DE3923279A1 - Minusheets ist ein neues produkt, um zellen in beliebigen behaeltnissen in hochdifferenzierter form auf einer moeglichst natuerlichen unterlage zu kultivieren - Google Patents

Description

Einleitung:

Es ist heutzutage allgemeines Wissensgut, daß die Zusammensetzung der extrazellulären Biomatrix bei der Zellkultivation in biologischen und biotechnologischen Experimenten von sehr großer Bedeutung für das Anhaf­ ten und die spezielle Differenzierungsleistung der kultivierten Zellen ist (1, 2, 3). Eine solche extrazelluläre Matrix (ECM) besteht unter anderem aus verschiedenen Kollagenen, Laminin, Fibronectin und anderen kollagen- oder nichtkollagenartigen Proteinen. In vielen Experimenten hat sich gezeigt (2, 3), daß hochspezialisierte Zellen ohne einen sol­ chen Support nicht kultiviert werden können.

Deshalb besteht zur Zeit und in Zukunft eine große Nachfrage nach käuflich zu erwerbenden zellu­ lären und extrazellulären Matrixprodukten, die in biologischen und bio­ technologischen Zellkulturexperimenten sinnvoll und vor allem vielseitig angewandt werden können. Geeignete kompatible Systeme, die sowohl die Kultivation hochdifferenzierter Zellen als auch später ein leichtes und vielseitiges Experimentieren garantieren, fehlen jedoch bisher.

Neben der Mikrocarrier-Technik gibt es einige wenige stationäre zellbio­ logische Hilfsmittel, um lebende Zellen auf spezifischen Supporten zu kultivieren. Diese werden für den Kleinlabormaßstab von Millipore (4, Millicell) und TECNOMARA (5; Transwell) angeboten (Fig. 1). Von TECNOMARA (5) werden hohe Hohlzylinder mit einem auf einer Seite aufge­ klebten kollagenbeschichteten Filter angeboten, während Millipore (4) zu seinen sehr ähnlich aussehenden Filterschalen lediglich Beschichtungs­ vorschriften aus der Literatur offeriert. Ein dritter Hersteller (Paesel and Lorei (6)) bietet ECM-beschichtete gewöhnliche Petrischalen oder auch mikroskopische Deckgläser an. Andere Hersteller von solchen Produk­ ten sind uns nach bestem Wissen nicht bekannt.

Die Neuheit, Erfindungshöhe und gewerbliche Anwendbarkeit:

Unsere Erfindung unterscheidet sich dahingehend von den beschriebenen Konkurrenzprodukten der Firmen Millipore, TECNOMARA und Paesel, daß mit ihrer Hilfe nicht mehr nur alleine die Kultivation hochdifferenzierter Zellen im Kleinlabormaßstab möglich ist, sondern zusätzlich auch eine Kultivation im großen Maßstab sowie die Überführung der kultivierten Zellen aus den Kulturschalen in weiterführende Experimentanordnungen wie z. B. Mikroperfusionskammern und Bioreaktoren. Dies wird dadurch mög­ lich, daß bei unserer Erfindung der Support nicht wie bei den Konkur­ renzprodukten fest mit dem Kulturgefäß verbunden ist, sondern sich auf einem in das Kulturgefäß einzulegenden, folienartigen Träger von variabler Größe und Geometrie befindet, der nach Anwachsen der Zellen auch jederzeit wieder aus dem Kulturgefäß entfernt werden kann (Fig. 3). Zur Stabilisierung werden diese möglicherweise mit Biomatrix beschichte­ ten Folien zwischen zwei konzentrische, ineinandergreifende Ringe ge­ klemmt und damit ähnlich dem Trommelfell einer Trommel ausgespannt.

Kommt ein einzelner "Minusheet" in einem Kulturgefäß zur Anwendung, so sind die Ringe des Halterungsapparates so flach gehalten, daß sie nicht wesentlich über das Niveau des Supportes herausragen. (Abb.1, 4) Das hat den entscheidenden Vorteil, daß nach Herausnehmen des "Minusheets" aus dem Kulturgefäß kein behindernder lateraler Rand vorhanden ist, und die Zellen somit zu experimentellen Zwecken auch seitlich ungehindert zu­ gänglich sind.

Der Halterungsapparat kann aber auch derart gestaltet werden, daß die "Minusheets" stapelbar werden, was die Zellkultivation in großem Maßstab auf minimiertem Raum ermöglicht.

Das neue Produkt erlaubt:

• 1) Die Kultivation hochdifferenzierte Zellen auf einem spezifischen flachen Supportmaterial.
• 2) Die Herstellung des flachen Supportmaterials in jeder beliebigen Größe und Form und damit die Verwendung in jeder beliebigen Kultur­ schale oder in jedem dafür geeigneten Gefäß.
• 3) Das beliebige Herausnehmen und Einsetzen auch bereits mit Zellen bewachsener Supporte aus bzw. in Kulturschalen ohne zusätzliche che­ mische oder biologische Behandlung; sowie
• 4) das Einbringen der mit Zellen bewachsenen Supporte in zellbiologi­ sche, physiologische oder biochemische weiterführende Experimentan­ ordnungen nach vorausgehender Kultivation in Kulturschalen.

Der neue Name des Produktes:

Durch Ausschneiden oder Ausstanzen einer geeigneten Folie, eines Fil­ ters, Gitters oder sonstigen geeigneten Trägermaterials sowie eventuel­ ler Beschichtung, z. B. mit einem zellulären oder extrazellulären Matrixprodukt und durch Verankerung dieses Supportes in einer flachen ringförmigen oder sonstigen geometrischen Halterung erhält man das neue zellbiologische Produkt

Minusheet. Die Herstellung von Minusheets:

Zur Herstellung von Minusheets muß ein permeables oder impermeables Trägermaterial in beliebigem Durchmessser ausgeschnitten oder ausge­ stanzt werden. Auf einem spezifischen, z. B. zylindrischen Herstel­ lungswerkzeug wird zuerst ein äußerst flacher Halterungsring installiert (Fig. 2). Das ausgestanzte Trägermaterial wird dann in den Ring einge­ legt. Mit einem kleineren, eng sitzenden flachen Ring wird das Support­ material im größeren Ring fixiert, ähnlich einem Trommelfell auf einer Trommel. Nachdem man den kleinen Ring eingepreßt hat, ist die Befesti­ gungsprozedur beendet. Wenn eine Beschichtung notwendig werden sollte, kann dies entweder vor dem Montieren des Minusheets oder aber auch danach geschehen. Das fertige Minusheet wird nun mit einem geeigneten Verfahren sterilisiert, gelangt steril verpackt zum Verbraucher. Mit einer feinen Pinzette kann das Minusheet jetzt leicht in jede x-belie­ bige Kulturschale oder aber auch in jedes Bioreaktorgefäß transferiert werden, um es für weitere Experimente zu verwerten.

Es ist wichtig, daß das Minusheet nicht eine Napf- oder eine Container­ charakteristik besitzt wie das z. B. bei Millicell- (4) oder Trans­ wellprodukten (5) der Fall ist. Ganz im Gegenteil, Minusheet ist eine blatt- oder folienartige flache Unterlage, die in Kulturschalen einge­ legt wird und dort als geeigneter Support dient, um lebenden Zellen eine gute Anhaftung und eine möglichst hohe Differenzierung zu erleichtern oder unter möglichst natürlichen Bedingungen überhaupt erst zu ermögli­ chen. Das heißt, diese flachen Minusheets verbessern für lebende Zellen entscheidend die Qualität der sehr unspezifischen Charakteristika eines Kulturgefäßes z. B. aus Plastik oder Glas. Nach Kultivation können dann die lebenden Zellen sehr schnell und unbeschadet für weitere zellbiolo­ gische Experimente verwendet werden.

Der Vorteil der Variabilität

Minusheets können ohne Schwierigkeiten in jeder Größe und Form und mit einer Vielzahl von Beschichtungen hergestellt werden. Da sie außerdem auch dann voll funktionsfähig sind, wenn sie den Boden eines Kultur­ gefäßes nicht vollständig abdecken, sind sie ohne weiteres für jede Art von Zellkulturgefäß, wie z. B. Flaschen, Roller, Plastik- oder Glas­ petrischalen und für Gefäße in jeder Größe anwendbar (Fig. 3).

Zusätzliche Anwendungsmöglichkeiten wie z. B. in Mikroperfusionskammern oder Bioreaktoren eröffnen sich durch Modifikation des Halterungsappa­ rates. Auf diesem Wege ist es möglich, apikale und basale Seite der Minusheets unabhängig voneinander zu perfundieren bzw. die Minusheets in geeigneten Kammern zu stapeln (Fig. 4, 6).

Da diese überaus vielseitigen Anwendungsmöglichkeiten durch geringste Änderungen des Herstellungsverfahrens bzw. durch die Auswahl zwischen drei verschiedenen Halterungssystemen eröffnet werden, und da zusätzlich die Möglichkeit besteht, die Minusheets leicht von einer Versuchsanord­ nung in eine andere zu überführen, sind die Minusheets in punkto Varia­ bilität und Handlichkeit den Konkurrenzprodukten, bei denen in allen Fällen die Kulturgefäße direkt beschichtet sind, weit überlegen.

Die Anwendung von Minusheets: Mikroperfusionssystem

Für Mikroperfusionsexperimente werden Minusheets mit daran anhaftenden Zellen z. B. aus einer Petrischale herausgenommen und dann in eine neu entwickelte Mikroperfusionskammer (Fig. 4) überführt, bei der eine ge­ trennte apikale und basale Perfusion der Zellen parallel zu einer elek­ trophysiologischen Registrierung von Transportvorgängen bei geringstem Totraumvolumen ermöglicht wird. Durch eine seitliche Abdichtung des Minusheets kann sehr leicht ein Leck verhindert werden. Dadurch wird es möglich, Transportvorgänge zwischen der apikalen und basalen Seite zu messen. Hinzu kommt, daß durch eine individuelle apikale bzw. basale Perfusion mit hypo- oder hypertonen Medien die Bildung eines Gradienten während der Kultur oder des Experiments möglich wird, wie das z. B. in der Niere vorkommt. Diese Art der Nutzung kultivierter Zellen ist einzigartig, öffnet ein neues Feld in der zellbiologischen Forschung und war bisher in dieser Art nicht möglich.

Mikropunktion:

Minusheets mit lebenden Zellen können sehr leicht in eine Mikropunk­ tionskammer auf Mikroskopiertischen eingesetzt werden (Fig. 5). Dadurch wird es möglich, mit Mikropipetten die kultivierten Zellen zu punktie­ ren, ohne daß durch eine seitliche Wand des Kulturgefäßes das Experiment beeinträchtigt wird. Falls es notwendig wird, die Zellen zu wechseln, nimmt man einfach das Minusheet heraus und ersetzt es durch ein anderes.

Biotechnologischer Fortschritt:

Minusheets können sehr hilfreich sein für die Bioreaktortechnologie, da sie die Überführung von Kultivationstechniken in größere, u. U. indu­ strielle Maßstäbe in Art einer Modultechnik erleichtern bzw. überhaupt erst möglich machen (Fig. 6).

• 1) Minusheets können gestapelt werden. Dabei kann sowohl der Durchmesser der Sheets variieren, es kann aber auch die Stapelhöhe beliebig gewählt werden.
• 2) Minusheets können perfundiert werden, nämlich von der apikalen und von der basalen Seite mit einem extrem niedrigen Totraumvolumen.
• 3) In einen Bioreaktor können entweder nur Sheets mit gleichartigen Zellen eingebracht werden, es können aber auch mit unterschiedlichen Zellarten bewachsene Sheets zur Anwendung kommen, wodurch u. U. eine positive Beeinflussung der Zellen untereinander ermöglicht wird.
• 4) Der Vorteil des gezeigten Systems ist darin zu sehen, daß jedes einzelne Minusheet für sich allein im Reaktor kontrolliert werden kann. Dies geschieht dadurch, daß jedes Sheet von apikal und basal eine Flüssigkeitszufuhr und -abfuhr besitzt (Fig. 6, Einstrom - Ausstrom). Damit kann jede Zellage für sich allein z. B. auf eine Infektion oder Sekretion hin kontrolliert werden. Das Reaktorrohr kann leicht geöffnet werden und jedes gewünschte Sheet kann für sich allein herausgenommen und ersetzt werden.
• 5) Die Überführung einer Kultivationstechnik in einen größeren Maßstab könnte folgendermaßen aussehen: Im Entwicklungsstadium werden die gewünschten Zellen auf kleinsten Sheets im Labormaßstab kultiviert. Durch Tests läßt sich feststellen, ob sie die gewünschte Sekretion an Bioprodukt erbringen. Wenn solche Experimente im Labormaßstab erfolg­ reich sind, können danach die Zellen auf Minusheets der nächsten oder übernächsten Größe weiter herangezüchtet werden. Der Vorteil des Systems besteht also darin, daß immer die gleiche Qualität an Minu­ sheets verwendet wird, daß aber in unterschiedlicher Größe gearbeitet werden kann. So ist es möglich, das Wachstumsverhalten der Zellen auf unterschiedlich großen Sheets direkt zu vergleichen (mini­ male/maximale Maße für die Differenzierung) und auf diese Weise das Kultivationsverfahren zu optimieren. Ebenso ist ein direkter Ver­ gleich von Minusheets mit unterschiedlicher Beschichtung möglich. Dies war bisher in der Bioreaktortechnologie nicht möglich. Unsere Entwicklung garantiert also eine unmittelbare Kontrolle über Anhaf­ tung der Zellen, Wachstum, Differenzierung und Sekretion auf einzel­ nen Minusheets zu jeder Zeit. References:
• 1) Opas M. (1989): Expression of the differentiated phenotype by epithelial cells in vitro is regulated by both biochemistry and mechanics of the substratum: Developmental Biology 131: 281-293
• 2) Minuth W.W. (1987): Neonatal rabbit cortex in culture as tool for the study of collecting duct formation and nephron differentiation. Differentiation 36: 12-22
• 3) Minuth W.W., Gilbert P. (1988): The expression of specific proteins in cultured renal collecting duct cells. Histochemistry 88: 435-441 Kompetitive Produkte
• 4) Millipore GmbH, Hauptstr. 71-79, D-6236 Eschborn: Millicell CM/HA Einsätze; z. B. Katalognr. PICM 0 1250 oder PIHA 01250
• 5) TECNOMARA Deutschland GmbH, Labortechnik für Mikrobiologie und Biotechnologie, Rahberg 4, D-6301 Fernwald: Costar Transwell TM- Einsätze in Mehrfachkulturschalen: z. B. Katalognr. 3408 oder 3415 oder collagenbeschichtet 3418
• 6) Paesel and Lorei GmbH and Co, Borsigallee 6, D-6000 Frankfurt 63: ECM coated dishes, z. B. Katalognr. 36-127-035 oder 36-127-222

Erklärungen zu den Zeichnungen:

Fig. 1: Schematischer Längsschnitt von Millipore Millicells (a), TECNO- MARA Transwell (b) und Minusheets (c): Minusheets werden mit einer speziellen, äußerst flachen Einfassung in Kulturgefäße als verbesserte Zellunterlage eingelegt, um das Wachstum und die Differenzierung von Zellen unter möglichst natürlichen Bedingungen zu erreichen. Konkurrie­ rende Produkte von Millipore (a) und TECNOMARA (b) sind hohe zylindri­ sche und an einem Ende mit einem Filter verklebte Einsätze, in denen Zellen kultiviert werden. Minusheets (c) dagegen sind äußerst flache scheibenartige und vor allem kompatible Zellunterlagen, die zur Verbes­ serung des unspezifischen Untergrundes in einer Kulturschale erfunden sind.

Fig. 2: Schematische Darstellung der Herstellung von Minusheets (Längsschnitt): Auf einem Montageblock wird ein erster flacher Haltering aufgelegt. In diesen ersten Haltering wird das beschichtete oder unbe­ schichtete dünne Supportmaterial eingelegt. Das Supportmaterial wird mit einem zweiten dünnen Haltering fixiert. Zum Gebrauch wird das äußerst dünne Minusheet um 180° gedreht, so daß der erste Haltering jetzt als Oberseite zu sehen ist. Das Minusheet wird dann zur Verbesserung eines Kulturbodens in ein dafür vorgesehenes Gefäß eingelegt. Es bedeckt die gesamte Fläche.

Schematische Darstellung der Variabilität:

Fig. 3: Minusheets zeichnen sich dadurch aus, daß sie erstens in belie­ biger Größe und Durchmesser und zweitens mit unterschiedlichstem Supportmaterial in jedem beliebigen Zellkulturgefäß als verbesserte und dadurch möglichst natürliche Zellunterlage eingelegt werden können.

Schematischer Längsschnitt einer Mikroperfusionskammer:

Fig. 4: Zellen wurden auf einem flachen Minusheet im Kulturschrank gezüchtet und dann in eine Mikroperfusionskammer eingesetzt. Für eine Vielzahl von Experimenten wird so eine getrennte apikale und basale Perfusion bei geringstem Totraumvolumen möglich. Dies ist bei vergleich­ baren Millipore- (Fig. 1a) und TECNOMARA-Produkten (Fig. 1b) wegen der hohen lateralen Wandung dergestalt nicht möglich. Bei Bedarf kann durch Öffnen der Kammer sehr leicht das Minusheet mit lebenden Zellen gegen ein anderes ausgetauscht werden.

Schematischer Längsschnitt durch eine Mikropunktionsanordnung:

Fig. 5: Für Mikroperfusionsexperimente kann ein flaches Minusheet mit kultivierten Zellen leicht in eine geeignete Halterung eingesetzt wer­ den. Die kultivierten Zellen sind von apikal und lateral für Mikro­ punktionswerkzeuge zugänglich. Dies ist bei Millipore- (Fig. 1a) und TECNOMARA-Produkten (Fig. 1b) wegen der lateralen hohen Wand in dieser Art nicht möglich. Das eingelegte Minusheet kann dann entweder von apikal oder basal mikroskopisch betrachtet werden (Objektiv). Ein schnelles Auswechseln des Minusheets ist jederzeit möglich.

Schematischer Längsschnitt durch eine Minusheet-Bioreaktor-Kartusche:

Fig. 6: Minusheets lassen sich in jeder Größe und mit jedem gewünschten Support in spezielle Perfusionsbioreaktorkartuschen einsetzen. Dabei kann jedes Minusheet von apikal wie auch von basal mit Kulturmedien perfundiert werden. Die Reaktorkartusche läßt sich leicht öffnen und schließen. Dadurch kann jedes einzelne Minusheet mit lebenden Zellen leicht eingesetzt oder aber wieder entfernt werden.

Claims (4)

1. Scheibenförmige, mit unterschiedlichen Substanzen beschichtete Trägerfolie in einem spezifischen Halteapparat zur Zellkultivation. Kennzeichnender Teil:
2. dadurch gekennzeichnet, daß ein variables, folienartiges Trägermaterial in einen speziell entwickelten Halteapparat eingespannt und bei Bedarf vor oder nach dem Einspannen mit zellulärer oder extrazellulärer Biomatrix beschichtet werden kann. Oberbegriff des Unteranspruchs:
3. Produkt, um lebende Zellen entsprechend ihrer natürlichen Umgebung in einfach zu handhabender Form zu kultivieren, um damit biologische, biotechnologische und medizinische Versuche leicht durchführen zu können. Kennzeichnender Teil:
4. dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerfolie durch Modifikation des Halteapparates sowohl in herkömmlichen Zellkulturgefäßen als auch in Mikroperfusionskammern und Bioreaktoren zur Anwendung kommen kann und daß die Trägerfolie problemlos von einem dieser unterschiedlichen Systeme in ein anderes überführt werden kann.