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DE4222315A1 - DNA-Sequenzen für Aminosäuretransporter, Plasmide, Bakterien, Hefen und Pflanzen enthaltend einen Transporter - Google Patents

DNA-Sequenzen für Aminosäuretransporter, Plasmide, Bakterien, Hefen und Pflanzen enthaltend einen Transporter

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DE4222315A1
DE4222315A1 DE4222315A DE4222315A DE4222315A1 DE 4222315 A1 DE4222315 A1 DE 4222315A1 DE 4222315 A DE4222315 A DE 4222315A DE 4222315 A DE4222315 A DE 4222315A DE 4222315 A1 DE4222315 A1 DE 4222315A1
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Germany
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amino acid
dna sequences
transporter
plant
acid transporter
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Withdrawn
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DE4222315A
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English (en)
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Wolf-Bernd Dr Frommer
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Bayer CropScience AG
Original Assignee
Institut fuer Genbiologische Forschung Berlin GmbH
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Publication date
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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Sequenzen, die die Kodierregion eines Aminosäuretransporters enthalten, deren Einführung in ein pflanzliches Genom eine Veränderung der Weiterleitung von Metaboliten in transgenen Pflanzen hervorruft, sowie Plasmide, Bakterien, Hefen und Pflanzen enthaltend diese DNA-Sequenzen.
Für viele Pflanzenspezies liegen Hinweise vor, daß die Abgabe energiereicher Verbindungen an das Phloem durch die Zellwand der Zelle hindurch erfolgt. Transportermoleküle, die den Durchtritt von Aminosäuren durch die pflanzliche Zellwand ermöglichen, sind nicht bekannt.
Bei Bakterien sind zahlreiche Aminosäure-Transportsysteme charakterisiert. Für aromatische Aminosäuren sind fünf verschiedene Transporter beschrieben, von denen einer Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan transportiert, während die anderen spezifisch für einzelne Aminosäuren sind (s. Sarsero et al., 1991, J. Bacteriol 173: 3231-3234). Die Geschwindigkeits­ konstanten des Transportvorgangs deuten an, daß der spezifische Transport weniger effizient erfolgt. Für mehrere Transporter- Proteine wurden die entsprechenden Gene kloniert. Dies wurde mit Hilfe transportdefizienter Mutanten erreicht, die nach Transformation mit DNA-Fragmenten als Insertionen in Expressionsvektoren auf die Transportfähigkeit hin selektiert wurden (s. Wallace et al., 1990, J. Bacteriol 172: 3214-3220). Die Mutanten wurden anhand ihrer Fähigkeit ausgewählt, in Gegenwart toxischer Analoga von Aminosäuren zu wachsen, da sie diese nicht aufnehmen können und daher nicht beeinträchtigt werden. Entsprechende Komplementationsstudien wurden mit der eukaryontischen Hefe Saccharomyces cerevisiae durchgeführt. Tanaka & Fink (1985, Gene 38: 205-214) beschreiben einen Histidin- Transporter, der durch Komplementation einer Mutation identifiziert wurde. Vandenbol et al. (1989, Gene 83: 153-159) beschreiben einen Prolin-Transporter von Saccharomyces cerevisiae. Die Hefe besitzt zwei verschiedene Permeasen für Prolin. Eine transportiert mit niederer Effizienz, kann aber auch andere Aminosäuren verwenden, die andere ist prolinspezifisch und arbeitet mit hoher Affinität. Letztere wird vom put4 Gen kodiert. Dieses trägt ein offenes Leseraster für ein Peptid mit dem Molekulargewicht 69 kDa. Das Protein enthält 12 membrandurchdringende Regionen, aber keine N-terminale Signalsequenz für Sekretion. Dies ist eine typische Eigenschaft von integralen Membranproteinen. Die Permease besitzt Homologie zur Arginin- und zur Histidin-Permease von Hefe, jedoch nicht zur Prolin-Permease von Escherichia coli.
Für pflanzliche Zellen wurde bei Studien an Tabak- Suspensionskulturen gefunden, daß der Transport von Arginin, Asparagin, Phenylalanin und Histidin pH- und energieabhängig ist. Da ein 1000facher Überschuß an Leucin den Transport der anderen Aminosäuren inhibiert, kann davon ausgegangen werden, daß alle den gleichen Transporter verwenden (McDaniel et al., 1982, Plant Physiol 69: 246-249). Li und Bush (1991, Plant Physiol 96: 1338-1344) ermittelten für aliphatische, neutrale Aminosäuren zwei Transportsysteme in Plasmamembranvesikeln von Beta vulgaris. Einerseits können Alanin, Methionin, Glutamin und Leucin einander am Transporter-Protein verdrängen, andererseits haben Isoleucin, Valin und Threonin kompetetitive Effekte untereinander. Bei kombinierten Kompetitions- und kinetischen Studien (Li & Bush, 1990, Plant Physiol 94: (268-277) lassen sich vier verschiedene Transportsysteme unterscheiden. Neben einem Transporter für alle neutralen Aminosäuren, der mit niederer Affinität arbeitet, existiert ein hochaffiner Typ, der jedoch geringe Affinität zu Isoleucin, Threonin, Valin und Prolin besitzt. Ferner existieren Transporter für saure sowie solche für basische Aminosäuren.
Die Transporter-Moleküle oder Gene für pflanzliche Transporter- Proteine sind nicht bekannt.
Es werden nun DNA-Sequenzen beschrieben, die die Kodierregion eines pflanzlichen Aminosäuretransporters enthalten, und deren in der Nukleotidabfolge enthaltene Information bei Integration in ein pflanzliches Genom die Bildung von Ribonukleinsäuren erlaubt, mit deren Hilfe eine neue Aminosäuretransporter-Aktivität in Pflanzenzellen eingeführt werden oder eine endogene Aminosäuretransporter-Aktivität unterdrückt werden kann.
Unter einem Aminosäuretransporter ist z. B. eine cDNA-Sequenz, die einen Aminosäuretransporter aus Arabidopsis thaliana kodiert zu verstehen.
Die Identifikation der Kodierregion des Aminosäuretransporters wird über ein Verfahren durchgeführt, das die Isolation von pflanzlichen DNA-Sequenzen, die Transporter Moleküle kodieren, mittels Expression in spezifischen Mutanten der Hefe Saccharomyces cerevisiae erlaubt. Hierzu müssen geeignete Hefe-Mutanten verfügbar sein, die nicht in der Lage sind, eine Substanz aufzunehmen, für die aus einer pflanzlichen Genbank die Kodierregion eines Transporter-Moleküls isoliert werden soll.
Eine Mutante, die nicht in der Lage ist, in Medien mit Prolin als einziger Stickstoffquelle zu wachsen, wird von Jauniaux et al. (1987), Eur. J. Biochem. 164: 601-606) beschrieben.
Für die Herstellung von Hefestämmen, die der Identifikation pflanzlicher Aminosäuretransporter dienen, wird nun z. B. eine Hefemutante, die nicht in der Lage ist, in Medien mit Prolin als einziger Stickstoffquelle zu wachsen mit pFL 61-Plasmiden, die als Insertion cDNA Fragmente aus einer cDNA Bibliothek von Arabidopsis thaliana tragen, transformiert.
Es wurde nun überraschend gefunden, daß bei der Transformation der Hefezellen bestimmte pflanzliche cDNA Fragmente die Hefe-Mutation komplementieren können. Bei Analysen der Eigenschaften des von der cDNA kodierten Proteins kann ermittelt werden, daß für die Komplementation der Mutation eine Kodierregion verantwortlich ist, die einen pflanzlichen Aminosäuretransporter mit breitem Spezifitätsspektrum kodiert (s. Ausführungsbeispiel 3).
Eine derartige Kodierregion eines Aminosäuretransporters weist z. B. die folgende Nukleotidsequenz (Seq. ID No: 1) auf:
Die mit Hilfe der transformierten Hefestämme identifizierten erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen, wie z. B. die Sequenz Seq. ID No: 1, können in Plasmide eingebracht und dabei mit Steuerelementen für Expression in eukaryontischen Zellen kombiniert werden (s. Ausführungsbeispiel 4). Derartige Steuerelemente sind einerseits Transkriptions-Promotoren und andererseits Transkriptions- Terminatoren. Mit den Plasmiden können eukaryontische Zellen transformiert werden mit dem Ziel der Expression einer translatierbaren mRNA, die die Synthese eines Aminosäuretransporters in den Zellen ermöglicht, oder mit dem Ziel der Expression einer nicht-translatierbaren RNA, die die Synthese eines endogenen Aminosäuretransporters verhindert. Durch Expression einer RNA entsprechend der erfindungsgemäßen Sequenz eines pflanzlichen Aminosäuretransporters ist eine Veränderung sowohl des pflanzlichen Aminosäure- als auch des gesamten Stickstoffmetabolismus möglich, deren wirtschaftliche Bedeutung offensichtlich ist: Stickstoff ist der hauptsächlich das Wachstum begrenzende Nährstoff. Die Lebensfähigkeit von Keimlingen sowie die Keimungsfähigkeit von Samen ist direkt abhängig vom Stickstoffgehalt der Speichergewebe. Die Bildung von hochwertigen, stark proteinhaltigen Nahrungsmitteln ist von einer ausreichenden Stickstoffzufuhr abhängig. Stickstoff wird im wesentlichen in Form von Aminosäuren transportiert. Die Verbesserung der Weiterleitung von Aminosäuren an Ernteteile kann daher zu einer Ertragssteigerung von Nutzpflanzen führen. Die Möglichkeit der Unterdrückung von Aminosäureaufnahme in einzelne Organe erlaubt die qualitative Verbesserung von solchen Organen, die wegen der Anforderungen der Verwertungsprozesse wenig Stickstoff enthalten sollen, beispielsweise von Kartoffeln, die zur Produktion von Stärke angebaut werden. Darüberhinaus können Veränderung der Gestalt einer Pflanze vorgenommen werden, indem das Wachstum einzelner Gewebe verlangsamt wird - beispielsweise von Blüten, während das Wachstum von Ernteteilen begünstigt wird. Hierbei ist an eine Verlängerung der Vegetationsphase von Kulturpflanzen zu denken, die zu einer vermehrten Bildung von Speicherstoffen führt. Es sind bereits Verfahren zur genetischen Modifikation dikotyler und monokotyler Pflanzen bekannt (vgl. u. a. Gasser, C.S., Fraley, R.T., 1989, Sience 244: 1293-1299; Potrykus, 1991, Ann Rev Plant Mol Biol Plant Physiol 42: 205-225). Zur Expression der kodierenden Sequenzen in Pflanzen müssen diese mit transkriptionell regulatorischen Elementen verknüpft werden. Solche Elemente, Promotoren genannt, sind vielfältig beschrieben (s. z. B. EP 375 091). Ferner müssen die Kodierregionen mit einem Transkriptionsterminationssignal versehen werden, damit sie korrekt transkribiert werden können. Derartige Elemente sind ebenfalls beschrieben (vgl. Gielen et al., 1989, EMBO J 8: 23-29). Der transkriptionelle Startbereich kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdartig bzw. heterolog zur Wirtspflanze sein. Terminationsbereiche sind gegeneinander beliebig austauschbar. Die DNA-Sequenz der Transkriptionsstart- und -terminationsregionen kann synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen enthalten. Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen sind eine große Anzahl Klonierungsvektoren verfügbar, die ein Replikationssignal für E. coli und einen Marker beinhalten, der eine Selektion der transformierten Zellen erlaubt. Beispiele für Vektoren sind pBR 322, pUC-Serien, M13 mp-Serien, pACYC 184 usw. Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanze können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und die linke Begrenzung der Ti- und Ri-Plasmid T-DNA, als Flankenbereich den einzuführenden Genen angefügt werden. Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in EP 120 516; Hoekema, In: The Binary Plant Vektor System, Offset-drukkerÿ Kanters B.V. Alblasserdam, (1985), Chapter V; Fraley, et al., Crit. Rev. Plant Sci., 4: 1-46 und An et al. (1985) EMBO J. 4: 277-287 beschrieben worden. Ist die eingeführte DNA einmal im Genom integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinotricin u. a. vermittelt. Der individuell verwendete Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingefügte DNA fehlt, gestatten.
Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen neben der Transformation mit Hilfe von Agrobakterien viele andere Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Fusion von Protoplasten, die Mikroinjektion von DNA, die Elektroporation sowie ballistische Methoden und Virusinfektion. Aus dem transformierten Pflanzenmaterial können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA getestet werden. Bei der Injektion und Elektroporation sind an sich keine speziellen Anforderungen an die Plasmide gestellt. Es können einfache Plasmide wie z. B. pUC-Derivate verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens notwendig. Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanzen in der üblichen Weise (siehe auch McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84). Diese Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen haben die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften.
Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen können in Plasmide eingebracht und dabei mit Steuerelementen für eine Expression in prokaryontischen Zellen kombiniert werden. Die Bildung einer von Bakterien translatierbaren RNA Sequenz eines eukaryontischen Aminosäuretransporters führt trotz der erheblichen Unterschiede in den Membranstrukturen von Pro- und Eukaryonten überraschend dazu, daß Prokaryonten nun einen eukaryontischen Aminosäuretransporter mit dessen Spezifität für bestimmte Substrate verwenden. Dies ermöglicht die Produktion von Bakterienstämmen, die für Studien der Eigenschaften des Transporters sowie seiner Substrate genutzt werden können. Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen können in Plasmide eingebracht werden, die eine Mutagenese oder eine Sequenzveränderung durch Rekombination von DNA-Sequenzen in prokaryontischen oder eukaryontischen Systemen erlauben. Dadurch kann die Spezifität des Transporters verändert werden. Durch Veränderung der Spezifität des Aminosäure-Transport-Systems ist der Transport neuer Verbindungen in eukaryontische oder aber in prokaryontische Zellen möglich, die weitere interessante Möglichkeiten erschließt. Beispielsweise kann im Falle von pflanzlichen Zellen ebenso an den Transport von Pestiziden wie auch von Substraten für Stoffwechselreaktionen der Pflanze gedacht werden. Mit Hilfe von Standardverfahren (vgl. Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: A laboratory manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA) können Basenaustausche vorgenommen oder natürliche oder synthetische Sequenzen hinzugefügt werden. Für die Verbindung der DNA-Fragmente untereinander können an die Fragmente Adaptoren oder linker angesetzt werden. Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnittstellen bereitstellen oder die überflüssige DNA oder Restriktionsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen wie z. B. Transitionen und Transversionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese, "primerrepair", Restriktion oder Ligation verwendet werden. Als Analysemethode werden im allgemeinen eine Sequenzanalyse, eine Restriktionsanalyse und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden durchgeführt. Nach jeder Manipulation kann die verwendete DNA-Sequenz gespalten und mit einer anderen DNA-Sequenz verbunden werden. Jede Plasmid-Sequenz kann in den gleichen oder anderen Plasmiden kloniert werden.
Ferner können die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen dazu genutzt werden, nach Standard-Verfahren aus dem Genom von Pflanzen verschiedener Spezies ähnliche Sequenzen zu isolieren, die ebenfalls Aminosäure- und andere Transportermoleküle kodieren. Mit diesen Sequenzen können Konstruktionen zur Transformation von Pflanzenzellen hergestellt werden, die Transportvorgänge in den transgenen Pflanzen verändern.
Um verwandte DNA-Sequenzen zu bestimmen, muß man zunächst Genbanken anlegen, die für den Gehalt von Genen einer Pflanzenart oder für die Expression von Genen in einer Pflanzenart repräsentativ sind. Erstere sind genomische, letztere sind cDNA- Banken. Aus diesen können mit Hilfe der erfindungsgemäßen DNA- Sequenzen als Sonde verwandte Sequenzen isoliert werden. Hat man die dazugehörigen Gene identifiziert und isoliert, ist eine Bestimmung der Sequenz und eine Analyse der Eigenschaften der von dieser Sequenz kodierten Proteine erforderlich.
Die phänotypischen Auswirkungen der Transformation von Pflanzenzellen mit Sequenzen, die einen Aminosäuretransporter kodieren, oder Sequenzen, die die Expression eines endogenen Transporters unterbinden, sind in den Ausführungsbeispielen beschrieben.
Zum besseren Verständnis der dieser Erfindung zugrundeliegenden Ausführungsbeispiele werden die wichtigsten eingesetzten Verfahren im folgenden erläutert.
1. Klonierungsverfahren
Zur Klonierung in E. coli wurden der Vektor pBluescriptSK (Short et al., 1988, Nucl Acids Res 16: 7583-7600) verwendet.
Für die Transformation von Hefen wurde der Vektor pFL61 verwendet (Minet & Lacroute, 1990, Curr Genet 18: 287-291).
Für die Pflanzentransformation wurden die Genkonstruktionen in den binären Vektor pBIN-Hyg kloniert.
2. Bakterien- und Hefestämme
Für den pBluescriptSK Vektor sowie für pBinAR-Konstrukte wurde der E. coli-Stamm XL1blue (Bullock et al., 1987, Biotechniques, 5, 376-378) verwendet.
Als Ausgangsstamm für die Expression der cDNA-Bibliothek in Hefe wurde der Hefestamm 22574d (Jauniaux et al., 1987, Eur. J. Biochem. 164: 601-606) verwendet.
Die Transformation der Plasmide in die Kartoffelpflanze wurde mit Hilfe des Agrobacterium tumefaciens-Stammes LBA4404 (Bevan (1984) Nucl. Acids Res 12: 8711-8720) durchgeführt.
3. Transformation von Agrobakterium tumefaciens
Der Transfer der DNA in die Agrobakterien erfolgt durch direkte Transformation nach der Methode von Höfgen & Willmitzer (1988, Nucleic Acids Res 16: 9877). Die Plasmid-DNA transformierter Agrobakterien wurde nach der Methode von Birnboim & Doly (1979, Nucl Acids Res 7: 1513-1523) isoliert und nach geeigneter Restriktionsspaltung gelelektrophoretisch analysiert.
4. Pflanzentransformation
Zehn kleine, mit einem Skalpell verwundete Blätter einer Kartoffel-Sterilkultur wurden in 10 ml MS-Medium mit 2% Saccharose gelegt, welches 30-50 µl einer unter Selektion gewachsenen Agrobacterium tumefaciens-Übernachtkultur enthielt. Nach 3-5 minütigem, leichtem Schütteln wurden die Blätter auf MS-Medium mit 1,6% Glukose, 2 mg/l Zeatinribose, 0,02 mg/l Naphthylessigsäure, 0,02 mg/l Giberellinsäure, 500 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin und 0,8% Bacto Agar ausgelegt. Nach einwöchiger Inkubation bei 25°C und 3000 Lux wurde die Claforankonzentration im Medium um die Hälfte reduziert.
Hinterlegungen
Am 12. 06. 1992 wurden bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, folgende Plasmide hinterlegt (Hinterlegungsnummer):
Beschreibung der Abbildungen
Fig. 1 zeigt das Plasmid pPPP1-20
Die fein gezogene Linie entspricht der Sequenz von pBluescript SK. Die starke Linie repräsentiert die cDNA Insertion. Schnittstellen der Insertion sind angegeben.
Fig. 2 zeigt die Aufnahme von 14C-Prolin aus dem Medium
no = Zeitverlauf der Aufnahme ohne Kompetitor
proline = Zeitverlauf bei vierfachem Überschuß an unmarkiertem Prolin
citrullin = Zeitverlauf bei vierfachem Überschuß an Citrullin
GABA = Zeitverlauf bei vierfachem Überschuß an Gamma-Amino- Buttersäure
time = Zeit in Sekunden
cpm = gezählte Zerfälle pro Minute.
Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele beschreiben die Klonierung und Identifikation sowie die Funktion und Verwendung eines pflanzlichen Aminosäuretransporters.
Ausführungsbeispiel 1 Klonierung der cDNA eines pflanzlichen Aminosäuretransporters
Zur Komplementation der Prolin-Transportmutation des Hefestamms 22574d (Jauniaux et al., 1987, Eur. J. Biochem 164: 601-606) wurde eine cDNA von jungen Keimlingen von Arabidopsis thaliana (Zwei- Blatt-Stadium) im Hefe-Expressionsvektor pFL61 (Minet & Lacroute, 1990, Curr Genet 18: 287-291) verwendet, die von M. Minet zur Verfügung gestellt wurde (Minet et al., 1992, Plant J 2: 417-422). Etwa 1 µg des Vektors mit der cDNA-Insertion wurden in den Hefestamm 22574d tranformiert nach der Methode von Dohmen et al. (1991, Yeast 7: 691-692). Hefetransformanden, die in Medien mit 4 mM Prolin als einziger Stickstoffquelle wachsen konnten, wurden propagiert. Aus den Linien wurde Plasmid-DNA nach Standardverfahren präpariert. Klone, die die Mutation komplementieren konnten, enthielten Plasmide mit ähnlichem Restriktionsmuster der cDNA-Insertion. Diese variierte in der Größe zwischen 1.6 und 1.7 kb.
Ausführungsbeispiel 2 Sequenzanalyse der cDNA-Insertion des Plasmids pFL61-ppp1-20
Aus einer entsprechend Ausführungsbeispiel 1 erhaltenen Hefe-Linie PPP1-20, die trotz der 22574d-Mutation mit Prolin als einziger Stickstoffquelle wachsen kann, wurde das Plasmid pFL61-ppp1-20 isoliert und seine cDNA-Insertion als NotI Fragment präpariert und in den Vektor pBluescriptSK umkloniert. Dabei wurde das Plasmid pPPP1-20 erhalten (s. Fig. 1). Mit Hilfe synthetischer Oligonukleotide wurde die Insertion nach der Methode von Sanger et al. (1977, Proc Natl Acad Sci USA 74: 5463-5467) sequenziert. Die Sequenz ist oben wiedergegeben.
Ausführungsbeispiel 3 Aufnahmestudien mit 14C-markiertem Prolin an der Hefe-Linie PPP1-20
Die Hefe-Linie PPP1-20, die entsprechend Ausführungsbeispiel 1 erhalten wurde, wurde in Flüssigmedium angezogen, bis die Kultur die logarithmische Phase erreicht hatte. Nach Zentrifugation der Kultur wurden die Zellen in Medium mit 14C-markiertem Prolin aufgenommen. Die Aufnahme der markierten Aminosäure wurde nach dem von Cirillo (1989, Meth Enzymol 174: 617-622) beschriebenen Verfahren gemessen. Die Aufnahme der markierten Aminosäure wurde derjenigen bei Koinkubation mit der proteinmodifizierenden Substanz Diethylpyrrocarbonat, die ein Inhibitor des Aminosäuretransports bei Membranvesikeln von Beta vulgaris ist, verglichen, sowie derjenigen bei Koinkubation mit weiteren proteinmodifizierenden Substanzen. Die berechnete Reduktion ist in Tabelle I aufgeführt. Ein Kompetitionsexperiment mit verschiedenen Aminosäuren und Analoga, an dem die Spezifität des Transporters abgelesen werden kann, ist in der Tabelle II aufgeführt. Der Zeitverlauf ist in Fig. 2 dargestellt.
Ausführungsbeispiel 4 Transformation von Pflanzen mit einer Konstruktion zur Überexpression der Kodierregion des Aminosäuretransporters
Aus dem Plasmid pPPP1-20, das als Insertion die cDNA für den Aminosäuretransporter aus Arabidopsis enthält, wurde ein internes Fragment der Insertion nach BamHI-Schnitt isoliert und in die BamHI Schnittstelle von pAJ kloniert, der zuvor mit dem Enzym BamHI linearisiert worden war. Anschließend wurde die cDNA als EcoRI/HindIII Fragment aus pA7 präpariert und in den Vektor pBIN-HYG kloniert. Nach Transformation von Agrobakterien wurden diese zur Infektion von Blattsegmenten von Tabak und Kartoffel eingesetzt.
Zehn unabhängig erhaltene Transformanden, in denen die Präsenz des intakten, nicht rearrangierten chimären Gens mit Hilfe von Southern blot Analysen nachgewiesen worden war, wurden bezüglich der Veränderungen von Aminosäure- und Stickstoffgehalt untersucht. Desweiteren wurden Aminosäurezusammensetzung, Photosyntheserate und Transpiration untersucht.
Inhibition des Aminosäuretransports durch proteinmodifizierende Substanzen
% vom Transport ohne Inhibitor
1 mM DEPC (Di-Ethyl-Pyro-Carbonat
65
10 µM CCP (Carbonyl-cyanid-m-chlorphenylhydrazon 63
10 µM 2,4 DNP (Di-Nitro-Phenol) 16
1 mM Natrium-Arsenat 35
10 µM Antimycin A 29
500 µM PCMBS (Parachlormercuribenzolsulfonsäure) 78
Tabelle II
Kompetition durch einfachen, vierfachen und zehnfachen Überschuß an Aminosäuren und Analoga

Claims (17)

1. DNA-Sequenzen, die die Kodierregion eines Aminosäuretransporters enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß die in der Nukleotidabfolge enthaltende Information bei Integration in ein pflanzliches Genom die Bildung von Ribonukleinsäure erlaubt und über diese Ribonukleinsäure eine neue Aminosäuretransporter- Aktivität in Pflanzenzellen eingeführt werden kann oder eine endogene Aminosäuretransporter-Aktitivät unterdrückt werden kann.
2. Eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie folgende Nukleotidabfolge (Seq-ID No 1) enthält:
3. Ein Plasmid, dadurch gekennzeichnet, daß es DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 1-2 enthält.
4. Plasmid pPPP1-20 (DSM 7129).
5. Plasmid pBin PPP1-20 (DSM 7130).
6. Verwendung der Plasmide gemäß den Ansprüchen 3 bis 5 oder Derivate oder Teile davon zur Transformation pro- und eukaryontischer Zellen.
7. Pflanzen, enthaltend DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 1 und 2.
8. Bakterien, enthaltend DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 1 und 2.
9. Verwendung der DNA-Sequenzen des Aminosäuretransporters gemäß den Ansprüchen 1 und 2 zur Herstellung von Plasmiden mit veränderter Spezifität des Transporters.
10. Verwendung der DNA-Sequenzen des Aminosäuretransporters gemäß den Ansprüchen 1 und 2 zur Isolierung ähnlicher Sequenzen aus dem Genom der Pflanze.
11. Verwendung der DNA-Sequenzen des Aminosäuretransporters gemäß den Ansprüchen 1 und 2 zur Expression einer translatierbaren mRNA, die die Synthese eines Aminosäuretransporters in pro- und eukaryontischen Zellen ermöglicht.
12. Verwendung der DNA-Sequenzen des Oligosaccharid-Transporters gemäß den Ansprüchen 1 und 2 zur Expression einer nicht translatierbaren RNA, die die Synthese eines endogenen Aminosäuretransporters in pro- und eukaryontischen Zellen verhindert.
13. Verwendung der DNA-Sequenzen des Aminosäuretransporters gemäß den Ansprüchen 1 und 2 in Kombination mit Steuerelementen für eine Expression in pro- und eukaryontischen Zellen.
14. Hefestämme enthaltend DNA-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 1 und 2.
15. Verwendung von Hefestämmen gemäß Anspruch 14 zur Identifikation pflanzlicher Aminosäuretransporter.
16. Verwendung der DNA-Sequenzen des Aminosäuretransporters gemäß den Ansprüchen 1 und 2 zur Herstellung von Pflanzen mit verändertem Aminosäure- und Stickstoffmetabolismus.
17. Verwendung der DNA-Sequenzen des Aminosäuretransporters gemäß den Ansprüchen 1 und 2 zur Herstellung von Nutzpflanzen mit größerem Ertrag.
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