DE3819530A1 - Verfahren, traeger und testsatz fuer die kultivierung und mikroskopische untersuchung von zellen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kultivierung von Zellen, insbesondere für deren licht- und elektronenmikro­ skopische Untersuchung, bei dem man lebende Zellen auf einer dünnen Schicht aus licht- und elektronendurchlässigem Kunst­ harz, welches auf ein Trägermaterial aufgebracht worden ist, kultiviert, sowie einen Träger und einen Testsatz (Kit) für die Kultivierung und für die licht- und elektronenmikrosko­ pische Untersuchung von Zellen.

Um die Topographie ganzer Zellen in einem Zustand studieren und abbilden zu können, der dem nativen Zustand der lebenden Zelle entspricht oder möglichst nahekommt, verwendet man für den Bereich der Lichtmikroskopie schon seit langem Objekt­ träger-Agarkulturen.

Zur Herstellung von solchen Agarfilmpräparaten wird der flüssige, auf 60 bis 70°C erhitzte Nähragar auf einen sau­ beren, abgeflammten Objektträger, d.h. eine Glasplatte von einer Dicke von etwa 0,8 mm, gegossen, so daß beim Erkalten ein dünner Agarfilm entsteht. Auf den Agarfilm wird dann ein Tropfen einer Suspension der zu untersuchenden lebenden Zel­ len oder Mikroorganismen gegeben und über die Fläche ver­ teilt. Prozesse wie Zellteilung, Sporenentwicklung, Plasma­ strömung und dergleichen können dann entweder sofort, z.B. mit dem Phasenkontrastmikroskop, verfolgt werden oder die Zellen können nach Ablauf einer Inkubationszeit mikrosko­ pisch untersucht werden (vgl. hierzu G. Drews, Mikrobiologi­ sches Praktikum, 3. Auflage, S. 71, Springer-Verlag, Berlin - Heidelberg - New York, 1976).

Für elektronenmikroskopische Untersuchungen sind herkömmli­ che Objektträgerkulturen jedoch nicht geeignet, weil der Ob­ jektträger elektronenundurchlässig, der Agarfilm nicht vom Objektträger zerstörungsfrei ablösbar ist und der Agarfilm überdies unter den Bedingungen der Elektronenmikroskopie so­ fort zerstört würde.

Zur elektronenmikroskopischen Untersuchung und Abbildung ganzer Zellen wurde von Wolosewick und Porter (J. Cell Biology, Vol. 82, Seite 114 bis 139, 1979) vorgeschlagen, Goldnetze mit Polyvinylformal-Harzen und Kohlenstoff zu be­ schichten und auf dieser Kunstharzbeschichtung Kulturen le­ bender Zellen anzulegen, welche dann auf den beschichteten Goldnetzen nach entsprechender Präparierung durch Fixierung, Entwässerung und Trocknung direkt elektronenmikroskopisch untersucht werden können.

Abgesehen davon, daß die kunstharzbeschichteten Goldnetze für eine massenhafte Anwendung, beispielsweise für mikrosko­ pische Reihenuntersuchungen in bezug auf bestimmte Blutkom­ ponenten, Viren oder sonstige Mikroorganismen, Antikörper, Immunfaktoren und dergleichen, viel zu teuer sind, hat sich gezeigt, daß sich die nativen inneren und äußeren Strukturen der nach dem bekannten Verfahren kultivierten Zellen, insbe­ sondere während der Fixierung, Entwässerung und Trocknung zum Teil erheblich verändern, so daß das elektronenmikrosko­ pisch gewonnene Bild der Zellstrukturen abweicht von den na­ tiven Strukturen der lebenden Zelle.

Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, ein Ver­ fahren der eingangs genannten Gattung zu schaffen, mit dem es gelingt, lebende Zellen auf möglichst einfache und billi­ ge, für Reihenuntersuchungen geeignete Weise so zu kultivie­ ren, daß zum einen das filmartige Substrat zerstörungsfrei von seinem Trägermaterial abgelöst und direkt in den Strah­ lengang eines Elektronenmikroskops eingebracht werden kann, zum anderen aber gleichzeitig die Veränderung der nativen Strukturen der lebenden Zelle insbesondere während der Fixierung, Entwässerung und Trocknung in höherem Maße, als bisher möglich, zu verhindern.

Der Erfindung liegt ferner die Aufgabe zugrunde, einen Trä­ ger für die Kultivierung und für die licht- und elektronen­ mikroskopische Untersuchung von Zellen bereitzustellen, der einfach und billig herstellbar ist, leicht sterilisierbar und in sterilem Zustand lange haltbar ist, der sich für die massenhafte Verwendung bei Reihenuntersuchungen eignet und gleichzeitig die Kultivierung lebender Zellen auf eine Weise ermöglicht, die die nativen Strukturen der Zellen insbeson­ dere auch bei der Fixierung, Entwässerung und Trocknung, d.h. bei der Präparation der Zellen für die Elektronenmikro­ skopie, in größtmöglichem Maße erhält.

Ein weiterer Teilaspekt der der Erfindung zugrunde liegenden Aufgabe besteht darin, einen Testsatz (Kit) für die Kulti­ vierung und für die licht- und elektronenmikroskopische Un­ tersuchung von Zellen bereitzustellen, der es ermöglicht, das erfindungsgemäße Verfahren in standardisierter Form, insbesondere bei Reihenuntersuchungen, durchzuführen.

Diese Aufgabe wird bei dem Verfahren der eingangs genannten Gattung erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man auf dem ge­ gebenenfalls zuvor sterilisierten Trägermaterial mindestens einseitig einen licht- und elektronendurchlässigen Film aus Melaminharz bildet und anschließend die zu kultivierenden Zellen unter sterilen Bedingungen auf den Film aufträgt, die auf dem Film befindlichen Zellen mitsamt dem Träger unter Zugabe eines für die Zellen geeigneten Nährmediums inkubiert und danach gegebenenfalls für die mikroskopische Untersu­ chung fixiert.

Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß Melaminharzfil­ me als Substrat für die Kultivierung von Zellen und gleich­ zeitig als licht- und elektronendurchlässiges Trägermaterial für die mikroskopische Untersuchung sowohl ganzer Zellen als auch von Ultradünnschnitten solcher Zellen besonders geeig­ net sind, weil sie sich leicht äußerst dünn und homogen, gleichzeitig aber mit sehr glatter Oberfläche herstellen lassen, für Licht und Elektronen hoch transparent sind und weil sich überraschenderweise gezeigt hat, daß sich aufgrund besonderer Wechselwirkungen chemischer und physikalischer Art zwischen der Oberfläche der Melaminharzfilme und den Proteinen der äußeren Oberfläche der Zellplasmamembranen ei­ ne besonders starke Bindung bzw. Haftung der Zellen auf den Melaminharzfilmen ergibt, die aber keine Veränderung der na­ tiven Topographie bzw. der nativen Strukturen der Zellen, sondern im Gegenteil deren Festschreibung und Bewahrung be­ wirkt, insbesondere während der kritischen Operationen der Präparierung der kultivierten Zellen für die Elektronen­ mikroskopie, also insbesondere während der Fixierung und der gegebenenfalls nachfolgenden Entwässerung und Trocknung der Zellen.

Erfindungsgemäß wird vorzugsweise ein Film aus mindestens teilweise vernetztem Hexamethylolmelaminether verwendet. Die im Handel erhältlichen wäßrigen oder alkoholischen Lösungen von Hexamethylolmelaminethern sind meist Mono- bis Hexa­ alkylether von C₁ bis C₄-Alkoholen oder deren Gemische. Die Methylolmelaminmethylether, insbesondere die Hexamethylolme­ laminmethylether sind in Wasser und Alkohol leicht löslich und lassen sich in der Wärme leicht zu Filmen mit besonders glatter Oberfläche und hervorragenden Transmissionseigen­ schaften vernetzen. Die durch chemische und physikalische Wechselwirkung zwischen den funktionellen Gruppen des ver­ netzten Hexamethylolmelaminethers und den funktionellen Gruppen der Proteine der Zellplasmamembranen ist mit einer besonders guten Stabilisierung der nativen Topographie bzw. der nativen Strukturen der Zellen verbunden, weshalb dieses Filmmaterial für die erfindungsgemäßen Zwecke besonders be­ vorzugt ist.

Ein weiterer wichtiger Vorteil der Melaminharzfilme und ins­ besondere der Filme aus Hexamethylolmelaminether besteht da­ rin, daß diese Filme thermisch so stabil sind, daß sie auf besonders einfache Weise sterilisiert werden können, und zwar entweder durch eine Wärmebehandlung in einem Wärme­ schrank oder in einem Ofen bei Temperaturen zwischen etwa 60 und 110°C oder durch Abflämmen, d.h. dadurch, daß der auf das Trägermaterial aufgebrachte Film kurzfristig durch die Flamme eines Bunsenbrenners oder dergleichen gezogen wird.

Zweckmäßig wird der Film in einer Dicke von weniger als 150 nm auf dem Trägermaterial gebildet, besonders bevorzugt in einer Dicke von etwa 80 nm, die für die Zwecke der Trans­ missionselektronenmikroskopie, aber auch der Rasterelektro­ nenmikroskopie besonders geeignet ist.

Bei einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemä­ ßen Verfahrens wird der Film in Form einer Gießfolie auf das Trägermaterial aufgebracht oder auf dem Trägermaterial ge­ bildet, wobei besonders bevorzugt so vorgegangen wird, daß der Film durch Eintauchen des gegebenenfalls zuvor sterili­ sierten Trägermaterials in eine Lösung von 1 Gew.-% Hexa­ methylolmelaminether und 0,3 Gew.-% p-Toluolsulfonsäure (Vernetzungskatalysator) in Ethanol und anschließende Wärme­ behandlung gebildet wird. Dabei kann das Trägermaterial vor dem kurzzeitigen Eintauchen in die ethanolische Lösung nicht nur sterilisiert, sondern, insbesondere bei dickerem Träger­ material, auch vorerhitzt werden, um die Vernetzung des Me­ laminharzes zu beschleunigen.

Die sich an das Eintauchen in die ethanolische Lösung an­ schließende Wärmebehandlung des mit der Lösung beschichteten Trägermaterials bzw. des auf dem Trägermaterial gebildeten Films erfolgt zweckmäßig bei einer Temperatur und während eines Zeitraums, welche einerseits ausreichen, um das Mela­ minharz zu vernetzen, andererseits aber das Trägermaterial nicht beeinträchtigen. Je nach dem verwendeten Trägermate­ rial und dem verwendeten Melaminharz kann der Fachmann an­ hand einfacher Versuche feststellen, welche Bedingungen für die spezielle Anwendung am günstigsten sind. Wie bereits er­ wähnt, kann die Wärmebehandlung darin bestehen, daß das mit der Lösung beschichtete Trägermaterial kurzfristig durch ei­ ne offene Flamme gezogen wird, oder aber darin, daß das be­ schichtete Trägermaterial in einem Wärmeschrank, Trocken­ schrank, Ofen oder dergleichen auf eine Temperatur zwischen 60 und 110°C erhitzt wird.

Als Trägermaterial werden erfindungsgemäß vorzugsweise Plat­ ten, Streifen, Stäbe, Fasern oder Folien aus Glas, z.B. Ob­ jektträger oder Deckgläser, wie sie in der Mikroskopie üb­ lich sind, oder aber aus Kunststoff, z.B. Streifen aus einer Polyethylenfolie, verwendet. Das Trägermaterial sollte in jedem Falle lichtdurchlässig und farblos sein, um es direkt als Objektträger für lichtmikroskopische Untersuchungen ver­ wenden zu können.

Bei einer vorteilhaften Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Melaminharzfilm mit Reagenzien getränkt, die das Wachstum der zu kultivierenden Zellen fördern. Vor­ zugsweise handelt es sich bei diesen Reagenzien um Bindege­ webskomponenten wie Kollagen, Laminin und/oder Vimentin, aber es kann sich auch um Mineralien, Hormone, Enzyme, Nähr­ stoffe oder dergleichen handeln. Diese Reagenzien können entweder in Form einer wäßrigen oder alkoholischen Lösung auf den bereits vernetzten Film aufgetragen werden oder aber, soweit sie mit den Bestandteilen der Tauchlösung, aus der der Film gebildet wird, verträglich sind und keine chemi­ schen Reaktionen eingehen, in die wäßrige oder alkoholische Tauchlösung gegeben werden, so daß der auf dem Trägermate­ rial gebildete Melaminharzfilm von vornherein die Reagenzien mitenthält.

Wenn die erfindungsgemäß kultivierten Zellen fixiert werden sollen oder müssen, dann erfolgt die Fixierung vorzugsweise unter Verwendung von Aldehyden, wobei Glutaraldehyd beson­ ders bevorzugt wird.

Da Melaminharze freie terminale Aminogruppen aufweisen, rea­ gieren sie, ähnlich wie Proteine, besonders leicht mit Alde­ hyden. Bei Verwendung von Aldehyden, insbesondere von Glutar­ aldehyd, als Mittel zur Fixierung der kultivierten Zellen werden deshalb die Zellen und der Melaminharzfilm über lös­ bare Aldehydbrücken reversibel vernetzt. Die Haftung der al­ dehydfixierten Zellen auf dem Melaminharzfilm ist deshalb stärker als direkt auf Glas oder inerten Kunststoffen. Er­ staunlicherweise führt diese "Aldehydvernetzung" nicht zu einer Veränderung der nativen Topographie der Zellen, son­ dern im Gegenteil zu ihrer Stabilisierung, Fixierung und Er­ haltung auch und gerade während der Präparierung der Zellen für die Elektronenmikroskopie, also während der Fixierung, Entwässerung und Trocknung der Zellen und natürlich auch während der Durchführung der Elektronenmikroskopie selbst.

Unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens lassen sich deshalb sowohl ganze Zellen als auch Ultradünnschnitte sol­ cher Zellen erstmals in einem Zustand elektronenmikrosko­ pisch abbilden, der die native Topographie bzw. die nativen inneren und äußeren Strukturen der lebenden Zelle so unver­ fälscht bzw. unverändert wiedergibt, wie es bisher mit kei­ ner anderen Technik möglich war.

In weiterer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die fixierten Zellen anschließend nach an sich be­ kannten Methoden entwässert und/oder getrocknet. Hierzu wen­ det man besonders bevorzugt die sogenannte "Kritischpunkt- Trocknung" unter Verwendung überkritischen Kohlendioxids an.

Obwohl der bevorzugte Anwendungsbereich des erfindungsgemä­ ßen Verfahrens die Kultivierung und elektronenmikroskopische Abbildung ganzer Zellen ist, kann das Verfahren auch ange­ wandt werden, um von den kultivierten Zellen Ultradünn­ schnitte herzustellen und letztere mikroskopisch zu unter­ suchen. Hierfür wendet man vorzugsweise das aus der DE-OS 32 38 639 bekannte Verfahren an, bei dem die entwässerten Zel­ len mit einem härtbaren Infiltrationsmittel infiltriert und nach dessen Aushärtung gegebenenfalls in ein Gießharz einge­ bettet werden, wonach aus dem nach dem Aushärten des Gieß­ harzes entstandenen Gießling Dünnschnitte geschnitten werden.

Als härtbares Infiltrationsmittel eignet sich besonders gut ein Gemisch aus Formaldehyd, Melamin und Wasser, das gege­ benenfalls noch ein Mittel zum Einstellen des pH-Werts ent­ hält, und als Gießharze eignen sich ebenfalls Melaminharze, die gegebenenfalls modifiziert sein können, oder Epoxidharze wie z.B. Epon®.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich nicht nur für die lichtmikroskopische oder elektronenmikroskopische Untersu­ chung bzw. Abbildung von ganzen Zellen oder von Ultradünn­ schnitt-Präparaten je für sich allein, sondern auch für die sukzessive Durchführung licht- und elektronenmikroskopischer Untersuchungen an ein und derselben Zelle bzw. ein und dem­ selben Präparat, wobei sich das Substrat, auf dem sich die zu untersuchende bzw. abzubildende Zelle befindet, nämlich der Melaminharzfilm, nicht verändert, sondern bei allen suk­ zessiv durchgeführten Untersuchungen als Objektträger ver­ wendet wird.

Vorzugsweise werden also die fixierten ganzen Zellen nach der Entwässerung und/oder Trocknung oder die Ultradünn­ schnitt-Präparate zunächst lichtmikroskopisch untersucht, wobei man den Melaminharzfilm auf dem Trägermaterial beläßt, und anschließend wird dieselbe Zelle bzw. dasselbe Präparat elektronenmikroskopisch untersucht bzw. abgebildet, wobei zuerst eine transmissionselektronenmikroskopische Untersu­ chung und danach eine rasterelektronenmikroskopische Unter­ suchung durchgeführt wird. Für die elektronenmikroskopischen Untersuchungen wird der die Zellen aufweisende Film mittels verdünnter wäßriger Flußsäurelösung vom Trägermaterial abge­ löst, die Flußsäurelösung anschließend durch Wasser verdrängt und die auf dem abgelösten, mit Wasser gewaschenen Film be­ findlichen ganzen Zellen oder die Ultradünnschnitte elektro­ nenmikroskopisch untersucht bzw. abgebildet.

Vor dem Ablösen des Melaminharzfilms mit vorzugsweise 0,4 %iger wäßriger Flußsäurelösung kann zur Erleichterung der Identifizierung einzelner Zellen in an sich bekannter Weise ein Buchstabennetz auf das fixierte und getrocknete Präparat aufgebracht werden.

In ebenfalls an sich bekannter Weise kann, insbesondere vor der Durchführung der rasterelektronenmikroskopischen Unter­ suchung, die Oberfläche des Präparats einschließlich der Zellen, mit Metall, z.B. Gold, bedampft werden, wenn die Oberflächenstrukturen, z.B. Mikrovilli (Mikrozotten) der Zellhüllen abgebildet werden sollen.

Der erfindungsgemäße Träger für die Kultivierung und für die licht- und elektronenmikroskopische Untersuchung von Zellen besteht aus einem mindestens teilweise mit einer dün­ nen Schicht aus licht- und elektronendurchlässigem Kunstharz beschichtetem Trägermaterial, und die der Erfindung insoweit zugrunde liegende Aufgabe wird dadurch gelöst, daß die Kunstharzschicht ein licht- und elektronendurchlässiger Film aus einem Melaminharz ist. Das Melaminharz besteht dabei vorzugsweise aus mindestens teilweise vernetztem Hexamethy­ lolmelaminether, besonders bevorzugt aus Hexamethylolmela­ minmethylether oder anderen C₁ bis C₄-Alkylethern des Hexa­ methylolmelamins.

Vorzugsweise weist der Film des erfindungsgemäßen Trägers eine Dicke von weniger als 150 nm auf, besonders bevorzugt eine Dicke von etwa 80 nm.

Zweckmäßig wird der Film durch Eintauchen des gegebenenfalls zuvor sterilisierten Trägermaterials in eine Lösung von 1 Gew.-% Hexamethylolmelaminether und 0,3 Gew.-% p-Toluolsul­ fonsäure in Ethanol, einem anderen Niedrigalkylalkohol, Was­ ser oder in einem Gemisch dieser Lösungsmittel und durch an­ schließende Wärmebehandlung gebildet.

Als Trägermaterial für den Melaminharzfilm wird vorzugsweise ein in bezug auf das Melaminharz und die Zellen inertes Ma­ terial in Form von Platten, Streifen, Stäben, Fasern oder Folien verwendet, wobei die Trägermaterialien aus Glas, bei­ spielsweise in der Mikroskopie übliche Objektträger, oder aus Kunststoff, beispielsweise Polyethylenfolie, bestehen.

Bei einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemä­ ßen Trägers ist der Melaminharzfilm mit Reagenzien getränkt, die das Wachstum der zu kultivierenden Zellen fördern. Be­ vorzugte derartige Reagenzien sind Bindegewebskomponenten wie Kollagen, Laminin und/oder Vimentin, aber auch Minera­ lien, Nährstoffe, Hormone, Enzyme und dergleichen.

Der erfindungsgemäße Träger ist vorzugsweise sterilisiert und einzeln oder zu mehreren steril verpackt. Er stellt ein einfach handhabbares Zellkultursubstrat dar, das nicht nur lichtdurchlässig ist, sondern auch leicht in eine elektro­ nendurchlässige Form durch Abziehen des Melaminharzfilms vom Trägermaterial gebracht werden kann und das als Objektträger für alle Mikroskopiearten einsetzbar ist. Der erfindungsge­ mäße Träger ist insbesondere zur massenhaften Durchführung von Reihenuntersuchungen besonders geeignet, und zwar in all jenen Fällen, in denen Zellkulturen menschlichen oder tieri­ schen Ursprungs zum Zwecke der Identifizierung und Charakte­ risierung zusätzlich zu biochemischen und immunologischen Untersuchungen elektronenmikroskopisch untersucht und abge­ bildet werden sollen. Solche elektronenmikroskopischen Be­ gleituntersuchungen werden immer wichtiger bei Virus- und Krebserkrankungen, bei Erkrankungen des Immunsystems, in der Allergologie und in der Epidemiologie. Um solche begleiten­ den elektronenmikroskopischen Untersuchungen rasch und in standardisierbarer Weise durchführen zu können, sind stand­ ardisierbare Objektträger mit den für sämtliche Mikroskopie­ arten erforderlichen Eigenschaften erforderlich, die zugleich Kultursubstrate für die genannten Zellkulturen darstellen und die in naher Zukunft ubiquitär in ähnlicher Weise zur Verfü­ gung stehen müssen wie z.B. die weltweit verbreiteten Test­ stäbchen zur Bestimmung von Blut- oder Urinzucker oder die Testheftchen zur Bestimmung von okkultem Blut im Stuhl. Ein ähnlich starkes Bedürfnis nach der Bereitstellung solcher Träger besteht im Bereich der Dermatologie, Proktologie und Mykologie. Auf diesen Gebieten wurden bisher Zellen oder Zellsuspensionen durch Abstriche gewonnen, die dann auf ge­ eigneten Nährböden separat kultiviert wurden und dann wie­ derum separat den Nährböden entnommen und auf einen Objekt­ träger gebracht wurden.

Dieses Bedürfnis nach einem standardisierbaren, universell verwendbaren, multifunktionalen Träger, der gleichzeitig Zellkultursubstrat und Objektträger für sämtliche Mikrosko­ piearten ist, wird durch die Bereitstellung des erfindungs­ gemäßen Trägers befriedigt.

Gegenstand der Erfindung ist schließlich ein Testsatz (Kit) für die Kultivierung und für die licht- und elektronenmikro­ skopische Untersuchung von Zellen, der mindestens einen, je einzeln steril verpackten sterilisierten Träger gemäß der Erfindung, ein gesondert verpacktes, für die Kultivierung der zu untersuchenden Zellen auf dem Träger geeignetes, ste­ riles, flüssiges Nährmedium sowie gegebenenfalls weitere, gesondert verpackte, sterilisierte Reagenzien zur Durchfüh­ rung des erfindungsgemäßen Verfahrens umfaßt.

Bei den weiteren, gesondert verpackten, sterilisierten Rea­ genzien kann es sich um Lösungsmittel wie z.B. Ethanol oder aqua destillata oder bidestillata, um Stoffe oder Lösungen zum Tränken des Melaminharzfilms mit Stoffen, die das Wachs­ tum der zu kultivierenden Zellen fördern, um Mittel zum Fixieren der kultivierten Zellen, z.B Glutardialdehyd, um verdünnte wäßrige Flußsäurelösung zum Ablösen des Melamin­ harzfilms vom Trägermaterial, um Entwässerungs- und Infil­ trationsmittel, um Mittel zum Anfärben der Zellen oder Ultradünnschnitt-Präparate und dergleichen handeln.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand eines Ausführungsbei­ spiels näher erläutert:

Beispiel A) Ausgangsmaterialien

Herzzellen von drei Tage alten Ratten wurden in HME-2 gemäß Boldin et al (Pflügers Arch. 409, 462 bis 467, 1987), kulti­ viert, wobei das Medium aus BM 86 der Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, und CMRL 1415 der Firma Biochrom, Berlin, im Verhältnis 1 : 1, ergänzt mit 2% Pferdeserum, 2% fetalem Kälberserum, 2 mMol Glutamin und 50 µg/ml Gentamicin, zusam­ mengesetzt war.

Einer Lösung von 1% (Gew/Vol) Hexamethylolmelaminether (Na­ noplast MME 01, erhältlich von Nanoplast Rolf Bachhuber, Blaubeuren, oder Agar Scientific, Stansted/England) in ana­ lysenreinem Ethanol wird mit 0,3% p-Toluolsulfonsäure ver­ setzt. Diese Lösung bleibt bei Raumtemperatur viele Wochen lang stabil.

B) Herstellung der Träger

Glasscheiben nach Art herkömmlicher Objektträger oder Deck­ gläser werden zum Zwecke der Sterilisation kurz durch die Flamme eines Bunsenbrenners gezogen oder auf andere, bekann­ te Weise abgeflammt oder auf einer Heizplatte, die eine Tem­ peratur von etwa 333°K aufweist, erhitzt und unmittelbar da­ nach mit Hilfe einer Pinzette in die vorstehend genannte Hexamethylolmelaminether-Lösung eingetaucht, und zwar derart, daß die als Trägermaterial verwendeten Gläser nur zu ¾ ih­ rer Länge in die Lösung eintauchten. Innerhalb von etwa 1 bis 2 Sekunden wurden die Gläser wieder aus der Lösung herausge­ zogen und unmittelbar danach zum Zwecke der Härtung bzw. Vernetzung und zur Sterilisation des Melaminharzfilms erneut durch die Flamme gezogen oder auf andere bekannte Weise ab­ geflammt. Bei Verwendung dickerer Trägermaterialien, z.B. herkömmlicher Objektträger aus Glas, wurden die melaminharz­ beschichteten Träger vor dem Abflammen erst etwa 5 Minuten lang in steriler Luft bei laminarer Strömung getrocknet. Die Dicke des Melaminharzfilms betrug praktisch regelmäßig etwa 80 nm, was durch Messungen an Dünnschnitten des Melaminharz­ films, in Gießharz eingebettet, bestätigt wurde.

C) Kultivierung und Präparierung der Zellen

Ein Tropfen der vorbereiteten Suspension von Herzzellen wur­ de zusammen mit dem flüssigen Nährmedium unter sterilen Be­ dingungen auf die so hergestellten sterilisierten Träger aufgetragen und mit der Pipette ausgestrichen. Die beimpften Träger wurden in einem Brutschrank bei 37°C ein bis drei Tage lang inkubiert.

Danach wurden die auf den Melaminharzfilm aufgewachsenen Zellen bei Raumtemperatur mit einer Lösung von 1 bis 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 M-Phosphatpuffer, der 2% Sucrose ent­ hielt, 30 Minuten lang fixiert, mit einem Propanol/Dimethoxy­ propan-Gemisch entwässert und der Kritischpunkt-Trocknung mit überkritischem Kohlendioxid unterworfen. Einige der Prä­ parate wurden ohne vorherige Entwässerung in einem Stick­ stoffstrom bei Raumtemperatur getrocknet.

D) Abziehen der Melaminharzfilme vom Trägermaterial

Für das Abziehen der die Zellen tragenden Melaminharzfilme von den Trägermaterialien wurden zwei verschiedene Verfahren entwickelt: Die im Stickstoffstrom getrockneten Präparate wurden mit der mit Zellen besetzten Seite nach oben in eine Petrischale (60 mm Durchmesser) gebracht, und es wurden 10 ml 0,4%iger wäßriger Fluorwasserstoffsäure vorsichtig zu­ gegeben. Weil der die Zellen tragende Film stark wasserab­ weisend ist, bleibt seine obere Oberfläche trocken. Inner­ halb von zwei bis fünf Minuten trennt sich der Film vom Glas bzw. vom Trägermaterial und schwimmt auf der Oberfläche der Lösung auf. Die Flußsäurelösung wird dann durch bidestillier­ tes Wasser ersetzt und Buchstabennetze, wie sie üblicherwei­ se in der Elektronenmikroskopie verwendet werden, werden auf den Film aufgebracht. Der Film wird dann mit einem Stück ei­ ner Parafilm M-Folie (Hersteller: American Can Corp.) auf­ genommen, und die Netze werden lichtmikroskopisch untersucht. Bei den nach der Kritischpunkt-Methode getrockneten Präpara­ ten kann der Film oder Filmteile relativ leicht mit einer feinen Uhrmacherpinzette, einem Haar oder einem anderen fei­ nen Instrument vom Trägermaterial abgezogen werden. Zur Iden­ tifizierung einzelner Zellen werden bei diesen Präparaten vorzugsweise Sandwich-Netze verwendet, weil die Buchstaben­ netze auf den Kritischpunkt-getrockneten Filmen nicht beson­ ders gut haften.

E) Mikroskopie

Die so präparierten ganzen Zellen wurden untersucht und ab­ gebildet, und zwar zunächst in einem Zeiss-Photomikroskop II, danach in einem Philips-Transmissionselektronenmikroskop vom Typ 400T (Arbeitsspannung 100-120 kV) und anschließend in einem Philips-Rasterelektronenmikroskop PSEM 500 (Ar­ beitsspannung 25 kV).

Das Ausführungsbeispiel hat gezeigt, daß das erfindungsge­ mäße Verfahren und der erfindungsgemäße Träger hervorragend geeignet sind, um Zellen auf ein und demselben Substrat zu­ nächst zu kultivieren, anschließend zu fixieren und gegebe­ nenfalls zu entwässern und/oder zu trocknen und dann nach­ einander sowohl lichtmikroskopisch als auch transmissions- und rasterelektronenmikroskopisch zu untersuchen und abzu­ bilden, wobei in einem bisher nicht bekannten Maße die na­ tive Topographie und die native äußere und innere Struktur der lebenden Zelle erhalten bleibt. Dieser überraschende Ef­ fekt tritt besonders deutlich dann zutage, wenn als Zellkul­ tursubstrat ein Hexamethylolmelaminether-Film verwendet wird und diese Verwendung kombiniert wird mit der Verwendung von Aldehyden, insbesondere von Glutaraldehyd, zur Fixierung der kultivierten Zellen. Die bewirkte Stabilisierung der nativen Zellstrukturen ist auch deshalb überraschend, weil man er­ wartet hätte, daß die chemischen und physikalischen Wechsel­ wirkungen zwischen den terminalen Aminogruppen des Melamin­ harzfilms und den funktionellen Gruppen der Proteine der Zellplasmamembranen, insbesondere bei zusätzlicher Vernet­ zung dieser funktionellen Gruppen mit Aldehyden, zu einer Veränderung der nativen Strukturen der lebenden Zelle, nicht aber zu deren Stabilisierung und Erhaltung führen würde.

Selbstverständlich ist die Erfindung nicht auf das vorste­ hende Ausführungsbeispiel beschränkt. Vielmehr umfaßt die Erfindung auch alle modifizierten und äquivalenten Ausfüh­ rungsformen im Rahmen der nachfolgenden Patentansprüche. Die Anwendung der Erfindung ist nicht auf die Kultur bzw. Abbil­ dung bestimmter Zellen wie etwa der beispielhaft aufgeführ­ ten Herzmuskelzellen oder der ebenfalls erfolgreich geteste­ ten Ratten-Fibroblasten beschränkt; vielmehr ist die Erfin­ dung in dieser Hinsicht auf Zellen jeder Art und jeden Ur­ sprungs anwendbar.

Claims (23)

1. Verfahren zur Kultivierung von Zellen, insbesondere für deren licht- und elektronenmikroskopische Untersuchung, bei dem man lebende Zellen auf einer dünnen Schicht aus licht- und elektronendurchlässigem Kunstharz, welches auf ein Trä­ germaterial aufgebracht worden ist, kultiviert, dadurch ge­ kennzeichnet, daß man auf dem gegebenenfalls zuvor sterili­ sierten Trägermaterial mindestens einseitig einen licht- und elektronendurchlässigen Film aus Melaminharz bildet und an­ schließend die zu kultivierenden Zellen unter sterilen Be­ dingungen auf den Film aufträgt, die auf dem Film befindli­ chen Zellen mitsamt dem Träger unter Zugabe eines für die Zellen geeigneten Nährmediums inkubiert und danach gegebe­ nenfalls für die mikroskopische Untersuchung fixiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man auf dem Trägermaterial einen Film aus mindestens teil­ weise vernetztem Hexamethylolmelaminether bildet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich­ net, daß der Film in einer Dicke von weniger als 150 nm auf dem Trägermaterial gebildet wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch ge­ kennzeichnet, daß der Film in Form einer Gießfolie auf das Trägermaterial aufgebracht oder auf dem Trägermaterial ge­ bildet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeich­ net, daß der Film durch Eintauchen des gegebenenfalls zuvor sterilisierten Trägermaterials in eine Lösung von 1 Gew.-% Hexamethylolmelaminether und 0,3 Gew.-% p-Toluolsulfonsäure in Ethanol und anschließende Wärmebehandlung gebildet wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Wärmebehandlung des Films bei einer Temperatur und während eines Zeitraums erfolgt, die einer­ seits ausreichen, um das Melaminharz zu vernetzen, anderer­ seits aber das Trägermaterial nicht beeinträchtigen.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch ge­ kennzeichnet, daß als Trägermaterial Platten, Streifen, Stä­ be, Fasern oder Folien aus Glas oder Kunststoff verwendet werden.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch ge­ kennzeichnet, daß der Melaminharzfilm mit Reagenzien getränkt wird, die das Wachstum der zu kultivierenden Zellen fördern.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Melaminharzfilm mit Bindegewebskomponenten wie Kollagen, Laminin und/oder Vimentin getränkt wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Zellen nach der Inkubation unter Ver­ wendung von Glutaraldehyd fixiert werden.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die fixierten Zellen anschließend entwässert und/oder ge­ trocknet werden.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die entwässerten Zellen mit einem härtbaren Infiltrations­ mittel infiltriert und nach dessen Aushärtung gegebenenfalls in ein Gießharz eingebettet werden.

13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die fixierten ganzen Zellen nach der Entwässerung und/oder Trocknung zunächst lichtmikroskopisch untersucht werden und daß anschließend der die Zellen aufweisende Film mittels verdünnter wäßriger Flußsäurelösung vom Trägermaterial abge­ löst wird, die Flußsäurelösung durch Wasser verdrängt wird, und die auf dem abgelösten, mit Wasser gewaschenen Film be­ findlichen ganzen Zellen elektronenmikroskopisch untersucht werden.

14. Träger für die Kultivierung und für die licht- und elektronenmikroskopische Untersuchung von Zellen, bestehend aus einem mindestens teilweise mit einer dünnen Schicht aus licht- und elektronendurchlässigem Kunstharz beschichteten Trägermaterial, dadurch gekennzeichnet, daß die Kunstharz­ schicht ein licht- und elektronendurchlässiger Film aus ei­ nem Melaminharz ist.

15. Träger nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Melaminharz aus mindestens teilweise vernetztem Hexa­ methylolmelaminether besteht.

16. Träger nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeich­ net, daß der Film eine Dicke von weniger als 150 nm aufweist.

17. Träger nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Film eine Dicke von etwa 80 nm aufweist.

18. Träger nach einem der Ansprüche 14 bis 17, dadurch ge­ kennzeichnet, daß der Film durch Eintauchen des gegebenen­ falls zuvor sterilisierten Trägermaterials in eine Lösung von 1 Gew.-% Hexamethylolmelaminether und 0,3 Gew.-% p-Tolu­ olsulfonsäure in Ethanol und anschließende Wärmebehandlung gebildet ist.

19. Träger nach einem der Ansprüche 14 bis 18, dadurch ge­ kennzeichnet, daß das Trägermaterial in bezug auf das Mela­ minharz und die Zellen inert ist und die Form von Platten, Streifen, Stäben, Fasern oder Folien aufweist.

20. Träger nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägermaterial aus Glas oder Kunststoff besteht.

21. Träger nach einem der Ansprüche 14 bis 20, dadurch ge­ kennzeichnet, daß der Melaminharzfilm mit Reagenzien getränkt ist, die das Wachstum der zu kultivierenden Zellen fördern.

22. Träger nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß der Melaminharzfilm mit Bindegewebskomponenten wie Kollagen, Laminin und/oder Vimentin getränkt ist.

23. Testsatz (Kit) für die Kultivierung und für die licht- und elektronenmikroskopische Untersuchung von Zellen, umfas­ send mindestens einen, je einzeln steril verpackten sterili­ sierten Träger gemäß einem der Ansprüche 14 bis 22, ein ge­ sondert verpacktes, für die Kultivierung der zu untersuchen­ den Zellen auf dem Träger geeignetes, steriles, flüssiges Nährmedium sowie gegebenenfalls weitere, gesondert verpackte, sterilisierte Reagenzien zur Durchführung des Verfahrens ge­ mäß einem der Ansprüche 1 bis 13.