DE3878991T2

DE3878991T2 - Peptide boronsaeure-hemmungsstoffe von trypsintyp-proteasen.

Info

Publication number: DE3878991T2
Application number: DE8888108817T
Authority: DE
Inventors: Charles Adrian Kettner; Ashokkumar Bhikkappa Shenvi
Original assignee: DuPont Merck Pharmaceutical Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Pharma Co
Priority date: 1987-06-05
Filing date: 1988-06-01
Publication date: 1993-07-15
Anticipated expiration: 2008-06-02
Also published as: IE881666L; EP0293881A3; FI882638A0; JPH0730090B2; KR890000514A; FI97297C; FI882638A; ES2046237T3; AU623592B2; KR910003619B1; EP0293881A2; PT87652A; CA1328332C; DK304488A; EP0293881B1; DE3878991D1; HUT49629A; PT87652B; AU1733288A; NO882472D0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein C-terminale α-Aminoboronsäure-Derivate von Lysin, Ornithin und Arginin, Homoarginin sowie die entsprechenden Isothiouronium-Analoga derselben und ihre Verwendung als Inhibitor Trypsin-artiger Serin-Proteasen wie etwa Thrombin, Plasma-Kallikrein und Plasmin.
Die Wirksamkeit vieler biologischer Systeme wird vermittelt durch hydrolytische oder proteolytische Enzyme, die Vorläufer-Proteine an bestimmten Stellen spalten. Es gibt vier Klassen solcher Enzyme, Metallo-, Thiol-, Säure- und Serinproteasen. Systeme wie etwa die Blutgerinnung, Fibrinolyse, Komplement und Kallikrein-Kinin werden alle durch eine Unterklasse von Serinproteasen, den Trypsin-artigen Proteasen, reguliert - eine Gruppe von Enzymen, die eine Primärspezifität für Arginyl- oder Lysyl-Reste aufweisen.
Innerhalb einer jeden Klasse sind Wirkmechanismus und Enzym- Reste der aktiven Zentren wie auch ihre Anfälligkeit gegenüber klassenspezifischen Inhibitoren ähnlich. Allerdings ist die Fähigkeit einer Verbindung, eine spezielle Protease oder eine spezielle Untergruppe von Proteasen wirksam zu hemmen, in hohem Maße von Struktur und Zusammensetzung der Verbindung abhängig.
Es wurde viel Forschung auf dem Gebiet der Protease-Hemmung geleistet, und eine Reihe von Forschern auf diesem Gebiet stellten Versuche mit Bor-haltigen Inhibitoren an.
Beispielsweise berichtet Shenvi, US 4 537 773 (1985), daß α-Aminoboronsäure-Analoga von Aminosäuren, die aliphatische und aromatische Alkyl-Seitenketten enthalten, wirksame Inhibitoren für Metalloenzyme sind. Dazu offenbaren Shenvi et al., US 4 499 082 (1985), daß in Peptide eingebaute α-Aminoboronsäuren Serinproteasen hemmen, deren Anforderungen an die Primärspezifität durch neutrale Seitenketten erfüllt werden wie etwa Pankreas- und Leukocyten-Elastase, Chymotrypsin und Cathepsin G. Dieses letztere Patent offenbart Tetrapeptide, umfassend C-terminale α-Aminoboronsäure- Reste als potente, reversible Inhibitoren derartiger proteolytischer Enzyme. Zu den offenbarten Peptiden gehören jedoch nicht C-terminale α-Aminoboronsäure-Reste von Lysin, Ornithin, Arginin, Homoarginin oder irgendeines der entsprechenden Isothiouronium-Salze.
Koehler et al., Biochemistry 10: 2477 (1971) berichten, daß 2-Phenylethanboronsäure ein Inhibitor für Chymotrypsin ist. Matteson et al., J.Am.Chem.Soc. 103: 5241 (1981), beschreiben die Synthese von (R)-1-Acetamido-2-phenylethanboronsäure und deren Verwendung als Chymotrypsin-Inhibitor Die Autoren geben einen Ki von 4 uM an.
In "Enzyme Inhibitors as Drugs", Sandler (Hrsg.), University Park Press, Baltimore, 1980, S. 43-51, spekuliert Lienhard, daß Peptid-Analoga von α-Aminoboronsäure potente Inhibitoren für Serin- und Thiol-Proteasen sind.
Zu den weiteren Offenbarungen gehören die von Kinder et al., J.Med.Chem. 28, 1917-1925 (1985), worin N-Acyl- und Dipeptidboronsäuren und Difluorboran-Analoga von Phenylalanin, Phenylglycin, Alanin, Valin und Isoleucin beschrieben sind, sowie Matteson, Organometallics 3, 1284-1288 (1984), worin die Synthese von α-Amido-γ-substituierten Boronsäureestern beschrieben ist. Letztere Autoren stellen fest, daß diese Verbindungen hergestellt wurden als mögliche Vorläufer für Boronsäure-Analoga von Arginin und Prolin.
Trypsin-ähnliche Proteasen sind außerordentlich wichtig bei der Regulierung einer Reihe physiologischer Vorgänge. Eine Erörterung derartiger Wirkungen findet sich in "Proteases and Biological Control", Reich, Rifkin und Shaw (Hrsg.), Cold Spring Harbor Press (1975). Thrombin, eine Art Trypsinähnliche Protease, spielt eine klare und entscheidende Rolle beim Vorgang der Blutgerinnung. Die Blutgerinnung kann aufgrund einer von zwei Zymogen-Aktivierungskaskaden eintreten. Die jeweils letzte Protease bei diesen Abläufen ist Thrombin, welches so wirkt, daß Fibrinogen unter Bildung von Fibrin hydrolysiert wird, welches wiederum aggregiert unter Bildung eines Blutgerinnsels. Diese Thrombin-katalysierte Hydrolyse ist wesentlich für den Vorgang der Blutgerinnung.
Plasma-Kallikrein, eine weitere Trypsin-ähnliche Protease, ist ebenfalls am Vorgang der Blutgerinnung beteiligt, insbesondere bei der Einleitung eines der Abläufe der Blutgerinnung. Kallikrein wirkt auch auf Kininogen, so daß das Nonapeptid Bradykinin freigesetzt wird. Bradykinin ist ein hypotensives Peptid, das mit dem Schmerz in Verbindung steht. Des weiteren wird angenommen, daß Kallikrein weitere biologische Funktionen besitzt. Neuere Informationen legen nahe, daß Plasma-Kallikrein bei Entzündungen beteiligt ist. Beispielsweise berichten Baumgarten et al., J.Immun. 137, 977-982 (1986), über erhöhte Kinin- und Kallikrein-Spiegel bei Allergikern, die einem Allergen ausgesetzt werden. Wachtfogel et al., Blood 67, 1731-1737 (1986), berichten, daß Plasma-Kallikrein Human-Neutrophile aggregiert und Neutrophil-Elastase freisetzt. Die Freisetzung von Elastase und die damit einhergehende, durch Elastase mittelbar bewirkte Gewebezerstörung sind Ereignisse, die mit dem Entzündungsvorgang in Zusammenhang stehen.
Das Entwerfen spezieller Inhibitoren für Trypsin-ähnliche Enzyme zur Kontrolle biologischer Vorgänge ist kein neuer Gedanke. Es wurden besondere Anstrengungen unternommen bei der Herstellung von Thrombin-Hemmern zur Ersetzung von Heparin bei der Behandlung von Thrombose ohne die mit der Heparin-Therapie verbundenen Nebenwirkungen, siehe Markwardt, TIPS 153-157 (1980), und Green et al., Thromb.Res. 37, 145-153 (1985). Für eine Reihe von Trypsin-ähnlichen Proteasen wurden hochwirksame Peptidchlormethylketone von Kettner et al., Methods in Enzymology 80, 826-842 (1981), hergestellt. Das eine Beispiel, H-(D)Phe-Pro-ArgCH&sub2;Cl, ist hochwirksam bei der Hemmung von Thrombin (Ki = 37 nM), und ist, wie von Shaw et al., US 4 318 904 (1982), gezeigt wurde, wirksam bei der Verhütung von Koronarthrombose am Modell des Kaninchens. Desgleichen berichten Bajusz et al., Int.J.Peptide Protein Res. 12, 217-221 (1979), daß der Peptidaldehyd H-(D)Phe-Pro-Arg-H ein wirksamer Thrombin- Hemmer ist (Ki = 75 nM), und Tremoli et al., Thromb.Res. 23, 549-553 (1981), berichten, daß eine verwandte Verbindung, Boc-(D)Phe-Pro-Arg-H, die Größe venöser Thrombosen bei Ratten verringert.
Es wurde auch gezeigt, daß substituierte Argininamide, zusammengesetzt aus sekundären Aminen, wirksame Thrombin- Hemmer sind. Kikumoto et al., Biochemistry 23, 85-90 (1984), berichten, daß (2R,4R)-4-Methyl-1-[N²-{(3-methyl-1,2,3,4- tetrahydro-8-chinolinyl)sulfonyl)-L-arginyl]-2-piperidincarbonsäure ein Thrombin-Hemmer ist (Ki = 19 nM). Wie von Green et al. berichtet, Thromb.Res. 37, 145-153 (1985) erhöht dieser Inhibitor bei 1 uM die Plasma-Prothrombinzeiten bei in vitro-Blutgerinnungstests um das Zweifache, und er wird als Fibrinolyse förderndes Mittel beansprucht, das in Kombination mit Gewebe-Plasminogenaktivator zu verwenden ist, Yoshikuni et al., EP-Anmeldung 0 181 267 (1986). Schließlich berichten Sturzebecher et al., Thromb.Res. 29, 635-642 (1983) und Kaiser et al., Thromb.Res. 43, 613-620 (1986), daß N-α- (2-Naphthylsulfonylglycyl)-4-amidinophenylalaninpiperidid der wirksamste bekannte Thrombin-Hemmer ist (Ki = 6 nM), und zeigen, daß er in vivo bei Maus und Ratte wirksam ist.
Trotz des Vorhergehenden werden neue und bessere Klassen von Inhibitoren für Thrombin und andere Trypsin-ähnliche Enzyme benötigt, um potentiell wertvolle Therapeutika zur Behandlung von Blutgerinnungsstörungen, Entzündungen und anderen Krankheiten bei Säugern bereitzustellen, worauf die vorliegende Erfindung abzielt.

KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung macht Verbindungen der Formel (Formel I)
zugänglich, worin
Y¹ und Y² unabhängig voneinander -OH oder F sind oder zusammengenommen eine Einheit bilden, die von einer Dihydroxy- Verbindung mit wenigstens zwei Hydroxy-Gruppen abgeleitet ist, die durch wenigstens zwei verbindende Atome in einer Kette oder einem Ring getrennt sind, wobei die Kette oder der Ring bis zu 20 Kohlenstoff-Atome und gegebenenfalls ein Hetero-Atom umfaßt, das N, S oder O sein kann;
R² ein substituiertes Alkyl ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -(CH&sub2;)z-X, -CH(CH&sub3;)-(CH&sub2;)&sub2;-X, -CH&sub2;-CH(CH&sub3;)-CH&sub2;-X, -(CH&sub2;)&sub2;-CH(CH&sub3;)-X und -(CH&sub2;)&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-X, worin X -NH&sub2;, -NH-C(NH)-NH&sub2; oder -S-C(NH)-NH&sub2; ist, und z 3 bis 5 ist;
n, o, p und q unabhängig voneinander 1 oder 0 sind;
A¹, A² und A³ unabhängig Aminosäuren der L- oder D-Konfiguration sind, die aus der aus Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr und Val bestehenden Gruppe ausgewählt sind; und
R¹ ein Peptid, umfassend 1 bis 20 Aminosäuren, eine Acyl- oder eine Sulfonyl-Gruppe, umfassend 1 bis 20 Kohlenstoff- Atome, H oder eine N-terminale Schutzgruppe ist; oder ein physiologisch annehmbares Salz derselben.
Die Erfindung stellt auch Zusammensetzungen bereit, die eine oder mehrere der vorstehenden Verbindungen der Formel I umfassen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen oder Zusammensetzungen sind vorteilhaft zur Hemmung von Trypsin-ähnlichen Serin- Proteasen wie etwa Thrombin und Plasma-Kallikrein, sowie zur Behandlung anomaler physiologischer Zustände wie etwa solchen, an denen Blutgerinnungsstörungen und Entzündungen beteiligt sind, die durch Trypsin-ähnliche Proteasen mittelbar bewirkt werden.
Des weiteren werden zwei Klassen von Zwischenprodukten für die vorstehenden Verbindungen bereitgestellt. Zu der ersten Klasse von Zwischenprodukten gehören Verbindungen der Formel (Formel II)
worin
Y³ eine Einheit ist, die von einer Dihydroxy-Verbindung mit wenigstens zwei Hydroxy-Gruppen abgeleitet ist, die durch wenigstens zwei verbindende Atome in einer Kette oder einem Ring getrennt sind, wobei die Kette oder der Ring bis zu 20 Kohlenstoff-Atome umfaßt;
R³ ein substituiertes Alkyl ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -(CH&sub2;)z-W¹, -CH(CH&sub3;)-(CH&sub2;)&sub2;-W¹, -CH&sub2;-CH(CH&sub3;)-CH&sub2;-W¹, -(CH&sub2;)&sub2;-CH(CH&sub3;)-W¹ und -(CH&sub2;)&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-W¹;
W und W¹ unabhängig voneinander Cl oder Br sind; und
z 3 bis 5 ist.
Zu der zweiten Klasse von Zwischenprodukten gehören Verbindungen der Formel (Formel III)
worin
A¹, A², A³, Y³, R¹, n, o, p und q wie vorstehend definiert sind;
R&sup4; ein substituiertes Alkyl ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -(CH&sub2;)z-W², -CH(CH&sub3;)-(CH&sub2;)&sub2;-W², -CH&sub2;-CH(CH&sub3;)-CH&sub2;-W², -(CH&sub2;)&sub2;-CH(CH&sub3;)-W² und -(CH&sub2;)&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-W²;
W² Cl, Br oder N&sub3; ist; und
z 3 bis 5 ist.
Abbildung 1 zeigt ein Diagramm der relativen Gerinnungszeiten gegen die Inhibitorkonzentration für zwei erfindungsgemäße Inhibitoren, H-(D)Phe-Pro-BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; und Boc-(D)Phe-Phe-BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6;. Die Daten für Abbildung 1 wurden aus den Tabellen 3 und 4 erhalten. Die relative Gerinnungszeit ergibt sich aus den aktivierten Partial- Thromboplastinzeiten (APTT) oder den Prothrombinzeiten (PT), je nach Fall, in Gegenwart von Inhibitor dividiert durch APTT bzw. durch PT in Abwesenheit von Inhibitor. Die Inhibitorkonzentration ist in uM gezeigt.
Die Hauptverbindungen der vorliegenden Erfindung, Verbindungen der Formel I, sind N-Acyl- und Peptid-Derivate von α-Aminoboronsäuren, worin der C-terminale Rest aus Lysin, Ornithin und Arginin, Homoarginin und entsprechenden Isothiouronium-Analoga derselben besteht. Diese Verbindungen sind gekennzeichnet durch ihre Wirkungsstärke als Inhibitoren bestimmter Trypsin-ähnlicher proteolytischer Enzyme, insbesondere Human-Thrombin, Plasma-Kallikrein und Plasmin.
Das saure terminale Bor der vorliegenden Verbindungen kann wahlweise in der Form einer ungeschützten Boronsäure sein, das heißt, worin Y¹ und Y² beide -OH sind, oder eines Borandifluorids, das heißt, worin Y¹ und Y² beide -F sind, oder Kombinationen derselben. Alternativ kann das terminale Bor mit einer breiten Vielfalt von Schutzgruppen geschützt sein, worin Y¹ und Y² zusammengenommen (-Y¹-Y²-) sind, um eine Einheit zu bilden.
Zu den geeigneten Schutzgruppen, worin Y¹ und Y² (-Y¹-Y²-) sind, gehören Einheiten, die von Verbindungen, hauptsächlich Diolen, abgeleitet sind, die wenigstens zwei Hydroxy-Gruppen aufweisen, die durch wenigstens zwei verbindende Atome in einer Kette oder einem Ring getrennt sind. Der Ausdruck Kette bezeichnet sowohl eine verzweigte als auch eine unverzweigte Einheit. Die Kette oder der Ring umfaßt bis zu 20 Kohlenstoff-Atome und kann gegebenenfalls ein Heteroatom einschließen, das N, S oder O sein kann.
Zu den Verbindungen, die im Rahmen der voraufgegangenen Beschreibung in Betracht zu ziehen sind, gehören beispielsweise Pinandiol, Pinakol, Perfluorpinakol, Ethylenglycol, Diethylenglycol, Catechin, 1,2-Cyclohexandiol, 1,3-Propandiol, 2,3-Butandiol, 1,2-Butandiol, 1,4-Butandiol, Glycerin, Diethanolamin und andere Aminoalkohole und andere Äquivalente, die dem Fachmann bekannt sind.
In der Beschreibung werden durchgängig die folgenden Abkürzungen für Aminosäure-Reste oder Aminosäuren verwendet:
Ala = L-Alanin
Arg = L-Arginin
Asn = L-Asparagin
Asp = L-Asparaginsäure
Cys = L-Cystein
Gln = L-Glutamin
Glu = L-Glutaminsäure
Gly = Glycin
His = L-Histidin
Ile = L-Isoleucin
Leu = L-Leucin
Lys = L-Lysin
Met = L-Methionin
Phe = L-Phenylalanin
Pro = L-Prolin
Ser = L-Serin
Thr = L-Threonin
Trp = L-Tryptophan
Tyr = L-Tyrosin
Val = L-Valin
Mit der vorangestellten Bezeichnung "D" geben die obigen Abkürzungen eine Aminosäure der D-Konfiguration an. Mit der vorangestellten Bezeichnung "D oder L" geben die obigen Abkürzungen an, daß die Aminosäure entweder D- oder L-Konfiguration aufweisen kann.
Der Ausdruck "N-terminale Schutzgruppe", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf verschiedenartige Aminoterminale Schutzgruppen, die in der Peptid-Synthese eingesetzt werden. Zu den Beispielen für geeignete Gruppen zählen Acyl-Schutzgruppen, zum Beispiel Formyl, Acetyl (Ac), Benzoyl (Bz), Trifluoracetyl und Methoxysuccinyl (MeOsuc); aromatische, Urethan schützende Gruppen, zum Beispiel Benzyloxycarbonyl (Z); und aliphatische, Urethan schützende Gruppen, zum Beispiel tert-Butoxycarbonyl (Boc) oder Adamantyloxycarbonyl. Gross und Mienhofer (Hrsg.), "The Peptides", Band 3, 3-88 (1981), Academic Press, New York, 1981, offenbaren zahlreiche geeignete Amin-Schutzgruppen.
Die folgenden bezeichnen bevorzugte N-terminale Schutzgruppen R¹:
Verbindungen dieser Erfindung mit Seitenketten-Amino-Gruppen, beispielsweise, in denen A¹, A² oder A³ Lys oder Arg sind, können gegebenenfalls geeignete N-terminale Schutzgruppen enthalten, die an die Seitenketten gebunden sind; in ähnlicher Weise können Aminosäure-Reste, die saure oder Hydroxy-Seitenketten besitzen, in Form von t-Butyl, Benzyl- oder anderen geeigneten Estern oder Ethern geschützt sein.
Wie bereits zuvor vermerkt, bezieht sich R² auf eine Alkyl- Gruppe, umfassend 3 bis 5 Kohlenstoff-Atome, die mit einer Amino-, Guanidino- oder Isothiouronium-Gruppe verknüpft ist. Vorzugsweise ist R² (CH&sub2;)z-X Ein stärker bevorzugter Wert für R² ist (CH&sub2;)z-X, worin z 3 bis 4 ist. Zu den Beispielen für stärker bevorzugte Werte für R² gehören 3-Guanidinopropyl, 3-Aminopropyl und 4-Aminobutyl. Meistbevorzugt ist 3-Guanidinopropyl.
Abkürzungen und Begriffe, denen "Boro-" vorangestellt ist, bezeichnen Aminosäuren der Formel I, in denen die endständige Carboxyl-Gruppe -CO&sub2;H ersetzt ist durch eine Boron-Funktionalität
So bezeichnet "Boroarginin" oder "BoroArg-" Boronsäure- Analoga von Arginin; "Borolysin" oder "BoroLys" bezeichnet Boronsäure-Analoga von Lysin; und "Boroornithin" oder "Boroorn" bezeichnet Boronsäure-Analoga von Ornithin. Das Präfix "Homo" wie in "Homoboroarginin" oder "HomoBoroArg-" bezeichnet Boroarginin-Analoga, in denen die Seitenkette eine zusätzliche Methylen-Gruppe aufweist. "Irg" bezeichnet das Isothiouronium-Analogon von Arginin oder Homoarginin, worin die Thiouronium-Gruppe, -S-C(NH)NH&sub2;, die Guanidino- Gruppe, -NH-C(NH)-NH&sub2;, ersetzt, und "BoroIrg-" oder "BorohomoIrg-" ist die Abkürzung für das entsprechende Boronsäure-Analogon.
Bei der Benennung der erfindungsgemäßen Verbindungen werden Y¹ und Y² bei Difluorboranen (Y¹ = Y² = -F) durch das Suffix "-F" vereinfacht, bei den ungeschützten Boronsäuren (Y¹ = Y² = -OH) durch "-OH", bei den Pinakolestern (Y¹ und Y² sind zusammengenommen -C&sub6;H&sub1;&sub2;) durch "-C&sub6;H&sub1;&sub2;", und bei den Pinandiolestern (Y¹ und Y² sind zusammengenommen -C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6;) durch "-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6;".
Bei der vorliegenden Erfindung werden auch physiologisch annehmbare Salze der Formel I in Betracht gezogen. Zu diesen Salzen gehören Säueadditionssalze, zum Beispiel Salze von Benzolsulfonsäure (BSA), Salzsäure (HCl), Bromwasserstoffsäure (HBr), Essigsäure, Trifluoressigsäure (TFA), Bernsteinsäure, Citronensäure oder andere geeignete Säureadditionssalze. Bei der Benennung der erfindungsgemäßen Verbindungen werden diese Salze durch ein " " in den Verbindungsnamen eingeführt.
Zu den in Betracht gezogenen Verbindungsklassen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung gehören die folgenden Aminosäuren mit D- oder L-Konfiguration. Zu einer ersten Klasse gehören Verbindungen, worin A¹ Ala, Pro, Gly, Val, Leu, Ile oder Met ist, das heißt, Aminosäuren mit neutraler Seitenkette. Zu einer zweiten Klasse gehören Verbindungen, worin A¹ Phe, Trp oder Tyr ist, das heißt, Aminosäuren mit aromatischer Seitenkette. Zu einer dritten Klasse gehören Verbindungen, worin A¹ Lys oder Arg ist, das heißt, basische Aminosäuren, und zu einer vierten Klasse gehören Verbindungen, worin A¹ Ser oder Thr ist, das heißt, Aminosäuren mit einer Hydroxy-Seitenkette. Zu einer fünften Klasse gehören schließlich Verbindungen, worin A¹ Asp, Glu, Asn oder Gln ist, das heißt, Aminosäuren mit einer sauren oder einer Carboxamido-Seitenkette. Zu den bevorzugten Werten für A¹-Substituenten gehören Lys, Phe, Pro, Ala, Leu, Gly, Glu, Val, Thr, Ile, Met, Tyr, Trp, Arg, Asp, Asn und Gln. Zu einer bevorzugten Klasse dieser Substituenten gehören Lys, Phe, Pro, Ala, Leu, Gly, Glu, Val und Thr.
Zu den vorstehenden Hauptklassen gehören Unterklassen, entsprechend den bevorzugten Werten für R , und diese Unterklassen sind des weiteren unterteilt in Gruppen, die durch bevorzugte Werte für A² und für die N-terminale Schutzgruppe R¹ definiert sind.
Zu den bevorzugten Werten für A² gehören alle Aminosäuren mit D-Konfiguration, meistbevorzugt (D)Phe. Weitere bevorzugte Werte für A² sind (D oder L)Phe, (D oder L)Ala, (D oder L)Leu, (D oder L)Pro, (D oder L)Glu und (D oder L)Gly. Zu einer weiteren Klasse von A²-Substituenten gehören (L)Glu und (D)Val.
Vorzugsweise weisen die Verbindungen der Formel I insgesamt zwei bei vier Aminosäure-Substituenten auf, einschließlich des Boroaminosäure-Analogons. Eine Verbindung mit drei Aminosäuren, die Pro in der Position A¹ und Boro-Arg als Boroaminosäure-Analogon aufweist, wie etwa
ist mit einer IC&sub5;&sub0; von deutlich unter 5 nM besonders als Thrombin-Hemmer geeignet.
Bei A¹, A², A³ kann es sich auch um die weniger gängigen oder modifizierten Aminosäuren Norleucin, Hydroxyprolin und Pyroglutaminsäure handeln.
Bei A¹, A² oder A³ kann es sich auch um Aminosäure-Reste handeln, worin funktionelle Gruppen in den Seitenketten durch geeignete Ester oder Ether geschützt sind.
Zu den speziellen Verbindungen im Rahmen der vorliegenden Erfindung, die nach den oben beschriebenen Konventionen benannt sind, zählen die nachstehenden Beispiele:
Die Erfindung stellt auch Zusammensetzungen zur Hemmung von Trypsin-ähnlichen Serin-Proteasen bereit - einschließlich Thrombin, Plasma-Kallikrein und Plasmin, aber nicht beschränkt darauf - sowie zur Behandlung anomaler physiologischer Zustände, einschließlich Blutgerinnung und Entzündungen bei Säugern, aber nicht beschränkt darauf. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen eine wirksame Menge einer Verbindung der Formel I und einen physiologisch annehmbaren Träger oder ein physiologisch annehmbares Verdünnungsmittel. Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens können die Verbindungen oder Zusammensetzungen alleine für sich oder in Kombination miteinander oder in Kombination mit anderen Therapeutika verwendet werden. Sie können oral, parenteral, intravenös, subkutan, intramuskulär, über das Kolon, rektal, nasal oder intraperitoneal in einer Vielzahl von Dosierformen verabreicht werden. Die vorteilhafte zu verabreichende Dosis und die Art der Verabreichung richten sich nach Alter, Gewicht und behandeltem Säuger sowie den im einzelnen eingesetzten Verbindungen. Typischerweise wird die Therapie mit niedrigerem Dosierungsniveau begonnen, wobei die Dosierung erhöht wird, bis die gewünschte Wirkung erzielt ist.
Die vorliegende Erfindung zieht des weiteren zwei Klassen kritischer Zwischenprodukte zu Verbindungen der Formel I, d.h., die Verbindungen der Formeln II und III in Betracht. Zu den Zwischenprodukte der Formel II gehören Verbindungen der Formel (Formel II)
worin
Y³ eine Einheit ist, die von einer Dihydroxy-Verbindung mit wenigstens zwei Hydroxy-Gruppen abgeleitet ist, die durch wenigstens zwei verbindende Atome in einer Kette oder einem Ring getrennt sind, wobei die Kette oder der Ring bis zu 20 Kohlenstoff-Atome umfaßt;
R³ ein substituiertes Alkyl ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (CH&sub2;)z-W¹, -CH(CH&sub3;)-(CH&sub2;)&sub2;-W¹, -CH&sub2;-CH(CH&sub3;)-CH&sub2;-W¹, -(CH&sub2;)&sub2;-CH(CH&sub3;)-W¹ und -(CH&sub2;)&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-W¹;
W und W¹ unabhängig voneinander Cl oder Br sind; und z 3 bis 5 ist.
Eine besonders bevorzugte Verbindung der Formel II ist eine, worin R³ -(CH&sub2;)z-W¹ ist und z 3 bis 4 ist.
Zu der zweiten Klasse von Zwischenprodukten gehören Verbindungen der Formel (Formel III)
worin
A¹, A², A³, Y³, R¹, n, o, p und q wie vorstehend definiert sind;
R&sup4; ein substituiertes Alkyl ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -(CH&sub2;)z-W², -CH(CH&sub3;)-(CH&sub2;)&sub2;-W², -CH&sub2;-CH(CH&sub3;)-CH&sub2;-W², -(CH&sub2;)&sub2;-CH(CH&sub3;)-W² und -(CH&sub2;)&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-W²;
W² Cl, Br oder N&sub3; ist; und
z 3 bis 5 ist.
In Betracht gezogene Verbindungsklassen im Rahmen von Formel III sind solche wie bei den analogen Verbindungen der Formel I beschrieben. Eine besonders bevorzugte Verbindung der Formel III ist eine, worin R&sup4; -(CH&sub2;)z-W² ist und z 3 bis 4 ist.

Herstellung der Inhibitoren

Temperaturen sind in ºC. Auf die numerierten Verbindungen, die in dem nachstehend dargestellten Schema mit dem Titel "Syntheseschema" gezeigt sind, wird im Text gemäß ihrer jeweiligen Nummer Bezug genommen. Wie hierin verwendet, bedeutet "NMR" protonenkernmagnetische Resonanz. SYNTHESESCHEMA Pinandiol Peptid Cyanamid Ethanol, 100ºC Ionenaustauscher Wäßrige HF Thioharnstoff
Nach den hierin aufgezeigten Methoden sind die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I mit hoher brauchbarer Reinheit erhältlich, das heißt, in 80-100% reiner Form.
Die Ausgangsmaterialien sind in hoher Reinheit von Chemikalienzulieferern erhältlich oder können mit Hilfe von fachweltbekannten Methoden leicht synthetisiert werden. Das Syntheseschema zeigt die allgemeine Reihenfolge, in der die erfindungsgemäßen Verbindungen synthetisiert wurden. Die Verbindungen 1-4 wurden hergestellt wie beschrieben von Matteson et al., Organometallics 3, 1284-1288 (1984), außer daß das Verfahren abgeändert wurde, um die Herstellung in großem Maßstab zu ermöglichen.
Die Verbindung 1 wird hergestellt durch Hydroborierung eines Alkenhalogenids mit Catechinboran. Die Komponenten werden in Tetrahydrofuran oder einem anderen inerten Lösungsmittel erhitzt, und das Produkt wird durch Destillation isoliert. Der halogensubstituierte Alkylboronsäurecatechinester wird umgeestert indem er mit einem geeigneten Diol (α-Pinandiol, Pinakol, 2,3-Butandiol etc.) in Tetrahydrofuran umgesetzt wird. (+)-α-Pinandiol ist bevorzugt im Hinblick auf die Beobachtungen bei Matteson et al., J.Am.Chem.Soc. 103, 5241 (1981), daß sterische Beschränkungen im Molekül die stereospezifische Addition der Gruppe -CHCl- bei der Bildung der Verbindung 3 und die nachfolgende Einführung einer Amino-Gruppe mit der "L"-Konfiguration erlauben. Die Strukturen 3-9 im Syntheseschema sind mit der Pinandiol-Schutzgruppe gezeigt. Bei der Herstellung im großen Maßstab wird die Abtrennung von Catechin, einem Produkt der Veresterungsreaktion, durch Kristallisieren aus Hexan erreicht - einem Lösungsmittel, worin Catechin nur begrenzt löslich ist. Die Verbindung 2 wird dann entweder durch Chromatographie an Kieselgel oder durch Destillation gereinigt oder wird ohne weitere Reinigung verwendet. Die Verbindung 2 wird durch Abtrennen des Lösungsmittels als Pinandiolester mit nahezu analytischer Reinheit erhalten. Eine weitere Reinigung kann durch Chromatographie an Kieselgel erreicht werden. Beim Pinakolester der Verbindung 2 wird die Endreinigung durch Destillieren bevorzugt.
Die Verbindung 3 wird hergestellt durch Homologisierung von 2 mit CHCl&sub2;&supmin;Li&spplus;. Dieses Reagens wird hergestellt durch Behandeln von Methylenchlorid mit n-Butyllithium in Tetrahydrofuran bei -100º. Verbindung 2 wird bei -100º mit 0,65 Äquivalenten Zinkchlorid versetzt. Die Mischung wird langsam auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und wird über Nacht gerührt. Die Verbindung 3 wird erhalten nach Abdampfen des Lösungsmittels, anschließendes Lösen des Rückstands in Hexan, gefolgt von Waschen der organischen Phase mit Wasser, Trocknen derselben mit Magnesiumsulfat und schließlich Verdampfen des Hexans. Die Verbindung 3 wird ohne weitere Reinigung verwendet, wenn sie als Pinandiolester geschützt ist, und alternativ kann sie destilliert werden, wenn sie als Pinakolester geschützt ist.
Die Verbindung 4 wird hergestellt durch Behandeln des α-Chlor-substituierten Boronsäureesters, Verbindung 3, mit [(CH&sub3;)&sub3;Si]&sub2;N&supmin;Li&spplus;. Hexamethyldisilazan wird in Tetrahydrofuran gelöst, und bei -78º wird ein Äquivalent n-Butyllithium zugesetzt. Die Mischung wird auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und wird dann, nach abermaligem Abkühlen auf -78º, mit einem Äquivalent 3 in Tetrahydrofuran versetzt. Die Mischung wird langsam auf Raumtemperatur kommen und über Nacht rühren gelassen. Das α-Bis(trimethylsilan)geschützte Amin wird isoliert durch Verdampfen des Lösungsmittels und Zugabe von Hexan unter wasserfreien Bedingugen. Der unlösliche Rückstand wird durch Filtration unter einer Stickstoff-Schutzschicht entfernt, und man erhält eine Hexan-Lösung von Verbindung 4.
Die Verbindung 5 wird erhalten durch Kühlen der Hexan-Lösung von Verbindung 4 auf -78º und Versetzen mit drei Äquivalenten Chlorwasserstoff. Die Lösung wird langsam auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und wird 1,5-2 h lang gerührt. Die Verbindung 5 wird dann durch Filtrieren isoliert und wird weiter gereinigt durch Lösen in Chloroform und Abtrennen des unlöslichen Materials. Die Verbindung 5 wird durch Entfernen des Chloroforms durch Verdampfen und Kristallisieren des Rückstands aus Ethylacetat als weißer kristalliner Feststoff erhalten.
Das obige Verfahren der Überführung von Verbindung 3 in Verbindung 5 führt überraschenderweise zu analytisch reinen Präparaten von Verbindung 5, so daß sich dann Verbindung 6 ohne die Schwierigkeiten erhalten läßt, die normalerweise beim Verknüpfen von heterogenem Material angetroffen werden. Das Fachwissen lehrt oder legt sehr stark nahe, daß die Verbindung 4 vor der Überführung in die Verbindung 5 gereinigt werden muß, damit reine Proben erhalten werden. Das einzige bekannte Verfahren zur Herstellung reiner α-Aminoboronsäuren ist das in Shenvi, US 4 537 773, offenbarte und in Shenvi et al., US 4 499 082, verwendete. In der Offenbarung von Shenvi et al. werden Verbindungen, die analog sind zu Verbindung 4, außer daß sie aromatische und Alkyl- Seitenketten aufweisen, durch Destillation gereinigt. Die Verbindung 4 ist im Hinblick auf die Destillation nach Shenvi et al. instabil, und es wird ein anderes Produkt erhalten.
Die Verbindung 6, die N-Acyl- oder N-Peptidyl-Form der Verbindung 5, läßt sich auf zwei verschiedenen Wegen herstellen. Der erste ist eine Abwandlung des von Matteson et al., Organometallics 3, 1284-1288 (1984) beschriebenen Verfahrens, bei dem Verbindung 4, hergestellt in situ (ohne Verdampfen des Lösungsmittels und Abtrennen der Salze durch Filtration), mit einem Äquivalent Essigsäure und einem Überschuß Acetanhydrid behandelt wird, um N-Acetyl-NH- CH[(CH&sub2;)&sub3;Br]BO&sub2;-pinandiol zu ergeben. Dieses Verfahren ist anwendbar auf das Verknüpfen des hochreaktiven Säurechlorids von N-Acetylphenylalanin (AC-Phe-Cl), mit der Abwandlung, daß die vorausgehende Behandlung mit Essigsäure wegfällt. Wird Essigsäure in Verbindung mit Ac-Phe-Cl zugesetzt, so werden außerordentlich niedrige Ausbeuten erhalten, die anscheinend zurückzuführen sind auf die Bildung eines gemischten Anhydrids von Ac-Phe und Essigsäure und der anschließend chemisch bevorzugten Verknüpfung, die zu N-Acetyl-NH-CH[(CH&sub2;)&sub3;Br]BO&sub2;-pinakol führt. Die Anwendung der Methode des gemischten Anhydrids bei der Herstellug der Verbindung 6 führte zu niedrigen Ausbeuten an gewünschtem Produkt und umfangreichen Problemen bei der Reinigung. So scheint es, daß diese Methode anwendbar ist auf das Verknüpfen von Alkyl-, Aryl- und N-geschützten Aminosäuren zu Verbindung 4 durch Anwenden der Säurechlorid-Methode. Allerdings sei vermerkt, daß Beschränkungen bestehen aufgrund der Erfordernisse der Säurechlorid-Verknüpfungsmethode. Erstens ist das Verfahren nicht ohne weiteres auf das Verknüpfen von Peptiden anwendbar, da Nebenreaktionen wie etwa Oxazolinon- Bildung seine Anwendung auf einen einzigen Aminosäure-Rest beschränken. Zweitens ist aufgrund des überschüssigen HCl, das bei der Bildung des Säurechlorids erzeugt wird, eine säurebeständige Schutzgruppe erforderlich. Schließlich ist eine Eigenart dieses Verfahrens die Racemisierung des Aminosäure-Rests.
Das zweite Verfahren zur Herstellung der Verbindung 6 ist das Verknüpfen einer Acyl-Gruppe oder eines N-geschützten Peptids mit einem geeigneten Seitenkettenschutz zu Verbindung 5. Dieses Verfahren ist dem ersten klar überlegen, da es hinreichend vielseitig ist, um die Synthese eines beliebigen Peptids innerhalb der Grenzen zu ermöglichen, die normalerweise bei Peptid-Synthesen angetroffen werden, wie z.B. ungenügende Löslichkeit. Es können Säurechloride oder andere aktive Formen von Acyl-Gruppen verknüpft werden. Bei Peptiden wird die Methode des gemischten Anhydrids von Anderson et al., J.Am.Chem.Soc. 89, 5012 (1967) bevorzugt. Das gemischte Anhydrid von N-geschützten Aminosäuren oder Peptiden, deren Länge vom Dipeptid zum Tetrapeptid reicht, mit geeigneten Seitenkettenschutzgruppen wird hergestellt durch Lösen des betreffenden Peptids in Tetrahydrofuran und Versetzen mit einem Äquivalent N-Methylmorpholin. Die Lösung wird auf -20º gekühlt und mit einem Äquivalent Chlorameisensäureisobutylester versetzt. Nach 5 min wird diese Mischung sowie ein Äquivalent Triethylamin (oder eine andere sterisch gehinderte Base) einer Lösung von Verbindung 5 entweder in kaltem Chloroform oder Tetrahydrofuran zugesetzt. Die Reaktionsmischung wird üblicherweise 1 h lang bei -20º gerührt, gefolgt von 1-2stündigem Rühren bei Raumtemperatur. Unlösliches Material wird durch Filtrieren abgetrennt, das Lösungsmittel wird durch Verdampfen entfernt und der Rückstand in Ethylacetat gelöst. Die organische Lösung wird mit 0,20 N Salzsäure, 5% wäßrigem Natriumbicarbonat und gesättigtem wäßrigen Natriumchlorid gewaschen. Dann wird die organische Phase über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und verdampft, um in den meisten Fällen einen teilweise festen Stoff zu ergeben. Bei einer Reihe von Verbindungen wurde die weitere Reinigung von Verbindung 6 als unnötig angesehen. Anwendbare Methoden zur Reinigung von Verbindung 6 sind Chromatographie an Kieselgel, in einigen Fällen Kristallisation, sowie Gelpermeationschromatographie unter Verwendung von Sephadex LH-20 und Methanol als Lösungsmittel. Bevorzugt wird die letztere Methode. Typischerweise zeigten die NMR-Spektren die Bande von -CH&sub2;-Br bei δ 3,45 und eine scharfe Singulettbande bei δ 0,80-0,95 für eine der Methyl-Gruppen in der Pinandiol- Schutzgruppe oder ein Singulett bei δ 1,3 bei der Pinakol- Gruppe.
Dann wird das Peptid-Alkylhalogenid, Verbindung 6, durch dreistündiges Behandeln mit zwei Äquivalenten Natriumazid in Dimethylformamid bei 100ºC in das Alkylazid überführt. In allen Fällen zeigte sich, daß diese Reaktion ohne Ändern der Reaktionsbedingungen glatt verläuft. Das NMR-Spektrum der Verbindung 7 in CDCl&sub3; weist typischerweise eine Verschiebung nach höherem Feld um δ 0,1-0,2 ppm von -CH&sub2;-Br nach Überführen in das Azid auf. Weitere Reinigung läßt sich durch Chromatographie an LH-20 erreichen, ist aber bei vielen dieser Peptide nicht nowendig.
Die Boroornithin-Peptide, -Verbindung 8, werden routinemäßig hergestellt durch katalytische Hydrierung der Alkylazide, Verbindung 7, in Gegenwart von 10% Pd/C und einem Äquivalent Benzolsulfonsäure in Alkohol.
Die Hydrierungen werden in einer Parr-Apparatur durchgeführt. Alternativ können die Hydrierungen bei Atmosphärendruck vorgenommen werden, und die Benzolsulfonsäure kann durch Mineralsäuren ersetzt werden. Es sei darauf hingewiesen, daß es erforderlich ist, Peptid-Schutzgruppen zu verwenden, die gegenüber katalytischen Hydrierungen beständig sind. Derartige Peptid-Schutzgruppen sind dem Fachmann bekannt und werden erörtert in "The Peptides" (E. Gross und J. Meienhofer, Hrsg.) Bd. 3, Academic Press, New York, 1981. Die bevorzugten Schutzgruppen sind die t-Butyloxycarbonyl-Gruppe für Amino-Gruppen und t-Butylether und -ester für Hydroxy- und Carbonsäure-Seitenketten. Zu weiteren geeigneten Schutzgruppen gehören Diisopropylmethoxycarbonyl, t-Amyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, Biphenylylisopropyloxycarbonyl und Tosyl. Es ist zu erwarten, daß sich die Überführung des Azids in das Amin durch Reduktion mit anderen Reduktionsmitteln unter Verwendung von Reagentien wie etwa Zinn(II)-chlorid und Trialkylphopshiten erreichen läßt wie beschrieben von Maiti et al., Tetrahedron Lett. 27, 1423-1424 (1986), und Koziara et al., Synthesis, 202-204 (1985). Von diesen Reagentien wird erwartet, daß sie mit den Peptid-Schutzgruppen verträglich sind, die gegenüber katalytischer Hydrierung instabil sind. Die Boroornithin-Peptide werden routinemäßig an Sephadex LH-20 chromatographiert und sind nach Verreiben mit Ether weiße amorphe Feststoffe.
Boroarginin-Peptide, Verbindung 9, werden hergestellt durch Reagierenlassen des entsprechenden Boroornithin-Peptids, Verbindung 8, mit einem wenigstens 4fachen Überschuß Cyanamid (50 mg/ml) in absolutem Ethanol bei 100ºC. Zunächst werden die Komponenten 2-3 Tage lang unter einer Stickstoff- Schutzschicht mit einem aufgesetzten wassergekühlten Kühler reagieren gelassen. Die Wasserkühlung wird abgebrochen, und die Reaktionsmischung wird über eine Zeitspanne von mehreren Tagen zum langsamen Einengen belassen. Die Beendigung der Reaktion wird bestimmt anhand der zunehmenden Intensität von Material, das Fleckenbildung mit Sakaguchi-Anfärbereagens für die Guanidino-Gruppe der Boroarginin-Einheit ergibt, sowie anhand des Verschwindens von Material, das positive Fleckenbildung mit Ninhydrin-Anfärbereagens für die Amino-Gruppe der Boroornithin-Einheit ergibt, und zwar auf Umkehrphasen-Dünnschichtplatten, die in Methanol/Wasser (85:15) entwickelt werden. Typischerweise zogen die Boroarginin- Peptide vom Startpunkt der Platte aus Streifen, die Boroornithin-Peptide wanderten als diskrete Flecke in der Mitte der Platte, und das Cyanamid wanderte mit der Lösungsmittelfront, so daß jede Komponente identifiziert werden konnte. Bei der Peptidsynthese ist die Verwendung spezieller Anfärbereagentien für die Guanidino-Gruppe und die Amino-Gruppe üblich. Verbindung 9 wurde durch Gelpermeationschromatographie unter Verwendung von Sephadex LH-20 und Methanol als Lösungsmittel gereinigt. Durch diesen chromatographischen Schritt lassen sich die Boroarginin-Peptide von niedermolekularen Nebenprodukten und unumgesetztem Cyanamid leicht abtrennen. In den meisten Fällen ist keine weitere Reinigung erforderlich. Allerdings ist es wesentlich, die Guanidierungsreaktion von Verbindung 8 bis zum Ende ablaufen zu lassen, da es schwierig, wenn nicht unmöglich ist, eine Mischung der Verbindungen 8 und 9 zu trennen. Die Endprodukte werden durch Verreiben mit Ether als amorphe weiße Feststoffe erhalten und sind in den meisten Fällen analytisch rein, wie NMR-, massenspektroskopische und verbrennungsanalytische Bestimmungen ergaben.
Es sei vermerkt, daß sich die Guanidierung von Verbindung 8 mit Cyanamid als in hohem Maße abhängig von den Reaktionsbedingungen erwies. Wie vorstehend erörtert, ist es zunächst wichtig, daß man die Reaktion hinreichend lange vonstatten gehen läßt, so daß sich relativ vollständige Umwandlung der Verbindung 8 zu Verbindung 9 ergibt. Häufig sind Reaktionszeiten von bis zu 7 Tagen und damit einhergehende Konzentrierung der Reagentien durch langsames Verdampfen der Lösungsmittel erforderlich. In einer anfänglichen Reaktionsüberschau zur Guanidierung der Verbindung 8 wurde die Verbindung 8 als Hydrochlorid-Salz mit Cyanamid in Ethanol mehrere Stunden am Rückfluß gehalten. Das gewünschte Produkt, Verbindung 9, war nicht nachweisbar. Versuche, die Verbindung 8 unter Anwendung der vorstehend erwähnten erfolgbringenden Bedingungen - außer daß das absolute Ethanol durch Tetrahydrofuran ersetzt wurde - zu guanidieren, lieferten kein nachweisbares Produkt. Auch bei Versuchen, Verbindung 8 unter Anwendung dieser Bedingungen zu guanidieren, außer daß das Benzolsulfonsäure-Salz der Amino- Gruppe des Boroornithin-Peptids vor der Guanidierung neutralisiert wurde, war die Verbindung 9 nur in kaum nachweisbaren Mengen vorhanden. Bei den bevorzugten Bedingungen wird das Benzolsulfonsäure-Salz von Verbindung 8 (nicht neutralisiert) umgesetzt. Erfolgreiche Reaktionen wurden auch mit dem entsprechenden Hydrochlorid-Salz durchgeführt.
Gängige Methoden zur Guanidierung von Ornithin-Peptiden unter Bildung der entsprechenden Arginin-Peptide, die von Fachleuten auf dem Gebiet der Peptid-Synthesen angewandt werden, sind die Neutralisierung des Amins am Ornithin- Peptid und Kuppeln entweder mit S-Alkyl- oder O-Alkyl- Isoharnstoffen oder Guanyl-3,5-dimethylpyrazol-nitrat, wie beschrieben von Barany et al., in "The Peptides" (E. Gross und J. Meienhofer, Hrsg.), Bd. 2, S. 169-175, Academic Press, New York (1980). Bannard et al., Can.J.Chem. 36, 1541-1549 (1958) gaben einen Überblick über verschiedene Methoden der Guanidierung von Aminen und fanden, daß Guanyl- 3,5-dimethylpyrazol der Verwendung von S-Methylisoharnstoff überlegen ist und schlossen, daß die Guanidierung mit Cyanamid nicht akzeptabel ist, obwohl sie in der älteren Literatur beschrieben ist. Mit S-Methylisoharnstoff-hydroiodid in Ethanol und Guanyl-3,5-dimethylpyrazol unter einer Viefalt von Bedingungen durchgeführte Reaktionen ergaben keine Guanidierung des Boroornithin-Peptids. In diesem Falle geht die mangelnde Reaktivität wahrscheinlich auf die Bildung eines inneren Lewis-Säure/Base-Komplexes zwischen der Amino- Gruppe der Ornithin-Seitenkette und dem Boronsäureester zurück. Ebenso war die Synthese von Verbindung 9 durch Behandeln von Verbindung 6 mit Guanidin in Ethanol eine nicht akzeptable Synthesemethode. Verbindung 9 wurde mit ungefähr 50% Reinheit aus der Reaktion von Guanidin mit 6 in weniger als 1% Ausbeute isoliert.
Die Guanidino-Gruppe von Boroarginin-pinandiol verhält sich ähnlich wie die Guanidino-Gruppe der natürlichen Amino-Säure Arginin, sobald sie einmal in das Molekül eingebaut ist. Zum Beispiel lassen sich die α-Amino-Gruppen mit einem Anhydrid selektiv acylieren, ohne daß die Guanidin-Gruppen von Boroarginin angegriffen werden. Deshalb erwarten wir, daß sich Verbindung 9 herstellen läßt durch Synthese von H-Boroarginin-pinandiol und nachfolgendes Zusetzen der N-geschützten Form des Peptid-Teils des Moleküls unter Anwendung der Methode der gemischten Anhydride, und in ähnlicher Weise lassen sich Di-, Tri- etc. Peptid-Analoga, die Boroarginin enthalten, durch Kuppeln weiterer Aminosäuren oder Peptide verlängern.
Eine zusätzliche Reinigung der geschützten Boroarginin-Peptide läßt sich erreichen durch Ionenaustauschchromatographie an SP-Sephadex . Die Peptide werden in 20% Essigsäure gelöst und in ihrer H&spplus;-Form auf die Säule aufgebracht. Nach Waschen der Säule mit 20% Essigsäure wird das Produkt eluiert durch Laufenlassen eines Gradienten von 0-0,3 N Salzsäure in 20% Essigsäure. Das Produkt wird eluiert als Mischung aus Pinandiolester und freier Peptid-Boronsäure. Ein homogenes Präparat wird erhalten durch Behandeln der Mischung mit Pinandiol unter wasserfreien Bedingungen und Verreiben des Produkts mit Ether.
Für die Abspaltung der Pinandiol-Schutzgruppe unter Bildung der freien Boronsäure, Verbindung 10, wurden zwei Verfahren entwickelt. Das erste ist eine Abwandlung des obigen Reinigungsverfahrens, wobei eine Mischung der freien Boronsäure und des Pinandiolesters von der Ionenaustauschersäule coeluiert wird. Diese Verbindungen können relativ leicht durch Chromatographie an LH-20 getrennt werden. Das zweite Verfahren ist eine Abwandlung der Methode von Kinder et al., J.Med.Chem. 28, 1917-1925 (1985). Der Boronsäureester wird 5 min lang bei -78º mit einem 2-3fachen Überschuß an Bortrichlorid in Methylenchlorid behandelt, und die Mischung wird 15 min lang bei 0º in einem Eisbad rühren gelassen. Man gibt langsam Wasser zu, um überschüssiges Bortrichlorid zu Borsäure und Salzsäure zu hydrolysieren. Die Reaktion wird weiter mit 20% Essigsäure verdünnt, um eine Endkonzentration an Salzsäure von 0,05 M zu ergeben. Die Konzentration an Salzsäure beruht auf der für die Reaktion verwendeten Anfangsmenge Bortrichlorid. Die wäßrige Phase wird auf eine Säule mit SP-Sephadex gegeben, und das Produkt wird als Hydrochlorid-Salz wie oben beschrieben eluiert. Die freien Borsäure-Peptide wurden als weiße amorphe Feststoffe erhalten.
Unter Anwendung einer Abwandlung des Verfahrens von Kinder et al., J.Med.Chem. 28, 1917-1925 (1985), läßt sich Verbindung 10 in das Difluorboran, Verbindung 11, überführen. Die Peptidboronsäure wird bei Raumtemperatur mit einem 5fachen molaren Überschuß an wäßriger 0,50 N Flußsäure behandelt. Überschüssige Flußsäure und Wasser werden durch Lyophilisieren entfernt, und der gebildete Feststoff wird mit Ether verrieben, um das gewünschte Produkt als weißen amorphen Feststoff zu ergeben.
Bei der vorstehenden Beschreibung geschieht die Herstellung der freien Boronsäure, Verbindung 10, aus Boroarginin-Pinandiolester und die Herstellung der Difluorboransäure, Verbindung 11, aus Verbindung 10. Das Verfahren zur Abspaltung der Ester-Schutzgruppe sollte sich anwenden lassen auf Acylpeptide von Boroornithin, Borolysin, Borohomoarginin, die entweder durch eine Pinandiol-, Pinakol- oder eine andere Ester-Schutzgruppe geschützt sind. In ähnlicher Weise lassen sich die entprechenden freien Boronsäuren in Difluorborane überführen.
Bevorzugte Seitenkettenschutzgruppen und N-terminale Schutzgruppen des Peptid-Teils des Moleküls sind diejenigen, die gegenüber katalytischer Hydrierung stabil und gegenüber wasserfreiem Chlorwasserstoff oder Trifluoressigsäure labil sind. Die t-Butyloxycarbonylamino-Peptid-Schutzgruppe und t-Butylether und -ester für Hydroxy- und saure Seitenketten erfüllen diese Kriterien ohne weiteres. Um diese Gruppen zu entfernen, werden die Peptide mit 4 N Chlorwasserstoff in Dioxan bei Raumtemperatur behandelt. Das von der Schutzgruppe befreite Peptid wird entweder durch Verdampfen des Lösungsmittels oder durch Fällen mit Ether isoliert. Bei Peptiden, die eine saure Seitenkette enthalten, ist besonders darauf zu achten, daß aller Chlorwasserstoff durch Verdampfen entfernt wird. Dadurch wird sichergestellt, daß das Boroarginin-Peptid als Benzolsulfonsäure-Salz bestehen bleibt. Andere Peptide können entweder als gemischtes Chlorwasserstoff/Benzolsulfonsäure-Salz isoliert werden, oder der größte Teil läßt sich mit Hilfe eines Durchgangs durch eine Anionenaustauschersäule in der Cl&supmin;-Form in das Chlorwasserstoff-Salz überführen.
Die Isothiouronium-Derivate von Verbindung 6 werden hergestellt durch Behandeln von Verbindung 6 mit Thioharnstoff in absolutem Ethanol, um Verbindung 12 zu ergeben, Analoga des Peptid-Boroargininesters, Verbindung 10. Routinemäßig wurden die Alkylhalogenide mehrere Tage bei Raumtemperatur mit einem 4-5fachen Überschuß an Thioharnstoff rühren gelassen. Falls notwendig, wird das Produkt von unumgesetzter Verbindung 6 durch Verreiben mit Ether abgetrennt. Für die meisten Peptide ist Verbindung 6 in Ether leicht löslich, wogegen das Produkt unlöslich ist. Abschließende Reinigung, Abtrennung von überschüssigem Thioharnstoff, wird erreicht durch Chromatographie an Sephadex LH-20 in Methanol und Verreiben mit Ether, um die Endprodukte als Bromwasserstoff-Salze zu ergeben. Seitenketten- und N-terminale Schutzgruppen werden durch Behandeln mit wasserfreiem Bromwasserstoff oder einer anderen wasserfreien Säure abgespalten.

Biologische Wirkung

Die biologische Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen wird sowohl anhand von in vitro- als auch in vivo-Daten nachgewiesen, die sich beziehen auf die Hemmung der Hydrolyse synthetischer Substrate durch die Trypsin-artigen Enzyme, Human-Thrombin und Plasma-Kallikrein, sowie die Hemmung physiologischer Reaktionen, die durch derartige Enzyme katalysiert werden, wie etwa Blutgerinnung und Entzündungen.
In den folgenden Beispielen wird die hydrolytische Wirkung eines jeden Enzyms sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit eines Inhibitors gemessen und die prozentuale Enzymwirkung bestimmt. Es wurde gefunden, daß es sich bei den wirksamsten Inhibitoren sowohl für Plasma-Kallikrein als auch für Thrombin um langsam bindende Inhibitoren handelt, deren Wirksamkeit mit der Zeit immer mehr zunimmt, bis ein stationärer Zustand erreicht ist. Ein stationärer Zustand wird ziemlich schnell erreicht und ist innerhalb 5 min annähernd verwirklicht. Die Wirkung wird zwischen 10-20 min nach dem Mischen der Komponenten bewertet, um sicherzustellen, daß sich die Komponenten der Reaktion im Gleichgewicht befinden. Die niedrigste geprüfte Inhibitorkonzentration wird bestimmt anhand der geschätzten Konzentration an Enzym.
Ein gegenüber der Enzymkonzentration 5facher Überschuß an Inhibitorkonzentration ist die niedrigste aufrechterhaltene Konzentration, so daß Reaktionsbedingungen von pseudo-erster Ordnung beobachtet werden. Die Aufrechterhaltung von Reaktionsbedingungen pseudo-erster Ordnung und die Empfindlichkeit der jeweiligen Analysen legt die unterste geprüfte Grenzkonzentration an Inhibitor auf 10 nM für Kallikrein- Inhibitoren und 5 nM für Thrombin-Inhibitoren fest.
Gewöhnlich wird die Wirksamkeit reversibler Inhibitoren bewertet durch Messen der Ki, der Dissoziationskonstanten für den Enzym/Inhibitor-Komplex. Definitionsgemäß handelt es sich bei diesem Wert um diejenige Inhibitorkonzentration, die erforderlich ist, um das Enzym in Abwesenheit von Substrat 50% zu hemmen. Das Substrat hat jedoch schützende Wirkung, deshalb sind höhere Inhibitorkonzentrationen erforderlich, um 50% Hemmung zu erzielen. Trotzdem läßt sich eine vorsichtige Schätzung der Ki aus Daten der prozentualen Wirkung (Hemmung) und der Inhibitorkonzentration erhalten. Eine Inhibitorkonzentration, die etwa um das 20fache höher ist als Ki, ist erforderlich, um eine Reaktion 95% zu hemmen, und eine Inhibitorkonzentration, die etwa um das 50fache höher ist als Ki, ist für 98% Hemmung erforderlich.
Plasmakallikrein hydrolysiert und setzt Bradykinin bevorzugt frei. Boroarginin-Peptide, die Phe benachbart zum Boroarginin enthalten, sind die wirkungsvollsten Inhibitoren diese Enzyms. Beispielsweise wird Kallikrein durch 10 nM H-(D)Phe-Phe-BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; mehr als 95% gehemmt. Es werden keine signifikanten Unterschiede zwischen der Wirksamkeit des Boroargininpinandiolesters und den entsprechenden Isothiouronium-Analoga (BoroIrg-) beobachtet. Zudem werden keine Unterschiede bei der Wirksamkeit der ungeschützten Boronsäure und dem entsprechenden Difluorboran beobachtet.
Bei Tests mit synthetischen Substraten werden für Thrombin ähnliche Ergebnisse erhalten wie bei Kallikrein, außer daß Thrombin eine viel höhere Affinität für Inhibitoren mit Prolin an der dem Boroarginin benachbarten Stelle aufweist. Der wirksamste Inhibitor ist Ac-(D)Phe-Pro-BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6;, der in einer Konzentration von 5 nM Thrombin zu 99% hemmt. Der wirkungsstärkste Inhibitor, über den in der Literatur berichtet wird, ist N-α-(2-Naphthylsulfonylglycyl)-4-amidinophenylalaninpiperidid, das eine Ki von 6 nM aufweist. Er wurde berichtet von Kaiser et al., Thromb.Res. 43, 613-620 (1986), und Sturzebecher et al., Thromb.Res. 29, 635-642 (1983). Die Beziehung zwischen Inhibitorkonzentration Ki und der prozentualen Hemmung, wie bereits beschrieben, legt nahe, daß die Ki von Ac-(D)Phe-Pro-BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; im Picomolbereich liegt. Auch scheint die Wirksamkeit von Inhibitoren mit einer (D)Phe-Pro-BoroArg-Sequenz relativ unempfindlich gegenüber der Gegenwart oder Abwesenheit oder der Beschaffenheit einer Amino-terminalen Schutzgruppe zu sein. Derartige Verbindungen mit einer Boc- und einer Ac-Schutzgruppe und ohne eine Schutzgruppe hemmen Thrombin in gleicher Weise und zeigen jeweils eine IC&sub5;&sub0; von weniger als 5 nM.
Die Wirksamkeit von Inhibitoren in Reaktionen, bei denen sie mit natürlichen Substraten um Zielenzyme konkurrieren, wird in vitro in Blutgerinnungstests gemessen. Es werden zwei verschiedene Tests verwendet, die APTT- (aktivierte partielle Thromboplastinzeiten) und PT-Tests (Prothrombinzeiten). Diese Tests ahmen den in vivo-Blutgerinnungsprozeß nach. Die Blutgerinnung tritt auf zweierlei Wegen ein, von denen jeder aus einer Kaskade von Zymogen-Aktivierungsschritten besteht. Diese Wege werden als endogener bzw. exogener Weg bezeichnet [siehe L. Lorand, Methods in Enzymology 45, 31-37 (1976)]. Der endogene Ablauf wird eingeleitet durch negativ geladene Oberflächen, in denen Plasmakallikrein, Faktor XII und Faktor IX aktiviert werden, wonach die Faktoren IX und X sowie Prothrombin in Calcium-abhängigen Schritten aktiviert werden. Thrombin, die letzte Protease in der Kaskade, hydrolysiert Fibrinogen zu Fibrin, was zur Gerinnselbildung führt. Bei den APTT-Tests werden Plasmakomponenten durch Einwirkung negativ geladener Oberflächen aktiviert, und dann werden die Gerinnungszeiten gemessen, nachdem dem System Calcium zugesetzt wurde. Beim exogenen Weg aktiviert Gewebethromboplastin den Faktor VII, welcher dann Faktor X aktiviert, was zur Aktivierung von Thrombin führt. Diese Vorgänge werden beim Prothrombinzeittest gemessen.
Peptide von Boroarginin und die entsprechenden Isothiouronium-Analoga hemmen bei beiden dieser Tests die Blutgerinnung auf wirksame Weise. Die wirksamsten erfindungsgemäßen Inhibitoren für Thrombin sind für beide Tests die wirksamsten. Andererseits hemmen Kallikreininhibitoren, obgleich weniger wirkungsstarke Gerinnungshemmer, beim APTT-Test (Kallikrein ist bei der Initiierung dieses Tests beteiligt) wirksamer als beim PT-Test. Dies zeigt sich deutlich in Figur 1 durch die Wirkung von H-(D)Phe-Pro- BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; (Thrombininhibitor) auf die Gerinnungszeiten von Plasma. Sie zeigt die Selektivität, die sich durch Verändern einer einzigen Aminosäure im Tripeptid-Inhibitor in einem ziemlich komplexen biologischen System erreichen läßt. Die wirksamen Konzentrationen der Thrombininhibitoren liegen im gleichen molaren Betreich wie bei Heparin. Gewöhnlich verstärken 0,2-0,4 Einheiten Heparin pro ml Plasma die Gerinnungszeiten um das 2-2,5fache. Geht man von einem mittleren Heparin-Molekulargeicht von 15 000 und einer spezifischen Aktivität von 150 Einheiten/mg aus, dann ist seine molare Konzentration 86-170 nM. Die zur Erhöhung der Gerinnungszeiten beim APTT-test erforderlichen Konzentrationen an Boroarginin-Peptiden liegen im Bereich von 170-320 nM. Es sei darauf hingewiesen, daß Heparin ein Cofaktor ist für den Protease-Inhibitor mit hohem Molekulargewicht, Antithrombin III.
Die Stabilität der Boroarginin-Peptide in Humanplasma zeigt sich bei deren Inkubation mit Plasma in Konzentrationen, die zur Verzögerung des Gerinnungsvorgangs wirksam sind. Die Inhibitorproben werden in zunehmenden Zeitintervallen entfernt, und ihre Fähigkeit zur Verzögerung der Gerinnung wird bei jedem Intervall gemessen. Gleichbleibende Gerinnungszeiten deuten auf gleichbleibende hemmende Wirkung der Inhibitoren während der Inkubation im Plasma hin. Es wurde keine merkliche Änderung der Inhibitoraktivität beobachtet, außer bei H-(D)Phe-Pro-BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6;, das nach 24 h seine Wirkung verloren hatte. Die erfindungsgemäßen Inhibitoren sind auch 24 h lang in Phosphat-Puffer bei pH 7,5 stabil, außer H-(D)Phe-Pro-BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6;, das seine hemmende Wirkung innerhalb einer Stunde verlor. Die größere Instabilität dieses Inhibitors in Puffer legt nahe, daß Phosphat-Puffer bei der Destabilisierung der Verbindung eine Rolle spielt.
Die gewonnenen in vivo-Daten zeigen deutlich die Wirksamkeit der betreffenden Verbindungen als Inhibitoren der Blutgerinnung in Säugersystemen.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind auch wirksame entzündungshemmende Mittel, was sich durch die Hemmung von Ödemen am Rattenohr zeigt, wenn diese Verbindungen zusammen mit einem Reizstoff topisch appliziert werden. Die molekularen Grundlagen für diese pharmakologische Aktivität sind nicht bekannt, da bei einer Entzündung mehrere Ereignisse eintreten. Allerdings geht man davon aus, daß Proteasen, die die Gefäßpermeabilität erhöhen, wie etwa Plasmakallikrein, das Kinine und Enzyme des Komplementärsystems freisetzt, welche die Anaphylatoxinpeptide freisetzen, am Entzündungsprozeß beteiligt sind.
Schließlich wurde gezeigt, daß Borolysin-Peptide Plasmin wirksam hemmen, ein Enzym, das eine Schlüsselrolle bei der Hämostase spielt.

Nutzbarkeit

N-Acyl- und N-Peptid-α-aminoboronsäuren, die erfindungsgemäße Analoga von Ornithin, Arginin, Lysin und Homoarginin sind, stellen eine neue Klasse wirkungsstarker, reversibler Inhibitoren Trypsin-artiger Enzyme dar. Bei den Trypsinartigen Enzymen handelt es sich um eine Gruppe von Proteasen, die Peptidbindungen an basischen Resten hydrolysieren, wobei entweder ein C-terminaler Arginyl- oder Lysyl-Rest freigesetzt wird. Unter diesen Enzymen finden sich die Proteasen des Blutgerinnungssystems (Faktoren XIIa, XIa, IXa, VIIa, Xa und Thrombin), des fibrinolytischen Systems (Pasminogenaktivatoren und Plasmin), des Komplementsystems (C1s, C1r, C3-Konvertase, Faktor D etc.), Pankreastrypsin (das eine Funktion bei der Verdauung besitzt) und Acrosin (eine Protease, die mit Spermien in Zusammenhang steht und für die Befruchtung notwendig ist).
Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen, Trypsinartige Proteasen zu hemmen, wurde bestimmt durch Hemmung zweier verschiedener Trypsin-artiger Enzyme, Humanthrombin und Plasmakallikrein. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind weitaus wirkungsstärkere Inhibitoren für beide dieser Enzyme als andere bekannte reversible Inhibitoren. Beispielsweise ist der wirksamste, bis dato vermeldete Thrombin-Inhibitor das N-α-(2-Naphthylsulfonylglycyl)-4-amidinophenylalaninpiperidid, das eine Ki von 6 nM aufweist. Die erfindungsgemäßen Verbindungen hemmen Thrombin nahezu vollständig in einer Konzentration von 5 nM, woraus sich eine Ki von < 1 nM ergibt, und sie sind somit ausgezeichnete Kandidaten für die Steurerung Thrombin-vermittelter Prozesse wie etwa die Blutgerinnung. Das wirksamste Boroarginin-Peptid hemmt die Blutgerinnung, wie sich in der Zunahme der APT- Zeiten und PT-Zeiten zeigt. Auf molekularer Basis ist sein Wirksamkeitsniveau ähnlich dem von Heparin. Zudem sind die Verbindungen in Humanplasma stabil. Die Verbindungen lassen sich verwenden als Antikoagulantien bei der Herstellung von Plasma für die Proteinisolierung sowie für die klinische Prüfung.
Ein weiteres Beispiel ist die Protease Plasmin, die eine zentrale Rolle bei det Lyse von Blutgerinnseln spielt. Es wurden Borolysin-haltige Peptide hergestellt und geprüft und als wirksame Inhibitoren für Plasmin befunden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind wirksam bei der Steuerung der Proteolyse in vivo und sollten pharmazeutisch wirksam sein bei der Behandlung von Krankheiten bei Säugern, die wegen unkontrollierter Proteasewirkung auftreten. Bemerkenswert unter diesen sind Zustände, die mit Thrombose und Verbrauchskoagulopathie in Zusammenhang stehen. Die Koronarthrombose spielt eine wichtige beisteuernde Rolle beim Myokardinfarkt. Die Verbrauchskoagulopathie, ein durch Verringerung von Blutgerinnungsfaktoren und Plasmaprotease- Inhibitor gekennzeichneter Zustand, wird bei Patienten mit akuter Pankreatitis und disseminierter intravaskulärer Koagulation (DIC) beobachtet. Es wird erwartet, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen anstelle von Heparin verwendet werden können, mit dem Vorteil, daß der Heparin-Plasmacofaktor Antithrombin III bei der Reaktion nicht verbraucht wird. Auch eine Thrombocytopenie - Nebenwirkung bei der Heparin-Behandlung - sollte nicht zu beobachten sein. Auch wird erwartet, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen wertvoll sind bei der Behandlung von Krankheiten, bei denen ein Mangel an natürlichen Inhibitoren für Trypsin-artige Enzyme vorliegt wie etwa hereditäre Ödeme. Diese Störung tritt auf wegen eines Mangels an C1-Inhibitor, dem Hauptinhibitor für Plasmakallikrein.
Schließlich zeigten die Verbindungen der vorliegenden Erfindung wirksungvolle entzündungshemmende Aktivität in vivo.

Synthesebeispiele

Die nun folgenden Beispiele veranschaulichen spezielle Ausführungsformen der Erfindung. Sämtliche angegebenen Schmelzpunkte sind ünkorrigiert. Sämtliche Teile sind gewichtsbezogen und sämtliche Temperaturen sind in Grad Celsius angegeben. Die Protonen-kernmagnetische Resonanz (NMR oder ¹H-NMR) gibt chemische Verschiebungen in δ-Einheiten, ppm nach tiefem Feld vom internen Tetramethylsilan-Standard an. Zu den verschiedenen, durchweg verwendeten Abkürzungen gehören: TFA = Trifluoressigsäure; DMF = N,N-Dimethylformamid; MS = Massenspektrometrie; DC = Dünnschichtchromatographie; RP-DC = Reverse-Phase-Dünnschichtchromatographie. Die Ester-Schutzgruppen für die Boronsäuren werden abgekürzt: -C&sub6;H&sub1;&sub2; = Pinakol-Gruppe und -C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; = Pinandiol- Gruppe. "Irg" ist die Abkürzung für das Isothiouronium-Analogon von Arginin (Arg), und das Präfix "Homo" weist auf Strukturen hin, bei denen die Seitenkette eine zusätzliche Methylen-Gruppe enthält. Sämtliche Aminosäure-Reste liegen in der "L"-Konfiguration vor, sofern nicht angegeben.
DC und RP-DC wurden durchgeführt auf Kiesegel 60-Platten von E. Merck (Katalog Nr. 5534, E. M. Sciences, Gibbstown, NJ) und Whatman KC18F Reverse-Phase-Platten (Katalog Nr. 4803-600, Whatman Co., Clifton, NJ). Neutrale Verbindungen wurden unter UV-Licht und nach Einwirkung von Iod-Dampf sichtbar gemacht. Verbindungen mit freien Amino-Gruppen wurden mit Ninhydrin angefärbt, und Verbindungen mit Guanidino-Gruppen wurden mit Sakaguchi-Färbereagens angefärbt. Das Sakaguchi-Färbereagens zeigt beträchtliche Spezifität für die monosubstituierten Guanidine wie etwa die in den Boroarginin-Peptiden vorhandenen [siehe Chemistry of the Amino Acids 3 (1984), Greenstein und Winitz, Hrsg., Robert E. Krieger Publishing Co., Malabar, FL).

Beispiel 1a

1-Amino-4-brombutylboronat-pinandiol-hydrochlorid, NH&sub2;-CH[(CH&sub2;)&sub3;Br)BO&sub2;-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; HCl

4-Brom-1-chlorbutylboronat-pinandiol wurde hergestellt mit Hilfe der Methode bei Matteson et al., Organometallics 3, 1284-1288 (1984), außer daß die Bedingungen für die Herstellung in großem Maßstab abgewandelt wurden. In einem typischen Experiment wurde Allylbromid (173 ml; 2,00 mol) mit Catechinboran (240 ml; 2,00 mol) hydroboriert durch Zugeben des Borans zu Allylbromid und anschließendes Erwärmen der Reaktion für 4 h auf 1000 unter einer Stickstoff-Atmosphäre. Das Produkt, 3-Brompropylboronat-catechin (Sdp. 95-102º, 0,25 mm) wurde durch Destillation in einer Ausbeute von 49% isoliert. Der Catechinester (124 g; 0,52 mol) wurde mit (+)-α-Pinandiol (88 g, 0,52 mol) umgeestert durch Mischen der Komponenten in 50 ml Tetrahydrofuran (THF) und Rührenlassen für 0,5 h bei 0º und 0,5 h bei Raumtemperatur. Das Lösungsmittel wurde durch Verdampfen entfernt, und es wurden 250 ml Hexan zugesetzt. Das Catechin wurde als weißer Feststoff abgetrennt. Quantitative Abtrennung wurde erreicht durch sukzessives Verdünnen mit Hexan auf 500 ml und auf 1000 ml und Abtrennen der Kristalle bei jeder Verdünnung. Durch Verdampfen des Lösungsmittels wurde das Produkt (147 g) als ein Öl erhalten.
Analyse für C&sub1;&sub3;H&sub2;&sub2;O&sub2;BrB:
Berechnet: C 51,85%, H 7,38%, und Br 26,54.
Gefunden: C 52,85%, H 7,30%, and Br 26,58%.
4-Brom-1-chlorbutylboronat-pinandiol wurde hergestellt durch Homologisieren des entsprechenden propylboronats. Methylenchlorid (34,8 ml; 0,540 mol) wurde gelöst in 500 ml THF, 1,54 N n-Butyllithium in Hexan (350 ml; 0,540 mol) und wurde bei -100º langsam zugegeben. 3-Brompropylboronat-pinandiol (148 g; 0,490 mol) wurde in 500 ml THF gelöst, es wurde auf den Gefrierpunkt der Lösung abgekühlt und der Reaktionsmischung zugesetzt. Zinkchlorid (33,5 g; 0,246 mol) wurde in 250 ml THF gelöst, auf 0ºgekühlt und der Reaktionsmischung in mehreren Portionen zugesetzt. Unter Rühren wurde die Reaktionsmischung langsam über Nacht auf Raumtemperatur erwärmen gelassen. Das Lösungsmittel wurde verdampft, und der Rückstand wurde in Hexan gelöst und mit Wasser gewaschen. Nach Trocknen über wasserfreiem Magnesiumsulfat und Filtrieren wurde das Lösungsmittel entfernt, um das gewünschte Produkt zu ergeben (140 g).
1-Amino-4-brombutylboronat-pinandiol wurde zunächst hergestellt durch Lösen von Hexamethyldisilizan (28,0 g; 80,0 mmol) in 30 ml THF, Kühlen der Lösung auf -78º und Zugeben von 1,62 N n-Butyllithium in Hexan (49,4 ml, 80,0 mmol). Die Lösung wurde langsam auf Raumtemperatur erwärmen gelassen, wurde dann abermals auf -78º gekühlt, und 4-Brom-1-chlorbutylboronat-pinandiol (28,0 g; 80,0 mmol) in 20 ml THF wurde zugesetzt. Die Mischung wurde langsam auf Raumtemperatur erwärmen und über Nacht rührengelassen. Das Lösungsmittel wurde durch Verdampfen entfernt, und es wurde trockenes Hexan (400 ml) zugesetzt, um einen Niederschlag zu ergeben, der durch Filtration unter einer Stickstoff-Atmosphäre abgetrennt wurde. Das Filtrat wurde auf -78º gekühlt, und es wurde 4 N Chlorwasserstoff in Dioxan (60 ml; 240 mmol) zugesetzt. Die Reaktion wurde langsam auf Raumtemperatur erwärmen gelassen, und bei dieser Temperatur wurde sie 2 h lang gerührt. Das gebildete Produkt (20 g) wurde durch Filtration als Feststoff isoliert. Nach Trocknen im Vakuum wurde das Rohprodukt in Chloroform gelöst, und unlösliches Material wurde Filtration entfernt. Das Filtrat wurde eingedampft und der Rückstand in Ethylacetat gelöst. Das Produkt kristallisierte aus Ethylacetat, um 15,1 g (Schmp. 142-144,5º) zu ergeben. [α]25d = +16,7 ± 0,80; c = 1,0 in absolutem Ethanol.
Analyse für C&sub1;&sub4;H&sub2;&sub6;NO&sub2;BrClB:
Berechnet: C 45,87%, H 7,16%, N 3,82% und B 2,95%.
Gefunden: C 45,76%, H 7,21%, N 3,79% und B 3,04%.

Beispiel 1b

(D,L)-1-Amino-4-brombutylboronat-pinakol HCl

(D,L)-NH&sub2;-CH[(CH&sub2;)&sub3;Br]BO&sub2;-C&sub6;H&sub1;&sub2; HCl

4-Brom-1-chlorbutylboronat-pinakol wurde hergestellt mit Hilfe der für das entsprechende Pinandiol beschriebenen Methode (Beispiel 1a), außer daß Pinakol für Pinandiol eingesetzt wurde, und 3-Brompropylboronat-pinakol (Sdp. 60-64º; 0,35 mm) und 4-Brom-1-chlorbutylboronat-pinakol (Sdp. 110-112º; 0,20 mm) destilliert wurden.
Analyse für C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub9;O&sub2;BrClB:
Berechnet: C 40,38% und H 6,45%,
Gefunden: C 40,70% und H 6,37%.
1-Amino-4-brombutylboronat-pinakol-hydrochlorid wurde ebenfalls nach dem Verfahren von Beispiel 1a hergestellt. Das Endprodukt wurde aus Ethylacetat/Hexan in einer Ausbeute von 52% kristallisiert.
Analyse für C&sub1;&sub0;H&sub2;&sub2;NO&sub2;BrClB:
Berechnet: C 38,19%, H 7,05%, N 4,45%, Cl 11,27% und Br 25,41%.
Gefunden: C 38,28%, H 7,39%, N 4,25%, Cl 11,68% und Br 26,00%.

Beispiel 1c

1-Amino-4-chlorbutylboronat-pinakol-hydrochlorid

(D,L)-NH&sub2;-CH[(CH&sub2;)&sub3;Cl]BO&sub2;-C&sub6;H&sub1;&sub2; HCl

3-Chlorpropylboronat-catechin (Sdp. 80-85º; 0,30 mm) und 3-Chlorpropylboronat-pinakol (Sdp. 63º; 0,20 mm) wurden hergestellt mit Hilfe der Methode von Beispiel 1a, außer daß Allylchlorid für Allylbromid eingesetzt wurde und Pinakol für Pinandiol eingesetzt wurde.
Analyse für C&sub9;H&sub1;&sub8;O&sub2;ClB:
Berechnet: C 52,85%, H 8,89% und Cl 17,33%.
Gefunden: C 53,41%, H 8,15% und Cl 16,81%.
Die Homologisierung wurde ebenfalls mit Hilfe der Methode von Beispiel 1a durchgeführt, und das Produkt wurde durch Destillation (Sdp. 95º; 0,25 mm) in einer Ausbeute von 65% isoliert.
Analyse für C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub9;O&sub2;Cl&sub2;B:
Berechnet: C 47,47%, H 7,58% und Cl 28,02%.
Gefunden: C 47,17%, H 7,45% und Cl 27,75%.
1-Amino-4-chlorbutylboronat-pinakol HCl wurde hergestellt mit Hilfe einer zu Beispiel 1a identischen Methode. Das Produkt kristallisierte aus Ethylacetat, um 8,8 g (Schmp. 132-135,5º) und 2,2 g (Schmp. 145-147º) zu ergeben. Das bei 145-147º schmelzende Produkt wurde für die Analysen verwendet.
Analyse für C&sub1;&sub0;H&sub2;&sub2;NO&sub2;Cl&sub2;B:
Berechnet: C 44,47%, H 8,23%, N 5,19% und B 4,00%.
Gefunden: C 44,01%, H 8,23%, N 4,77% und B 3,80%.

Beispiel 1d

(D,L)-1-Amino-5-brompentylboronat-pinacol HCl

(D,L)-NH&sub2;-CH[(CH&sub2;)4Br]BO&sub2;-C&sub6;H&sub1;&sub2; HCl

4-Brombutylboronat-pinakol wurde hergestellt mit Hilfe der für 3-Brompropylboronat-pinandiol beschriebenen Methode (Beispiel 1a), außer daß 4-Brom-1-buten für Allylbromid und Pinakol für Pinandiol eingesetzt wurde. Das Produkt wurde als Öl isoliert (Sdp. 77º; 0,3 mm). Die Homologisierung ergab 5-Brom-1-chlorpentylboronat-pinakol.
MS(CI) für C&sub1;&sub1;H&sub2;&sub1;O&sub2;BrClB:
Berechnet H: 310,47.
Gefunden: 310.
Das Endprodukt, 1-Amino-5-brompentylboronat-pinakol HCl, wurde hergestellt mit Hilfe der Methode von Beispiel 1a in einer Ausbeute von 35%.
Analyse für C&sub1;&sub1;H&sub2;&sub4;NO&sub2;BrBCl:
Berechnet: C 40,22%, H 7,36%, N 4,26%, Cl 10,79%, Br 24,32% und B 3,29%.
Gefunden: C 39,23%, H 7,18%, N 4,04%, Cl 15,21%, Br 25,66%, und B 3,75%.

Beispiel 2

Boc-(D)Phe-Pro-NH-CH[(CH&sub2;)&sub3;Br]BO&sub2;-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6;

Boc-(D)Phe-Pro-OH wurde hergestellt, indem zunächst der Dipeptidbenzylester hergestellt und dann der Ester durch katalytische Hydrierung abgespalten wurde. Boc-(D)Phe-OH (10,0 g; 37,7 mmol) wurde in 50 ml THF gelöst und N-Methylmorpholin (4,14 ml; 37,7 mmol) wurde zugegeben. Die Lösung wurde auf -20º gekühlt und es wurde Isobutylchlorformiat (4,90 ml; 37,7 mmol) zugesetzt. Nach 5 min wurde H-Pro-OBzl HCl (9,11 g; 37,7 mmol), gelöst in 50 ml Chloroform und gekühlt auf -20º, zugegeben. Es wurde Triethylamin (5,25 ml; 37,7 mmol) zugesetzt, und die Mischung wurde 1 h lang bei -20º and 2 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde filtriert und das Filtrat wurde eingedampft. Der Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst und mit 0,2 N Salzsäure, 5% wäßrigem Natriumbicarbonat und gesättigtem wäßrigen Natriumchlorid gewaschen. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft, um 15,2 g Boc-(D)Phe-Pro-OBzl als Öl zu ergeben. Der Benzylester (15,2 g) wurde in 100 ml Methanol gelöst und wurde mit einem Anfangsdruck von 40 psi in einer Parr-Apparatur in Gegenwart von 0,5 g 10% Pd/C hydriert. Die Reaktionslösung wurde durch Celite filtriert und eingedampft, um einen Feststoff zu ergeben. Dieses feste Material wurde isoliert und mit Ethylacetat und dann mit Ether gewaschen, um 10,0 g des gewünschten Produkts zu ergeben. (Schmp. 176,5-177º).
Analyse für C&sub1;&sub9;H&sub2;&sub6;N&sub2;O&sub5;:
Berechnet: C 62,95%, H 7,24% und N 7,73%.
Gefunden: C 62,91%, H 7,15% und N 7,53%.
Boc-(D) Phe-Pro-NH-CH[(CH&sub2;)&sub3;Br]BO&sub2;-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; wurde hergestellt durch Kuppeln des Dipeptids an das entsprechende Amin unter Anwendung der Methode der gemischten Anhydride. Das gemischte Anhydrid von Boc-(D)Phe-Pro-OH wurde hergestellt durch Lösen dieser Säure (4,94 g; 13,6 mmol) in 30 ml THF und Versetzen mit N-Methylmorpholin (1,50 ml; 13,6 mmol). Die Lösung wurde auf -20º gekühlt, und es wurde Isobutylchlorformiat (1,77 ml; 13,6 mmol) zugegeben. Nach 5minütigem Rühren bei -20º wurde die Mischung dem Amin wie in Beispiel 1a, NH&sub2;-CH[(CH&sub2;)&sub3;Br]BO&sub2;-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; HCl (5,0 g; 13,6 mmol), gelöst in 10 ml kaltem Chloroform, zugesetzt. Es wurde mit kaltem THF (10 ml) und Triethylamin (1,90 ml; 13,6 mmol) versetzt, und die Mischung wurde 1 h lang bei -20º und ungefähr 2 h lang bei Raumtemperatur rührengelassen. Die Mischung wurde filtriert, und die Flüssigkeit des Filtrats wurde verdampft. Der Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst und mit 0,2 N Salzsäure, 5% wäßrigem Natriumbicarbonat und gesättigtem wäßrigen Natriumchlorid gewaschen. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel verdampft, um 9,0 g eines Öls zu ergeben. Dieses Material wurde in Methanol gelöst und an einer 2,5 x 50 cm Säule mit LH-20 chromatographiert. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und eingedampft, um 5,8 g eines Feststoffs zu ergeben. Ein DC mit Methanol/Chloroform (1:9) zeigte einen einzigen Fleck, Rf 0,70.
MS(FAB) für C&sub3;&sub3;H&sub4;&sub9;N&sub3;O&sub6;BBr:
Berechnet + H: 674,30
Gefunden: 674,30

Beispiel 3

Boc-(D)Phe-Pro-NH-CH[(CH&sub2;)&sub3;N&sub3;]BO&sub2;-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6;

Boc-(D)Phe-Pro-NH-CH[(CH&sub2;)&sub3;Br)BO&sub2;-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6;, das Produkt von Beispiel 2 (4,4 g; 6,54 mmol), wurde in 7 ml DMF gelöst, und es wurde Natriumazid (0,919 g; 14,1 mmol) zugesetzt. Die Mischung wurde 3 h lang auf 100º erwärmt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat (100 ml) versetzt und mit Wasser und gesättigtem wäßrigen Natriumchlorid gewaschen. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft. Es ergab sich eine Ausbeute von 4,1 g eines Feststoffs. Dieses Material wurde an einer 2,5 x 50 cm Säule mit LH-20 in Methanol chromatographiert. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Frak- -tionen wurden vereinigt, die Flüssigkeit wurde verdampft, um 2,3 g des Azids zu ergeben. Ein DC mit Methanol/Chloroform (1:9) zeigte einen einzigen Fleck, Rf 0,76.
Analyse für C&sub3;&sub3;H&sub4;&sub8;N&sub6;O&sub6;B:
Berechnet: C 62,35%, H 7,63%, N 13,33% und B 1,70%.
Gefunden: C 63,63%, H 8,02%, N 11,58% und B 1,80%.
MS(FAB) für C&sub3;&sub3;H&sub4;&sub8;N&sub6;O&sub6;B:
Berechnet + H: 637,39.
Gefunden: 637,49.

Beispiel 4

Boc-(D)Phe-Pro-NH-CH[(CH&sub2;)&sub3;NH&sub2;]BO&sub2;-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; Benzolsulfonsäure

Das Azid von Beispiel 3 (8,0 g; 13,8 mmol), wurde in 150 ml Methanol gelöst und in einer Parr-Apparatur bei 40 psi in Gegenwart von 0,50 g 10% Pd/C und Benzolsulfonsäure (2,19 g; 13,8 mmol) hydriert. Nach 1 h wurde der Katalysator entfernt, und die Lösung wurde eingedampft, um einen Feststoff zu ergeben, der mit Hexan verrieben wurde, um 9,9 g des gewünschten Produkts zu ergeben. Ein RP-DC in Methanol/Wasser (85:15) zeigte einen UV-Fleck, Rf 0,91, sowie einen Ninhydrin-positiven Fleck mit Rf 0,52.

Beispiel 5

Boc-(D)Phe-Pro-NH-CH[(CH&sub2;)&sub3;-NH-C(NH)NH&sub2;]BO&sub2;-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; Benzolsulfonsäure

Boc-(D)Phe-Pro-BoroOrn-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; Benzolsulfonsäure, Beispiel 4 (4,6 g; 6,11 mmol) wurde bei 100º in 20 ml absolutem Ethanol, enthaltend Cyanamid (50 mg/ml), am Rückfluß gehalten. Der Fortgang der Reaktion wurde durch RP-DC in Methanol/Wasser (85:15) überwacht, wobei das verschwinden des Ninhydrin- Flecks für das Amin-Ausgangsmaterial (Rf 0,54) und das Erscheinen des Sakaguchi-Streifens des Produkts (Rf 0-0,13) beobachtet wurden. Das Produkt konnte nach 18 h Rückfluß nachgewiesen werden, und sein Anteil erhöhte sich mit der Zeit ständig. Nach 7 Tagen konnte kein Amin mehr nachgewiesen werden, und die Reaktionslösung wurde durch passives Verdampfen auf eine ungefähr 50%ige Lösung eingeengt. Die Reaktionslösung wurde filtriert, eingeengt und an einer 2,5 x 100 cm Säule mit LH-20 in Methanol chromatographiert. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und eingedampft, um 3,7 g des gewünschten Produkts zu ergeben. Ein Teil (2,3 g) wurde aus Ethylacetat/Hexan kristallisiert, um 0,89 g zu ergeben, und der Rückstand (1,2 g) wurde durch Verreiben mit Ether als Feststoff erhalten (in getrennten Versuchen).
MS(FAB) für C&sub3;&sub4;H&sub5;&sub3;N&sub6;O&sub6;SB:
Berechnet + H: 653,42
Gefunden: 653,38
Analyse für C&sub4;&sub0;H&sub5;&sub9;N&sub6;O&sub9;SB H&sub2;O:
Berechnet: C 57,95%, H 7,43%, N 10,14% und B 1,30%.
Gefunden: C 57,20%, H 7,14%, N 10,94% und B 1,01%.

Beispiel 6

H-(D)Phe-Pro-BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; 2HCl

Boc- (D) Phe-Pro-BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; Benzolsulfonsäure, das Produkt von Beispiel 5 (1,17 g; 1,54 mmol), wurde mit 5 ml 4 N Chlorwasserstoff in Dioxan 15 min bei Raumtemperatur umgesetzt. Das produkt wurde durch Zugabe von Ether gefällt, isoliert, mit Ether gewaschen und im Vakuum getrocknet. Dann wurde es in 10 ml Wasser gelöst und auf eine 5 ml-Anionenaustauschersäule von BIO-RAD AG1 X8 (Cl&supmin;-Form; BIO-RAD Co., Richmond, CA) gegeben, und die Säule wurde mit Wasser gewaschen (ungefähr 30 ml). Der Ablauf wurde im Vakuum eingedampft, und der Rückstand wurde mit Ether verrieben, um das gewünschte produkt zu ergeben (0,80 g).
MS(FAB) für C&sub2;&sub9;H&sub4;&sub5;N&sub6;O&sub4;B:
Berechnet + H: 553,37.
Gefunden: 553,40 und 538,40 (nicht identifiziert).
Analyse von H-(D)Phe-Pro-BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; 1BSA TFA:
Gefunden: 553,4.

Beispiele 7 - 8

Ac-(D)Phe-Pro-BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; HCl (Beispiel 7)

Ac-(D)Phe-Pro-BoroArg-OH HCl (Beispiel 8)

Boc(D)Phe-Pro-BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; Benzolsulfonsäure, das Produkt von Beispiel 5 (0,86 g; 1,13 mmol), wurde mit wasserfreier TFA (ungefähr 5 ml) 5 min bei Raumtemperatur umgesetzt. Überschüssige TFA wurde durch Verdampfen entfernt, und der Rückstand wurde mit Ether verrieben, um 0,76 g zu ergeben. Dieses produkt (0,70 g; 0,91 mmol) wurde gelöst in einer Mischung, bestehend aus 2 ml Dioxan und 1 ml Wasser. Acetanhydrid (0,47 ml; 5,0 mmol) und Natriumbicarbonat (0,42 g; 5,0 mmol) wurden zugesetzt. Die Mischung wurde 20 min lang bei Raumtemperatur gerührt. Ethylacetat (50 ml) und Wasser (5 ml) wurden zugesetzt. Die Phasen wurden getrennt, und die organische Phase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert, und das Lösungsmittel wurde durch Verdampfen entfernt, um 0,56 g eines zum Teil festen Stoffes zu ergeben.
Die Probe wurde in 4 ml Eisessig gelöst und mit 16 ml Wasser verdünnt. Sie wurde unmittelbar auf eine Säule, enthaltend 15 ml SP-Sephadex (H+-Form) gegeben und mit 20% Essigsäure äquilibriert. Die Säule wurde mit 300 ml 20% Essigsäure gewaschen, und dann wurde ein linearer Gradient von 100 ml 20% Essigsäure bis 100 ml 20% Essigsäure, eingestellt mit 0,30 N Salzsäure, laufengelassen. Die von 0,08 bis 0,17 N Salzsäure aufgefangenen Fraktionen enthielten das N-Acetylpeptid (0,29 g) als Mischung der freien Boronsäure und Pinandiolester.
Der Pinandiolester und die freie Boronsäure wurden durch Chromatographie an einer 2,5 x 100 cm Säule mit LH-20 in Methanol getrennt. Die Größe der Fraktionen belief sich auf 8,2 ml. Der Pinandiolester (102 mg) eluierte in Fraktionen 41-43, während die freie Boronsäure (131 mg) langsam in den Fraktionen 45-129 eluierte.
MS(FAB) (Beispiel 7):
[Ac-D)Phe-Pro-BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6;] für C&sub3;&sub1;H&sub4;&sub7;N&sub6;O&sub5;B:
Berechnet + H: 595,33.
Gefunden: 595,33.
MS(FAB) (Beispiel 8):
[Ac-(D)Phe-Pro-BoroArg-OH HCl] für C&sub2;&sub1;H&sub3;&sub3;N&sub6;O&sub5;B:
Berechnet + H: 449,60.
Gefunden: 579,24-581,24.
Das letztere Ergebnis ließ sich nicht erklären. Allerdings stand das NMR mit der Struktur der freien Boronsäure in Einklang, da definitive Banden für die Pinandiol-Gruppe wie etwa die Singuletts der Methyl-Gruppen, die bei δ 0,85 (3H), 1,30 (3H) und 1,36 (3H) beobachtet werden, fehlten. Als zusätzlicher Strukturbeweis wurde eine Probe der freien Boronsäure wiederverestert, um das Produkt von Beispiel 7 zu ergeben. Eine analytische Probe (20 mg) wurde mit einem 2fachen Überschuß Pinandiol (14 mg) in 3 ml Methanol 5 min lang behandelt. Das Lösungsmittel wurde verdampft, und überschüssiges Pinandiol wurde durch Verreiben mit Ether entfernt, um das Produkt zu ergeben (26 mg).
MS(FAB) (Gefunden: 595,38) und NMR standen mit dem für das veresterte Produkt in Einklang und waren nahezu identisch mit denen des Pinandiol-Produkts von Beispiel 7.

Beispiel 9

Ac-Phe-BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; HCl

Ac-Phe-NH-CH[(CH&sub2;)&sub3;Br)BO&sub2;-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; wurde hergestellt mit Hilfe der in Beispiel 2 beschriebenen Methode. Das gemischte Anhydrid von Ac-Phe-OH (0,565 g; 2,73 mmol) wurde hergestellt in 10 ml THF und gekuppelt mit NH&sub2;-CH[(CH&sub2;)&sub3;Br)BO&sub2;- C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; HCl (das Produkt von Beispiel 1a; 1,00 g; 2,73 mmol), gelöst in 10 ml kaltem THF, um 1,47 g eines weißen Schaums zu ergeben. Dieses Material wurde über Nacht mit Hexan gerührt, um einen Feststoff zu ergeben, 1,01 g (Schmp. 106,5-109º).
Analyse für C&sub2;&sub5;H&sub3;&sub6;N&sub2;O&sub4;BrB:
Berechnet: C 57,81%, H 7,00%, N 5,40%, Br 15,40%, B 2,08%.
Gefunden: C 58,33%, H 7,33%, N 4,76%, Br 14,18%, B 1,80%.
MS(FAB) für C&sub2;&sub5;H&sub3;&sub6;N&sub2;O&sub4;BrB:
Berechnet + H: 519,20.
Gefunden: 519,23.
Ac-Phe-NH-CH[(CH&sub2;)&sub3;N&sub3;]BO&sub2;-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; wurde hergestellt durch Behandeln von Ac-Phe-NH-CH[(CH&sub2;)&sub3;Br)BO&sub2;-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; (3,22 g; 6,20 mmol) mit Natriumazid mit Hilfe der in Beispiel 3 beschriebenen Methode. Das Produkt aus der Reaktion (3,03 g) wurde an LH-20 chromatographiert. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und eingedampft.
Der Rückstand wurde mit Hexan verrieben, um 2,21 g des Azids zu ergeben.
Ac-Phe-BoroOrn-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; Benzolsulfonsäure wurde hergestellt aus Ac-Phe-NH-CH[(CH&sub2;)&sub3;N&sub3;]BO&sub2;-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; (2,21 g; 4,59 mmol) mit Hilfe des Verfahrens von Beispiel 4, außer daß die Hydrierung bei Atmosphärendruck durchgeführt wurde. Nach Filtration und Verdampfen des Lösungsmittels wurde das gewünschte Produkt (2,22 g) durch Verreiben mit Ether erhalten.
Ac-Phe-BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; Benzolsulfonsäure wurde hergestellt durch Behandeln von Ac-Phe-BoroOrn-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; Benzolsulfonsäure (2,0 g; 3,26 mmol) mit 10 ml einer Lösung von Cyanamid (100 mg/ml) in Ethanol. Es wurde das Guanidierungsverfahren von Beispiel 5 angewandt, außer daß sich die Reaktionszeit auf 3 Tage belief und die Reaktionsmischung eine Mischung aus Ausgangsmaterial und Produkt enthielt. Dadurch wurde ein zusätzlicher Reinigungsschritt erforderlich, der durch eine längere Reaktionszeit höchstwahrscheinlich hätte umgangen werden können. Die Lösung wurde eingeengt und an einer 2,5 x 100 cm Säule mit LH-20 in Methanol chromatographiert. Die das gewünschte produkt enthaltenden Fraktionen, nachgewiesen durch Sakaguchi-Anfärbung, wurden vereinigt und eingedampft, um 1,4 g zu ergeben. Das resultierende Material (1,2 g) wurde in 6 ml Essigsäure gelöst und mit 30 ml Wasser verdünnt, um eine milchige Lösung zu ergeben. Sie wurde auf eine 30 ml-Säule mit SP-Sephadex C-25 (H+-Form) gegeben und mit 20% wäßriger Essigsäure äquilibriert. Die Säule wurde mit 240 ml 20% Essigsäure gewaschen, und dann wurde ein linearer Gradient von 250 ml 20% Essigsäure bis 250 ml 20% Essigsäure, enthaltend 0,30 N Salzsäure, laufengelassen. Die von 0,12 N bis 0,16 N Salzsäure eluierten Fraktionen wurden vereinigt, um 0,42 g des gewünschten Produkts als Mischung der freien Boronsäure und Pinandiolester zu ergeben. Die Mischung wurde in Methanol gelöst (10 ml), und es wurden 80 mg Pinandiol zugesetzt, um die freie Boronsäure zu verestern. Nach 30 min Rühren wurde das Lösungsmittel vedampft, und der Rückstand wurde mit Ether verrieben, um 0,28 g des gewünschten Produkts zu ergeben.
Analyse für C&sub2;&sub6;H&sub4;&sub0;N&sub5;O&sub4;B HCl 2H&sub2;O:
Berechnet: C 54,78%, H 8,15%, N 12,30% und B 1,90%.
Gefunden: C 55,34, H7,83, N 11,66% und B 1,99%.
MS(FAB) für C&sub2;&sub6;H&sub4;&sub0;N&sub5;O&sub4;B:
Berechnet + H: 498,32.
Gefunden: 498,31.

Beispiel 10

Ac-(D,L)Phe-(D,L)BoroArg-C&sub6;H&sub1;&sub2;

Das Zwischenprodukt Ac-(D,L)Phe-(D,L)-NH-CH[(CH&sub2;)&sub3;Br]BO&sub2;- C&sub6;H&sub1;&sub2; wurde hergestellt durch Abwandlung der Verfahren der Beispiele 1b und 2. Das Säurechlorid von Ac-Phe-OH wurde hergestellt durch Umsetzen von Ac-Phe-OH (30 g; 0,145 mol) mit Phosphorpentachlorid (30 g; 0,144 mol) in 175 ml THF bei -10º. Die Reaktion wurde ungefähr 1 h lang bei 0º gerührt, dann mit kaltem Ether auf ein Volumen von 350 ml verdünnt. Das Produkt wurde als Feststoff isoliert, mit kaltem Ether gewaschen und im Vakuum getrocknet, um 21 g zu ergeben. Das aktivierte Ac-Phe-Derivat (14,8 g; 65,6 mmol) wurde in 40 ml THF gelöst und dem Produkt der Reaktion von 4-Brom-1-chlorbutylboronat-pinakol und Hexamethyldisilizan (hergestellt im 20 mmol-Maßstab) bei -78º zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur erwärmen gelassen, dann über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wurde durch Verdampfen entfernt. Der Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst und nacheinander mit Wasser, 5% wäßriger Natriumbicarbonat-Lösung und gesättigter wäßriger Natriumchlorid-Lösung gewaschen. Die organische Phase der resultierenden Mischung wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingeengt, um das gewünschte Produkt als kristallinen Feststoff (1,37 g; Schmp. 146,5-148º) zu ergeben. In einem getrennten Versuch wurde die folgende Analyse erhalten.
Analyse für C&sub2;&sub1;H&sub3;&sub2;N&sub2;O&sub4;BrB:
Berechnet: C 53,98%, H 6,92%, N 6,00%, Br 17,10% und B 2,31%
Gefunden: C 54,54%, H 6,78%, N 5,89%, Br 16,46% und B 3,40%
Das Alkylbromid wurde mit Hilfe des Verfahrens von Beispiel 3 in das entsprechende Azid überführt. Das Produkt kristallisierte aus Ethylacetat (Schmp. 143-144º).
Analyse für C&sub2;&sub1;H&sub3;&sub2;N&sub5;O&sub4;B:
Berechnet: C 58,74%, H 7,53%, N 16,31% und B 2,53%.
Gefunden: C 58,85%, H 7,48%, N 16,53% und B 2,93%.
Das Azid wurde überführt in Ac-(D,L)Phe-(D,L)BoroOrn-C&sub6;H&sub1;&sub2; Benzolsulfonsäure mit Hilfe des Verfahrens von Beispiel 4, außer daß die Hydrierung bei Atmosphärendruck durchgeführt wurde.
Ac-(D,L)Phe-(D,L)BoroOrn-C&sub6;H&sub1;&sub2;-Benzolsulfonsäure (0,243 g; 0,433 mmol) wurde bei 100º über Nacht mit Cyanamid (0,020 g; 0,476 mmol) in 2 ml absolutem Ethanol umgesetzt. Die Lösung wurde eingeengt und mit Ether verrieben, um 0,21 g eines weißen Feststoffs zu ergeben. Ein RP-DC des Materials zeigte die charakteristische, mit Sakaguchi-Anfärbereagens positive streifenfärbung für Boroarginin-Peptide, Rf 0-0,55, und einen diskreten Fleck mit Rf 0,68, der unumgesetztem Ausgangsmaterial entspricht. Das Produkt (81 mg) wurde nochmals nach obigem Verfahren mit 2 ml Cyanamid (10 mg/ml) über Nacht behandelt, um nach Verreiben mit Ether 71 mg zu ergeben.
MS(FAB) für C&sub2;&sub2;H&sub3;&sub7;N&sub5;O&sub4;B:
Berechnet + H: 446,30.
Gefunden: 446,23 und 404,19 (entsprechend dem unumgesetzten BoroOrn-Peptid)
Man beachte, daß das Verfahren von Beispiel 5 ein überlegenes Verfahren zur Herstellung der Boroarginin-Peptide ist und sich darin unterscheidet, daß ein größerer Überschuß an Cyanamid und längere Reaktionszeiten angewandt werden.

Beispiel 11

Boc-(D)Phe-Phe-BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; Benzolsulfonsäure

Boc-(D)Phe-Phe-OH wurde hergestellt mit Hilfe des für Boc-(D)Phe-Pro-OH in Beispiel 2 beschriebenen Verfahrens. Nach der Hydrierung des Benzylesters kristallisierte das Material aus Chloroform/Hexan, wobei sich das gewünschte Peptid ergab (Schmp. 133-133,5º).
Analyse für C&sub2;&sub3;H&sub2;&sub8;N&sub2;O&sub5;:
Berechnet: C 66,96%, H 6,86% und N 6,79%.
Gefunden: C 66,75%, H 6,79% und N 6,56%.
Boc-(D)Phe-Phe-NH-CH[(CH&sub2;)&sub3;Br]BO&sub2;-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; wurde hergestellt durch Kuppeln von Boc-(D)Phe-Phe-OH (6,00 g; 14,5 mmol) mit NH&sub2;-CH[(CH&sub2;)&sub3;Br]BO&sub2;-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; HCl (Beispiel 1a, 5,33 g; 14,5 mmol) unter Anwendung des in Beispiel 2 beschriebenen Verfahrens, außer daß der LH-20-Chromatographieschritt wegfiel. Das Produkt kristallisierte aus Ethylacetat, um 2,47 g (Schmp. 132-134º) in der ersten Ausbeute und 5,05 g (Schmp. 133-135º) in einer zweiten Ausbeute zu ergeben. Ein RP-DC in Methanol/Wasser (85:15) zeigte einen einzigen Fleck mit Rf 0,29.
Analyse für C&sub3;&sub7;H&sub5;&sub1;N&sub3;O&sub6;BrB:
Berechnet: C 61,32%, H 7,11%, N 5,80%, Br 11,03%.
Gefunden: C 61,21%, H 7,02%, N 5,59%, Br 10,22%.
Boc-(D)Phe-Phe-NH-CH[(CH&sub2;)&sub3;N&sub3;]BO&sub2;-C&sub1;&sub0;H16 wurde hergestellt durch Behandeln des entsprechenden Alkylbromids (7,15 g; 9,87 mmol) mit Natriumazid unter Anwendung des Verfahrens von Beispiel 3, außer daß der LH-20-Chromatographieschritt zur Reinigung nicht erforderlich war. Das produkt fiel als Gel aus einer Ethylacetat/Hexan-Lösung an und wurde isoliert und mit Hexan gewaschen, um 3,0 g in der ersten Ausbeute und 2,9 g in einer zweiten Ausbeute zu ergeben.
Boc-(D)Phe-Phe-BoroOrn-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; Benzolsulfonsäure wurde hergestellt aus dem Azid (5,37 g; 7,82 mmol) mit Hilfe des Verfahrens von Beispiel 4, um 5,33 g zu ergeben. Ein RP-DC in Methanol/Wasser (85:15) zeigte einen intensiven Ninhydrin-positiven Fleck mit Rf 0,42 und einen schwachen Ultraviolett (UV)-Fleck, 0,92. (Der UV-Fleck bei Rf 0,92 ist typisch für Amine oder Guanidino-Verbindungen, die als Benzolsulfonsäure-Salze vorliegen.)
MS(FAB) für C&sub3;&sub7;H&sub5;&sub3;N&sub4;O&sub6;B:
Berechnet + H: 661,76.
Gefunden: 661,14.
Boc-(D)Phe-Phe-BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; wurde hergestellt mit Hilfe des Verfahrens von Beispiel 5. Das Boroornithin-Peptid (4,83 g; 5,90 mmol) wurde 7 Tage lang mit Cyanamid (50 mg/ml) in 20 ml absolutem Ethanol behandelt. Ein Teil der Reaktionsmischung, entsprechend 1,0 g Ausgangsmaterial, wurde entnommen und getrennt für sich ohne Rückflußkühler über Nacht erhitzt, um komplette Umsetzung des Amins in die Guanidino-Verbindung zu erreichen. Nach Chromatographie an LH-20 und Verreiben des Produkts mit Ether wurden 0,52 g des gewünschten Produkts erhalten.
Analyse für C&sub4;&sub4;H&sub6;&sub1;N&sub6;O&sub9;SB:
Berechnet: C 61,38%, H 7,16%, N 9,76%, B 1,25%.
Gefunden: C 59,69%, H 7,41%, N 9,82%, B 1,26%.
MS(FAB) für C&sub3;&sub8;H&sub5;&sub5;N&sub6;O&sub6;B:
Berechnet + H: 703,43.
Gefunden: 703,49.

Beispiel 12

H-(D)Phe-Phe-BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; 2HCl

Boc-(D)Phe-Phe-BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; Benzolsulfonsäure (Beispiel 11, 0,59 g; 1,25 mmol) wurde mit Hilfe des Verfahrens von Beispiel 6 deblockiert, außer daß die Probe in 20% Ethanol auf die Ionenaustauschersäule gegeben und die Säule mit 20% Ethanol eluiert wurde. Das Produkt (0,424 g) wurde als weißer Feststoff erhalten.
MS(FAB) für C&sub3;&sub3;H&sub4;&sub7;N&sub6;O&sub4;B:
Berechnet + H: 603,38.
Gefunden: 603,41.

Beispiel 13

Ac-Ala-Lys(Boc)-BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; Benzolsulfonsäure

Ac-Ala-Lys(Boc)-OH wurde hergestellt durch Kuppeln des N-Hydroxysuccinimidesters von Ac-Ala-OH, hergestellt mit Hilfe der Methode von Anderson et al., J.Am.Chem.Soc. 86, 1839 (1964), an H-Lys(Boc)-OH. Das N-Hydroxysuccinimid von Ac-Ala-OH (6,25 g; 27,4 mmol) wurde in 30 ml Dioxan gelöst und wurde einer Lösung von H-Lys(Boc)-OH (7,50 g; 30,4 mmol), gelöst in einer Lösung bestehend aus 30 ml 1,0 N Natriumhydroxid und Triethylamin (2,12 ml; 15,0 mmol), zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht gerührt und dann mit Salzsäure angesäuert. Es wurde genügend trockenes Natriumchlorid zugesetzt, um die Lösung nahezu zu sättigen. Das Produkt wurde in Ethylacetat extrahiert und wurde mit 0,2 N Salzsäure, bereitet in gesättigtem wäßrigen Natriumchlorid, gewaschen. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Das Lösungsmittel wurde durch Verdampfen entfernt. Das Produkt wurde aus Ethylacetat/Hexan kristallisiert, um 7,3 g (Schmp. 86-89º) zu ergeben.
Ac-Ala-Lys(Boc)-NH-CH[(CH&sub2;)&sub3;Br]BO&sub2;-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; wurde mit Hilfe des Verfahrens von Beispiel 2 hergestellt, außer daß das Produkt durch fraktionierte Kristallisation aus Ethylacetat gereinigt wurde. Das bei der zweiten und dritten Ausbeute erhaltene Produkt (1,13 g) zeigte im RP-DC in Methanol/Wasser (85:15) einen Rf von 0,51. Die DC-platte wurde Salzsäuredämpfen ausgesetzt, wobei das gebildete Amin nach Zugabe des Ninhydrin-Anfärbereagens nachgewiesen wurde.
Ac-Ala-Lys(Boc)-NH-CH[(CH&sub2;)&sub3;N&sub3;]BO&sub2;-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; wurde hergestellt aus dem entsprechenden Alkylbromid (1,95 g; 2,90 mmol) mit Hilfe des Verfahrens von Beispiel 3, außer daß das Produkt durch Kristallisieren aus Ethylacetat und nicht durch LH-20- Chromatographie gereinigt wurde. Das Rohprodukt (1,60 g) kristallisierte, um 0,55 g (Schmp. 79-84º) und 0,96 g Rückstand zu ergeben. Die Analyse des kristallinen Produkts folgt.
Analyse für C&sub3;&sub0;H&sub5;&sub2;N&sub7;O&sub7;B:
Berechnet: C 56,86%, H 8,29%, N 15,48% und B 1,71%.
Gefunden: C 56,76%, H 8,26%, N 15,89% und B 1,65%.
Ac-Ala-Lys(Boc)-BoroOrn-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; Benzolsulfonsäure wurde hergestellt aus dem entsprechenden Alkylazid (0,433 g; 0,683 mmol) unter Anwendung der in Beispiel 4 beschriebenen Methode. Katalysator und Lösungsmittel wurden entfernt, dann wurde das Produkt (0,45 g) durch Verreiben mit Ether erhalten.
MS(FAB) für C&sub3;&sub0;H&sub5;&sub4;N&sub5;O&sub7;B:
Berechnet + H: 608,42.
Gefunden: 608,49.
Ac-Ala-Lys(Boc)-BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; Benzolsulfonsäure wurde hergestellt durch Umsetzen des entsprechenden Boroornithin- Peptids mit Cyanamid unter Anwendung der in Beispiel 5 beschriebenen Methode. Die das gewünschte Produkt enthaltenden chromatographischen Fraktionen wurden mit Ether verrieben, um 0,83 g eines weißen Feststoffs zu ergeben.
Analyse für C&sub3;&sub7;H&sub6;&sub2;N&sub7;O&sub1;&sub0;BS:
Berechnet: C 55,00%, H 7,75%, N 12,14% und B 1,34%.
Gefunden: C 54,09%, H 7,53%, N 12,22% und B 1,34%.

Beispiel 14

Ac-Ala-Lys-BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; 2HCl

Ac-Ala-Lys(Boc)-BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; Benzolsulfonsäure (0,200 g; 0,248 mmol) wurde deblockiert mit Hilfe der in Beispiel 6 beschriebenen Methode. Nach Ionenaustausch, Verdampfen des Lösungsmittels, Trocknen im Vakuum und Verreiben mit Ether wurden 0,14 g Material erhalten.
MS(FAB) für C&sub2;&sub6;H&sub4;&sub8;N&sub7;O&sub5;B: Berechnet + H: 550,39. Gefunden: 550,42. Beispiel 15 Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; Benzolsulfonsäure
Boc-Leu-Ala-OBzl wurde hergestellt mit Hilfe des Verrfahrens zur Dipeptid-Synthese von Beispiel 2. Boc-Leu-Ala-OBzl (23,7 g; 57,7 mmol) wurde in 40 ml wasserfreier Trifluoressigsäure gelöst. Nach 15 min wurde die überschüssige Trifluoressigsäure durch Verdampfen entfernt, und der Rückstand wurde mit Ether behandelt, um H-Leu-Ala-OBzl Trifluoressigsäure als kristallines Produkt zu ergeben (22,8 g).
Analyse für C&sub1;&sub8;H&sub2;&sub5;N&sub2;O&sub5;F&sub3;:
Berechnet: C 53,19%, H 6,21% und N 6,89%.
Gefunden: C 53,37%, H 5,68% und N 6,84%.
Boc-Gly-Leu-Ala-OBzl wurde hergestellt durch Kuppeln von Boc-Gly-OH (5,70 g; 32,6 mmol) an H-Leu-Ala-OBzl unter Anwendung der in Beispiel 2 beschriebenen Methode der gemischten Anhydride. Das Produkt (13,8 g) wurde als amorpher Feststoff erhalten. Boc-Gly-Leu-Ala-OBzl wurde deblockiert mit Trifluoressigsäure mit Hilfe des für die Herstellung von H-Leu-Ala-OBzl beschriebenen Verfahrens, außer daß das Trifluoracetat-Salz in Ether löslich war. Das Präparat wurde in Ethylacetat gelöst und mit wasserfreiem Chlorwasserstoff behandelt. Das resultierende Produkt wurde durch Zugabe von Ether gefällt, um 7,7 g H-Gly-Leu-Ala-OBzl HCl in einer ersten Ausbeute zu ergeben.
Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-OBzl wurde hergestellt durch Kuppeln von Boc-Leu-OH (2,62 g; 10,5 mmol) an H-Gly-Leu-Ala-OBzl unter Anwendung der in Beispiel 2 beschriebenen Methode der gemischten Anhydride. Das resultierende Produkt wurde aus Ethylacetat/Hexan kristallisiert, um 2,7 g (Schmp. 95-96º) in der ersten Ausbeute zu ergeben.
Analyse für C&sub2;&sub9;H&sub4;&sub6;N&sub4;O&sub7;:
Berechnet: C 61,89%, H 8,26% und N 9,96%.
Gefunden: C 62,00%, H 8,40% und N 9,83%.
Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-OH wurde hergestellt durch katalytische Hydrierung des Benzylesters (2,6 g; 4,62 mmol) mit Hilfe des in Beispiel 2 beschriebenen Verfahrens, um 2,1 g zu ergeben. Das resultierende Produkt wurde aus heißem Ethylacetat kristallisiert, um 1,4 g zu ergeben.
Analyse für C&sub2;&sub2;H&sub4;&sub0;N&sub4;O&sub7;:
Berechnet: C 55,90%, H 8,55% und N 11,86%.
Gefunden: C 55,42%, H 8,47% und N 11,73%.
Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-NH-CH[(CH&sub2;)&sub3;Br]BO&sub2;-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; wurde hergestellt durch Kuppeln von Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-OH (1,40 g; 2,96 mmol) an das Amin von Beispiel 1a. Dies wurde durchgeführt unter Anwendung des in Beispiel 2 beschriebenen Verfahrens, außer daß der chromatographische Schritt wegfiel. Das Produkt kristallisierte aus Ethylacetat/Hexan, um 1,17 g zu ergeben. Ein DC in Methanol/Chloroform (1:9) zeigte einen einzigen Fleck mit Rf 0,68.
Analyse für C&sub3;&sub6;H&sub6;&sub3;N&sub5;O&sub8;BrB:
Berechnet: C 55,10%, H 8,11%, N 8,93% und B 1,38%.
Gefunden: C 55,96%, H 8,30%, N 8,74% und B 1,33%.
Das entsprechende Azid wurde in einer Ausbeute von 97% mit Hilfe des in Beispiel 3 beschriebenen Verfahrens hergestellt und wurde mit Hilfe des in Beispiel 4 beschriebenen Verfahrens in Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-BoroOrn-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; überführt. Es wurde eine analytische Probe hergestellt durch Fällen des Produkts mit Ether, wonach es an LH-20 chromatographiert und mit Hexan aus Chloroform wiederausgefällt wurde.
MS(FAB) für C&sub3;&sub6;H&sub6;&sub5;N&sub6;O&sub8;B:
Berechnet + H: 721,50.
Gefunden: 721,55.
Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; Benzolsulfonsäure wurde hergestellt mit Hilfe des Verfahrens von Beispiel 5. Das entsprechende Boroornithin-Peptid (0,695 g; 0,791 mmol) wurde umgesetzt mit 5 ml einer Cyanamid-Lösung (50 mg/ml) in absolutem Ethanol. Die obige Mischung wurde chromatographiert und mit Ether verrieben, wobei 0,41 g des gewünschten Produkts erhalten wurden.
MS(FAB) für C&sub3;&sub7;H&sub6;&sub7;N&sub8;O&sub8;B:
Berechnet + H: 763,53.
Gefunden: 763,8.

Beispiel 16

H-Leu-Gly-Leu-Ala-BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; HCl Benzolsulfonsäure

Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; Benzolsulfonsäure (Beispiel 15; 0,050 g; 0,0543 mmol) wurde 5 min lang bei Raumtemperatur mit 2 ml 4 N Chlorwasserstoff in Dioxan umgesetzt. Das Lösungsmittel und überschüssiger Chlorwasserstoff wurden durch Verdampfen entfernt. Die Probe wurde über Nacht über wasserfreiem Kaliumhydroxid im Vakuum getrocknet und dann mit Ether verrieben, um das Produkt (46 mg) als gemischtes Salz zu ergeben.
MS(FAB) für C&sub3;&sub2;H&sub5;&sub9;N&sub8;O&sub6;B:
Berechnet + H: 663,47.
Gefunden: 663,50.

Beispiel 17

Bz-Glu(OBu)-Gly-BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; Benzolsulfonsäure

Bz-Glu(OBu)-Gly-NH-CH[(CH&sub2;)&sub3;Br)BO&sub2;-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; wurde hergestellt durch Kuppeln von Bz-Glu(OBu)-Gly-OH an das Amin nach der in Beispiel 2 beschriebenen Methode. Das entsprechende Azid wurde hergestellt mit Hilfe des in Beispiel 3 beschriebenen Verfahrens, und das Boroornithin-Peptid wurde hergestellt mit Hilfe des in Beispiel 4 beschriebenen Verfahrens.
MS(FAB) für C&sub3;&sub2;H&sub4;&sub9;N&sub4;O&sub7;B:
Berechnet + H: 613,38.
Gefunden: 613,60.
Das Endprodukt wurde erhalten mit Hilfe des in Beispiel 5 beschriebenen Verfahrens.
MS(FAB) für C&sub3;&sub3;H&sub5;&sub1;N&sub6;O&sub7;B:
Berechnet + H: 655,40.
Gefunden: 655,37.
Analyse für C&sub3;&sub9;H&sub5;&sub7;N&sub6;O&sub1;&sub0;SB:
Berechnet: c 57,62%, H 7,08%, N 10,34% und B 1,33%.
Gefunden: C 57,43%, H 7,25%, N 9,91% und B 1,23%.

Beispiel 18

Bz-Glu-Gly-BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; Benzolsulfonsäure

Bz-Glu(OBu)-Gly-BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; Benzolsulfonsäure (0,13 g; 0,16 mmol) wurde in 5 ml Dioxan gelöst, es wurde Benzolsulfonsäure (0,10 g; 0,66 mmol) zugesetzt, und die Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde dann durch Verdampfen auf ungefähr 1 ml eingeengt und wurde dann mit Ether verrieben, um einen Feststoff zu ergeben (0,14 g). Dieses Material wurde an einer 2,5 x 50 cm Säule mit LH-20 in Methanol chromatographiert. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen wurden eingedampft, und der Rückstand wurde mit Ether verrieben, um 53 mg des gewünschten Produkts zu ergeben.
MS(FAB) für C&sub2;&sub9;H&sub4;&sub3;N&sub6;O&sub7;B:
Berechnet + H: 599,34.
Gefunden: 599,35 + 613,36 (nicht identifiziert).

Beispiel 18a

Bz-Glu-Gly-BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; Benzolsulfonsäure

Bz-Glu(OBu)-Gly-BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; Benzolsulfonsäure (Beispiel 17; 0,20 g; 0,246 mmol) wurde 45 min lang mit wasserfreiem Chlorwasserstoff nach dem in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren behandelt. Nach Verreiben des Materials mit Ether, zeigte ein NMR, das ungefähr 30% der t-Butyl-Schutzgruppen noch vorhanden waren. Das Produkt wurde dann 45 min lang mit wasserfreier TFA bei Raumtemperatur umgesetzt. Die TFA wurde durch Verdampfen entfernt, und der Rückstand wurde mit Ether verrieben, um 143 mg zu ergeben.
MS(FAB) für C&sub2;&sub9;H&sub4;&sub3;N&sub6;O&sub7;B:
Berechnet + H: 599,34.
Gefunden: 599,35.

Beispiel 19

Bz-Pro-Phe-BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; Benzolsulfonsäure

Bz-Pro-Phe-OH (Schmp. 200-201º) wurde hergestellt mit Hilfe des in Beispiel 2 für die Dipeptid-Synthese beschriebenen Verfahrens.
Analyse für C&sub2;&sub1;H&sub2;&sub2;N&sub2;O&sub4;:
Berechnet: C 68,82%, H 6,06% und N 7,65%.
Gefunden: C 68,91%, H 6,09% und N 7,47%.
Bz-Pro-Phe-NH-CH[(CH&sub2;)&sub3;Br]BO&sub2;-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; wurde hergestellt durch Kuppeln von Bz-Pro-Phe-OH an das Amin unter Anwendung des in Beispiel 2 beschriebenen allgemeinen Verfahrens. Ein DC mit Methanol/Chloroform (1:9) zeigte einen Hauptfleck bei Rf 0,72 und eine Spur bei Rf 0,86.
MS(FAB) für C&sub3;&sub5;H&sub4;&sub5;N&sub3;O&sub5;BBr.
Berechnet + H: 678,27.
Gefunden: 677,95.
Das Alkylhalogenid wurde mit Hilfe der in den Beispielen 3 und 4 beschriebenen Verfahren in das Azid und in das Boroornithin-Peptid überführt.
MS(FAB) für (Bz-Pro-Phe-BoroOrn-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6;) C&sub3;&sub5;H&sub4;&sub7;N&sub4;O&sub5;B:
Berechnet + H: 615,37.
Gefunden: 615,42.
Bz-Pro-Phe-BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; Benzolsulfonsäure wurde hergestellt mit Hilfe des in Beispiel 5 beschriebenen Verfahrens.
MS(FAB) für C&sub3;&sub6;H&sub4;&sub9;N&sub6;O&sub5;B:
Berechnet + H: 657,39.
Gefunden: 657,13.
Analyse für C&sub4;&sub2;H&sub5;&sub5;N&sub6;O&sub8;SB:
Berechnet: C 61,90%, H 6,82%, N 10,31% und B 1,33%.
Gefunden. C 60,16%, H 7,27%, N 9,79% und B 1,44%.

Beispiel 20

Bz-Pro-Phe-BoroArg-OH HCl

Bz-Pro-Phe-BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; Benzolsulfonsäure (Verbindung von Beispiel 19; 0,64 g; 0,79 mmol) wurde in 4 ml Methylenchlorid gelöst und auf -78º gekühlt. Dies wurde einem Kolben in einem Trockeneisbad zugegeben, der 4 ml 0,50 N Bortrichlorid enthielt, welches hergestellt wurde durch Verdünnen von 1,0 N Bortrichlorid (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) mit trockenem Methylenchlorid auf 50%. Die Lösung wurde 5 min lang bei -78º gerührt, dann wurde der Kolben in ein Eisbad mit 0º überführt, wo die Lösung 15 min lang gerührt wurde. Es wurde langsam kaltes Wasser (5 ml) zugesetzt, dann wurde die Lösung mit 20% Essigsäure auf 120 ml verdünnt. Die sich abscheidende organische Phase wurde abgetrennt und verworfen. Die wäßrige Phase wurde auf eine 20 ml-Säule mit SP-Sephadex gegeben, die mit 20% Essigsäure äquilibriert wurde. Die Säule wurde mit ungefähr 150 ml 20% Essigsäure gewaschen und dann einem linearen Gradienten von 200 ml 20% Essigsäure bis 200 ml 20% Essigsäure, enthaltend 0,30 N Salzsäure, unterworfen. Das Produkt eluierte, wenn die Konzentration der Salzsäure zwischen 0,08 und 0,15 N betrug. Das gewünschte Produkt (0,19 g) wurde erhalten nach Verdampfen des Lösungsmittels, Trocknen des Rückstands im Vakuum und Verreiben mit Ether.
MS(FAB) für C&sub2;&sub6;H&sub3;&sub5;N&sub6;O&sub5;B:
Berechnet: + H: 523,29.
Gefunden: 579,34 (nicht identifiziert).
Analyse für C&sub2;&sub6;H&sub3;&sub6;N&sub6;O&sub5;ClB:
Berechnet: C 53,29%, H 6,55%, N 14,34% und B 1,84%.
Gefunden: C 53,27%, H 6,58%, N 13,25% und B 1,89%.
Die Veresterung des Produkts mit Pinandiol wie beschrieben in Beispiel 8a ergab ein Produkt, dessen NMR- und MS-Charakteristika mit dem Ausgangsester von Beispiel 19 in Einklang standen.
MS(FAB) für C&sub3;&sub6;H&sub4;&sub9;N&sub6;O&sub5;B:
Berechnet + H: 657,40.
Gefunden: 657,39.

Beispiel 21

Bz-Pro-Phe-BoroArg-F-hydrochlorid

Bz-Pro-Phe-NH-CH[(CH&sub2;)&sub3;-NH-C(NH)NH&sub2;]BF&sub2; HCl

Bz-Pro-Phe-BoroArg-F wurde hergestellt mit Hilfe einer Abwandlung des von Kinder et al., J.Med.Chem. 28, 1917-1925 (1985), beschriebenen Verfahrens. Die freie Boronsäure (Verbindung von Beispiel 20; 0,100 g; 0,179 mmol) wurde in 2 ml Wasser gelöst. Dazu wurden bei Raumtemperatur 0,040 ml 48% Flußsäure gegeben. Fast augenblicklich bildete sich ein gummiartiger Niederschlag. Die Reaktion wurde 10 min lang gerührt, dann wurde die Mischung gefroren, und überschüssige Flußsäure und Wasser wurden im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in Methanol gelöst, eingeengt und mit Ether verrieben. Es wurde eine Ausbeute von 0,093 g erhalten.
MS(FAB) für C&sub2;&sub6;H&sub3;&sub3;N&sub6;O&sub3;BF&sub2;:
Berechnet + H: 527,29.
Gefunden: 527,31 sowie zusätzliche, für freie Boronsäure charakteristische Massen.
Analyse für C&sub2;&sub6;H&sub3;&sub4;N&sub6;O&sub3;BF&sub2;Cl H&sub2;O
Berechnet: C 53,47%, H 6,25%, N 14,47%, B 1,86% und F 6,54%.
Gefunden: C 54,00%, H 6,40%, N 13,48%, B 1,95% und F 7,06%.

Beispiel 22

Boc-(D)Phe-Pro-BoroIrg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; HBr

BoroIrg-ist die Abkürzung für -NH-CH[(CH&sub2;)&sub3;S-C(NH)NH&sub2;]BO&sub2;-, worin die Isothiouronium-Gruppe das Guanidino von Boroarginin ersetzt. Boc-(D)Phe-Pro-NH-CH[(CH&sub2;)&sub3;Br]BO&sub2;-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; (Verbindung von Beispiel 2; 1,00 g; 1,61 mmol) wurde in 4 ml absolutem Ethanol gelöst, und Thioharnstoff (0,37 g; 4,82 mmol) wurde zugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Lösung wurde eingeengt, und der Rückstand wurde fit Ether verrieben, um 0,58 g eines Feststoffs zu ergeben. Der resultierende Feststoff wurde an einer 2,5 x 50 cm Säule mit LH-20 in Methanol chromatographiert. Die das gewünschte Produkt enthaltenden vereinigten Fraktionen wurden eingedampft, um 0,26 g Produkt zu ergeben. Die Probe wurde mit Ether verrieben, um 0,150 g eines amorphen Feststoffs zu ergeben.
MS(FAB) für C&sub3;&sub4;H&sub5;&sub3;N&sub5;O&sub6;BS:
Berechnet + H: 670,38.
Gefunden: 670,39.
Analyse für C&sub3;&sub4;H&sub5;&sub3;N&sub5;O&sub6;SBrB:
Berechnet: C 54,40%, H 7,13%, N 9,33% und B 1,44%.
Gefunden: C 54,10%, H 7,39%, N 9,27% und B 1,47%.
Der aus dieser Reaktion erhaltene Ether-lösliche Rückstand bestand hauptsächlich aus Ausgangsmaterial, das durch längere Reaktionszeiten in das Isothiouronium-Salz umgewandelt wurde.
Dieses allgemeine Verfahren wurde angewandt, um weitere Isothiouronium-Salze herzustellen, außer in einigen Fällen, wo ein 4facher Überschuß an Thioharnstoff und 3-4 Tage Reaktionszeit angewandt wurden.

Beispiel 23

H-(D)Phe-Pro-BoroIrg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; HBr,HCl

Boc-(D)Phe-Pro-BoroIrg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; HBr (Verbindung von Beispiel 22; 0,050 g; 0,067 mmol) wurde 15 min lang bei Raumtemperatur umgesetzt mit 1 ml 4 N Chlorwasserstoff in Dioxan. Das Lösungsmittel wurde verdampft, und der Rückstand wurde mit Ether verrieben, um 0,040 g eines weißen Feststoffs zu ergeben.
MS(FAB) für C&sub2;&sub9;H&sub4;&sub5;N&sub5;O&sub4;SB:
Berechnet + H: 571,29.
Gefunden: 570,47.

Beispiel 24

Ac-Ala-Lys(Boc)-BoroIrg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; HBr

Ac-Ala-Lys(Boc)-NH-CH[(CH&sub2;)&sub3;Br)BO&sub2;-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; (von Beispiel 13, 0,700 g; 1,04 mmol) wurde 4 Tage lang mit Thioharnstoff (0,320 g; 4,00 mmol) in 4 ml absolutem Ethanol umgesetzt. Das Produkt wurde gereinigt mit Hilfe des in Beispiel 22 beschriebenen Verfahrens. Nach der Chromatographie wurden 0,28 g des gewünschten Produkts erhalten. Verreiben mit Ether ergab 0,173 g des Produkts als amorphen weißen Feststoff.
MS(FAB) für C&sub3;&sub1;H&sub5;&sub5;N&sub6;O&sub7;SB:
Berechnet + H: 667,8.
Gefunden: 667.
Analyse für C&sub3;&sub1;H&sub5;&sub6;N&sub6;O&sub7;SBrB:
Berechnet: C 49,79%, H 7,56%, N 11,24% und B 1,44%.
Gefunden: C 49,20%, H 7,62%, N 11,31% und B 1,36%.

Beispiel 25

Ac-Ala-Lys-BoroIrg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; 2HBr

Ac-Ala-Lys(Boc)-BoroIrg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; HBr (die Verbindung von Beispiel 24, 0,050 g; 0,067 mmol) wurde in 1 ml Methanol gelöst, und es wurde 10 min lang Bromwasserstoff-Gas durch die Lösung hindurchperlen gelassen. Das Lösungsmittel wurde durch Verdampfen entfernt, und der Rückstand wurde mit Ether verrieben, um das gewünschte Produkt als Feststoff zu ergeben (49 mg).
MS(FAB) für C&sub3;&sub6;H&sub4;&sub7;N&sub6;O&sub5;SB:
Berechnet + H: 567,35.
Gefunden: 567,41.

Beispiel 26

Ac-Phe-BoroIrg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; HBr
Ac-Phe-NH-CH[(CH&sub2;)&sub3;Br]BO&sub2;-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; HCl (von Beispiel 9; 1,00 g; 2,41 mmol) wurde nach dem in Beispiel 22 beschriebenen Verfahren mit einem 3fachen Überschuß Thioharnstoff in 5 ml absolutem Ethanol umgesetzt. Das Produkt (0,284 g) wurde als weißer amorpher Feststoff erhalten. Zusätzliches Produkt wurde erhalten durch abermaliges Umsetzen jeglichen verbliebenen Ether-löslichen Materials mit Thioharnstoff und Wiederholen des Reinigungsvorgangs.
MS(FAB) für C&sub2;&sub6;H&sub3;&sub9;N&sub4;O&sub4;SB:
Berechnet + H: 515,29.
Gefunden: 515,29.
Analyse für C&sub2;&sub6;H&sub3;&sub9;N&sub4;O&sub4;SB:
Berechnet: C 52,44%, H 6,79%, N 9,41% und B 1,82%.
Gefunden: C 52,83%, H 6,89%, N 8,47% und B 1,85%.

Beispiel 27

Bz-Pro-Phe-BoroIrg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; HBr

Bz-Pro-Phe-NH-CH[(CH&sub2;)&sub3;Br]BO&sub2;-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; (Produkt von Beispiel 19; 0,500 g, 0,737 mmol) wurde verwendet, um das Produkt dieses Beispiels nach dem in Beispiel 22 beschriebenen Verfahren herzustellen. Das Produkt (0,358 g) wurde als weißer Feststoff erhalten.
MS(FAB) für C&sub3;&sub6;H&sub4;&sub8;N&sub5;O&sub5;SB:
Berechnet + H: 674,35.
Gefunden: 674,27.
Analyse für C&sub3;&sub6;H&sub4;&sub9;N&sub5;O&sub5;SBBr:
Berechnet: C 57,29%, H 6,56%, N 9,28% und B 1,43%.
Gefunden: C 57,46%, H 6,45%, N 8,78% und B 1,38%

Beispiel 28:

Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-BoroIrg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; HBr

Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-NH-CH[(CH&sub2;)&sub3;Br]BO&sub2;-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; (Produkt von Beispiel 15; 0,770 g, 0,980 mmol) wurde verwendet, um das Isothiouronium-Analogon dieses Beispiels nach dem in Beispiel 22 beschriebenen Verfahren herzustellen. Nach Chromatographie der Reaktionsprodukte wurde das Endprodukt (0,400 g) durch Verreiben mit Hexan als weißer Feststoff erhalten.
MS(FAB) für C&sub3;&sub7;H&sub6;&sub6;N&sub7;O&sub8;SB:
Berechnet + H: 780,48.
Gefunden 780,52.
Analyse für C&sub3;&sub7;H&sub6;&sub7;N&sub7;O&sub8;SBrB:
Berechnet: C 51,62%, H 7,86%, N 11,39% und B 1,26%.
Gefunden: C 51,03%, H 7,86%, N 11,14% und B 1,18%.

Beispiel 29

H-Leu-Gly-Leu-Ala-BoroIrg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; 2HBr

Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-BoroIrg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; HBr (Verbindung von Beispiel 28; 0,100 g; 0,12 mmol) wurde in 1 ml Methanol gelöst, und es wurde 1 ml 0,7 N Bromwasserstoff in Methylenchlorid zugesetzt. Die Mischung wurde 15 min lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel und überschüssiger Bromwasserstoff wurden durch Verdampfen entfernt, und der Rückstand wurde mit Ether verrieben, um das gewünschte Produkt in nahezu quantitativer Ausbeute zu ergeben.
MS(FAB) für C&sub3;&sub2;H&sub5;&sub8;N&sub7;O&sub6;SB:
Berechnet + H: 680,43.
Gefunden: 680,50.

Beispiel 30

Bz-Glu(OBu)-Gly-BoroIrg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; HBr

Bz-Glu(OBu)-Gly-NH-CH[(CH&sub2;)&sub3;Br]BO&sub2;-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; (Produkt von Beispiel 17; 0,293 g; 0,433 mmol) wurde verwendet, um das Isothiouronium-Analogon (0,220 g) nach dem in Beispiel 22 beschriebenen Verfahren herzustellen.
MS(FAB) für C&sub3;&sub3;H&sub5;&sub0;N&sub5;O&sub7;SB:
Berechnet + H: 672,36.
Gefunden: 672,3.
Analyse für C&sub3;&sub3;H&sub5;&sub1;N&sub5;O&sub7;SBBr:
Berechnet: C 52,66%, H 6,84%, N 9,31% und B 1,44%.
Gefunden: C 52,38%, H 6,76%, N 8,81% und B 1,46%.

Beispiel 31

Bz-Glu-Gly-BoroIrg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; HBr

Bz-Glu(OBu)-Gly-BoroIrg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; HBr (das Produkt von Beispiel 30; 0,050 g; 0,066 mmol) wurde in 1 ml TFA gelöst und 1 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Es wurde Bromwasserstoff in Methylenchlorid (0,35 mmol) zugesetzt, und die Flüssigkeit der resultierenden Lösung wurde verdampft. Der Rückstand wurde mit Ether verrieben, um 47 mg zu ergeben.
MS(FAB) für C&sub2;&sub9;H&sub4;&sub2;N&sub5;O&sub7;SB:
Berechnet + H: 616,30.
Gefunden: 616,34.

Beispiel 32

Boc-(D)Phe-Phe-BoroIrg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; HBr

Boc-(D)Phe-Phe-NH-CH[(CH&sub2;)&sub3;Br]BO&sub2;-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; (Verbindung von Beispiel 11; 1,50 g; 2,07 mmol) wurde verwendet, um das Isothiouronium-Analogon (0,90 g) nach dem in Beispiel 22 beschriebenen Verfahren herzustellen.
MS(FAB) für C&sub3;&sub8;H&sub5;&sub4;N&sub5;O&sub6;SB:
Berechnet + H: 719,84.
Gefunden: 720.
Analyse für C&sub3;&sub8;H&sub5;&sub5;N&sub5;O&sub6;SBBr: Berechnet: C 56,99%, H 6,94%, N 8,75% und B 1,35%. Gefunden: C 55,89%, H 6,87%, N 8,59% und B 1,18%.

Beispiel 33

H-(D)Phe-Phe-BoroIrg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; 2HBr

Boc-(D)Phe-Phe-BoroIrg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; HBr (Verbindung von Beispiel 20; 0,20 g; 0,25 mmol) wurde nach dem in Beispiel 29 beschriebenen Verfahren mit Bromwasserstoff umgesetzt, um 188 mg des gewünschten Produkts zu ergeben.
MS(FAB) für C&sub3;&sub3;H&sub4;&sub6;N&sub5;O&sub4;SB:
Berechnet + H: 620,34.
Gefunden: 620,40.

Beispiel 34

Z-Phe-Gly-Gly-BoroIrg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; HBr

Z-Phe-Gly-Gly-NH-CH[(CH&sub2;)&sub3;Br)BO&sub2;-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; wurde hergestellt durch Kuppeln von Z-Phe-Gly-Gly-OH an das Amin (Beispiel 1a) mit Hilfe des in Beispiel 2 beschriebenen Verfahrens.
Analyse für C&sub3;&sub5;H&sub4;&sub6;N&sub4;O&sub7;BBr:
Berechnet: C 57,93%, H 6,40%, N 7,72% und B 1,49%.
Gefunden: C 58,42%, H 6,83%, N 7,74% und B 1,96%.
Das Alkylhalogenid (1,00 g; 1,38 mmol) wurde in das Isothiouronium-Analogon überführt mit Hilfe der Methode von Beispiel 22, um das Produkt (0,87 g) als weißen amorphen Feststoff zu ergeben.
MS(FAB) für C&sub3;&sub6;H&sub4;&sub9;N&sub6;O&sub7;SB:
Berechnet + H: 721,36.
Gefunden: 721,32.
Analyse für C&sub3;&sub6;H&sub5;&sub0;N&sub6;O&sub7;SBBr: Berechnet: C 54,00%, H 6,31%, N 10,50% und B 1,35%. Gefunden: C 53,17%, H 6,50%, N 10,03% und B 1,25%.

Beispiel 35

Boc-Ala-Phe-(D,L)BoroIrg-C&sub6;H&sub1;&sub2; HBr

Boc-Ala-Phe-OMe wurde hergestellt mit Hilfe des in Beispiel 2 beschriebenen Verfahrens der gemischten Anhydride.
Analyse für C&sub1;&sub8;H&sub2;&sub6;N&sub2;O&sub5;:
Berechnet: C 61,70%, H 7,48%, N 7,99%.
Gefunden: C 61,51%, H 7,56%, N 7,92%.
Der Methylester wurde mit Base hydrolysiert, um Boc-Ala-Phe-OH in einer Ausbeute von 56% zu ergeben.
Boc-Ala-Phe-NH-CH[(CH&sub2;)&sub3;Br)BO&sub2;-C&sub6;H&sub1;&sub2; wurde hergestellt durch Kuppeln von Boc-Ala-Phe-OH an NH&sub2;-CH[(CH&sub2;)&sub3;Br]BO&sub2;-C&sub6;H&sub1;&sub2; HCl (Beispiel 1b) mit Hilfe der in Beispiel 20 beschriebenen Methode, außer daß die LH-20-Chromatographie nicht angewandt wurde.
Boc-Ala-Phe-NH-CH[(CH&sub2;)&sub3;Br)BO&sub2;-C&sub6;H&sub1;&sub2; (1,00 g; 1,72 mmol) wurde mit Thioharnstoff umgesetzt mit Hilfe des in Beispiel 22 beschriebenen Verfahrens, um das Isothiouronium- Analogon (0,485 g) als weißen Feststoff zu ergeben.
MS(FAB) für C&sub2;&sub8;H&sub4;&sub6;N&sub5;O&sub6;SB:
Berechnet + H: 592,33.
Gefunden: 592,60.
Analyse für C&sub2;&sub8;H&sub4;&sub7;N&sub5;O&sub6;SBBr:
Berechnet: C 50,00%, H 7,06%, N 10,41% und B 1,61%.
Gefunden: C 49,50%, H 7,24%, N 10,22% und B 1,41%.

Beispiel 36

H-Ala-Phe-(D,L)BoroIrg-C&sub6;H&sub1;&sub2; 2HBr

Boc-Ala-Phe-BoroIrg-C&sub6;H&sub1;&sub2; HBr (Beispiel 35; 0,10 g; 0,149 mmol) wurde umgesetzt mit Bromwasserstoff nach dem in Beispiel 29 beschriebenen Verfahren, um das gewünschte Produkt in nahezu quantitativer Ausbeute zu ergeben.
MS(FAB) für C&sub2;&sub3;H&sub3;&sub8;N&sub5;O&sub6;SB:
Berechnet + H: 492,28.
Gefunden: 492,26.

Beispiel 37

Boc-Ala-Phe-(D,L)BoroHomoIrg-C&sub6;H&sub1;&sub2; HBr

Boc-Ala-Phe-NH-CH[(CH&sub2;)&sub4;-S-C(NH)NH&sub2;]BO&sub2;-C&sub6;H&sub1;&sub2; HBr

Boc-Ala-Phe-OH (von Beispiel 35) wurde an das Amin (Beispiel 1d) gekuppelt, um Boc-Ala-Phe-NH-CH[(CH&sub2;)&sub4;Br]BO&sub2;-C&sub6;H&sub1;&sub2; zu ergeben. Es wurde das Verfahren von Beispiel 2 angewandt, außer daß der LH-20-Chromatographieschritt zur Reinigung nicht erforderlich war. Eine analytische Probe wurde erhalten durch Chromatographie an Kieselgel unter Verwendung von Ethylacetat als Elutionsmittel.
MS(FAB) für C&sub2;&sub8;H&sub4;&sub5;N&sub3;O&sub6;BrB:
Berechnet + H: 610,27.
Gefunden: 610,24.
Analyse für C&sub2;&sub8;H&sub4;&sub5;N&sub3;O&sub6;BrB:
Berechnet: C 55,19%, H 7,28%, N 6,90%, Br 13,11% und B 1,78%
Gefunden: C 55,30%, H 7,39%, N 6,40%, Br 12,07% und B 1,95%
Das Alkylbromid (0,537 g; 0,883 mmol) wurde nach dem Verfahren von Beispiel 22 mit Thioharnstoff umgesetzt. Das Produkt (0,23 g) wurde nach Verreiben mit Ether als amorpher weißer Feststoff erhalten.
MS(FAB) für C&sub2;&sub9;H&sub4;&sub8;N&sub5;O&sub6;SB:
Berechnet + H: 606,35.
Gefunden: 606,38.
Analyse für C&sub2;&sub9;H&sub4;&sub9;N&sub5;O&sub6;SBBr:
Berechnet: C 50,73%, H 7,21%, N 10,20% und B 1,57%.
Gefunden: C 50,22%, H 7,46%, N 9,74% und B 1,55%.

Beispiel 38

H-Ala-Phe-(D,L)BoroHomoIrg-C&sub6;H&sub1;&sub2; 2HBr

Boc-Ala-Phe- (D,L)BoroHomolrg-C&sub6;H&sub1;&sub2; HBr (Verbindung von Beispiel 37; 0,050 g; 0,073 mmol) wurde mit Bromwasserstoff reagieren gelassen nach dem in Beispiel 29 beschriebenen Verfahren, um 44 mg des gewünschten Produkts zu ergeben.
MS(FAB) für C&sub2;&sub4;H&sub4;&sub0;N&sub5;O&sub4;SB:
Berechnet + H: 506,30.
Gefunden: 506,39.

Beispiel 39

Boc-Ala-Phe-(D,L)BoroLys-C&sub6;H&sub1;&sub2; HCl

Boc-Ala-Phe-NH-CH[(CH&sub2;)&sub4;NH&sub2;]BO&sub2;-C&sub6;H&sub1;&sub2;-Benzolsulfonsäure

Boc-Ala-Phe-NH-CH[(CH&sub2;)&sub4;Br]BO&sub2;-C&sub6;H&sub1;&sub2; (von Beispiel 35) wurde in das Alkylazid überführt mit Hilfe des Verfahrens von Beispiel 3, außer daß der LH-20-Chromatographieschritt zur Reinigung nicht erorderlich war. Das Azid wurde hydriert mit Hilfe der in Beispiel 4 beschriebenen Methode, außer daß 2 Äquivalent Benzolsulfonsäure verwendet wurden und die Hydrierzeit sich auf 2 h belief, um das Endprodukt in einer Ausbeute von 40% zu ergeben (Schmp. 154-160º, Zers.)
MS(FAB) für C&sub2;&sub8;H&sub4;&sub6;N&sub4;O&sub6;B:
Berechnet + H: 547,38.
Gefunden: 547,43.

Beispiel 40

H-Ala-Phe-(D,L)BoroLys-C&sub6;H&sub1;&sub2; TFA Benzolsulfonsäure

Boc-Ala-Phe-(D,L)BoroLys-C&sub6;H&sub1;&sub2; Benzolsulfonsäure (Verbindung von Beispiel 39) wurde 1 h lang bei Raumtemperatur mit Trifluoressigsäure umgesetzt. Das Lösungsmittel wurde verdampft, und der Rückstand wurde mit Ether verrieben, um einen Feststoff zu ergeben.
MS(FAB) für C&sub2;&sub3;H&sub3;&sub9;N&sub4;O&sub4;B:
Berechnet + H: 447,31.
Gefunden: 447,31.
Analyse für C&sub3;&sub1;H&sub4;&sub6;N&sub4;O&sub9;SF&sub3;B 2H&sub2;O:
Berechnet: C 49,34%, H 6,68%, N 7,42% und B 1,43%.
Gefunden: C 49,26%, H 5,94%, N 7,12% und B 1,34%.

Beispiel 41

Boc-(D)Val-Leu-BoroLys-C&sub6;H&sub1;&sub2; Benzolsulfonsäure

Boc-(D)Val-Leu-OH wurde hergestellt mit Hilfe der in Beispiel 2 beschriebenen Methode. Der Benzylester wurde in einer Ausbeute von 76% erhalten.
MS(FAB) für C&sub2;&sub3;H&sub3;&sub6;N&sub2;O&sub5;:
Berechnet + H: 421,27.
Gefunden: 421,38.
Nach Hydrierung wurde die freie Säure als weißer kristalliner Feststoff in einer Ausbeute von 100% erhalten.
Analyse für C&sub1;&sub6;H&sub2;&sub9;N&sub2;O&sub5;:
Berechnet: C 59,34%, H 8,87% und N 8,50%.
Gefunden: C 59,34%, H 8,87% und N 8,50%.
Boc-(D)Val-Leu-OH wurde an das Amin (Beispiel 1d) gekuppelt unter Anwendung des in Beispiel 37 beschriebenen Verfahrens zum Kuppeln von Boc-Ala-Phe-OH, um Boc-(D)Val-Leu-NHCH[(CH&sub2;)&sub4;Br]BO&sub2;-C&sub6;H&sub1;&sub2; in einer Ausbeute von 97% zu ergeben.
MS(FAB) für C&sub2;&sub7;H&sub5;&sub1;N&sub3;O&sub6;BBr:
Berechnet + H: 604,31.
Gefunden: 604,31.
Das Alkylbromid wurde mit Hilfe des in Beispiel 3 beschriebenen Verfahrens in einer Ausbeute von 85% in das entsprechende Azid überführt, und das Azid wurde mit Hilfe des in Beispiel 39 beschriebenen Verfahrens hydriert, um das Endprodukt als weißen Feststoff in einer Ausbeute von 62% zu ergeben.
MS(FAB) für C&sub2;&sub7;H&sub5;&sub3;N&sub4;O&sub6;B:
Berechnet + H: 541,41.
Gefunden: 541,46.
Analyse für C&sub3;&sub3;H&sub5;&sub9;N&sub4;O&sub9;SB 1,5H&sub2;O
Berechnet: C 54,62%, H 8,61%, N 7,73% und B 1,49%.
Gefunden: C 54,58%, H 8,59%, N 7,92% und B 1,98%

Beispiel 42

Ac-Phe-BoroLys-C&sub6;H&sub1;&sub2; Benzolsulfonsäure

Beispiel 42 wurde hergestellt nach dem in Beispiel 39 beschriebenen Verfahren. Ac-Phe-NH-CH[(CH&sub2;)&sub4;Br)BO&sub2;-C&sub6;H&sub1;&sub2; wurde in einer Ausbeute von 72% hergestellt.
MS(FAB) für C&sub2;&sub2;H&sub3;&sub4;N&sub2;O&sub4;BBr:
Berechnet + H: 481,00.
Gefunden: 481,21.
Das Azid wurde in einer Ausbeute von 57% erhalten. Das Endprodukt wurde in einer Ausbeute von 50% erhalten.
MS(FAB) für C&sub2;&sub2;H&sub3;&sub7;N&sub3;O&sub4;B:
Berechnet: + H: 418,29.
Gefunden: 418,31.
Analyse für C&sub2;&sub9;H&sub4;&sub2;N&sub3;O&sub7;SB H&sub2;O:
Berechnet: C 56,66%, H 7,47%, N 7,08% und B 1,82%.
Gefunden: C 56,88%, H 7,43%, N 7,22% und B 1,53%.

Beispiel 43

Bz-(D,L)BoroIrg-C&sub6;H&sub1;&sub2; HBr

Bz-(D,L)NH-CH[(CH&sub2;)&sub3;Br]BO&sub2;-C&sub6;H&sub1;&sub2; wurde hergestellt durch Umsetzen des Amins (Beispiel 1b, 5,0 g; 15,9 mmol) mit einem Äquivalent Benzoylchlorid und zwei Äquivalenten Natriumbicarbonat in einer Mischung, bestehend aus 4 ml Dioxan und 4 ml Wasser bei 0º. Nach Mischen der Reagenzien zu Beginn wurde die Reaktion mit 6 ml 50% Dioxan/Wasser verdünnt und auf Raumtemperatur erwärmen gelassen. Die Reaktionsmischung wurde ungefähr 30 min bei Raumtemperatur gerührt, und das Produkt wurde in Ethylacetat extrahiert und mit Wasser, 0,2 N Salzsäure, 5% wäßrigem Natriumbicarbonat und gesättigtem wäßrigen Natriumchlorid gewaschen. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und verdampft, um ein kristallines Produkt zu ergeben. Nach Isolieren und Waschen mit Ethylacetat wurden 3,26 g Verbindung (Schmp. 176-177º) erhalten.
Analyse für C&sub1;&sub7;H&sub2;&sub5;NO&sub3;BrB:
Berechnet: C 53,44%, H 6,59%, N 3,67% und B 2,83%.
Gefunden: C 54,50%, H 6,76%, N 3,68% und B 2,84%.
Das Alkylhalogenid (1,00 g; 2,62 mmol) wurde mit Hilfe des in Beispiel 22 beschriebenen Verfahrens in das entsprechende Isothiouronium-Salz überführt. Das Produkt, 0,84 g, wurde als weißer Feststoff erhalten.
MS(FAB) für C&sub1;&sub8;H&sub2;&sub8;N&sub3;O&sub3;SB:
Berechnet + H: 378,20.
Gefunden: 378,21.
Analyse für C&sub1;&sub8;H&sub2;&sub9;N&sub3;O&sub3;SBBr:
Berechnet: C 47,18%, H 6,38%, N 9,17% und B 2,36%.
Gefunden: C 46,11%, H 6,71%, N 8,97% und B 2,22%. Beispiel 44 Bz-(D,L)BoroArg-C&sub6;H&sub1;&sub2; Benzolsulfonsäure
Das Alkylhalogenid (Beispiel 43, 2,0 g; 5,25 mmol) wurde mit Hilfe des Verfahrens von Beispiel 3 in 0,97 g Azid (Schmp. 138-139º) überführt. Das Azid wurde nach dem Verfahren in Beispiel 4 in nahezu quantitativer Ausbeute in Bz-BoroOrn- C&sub6;H&sub1;&sub2; Benzolsulfonsäure überführt.
MS(FAB) für C&sub1;&sub8;H&sub2;&sub7;N&sub2;O&sub3;B: Berechnet + H: 319,22. Gefunden: 319,26.
Bz-BoroOrn-C&sub6;H&sub1;&sub2; Benzolsulfonsäure (0,90 g; 1,84 mmol) wurde nach dem Verfahren von Beispiel 5 mit Cyanamid umgesetzt, um 0,65 g kristallines Produkt (Schmp. 242-244º) zu ergeben.
FAB(MS) für C&sub1;&sub8;H&sub2;&sub9;N&sub4;O&sub3;B:
Berechnet + H: 361,24.
Gefunden: 361,24.
Analyse für C&sub2;&sub4;H&sub3;&sub5;N&sub4;O&sub6;SB:
Berechnet: C 55,59%, H 6,82%, N 10,81% und B 2,08%.
Gefunden: C 54,60%, H 6,70%, N 11,24% und B 1,87%.

Beispiel 45

Ac-Leu-Thr(OBu)-BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; Benzolsulfonsäure

Ac-Leu-Thr(OBu)-OH wurde hergestellt durch Kuppeln von Ac-Leu-OSu an H-Thr(OBu)-OH mit Hilfe des Verfahrens von Beispiel 13 für die Dipeptidsynthese, außer daß das Endprodukt nach Chromatographie an LH-20 als amorpher weißer Feststoff erhalten wurde. Ac-Leu-Thr(OBu)-OH (3,29 g; 9,90 mmol) wurde an das Amin (Beispiel 1a) gekuppelt unter Anwendung der Methode der gemischten Anhydride von Beispiel 2, außer daß der LH-20-Chromatographieschritt nicht erforderlich war.
Ac-Leu-Thr(OBu)-NH-CH[(CH&sub2;)&sub3;Br]BO&sub2;-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; wurde als amorpher weißer Feststoff, 5,39 g, erhalten. Das Alkylhalogenid wurde nach der Methode von Beispiel 3 in einer Ausbeute von 82% in das entsprechende Azid überführt, außer daß ein Chromatographieschritt zur weiteren Reinigung nicht erforderlich war. Das Azid (3,88 g; 6,42 mmol) wurde mit Hilfe des Verfahrens von Beispiel 4 hydriert. Das Produkt, Ac-Leu-Thr(OBu)-Boro-Orn-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; Benzolsulfonsäure, wurde nach Chromatographie des Produkts an LH-20 und Verreiben mit Ether in einer Ausbeute von 74% erhalten.
MS(FAB) für C&sub3;&sub0;H&sub5;&sub5;N&sub4;O&sub6;B:
Berechnet + H: 579,43.
Gefunden: 579,48.
Das Boroornithin-Peptid wurde nach der Methode von Beispiel 5 in einer Ausbeute von 86% in das Endprodukt überführt.
MS(FAB) für C&sub3;&sub1;H&sub5;&sub7;N&sub6;O&sub6;B:
Berechnet + H: 621,45.
Gefunden: 621,50.
Analyse für C&sub3;&sub7;H&sub6;&sub3;N&sub6;SO&sub9;B:
Berechnet: C 57,05%, H 8,17%, N 10,79% und B 1,39%.
Gefunden: C 56,47%, H 8,01%, N 10,93% und B 1,34%.

Beispiel 46

Ac-Leu-Thr-BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; Benzolsulfonsäure

Ac-Leu-Thr(OBu)-BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; Benzolsulfonsäure (Beispiel 45; 0,200 g; 0,257 mmol) wurde in einer Mischung von 2 ml Methylenchlorid und 2 ml 4 N HCl/Dioxan gelöst und 30 min bei Raumtemperatur rührengelassen. Das Lösungsmittel wurde verdampft und der Rückstand unter Hochvakuum getrocknet. Das gewünschte Produkt wurde durch Verreiben mit Ether als weißer Feststoff in einer Ausbeute von 97% erhalten.
MS(FAB) für C&sub2;&sub7;H&sub4;&sub9;N&sub6;O&sub6;B:
Berechnet + H: 565,39.
Gefunden: 565,48.

Beispiel 47

Ac-Lys(Boc)-Pro-BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; Benzolsulfonsäure

Ac-Lys(Boc)-Pro-OH wurde hergestellt mit Hilfe des in Beispiel 13 beschriebenen Verfahrens. Es wurde nach Umkristallisieren aus Ethylacetat als weißer Feststoff (Schmp. 160-161.5º) erhalten. Nach dem Verfahren von Beispiel 2 wurde Ac-Lys(Boc)-Pro-OH (3,15 g; 8,18 mmol) an das Amin (Beispiel 1a) gekuppelt. Das Produkt, 5,8 g, wurde ohne weitere Reinigung verwendet. Es wurde mit Hilfe der Methode von Beispiel 3 in das Azid überführt in einer Ausbeute von 73% nach Chromatographie an LH-20. Hydrierung nach der Methode von Beispiel 4, Chromatographie an LH-20 und Verreiben der Probe mit Ether ergab Ac-Lys(Boc)-Pro-BoroOrn- C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; Benzolsulfonsäure in einer Ausbeute von 81%.
MS(FAB) für C&sub3;&sub2;H&sub5;&sub5;N&sub5;O&sub7;B:
Berechnet + H: 634,43.
Gefunden: 634,46.
Das Boroornithin-Peptid (2,0 g; 2,53 mmol) wurde mit Hilfe des Verfahrens von Beispiel 5 mit Cyanamid umgesetzt, um 1,8 g des gewünschten Produkts als einen weißen Feststoffe zu ergeben.
MS(FAB) für C&sub3;&sub3;H&sub5;&sub7;N&sub7;O&sub7;B:
Berechnet + H: 676,46.
Gefunden: 676,41.
Analyse für C&sub3;&sub9;H&sub6;&sub3;N&sub7;O&sub1;&sub0;SB:
Berechnet: C 56,23%, H 7,64%, N 11,77% und B 1,30%.
Gefunden: C 56,06%, H 7,48%, N 11,75% und B 1,22%.

Beispiel 48

Ac-Lys-Pro-BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; 2HCl

Ac-Lys(Boc)-Pro-BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; Benzolsulfonsäure (Beispiel 47; 0,30 g; 0,360 mmol) wurde mit einer 50:50-Mischung aus Eisessig und 4 N HCl/Dioxan 15 min lang bei Raumtemperatur umgesetzt. Das Lösungsmittel wurde verdampft und der Rückstand im Vakuum getrocknet. Der Rückstand wurde in Wasser gelöst und über eine 5 ml-Säule mit AG1-X8 (Cl&supmin;-Form) gegeben. Die Probe wurde eingedampft und der Rückstand mit Ether verrieben, um das gewünschte Produkt als weißen Feststoff zu ergeben (230 mg).
MS(FAB) für C&sub2;&sub8;H&sub4;&sub9;N&sub7;O&sub5;B:
Berechnet + H: 576,40.
Gefunden: 576,45.

Beispiel 49

Ac-Ala-Glu(OBu)-BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; Benzolsulfonsäure

Ac-Ala-Glu(OBu)-OH wurde hergestellt durch Kuppeln von Ac-Ala-OSu an H-Glu(OBu)-OH unter Anwendung der Methode von Beispiel 13. Das Produkt kristallisiert aus Ethylacetat/Hexan (Schmp. 147,5-148º).
Analyse für C&sub1;&sub4;H&sub2;&sub4;N&sub2;O&sub6;:
Berechnet: C 53,14%, H 7,66% und N 8,85%.
Gefunden: C 53,28%, H 7,53% und N 9,08%.
Ac-Ala-Glu(OBu)-NH-CH[(CH&sub2;)&sub3;Br]BO&sub2;-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; wurde hergestellt mit Hilfe des in Beispiel 2 beschriebenen Verfahrens, außer daß zu Beginn der Aufarbeitung der Reaktion Chloroform anstelle von Ethylacetat für die organische Phase verwendet wurde und die Chromatographie an LH-20 nicht angewandt wurde. Nach Verdampfen der organischen Phase wurde das gewünschte Produkt in einer Ausbeute von 87% als teilweise kristalliner Feststoff erhalten. Das Alkylbromid wurde nach dem Verfahren von Beispiel 3 in das Azid überführt. Das gewünschte Produkt (Schmp. 163,5-166º) wurde durch Kristallisieren des Reaktionsprodukts aus Chloroform in einer Ausbeute von 50% erhalten..
Analyse für C&sub2;&sub8;H&sub4;&sub7;N&sub6;O&sub7;B:
Berechnet: C 53,51%, H 7,55%, N 6,69% und B 1,73%.
Gefunden: C 55,51%, H 7,50%, N 6,50% und B 1,66%.
Das Boroornithin-Peptid wurde hergestellt nach der Methode von Beispiel 4, um das gewünschte Produkt in einer Ausbeute von 79% zu ergeben.
MS(FAB) für C&sub2;&sub8;H&sub4;&sub9;N&sub4;O&sub7;B:
Berechnet + H: 565,38.
Gefunden: 565,51.
Das Endprodukt wurde nach dem Verfahren von Beispiel 5 als weißer amorpher Feststoff in einer Ausbeute von 70% erhalten.
MS(FAB) für C&sub2;&sub9;H&sub5;&sub1;N&sub6;O&sub7;B:
Berechnet + H: 607,40.
Gefunden: 607,41.
Analyse für C&sub3;&sub5;H&sub5;&sub7;N&sub6;O&sub1;&sub0;BS:
Berechnet: C 54,96%, H 7,53%, N 10,99% und B 1,41%.
Gefunden: C 54,36%; H 7,71%, N 11,27% und B 1,21%.

Beispiel 50

Ac-Ala-Glu-BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; Benzolsulfonsäure

Ac-Ala-Glu(Bu)-BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6; Benzolsulfonsäure (Beispiel 49; 0,10 g; 0,131 mmol) wurde in 10 ml Essigsäure gelöst, und es wurde 20 min lang wasserfreies HCl durch die Lösung perlengelassen. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur 1,5 h lang gerührt, und das Lösungsmittel wurde verdampft, um ein Öl zu ergeben. Nach Trocknen im Vakuum und Verreiben mit Ether wurde das gewünschte Produkt als weißer Feststoff (82 mg) erhalten.
MS(FAB) für C&sub2;&sub5;H&sub4;&sub3;N&sub6;O&sub7;B:
Berechnet + H: 551,34.
Gefunden: 551,41.
Mit Hilfe der im wesentlichen gleichen Verfahren wie in den obigen Beispielen 39 und 40 wurden auch die folgenden Verbindungen hergestellt:
Boc-Val-Val-BoroLys-C&sub6;H&sub1;&sub2; BSA;
H-Val-Val-BoroLys-C&sub6;H&sub1;&sub2; BSA TFA;
Boc-(D) Phe-Phe-BoroLys-C&sub6;H&sub1;&sub2; BSA;
H-(D)Phe-Phe-BoroLys-C&sub6;H&sub1;&sub2; BSA TFA
Boc-Glu-Phe-BoroLys-C&sub6;H&sub1;&sub2; BSA;
PyroGlu-Phe-BoroLys-C&sub6;H&sub1;&sub2; BSA;

Biologische Beispiele

In den folgenden Beispielen bezeichnet u Mikro.

Beispiel 51 - 71

Hemmung von Humanplasma-Kallikrein

Humanplasma-Kallikrein wurde bezogen von Protogen AG (Schweiz). Die spezifische Aktivität wie vom Zulieferer beschrieben beläuft sich auf 15 Einheiten pro mg. Eine Einheit ist definiert als die zur Hydrolyse von 1 umol Substrat, H-(D)Pro-Phe-Arg-p-nitroanilid (Kabi S2302), erforderliche Enzymmenge pro Minute bei einer Substratkonzentration von 0,50 mM bei 25º in 50 mM Kaliumphosphat- Puffer, pH 8,0.
Eine Enzym-Stammlösung (1 Einheit/ml) wurde hergestellt in 50% Glycerin/0,10 M Natriumphosphat-Puffer, pH 7,5, enthaltend 0,20 M Natriumchlorid und 0,1% PEG 6000 (Polyethylenglycol). Bei Standardtests wurden 10 ul der Kallikrein- Stammlösung bei 250 zu 990 ul einer Lösung zugesetzt, bestehend aus 0,20 mM S2302 in 0,10 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 7,5, enthaltend 0,20 M Natriumchlorid und 0,1% PEG. Die Wirkung der Inhibitoren wurde bewertet durch Überwachen der Enzymaktivität, bestimmt durch Messen der Absorptionszunahme bei 405 nm über die Zeit sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von Inhibitoren. Tabelle 1 zeigt Inhibitorkonzentrationen und verbleibende Aktivität, gemessen im Zeitintervall von 10 bis 20 min nach Ingangsetzen der Reaktion. Die Aktivität der Kontrollen belief sich auf 0,0092 ± 0,0095 min&supmin;¹. Tabelle 1 Hemmung von Humanplasma-Kallikrein Inhibitor Prozent Aktivität (Tabelle 1, Fortsetzung) Inhibitor Prozent Aktivität

Beispiel 72 - 110

Hemmung von Thrombin (Esterase-Aktivität)

Humanthrombin (spezifische Aktivität 2345 NIH-Einheiten/mg) wurde erhalten von R.Q.P. Laboratories, South Bend, IN) (Lot HT102). Eine Thrombin-Stammlösung wurde hergestellt in 0,010 M PIPES-Puffer, pH 6,0, enthaltend 0,75 M Natriumchlorid. Die Thrombintests wurden durchgeführt nach dem Verfahren von Green und Shaw, Anal.Biochem. 93, 223 (1979), in Natriumphosphat-Puffer, pH 7,5, enthaltend 0,20 M Natriumchlorid und 0,1% PEG 6000. Die Anfangskonzentration an Substrat belief sich auf 0,10 mM, und die Thrombin- Konzentration betrug 1,0 nM (gewichtsbezogen). Tabelle 2 zeigt Inhibitorspiegel und verbleibende Aktivität, gemessen im Zeitintervall von 10 bis 20 min nach Ingangsetzen der Reaktion. Die Aktivität der Kontrollen belief sich auf 0,0076 ± 0 0005 min&supmin;¹ Tabelle 2 Hemmung von Thrombin Inhibitor Prozent Aktivität (Tabelle 2, Fortsetzung) Inhibitor Prozent Aktivität

Beispiele 111- 124

Hemmung der Blutgerinnung, gezeigt anhand APTT- und PT-Bestimmung

Die Wirkung von Protease-Hemmern auf die Blutgerinnung wurde in vitro bestimmt durch Messen ihrer Wirkung auf zwei unterschiedliche klinische Parameter, den aktivierten partiellen Thromboplastin-Zeiten (APTT) und den Prothrombin-Zeiten (PT). Die jeweiligen Reagenzien für diese Tests wurden geliefert von General Diagnostics, Jessup MD. Stammlösungen der Inhibitoren wurden hergestellt in 25 mM HEPES-Puffer, pH 7,5, enthaltend 0,10 M Natriumchlorid. Für den APTT-Assay wurde die Inhibitorlösung (0,100 ml) mit normalem Humanplasma (0,100 ml) und automatisiertem APTT-Reagens (0,100 ml) inkubiert. Nach 5 min Inkubation bei 37º wurde Calciumchlorid (0,100 ml) zugesetzt, und die Gerinnungszeiten, gemessen in Sekunden, wurden in einem Fibrometer bestimmt. Die Auswirkungen der verschiedenen Inhibitorkonzentrationen auf die Blutgerinnungszeiten, verglichen mit den Blutgerinnungszeiten der Kontrolläufe in Abwesenheit von Inhibitor, sind in Tabelle 3 gezeigt.
Für die PT-Tests wurden die Inhibitorlösungen (0,100 ml) 2 min lang bei 370 mit normalem Humanplasma (0,100 ml) inkubiert. Dann wurde Simplastin-Reagenz (0,200 ml) zugesetzt und die Gerinnungszeiten gemessen wie in Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 5 gibt eine Zusammenfassung der Ergebnisse in den Tabellen 3 und 4 und zeigt die ungefähren Inhibitorkonzentrationen, die notwendig sind, um die aktivierten partiellen Thromboplastin-Zeiten (2X APTT) und die Prothrombin-Zeiten (2X PT) auf das Doppelte zu erhöhen. Verbindungsbezeichnung in den Tabellen 3-5, 7-10 Name des Inhibitors Tabelle 3 Aktivierte partielle Thromboplastinzeiten (gemessen in s) Beispiel Nummer Verbindung Tabelle 4 Prothrombin-Zeiten (gemessen in Sekunden) Beispiel Nummer Verbindung Tabelle 5 Hemmung der Blutgerinnung Berechnete Konzentration Verbindung

Beispiel 125 - 127

Hemmung der Blutgerinnung, gezeigt anhand TT-Bestimmungen

Die Wirkung des Protease-Inhibitors Ac-(D)Phe-Pro-BoroArg-OH (Beispiel 8) auf die Blutgerinnung in vitro wurde bestimmt durch Messen seiner Auswirkung auf die Thrombinzeiten (TT). Eine Mischung aus 0,2 ml normalen Kaninchenplasmas und 0,05 ml eines Puffers, der den Inhibitor mit der 6fachen gewünschten Endkonzentration enthält, wurde auf 37º erwärmt. Die Gerinnung wurde durch Zugabe von Thrombin (0,05 ml mit der 6fachen Endkonzentration) eingeleitet. Das verwendete Thrombin wurde bei Sigma Chemical Company (Nr. T-6634, Aktivität 1190 NIH-Einheiten pro mg Protein) bezogen und in Puffer präpariert. Der sowohl für den Inhibitor als auch das Thrombin verwendete Puffer war 0,1 M Tris-Puffer (12,10 g/l), enthaltend 0,154 M NaCl (8,84 g/l) und 2,5 mg/ml Rinderseruinalbumin, pH 7,4. Die in Sekunden gemessenen Gerinnungszeiten wurden mit Hilfe eines Fibrometers bestimmt. Die Auswirkungen des Inhibitors auf die Blutgerinnungszeiten, verglichen mit den Blutgerinnungszeiten der Kontrolläufe in Abwesenheit von Inhibitoren, sind in Tabelle 6 gezeigt. Die Werte stellen das Mittel aus wenigstens drei Bestimmungen dar. Trat innnerhalb 300 s keine Gerinnung auf, so wurde die Reaktion beendet. Tabelle 6 Thrombinzeiten Thrombin-Konz. (u/ml) Inhibitorkonz. (nM) Thrombinzeiten* * Mittlere für das Gerinnen erforderliche Zeit, gemessen in Sekunden, ± Standardabweichung

Beispiele 128 - 132

Stabilität von Inhibitoren in Humanplasma, gemessen mittels APTT

Die Stabilität von Inhibitoren in Plasma wurde bestimmt anhand deren Fähigkeit, die Blutgerinnung zu hemmen. Zunächst wurden Stammlösungen (1,0 uM) der zu prüfenden Inhibitoren in 25 mM HEPES-Puffer, pH 7,5, enthaltend 0,10 N Natriumchlorid, mit normalem Humanplasma auf 50% verdünnt. Die Mischungen wurden bei 0º bereitet, dann wurden aliquote Teile (0,200 ml) entnommen und für 2 min bei 37º inkubiert. Ein gleiches Volumen automatisiertes APTT-Reagens wurde zugesetzt, und die Gerinnungszeiten wurden gemessen wie in den Beispielen 111-117 beschrieben. Die Endkonzentration an Inhibitor bei den Gerinnungstests belief sich auf 250 nM.
Die Inkubationszeiten (gezeigt in Stunden) und die Gerinnungszeit (gemessen in Sekunden) sind in Tabelle 7 für die einzelnen Inhibitoren gezeigt. Die Werte für die Verbindungen E und F wurden gleichzeitig mit der Kontrolle bestimmt. Werte für die Verbindungen A, B und C wurden an einem anderen Tag erhalten. Tabelle 7 Stabilität von Inhibitoren in Humanplasma Beispiel Nummer Verbindung Kontrolle Inkubationszeit (h) Gerinnungszeit (s)

Beispiel 133-136

Stabilität von Inhibitoren in Puffer

Inhibitoren in einer Konzentration von jeweils 1,0 uM wurden bei Raumtemperatur in 0,20 M Natriumphosphat-Puffer, pH 7,5, enthaltend 0,20 M Natriumchlorid und 0,10% PEG, inkubiert. Aliquote Teile (4,0 ul) wurden entnommen und mit dem mit in den Beispielen 72-110 beschriebenen Thrombintest geprüft. Die nach der Inkubation verbleibende Thrombinaktivität und die Zeitdauer, für die sich die Inhibitoren im Natriumphosphat-Puffer befanden, ist in Tabelle 8 gegeben. Bei den Inhibitoren A und C gibt es wenig Verlust in der Inhibitoraktivität. Inhibitor B verliert seine biologische Wirkung über einen Zeitraum von einer Stunde. Tabelle 8 Stabilität der Inhibitoren in Puffer Prozent Thrombinaktivität Beispiel Nr. Verbindung

Beispiele 137 - 142

Hemmung der Blutgerinnung nach in vivo-Oraldosierung

Männliche Ratten (Sprague Dawley CD-Ratten, 130-140 g, geliefert von Charles River Labs, Inc., Wilmington, MA) wurden mit Natriumpentobarbital (50 mg/kg, i.p.) anästhesiert. Auf der ventralen Seite des Halses wurde ein Mittelschnitt vorgenommen, und in eine der Halsschlagadern wurde ein Polyethylen-Katheter eingesetzt und an der Rückseite des Halses wieder herausgeführt. Nach Erholung von der Anästhesie wurden Blutproben aus dem Halsschlagaderkatheter entnommen, mit Natriumcitrat gerinnungshemmend behandelt und zentrifugiert (2000 x g, 10 min). Das Plasma wurde in Kunststoffröhrchen überführt und bis zu seiner Prüfung auf Eis gehalten. Die Thrombinzeiten wurden mit einem Fibrometer gemessen wie in den Beispielen 125-127 beschrieben.
Den Ratten wurde mittels Zwangsfütterung entweder der Proteaseinhibitor Ac-(D)Phe-Pro-BoroArg-OH in einem Vehikel oder das Vehikel alleine in einem Volumen von weniger als 4 ml gegeben. Das verwendete Vehikel war 5% Dimethylsulfoxid in Salzlösung. Blutproben wurden zu verschiedenen Zeiten nach oralem Dosieren entnommen und wie oben beschrieben geprüft. Die Ergebnisse, gezeigt als Gerinnungszeiten in Sekunden, sind in nachstehender Tabelle 9 gegeben. Bei Gerinnungszeiten über 300 s werden diese nachstehend als > 300 angegeben. Die übrigen Daten zeigen die zur Gerinnung erforderliche mittlere Zeit, gemessen in Sekunden, ± Standardabweichung. Tabelle 9 Hemmung der Blutgerinnung nach in vivo-Oraldosierung Zeit Kontrolle Inhibitor-Konzentration * NB = nicht bestimmt.

Beispiel 143

In vivo-Hemmung der Blutgerinnung nach Oraldosierung

Um weiterhin die Fähigkeit dieser Verbindung zur in vivo-Hemmung der Blutgerinnung zu demonstrieren, wurden Ratten mit Natriumpentobarbital (50 mg/kg, i.p.) anästhesiert, ein Jugularvenenkatheter wurde eingesetzt, und der Schnitt wurde geschlossen. Nach Erholung von der Anästhesie wurden die Ratten entweder mit 5 mg/kg des Protease-Inhibitors Ac-(D)Phe-Pro-BoroArg-OH, gelöst in Wasser, oder einem gleichen Volumen Wasser oral behandelt. 30 bis 60 Minuten später erhielten alle Ratten eine Infusion von 500 Einheiten/kg Thrombin über einen Zeitraum von 1 min. Alle 14 Ratten, denen nur Wasser verabreicht wurde, starben innerhalb von 10 min nach der Thrombininfusion. Dagegen starben innerhalb 10 min nur 8 von 17 Ratten, die mit dem inhibitorhaltigen Wasser behandelt worden waren, und die Übrigen überlebten eine Stunde, wonach sie euthanasiert wurden.

Beispiele 144 - 162

In vivo-Hemmung der Blutgerinnung nach oraler, Kolon- und rektaler Verabreichung

Allgemeine Arbeitsweisen:

Männliche Lewis-Ratten mit einem Gewicht von 300-350 g wurden mit Natriumpentobarbital (50 mg/kg, i.p.) anästhesiert, und die Jugularvene wurde kanüliert mit einer Silicongummi-Schlauchleitung, die an eine Polyethylen 50-Schlauchleitung angeschlossen war. Die Schlauchleitung wurde an der Rückseite des Halses wieder herausgeführt und über einen Absperrhahn an eine Spritze angeschlossen. Vor und in verschiedenen Zeitabständen der Dosierung mit dem Protease- Inhibitor Ac-(D) Phe-Pro-BoroArg-OH wurden Blutproben (0,5 ml) mit der Spritze entnommen, die vor jeder Entnahme mit Citrat-Puffer gespült wurde. Die Blutproben wurden dann in einen Citrat-Puffer enthaltenden Vakuumbehälter überführt. Auch wurden die Kanülen nach jeder Entnahme mit Salzlösung gespült. Dann wurden die Blutproben sofort zentrifugiert (2500 U/min für 15 min), und 0,2 ml der Plasmaproben wurden für die Messungen der Gerinnungszeiten verwendet. Unter Verwendung eines Fibrometers wurden die Messungen der Gerinnungszeiten wie folgt durchgeführt. Zunächst wurde Plasma (0,2 ml) in einen Fibrobecher gegeben, und es wurde ein Tris-Puffer (50 ul; pH 7,4) zugesetzt. Die Plasma- Pufferlösung wurde 1 min lang bei 37ºC inkubiert, dann wurden 50 ul einer 24 u/ml-Thrombinlösung in Tris-Puffer zugesetzt, und die Gerinnungszeiten in Sekunden wurden gemessen. Überstiegen die Gerinnungszeiten 300 s, so sind sie nachstehend als > 300 angegeben.

Orale Dosierung:

Die Ratten mit Jugularvenenkanüle wurden zur Erholung von der Anästhesie belassen, ehe oral dosiert wurde. Die wäßrige Lösung des Protease-Inhibitors Ac-(D)Phe-Pro-BoroArg-OH, bestehend aus 3 mg Inhibitor pro kg Gewicht der Ratte (ungefähr 1 mg/Ratte) in einem Volumen von 0,75 ml Wasser pro kg Ratte, wurde durch Zwangsfütterung verabreicht. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 10 angegeben.

Kolonverabreichung:

Während die Ratten mit Jugularvenenkanüle noch unter Anästhesie waren, wurde ein Bauchhöhlenschnitt von 3 cm vorgenommen. Der Dickdarm wurde lokalisiert und wurde sowohl am Anfang als auch am Ende abgebunden. Die wäßrige Lösung des Protease-Inhibitors Ac-(D)Phe-Pro-BoroArg-OH, bestehend aus 3 mg Inhibitor pro kg Gewicht der Ratte (ungefähr 1 mg/Ratte) in einem Volumen von 1 ml Wasser pro kg Ratte, wurde zu Anfang in die Dickdarmhöhle injiziert. Der Schnitt wurde mit Wundklammern verschlossen. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 11 angegeben.

Rektale Verabreichung:

Die Arbeitsweise der rektalen Verabreichung an Ratten mit Jugularvenenkanüle war wie beschrieben bei Kamiya et al., J.Pharm.Sci. 71, 621 (1982). Kurz umrissen, es wurde eine Vorrichtung hergestellt, bestehend aus einem Silicongummi- Septum mit 0,89 cm und einem mit 0,71 cm, die durch einen Draht von 2 cm Länge verbunden waren. Diese Vorrichtung wurde in das Rektum der Ratte eingesetzt, das große Septum zuerst, und mit einem geeigneten Leim an den Anus angeklebt. Das Dosieren wurde mittels Injektion durch das freiliegende Septum vorgenommen. Die rektale Dosis belief sich auf 3 mg Protease-Inhibitor Ac-(D)Phe-Pro-BoroArg-OH pro kg Gewicht der Ratte (ungefähr 1 mg/Ratte) in einem Volumen von 0,6 ml Wasser pro kg Ratte. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 12 angegeben. Tabelle 10 In vivo-Hemmung der Blutgerinnung nach oraler Verabreichung Zeit(h) Kontrolle* Inhibitor** * Die Daten stellen den Durchschnitt für 2 Ratten dar. ** Die Daten stellen das Mittel für 3 Ratten dar. Tabelle 11 In vivo-Hemmung der Blutgerinnung nach Kolonverabreichung Zeit(h) Kontrolle* Inhibitor** * Die Daten stellen den Durchschnitt für 2 Ratten dar. ** Die Daten stellen das Mittel für 3 Ratten dar. Tabelle 12 In vivo-Hemmung der Blutgerinnung nach rektaler Verabreichung Zeit(h) Kontrolle* Inhibitor** * Die Daten wurden erhalten aus 1 Ratte. ** Die Daten stellen das Mittel für 3 Ratten dar.

Beispiele 163-168

In vivo-Hemmung von Crotonöl-induzierter Entzündung

Es wurden zwei Lösungen hergestellt, die erste bestehend aus 5% Crotonöl, einem bekannten inflammatorischen Agens, in einem Aceton-Träger (Croton-Lösung), und die zweite bestehend aus 5% Crotonöl in einem Aceton-Träger, die mit 10 mg/ml erfindungsgemäßer Verbindung versetzt war (Verbindungslösung). Die Croton-Lösung (10 ul) oder alternativ die Verbindungslösung (10 ul) wurde auf das rechte Ohr eines jeden Tiers aufgebracht (Sprague Dawley CD-Ratten, 130-140 g, geliefert von Charles River Labs, Inc., Wilmington, MA). Der Aceton-Träger alleine (Aceton-Lösung) (10 ul) wurde auf das rechte Ohr eines jeden Tiers aufgebracht. 1 h nach der Behandlung wurden die Tiere getötet, ihre Ohren entfernt, und es wurden Scheiben von 1/4 inch Durchmesser herausgestanzt und gewogen. Die Schwellung wurde gemessen als Gewichtsdifferenz zwischen Crotonlösung-behandeltem rechten Ohr und mit Aceton-Lösung behandeltem linken Ohr. Die Ergebnisse werden verglichen mit Indomethacin, einem bekannten nichtsteroidischen entzündungshemmenden Mittel (Indomethacin-Lösung), das in einer Weise hergestellt und appliziert wurde, die im wesentlichen mit der für die Verbindungslösung identisch war. Gemittelte Daten sind in Tabelle 13 für Verbindung F, Ac-Phe-BoroArg-C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub6;, gezeigt. Die Bezeichnung "Dosis", wie nachstehend verwendet, gibt die Menge an wirksamem entzündungshemmenden Bestandteil in ug (Verbindungen A, C, D, E, F oder G, oder Indomethacin, je nach Lage der Dinge) in der jeweils auf das rechte Ohr aufgetragenen Lösung an, und "n" gibt die Zahl der bei den Tests jeweils verwendeten Tiere an. "SF" bedeutet Standardfehler. Die Beispiele 164-168 in Tabelle 14 zeigen die entzündungshemmende Wirkung für die Verbindungen A, C, D, E, F und G, die unter im wesentlichen gleichen Bedingungen durchgeführt wurden (Dosis = 100 ug). Tabelle 13 Hemmung von Crotonöl-induzierter Entzündung Beispiel Dosis rechtes Ohr (ug/Ohr) Mittel rechtes Ohr Gew. (mg) Mittel linkes Ohr Gew. (mg) Mittlere Schwellung (mg+SE) Prozent Hemmung Croton Tabelle 14 Hemmung von Crotonöl-induzierter Entzündung Beispiel Nr. Verbindung Prozent Hemmung

Claims

1. Verbindung der Formel (Formel I)

worin

Y¹ und Y² unabhängig voneinander -OH oder F sind oder zusammengenommen eine Einheit bilden, die von einer Dihydroxy-Verbindung mit wenigstens zwei Hydroxy-Gruppen abgeleitet ist, die durch wenigstens zwei verbindende Atome in einer Kette oder einem Ring getrennt sind, wobei die Kette oder der Ring bis zu 20 Kohlenstoff- Atome und gegebenenfalls ein Hetero-Atom umfaßt, das N, S oder O sein kann;

R² ein substituiertes Alkyl ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -(CH&sub2;)z-X, -CH(CH&sub3;)-(CH&sub2;)&sub2;-X, -CH&sub2;-CH(CH&sub3;)-CH&sub2;-X, -(CH&sub2;)&sub2;-CH(CH&sub3;)-X und -(CH&sub2;)&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-X, worin X -NH&sub2;, -NH-C(NH)-NH&sub2; oder -S-C(NH)-NH&sub2; ist, und z 3 bis 5 ist;

n, o, p und q unabhängig voneinander 1 oder 0 sind;

A¹, A² und A³ unabhängig Aminosäuren der L- oder D-Konfiguration sind, die aus der aus Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, ser, Thr, Trp, Tyr und Val bestehenden Gruppe ausgewählt sind; wobei die funktionellen Gruppen in den Seitenketten der Aminosäuren A¹, A² und A³ durch geeignete N-terminale Schutzgruppen oder geeignete Ester oder Ether geschützt sein können; und

R¹ ein Peptid, umfassend 1 bis 20 Aminosäuren, eine Acyl- oder eine Sulfonyl-Gruppe, umfassend 1 bis 20 Kohlenstoff-Atome, H oder eine N-terminale Schutzgruppe ist;

oder ein physiologisch annehmbares Salz derselben.

2. Verbindung nach Anspruch 1, worin A¹ eine Aminosäure der L- oder D-Konfiguration ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lys, Phe, Pro, Ala, Leu, Gly, Glu, Val, Thr, Ile, Met, Tyr, Trp, Arg, Asp, Asn und Gln.

3. Verbindung nach Anspruch 2, worin A ¹ eine Aminosäure der L- oder D-Konfiguration ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lys, Phe, Pro, Ala, Leu, Gly, Glu, Val und Thr.

4. Verbindung nach Anspruch 1, worin A² eine Aminosäure der D-Konfiguration ist.

5. Verbindung nach Anspruch 4, worin A² Phe ist.

6. Verbindung nach Anspruch 1, worin A² eine Aminosäure der L- oder D-Konfiguration ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus phe, Ala, Leu, Pro, Glu und Gly.

7. Verbindung nach Anspruch 1, worin R² ein substituiertes Alkyl ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -(CH&sub2;)z-X.

8. Verbindung nach Anspruch 7, worin z 3 bis 4 ist.

9. Verbindung nach Anspruch 7, worin R² ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 3-Guanidinopropyl, 3-Aminopropyl und 4-Aminobutyl.

10. Verbindung nach Anspruch 9, worin R² 3-Guanidinopropyl ist.

11. Verbindung nach Anspruch 1, die Ac-(D)Phe-Pro-boroArg-OH ist.

12. Zusammensetzung zur Hemmung einer Trypsin-ähnlichen Serin-Protease und/oder von Thrombin und/oder Plasma- Kallikrein und/oder Plasmin und/oder zur Behandlung der Blutgerinnung und/oder zur Behandlung von Entzündungen in einem Säuger, umfassend eine wirksame Menge einer Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11 und einen physiologisch annehmbaren Träger oder ein physiologisch annehmbares Verdünnungsmittel.

13. Verbindung der Formel (Formel II)

worin

Y³ eine Einheit ist, die von einer Dihydroxy-Verbindung mit wenigstens zwei Hydroxy-Gruppen abgeleitet ist, die durch wenigstens zwei verbindende Atome in einer Kette oder einem Ring getrennt sind, wobei die Kette oder der Ring bis zu 20 Kohlenstoff-Atome umfaßt;

R³ ein substituiertes Alkyl ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -(CH&sub2;)z-W¹, -CH(CH&sub3;)-(CH&sub2;)&sub2;-W¹, -CH&sub2;-CH(CH&sub3;)-CH&sub2;-W¹, -(CH&sub2;)&sub2;-CH(CH&sub3;)-W¹ und -(CH&sub2;)&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-W¹;

W und W¹ unabhängig voneinander Cl oder Br sind; und z 3 bis 5 ist.

14. Verbindung nach Anspruch 13, worin R³ -(CH&sub2;)z-W¹ ist, und z 3 bis 4 ist.

15. Verbindung der Formel (Formel III)

worin

R&sup4; ein substituiertes Alkyl ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -(CH&sub2;)z-W², -CH(CH&sub3;)-(CH&sub2;)&sub2;-W², -CH&sub2;-CH(CH&sub3;)-CH&sub2;-W², -(CH&sub2;)&sub2;-CH(CH&sub3;)-W² und -(CH&sub2;)&sub2;-C(CH&sub3;)&sub2;-W²;

W² Cl, Br oder N&sub3; ist;

z 3 bis 5 ist;

R¹ ein Peptid, umfassend 1 bis 20 Aminosäuren, eine Acyl- oder eine Sulfonyl-Gruppe, umfassend 1 bis 20 Kohlenstoff-Atome, H oder eine N-terminale Schutzgruppe ist; und

n, o, p und q unabhängig voneinander 1 oder 0 sind.

16. Verbindung nach Anspruch 15, worin R&sup4;-(CH&sub2;)z-W² ist, und z 3 bis 4 ist.