DE4124758A1 - Antitumorwirksame substanz aus humanen makrophagen - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine von Tumornekrosisfak­ tor α (TNF α) verschiedene, antitumorwirksame Substanz, die aus der hochmolekularen Fraktion von Kulturüberständen dif­ ferenzierter humaner Makrophagen erhältlich ist, die unter serumfreien Bedingungen kultiviert und durch Kombination von γ-Interferon und bakteriellem Lipopolysaccharid stimuliert wurden.

Makrophagen bilden neben cytotoxischen T-Lymphozyten und natürlichen Killerzellen aufgrund ihrer Fähigkeit zur selek­ tiven Zerstörung maligner Zellen einen wichtigen Bestandteil der Immunabwehr gegen Neoplasien (siehe z. B. Fidler und Schroit (1988), Biochim.Biophys.Acta 948, 151-173). Die Zer­ störung von neoplastischen Zellen durch Makrophagen kann auf mindestens zwei unterschiedlichen Wegen erfolgen, die als antikörperabhängige zelluläre Cytotoxizität (ADCC) und Makro­ phagen-Tumor-Cytotoxizität (MTC) bezeichnet werden (siehe z. B. Adams und Nathan (1983), Immunol. Today 4, 166-170). Die MTC kann in vitro durch kombinierte oder sequenzielle Behand­ lung mit einer Signalsubstanz wie etwa γ-Interferon (siehe z. B. Adams und Hamilton in: Mononuclear Phagocytes, van Furth (Ed), Boston, Nejhoff (1985), 493-500) und einer Auslösersub­ stanz wie etwa bakteriellen Lipopolysacchariden (LPS) oder einer Reihe anderer natürlicher oder synthetischer Verbindun­ gen (siehe z. B. Drysdale et al. (1988), Prog.Allergy 40, 111- 161) aktiviert werden. Da die MTC auch durch konditionierte Kulturüberstände von aktivierten Makrophagen hervorgerufen werden kann (Currie und Basham (1975), J.Exp.Med. 142, 1600- 1605; Adams et al. (1982), Fed.Proc. 41, 2212-2221), scheinen daran mindestens teilweise antitumorwirksame Faktoren betei­ ligt zu sein, welche von den aktivierten Makrophagen sekre­ tiert werden.

Der bekannteste dieser Faktoren ist der Tumornekrosefaktor α, der von mit LPS stimulierten Makrophagen sekretiert wird (Männel et al. (1980), Infect.Immun. 30, 523-530). Sowohl muriner als auch humaner TNF α sind bereits kloniert worden (Pennica et al. (1985), Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82, 6060- 6064; Shirai et al. (1985), Nature 313, 803-806). Es wurde jedoch festgestellt, daß die cytolytischen Effekte von TNF α nur auf eine geringe Anzahl von Tumorzellinien, wie etwa das murine Fibroblastom L929 beschränkt waren, während die mei­ sten anderen Tumorzellen nicht angegriffen wurden. Ein erheb­ licher Nachteil von TNF α besteht somit darin, daß seine Wirksamkeit und auch seine therapeutischen Einsatzmöglichkei­ ten auf eine recht geringe Anzahl von Zielzellen beschränkt ist.

Ein anderer aus Makrophagen stammender antitumorwirksamer Faktor ist Interleukin 1 (IL-1). Die Wirksamkeit von IL-1 ist jedoch in erster Linie cytostatisch und ebenfalls nur auf einige wenige Tumorzellinien beschränkt (Onozaki et al. (1985), J.Immunol. 135, 3962-3968; Lovett et al. (1986), J.Immunol. 136, 340-347). Somit scheint IL-1 als Effektormo­ lekül bei der MTC nur von geringerer Bedeutung zu sein.

Bei anderen antitumorwirksamen Substanzen, die möglicherweise bei der MTC beteiligt sein können, handelt es sich um Protea­ sen, wie etwa die cytolytische Protease (Adams et al. (1980), J.Immunol. 124, 293-300) oder α-MCT (Reidarson et al. (1982), J.Natl.Cancer.Inst. 69, 889-894), die durch verschiedene Proteasehemmstoffe inaktiviert werden können.

Ferner wurde eine antitumorwirksame Aktivität mit hohem Mole­ kulargewicht aus murinen Makrophagen isoliert (Schwamberger et al. (1991), Pathobiology 59, 248-253). Diese Aktivität wird durch Behandlung mit Trypsin, Neuraminidase und 56°C inaktiviert, konnte aber nicht signifikant durch neutralisie­ rende Antikörper gegen rekombinanten TNF α und Serinprotease- Inhibitoren gehemmt werden.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Bereitstellung einer neuen antitumorwirksamen Substanz, bei der die Nachtei­ le von bereits bekannten Substanzen, insbesondere hinsicht­ lich der Beschränkung der Wirksamkeit auf eine geringe Anzahl von Zielzellen zumindestens teilweise beseitigt sind.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit eine antitumorwirksame Substanz, erhältlich aus der hochmolekula­ ren Fraktion von Kulturüberständen differenzierter humaner Makrophagen, die unter serumfreien Bedingungen kultiviert und durch eine Kombination von γ-Interferon (IFN-γ) und bakeriel­ lem Lipopolysaccharid (LPS) stimuliert wurden, welche dadurch gekennzeichnet ist, daß sie

• a) ein Molekulargewicht von 100 bis 200 kDa nach Gelchro­ matographie aufweist,
• b) mit humanem Tumornekrosefaktor α eine synergistische Wirkung zeigt,
• c) gegen eine Reihe von Tumorzellinien wirksam ist, die für Tumornekrosefaktor α insensitiv sind, und
• d) durch Hitzebehandlung bei 56°C oder Inkubation mit Tryp­ sin, aber nicht durch Serinproteaseinhibitoren inakti­ vierbar ist.

Die erfindungsgemäße antitumorwirksame Substanz wurde aus der hochmolekularen Fraktion von Kulturüberständen gewonnen, die durch terminal differenzierte, mit einer Kombination von IFN- γ und LPS stimulierten Makrophagen konditioniert waren. Dage­ gen fehlten in Kulturüberständen von frisch isolierten Mono­ zyten aus Blut, die unter identischen Bedingungen kultiviert wurden, eine signifikante cytolytische Aktivität, die auf die erfindungsgemäße Substanz zurückzuführen war. Die antitumor­ wirksame Substanz besitzt ein Molekulargewicht im Bereich von 100 bis 200 kDa, das mittels gelchromatographischer Methoden bestimmt wurde. Die Expression der erfindungsgemäßen cytoly­ tischen Substanz war sehr unterschiedlich bei Makrophagen, die von unterschiedlichen gesunden Spendern stammte. Eine signifikante cytolytische Aktivität in Kulturüberständen von Makrophagen war bei 6 von 15 Spendern auffindbar, wobei aber Wiederholungen der Experimente mit einzelnen Spendern gut reproduzierbare Ergebnisse zeigten. Es wurde keine Korrela­ tion zwischen der Menge an sekretiertem TNF α und der durch die erfindungsgemäße Substanz hervorgerufenen cytolytischen Aktivität beobachtet.

Eine weitere Charakterisierung der erfindungsgemäßen Substanz zeigte, daß sie tumorspezifisch ist, wobei sie bei 4 von 7 getesteten für TNF α nicht sensitiven humanen Tumorzellinien wirksam war, während sie keine cytolytische Aktivität gegen­ über frisch isolierten, peripheren Blutlymphozyten oder pri­ mären Hautfibroblasten zeigte. Die Antitumoraktivität war bei 37°C labil und wurde bei 56°C oder Behandlung mit Trypsin sehr stark inhibiert. Die Antitumoraktivität konnte hingegen nicht durch Serin-Proteaseinhibitoren gehemmt wer­ den.

Überraschenderweise zeigte ein neutralisierender monoklonaler Antikörper gegen rekombinanten humanen TNF α (Antikörper Klon 195/8, beschrieben in der DE-A 36 31 229 und kommerziell von Boehringer Mannheim erhältlich) eine partielle Inhibierung der durch die erfindungsgemäße Substanz verursachten Antitu­ moraktivität, während gleichzeitig die gesamte nachweisbare TNF α-Aktivität in den getesteten Überständen neutralisiert wurde. Selbst ein tausendfacher Überschuß des Anti-TNF α- Antikörpers konnte jedoch keine weitere Verringerung der cytolytischen Aktivität hervorrufen. Hingegen konnte die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Substanz durch Zugabe ge­ ringer Mengen an rekombinantem humanem TNF α in solchen Kon­ zentrationen verbessert werden, die selbst keinen cytoto­ xischen Effekt auf die verwendeten Tumorzielzellen zeigten. Daraus geht hervor, daß die erfindungsgemäße Substanz syner­ gistisch mit TNF α wirkt.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Isolierung einer antitumorwirksamen Substanz aus humanen Makrophagen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man

• a) terminal differenzierte, humane Makrophagen unter se­ rumfreien Bedingungen kultiviert,
• b) mit einer Kombination von γ-Interferon und bakteriellen Lipopolysacchariden stimuliert,
• c) die hochmolekulare Fraktion des Kulturüberstands gewinnt und
• d) die erfindungsgemäße antitumorwirksame Substanz mittels chromatographischer Methoden anreichert.

Ferner betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammen­ setzung, die als Wirkstoff eine erfindungsgemäße antitumor­ wirksame Substanz, gegebenenfalls in Kombination mit pharma­ zeutisch verträglichen Füll-, Verdünnungs-, Hilfs- und Trä­ germitteln enthält. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann dabei sowohl in Form eines Lyophilisats oder einer pharmazeu­ tisch applizierbaren Lösung vorliegen.

Neben der erfindungsgemäßen antitumorwirksamen Substanz kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung noch zusätzlich eine oder mehrere weitere antitumorwirksame Substanzen enthalten, insbesondere solche Substanzen, die aus Makrophagen isoliert werden können, z. B. TNF α oder Interleukin 1. Besonders be­ vorzugt ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche die erfindungsgemäße antitumorwirksame Substanz in Kombination mit TNF α enthält.

Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Anti­ tumormittel, welches eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung enthält.

Der Begriff "antitumorwirksame Substanz oder Aktivität" im Sinne der vorliegenden Erfindung kann sowohl eine Einzelsub­ stanz, z. B. ein Protein als auch ein aus mehreren Einzelsub­ stanzen, z. B. Proteinuntereinheiten bestehendes Substanzge­ misch umfassen.

Hinsichtlich der Kultivierung der Makrophagen und der Durch­ führung der einzelnen Experimente zur Charakterisierung der erfindungsgemäßen Substanz soll auf die Arbeit Schwamberger et al. (Pathobiology 59 (1991), 248-253), welche die Isolie­ rung einer murinen cytolytischen Aktivität beschreibt, und die dort zitierten Literaturstellen verwiesen werden.

Claims (6)

1. Antitumorwirksame Substanz, erhältlich aus der hochmole­ kularen Fraktion von Kulturüberständen differenzierter humaner Makrophagen, die unter serumfreien Bedingungen kultiviert und durch eine Kombination von γ-Interferon und bakteriellem Lipopolysaccharid stimuliert wurden, dadurch gekennzeichnet daß sie

• a) ein Molekulargewicht von 100 bis 200 kDa nach Gel­ chromatographie aufweist,
• b) mit humanem Tumornekrosefaktor α eine synergisti­ sche Wirkung zeigt,
• c) gegen eine Reihe von Tumorzellinien wirksam ist, die für Tumornekrosisfaktor α insensitiv sind und
• d) durch Hitzebehandlung bei 56°C oder Inkubation mit Trypsin, aber nicht durch Serinprotease-Inhibitoren inaktivierbar ist.

2. Verfahren zur Isolierung einer antitumorwirksamen Sub­ stanz aus humanen Makrophagen, dadurch gekennzeichnet daß man

• a) terminal differenzierte, humane Makrophagen unter serumfreien Bedingungen kultiviert,
• b) mit einer Kombination von γ-Interferon und bakte­ riellen Lipopolysacchariden stimuliert,
• c) die hochmolekulare Fraktion des Kulturüberstands gewinnt und
• d) die antitumorwirksame Substanz nach Anspruch 1 mittels chromatographischer Methoden anreichert.

3. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet daß sie als Wirkstoff eine antitumorwirksame Substanz nach Anspruch 1, gegebenenfalls in Kombination mit phar­ mazeutisch verträglichen Füll-, Verdünnungs-, Hilfs- und Trägermitteln enthält.

4. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet daß sie zusätzlich ein oder mehrere weitere antitumor­ wirksame Substanzen enthält.

5. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet daß sie zusätzlich Tumornekrosefaktor α als weitere antitumorwirksame Substanz enthält.

6. Antitumormittel, dadurch gekennzeichnet daß es eine pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 3 bis 5 enthält.