat, Polycarbonat und Polypropylen sowie Materialien, wie ein Keramikmaterial oder ein Material, wie Hydroxyapatit, ein. Insbesondere kann die Form aus Metallen, Keramik, Halbleitern, organischen Polymeren und Zusammensetzungen bestehen. Repräsentative Metalle und Halbleiter schließen nicht rostenden Stahl mit pharmazeutischer Zulassung, Gold, Titan, Nickel, Eisen, Gold, Zinn, Chrom, Kupfer, Legierungen dieser Elemente oder anderer Metalle, Silicium, Siliciumdioxid ein.
Typischerweise wird Mikrobearbeitung auf Einkristall-Siliciumplatinen von Standardmasse mit einem Durchmesser im Bereich zwischen 50 und 300 mm und einer Dicke im Bereich zwischen 200 und 1200 Mikron durchgeführt. Diese Platinen können von einer großen Anzahl von Händlern von Standardhalbleitermaterial bezogen werden und werden gesägt und poliert, um genau bemessene, gleichmäßige kristallographische Orientierung und hochpolierte, optisch ebene Oberflächen zu bekommen. Platinen aus Pyrex-Borsilikat oder anderen Gläsern können beschafft und in Mikrobearbeitungsverfahren eingesetzt werden, wobei alternative Verfahren zum Ätzen der Glasmaterialien benutzt werden können.
Die Wahl eines Substratmaterials wird durch viele Betrachtungen gelenkt, einschließlich durch die Erfordernisse für das Herstellungsverfahren durch die erwünschten Formabmessungen, die erwünschte Größe der endgültigen Matrizen und durch die Oberflächeneigenschaften der Platine und ihrer Wechselwirkung mit den verschiedenen Zelltypen, extrazellulärer Matrize („ECM") und das Polymergrundgerüst. Kosten können auch eine Betrachtung darstellen, je nach den Gesamtgrößenerfordernissen der Gewebeform.
Wenn nichts anderes angegeben ist, schließt der Begriff „Polymer" Polymere und Monomere, die unter Bildung einer einstückigen Einheit polymerisiert oder zum Anhaften gebracht werden können. Das Polymer kann biologisch nicht abbaubar oder biologisch abbaubar sein, typischerweise über Hydrolyse oder enzymatische Spaltung, obwohl biologisch abbaubare Matrizen nicht typischerweise bevorzugt sind, da die Formen nicht implantiert werden und vorzugsweise wiederverwendbar sind. Nichtpolymere Materialien, die auch verwendet werden können, schließen organische und anorganische Werkstoffe, wie Hydroxyapatit, Calciumcarbonat ein, welche durch Aufbringung von Klebstoff statt eines Lösungsmittels verfestigt werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden Polymere auf der Basis der Fähigkeit des Polymers, geeignete biologische Reaktion aus Zellen herauszuholen, ausgewählt, wie beispielsweise Anhaftung, Wanderung, Vermehrung und Genexpression. Wie oben festgestellt, sind viele nicht biologisch abbaubare Kunststoffe bekannt, die derzeit in Zellkultur verwendet werden, einschließlich Polystyrol, Polycarbonat, Polypropylen, Polyvinylacetat sowie biologisch abbaubare Polymere, wie Polyhydroxysäuren und Polyhydroxyalkanoate. Photopolymerisierbare, biologisch verträgliche, wasserlösliche Polymere schließen Polyethylenglykoltetraacrylat (Ms 18.500) ein, welches mit einem Argonlaser unter biologisch verträglichen Bedingungen unter Verwendung eines Initiators, wie Triethanolamin, N-Vinylpyrrolidon und Eosin Y photopolymerisiert werden können. Andere geeignete Polymere können durch Bezugnahme auf The Polymer Handbook, 3. Auflage (Wiley, N.Y., 1989), erhalten werden.
Lösungsmittel für die meisten der thermoplastischen Polymere sind bekannt, wie beispielsweise Methylenchlorid oder andere organische Lösungsmittel. Organische und wäßrige Lösungsmittel für Protein- und Polysaccharidpolymere sind auch bekannt. Das Bindemittel kann das gleiche Material sein, wie es in herkömmlichen Pulververarbeitungsmethoden benutzt wird, oder es kann danach bestimmt werden, ob es letztlich das gleiche Bindemittel durch chemische oder physikalische Veränderungen ergibt, welches als ein Ergebnis von Erhitzen, Photopolymerisieren oder Katalyse entsteht.
Diese können mit einem die Zelladhäsion verbessernden Material beschichtet werden. In einigen Ausführungsformen wird die Befestigung der Zellen an dem Polymer durch Beschichten des Substrates mit Verbindungen, wie Grundmembrankomponenten, Agar, Agarose, Gelatine, Gummi arabicum, Kollagene vom Typ I, II, III, IV oder V, Fibronectin, Laminin, Glycosaminogly cane, Gemische hiervon und andere dem Fachmann auf dem Gebiet der Zellkulturen bekannte Materialien.
Eigenschaften der Formoberfläche können auch durch den Einschluß von Materialien auf oder in dem Formmaterial manipuliert werden, was die Porosität, die Zellanhaftung (beispielsweise durch Änderung der Oberflächenladung oder -struktur), Flexibilität oder Steifheit (was erwünschtermaßen Entfernung von Gewebekonstrukten erleichtern kann).
Methoden zur Bestimmung der Formoberflächen
Nachdem das Substratmaterial ausgewählt wurde, muß die Verfahrensabfolge für die Formgeneration definiert werden. Die Geometrie der Form, insbesondere die Anzahl unterschiedlicher erforderlicher Merkmalstiefen, ist der Hauptfaktor, der die spezielle Arbeitsabfolge bestimmt. Der einfachste Fall ist der einer einzelnen Tiefenabmessung für die Form. Speziell ist für ein Siliciumsubstrat die Verfahrensfolge (in 1a gezeigt) die nachfolgende. Zunächst wird die gewöhnliche Platine gereinigt, und eine Schicht von lichtempfindlichem Material wird auf der Oberfläche aufgebracht. Typischerweise wird die Schicht mit einer hohen Umdrehungszahl aufgesponnen, um einen Überzug von gleichmäßiger Dicke zu erhalten. Der Photoresist wird eingebrannt, und die Platine wird dann Ultraviolett- oder einem anderen kurzwelligen Licht durch eine halbtransparente Maske hindurch ausgesetzt. Diese Stufe kann unter Verwendung irgendeiner von mehreren Maskierungstechniken durchgeführt werden, je nach der erwünschten Bildauflösung. Der Resist wird dann in einer geeigneten Entwicklerchemie entwickelt und die Platine dann hartgebrannt, um überschüssiges Lösungsmittel aus dem Resist zu entfernen. Wenn das lithographische Verfahren abgeschlossen ist, kann die Platine in einem Plasmareaktor unter Verwendung eines von mehreren möglichen chemischen Wegen geätzt werden. Das Ätzen dient dazu, das zweidimensionale Bild in die dritte Dimension zu überführen: eine spezifische Tiefe in der Platine. Plasmaparameter werden durch die erwünschte Form des resultierenden Grabens (halbkreisförmig, Profil mit geraden Wandungen, angewinkelter Seitenwand), wie auch durch die Selektivität des Ätzmittels für Silicium über dem Maskierungsphotoresist, bestimmt. Wenn das Ätzen abgeschlossen ist, kann der Photoresist entfernt werden und die Platine für die Verwendung in dem Gewebeformverfahren aufbereitet werden.
Glas- und Polymerplatinenformen können unter Verwendung einer ähnlichen Sequenz hergestellt werden, doch kann das tatsächliche Verfahren durch die Zugabe einer Zwischenmaskierschicht modifiziert werden, da Ätzmittel für diese Materialien auch Photoresist angreifen können. Solche Störmaterialien fungieren einfach als Maskier- und Ätzmittel, wie in 1b gezeigt. Solche Störmaterialien wirken einfach so, daß sie das Bild von dem Photoresist auf die Zwischenschicht und dann auf die nachfolgende Platine übertragen. Für Silicium, das in einer der mehreren chemischen Feuchtverfahren geätzt wurde, kann eine Zwischenschicht auch erforderlich sein.
Erhöhte Flexibilität in der Geometrie der Platineform kann durch Einsetzen weiterer Maskier- und Ätzzyklen erhalten werden, wie in 1b gezeigt ist. Hier ist eine zweite Stufe dargestellt, in welcher eine Maskierschicht aufgebracht wurde, und es sind geätzte offene Bereiche gezeigt. Diese Abwandlung ergibt die günstige Möglichkeit, Maschinenkanäle variierender Tiefen in der Platinenform zu variieren. Für vaskuläre Verzweigungen mit unterschiedlichen Durchmessern wird diese gesteigerte Flexibilität sehr wichtig. Die Techniken können so ausgedehnt werden, daß sie möglichst viele zusätzliche Schichten und unterschiedliche Tiefen erbringen, wenn dies erwünscht ist.
Die Formoberfläche wird gestaltet, wie erforderlich ist, um Gewebeabschnitte mit den erwünschten vaskulären oder anderen röhrenförmigen Strukturen zu haben. Im Falle, wo eine natürlich vorkommende Struktur nachgeahmt wird, werden Kanäle in dem gleichen zweidimensionalen Bild geätzt, das in dem natürlichen Gewebe auftritt. Ein Unterschied besteht darin, daß das natürliche Gewebe nicht auf eine zweidimensionale Struktur beschränkt ist, sondern statt dessen Vaskularisation einschließen würde, die sich dreidimensional erstreckt. Dies unterscheidet sich von dem dünnen Gewebe oder den dünnen Organabschnitten, die, wie hier beschrieben, erzeugt werden.
Die Gestaltung der verzweigten Kanäle kann durch eine Anzahl von Mitteln konstruiert werden, wie durch Bruchmathematik, die durch Computer in zweidimensionale Anordnungen von Verzweigungen umgewandelt werden können und dann auf Platinen geätzt werden. Auch können Computer Modelle von lebenden oder konservierten Organen oder Geweben formulieren, die Proben dreidimensionaler vaskulärer Kanäle sind, sodann die zweidimensionalen Muster oder Bilder umwandeln und dann die Rückumwandlung in eine dreidimensionale lebende vaskularisierte Struktur unterstützen. Softwareprogramme vom Typ CAD-CAM würden typischerweise am brauchbarsten für die Gestaltung dieser Strukturen sein.
Methoden zur Konfiguration der Formen
Die Auswahl des Materials, welches als der Träger verwendet wird, bestimmt, wie die Oberfläche der Form gestaltet wird, um die Verzweigungsstruktur zu bilden. Materialien können durch Formen gestaltet werden, besonders in dem Fall von Polymeren, Ätzen unter Verwendung von Techniken, wie Laser-, Plasmaätzen oder chemisches Ätzen, Photolithographie oder Techniken mit kompakter freier Form einschließlich dreidimensionaler Druckmethoden (3DP), Stereolithographie (SLA), selektiver Lasersinterung (SLS), ballistischer Teilchenherstellung (BPM) und Fusionsabscheidungsmodellierung (FDM), Mikrobehandlung oder Kombinationen hiervon.
Herkömmliche Polymerverarbeitung
Polymere können unter Verwendung von Standardtechniken, wie Gießen in einem Lösungsmittel oder Extrudierformung in eine vorgefertigte Form, ausgeformt unter Verwendung einer der Techniken mit kompakter freier Form oder Gestaltung nach Formgebung unter Ver wendung chemischen Ätzens, mikromaschineller Bearbeitung, Laserstrahlen oder anderer Methoden, die hier beschrieben sind. Diese Methoden können auch verwendet werden, um die Formen von anderen Materialien als den Polymeren zu bilden.
Mikromaschinelle Verarbeitung und chemische Verarbeitung von Siliciummaterialien
Bei einer Ausführungform werden die Formen durch Mikroherstellungsverfahren, durch Erzeugung kleiner mechanischer Strukturen in Silicium, Metall, Polymer und anderen Materialien hergestellt. Diese Mikroherstellungsverfahren basieren auf wohlbekannten Verfahren, die verwendet werden, integrierte Schaltungen und andere mikroelektronische Einrichtungen herzustellen, ergänzt durch weitere Methoden, die von Entwicklern auf dem Gebiet der mikromaschinellen Verarbeitung entwickelt wurden.
Mikroherstellungsverfahren, die bei der Herstellung der hier beschriebenen Formen verwendet werden können, sind beispielsweise Lithographie, Ätztechniken, wie chemische Naßverfahren, Trockenverfahren und Photoresistentfernung, thermische Oxidation von Silicium, Galvanisier- und stromlose Plattierverfahren, Diffusionsverfahren, wie Bor-, Phosphor-, Arsen- und Antimondiffusion, Ionenimplantation, Filmabscheidung, wie Verdampfung (Fäden, Elektronenstrahl, Vakuum- und andersfarbige Aufplattierung sowie Stufenabdeckung), Sputtern, chemische Abscheidung aus der Dampfphase (CVD), Epitaxie (Dampfphase, flüssige Phase und Molekularstrahl), Elektroplattieren, Siebdruck und Laminieren. Siehe allgemein Jaeger, Introduction to Microelectronic Fabrication (Addison-Wesley Publishing Co., Reading MA 1998); Runyan, et al., Semiconductor Integrated Circuit Processing Technology (Addison-Wesley Publication Co., Reading MA 1990); Proceedings of the IEEE Micro Electro Mechanical Systems Conference 1987–1988; Rai-Choudhry, ed., Handbook of Microlithograghy, Micromachining & Microfabrication (SPIE Optical Engineeering Press, Bellingham, WA 1997). Die folgenden Methoden sind bevorzugt zur Herstellung von Formen.
Elektrolytische Anodisierung von Silicium in wäßriger Fluorwasserstoffsäure, gegebenenfalls in Kombination mit Licht, kann verwendet werden, um Kanäle in dem Silicium zu ätzen. Durch Variieren der Dotierkonzentration der zu ätzenden Siliciumplatine kann das elektrolytische Potential während des Ätzens, die einfallende Lichtintensität und die Elektrolytkonzentration, eine Kontrolle über die letztlich erhaltene Porenstruktur erhalten werden.
Dieses Verfahren verwendet tiefes Plasmaätzen von Silicium, um Formen mit Durchmessern in der Größenordnung von 0,1 μm oder größer zu erzeugen. Nadeln werden direkt unter Verwendung von Photolithographie statt indirekt durch Kontrollieren der Spannung (wie beim elektrochemischen Ätzen) als Muster erhalten, was eine stärkere Kontrolle über die Geometrie der fertigen Form ergibt.
In diesem Verfahren wird ein geeignetes Maskiermaterial (z. B. Metall) auf einem Siliciumplatinensubstrat und in Form eines Musters in Punktform mit einem Durchmesser der erwünschten Formen abgeschieden. Die Platine wird dann einem sorgfältig gesteuerten Plasma auf der Basis von Fluor/Sauerstoff-Chemie, um sehr tief zu ätzen, ausgesetzt, und ein hohes Verhältnis von Höhe zu Breite zieht Gräben in das Silicium. Siehe z. B. Jansen, et al., „The Black Silicon Method IV; The Fabrication of Three-Dimensional Structures in Silicon with High Aspect Ratios for Scanning Probe Microscopy and Other Applications", IEEE Proceedings of Micro Electro Mechanical Systems Conference, Seiten 88–93 (1995).
In diesem Verfahren wird zunächst eine Metallschicht auf ein ebenes Substrat aufgedampft. Eine Photoresistschicht wird dann auf dem Metall unter Bildung einer gemusterten Form abgeschieden, welche einen belichteten Metallbereich in der Nadelform zurückläßt. Durch Elektroplattieren auf den belichteten Bereichen der Metallschicht kann die durch Photoresist gebundene Form mit elektroplattiertem Material gefüllt werden. Schließlich werden das Substrat und die Photoresistform entfernt und hinterlassen dabei die fertige Formanordnung. Die nach diesem Verfahren hergestellten Formen haben allgemein Durchmesser in der Größenordnung von 1 μm oder größer, siehe z. B. Frazier, et al., „Two dimensional metallic microelectrode arrays for extracellular stimulation and recording of neurons", IEEE Proceedings of the Micro Electro Mechanical Systems Conference, Seiten 195–200 (1993).
Ein anderes Verfahren zur Gewinnung von Formen aus Silicium oder anderen Materialien ist die Verwendung von Mikroherstellungstechniken zur Erzeugung einer Form, indem man jene Form auf andere Materialien überträgt und dabei Standardformübertragungstechniken, wie Prägen oder Spritzgußformung, verwendet, und die neu erzeugte Form benutzt, die Endformen zu ergeben. Alternativ könnte die Erzeugung der Form übersprungen werden und die Form direkt mikrohergestellt werden, was angewendet werden könnte, um die Endformen zu erzeugen.
Eine andere Methode zur Ausbildung der festen Siliciumformen ist die unter Verwendung epitaxischen Wachstums auf Siliciumsubstraten, wie von Containerless Research, Inc. (Evanston, Illinois, USA) für deren Produkte benutzt wird.
Die Größenverteilung der geätzten porösen Struktur ist stark abhängig von verschiedenen Variablen einschließlich der Dotierart und der Belichtungsbedingungen, wie im einzelnen in Lehmann, „Porous Silicon -- A New Material for MEMS", IEEE Proceedings of the Micro Electro Mechanical Systems Conference, Seiten 1–6 (1996) beschrieben. Poröse Polymerformen können beispielsweise durch Mikroformung eines Polymers mit einem Gehalt eines verflüchtigbaren oder auslaugbaren Materials, wie eines flüchtigen Salzes, dispergiert in dem Polymer mit anschließendem Verflüchtigen oder Auslaugen des dispergierten Materials, wobei ein poröses Polymergemisch in der Form verbleibt. Hohlformen können beispielsweise unter Verwendung von Kombinationen von trockenem Ätzverfahren hergestellt werden (Laermer, et al., „Bosch Deep Silicon Etching: Improving Uniformity and Etch Rate for Advanced MEMS Applications", MicroElectro Mechanical Sytems, Orlando, FI, USA (Jan. 17–21, 1999); Despont et al., „High-Aspect-Ratio, Ultrathick, Negative-Tone Near-UV Photoresist for MEMS", Proc. of IEEE 10^th Annual International Workshop on MEMS, Nagoya, Japan, Seiten 518–522 (Jan. 26–30, 1997)); Mikroformerzeugung in lithographisch definierten Polymeren und selektive Seitenwandelektroplattierung oder direkte Mikroformtechniken unter Verwendung von Epoxyformüberführungen.
Eine Chrommaske kann die festen Formen unter Verwendung einer Siliciumnitridschicht, die mit Chrom bedeckt wird, ersetzen. Feste Formen werden dann geätzt, das Chrom wird abgestreift und das Silicium oxidiert. Die Siliciumnitridschicht wird Oxidation verhindern. Das Siliciumnitrid wird dann abgestreift und hinterläßt überall Silicium und mit Sauerstoff bedecktes Silicium. Die Nadel wird dann einem ICP-Plasma ausgesetzt, welches selektiv das Silicium in einer stark anisotropen Weise ätzt, um den inneren Hohlraum der Nadel zu bilden. Eine zweite Methode verwendet kompaktes Silicium als „Formen", um welche die tatsächlichen Nadelstrukturen abgeschieden werden. Nach der Abscheidung werden die Formen weggeätzt und ergeben die Hohlstrukturen. Kieselsäurenadeln oder Metallnadeln können unter Verwendung unterschiedlicher Methoden gebildet werden. Die Platinen werden dann zu einer kontrollierten Dicke oxidiert, das Siliciumnitrid wird abgestreift und der Siliciumkern selektiv weggeätzt (z. B. in einer nassen alkalischen Lösung), um eine hohle Kieselsäureform zu bilden.
Bei einer anderen Ausführungsform wird tiefes reaktives Ionenätzen mit einem modifizierten Verfahren mit schwarzem Silicium in einer herkömmlichen reaktiven Ionenätzweise vereinigt. Zunächst werden Gestaltungen als Muster über Photoresist in SIO₂, wie auf eine Siliciumplatine, übertragen. Sodann kann das Silicium unter Verwendung von tief reagierendem Ionenätzen (DRIE) in einem induktiv gekoppelten Plasma (ICP)-Reaktor geätzt werden, um tiefe vertikale Löcher oder Kanäle zu ätzen. Der Photoresist wird dann entfernt. Danach wird eine zweite Photolithographiestufe dazu verwendet, die restliche SiO₂-Schicht als Muster zu übertragen. Der Photoresist wird dann entfernt und die Siliciumplatine wiederum tief mit Silicium vollständig durch die Platine hindurch in die Bereiche geätzt, die nicht mit SiO₂ bedeckt sind. Dieses Verfahren kann folgendermaßen variiert werden. Nachdem das Muster oder Bild auf die Platine übertragen ist, werden die Photoresist- und SiO₂-Schichten mit konformem DC-gesputterten Chrom ersetzt. Das zweite ICP-Ätzen wird mit einer SF₆/O₂-Plasmaätzung in einer reaktiven Ionenätzvorrichtung (RIE) ersetzt, was zu positiv abgeschrägten Außenseitenwänden führt. Henry et al., "Micromachined Needles for the Transdermal Delivery of Drugs", Micro Electro Mechanical Systems, Heidelberg, Germany, Seiten 494–498 (Jan. 26–29, 1998).
Metallformen können durch physikalische Abscheidung aus der Dampfphase geeigneter Metallschichten auf festen Formen erzeugt werden, welche aus Silicium unter Verwendung der oben beschriebenen Techniken gebildet werden können, oder die unter Verwendung anderer Standardformtechniken, wie Prägen oder Spritzgußformung, gewonnen werden können. Die Metalle werden selektiv unter Verwendung von Elektropoliertechniken entfernt, bei denen ein angelegtes anodisches Potential in einer Elektrolytlösung eine Auflösung von Metallen infolge Konzentration elektrischer Feldlinien bewirkt wird. Wenn das darunterliegende Silicium freigelegt wurde, wird das Silicium selektiv weggeätzt, um Strukturen zu bilden. Dieses Verfahren könnte auch verwendet werden, um Strukturen aus anderen Materialien herzustellen, indem man ein anderes Material als Metall auf der Nadel bildet und das oben beschriebene Verfahren verfolgt.
Aus Siliciumdioxid gebildete Formen können durch Oxidieren der Oberfläche der Siliciumform statt Abscheidung eines Metalls gewonnen werden, worauf dann die kompakten Nadelformen die hohlen Siliciumdioxidstrukturen zurücklassen. Bei einer Ausführungsform werden hohle, poröse oder kompakte Formen mit Längsnuten oder anderen Modifikationen auf der äußeren Oberfläche der Formen erzeugt.
Polymerformen können unter Verwendung mikrohergestellter Formen gewonnen werden. Beispielsweise können die Epoxyformen, wie oben beschrieben, hergestellt werden, und Spritzgußformtechniken können angewendet werden, um die Strukturen zu bilden. Diese Mikro-Mikroformungstechniken sind relativ billiger zu replizieren als die anderen hier beschriebenen Methoden.
Methoden zur Bildung kompakten freier Formen für die Gestaltung der Formgebungen
3DP wird von Sachs, et al., „CAD-Casting: Direct Fabrication of Ceramic Shells and Cores by Three Dimensional Printing" Manufacturing Review 5(2), 117–126 (1992) und US-Patent Nr. 5,204,055 von Sachs, et al., beschrieben. 3DP wird verwendet, um ein kompaktes Objekt durch Tintenstrahldruck eines Bindemittels in ausgewählten Bereichen nacheinander abgeschiedener Pulverschichten zu erzeugen. Jede Schicht wird durch Ausbreiten einer dünnen Pulverschicht über der Oberfläche eines Pulverbettes erzeugt. Das Pulverbett wird von einem Kolben getragen, der bei der Ausbreitung des Pulvers und beim Bedrucken jeder Schicht abwärts geht (oder umgekehrt werden die Tintenstrahlen und Ausbreitungseinrichtungen nach dem Bedrucken jeder Schicht angehoben, und das Bett bleibt ortsfest). Instruktionen für jede Schicht leiten sich direkt von einer computergestützten Gestaltungswidergabe (CAD) der Komponente her. Den zu bedruckenden Bereich bekommt man durch Computerverarbeitung des Bereichs, in dem sich die erwünschte Ebene und die CAD-Repräsentation des Objektes überschneiden. Die einzelnen zu Scheiben geschnittenen Segmente oder Schichten werden verbunden, um die dreidimensionale Struktur zu bilden. Das ungebundene Pulver unterstützt zeitweilig unverbundene Abschnitte der Komponente, wenn die Struktur aufgebaut wird, doch wird nach Abschluß des Bedruckens entfernt.
Andere SFF-Methoden als 3DP, die in einigem Umfang benutzt werden können, wie hier beschrieben ist, sind Stereolithographie (SLA), selektive Lasersinterung (SLS), ballistische Teilchenherstellung (BPM) und Fusionsabscheidungsformung (FDM). SLA basiert auf der Verwendung eines fokussierten Ultraviolettlasers (UV), welcher über der Oberseite eines Bades eines photopolymerisierbaren flüssigen Polymermaterials Vector-gescannt wird. Der UV-Laser bewirkt, daß das Bad polymerisiert, wo der Laserstrahl auf die Oberfläche des Bades auftrifft, was zur Erzeugung einer ersten festen Kunststoffschicht an und gerade unter der Oberfläche führt.
Die kompakte Schicht wird dann in das Bad abgesenkt, und das Laser-erzeugte Polymerisationsverfahren wird wiederholt für die Generation der nächsten Schicht usw., bis eine Vielzahl übereinanderliegender Schichten gebildet ist, mit denen die erwünschte Vorrichtung erhalten wird. Die jüngst erzeugte Schicht wird in jedem Fall immer bis zu einer Position für die Erzeugung der nächsten Schicht etwas unterhalb der Oberfläche des flüssigen Bades abgesenkt. Ein System für Stereolithographie wird gemacht und bei 3D Systems, Inc. in Valencia, CA, gekauft, und dieses System ist leicht für die Verwendung mit biologisch verträglichen Polymermaterialien verarbeitbar. SLS verwendet auch einen fokussierten Laserstrahl, doch um Bereiche eines locker kompaktierten Kunststoffpulvers zu sintern, wobei das Pulver Schicht um Schicht aufgetragen wird. Bei dieser Methode wird eine dünne Pulverschicht gleichmäßig auf einer flachen Oberfläche mit einem Walzenmechanismus ausgebreitet. Das Pulver wird dann Rastergescannt mit einem energiereichen Laserstrahl. Das Pulvermaterial, das von dem Laserstrahl getroffen wird, verschmilzt, während die anderen Pulverbereiche dissoziiert bleiben. Aufeinanderfolgende Pulverschichten werden abgeschieden und Raster-gescannt, eine über der anderen, bis ein Gesamtteil vollständig bearbeitet ist. Jede Schicht wird tief genug gesintert, um sie an die vorausgehende Schicht zu binden. Ein geeignetes System, das für die Verwendung bei der Herstellung medizinischer Einrichtungen anpaßbar ist, ist bei DTM Corporation in Austin, TX, erhältlich.
BPM verwendet eine Tintenstrahldruckeinrichtung, worin ein Tintenstrahlstrom von flüssigem Polymer oder einer Polymerzusammensetzung verwendet wird, um dreidimensionale Objekte unter Computersteuerung ähnlich dem Weg eines Tintenstrahldruckers herzustellen, wobei zweidimensionale grafische Drucke erzeugt werden. Die Vorrichtung wird durch Bedrucken von Querschnitten nacheinander eine Schicht nach der anderen mit dem Ziel gebildet, eine Kaltschweiß- oder Schnellverfestigungstechnik zu verwenden, was eine Bindung zwischen den Teilchen und den nachfolgenden Schichten bewirkt. Dieser Weg wurde auf Metall oder Metallzusammensetzungen, angewendet von Automated Dynamic Corporation in Troy, N.Y., vorgeschlagen. FDM verwendet einen x-y-Plotter mit einer z-Bewegung, um einen extrudierbaren Faden zu positionieren, der aus einem Polymermaterial gebildet wird, welches durch die Hitze oder das Vorhandensein eines Lösungsmittels fluid gemacht wird. Ein geeignetes System ist bei Stratsys, Incorporated, Minneapolis, MN, erhältlich.
Zellen für die Bildung vaskularisierter Gewebeschichten
Obwohl hier speziell unter Bezugnahme auf die Bildung von vaskularisiertem Gewebe beschrieben, sollte doch verstanden werden, daß die Kanäle auch für das Bilden von Hohlräumen für den Durchgang verschiedener Fluide verwendet werden können, nicht gerade für Blut, aber auch für Gallenflüssigkeit, Lymphflüssigkeit, Urin und andere Körperflüssigkeiten sowie für die geführte Regenerierung oder das Wachstum anderer Zelltypen, besonders Nervenzellen. Die Gewebeschicht kann einige Hohlräume für die Bildung von Vaskularisation und einige für andere Zwecke einschließen oder für einen Zweck dienen, der typischerweise eine Blutzufuhr braucht, um Sauerstoff und Nährstoffe zu den Zellen in dem Gewebe und von ihnen weg zu transportieren.
Das Gewebe wird typischerweise ein oder mehrere Typen „funktionelle" oder Parenchymzellen sowie Zellen mit speziellen Stoffwechselfunktionen einschließen, wie Pancreas-Hepatozyt-Zellen, Nieren-, Gehirn-, reproduktive Gewebezellen, Zellen, die den Darm bilden, Nervenzellen, Knoch-, Muskel-, Herz-, Haut-Zellen usw. Die Vaskulisation wird typischerweise von Endothelzellen gebildet.
Zellen können durch Biopsie oder Entnahme aus einem lebenden Donor, durch Zellkultur oder Autopsie erhalten werden. Zellen könnten unter Verwendung von Standardtechniken, wie Aufschluß mit Kollagenase, anschließendes unmittelbares Aussäen in die Form oder nach Lagerung der Zellkultur dissoziiert werden. Zellen können normale Zellen oder genetisch aufgebaute Zellen von dem Patienten sein, in welchen das Gewebe implantiert werden soll, oder von einem geeigneten Donor.
Methoden zum Aussäen von Zellen in die Form
Ein Verfahren und Materialien zur Erzeugung von kompliziertem vaskularisiertem lebendem Gewebe in drei Dimensionen aus einer zweidimensionalen mikrofabrizierten Form wurden entwickelt. Die Methode schloß eine Erzeugung einer zweidimensionalen Oberfläche mit einer Verzweigungsstruktur, die in die Oberfläche eingeätzt war, ein. Wie in 2a gezeigt, beginnt in einer bevorzugten Ausführungsform das Bild in der Form 10, das von einer Siliciumplatine 11 unterstützt wird, mit einem oder mehreren großen Kanälen 12, die sich nach und nach in eine große Anordnung von Kanälen verzweigen, die so klein wie einzelne Kapillaren 14a, 14b, 14c usw. sind, dann zu einer oder mehreren großen Kanälen 16 konvergieren. Der Querschnitt des einzelnen „arteriellen" Kanals 12 und des „venösen" Kanals 16 sind in 2b gezeigt. Die Querschnitte des Formbereichs 10, die die „Kapillar"-Kanäle 14a, 14b, 14c usw. enthalten, sind in 2c gezeigt. Die Form ist im Querschnitt in 2d mit einer Tiefe von etwa 5 Mikron gezeigt.
Die geätzte Oberfläche dient als eine Matrize in einer Form, die mit der geätzten Oberfläche für die Zirkulation eines individuellen Gewebes oder Organs dient. Wie in 4a gezeigt, sind die Formteile 30 und 32 zusammengepaßt, um einen Einschluß 34 und Zellkulturen zu schaffen. Die vaskulären Zellen bilden Vaskulärkanäle 36 auf der Basis des Bildes, welches in die Form eingeätzt ist, wie in 4b gezeigt ist. Wenn die Spitze 32 durch ihre eigene Matrize gebildet und beibehalten wurde, wird der obere Teil 32 der Form entfernt, und die speziellen Organ- oder Gewebezellen werden dann zu der geätzten Oberfläche zugegeben, wo sie gebunden werden und sich vermehren, um einen dünnen vaskularisierten Gewebebogen 36 zu bilden. Wie in 4c gezeigt, kann das Gewebe dann vorsichtig von der Form unter Verwendung von Techniken, wie Fluidfluß und anderes Stützmaterial abgehoben werden.
Aufbau von Gewebe- oder Organäquivalenten
Nach der Bildung der Gewebeschichten kann das Gewebe systematisch gefaltet und in eine dreidimensionale vaskularisierte Struktur verdichtet werden, wie in 5 gezeigt ist. Die zweidimensionale Oberfläche der Form kann variiert werden, um das Falten und Verdichten zu unterstützen. Beispielsweise kann die Oberfläche von eben zu einer Faltwand verändert werden. Sie kann zu mehreren kovergenten Platten gestapelt werden. Sie könnte auch krummlinig sein oder mehrere Vorsprünge haben.
Die 3A–G sind perspektivische Darstellungen von Wegen, auf denen eine einzelne Gewebeschicht 36 (3A) gefaltet sein kann (3B und 3C) oder gestapelt (3D) oder unter Bildung einer Ballonform (3E), eines Trichters (3F) oder eines großen Hohlraumes (3G) ausgedehnt sein kann.
Diese Struktur kann dann bei Tieren oder Menschen implantiert werden, indem direkt die Blutgefäße in einer Weise verbunden werden, daß ihr Fluß in die Vorrichtung und aus der Vorrichtung geht, wie in 6 dargestellt ist. Unmittelbare Perfusion von oxidiertem Blut erfolgt, was ein Überleben und Funktionieren der gesamten lebenden Masse gestattet.
Unterschiedliche Gewebetypen oder Mehrfachschichten des gleichen Gewebetyps können in Nachbarschaft zueinander plaziert werden, bevor gefaltet und verdichtet wird, um kompliziertere oder größere Strukturen zu erzeugen. Beispielsweise kann ein Röhrensystem auf einem vaskulären System abgelagert werden, um kugelförmiges Gewebe herzustellen und Röhren für Nieren zu sammeln. Gallengangröhren können über der vaskularisierten Leber oder über Häpatozytengewebe abgelegt werden, um ein Gallengangdrainagesystem zu erzeugen. Alveol- und Luftweggewebe kann auf Lungenkapillaren plaziert werden, um neues Lungengewebe zu gewinnen. Nerven oder Lymphgefäße können unter Verwendung von Variationen dieser gleichen allgemeinen Techniken zugeführt werden. Die zweidimensionale Oberfläche der Form kann auch zur Unterstützung des Faltens und Verdichtens variiert werden. Beispielsweise kann die Oberfläche von eben zu faltwandartig verändert werden. Es kann zu Mehrfachabdeckungsplatten gestapelt werden. Es könnten auch krummlinige oder mehrfach übereinanderliegende Vorsprünge vorliegen.
Beispiel 1: Mikrobearbeitung einer Matrize zu Gewebeaufbau mit verzweigten vaskularisierten Kanälen für die Leberherstellung
Mikrobearbeitungstechnologien wurden auf Silicium- und Pyrexoberflächen verwendet, um komplette Gefäßsysteme zu erzeugen, die mit aufgebautem Gewebe vor der Implantation integriert werden können. Rillenmuster, die an verzweigte Architektur von Gefäß- und Kapillarnetzwerken erinnern, wurden unter Verwendung vaskulärer und kapillarer Standard-Photolithographietechniken auf Silicium- und Pyrexoberflächen eingeätzt, wobei Standardphotolithographische Techniken auf Silicium- und Pyrexoberflächen verwendet wurden, um als Matrizen zu dienen. Hepatozyt- und Endothelzellen wurden gezüchtet und anschließend als Einzelzellenmonoschichten von diesen beiden Dimensionsformen abgehoben. Beide Zelltypen waren lebensfähig und vermehrungsfähig auf diesen Oberflächen. Außerdem unterstützten Hepatozyten die Albuminproduktion. Die abgehobenen Monoschichten wurden dann zu kompakten dreidimensionalen Geweben gefaltet. Das Ziel ist es, dieses verzweigte vaskuläre Netz von den zweidimensionalen Matrizen so abzuheben, um sie mit Schichten von Parenchymgewebe, wie Hepatozyten, zu kombinieren, um dreidimensionale Ausbildungen von lebendem vaskularisiertem Gewebe für die Implantation zu bilden.
Materialien und Methoden
Mikrobehandlungstechniken
Matrizen für die Bildung von Bögen von lebendem vaskularisiertem Gewebe wurden unter Benutzung von Mikrobearbeitungstechnologie hergestellt. Für die vorliegende Arbeit wurde ein einzelner Ätzlevel benutzt, um ein vaskuläres Netzwerkbild in einem Muster verbundener Rillen in die Oberfläche sowohl der Silicium- als auch der Pyrexplatinen zu übertragen.
Bei diesem Prototyp wurde eine einfache Geometrie gewählt, um das Muster in das vaskuläre Netz zu bringen. Nahe der Kante einer jeden Platine wurde ein einzelner Einlaß oder Auslaß mit einer Breite von 500 μm positioniert. Nach einer kurzen Länge verzweigten sich der Einlaß und der Auslaß in drei kleinere Kanäle einer Breite von 250 μm, jede dieser Verzweigungen wieder in drei Kanäle von 125 μm und schließlich herab bis zu 3 Kanälen von 50 μm. Kanäle erstreckten sich von den Kanälen mit 50 μm zur Bildung eines Kapillarnetzes, welches die Masse des Layout umfaßt. Zwischen diesen Einlaß- und Auslaßnetzen liegt ein gefliestes Diamantmuster, und Hexagone bildeten ein Kapillarbett, wobei sie den gesamten Raum zwischen dem Einlaß und dem Auslaß füllen. In einer Konfiguration war die Kapillarbreite auf 25 μm eingestellt, während in der anderen die Kapillaren bei 10 μm fixiert wurden. Diese Geometrie wurde wegen ihrer Einfachheit sowie ihrer rohen Näherung der Größenmaßstäbe der Verzweigungsarchitektur der Leber ausgewählt. Das Layout dieses Netzes wurde unter Verwendung von CADENCE-Software (Cadence, Chelmsford, Massachusetts) auf einer Silicium-Grafik-Arbeitsstation gespeichert. Ein Speicherexemplar mit dem Layout wurde ausgedruckt und elektronisch an Align-Rite (Burbank, Kalifornien) geliefert, wo Glasplatten mit Elektronenstrahlerzeugten Mustern oder Bildern, die die Layoutgeometrie replizierten, erzeugt wurden und für lithographische Verarbeitung zurückgeführt wurden.
Ausgangsmaterialien für Gewebeaufbaumatrizenherstellung waren Standard-Halbleitersiliciumplatinen (Virginia Semiconductor, Powhatan, Virginia) und Standard-Pyrexplatinen (Bullen Ultrasonics, Eaton, Ohio), geeignet für MEMS-Verarbeitung. Siliciumplatinen hatten einen Durchmesser von 100 mm und eine Dicke von 525 Mikron mit Primär- und Sekundärschichten, die in die Platinen eingeschnitten wurden, um Signalkristalle zu orientieren. Die Kristallorientierung war <100>, und Platinen wurden mit Bor dotiert, um Widerstand von etwa 5 W-cm zu erhalten. Die Vorderfläche wurde an einer optischen Nachbehandlungseinrich tung poliert, und die Rückoberfläche wurde zu einer matten Konsistenz geschliffen. Pyrexplatinen hatten eine identische Zusammensetzung wie Corning 7740 (Corning Glass Works, Corning NY) und waren auch 100 mm im Durchmesser, hatten aber eine Dicke von 775 Mikron. Sowohl die Vorder- als auch die hinteren Oberflächen wurden mit einem optischen Nachbehandlungsmittel poliert. Vor der Mikrobehandlung wurden beide Platinentypen in einem Gemisch von 1 Teil H₂SO₄ zu 1 Teil H₂O₂ während 20 Minuten bei 140°C entionisiert, bei 140°C 8 mal in entionisiertem Wasser mit einem Widerstand von 18 MW gespült und in einem Strom von heißem N₂-Gas getrocknet.
Für Silicium- und Pyrexplatinen wurde Standard-Photolithographie als die Ätzmaske für Rillenbildung verwendet. Ätzen von Pyrexplatinen erfordert die Abscheidung einer Zwischenschicht für die Bildübertragung, die undurchlässig für die Ätzchemie ist. Eine Schicht von Polysilicium mit einer Dicke von 0,65 μm über dem Pyrex wurde für diesen Zweck benutzt. Diese Schicht wurde unter Verwendung der chemischen Abscheidung aus der Dampfphase bei niedrigem Druck (LPCVD) bei 570°C und 500 m Torr über die Standard-Silanzersetzungsmethode abgeschieden. In dem Fall von Silicium konnte der Photoresist alleine begrenzt widerstehen, wenn er zwei von den drei Ätzwegen anwendete. Für den dritten chemischen Weg wurde eine 1,0 μm dicke Schicht von Siliciumdioxid thermisch bei 1100°C in Wasserstoff und Sauerstoff abgeschieden.
Wenn die Platinen gereinigt und für die Verarbeitung vorbereitet waren, wurden Bilder des Prototyps der Verzweigungsarchitektur auf die Platinenoberflächen unter Verwendung von Standard-MEMS-Lithographietechniken übertragen. Eine einzelne Photoresistschicht (Shipley 1822, MicroChem Corp., Newton, Massachusetts) wurde auf die Platinenoberflächen bei 4000 Umdrehungen je Minute aufgesponnen, was eine Filmdicke von etwa 2,4 μm ergab. Nach dem Einbrennen bei 90°C während 30 Minuten wurde die Photoresistschicht UV-Licht unter Verwendung eines Karl Suss MA6 (Suss America, Waterbury, Vermont)-Maskenausrichters vorgesehen. Licht wurde durch die oben beschriebene lithographische Platte geschickt, die in physikalischem Kontakt mit der beschichteten Platine stand. Diese Methode repliziert das Muster auf der Platte bis zu einer Genauigkeit von 0,1 m μm. Nach der Belichtung wurden Platinen in Shipley 319 Developer (MicroChem Corp., Newton, Massachusetts) entwickelt und gespült und in entionoisiertem Wasser getrocknet. Schließlich wurden Platinen bei 110°C während 30 Minuten eingebrannt, um den Resist zu härten, und einem Sauerstoffplasma mit 80 Watt Energie für 42 Sekunden ausgesetzt, um Spuren von Harz aus offenen Bereichen zu entfernen.
Siliciumplatinen wurden unter Verwendung von drei unterschiedlichen chemischen Wegen geätzt, während Pyrexplatinen unter Verwendung nur einer Technik verarbeitet wurden. Für Pyrex wurde das lithographische Bild auf die Polysiliciumzwischenschicht aufgebracht und unter Verwendung eines kurzen Einwirkens (etwa 1 Minute) auf SF₆ in einem Reaktivionenätzplasmasystem (Surface Technology Systems, Newport, Großbritannien) ausgesetzt. Photoresist wurde entfernt und das in die Polysiliciumschicht ansatzweise übertragene Bild wurde bei Raumtemperatur unter Verwendung eines Gemisches aus 2 Teilen HNO₃ auf 1 Teil HF in Form von Kanälen in das Silicium übertragen. Mit einer Ätzrate von 1,7 Mikrometern pro Minute wurden innerhalb von etwa 12 Minuten 20 Mikrometer tiefe Kanäle in die Pyrexscheiben geätzt. Da die Chemie isotrop ist, werden die Kanten, während sie geätzt werden, breiter. Bearbeitung mit dem Layoutbild mit 25 μm weiten Kapillarpflanzen neigte zum Ergebnis beim Verschmelzen der Kanäle, während die Verwendung von 10 μm breiten Kanälen dieses Phänomen vermieden. Interferometrische Analyse der Kanäle nach dem Ätzen zeigte, daß die Oberflächenrauheit geringer als 0,25 μm war. Wenn ein Kanalätzen von Pyrexplatinen beendet war, wurde das Polysilicium mit einem Gemisch von 10 Teilen HNO₃ zu 1 Teil HF bei Raumtemperatur entfernt, und Platinen wurden erneut in 1 Teil H₂SO₄ zu 1 Teil HF gereinigt.
Drei unterschiedliche chemische Wege wurden beschritten, um Silicium zu ätzen und so die Wechselwirkung zwischen Kanalgeometrie und Zellenverhalten zu untersuchen. Zunächst wurde eine Standard-Ätzchemie mit anisotropem Plasma unter Verwendung eines Gemisches von SF₆ und C4F₈ in einem Plasmasystem mit umgeschaltetem Verfahren aus STS²⁴ verwendet, um rechtwinklige Rillen in Silicium zu erzeugen. Engere Rillen sind flacher als tiefe Rillen infolge eines als RIE-lag bekannten Phänomens. Ein zweites Verfahren benutzte ein anderes Plasmasystem von STS, welches isotrope Rillen mit einem U-förmigen Profil erzeugt. Während das Verfahren isotrop ist, ist eine Verbreiterung der Rillen nicht so stark wie beim isotropen Pyrexätzen festgestellt wurde, wobei dieses Verfahren später beschrieben wird. In diesen beiden Plasmaätzfällen wurden Rillen in einer nominalen Tiefe von 20 μm geätzt. Für das dritte Verfahren, anisotropes Ätzen in KOH (45 %Gewicht/Gewicht in H₂O bei 88°C) wurde die Siliciumdioxidzwischenschicht verwendet, die oben erwähnt ist. Zunächst wurde die Siliciumdioxidschicht unter Verwendung von HF als Ätzmittel bei Raumtemperatur mit Muster versehen. Das KOH-Verfahren erzeugt angewinkelte Seitenwände statt des rechtwinkligen Profils oder U-förmigen Profils, die durch die ersten beiden Rezepturen produziert werden. Kristallebenen in der <111> Orientierung werden zusammen mit den angewinkelten Seitenwänden infolge von Anisotropieeigenschaften des KOH-Ätzverfahrens als eine Funktion der Kristallorientierung erhalten. Infolge der selbstbeschränkenden Natur der Kanäle, die nach diesem Verfahren produziert werden, war die Rillentiefe auf 10 μm beschränkt. Nach Abschluß des Siliciumplatineätzens wurden alle Schichten von Photoresist und Siliciumdioxid entfernt, und die Platinen wurden in 1 Teil H₂SO₄ 1 Teil H₂O₂ bei 140°C gespült, gefolgt von einer Spülung in entionisiertem Wasser und Trocknen in Stickstoffgas.
Für diese Experimente wurde kein Versuch unternommen, die Oberflächenchemie der Silicium- und Pyrexplatinen zu verändern. Vor der Bearbeitung waren die Siliciumplatinen gleichmäßig hydrophob, während die Pyrexplatinen gleichmäßig hydrophil waren, wie durch Beobachtungen von Flüssigkeitsschichten und das Verfahren des ruhenden Tropfens bestimmt wurde. Nach dem Bearbeiten behielten die ungeätzten Oberflächen offenbar diese Eigenschaften, doch wurde die Oberflächenchemie in den Kanälen nicht bestimmt.
Tiere
Erwachsene männliche Lewis-Ratten (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) mit einem Gewicht von 150 – 200 g wurden als Zelldonoren verwendet. Tiere wurden in dem Animal Facility of Massachusetts General Hospital gemäß Richtlinien des NIH für die Behandlung von Laboratoriumstieren untergebracht. Man ließ die Ratte fressen und Wasser ad libitum trinken und hielt sie jeweils 12 Stunden bei Licht und bei Dunkelheit.
Zellisolierungen
Männliche Lewis-Ratten wurden als Leberzellendonoren verwendet. HCs wurden unter Verwendung einer Abwandlung der zweistufigen Kollagenaseperfusion, wie oben von Aiken et al., J Pediatr Surg 25, 140 (1990); Seglen PO Methods Cell Biol 13, 29 (1976) beschrieben, isoliert. Kurz gesagt wurden die Tiere mit Nembutal-Natriumlösung (Abbott Laboratories, North Chicago, IL), 50 mg/kg, anästhesiert, und der Hinterleib wurde in steriler Weise präpariert. Ein Hinterleib-Mittellinieneinschnitt wurde gemacht, und die untere Leber-Vena cava wurde mit einem 16-Gauge Angiokatheter (Becton Dickinson) kanüliert. Die Porta-Vene wurde eingeschnitten, um einen rückwärts gerichteten Ausfluß zu erlauben, und die Suprahepatica Inferior-Vena cava wurde abgebunden. Die Perfusion erfolgte mit einer Fließgeschwindigkeit von 29 ml/je Minute am Anfang mit calciumfreier Pufferlösung für 5 bis 6 Minuten, dann mit einem Puffer, der Kollagenase vom Typ 2 (Worthington Biomedical Corp., Freehold, NJ) enthielt, bei 37°C. Die Leber wurde herausseziert nach ausreichender Digestion der extrazellulären Matrix und mechanisch in William's E Medium (Sigma, St. Louis, MO) mit Zusätzen zur Erzeugung einer einzelnen Zellsuspension mechanisch gerührt. Die Suspension wurde durch ein 300 Mikron Maschensieb filtriert und in zwei Fraktionen durch Zentrifugieren bei 50 G während 2 Minuten bei 4°C aufgeteilt. Das Pellet, welches die lebenswichtige HC-Fraktion enthielt, wurde erneut in William's E Medium suspendiert und weiter mit einer Isodichte-Percoll-Zentrifugierung gereinigt. Das resultierende Pellet wurde dann erneut in Hepatocyte Growth Medium suspendiert, und Zellzählungen sowie Lebensfähigkeiten von HCs wurden unter Verwendung des Trypanblau-Ausschlußtests bestimmt.
Die Endothelzellen stammten aus Rattenlunge-Mikrogefäßen und wurden direkt von dem Händler Vascular Endothelial Cell Technologies (Rensellaer, NY) gekauft.
Hepatozytenkulturmedium
William's E Medium, ergänzt mit 1 g Natriumpyruvat (Sigma, St. Louis, MO) und 1 % Glutamin-Penicillin-Streptomycin (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) wurde während der Zellisolierung verwendet. Das Plattiermedium war Dulbeccos modifiziertes Eaglemedium (Gibco BRL), ergänzt mit 10% Rinderfötusserum, 1 % Penicillin-Streptomycin, 44 mM Natriumbicarbonat, 20 mM HEPES, 10 mM Niacinamid, 30 Mikrogramm/ml L-Prolin, 1 mM Ascorbinsäure-2-phosphat, 0,1 MikroM Dexamethason (Sigma), Insulin-Transferin-Natriumselenit (5 mg/l-5 mg/l-5-Mikrogramm/l, Roche Molecular Biomedicals, Indianapolis, IN) und 20 ng/ml Epidermis Wachstumsfaktor (Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA).
Endothelzellkulturmedium
Dulbeccos modifiziertes Eaglemedium (Gibco BRL) wurde mit 10% Rinderfötusserum, 1 % Penicillin-Streptomycin, 235 mg Ascorbinsäure (Sigma), 10 mg L-Alanin (Sigma), 25 mg L-Prolin (Sigma), 1,5 Mikrogramm Kupfersulfat (Sigma), Glycin (sigma) und 1 mg Hepes-Pufferlösung (Gibvo BRL) ergänzt. Das Medium wurde mit 8 mg Ascorbinsäure je Tag ergänzt.
Zellbindung und Abheben von nichtgeätzten Silicium- und Pyrexplatinen
Silicium und Pyrex wurden beide als mögliche Substrate für die Kultur und das Abheben von Endothelzellen und Hepatozyten getestet. Vor der Zellaussaat wurden die Pyrexplatinen mit 70%igem Ethanol (Fisher, Pittsburg, PA) über Nacht sterilisiert und dreimal mit steriler, Phosphat-gepufferter Salzlösung (Gibco BRL) gewaschen. Siliciumplatinen wurden zunächst in Aceton während 1 Stunde getränkt, wonach ein Spülen mit Methanol während 15 Minuten und eine Sterilisierung über Nacht in 100%igem Isopropylalkohol folgte. Rattenlunge-Mikrovaskulär-Endothelzellen wurden auf nichtbeschichteten Pyrex- und Siliciumoberflächen sowie auf Platinen, die mit Vitrogen (30 Mikrogramm/ml), Matrigel^® (1%) oder Gelatine (10 mg/ml) beschichtet waren. Nach der Isolierung wurden die Zellen erneut in Endothelzellkulturmedium suspendiert, gleichmäßig auf der Platine mit einer Dichte von 26,7 × 10³ Zellen/cm² ausgesät und bei 5% CO₂ und 37°C gezüchtet. Nach dem Erreichen des Zusammenfließens wurde die Fähigkeit der Monoschicht von Endothelzellen, von den Platinen abzuheben, unter Verwendung eines Zellabstreifers zur Förderung der Ablösung getestet.
Die Ratten-Hepatozyten wurden auch auf nichtbeschichtetem Pyrex und Silicium sowie auf Platinen, die mit einer dünnen und dicken Schicht von Vitrogen (30 Mikrogramm/ml und 3 Mikrogramm/ml) sowie Matrigel (1%), um die optimalen Methoden zum Abheben von Hepatozytbögen zu bestimmen, gezüchtet. Nach der Isolierung wurden die Hepatozyten erneut in Hepatozyt-Wachstumsmedium suspendiert, auf der Platine mit einer Dichte von 111,3 × 10³ Zellen/cm² ausgesät und bei 5% CO₂ und 37°C gezüchtet. Die Zellbindung und das Wachstum wurden täglich unter Verwendung von Mikroskopie und spontanem Zellabheben beobachtet.
Nach der Bestimmung, welche Methode für das Züchten am besten beim Abheben der Hepatozyten und Endothelzellen von einer intakten Schicht am günstigsten war, wurden beide Membranen in 10%igem gepuffertem Formalin während 1 Stunde fixiert und für histologische Untersuchungen herangezogen, und die Hepatozyten wurden immunohistochemisch gefärbt.
Immunohistochemische Färbung
Die Hepatozytenzell-Monoschichtmembran wurde in 10%igem gepuffertem Formalin fixiert und für Hämatoxylin-Eosin und immunohistochemische Anfärbung unter Verwendung einer Methode mit markiertem Streptavidin-Biotin (LSAB2-Kit für Rattenproben, DAKO, Carpin teria, CA). Der primäre Antikörper war Kaninchen anti-Albumin (ICN, Costa Mesa, CA). Schnitte von drei Mikron wurden hergestellt und von Paraffin befreit. Die Proben wurden mit Peroxidase-Blockierpuffer (DAKO) behandelt, um die nichtspezifische Färbung zu verhindern. Schnitte wurden mit Albumin, welches mit Phosphatpuffer-Salzlösung verdünnt war, angefärbt und anschließend mit Biotin-Kaninchen-Antikörper und HRP-konjugiertem Streptavidin umgesetzt. Schnitte wurden mit DAB als Substrat behandelt und mit Hämatoxylin als Kontrastfärbung behandelt.
Albuminproduktion
Um die Hepatozytenfunktion zu prüfen, wurde die Albuminkonzentration in dem Kulturmedium alle 24 Stunden während 5 Tagen pro Zellablösung unter Verwendung eines mit Enzyme verbundenen Immunosorbens-Assay (n=5) gemessen, wie von Schwere et al., Clinica Chemica Acta 163, 237 (1987) beschrieben ist. Kurz gesagt wurde eine Mikroplatte mit 96 Vertiefungen mit Anti-Rattenalbumin-Antikörper (ICN) beschichtet. Nach dem Blockieren nichtspezifischer Reaktionen mit einer 1 %igen Gelatinelösung wurde jede Probe auf der Platte ausgesät und 1 Stunde inkubiert. Danach folgte eine weitere Stunde Inkubation mit Anti-Rattenalbumin-Antikörper mit konjugierter Peroxidase ICN). Schließlich wurde das Substrat zugegeben und die Extinktion mit einem Mikroplattenlesegerät bei 410 nm gemessen. R² der Standardkurve war >0,99.
Sfatistische Analyse
Alle Daten wurden als Mittelwert ± SD ausgedrückt. Statistische Analyse erfolgte mit paarweise ausgeführtem t-Testmaterial. Statistische Signifikanz wurde bestimmt, wenn der p-Wert jeden Tests geringer als 0,05 war.
Zellbindung an geätztes Silicium und an Pyrexplatinen
Endothelzellen und Hepatozyten wurden auch auf geätzten Silicium- und Pyrexplatinen ausgesät. Vor der Zellaussaat wurden die Pyrexplatinen mit 70%igem Ethanol (Fisher) über Nacht sterilisiert und dreimal mit steriler Phosphat-gepufferter Salzlösung (Gibco BRL) gewaschen. Siliciumplatinen wurden zunächst mit Aceton während 1 Stunde imprägniert, worauf mit Methanol während 15 Minuten gespült und über Nacht in 100%igem Isopropylalkohol sterilisiert wurde. Auf diesen Platinen wurden Rattenlunge-Mikrovaskulär-Endothelzellen mit einer Dichte von 26,7 × 10³ Zellen/cm² oder Ratten-Hepatozyten mit einer Dichte von 111,3 × 103 Zellen/cm² ausgesät. Diese Zellen wurden bei 5% CO₂ und 37°C an ihrer Bindung und ihrem Wachstum täglich unter Verwendung von Mikroskopie beobachtet.
Implantation von Hepatozytbögen im Ratten-Omentum
Hepatozyten wurden auf Siliciumplatinen, die mit einer dünnen Vitrogenschicht (30 Mikrogramm/ml) beschichtet war, gezüchtet und in Bögen angehoben. Retrorsin ist ein Mittel, das bekanntermaßen die Regenerierung der normalen Leber durch Produktion eines Blockers in dem Hepatozytzellenkreislauf mit einer Ansammlung von Zellen in später S- und/oder G₂-Phase (Peterson JE J pathol Bacteriol 89, 153 (1965)) hemmt. Dieses Mittel wurde in den peritonealen Hohlraum von zwei Ratten bei einer Dosis von 3 mg/ml/100 g am Tag 0 und nach zwei Wochen verabreicht. Drei Wochen später wurde ein Porta cava-Shunt erzeugt, und die folgende Woche ein Hepatozytbogen, der nach vier Tagen Kultur auf Vitrogen-beschichtetem Silicium (30 Mikrogramm/ml) auf der Mikrovaskulatur des Ratten-Omentum implantiert und zu einem dreidimensionalen Zylinder aufgerollt wurde, und eine 60%ige Hepatektomie wurde durchgeführt. Das gerollte Omentum wurde mit Hepatozyten nach vier Wochen und nach drei Monaten nach der Implantation gesammelt und unter Verwendung von Histologie analysiert.
ERGEBNISSE
Mikroverarbeitung
Ein Schema des vaskulären Verzweigungsnetzes, das bestimmungsgemäß als eine Matrize für Mikroverarbeitung bestimmt war, ist in 9a gezeigt. Dieses Bild wurde unter Verwendung des in dem Abschnitt Materialien und Methoden beschriebenen Verfahrens auf Silicium- und Pyrexplatinen übertragen. Typische Rillentiefen von 20 Mikron auf Silicium und 10 Mikron auf Glas wurden unter Verwendung dieses Verfahrens erreicht. Eine optische Mikrophotographie eines Teils des Kapillarnetzes, das in eine Siliciumplatine geätzt war, ist in 9b gezeigt. In 9c ist ein Querschnitt einer gewinkelten Rille mit Rasterelektronenmikroskop, geätzt unter Verwendung des anisotropen Ätzverfahrens gezeigt, welches oben beschrieben wurde. Dieses Verfahren führte zu ausgezeichneter Haftung und verbesserter Abhebmöglichkeit von lebendem Gewebe.
Wachstum und Anheben von Zellen aus den Silicium- und Pyrexplatinen
Die Haftung und das Wachstum von Endothelzellen und Hepatozyten bei mehreren verschiedenen Substratoberflächen wurden verglichen. Auf allen Pyrexplatinen, beschichtet oder nichtbeschichtet, vermehrten sich die Endothelzellen und wuchsen bis zum Zusammenfließen innerhalb von 4 Tagen. Diese Zellen ließen sich nicht spontan abheben und ließen sich, wenn man sie abschabte, nicht als ein einzelner Bogen anheben. Außerdem, wenn die nichtbeschichteten Siliciumplatinen mit Endothelzellen eingesät wurden, brach der Zellbogen beim Anheben. Andererseits ließen sch Endothelzellen, die auf Siliciumoberflächen ausgesät wurden, wobei diese Oberflächen mit Vitrogen (30 Mikrogramm/ml), Matrigel (1%) und Gelatine (10 mg/ml) beschichtet waren, unter Verwendung mechanischer Mittel (d.h. eines Zellkratzers) abheben und ergaben einen intakten Monoschichtbogen von Endothelzellen. Bei Beobachtung wurden keine signifikanten Unterschiede in den Wirkungen der drei Beschichtungsmethoden auf den gelockerten Zellbögen festgestellt.
Hepatozyten, die auch gut auf allen beschichteten und nichtbeschichteten Pyrexplatinen hafteten und ausbreiteten, ließen sich nicht spontan oder in Bögen abheben, wenn nach mehreren Tagen Wachstum abgekratzt wurde. Wenn sie jedoch auf Siliciumplatinen ausgesät wurden, ließen sie sich spontan auf allen nichtbeschichteten und beschichteten Platinen abheben. Die von den nichtbeschichteten Platinen nach 3 Tagen angehobenen Hepatozytenbögen waren sehr brüchig und zerbrachen leicht. Die Monoschichten, die sich von den dünnen und dick beschichteten Vitrogensubstraten (30 Mikrogramm/ml und 3 Mirogramm/ml) ließen sich nach 4 Tagen Wachstum unter Bildung einer intakten Hepatozytschicht abheben. Von dem mit Matrigel (1%ig) beschichteten Siliciumplatinen ließen sich Zellen nach 5 Tagen Wachstum abheben. Es gab keine signifikanten Unterschiede im Aussehen zwischen den Zellbögen, die sich von den Vitrogen- und den Matrigel-beschichteten Platinen abheben ließen.
Histologische Prüfung der abgelösten Zellmonoschichten sowohl der Hepatozyten als auch der Endothelzellen ergaben vielversprechende Ergebnisse. Hämotoxylin- und Eosin (H&E)-Anfärbung beider zeigte, daß alle Zellen lebensfähig waren und daß die meisten Mitosen hatten. Die Endothelzellen wurden, wie beobachtet wurde, primär gedämpft und bildeten eine Einzelzellenausrichtung. Die Monoschicht von Hepatozyten zeigte, daß jede Zelle von kugeliger Konfiguration mit eosinophilem flockigem Zytoplasma und einem großen Kern mit einem leuchtend roten Nukleus ähnlich dem, welchen man in der natürlichen Leber findet. Außerdem waren die Zellebindungen weniger gedämpft als die Endothelzellen. So erinnern diese Ergebnisse an jede der speziellen Funktionen der Zelltypen. In biologische Systemen funktioniert das Endothel so, daß es eine dünne glatte Außenoberfläche einer Barriere und eines Transportkanals liefert, und so ist es verständlich, daß diese Zellen hier als primär gedämpfte Zellen und in einer Einzelzellenanordnung beobachtet werden. Die Hepatozyten haben mehr eine Tendenz, Gewebe zu bilden und weniger eine Einzelzellenanordnung und mehr eine abgerundete mehrschichtige Anordnung.
Albuminsekretion in dem Hepatozytkulturmedium am Tag 2, 3, 4 und 5 war 165,96 ± 29,87, 164,44 ± 17,22, 154,33 ± 18,46, 115,47 ± 18,09 (Mikrogramm/Tag, Graph 1). Obwohl es einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen Tag 4 und Tag 5 gab, wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen Tag 2, Tag 3 und Tag 4 beobachtet (p<0,05 durch den paarweise durchgeführten t-Test). Somit zeigen diese Daten, daß Zellen, die auf Siliciumplatinen gezüchtet wurden, in der Lage sind, recht konstante Albuminproduktionsraten bis Tag 4 zu liefern.
Außerdem wurden durch immunohistochemisches Anfärben der abgelösten Hepatozyt-Monoschichten viele Zellen positiv für Albumin angefärbt, was weiterhin anzeigt, daß Hepatozytfunktion auf Siliciumplatinen aufrecht erhalten wurde.
Implantation von Hepatozytbogen in das Ratten-Omenfum
H&E-Anfärbung von Hepatozytbögen, die in ein Ratten-Omentum eingepflanzt wurden, demonstrierten, daß alle Zellen lebensfähig waren und eine Vermehrung bei vier Wochen und drei Monaten zeigten. Die implantierten Hepatozyt-Monoschichtbögen waren, wenn gesammelt, nach 5 Zellschichten Dicke in den meisten Bereichen.
Diese Studie demonstriert, daß Silicium-Mikroverarbeitungstechnologie benutzt werden kann, um große Bögen von lebendem Gewebe zu bilden. Sie demonstriert auch die Durchführbarkeit des Ätzens, geordnet durch verzweigende Kanalanordnungen, die es erlauben, lebende Endothelzellen zu der Luminaloberfläche der Kanäle zu leiten. Außerdem wurde gezeigt, daß organisierte Bögen von aufgebautem Hepatozytgewebe und Endothelgewebe von der Oberfläche der Silicium- oder Pyrexplatinen abgehoben werden kann und zu einer kompakten dreidimensionalen Gestaltung gefaltet werden kann. Die Hepatozytbögen wurden dann in Ratten an der hochvaskulären Oberfläche des Omentum angeordnet. Die Struktur wurde dann in einen dreidimensionalen Zylinder als Modell für eine aufgebaute Vaskulatur angesehen. Vaskularisiertes Lebergewebe wurde als eine permanente Pfropfung gebildet.

Claims

System zur Erzeugung dünner Gewebeschichten (36) mit (a) einer Form (10, 30, 32) mit einer Trägerfläche (11), die i) ein zweidimensionales Bild von Kanälen (12, 14a–c, 16) darauf mit einer Auflösung von etwa 0,1 Mikron, geeignet für eine Befestigung und Züchtung eines oder mehrerer Zelltypen, so daß in den Kanälen durch wenigstens eine Zelltype Lumina gebildet werden, und ii) Bereiche zwischen den Kanälen, die für eine Befestigung und Züchtung einer oder mehrerer Zelltypen geeignet sind, die nicht die Lumina besitzen, hat, wobei die dünnen Gewebeschichten von der Form entfernbar sind.
System nach Anspruch 1, weiterhin mit (b) Verbindungen und Einrichtungen zur Zirkulation von Kulturflüssigkeit durch die Form, um die darauf befestigten Zellen zu züchten.
System nach Anspruch 1, bei dem die Form verzweigte Kanäle darin hat, die bei einem oder mehreren Einlässen (12) beginnen und sich in weitere Kanäle (14a–c) ausdehnen und zurück in einen oder mehrere Auslässe (16) konvergieren.
System nach Anspruch 1, das weiterhin Pumpeinrichtungen für die Zirkulation von Flüssigkeit durch die Form einschließt.
System nach Anspruch 1, bei dem die Form von einem Material gebildet wird, das aus der Gruppe Silicium, Glas, natürliche Zellsubstrate, wie Hydroxyapatit, und Polymere ausgewählt wird.
System nach Anspruch 1 weiterhin mit einer Beschichtung auf den Kanälen, die ein Anhaften und ein Anheben von Zellen als intakte Bögen aus der Form fördert.
System nach Anspruch 1, bei dem die Kanäle mit einem U-förmigen Profil ausgestattet sind.
Verfahren zur Herstellung der Form nach Anspruch 1, bei dem man (a) ein Material zur Bildung der Trägeroberfläche (11) aus der Gruppe Silicium, Metalle, Polymere und natürliche Zellsubstrate, wie Hydroxyapatit, auswählt, (b) die Oberfläche der Materialien mit Kanälen versieht, um Lumina zu erzeugen, die mit Zellen beimpft werden können und um so röhrenförmige Strukturen für Fluidfluß zu bilden, und (c) die Form so ausbildet, daß Zellen in der Form unter Bildung einer dünnen Gewebeschicht geimpft werden können, wobei einige Zellen an Dicke die röhrenförmigen Strukturen geben.
Verfahren nach Anspruch 8, bei dem die Anbringung von Kanälen nach einem Verfahren erfolgt, welches aus der Gruppe Mikromaschinenbau, Lithographie, Ätzen oder Formen besteht.
Verfahren zur Bildung komplexer Gewebe, bei dem man (a) eine Form mit einem komplexen Muster von Kanälen auswählt, die in wenigstens einer Oberfläche gebildet werden, in welcher Zellen eingeimpft werden können, (b) mit Zellen in den Kanälen impft, um Blutgefäße oder andere Lumina zu bilden, (c) Zellen unter Bedingungen züchtet, bis sie Gefäße oder Lumina bilden, (d) in die Struktur eine andere Zelltype oder andere Zelltypen einimpft, so daß ein Gewebe gebildet wird, das die Gefäße oder Lumina enthält, und (e) die Gewebeschicht (36) entfernt.
Verfahren nach Anspruch 10, bei dem man weiterhin (f) mehrere Schichten der Gewebeschichten miteinander vereinigt, bis die erwünschte komplexe Struktur gebildet ist.
Verfahren nach Anspruch 10, bei dem man weiterhin auf dem Kanal eine Beschichtung auf den Kanälen anbringt, die eine Haftung und ein Anheben von Zellen als intakte Bögen von der Form fördert.
Laminierte Struktur, im wesentlichen bestehend aus mehreren Schichten (36), worin jede Schicht im wesentlichen aus Gewebe und Gefäßen besteht und worin die Schichten miteinander durch Falten des Preßlings vereinigt werden, die resultierenden Gefäße in drei Dimensionen die Struktur durchdringen und die Struktur Verbindungen für einen Fluß in die Gefäße und aus den Gefäßen hat und wobei die Struktur direkt durch Verbindung mit Blutgefäßen implantiert werden kann, um in die Gefäße und aus den Gefäßen zu fließen.
Struktur nach Anspruch 13, bei der die Gefäße Endothelzellen umfassen.
Struktur nach Anspruch 13, zusätzlich mit Zellen, die aus der Gruppe Parenchymzellen, knorpel- oder knochenbildende Zellen, Muskelzellen und Nervenzellen ausgewählt sind.
Struktur nach Anspruch 15, worin die Parenchymzellen von Organen stammen, die aus der Gruppe Herz, Pankreas, Magen-Darm-Kanal, Gehirn, Niere, reproduzierbare Gewebe und Lunge ausgewählt sind.
Struktur nach Anspruch 13 mit Glomerula-Gewebe und einem Drainagesystem.
Struktur nach Anspruch 13 mit Alveolargewebe oder Gewebe der Luftwege.
Struktur nach Anspruch 13 mit Nerven- oder Lymphgefäßen.