DE3852961T2

DE3852961T2 - Arzneistoff-Lipid-Systeme mit geringer Toxizität.

Info

Publication number: DE3852961T2
Application number: DE3852961T
Authority: DE
Inventors: Lawrence Boni; Pieter R Cullis; Anthony G Durning; Andrew S Janoff; John J Kearns; Robert Klimchak; Robert P Lenk; Thomas Madden; Joel Portnoff
Original assignee: Liposome Co Inc
Current assignee: Elan Pharmaceuticals LLC
Priority date: 1987-03-05
Filing date: 1988-03-04
Publication date: 1995-07-06
Anticipated expiration: 2008-03-05
Also published as: NZ223660A; EP0282405A2; NO179995B; DK98089D0; ATE118169T1; NL990004I1; DE3852961D1; NO884391L; NO944071D0; IL85607A; CN88101864A; AU622405B2; LU88684I2; ES2070131T3; HK1007495A1; PT86913B; NO179995C; FI102724B1; FI102724B; DK176010B1

Description

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung ist auf Formulierungen und Verfahren gerichtet zur Herstellung von Arzneimittel-assoziierten Lipidkomplexen mit hohen Arzneimittel:Lipid-Verhältnissen (high drug:lipid complexes oder HDLC). Derartige Formulierungen sind im allgemeinen im wesentlichen geich oder größer hinsichtlich der Wirksamkeit bei dem gleichen Arzneimittel in dessen freier Form, haben jedoch eine geringere Toxizität. Zusätzlich sind Verfahren zur Bildung derartiger HDLC offenbart. Insbesondere ist die Erfindung auf die Verwendung dieser Arzneimittel:Lipid-Komplexe mit den toxischen antifungalen Polyen-Antibiotika gerichtet, insbesondere von Amphotericin B und Nystatin.
Die Komplexe mit hohen Arzneimittel:Lipid-Verhältnissen (HDLC) der vorliegenden Erfindung können nach Techniken hergestellt werden, die im wesentlichen die gleichen sind, wie die zur Herstellung von Liposomen. Die Erfindung umfaßt die Verwendung von diesen HDLC-Strukturen in Assoziation mit bioaktiven Mitteln, wie Arzneimitteln, speziell mit Polyen-Antibiotika, wie Amphotericin B und Nystatin.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung besteht in einem neuen Verfahren zur Bildung von Liposomen (oder HDLC) ohne Verwendung von organischen Lösungsmitteln. Die Verkapselung oder Assoziierung von einem Arzneimittel in Liposomen erfolgt über Ethanol oder ein wäßriges Zwischenprodukt.
Liposome sind vollständig geschlossene Lipid-Bilayer-Membranen, die ein eingeschlossenes wäßriges Volumen enthälten. Liposome können unilamellare Vesikel sein (die eine Einfachmembran-Bilayer haben) oder multilamellare Vesikel (Onion-ähnliche Strukturen, gekennzeichnet durch Mehrfachmembran-Bilayer, die jeweils von der nächsten durch eine wäßrige Schicht getrennt sind). Die Bilayer besteht aus zwei Lipid-Monolayern, die einen hydrophoben "Schwanzbereich" und einen hydrophilen "Kopf"bereich haben. Die Struktur der Membranbilayer ist so, daß die hydrophoben (unpolaren) "Schwänze" der Lipid-Monolayer sich in Richtung des Zentrums der Bilayer orientieren, während sich die hydrophilen "Köpfe" in Richtung der wäßrigen Phase orientieren.
Die ursprüngliche Liposomherstellung von Bangham et al. (J. Mol. Biol., 1965, 13:238-52) bestand im Suspendieren von Phospholipiden in einem organischen Lösungsmittel, das anschließend bis zur Trockne eingeengt wurde, wobei ein Phospholipidfilm auf dem Reaktionsbehälter zurückblieb. Als nächstes wurde eine entsprechende Menge einer wäßrigen Phase hinzugegeben, man ließ das Gemisch "quellen", und die erhaltenen liposomen, die aus multilamellaren Vesikeln (MLV) bestanden, wurden mit Hilfe mechanischer Hilfsmittel dispergiert. Diese Technik war die Basis für die Entwicklung kleiner beschallter unilamellarer Vesikel, die von Paphadjopoulos et al. (Biochem. Biophys. Acta., 1967, 135:624-638) beschrieben wurden und von großen unilamellaren Vesikeln.
Techniken zur Herstellung großer unilamellarer Vesikel (LUV), wie die Umkehrphasenverdampfpung, Infusionsverfahren und Detergenzverdünnung können zur Herstellung von Liposomen eingesetzt werden. Ein Überblick über diese und andere Verfahren zur Herstellung von Liposomen kann in dem Text Liposomes, Marc Ostro, Hrsg., Marcel Dekker, Inc., New York, 1983, Kapitel I; siehe auch Szoka, Jr. et al. (1980, Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9:467) gefunden werden. Ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Bildung von LUV ist in Cullis et al., PCT-Veröffentlichung Nr. 87/00238, 16. Januar 1986 mit dem titel "Extrudertechnik zur Herstellung unilammellarer Vesikel" beschrieben. Vesikel, die durch dieses Verfahren hergestellt werden, die als LUVETS bezeichnet werden, werden unter Druck durch ein Membranfilter extrudiert. Vesikel können auch hergestellt werden durch eine Extrusionstechnik durch ein 200 nm Filter; derartige Vesikel sind als VET&sub2;&sub0;&sub0; bekannt. Diese Vesikel können wenigstens einem Frost- und Tauzyklus vor der Extruderverarbeitung ausgesetzt werden; dieses Verfahren ist bei Mayer et al., 1985, Biochem. et Biophys. Acta., 817: 193-196 beschrieben mit dem Titel "Verteilungen des gelösten Stoffes und Einkapselungseffizienzen, beobachtet bei multilamellaren Frost-Tau-Vesikeln".
Bei der praktischen Durchführung dieser Erfindung wird eine Klasse von Liposomen und ein Verfahren zur deren Bildung bevorzugt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es eine im wesentliche gleiche Verteilung des lamellaren gelösten Stoffes hat. Diese bevorzugte Klasse von Liposomen wird als stabile plurilamellare Vesikel (SPLV) bezeichnet, wie in der US-A-4522803 von Lenk et al. definiert, und sie schließt Monophasenvesikel ein, wie in der US-A-4588578 von Fountain et al. beschrieben, sowie die multilamellaren gefrorenen und aufgetauten Vesikel (FATMLV), wie oben beschrieben.
Eine Vielzahl von Sterolen und deren wasserlösliche Derivate sind zur Bildung von Liposomen eingesetzt wurde; siehe speziell Janoff et al., US-A- 4721612, veröffentlicht 26. Januar 1988 mit dem Titel "Steroid-Liposomen". Mayhew et al., PCT-Veröffentlichung WO 85/00968, veröffentlicht am 14. März 1985, beschreibt ein Verfahren zur Verringerung der Toxizität von Arzneimitteln durch deren Verkapselung in Liposomen, die α-Tocopherol und bestimmte Derivate davon umfassen. Es sind auch eine Vielzahl von Tocopherolen und deren wasserlösliche Derivate zur Bildung von Liposomen verwendet worden; siehe Janoff et al., PCT-Veröffentlichung 87/0219, veröffentlicht am 23. April 1987 mit dem Titel "Auf α-Tocopherol basierende Vesikel".
In einem Liposom-Arzneimittel-Transportsystem ist das bioaktive Mittel, wie ein Arzneimittel, in dem Liposom verkapselt und wird anschließend dem zu behandelnden Patienten verabreicht. Siehe zum Beispiel Rahman et al., US-A- 3993754; Sears, US-A-4145410;Papahadjopoulos et al., US-A-4235871; Schneider, US-A-4224179; Lenk et al., US-A-4522803; und Fountain et al., US-A-4588578. Alternativ dazu kann, wenn das Arzneimittel lipophil ist, es mit der Lipid- Bilayer assoziieren. In der vorliegenden Erfindung bedeuten die Begriffe "Einfangen" oder "Einkapseln" sowohl, daß das Arzneimittel in dem wäßrigen Volumen des Liposoms aufgenommen ist, als auch, daß das Arzneimittel mit der Lipid- Bilayer assoziiert ist.
Viele Arzneimittel, die zur Behandlung einer Krankheit nützlich sind, zeigen bei dem Patienten Toxizitäten; derartige Toxozitäten können Kardiotoxizität sein, wie bei dem Antitumor-Arzneimittel Doxorubicin, oder Nephrotoxizität, wie bei dem Aminoglycosid oder bei Polyen-Antibiotika, wie Amphotericin B. Amphotericin B ist ein extrem toxisches antifungales Polyen-Antibiotikum, das als einziges am zuverlässigsten bei der Behandlung lebensbedrohlicher fungaler Infektion ist (Taylor et al., Am. Rev. Respir. Dis., 1982, 125: 610-611). Da Amphotericin B ein hydrophobes Arzneimittel ist, ist es in wäßriger Lösung unlöslich und ist kommerziell als kolloidale Dispersion in Desoxycholat verfügbar, einem Detergenz, das zu dessen Suspendierung verwendet wird, das aber selbst toxisich ist. Amphotericin B-methylester und Amphotericin B haben auch erkennen lassen, daß sie wirksam sind gegen den HTLV-III/LAV-Virus, ein Lipidumhülltes Retrovirus, das sich in der Ätiologie des erworbenen Immunschwächesyndroms (AIDS) zeigt (Schaffner et al., Biochem. Pharmacol., 1986, 35: 4110-4113). Bei dieser Studie wurden das Amphotericin B-methylester-ascorbinsäuresalz (wasserlöslich) und Amphotericin B separaten Kulturen von HTLV-III/LAV-infizierten Zellen zugesetzt, und die Zellen wurden auf Replikation des Virus getestet. Die Ergebnisse zeigten, Daß Amphotericin B-methylester und Amphotericin B Targetzellen gegen cytopathische Wirkungen des Virus schützte, ähnlich, wie es für den Herpesvirus demonstriert wurde (Stevens et al., Arch. Virol., 1975, 48: 391).
Es sind Berichte uber die Verwendung von Liposom-verkapseltem Amphotericin B in der literatur erschienen. Juliano et al., (Annals N.Y. Acad. Sci., 1985, 446:390-402) diskutieren die Behandlung von systemischen fungalen Infektionen mit liposomalem Amphotericin B. Derartige Liposomen bestehen aus einem Phospholipid, zum Beispiel Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC) und Dimyristoylphosphatidylglycerol (DMPG) in einem Molverhältnis von 7:3 und Cholesterol. Untersuchungen zur akuten Toxizität (LD&sub5;&sub0;) und in vitro-Tests, die freies und Liposom-verkapseltes Amphotericin B verglichen, zeigten niedrigere Toxizitäten bei Verwendung liposomaler Präparationen mit im wesentlichen unveränderter antifungaler Potenz. Lopez-Berenstein et al. (J. Infect. Dis., 1986, 151: 704-710) verabreichten Liposom-verkapseltes Amphotericin B an Patienten mit systemischen fungalen Infektionen. Die Liposomen bestanden aus einem 7:3-Molverhältnis von DMPC:DMPG, und das Arzneimittel war mit einer Effektivität von größer als 90% eingekapselt. Als Ergebnis der liposomalen Arzneimittelbehandlung bei 5 Mol-% Amphotericin B reagierten 66% der Patienten günstig mit entweder teilweiser oder vollständiger Remission der fungalen Infektion. Lopez-Berestein et al. (J. Infect. Dis., 1983, 147:939-945), Ahrens et al., ( S. Jour. Med. Vet. Mycol., 1984, 22: 161-166), Panosian et al. (Antimicrob. Agents Chemo., 1984, 25: 655- 656) und Tremblay et al. (Antimicrob. Agents Chemo., 1984, 26: 170-173) testeten ebenfalls im Vergleich die Wirksamkeit von freiem gegenüber liposomalem Amphotericin B bei der Behandlung und bei der Prophylaxe von systemischer Candidiasis und Leishmaniasis (Panosian et al., siehe oben) bei Mäusen. Sie fanden einen erhöhten therapeutischen Index mit dem liposomal-Verkapselten Amphotericin B bei der Behandlung Candidiasis. In allen Fällen wurde gefunden, daß wesentlich höhere Dosierungen von Amphotericin B toleriert werden können, wenn dieses Arzneimittel in Liposomen eingekapselt ist. Die Amphotericin B-Liposomformulierungen hatten wenig bis keine Wirkung bei der Behandlung von Leishmaniasis.
Proliposomen (Lipid- und Arzneimittel-beschichtet auf einem löslichen Träger, um ein Granulatmaterial zu bilden), die aus DMPC:DMPG, Ergosterol und Amphotericin B bestanden, wurden ebenso hergestellt (Payne et al., J. Pharm. Sci., 1986, 75: 330-333).
Bei anderen Untersuchungen wurde die intrevenöse Behandlung von Cryptococcosis bei Mäusen mit liposomalem Amphotericin B verglichen mit einer ähnlichen Behandlung mit Amphotericin B-Desoxycholat (Graybill et al., J. Infect. Dis., 1982, 145: 748-752). Mit liposomalem Amphotericin B behandelte Mäuse zeigten höhere Überlebenszeiten, geringere Gewebszählungen von Cryptococci und eine verringerte akute Toxizität. Bei dieser Untersuchung erwendete multilamellare Liposomen enthielten Ergosterol. Taylor et al. (Am. Rev. Resp. Dis., 1982, 125: 610-611) behandelten die Histoplasmose bei Mäusen mit liposomalem Amphotericin B, wobei die Liposomen Ergosterol und Phospholipide enthielten. Die liposomalen Präparationen waren weniger toxisch, wirksamer bei der Behandlung der Histoplasmose und hatten veränderte Serum- und Gewebsverteilungen mit niedrigeren Serumspiegeln und höheren Leber- und Milzkonzentrationen als die Präparationen mit freiem Amphotericin B.
Bei den oben genannten Untersuchungen wurden Lipid-enthaltende Liposomen verwendet, um die Toxizität des verkapselten Arzneistoffes zu verbessern, mit dem Trend in Richtung Erhöhung des Lipidgehaltes in den Formulierungen, um die Arzneimitteltoxizität zu puffern. Die Anmelder haben überraschenderweise gefunden, daß tatsächlich ein geringer Lipidbestandteil die Toxizität am wirksamsten absenkt. Bei der Formulierung der HDLC der Erfindung mittels eines MLV-Verfahrens kann sich eine gemischte Population von HDLC mit MLV ergeben; diese Präparationen sind jene, die von etwa 5 bis etwa 25 Molprozent Arzneimittel (Amphotericin B) verwenden, mit einem sich erhöhenden Anteil von HDLC in dem Maße, wie sich die Molprozente des Arzneimittels erhöhen. Präparationen, die 25 Molprozent bis etwa 50 Molprozent Arzneimittel einsetzen, sind im wesentlichen HDLC, frei von Liposomen. Alternativ dazu sind Präparationen, die 5 Molprozent hydrophobes Arzneimittel und weniger enthalten, im wesentlichen liposomal mit einigem HDLC. Die Trennung der HDLC von den heterogenen Populationen, falls sie erforderlich ist, kann unter Verwendung einer beliebigen, aus dem Stand der Technik bekannten Trenntechnik erfolgen, zum Beispiel durch Dichtegradienten- Zentrifugierung.
Die Verfahren, die zur Bildung dieser HDLC eingesetzt wird, können im wesentlichen die gleichen sein, wie sie für die Bildung von Liposomen verwendet werden, jedoch werden bei der vorliegenden Erfindung unter Verwendung hoher Arzneimittel:Lipid-Verhältnisse mehr HDLC als Liposomen gebildet mit einer unerwartet großen Verringerung der Toxizität im Vergleich mit den liposomalen Formulierungen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung offenbart HDLC (high drug:lipid ratio complexes = Komplexe mit hohen Arzneimittel:Lipid-Verhältnissen)-Systeme, die Lipide und bioaktive Mittel einschließlich Arzneimittel umfassen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung, die einen hydrophoben bioaktives Mittel-Lipid-Komplex umfaßt mit einem hohen Arzneimittel:Lipid-Verhältnis (HDLC), wie in den Patentansprüchen 1 bis 14 beansprucht, sowie pharmazeutische Zusammensetzungen, wie in den Patentansprüchen 15 bis 17 beansprucht. Derartige HDLC können Phospholipide, wie DMPC und DMPG umfassen, vorzugsweise in einem Molverhältnis 7:3, oder gesättigte Phospholipide oder Fettsäurephospholipide. Das bioaktive Mittel ist vorzugsweise ein Arzneimittel, wie ein antifungales Arzneimittel, wie Nystatin oder Amphotericin B. Der Molprozent-Gehalt an vorhandenem Arzneimittel liegt vorzugsweise von 6 bis 50 Molprozent, vorzugsweise 30 bis 50 Molprozent. Pharmazeutische Zusammensetzungen der HDLC, die vorzugsweise ein Arzneimittel wie Amphotericin B enthalten, werden hergestellt unter Verwendung von pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder Verdünnungsmitteln, und diese Zusammensetzungen können parenteral verabreicht werden. Derartige Zusammensetzungen werden zur Behandlung infektiöser Erkrankungen, wie fungaler Infektionen eingesetzt, indem sie an Säuger wie Menschen verabreicht werden. Die HDLC-enthaltenden Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung schließen solche Zusammensetzungen ein, die im wesentlichen frei von Liposomen sind sowie Zusammensetzungen, die im wesentlichen frei von das Arzneimittel einschließenden Liposomen sind. Im wesentlichen bedeutet nicht mehr als etwa 10 Gewichts-% Lipid, vorzugsweise nicht mehr als 5% und bevorzugter nicht mehr als 3%.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung einer HDLC-Zusammensetzung bereit, wie in den Patentansprüchen 8 bis 24 beansprucht.
Verschiedene Verfahren zur Herstellung der HDLC der Erfindung sind offenbart; zum Beispiel Techniken, bei denen zuerst das Arzneimittel solubilisiert wird, speziell Amphotericin B in einem Lösungsmittel wie DMSO oder Methanol. Das Lipid (vorzugsweise DMPC:DMPG in einem Molverhältnis 7:3) wird in einem Lösungsmittel wie Methylenchlorid solubilisiert, und die Lipid- und Arzneimittellösungen werden vermischt. Die Lösungsmittel können unter vermindertem Druck abgedampft werden, was zu einem dünnen Lipid-Arzneimittelfilm führt. Der Film kann in einer wäßrigen Lösung, wie Salzlösung, PBS oder Glycin-Puffer hydratisiert werden und führt zur Bildung der HDLC. Alternativ dazu kann die wäßrige Lösung zu dem Lösungsmittel-enthaltenden Arzneimittel und der Lipidphase vor der Verdampfung des Lösungsmittels zugegeben werden. Als andere Alternativekann der erhaltene trockene Lipid-Arzneimittelfilm in einem Lösungsmittel wie Methylenchlorid resuspendiert werden und wieder unter vermindertem Druck vor der Hydratisierung des Filmes eingedampft werden. Es kann auch mit einem Dehydratisierungsverfahren gearbeitet werden; bei diesem Verfahren wird ein trockener Lipid- Arzneimittelfilm hydratisiert, um Schuppen zu bilden, die wiederum mit wäßriger Lösung hydratisiert werden.
Als alternatives Verfahren zur Bildung der HDLC der Erfindung können Lipidteilchen (oder Liposomen), die bioaktives Mittel (Arzneimittel, zum Beispiel antifungale Polyen-Verbindungen, wie Amphotericin B) enthalten, durch das MLV-Verfahren hergestellt werden, die 6 bis 50 Molprozent Amphotericin B erhalten, gebildet werden, und anschließend werden die Teilchen (oder Liposomen) einem Erwärmungszyklus bei 25º C bis 60º C, am bevorzugtesten bei 60º C ausgesetzt. Ein solcher Zyklus bildet einen höher geordneten und weniger toxischen Amphotericin B/Lipid-Komplex.
Mit der Absorptionsspektrum-Technik wird die Toxizität eines Arzneimittel (z.B. ein antifungales Polyen, wie Amphotericin B)-Lipid-Komplexes bestimmt. Das Absorptionsspektrum eines Arzneimittels ist spezifisch für dieses Arzneimittel; das Kennzeichen des Arzneimittels kann ein Peak oder eine Serie von peaks im ultravioletten oder sichtbaren Bereich sein. Der kennzeichnende Peak für Amphotericin B (wiedergegeben in Fig. 12, gelöst in Desoxycholat) liegt zwischen 300 und 500 nm und hat charakteristische Peaks, wobei der repräsentativste dieser Peaks der bei 413 nm ist. Die Dämpfung dieses Peaks durch Komplexierung des Arzneimittels mit Lipid kann quantitativ als Maß für die Toxizität der HDLC verwendet werden. Mit anderen Worten, der Grad an Toxizität kann durch die Intensität der Absorptionspeakhöhe bestimmt werden.
Es wird auch ein Liposom-Beladungsverfahren offenbart, worin das Arzneimittel, speziell das Polyen-Antibiotikum Amphotericin B durch Ultraschall in einem Lösungsmittel wie Ethanol dispergiert wird, zu dem eine Säure wie Salzsäure hinzugegeben wurde. Ein Lipidfilm, der speziell DMPC:DMPG in einem Molverhältnis von etwa 7:3 umfaßt, wird mit einer wäßrigen Lösung hydratisiert, speziell mit einem wäßrigen Puffer wie PBS, und ein Aliquotes der angesäuerten Ethanollösung, die das Arzneimittel enthält, wird in das Liposom durch Zugabe dessen zu der Liposompräparation eingebracht. Der Ethanol in der enthaltenen Suspension wird entfernt, und die Lösung wird mit einer wäßrigen Lösung resuspendiert. In Abhängigkeit von dem Molverhältnis des Arzneimittels im Co- Gemisch mit dem Lipid begünstigt das Verfahren die Bildung von HDLC eher als die der Liposome; z.B. bei einem Molprozentgehalt von Arzneimittel von 16 und darüber werden mehr HDLC als Liposome gebildet. Im Gegensatz dazu begünstigt das Verfahren bei 0 bis 15 Molprozent Arzneimittel die Bildung von Liposomen. Liposome oder HDLC, die durch dieses Beladungsverfahren von sauer gemachtem Ethanol hergestellt werden, können zur Verwendung als pharmazeutische Zusammensetzungen durch Zugabe von pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder Verdünnungsmitteln verwendet werden, und sie können bei der Behandlung von fungalen Infektionen eingesetzt werden durch Verabreichung an einen Säuger, wie einen Menschen.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Fig.1 ist eine graphische Darstellung der akuten Toxizität, gemessen durch LD&sub5;&sub0; als Funktion der Molprozente von Amphotericin B in der Präparation.
Fig.2 ist ein Differentialkalorimeterspektrum einer liposomalen (MLV)- Präparation, die 5 Molprozent Amphotericin B enthält.
Fig.3 ist ein Differentialkalorimeterspektrum einer HDLC-Präparation (MLV- Verfahren), die 25 Molprozent Amphotericin B enthält.
Fig. 4 ist die graphische Darstellung eines isopyknischen Gradienten von multilamellaren Liposomen, die 5 Molprozent Amphotericin B enthalten. Lipid (durchgehende Linie); Amphotericin B (gestrichelte Linie).
Fig.5 ist die graphische Darstellung eines isopyknischen Gradienten von HDLC (MLV-Verfahren), hergestellt mit 50 Molprozent Amphotericin B. Lipid (durchgehende Linie); Amphotericin B (gestrichelte Linie).
Fig.6 ist die graphische Darstellung von Röntgenpulver-Daten für Liposom- und HDLC-Präparationen (MLV-Verfahren), die 5 bzw. 50 Molprozent Amphotericin B enthalten.
Fig.7 zeigt ³¹P NMR-Spektren für HDLC-Präparationen (MLV-Verfahren), die 25 und 50 Molprozent Amphotericin B enthalten.
Fig.8 zeigt ³¹P NMR-Spektren für Liposom (MLV)-Präparationen, die 0 und 5 Molprozent Amphotericin B enthalten.
Fig.9 ist die graphische Darstellung eines isopyknischen Dichtegradienten von Amphotericin B-enthaltenden Liposomen, gebildet nach dem sauren Ethanolverfahren, die 5 Molprozent Amphotericin B enthalten. Lipid (durchgehende Linie); Amphotericin B (gestrichelte Linie).
Fig.10 ist ein Absorptionsspektrum von freiem Amphotericin B, gelöst in Desoxycholat.
Fig.11 sind Absorptionsspektren von 5 Mol-% Amphotericin B (a), 25 Mol-% Amphotericin B (b), 25 Mol-% Amphotericin B nach Erhitzen (c) und 50 Mol-% Amphotericin B (d) in 7:3 DMPC:DMPG.
Fig.12 ist ein Absorptionsspektrum von 25 Mol-% Amphotericin B in 7:3 DMPC:DMPG, beide vor (a) und nach (b) Erhitzen für 10 Minuten bei 60º C.
Fig.13 ist ein DSC-Spektrum von 7:3 DMPC/DMPG, die 25 Mol-% Amphotericin B enthalten, beide vor (a) und nach (b) dem Erwärmungszyklus, im Vergleich mit dem Spektrum von reinem DMPC/DMPG (c).
Fig.14 ist ein ³¹P NMR-Spektrum von Komplexen des 7:3 Molverhältnisses DMPC/DMPG, die 25 Mol-% Amphotericin B enthalten vor (a) und nach (b) dem Erwärmungszyklus bei 60º C.
Fig.15 ist eine graphische Darstellung, die den Einfluß der Ionenstärke auf die Aufnahme von Amphotericin B in DMPC:DMPG-Liposomen demonstriert.
Fig.16 zeigt die Wirkung der Inkubationstemperatur auf die Geschwindigkeit der Amphotericin B-Aufnahme in DMPC:DMPG-Liposomen.
Fig.17 zeigt den Einfluß der Liposomenstruktur auf die Aufnahme von Amphotericin B in DMPC:DMPG MLV oder LUVA.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Nichtliposomale Komplexe mit hohem Arzneimittel:Lipid-Verhältnis (HDLC) haben einzigartige Eigenschaften, und es werden Verfahren zu deren Herstellung beschrieben. Diese HDLC enthalten ein bioaktives Mittel, wie ein hydrophobes Arzneimittel, das, wenn der HDLC an einen Organismus verabreicht wird, eine im wesentlichen gleiche oder größere Wirksamkeit und niedrigere Toxizität hat im Vergleich mit dem Arzneimittel, verabreicht in entweder freier oder liposomaler Form. Derartige HDLC haben ein hohes Arzneimittel: Lipid-Molverhältnis (größer als etwa 5 Mol-% Arzneimittel). Die vorliegende Erfindung demonstriert überraschend die herabgesetzte Toxitiät der Komplexe, die weniger Lipid enthalten als die unmittelbaren HDLC-Systeme im Vergleich mit liposomalen Systemen. Die Erfindung bezieht HDLC-Formulierungen zur Verwendung als Arzneimittelträgersysteme in Assoziation mit Arzneimitteln ein, wie die antifungalen Polyen-Antibiotika Amphotericin B und Nystatin. Derartige Formulierungen sind im Gegensazt zu den kommerziell erhältlichen Formulierungen stabil in wäßrigen Lösungen, wie in Salzlösung.
Darüber hinaus wird ein neues Liposom-Beladungsverfahren beschrieben, bei dem Liposome beladen werden durch Einkapselung eines Arzneimittels über ein Lösungsmittel-Zwischenprodukt. Dieses Lösungsmittel hat die Eigenschaften, daß es das bioaktive Mittel, wie Amphotericin B, solubilisiert, es die Liposommembranstruktur nicht zerreißt, und es mit einer wäßrigen Lösung wie Wasser kompatibel ist Ein solches Lösungsmittel ist Ethanol. Dieses Verfahren läuft ohne Verwendung organischer Lösungsmittel ab. In Abhängigkeit von den Molprozenten des in der Präparation verwendeten Arzneimittels werden eher HDLC als Liposome gebildet. In dem Falle, wo die Bildung von HDLC begünstigt wird, werden die HDLC innerhalb des Verfahrens mit Arzneimittel beladen.
HDLC bezieht sich auf Arzneimittel-assoziiertes Lipid in Teilchenform, wie Partikel, die ihrer Art nach nichtliposomal sind. Bei der Bildung über in MLV- Verfahren werden solche HDLC beispielsweise charakterisiert durch: (1) Gefrierbruch-Elektronenmikroskopaufnahmen (Deamer et al., Biochem. Biophys. Acta, 1970, 219: 47-60), zeigt nicht liposomale Komplexe; (2) Einfangsvolumenmessungen (Deamer et al., Chem. Phys. Lipids, 1986, 40: 167-168), zeigt im wesentlichen eingefangenes Nullvolumen und ist daher nichtliposomal; (3) Diferentialkalorimetrie (DSC) (Chapman, D. in: Liposomtechnologie; Gregoriadis, G. Hrsg., 1984, CRC Press, Boca Raton), zeigt keine Lipidbilayer-Vorübergangsphase oder Hauptübergang; (4) ³¹P-NMR-Spektren (Cullis et al., 1982 in: Membrane Fluidity in Biology, Academic Press, Inc., London und N.Y.), schlägt Merkmale von hoch-immobilisiertem Lipid (breit isotropisch) vor; und (5) Röntgenpulver-Daten (Shipley et al., in: Biomembranen, 1973, Chapman, D. und Wallach, D., Hrsg., Bd. 2:1, Academic Press, Inc., London und N.Y.), zeigt Gelphasenlipid an. Das Merkmal dieser Systeme ist auch die vollständige Assoziation des Arzneimittels mit dem Lipid, wie durch Dichtegradientenzentrifugierung deutlich wird. Bei dieser Technik wird der Gradient bei verstärkter Kraft (etwa 230000 x g) für etwa 24 Stunden zentrifugiert. Dies sichert, daß alle Komponenten in dem Gradienten ihre Gleichgewichtsdichtepositionen erreichen. Die Eluierungsprofile dieser Systeme zeigen sich überlappende Arzneimittel- und Lipid-Peaks, die anzeigen, daß alles Arzneimittel mit dem Lipid assoziiert ist.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Arzneimittel:Lipid- Verhältnis, das HDLC bildet, was zu einer im wesentlichen gleichen oder größeren Wirksamkeit des Arzneimittels führt, während sich im allgemeinen die akute Toxizität, gemessen als LD&sub5;&sub0; bei Mäusen (Fig.1) verringert. Die Anmelder haben gefunden, daß diese Erfordernisse zwischen 6 und 50 Molprozent bei hydrophobem Arzneimittel erfüllt werden, wobei ein bevorzugtes Verhältnis zwischen 15 und 50, bevorzugter zwischen 25 und 50 liegt, am bevorzugtesten 25 bis 30 Molprozent überschreiten und bis annähernd 25 Molprozent, werden gemischte Populationen von Liposomen und HDLC gebildet. Innerhalb dieses Bereiches, wenn der Molprozentanteil des Arzneimittels 25 erreicht, ist ein größerer Prozentanteil der Strukturen eher HDLC als Liposomen. Bei Arzneimittelkonzentrationen von 5 Molprozent und weniger und bis zu einer unteren Grenze des Lipids, das der aus dem Stand der Technik bekannten "kritischen Micellenkonzentration" entspricht, sind gemischte HDLC/Liposom-Populationen vorhanden, jedoch im wesentlichen liposomale Strukturen. Derartige Liposomen können durch den neuen Ethanol-Zwischenprodukt- Prozeß der vorliegenden Erfindung gebildet werden.
Ein Merkmal der oben genannten HDLC sind verschiedene Arzneimittel-Lipid- Dispersionen, die nach der Dichtezentrifugierung beobachtet werden. Die Trennung des Arzneimittel-Lipid (DMPC:DMPG bei einem 7:3-Molverhältnis)-Kompexes über die isopyknishen Saccharose-Dichtesäulen, zeigt Banden, die von dem Arzneimittel:Lipid-Verhältnis abhängig sind und von dem Verfahren zur Herstellung. In Systemen, die 5 Molprozent Arzneimittel enthälten, hergestellt nach dem MLV- Verfahren, werden zwei hauptbanden an Material beobachtet; eine von Liposomen und eine , wo das Arzneimittel mit dem Lipid assoziiert ist (HDLC). Präparationen, die 25 und 50 Molprozent Arzneimittel enthalten, zeigen eine einzelne Bande, wobei das meiste an Arzneimittel mit dem lipid assoziiert ist. Überraschenderweise waren diese Systeme mit einem niedrigen Lipid- und höheren Arzneimittelanteil (Molprozent) weniger toxisch. Fig.1 zeigt LD&sub5;&sub0;-Werte (mg/kg) bei Mäusen als Funktion des Molprozentanteils des Arzneimittels Amphotericin B in der Präparation. Die LD&sub5;&sub0;-Werte steigen zwiscchen 5 und 50 Molprozent Arzneimittel an, fallen dann bei 60 Molprozent ab. Das gleiche Diagramm ist bei der LD&sub5;&sub0; für die kommerziell erhältliche Form dieses Arzneimittels, Fungizon, bei eetwa 3,5 mg/kg. Die in vitro Blutzellysis (Hämolyse) zeigt die gleiche Toxizitätserscheinung.
Studien mit eingekapselten Volumina (Einkapselung einer Lösung (in ul) pro umol Lipid), durchgeführt bei MLV-Präparationen von Arzneimittel: Lipid-Assoziationen bei unterschiedlichen Molprozentanteilen Arzneimittel, demonstrieren die unübliche Art der Formulierungen von 25 Molprozent und mehr (HDLC); diese Systeme kapseln keine Lösung ein und sind daher nichtliposomal. Elektronenmikroskopische Gefrierbruchaufnahmen der gleichen Systeme zeigen Liposomen bei 0 und 5 Molprozent Arzneimittel, jedoch nichtliposomale HDLC bei 25 und 50 Molprozent Arzneimittel.
Differentialkalorimetrische Aufnahmen, ausgeführt an MLV-Präparationen mit unterschiedlichen Molprozentanteilen Arzneimittel, zeigen die gleiche Erscheinung; das heißt, die Spektren zeigen Übergangspeaks, die charakteristisch sind für den ungestörten Bilayerzustand des Lipids bei 5 Molprozent Arzneimittel (Fig.2), jedoch keinen Übergangspeak bei 25 Molprozent Arzneimittel (Fig.3). Im Falle von 25 Molprozent Arzneimittel ist das Lipid vollständig mit dem Arzneimittel assoziiert, d.h. die Acyl-Ketten des Lipids sind nicht frei, einem kooperativen Übergang zu unterliegen. Diese daten bestätigen die Dichte-Zentrifugierungsdaten, die einen Doppelpeak von Lipid-assoziiertem Arzneimittel und freiem lipid bei 5 Molprozent Arzneimittelkonzentration zeigen (Fig.6), jedoch einen einzelnen Peak, wenn das gesamte Lipid mit dem Arzneimittel bei 25 und 50 Molprozent Arzneimittelkonzentration assoziiert ist (Fig.5).
Die Röntgendaten bei 5 Molprozent (MLV-Verfahren) zeigen Gelphasenlipid bei niedrigen Temperaturen mit einem Übergang zur flüssigen kristallinen Phase bei der charakteristischen Temperatur 23º C. Bei 50 Molprozent Arzneimittel ist allerdings das Lipid bei allen Temperaturen in der Gelphase; es gibt keinen Übergang, da sich das gesamte Lipid in fester Assoziierung mit dem Arzneimittel befindet (FIg.6). Ähnliche Daten für die ³¹P-NMR-Studien zeigen das Fehlen des freien Lipidsignals für diese höheren (25 und 50) Molprozent Arzneimittelformulierungen (HDLC); es fehlen die Niederfeldschulter/Hochfeldpeak-Merkmale dieser Art von Lipid (Fig.7), während es bei den 0 und 5 Molprozent Arzneimittelproben sichtbar ist (Fig.8).
Obgleich die Lipid-Komplexsysteme mit ihren assoziierten hohen Arzneimittel-Lipid-Verhältnissen ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können die Liposom-bildenden Verfahren bei der Bildung dieser Lipidkomplexe verwendet werden. Speziell solche Verfahren schließen jene ein, die Liposome bilden, die als multilamellare Vesikel (MLV) bekannt sind. Andere Verfahren können eingesetzt werden, wie jene, die stabile plurilamellare Vesikel (SPLV), große unilamellare Vesikel, gebildet durch ein Extruderverfahren (LUVETS), bilden oder andere Liposomen-bildende Verfahren, die aus dem Stand der Technik bekannt sind. Das Verfahren zur Bildung SPLV ist von Lenk et al., US-A-4522803 offenbart, ausgegeben am 11. Juni 1985, und das LUVET-Verfahren ist offenbart bei Cullis et al., PCT-Anmeldung WO 86/00238, veröffentlicht am 16. Januar 1986. Bei dem Gegenstand der vorliegenden Erfindung, der die neue Liposombildung betrifft, werden Liposome in wäßriger Lösung gebildet, zu denen das einzukapselnde Arzneimittel hinzugegeben wird, in saurem Ethanol. Bei einer anderen Ausführungsform der Liposombildung der vorliegenden Erfindung wird Amphotericin B in Liposome über ein wäßriges Zwischenprodukt eingearbeitet. Bei dieser Technik wird Amphotericin B in einer wäßrigen Lösung suspendiert, zum Beispiel in destilliertem Wasser durch Beschallung. Das suspendierte Arzneimittel wird anschließend mit einer Suspension eines Lipids in wäßriger Lösung vermischt, wie destilliertem Wasser oder Natriumchloridlösung. Das Gemisch wird bei oder oberhalb der Übergangstemperatur des angewandten Lipids inkubiert, mit dem Ergebnis der Bildung von MLV.
Die Lipide, die (1) zur Herstellung der Lipidkomplexe eingesetzt werden können und die (2) bei der neuen Liposombildungstechnik der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind Phospholipide, wie Phosphatidylcholin (PC), Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidylserin (PS), Phosphatidylglycerol (PG), Phosphatidsäure (PA), Phosphatidylinositol (PI), Sphingomyelin (SPM) und ähnliche, allein oder in Kombination. Gesättigte Phospholipide, wie hydriertes Soja-PC kann ebenso verwendet werden. Die Phospholipide können synthetische sein oder von natürlichen Quellen abgeleitet sein, wie von Ei oder Soja. Eine weitere Lipidzusammensetzung sind die gesättigten Fettsäuren, wie Myristinsäure. Bei bevorzugten Ausführungsformen werden die Phospholipide Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC) und Dimyristoylphosphatidylglycerol (DMPG) in Kombination in einem beliebigen Molverhältnis von 99:1 bis 1:99 DMPC:DMPG, vorzugsweise in einem Molverhältnis 7:3 eingesetzt. DMPC und Dimeyristoylphosphatidylserin (DMPS) können auch in Kombination verwendet werden. Es kann allerdings auch DMPC allein eingesetzt werden. Die Lipidkomplexe und Liposomen können auch eine Steroidkomponente als Teil der Lipidphase enthalten, wobei derartige Steroide sein können Cholesterol, Polyethylenglycol-Derivate von Cholesterol (PEG-Cholesterole), Coprostanol, Cholestanol, Cholestan, organische Säurederivate von Sterolen, wie Cholestrol-hemisuccinat (CHS) und ähnliche. Organische Säurederivate von Tocopherolen können ebenso als Komplex- oder Liposom-Bildende Bestandteile verwendet werden, wie α-Tocopherolhemisuccinat (THS). Sowohl CHS- als auch THS-enthaltende Komplexe und deren tris-Salzformen können allgemein nach beliebigen Verfahren hergestellt werden, die aus dem Stand der Technik für die Herstellung von Liposomen, die diese Sterole enthalten, bekannt sind. Insbesondere siehe die Verfahren von Janoff et al., US-A-4721614, ausgegeben am 26 Januar 1988 mit dem Titel "Steroidale Liposome", und von Janoff et al., PCT-Veröffentlichung 87/022-19, veröffentlicht am 23. April 1987 mit dem Titel "Auf α-Tocopherol basierende Vesikel", eingereicht am 24. September 1986.
In der vorliegenden Erfindung können bioaktive Mittel wie Arzneimittel eingesetzt werden. Im Falle von HDLC sind zu verwendende bioaktive Mittel solche, die hydrophob sind; im Falle von Liposomen können die bioaktiven Mittel entweder hydrophob oder hydrophi sein, da Liposomen beide Typen von Mitteln einschließen können. Zu derartigen bioaktiven Mitteln gehören, sind jedoh nicht darauf beschränkt, die Polyen-Antibiotika, wie die antifungalen Mittel Pimaricin, Candicidin, Filipin und vorzugsweise Nystatin und Amphotericin B. Andere bioaktive Mittel, die verwendet werden können, schließen ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt, antibakterielle Verbindungen, wie die Aminoglycoside, zum Beispiel Gentamycin, antivirale Verbindungen wie Rifampacin, antiparasitäre Verbindungen wie die Antimonderivate, antineoplastische Verbindungen, wie Vinblastin, Vincrystin, Mitomycin C, Doxorubicin, Danorubicin, Methotrexat und Cisplatin, sowie unter anderem Proteine, wie Albumin, Toxine wie Diphtherie- Toxin, Enzyme wie Catalase, Hormone wie Östrogene, Neurotransmitter wie Acetylcholin, Lipoproteine wie α-Lipoprotein, Glycoproteine wie Hyaluronsäure, Immunglobuline wie IgG, Immunmodulatoren wie die Interferone oder die Interleukine, Farbstoffe wie Arsenazo III, Radiomarker wie ¹&sup4;C, radio-opake Verbindungen wie &sup9;&sup9;Te fluoreszente Verbindungen wie Carboxyfluoreszein, Polysaccharide wie Glycogen, Zellrezeptor-Bindungsmoleküle wie Östrogenrezeptorprotein, nicht-steroide entzündungswidrige Mittel wie Indomethacin, Salicylsäure-acetat, Iboprufen, Sulindac, Piroxicam und Naproxen; entzündungswidrige Mittel wie Dexamethason, Antiglaukom-Mittel wie Timolol oder Pilocarpin, Anästhetika wie Dibucain, Nukleinsäuren wie Thymin, Polynucleotide wie RNA-Polymere, cardiovasculäre Mittel wie α-Blocker, β-Blocker, Calcium-Kanalblocker, ACE-Inhibitoren und ähnliche ZNS-Mittel und Prostaglandine.
Während der Herstellung der HDLC können, wie allgemein bei der Herstellung von Liposomen, organische Lösungsmittel verwendet werden. Geeignete organische Lösungsmittel sind solche mit intermediären Polaritäten und dielektrischen Eigenschaften (solche, die eine Polarität zwischen entgegengesetzten elektrischen Ladungen haben), die Lipide solubilisieren, und dazu gehören, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Chloroform, Ethanol, Dimethylsulfoxid (DMSO), Methylenchlorid und Lösungsmittelgemische, wie Chloroform:Methanol (70:30) und Benzen: Methanol (70:30). Als Ergebnis werden die Lipide enthaltende Lösungen gebildet, definiert als Gemische, in denen die Komponenten gleichmäßig verteilt sind. Lösungsmittel werden vorzugsweise aus Basis ihrer Biokompatibilität, der niedrigen Toxizität und der Entflammbarkeit ausgewählt. Bei der Solubilisierung des Arzneimittels, speziell bei Amphotericin B, wird DMSO bevorzugt, da es am löslichsten in DMSO ist. Methanol kann DMSO ersetzen bei gleichzeitiger Erhöhung des Lösungsmittelvolumens. Für die Solubilisierung des Lipids wird Methylenchlorid vorzugsweise verwendet wegen dessen niedriger Toxizität beim Menschen. In den neuen Liposom-bildenden Verfahren der vorliegenden Erfindung sind Ethanol oder wäßrige Lösungen bevorzugte Lösungsmittel.
Bei der Hydratationsstufe der HDLC-Bildung können wäßrige Lösungen, wie destilliertes Wasser (z.B. Wasser zur Injektion gemäß Arzneibuch der USA (USP- Wasser)), Salzlösung oder wäßrige Puffer verwendet werden. Wäßrige Puffer, die verwendet werden können, schließen ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt, gepufferte Salzlösungen wie Phosphat-gepufferte Salzlösung ("PBS"), Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Hydrochlorid ("TRIS")-Puffer oder Glycin-Puffer bei einem pH von 7,0 bis 7,5, vorzugsweise 7,2.
Bei den Herstellungsstufen der HDLC oder der neuen Liposome kann eine Beschallungsstufe durchgeführt werden. Ein solches Verfahren wird in einem Bad- Schallgerät für 15 bis 30 Minuten bei 25º C bei 50 bis 60 Hz durchgeführt.
Die HDLC oder Liposomen, die gebildet werden, können durch Extrudierung durch ein Filter auf Größe gebracht werden nach dem Verfahren von Cullis et al., PCT-Veröffentlichung 88/00238, veröffentlicht am 16. Januar 1986. Derartige Trennverfahren nach Korngrößen gestatten die Bildung von homogenen Populationen von Partikeln hinsichtlich der Größe. so kann zum Beispiel das Filtern der HDLC über einen gekrümmten Weg oder gerade durch ein Membranfilter hindurch, wie ein Polycarbonat-Filter, durchgeführt werden.
Die HDLC oder Liposomen, die durch die neuen Verfahren der vorliegenden Erfindung gebildet werden, können Gegenstand einer Lyophilisierung oder eines Dehydratationsverfahrens in verschiedenen Stufen der Bildung sein. Zum Beispiel kann der Lipidfilm nach Entfernung des Lösungsmittels und vor Zugabe des Arzneimittels lyophilisiert werden. Alternativ dazu kann der Lipid-Arzneimittelfilm vor der Hydratisierung der HDLC oder Liposome lyophilisiert werden. Eine derartige Dehydratisierung kann durchgeführt werden, indem Lipid, HDLC oder Liposom einem vermindertem Druck ausgesetzt werden, wodurch das gesamte suspendierende Lösungsmittel entfernt wird. Alternativ oder zusätzlich kann auch die am Ende hydratisierte HDLC- oder Liposom-Präparation dehydratisiert werden, indem sie in ein umgebendes medium von flüssigem Stickstoff gebracht wird und sie vor der Dehydratisierungsstufe eingefroren wird. Die Dehydratisierung mit vorheriger Einfrierung kann in Gegenwart von einem oder mehreren Schutzzuckern in der Präparation durchgeführt werden nach den Techniken von Bally et al., PCT-Veröffentlichung 86/01103, veröffentlicht am 17. Februar 1986 und Schneider et al., US-A-4229360, ausgegeben am 21. Oktober 1980. Derartige Techniken verstärken die Langzeitlagerfähigkeit und Stabilität der Präparationen. Andere geeignete Verfahren, die nicht bekannt oder später entdeckt werden, können bei der Dehydratisierung der oben offenbarten Lipid-Komplex-Präparationen verwendet werden.
Ein Verfahren zur Bildung HDLC der vorliegenden Erfindung ist ein MLV- Verfahren, worin das bioaktive Mittel (z.B. ein Arzneimittel) in Methanol in einem Kolben gelöst wird, zu dem anschließend Lipid, wie DMPC und DMPG in einem Molverhältnis 7:3 von DMPC:DMPG in Chloroform gegeben wird. nach Rotationsverdampfung der Lösung bei verringertem Druck wird der getrocknete Film in PBS resuspendiert und in einem Bad-Beschallungsgerät beschallt (bei 25º C für 30 Minuten, 50 bis 60 Hz) bis zur Klarheit. Bei Molverhältnissen von Arzneimittel:Lipid von 6 und darüber (bis 60 Molprozent) sind die Präprationen nichtliposomale HDLC-Strukturen, die im wesentlichen frei von Liposomen sind. Toxizitäten der HDLC-Präparationen sind vom Arzneimittel:Lipid-Verhältnis abhängig, Präparationen mit höheren Arzneimittel:Lipid-Verhältnissen (etwa 16 bis 50 Molprozent Arzneimittel) zeigen eine geringere akute Toxizität als Präparationen mit niedrigerem Arzneimittel:Lipid-Verhältnis (6 bis 15 Molprozent Arzneimittel). Wie oben erörtert, sind Präparationen, die bis zu 5 Molprozent Arzneimittel enthalten, im wesentlichen liposomal.
Ein weiteres Verfahren ist ein modifiziertes MLV-Verfahren, wobei der oben hergestellte Arzneimittel-Lipidfilm in einer Glasglocke unter verringertem Druck getrocknet wird, um ein schuppiges Arzneimittel-Lipid herzustellen. Diese Schuppen werden zu einem Pulver pulverisiert, das homogen hydratisiert wird, wenn wäßrige Lösung zugegeben wird. Das Verfahren schließt ein das Lösen des Arzneimittels in einem organischen Lösungsmittel wie DMSO oder Methanol, gefolgt vom Mischen mit einem Lipid (am bevorzugtesten mit einem 7:3 Molverhältnis von DMPC:DMPG) in Methylenchlorid. Das Gemisch wird anschließend unter verringertem Druck zu einem Film getrocknet, der dann beispielsweise in einer Glasglocke unter verringertem Druck getrocknet wird. Das erhaltene Pulver wird mit einer wäßrigen Salzlösung hydratisiert und erhitzt, um zu einer Arzneimittel-Lipid- Suspension zu gelangen. Wie oben erörtert, hängt die Bildung von HDLC, Liposomen und deren Gemischen und gleichzeitig der Grad an Toxizität von dem Arzneimittel:Lipid-Verhältnis ab.
Andere Verfahren können bei der Bildung von HDLC eingesetzt werden. Ein solches Verfahren ein SPLV-Verfahren, worin das Arzneimittel in einem Lösungsmittel wie DMSO gelöst wird. Ein Lipid (wie ein 7:3 Molverhältnis von DMPC:DMPG) in einem Lösungsmittel z.B. Chloroform oder Methylenchlorid) wird zu einem dünnen Film unter verringertem Druck getrocknet, und ein organiches Lösungsmittel wie Methylenchlorid wird zu dem Lipid hinzugegeben. Ein Aliquotesd e s Arzneimittels (z.B. Amphotericin B) in Lösung wird zu der Lipidsuspension hinzugegeben, und das erhaltene Gemisch wird bis zur Klarheit beschallt. Eine gepufferte wäßrige Lösung (z.B. gepufferte Salzlösung) wird hinzugegeben, und das Gemisch wird nochmals unter verringerten Druck gebracht, um das Methylenchlorid zu entfernen. Die erhaltene Paste wird weiterhin mit PBS hydratisiert und bis zur Klarheit beschallt. Wie bei dem obigen Verfahren ist die erhaltene Präparation ein HDLC oder liposomal in Abhängigkeit von dem Molverhältnis vom verwendeten Arzneimittel:Lipid. Die D&sub5;&sub0;-Werte bei Mäusen nach diesem Verfahren zeigten geringere Toxizitäten bei höheren Arzneimittel:Lipid-Verhältnissen.
Ein weiteres Verfahren ist ein modifiziertes SPLV-Verahren, worin das Arzneimittel in einem organischen Lösungsmittel (z.B. DMSO) mit Lipid (z.B. DMPC:DMPG) in Lösung vermischt wird, und eine gepufferte wäßrige Lösung (z.B. PBS) wurde hinzugegeben, gefolgt von der Verdampfung des Lösungsmittels unter Stickstoff während der Beschallung. Zusätzliches PBS wurde hinzugegeben, und die erhaltene Lösung filtriert, vorzugsweise durch ein 5 Mikrometer Filter, anschließend bei etwa 10 000 x g für etwa 10 Minuten zentrifugiert. Die überstehende Lösung wurde entfernt, verworfen, und das Pellet in wäßrigem Lösungsmittel (PBS) resuspendiert. Nach einer zweiten "Wäsche" durch Zentrifugierung wurde das erhaltene Pellet in PBS resuspendiert. Wie bei den oben offenbarten Präprationen ist die akute Toxizität der präparationen direkt abhängig vom Arzneimittel:Lipid-Verhältnis; das heißt, je höher das Verhältnis ist (bis 60 Molprozent Arzneimittel) desto weniger toxisch ist die Präparation.
Nach einem weiteren SPLV-Verfahren wird eine Präparation hergestellt, worin das Arzneimittel-Lösungsmittel und die Lipidlösungen vorher vermischt werden, jedoch anstelle von Salzlösung Wasser für die Injektion gemäß US-Arzneibuch zugegeben wird, und die Suspension wird auf 37ºC erwärmt. Das Lösungsmittel wird wiederum unter Stickstoff bei Beschallung abgedampft, es wird mehr Wasser für die Injektion hinzugegeben, und die Suspension wird für etwa 10 Minuten bei 37ºC gehalten. Die Präparationen werden steril durch ein 0,1 oder 0,15 Mikrometer-Filter unter Einsatz des LUVET-Verfahrens filtriert. Ein solches Verfahren ist ein Extruderverfahren, wobei Liposome durch Filtration bei Drücken von etwa 700 psi hergestellt werden, und es ist Gegenstand der PCT-Veröffentlichung 86/99238, Cullis et al., veröffentlicht am 16. Januar 1986. Derartige Präparationen können auch nach dem Verfahren von Bally et al., wie zuvor beschrieben, dehydratisiert werden. Die akuten Toxizitätstests zeigen wiederum die verbessernden Wirkungen eines hohen Verhältnisses Arzneimittel:Lipid auf die Arzneimitteltoxizität.
Ein weiteres Verfahren besteht in der Lösung des Arzneimittels in sauer gemachtem wasserfreiem Ethanol durch Beschallung. Ein Lipid (z.B. ein Molverhältnis 7:3 von DMPC:DMPG), gelöst in einem Lösungsmittel (zB. Benzen:Methanol) wird lyophilisiert, anschließend wirbelnd mit einem wäßrigen Lösungsmittel (z.B. PBS) vermischt und die saure Alkohol-Arzneimittellösung zugegeben und bei Raumtemperatur gerührt. Die Präparation wird anschließend lyophilisiert und mit wäßrigem Puffer rehydratisiert. Alternativ dazu kann das Lösungsmittel unter Zurücklassung eines Lipid-Arzneimittel-Filmes verdampft werden, der dann mit wäßriger Lösung hydratisiert werden kann. Nochmals: niedrige akute Toxizitäten sind mit Präparationen von höheren Arzneimittel:Lipid-Verhältnissen verbunden. Wenn eine Arzneimittelkonzentration von 5 Molprozent und darunter verwendet wird, erbringt das Verfahren meist Liposome, im Vergleich mit der Verwendung mit 6 Molprozent und darüber, was zu Bildung von hauptsächlich HDLC führt. Die Zentrifugierung der Präparation über einen Dichtegradienten bestätigt, daß das gesamte Lipid mit dem Arzneimittel assoziiert ist. Die Präparation kann anschließend lyophilisiert werden, wobei Ethanol entfernt wird, und in wäßriger Lösung, wie destilliertem Wasser, rehydratisiert werden.
In einer anderen Liposom-bildenden Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Amphotericin B in Liposome über ein wäßriges Zwischenprodukt eingebracht. Bei dieser Technik wird Amphotericin B in einer wäßrigen Lösung suspendiert, zum Beispiel in destilliertem Wasser, durch Beschallung. Das suspendierte Arzneimittel wird anschließend mit einer Suspension von Lipid in wäßriger Lösung, wie destilliertem Wasser oder Natriumchloridlösung vermischt. Das Gemisch wird bei oder oberhalb der Übergangstemperatur des angewandten Lipids inkubiert, mit dem Ergebnis der Bildung von MLV.
Das hohe Molverhältnis Amphotericin B-Lipid-Präparationen, das oben diskutiert wurde, ist vermutlich der Grund für die niedrige Toxizität wegen der verstärkten Amphotericin B-Amphotericin B-Wechselwirkungen in der Lipidmatrix. Dies kann durch Absorptionsspektroskopie demonstriert werden. Die Absorption bei 413 nm, die zum Beispiel von freiem Amphotericin B in Desoxycholat erreicht wird, ist größer als die für nicht erhitztes 5 Mol-% Amphotericin B in Lipid. Weiterhin ist die für nicht erhitztes 5 Mol-% Amphotericin B in Lipid. Weiterhin ist die Absorption von 25 Mol-% Amphotericin B größer als die, die bei 50 Mol-% Amphotericin B in Lipid auftritt (siehe Fig. 10).
Das Absorptionsspektrum wird dazu verwendet, die Toxizität eines Arzneimittels (z.B. Amphotericin B)-Lipid-Komplexes zu bestimmen. Das Absorptionsspektrum eines Arzneimittels ist spezifisch für dieses Arzneimittel; das Kennzeichen von Amphotericin B (erscheint in Fig. 12, gelöst in Desoxycholat) liegt zwischen 300 und 500 nm und hat charakteristische Peaks, wobei die repräsentativsten dieser peaks die bei 413 nm sind. Die Dämpfung dieses Peaks durch Komplexierung des Arzneimittels mit einem Lipid kann quantitativ als Maß der Toxizität der HDLCC verwendet werden. Bei einem beliebigen der oben genannten Lipide wäre, wenn es auf diese Weise komplexiert wird, eine charakteristische, wenn auch abgeschwächte Absorption zu erwarten, wie hier diskutiert, da das Spektrum spezifisch für das Arzneimittel ist.
Wenn Amphotericin B-Lipid-Systeme, die weniger als maximale Toxizitätsabpufferung zeigen (zum Beispiel 25 Mol-% Proben), auf 25 bis 60ºC erhitzt werden, wird die Toxizität des erhaltenen Systems abgeschwächt (siehe Fig.11). Die Abschwächung oder Dämpfung führt zu einem Maximum der Toxizität, das beobachtet wird, wenn Amphotericin B mit 50 Mol-% Lipid komplexiert wird (siehe Fig.11). Eine mögliche Erklärung besteht darin, daß diese Abschwächung auftritt, da das Lipid phasengetrennt ist und dadurch vom Amphotericin B bei der Erwärmungsstufe verdrängt wird, was eine engere Assoziation des Amphotericin B mit sich selbst ermöglicht und somit ein weniger toxisches System. Das verdrängte Lipid zeigt sich durch das Wiedererscheinen (nach Erhitzen) eines Endotherms, das im Differentialkalorimeterspektrum (siehe Fig.12) sichtbar wird, übereinstimmend mit dem Lipid, das im wesentlichen frei von Amphotericin B ist. Weiterhin kann das verdrängte Lipid durch die Verengung des ³¹P-NMR-Signals demonstriert werden, das sich aus den erhitzten Systemen ergibt (siehe Fig.13). Nochmals: diese Verengung steht in Übereinstimmung mit dem Lipid, das im wesentlichen hinsichtlich der Amphotericin B-Konzentration reduziert ist.
Schließlich zeigt die Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie der erhitzten Systeme die Existenz von Lipid (und Liposomen) nach dem Erhitzen, was vorher nicht beobachtet wurde. Die nicht erhitzte probe zeigt Komplexe mit keinem freien Lipid, ein Charakteristikum von Systemen, die intramolekulare Wechselwirkung zwischen dem Lipid und dem Amphotericin B zeigen.
Wenn die obigen Untersuchungen an Proben durchgeführt werden, die 50 Mol-% Amphotericin B enthalten, werden geringe Differenzen zwischen den Proben beobachtet, die vor und nach dem Erhitzen untersucht wurden. Vermutlich ist bei dem 50 Mol-%-Niveau die Wechselwirkung des Arzneimittels mit dem Lipid nicht so groß, daß es kein weiteres Lipid gibt, das verdrängt aus der Struktur erhältlich ist. Diese Proben demonstrieren dann im wesentlichen unveränderte Signale sowohl vor als auch nach dem Erhitzen bei Untersuchung durch DSC und NMR.
Die Theorie, daß das Phasen-getrennte Lipid das Amphotericin B in einer Umgebung verläßt, die der Amphotericin B-Amphotericin B-Wechselwirkung dienlicher ist (und somit weniger toxisch), kann durch die Absorptionsspektroskopie gestützt werden. Die sich durch die erhitzten Systeme ergebenen Spektren sind wesentlich weniger intensiv (geben eine verringerte Toxizität an) im Vergleich mit unbehandelten Systemen. In einem Falle führte ein solches Erhitzen zu einer LD&sub5;&sub0; von größer als 30 mg/kg im Vergleich zu der nicht erhitzten Präparation mit einer LD&sub5;&sub0; von 15 mg/kg. In diesem Falle wurde die Dämpfung der Absorption bei 413 nm nach dem Erhitzen festgestellt.
Der obige Erhitzungsprozeß konnte mit einer beliebigen Art von Liposom oder Lipidpartikel oder Liposom- oder Lipidapartikel-Bildungsverfahren demonstriert werden, wie einem beliebigen der zuvor aufgezählten, jedoch in diesem Beispiel wurde das MLV-Verfahren verwendet. In ähnlicher Weise kann ein beliebiges der zuvor genannten Lipide oder Phospholipide verwendet werden sowie ein beliebiges Lösungsmittel oder wäßriger Puffer, wie zuvor genannt. Zum Beispiel wird ein Lipid (in einer beliebigen Menge, die zur Bildung von Lipiden bekannt ist, wie einem Molverhältnis 7:3 von DMPC:DMPG), suspendiert in einem organischen Lösungsmittel wie Chloroform, zu einem dünnen Film auf den Seiten eines Rundkolbens getrocknet. Amphotericin B (oder ein beliebiges anderes Arzneimittel, wie zuvor beschrieben) wird in einem beliebigen geeigneten organischen Lösungsmittel (ein geeignetes Lösungsmittel ist ein solches, das das Arzneimittel löst, speziell zum Beispiel das Amphotericin B) gelöst. Bei der vorliegenden Erfindung kann ein beliebiger Molprozentgehalt von Arzneimittel (Amphotericin B), der Liposomen oder Lipidteilchen bildet, verwendet werden. Speziell werden in der vorliegenden Erfindung von 5 bis 50 Mol-% Amphotericin B verwendet. Wo Liposomen zu bilden sind, wird ein Arzneimittel-zu-Lipid-Molverhältnis von 5 Mol-% Arzneimittel und weniger angewandt. Zur Bildung von HDLC werden 6 bis 50 Mol-% Arzneimittel angewandt. Bei 25 Mol-% Arzneimittel und darüber besteht die Population im wesentlichen aus HDLC.
Was die Erhitzung betrifft, einem Gegenstand der vorliegenden Erfindung, wird Amphotericin B gelöst in Methanol mit 10 mg Amphotericin B pro 100 ml Methanol oder 0,1 mg/ml Amphotericin B. Das Methanol enthaltende gelöste Amphotericin B (100,0 ml) wurde zu dem Lipidfilm hinzugegeben und der Film resuspendiert. Die erhaltene Suspension wurde anschließend unter vermindertem Druck zu einem dünnen Film rotationsverdampft. Der Lipid-Amphotericin B-Film wurde anschließend in einem Aliquoten der wäßrigen Lösung resuspendiert, wobei das Volumen davon ausreichend war, Liposomen oder Lipidteilchen zu bilden, wie zum Beispiel 4,0 ml. Die Suspension kann anschließend gerührt und mehrere Minuten bis etwa 1 Stunde beschallt werden und in einem Wasserbad von 25º C bis 60º C für 10 bis 400 Minuten erhitzt werden.
In einem anderen Verfahren zur Bildung HDLC der Erfindung wird anstelle der Beschallung mit einer Homogenisierungsstufe gearbeitet. So können zum Beispiel die HDLC hergestellt werden nach dem SPLV-Verfahren, worin ein Arzneimittel (z.B. Amphotericin B) zu einem entsprechenden Lösungsmittel (wie DMSO) hinzugegeben und mit einem mechanischen Rührer vermischt wird, um das gesamte Arzneimittel zu lösen. Falls erforderlich, kann die Lösung im Anschluß daran filtriert werden, wobei ungelöste Teilchen des Arzneimittels entfernt werden. Ein 7:3 Molverhältnis von DMPC:DMPG kann anschließend in einem entsprechenden Lösungsmittel (wie Methylenchlorid) gelöst werden, und das Lipid wird dann mit der Arzneimittel-DMSO-Lösung vermischt. Eine wäßrige Lösung, wie eine Salzlösung, wird anschließend zu dem Gemisch hinzugegeben, und die organischen Lösungsmittel durch Rotationsverdampfung bei etwa 35 bis 45º C entfernt. Im Anschluß an die Lösungsmittelentfernung wird das erhaltene Arzneimittel-Lipid- Gemisch mit wäßriger Lösung, wie Salzlösung, verdünnt, und die Suspension von HDLC unter Verwendung eines Homogenisators gemahlen. Für dieses Verfahren ist eine beliebige Homogenisierungsvorrichtung oder Kolloidmühle, die die Teilchen mahlt, annehmbar, vorzugsweise wird jedoch eine Gifford-Wood-Kolloidmühle verwendet. Die Teilchen werden solange gemahlen, bis eine annehmbare Teilchengröße erreicht wird, zum Beispiel, wenn 90% der Teilchen unterhalb 10 um Durchmesser sind, vorzugsweise in einem Größenbereich von 4 bis 10 um oder 15 bis 30 Minuten. Die Teilchen können die Mühle einmal oder mehrere Male passieren in Abhängigkeit von der gewünschten Größe und Homogenität. Die HDLC-Teilchen können hinsichtlich der Größenverteilung unter Verwendung des Malvern-Teilchengrößenmessers analysiert werden. Falls erforderlich können größere und kleinere Teilchen nach beliebigen aus dem Stand der Technik für die Abtrennung von Teilchen bekannten Verfahren entfernt werden, wie durch Filtration. Ein solches Verfahren führt vorzugsweise zu Teilchen zwischen etwa 0,2 um und 10,0 um Durchmesser.
Andere Verfahren, die den Fachleuten auf diesem Gebiet zur Bildung von Liposomen bekannt sind, können bei der praktischen Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden; die Erfindung der HDLC ist nicht allein auf die oben genannte Verfahren zu deren Herstellung beschränkt.
Die HDLC-Präparationen und die Liposomen, die aus dem neuen Verfahren der vorliegenden Erfindung resultieren, können therapeutisch bei Lebewesen (einschließlich des Menschen) für die Behandlung einer Anzahl von Infektionen oder Zuständen verwendet werden, die erfordern: (1) wiederholte Verabreichungen; (2) verzögerte Freisetzung eines Arzneimittels in seiner bioaktiven Form; oder (3) die herabgesetzte Toxizität mit im wesentlichen gleicher oder größerer Wirksamkeit des betreffenden freien Arzneimittels. Solche Zustände schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf fungale Infektionen, sowohl topische als auch systemische, wie solche, die mit antifungalen Mitteln behandelt werden können, wie Nystatin und Amphotericin B, und die viralen Erkrankungen erworbenes Immunschwächesyndrom (AIDS) und Herpes. Zusätzlich sind die erfindungsgemäßen Präparationen stabil in wäßrigen Lösungen.
Die Art der Verabreichung der Präparation kann die Stellen und die Zellen im Organismus bestimmen, an die die Verbindung gelangen soll. Die HDLC und Liposome der vorliegenden Erfindung können allein verabreicht werden, werden jedoch im allgemeinen im Gemisch mit einem pharmazeutischen Träger verabreicht, der in Hinblick auf den beabsichtigten Weg der Verabreichung und pharmazeutische Standardpraktiken ausgewählt wird. Zum Beispiel kann die Zuführung zu einer bestimmten Stelle am leichtesten durch topische Anwendung erfolgen (wenn die Infektion äußerlich ist, z.B. an Flächen wie den Augen, der Haut, in den Ohren oder bei Schmerzen wie Wunden oder Verbrennungen). Solche topischen Applikationen können in Form von Cremes, Salben, Gelen, Emulsionen oder Pasten für das direkte Auftragen auf die beeinträchtigte Fläche vorliegen. Alternativ dazu können die Präparationen parenteral injiziert werden, zum Beispiel intravenös, intramuskulär oder subcutan. Für die parenterale Verabreichung können sie zum Beispiel in Form einer sterilen wäßrigen Lösung verwendet werden, die andere gelöste Stoffe enthalten kann, zum Beispiel ausreichende Menge Salze oder Glucose, um die Lösung isotonisch zu machen. Andere Verwendungen können in Abhängigkeit von den besonderen Eigenschaften der Präparation von den Fachleuten auf diesem Gebiet vorgesehen werden.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können für die Behandlung von Asthma durch Einbringen einer versprühten wäßrigen Suspension der Liposomen oder der HDLC in die Lungen eingesetzt werden. Zum Beispiel können die Liposome oder HDLC in einem geeigneten Lösungsmittel suspendiert werden, das durch einen pneumatischen oder Ultraschall-Sprüher in einen Aerosol überführt werden kann, oder bequemer durch einen in sich abgeschlossenen Zerstäuber, der durch Gasdruck aus einem Fluorcarbon-Pellet betrieben wird. Es sind auch andere Inhalationssysteme akzeptabel, wie solche, bei denen die Liposomen oder HDLC in Teilchenform entweder als trockene Pulver oder als Suspension in einem geeigneten Trägersystem zugeführt werden. Nach der Vernebelung geht der meiste Teil des Treibmittel-Lösungsmittels durch Entspannungverdampfung verloren und wird durch Feuchtigkeit im Atemtrakt ersetzt, was zur Ablagerung der Teichen führt.
Für die Verabreichung beim Menschen bei der heilenden oder prophylaktischen Behandlung von fungalen oder viralen Erkrankungen wird der behandelnde Arzt endgültig die entsprechende Dosierung für einen menschlichen Patienten bestimmen, wobei dies entsprechend dem Alter, dem Gewicht und dem Zustand der Individuums sowie der Art und der Schwere der Symptome der Patienten variieren kann. Die Dosierung des Arzneimittels in der HDLC- oder der liposomalen Form wird im allgemeinen etwa der entsprechen, wie die für das freie Arzneimittel angewandt wird. In einigen Fällen kann es allerdings erforderlich sein, Dosierungen außerhalb dieser Grenzen zu verabreichen.

Beispiel 1

Amphotericin B (10 mg; Gesamtarzneimittel 5 Molprozent) wurde zu 100 ml Methanol in einem 500 ml Rundkolben gegeben, und das Gemisch wurde bis zur Klarheit beschallt. Die Beschallungsstufe wurde in einem Bad-Beschallungsgerät für 15 Minuten bei 25ºC und bei 50 bis 60 Hz durchgeführt. Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC) wurde hinzugegeben (100 mg in 1,0 ml Chloroform) sowie 42 mg Dimyristoylphosphatidylglycerol (DMPG) (in 0,42 ml Chloroform). Die erhaltene Dispersion wurde durch Rotationsverdampfung bei 60ºC unter vermindertem Druck getrocknet, um zu einem dünnen Film in dem Kolben zu gelangen. Der Film wurde resuspendiert in 4,0 ml PBS, wobei die Lösung in ein Glasröhrchen überführt wurde und bis zur Klarheit beschallt wurde.
Das obige Beispiel wurde mit 16,7 20, 25, 33, 50 und 60 Molprozent Amphotericin B wiederholt. Untersuchungen zur akuten Toxizität (LD&sub5;&sub0;), bei denen die Dosierung des Arzneimittels gemessen wurde, das zu einer 50% Todesrate bei Mäusen führte, lagen in dem Maße höher, wie die Molprozente an Arzneimittel erhöht wurden, bis zu 50 Molprozent Amphotericin B.

Beispiel 2

Amphotericin B (140 mg; Gesamtarzneimittel 5 Molprozent) wurde zu 1,5 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) gegeben. DMPC (1400 mg) und 600 mg DMPG wurden in 50 ml Methylenchlorid gelöst, und die beiden Lösungen wurden in einen Kolben übertragen. Die Lösung wurde bis zur Klarkeit gemischt und anschließend durch Rotationsverdampfung unter vermindertem Druck getrocknet, um einen Film auf dem Kolben herzustellen, und anschließend 1 bis 4 Tage in einer Glasglocke getrocknet. Nach diesem Trocknen wurde der Film, der trockene Schuppen gebildet hatte, zu einem Pulver pulverisiert und mit 100 ml oder 50 ml 0,9% Salzlösung oder 50 ml Wasser zur Injektion gemäß US-Arzneibuch gemischt. Die erhaltene Suspension wurde bei 37ºC für eine Stunde erhitzt.
Das obige Beispiel wurde unter Verwendung von Methanol anstelle von DMSO als suspendierendes Lösungsmittel für das Amphotericin B wiederholt und mit Molprozenten an Amphotericin B von 10, 16,7 und 33. 1 g und 2 g Ei-Phosphatidylcholin wurden anstelle des 7:3 Molverhältnisses von DMPC:DMPG verwendet.

Beispiel 3

Amphotericin B (100 mg; Gesamtarzneimittel 5 Molprozent) wurde in 2,0 ml DMSO gelöst. DMPC (100 mg in 1,0 ml) und DMPG (42 mg in 0,42 ml) wurde zugleich in Chloroform in einem Kolben gelöst, und das Chloroform wurde durch Rotationsverdampfung unter vermindertem Druck entfernt. Methylenchlorid (20 ml) wurde in den Kolben gegeben, gefolgt durch die Zugabe von 0,2 ml der Stammlösung von Amphotericin B. Diese Suspension wurde bis zur Klarheit beschallt (etwa 1 Minute) unter den in Beispiel 1 genannten Bedingungen. PBS (0,3 ml), pH 7,2 , wurde hinzugegeben, und das Methylenchlorid wurde anschließend unter einem Stickstoffstrom während der Beschallung entfernt. Die erhaltene Paste wurde in 10,0 ml PBS resuspendiert und bei 10 000 x g für 10 Minuten zentrifugiert, gefolgt von einer Badbeschallung für etwa 20 Minuten. Das obige Beispiel wurde wiederholt unter Verwendung von 16,7 , 20, 25, 33, 50 und 60 Molprozent Amphotericin B.

Beispiel 4

Amphotericin B (100 mg; Gesamtarzneimittel 5 Molprozent) wurde in 1,5 ml Methylenchlorid gelöst. Die beiden Lösungen wurden bis zur Klarheit miteinander vermischt, in einen Kolben übertragen und mit 8,0 ml PBS gemischt. Methylenchlorid wurde unter einem Stickstoffstrom abgedampft während der Badbeschallung. Die Beschallung wurde wie im Beispiel 1 fortgesetzt. PBS (32 ml) wurde hinzugegeben, und die Lösung mit einem 5 um porigem Teflonfilter aus Polytetrafluorethylen (PTFE) filtriert, zweimal durch Zentrifugieren gewaschen und schließlich in 100 ml PBS suspendiert.
Das obige Beispiel wurde wiederholt unter Verwendung von 4,0 und 12,0 ml PBS, um das Lipid zu hydratisieren.

Beispiel 5

Amphotericin B (140 mg; Gesamtarzneimittel 5 Molprozent) wurde in 1,5 ml DMSO gelöst. DMPC (1400 mg) und 600 mg DMPG wurden in 50 ml Methylenchlorid gelöst. Die beiden Lösungen wurden bis zur Klarheit miteinander vermischt, in einen Kolben übertragen und zu einem dünnen Film durch Rotationsverdampfung unter vermindertem Druck getrocknet. Der Film wurde anschließend in 50 ml Methylenchlorid resuspendiert, und zu dieser Lösung wurden 8,0 ml PBS gegeben. Methylenchlorid wurde durch Verdampfung unter Stickstoff während der Beschallung entfernt nach der Verfahrensweise von Beispiel 1. Die erhaltene Paste wurde weiter hydratisiert mit 32 ml PBS, und die Suspension wurde durch zweimalige Zentrifugierung gewaschen, schließlich in 100 ml PBS resuspendiert und durch ein 5 um poriges Teflonfilter (PTFE) filtriert.
Das obige Beispiel wurde wiederholt unter Verwendung von Glycin-Puffer bei pH 3, 6 und 9 anstelle von PBS.
Das obige Beispiel wurde ebenso wiederholt unter Verwendung von 5,0, 10,0, 15,0, 20,0 ml PBS als Volumen des Hydratisierungspuffers.

Beispiel 6

Amphotericin B (140 mg; Gesamtarzneimittel 5 Molprozent) wurde in 1,5 ml DMSO gelöst. Ei-Phosphatidylcholin (EPC) (2,0 g) wurde in 50 g methylenchlorid gelöst, und die beiden Lösungen wurden in einem Kolben vermischt. PBS (8,0 ml) wurde hinzugegeben, und das Lösungsmittel unter einem Stickstoffstrom während der Beschallung entfernt gemäß der Verfahrensweise von Beispiel 1. PBS (200 ml) wurde zugesetzt.
Das obige Beispiel wurde wiederholt unter Verwendung von 10 und 20 Molprozent Amphotericin B.

Beispiel 7

Amphotericin B (140 mg; Gesamtarzneimittel 5 Molprozent) wurde in 1,5 ml DMSO gelöst. DMPC (1400 mg) und 600 DMPG wurden in einem 500 ml Rundkolben mit 50 g Methylenchlorid gelöst. Die beiden Lösungen wurden in einem Kolben vermischt, und 10 ml Wasser zur Injektion gemäß US-Arzneibuch wurde bei 37ºC hinzugegeben. Das Lösungsmittel wurde unter Verwendung eines Stickstoffstromes während der Beschallung abgedampft nach der Verfahrensweise von Beispiel 1, und 50 ml Wasser zur Injektion, US-Arzneibuch, wurde anschließend hinzugegeben, und die Lösung wurde auf 37ºC für 30 Minuten erwärmt.
Das obige Beispiel wurde wiederholt unter Verwendung von 10 und 16,7 Molprozent Amphotericin B, gefolgt von der Passage der Lösung durch ein 3 um Polycarbonatfilter mit Direktdurchgang, erhältlich von Nucleopore.

Beispiel 8

Amphotericin B (140 mg; Gesamtarzneimittel 16,7 Molprozent) wurde mit 50 ml Methanol vermischt, und das Gemisch wurde 15 Minuten beschallt, um eine Lösung zu bilden. Diese wurde anschließend durch einen 0,22 um Polycarbonatfilter mit Vielfachwindungen (Gemisch von Cellulose- und Acetatnitratestern), erhältlich von Willex, geführt. DMPC (350 mg) und 150 mg DMPG wurden daneben in 50 g Methylenchlorid gelöst und mit der Filtratlösung vermischt. Die Lösungsmittel wurden unter einem Stickstoffstrom während der Beschallung abgedampft nach der Verahrensweise von Beispiel 1. PBS (50 ml) wurde hinzugegeben. Die Hälfte der Präparation (25 ml) wurde nach Standard-Lyophilisierungsverfahren lyophilisiert.

Beispiel 9

Zu 2,0 wasserfreiem Ethanol wurden 10 ul einer 1 N Salzsäure gegeben. Amphotericin B (20 mg; Gesamtarzneimittel 5 Molprozent) wurde zu dem sauren Ethanol hinzugegeben, und das Gemisch wurde bis zur Klarheit unter den Bedingungen wie im Beispiel 1 beschallt, mit Ausnahme der Beschallungszeit, die 30 bis 60 Sekunden betrug. DMPC (200 mg) und DMPG (42 mg) wurden in ein Teströhrchen gegeben, zu dem eine Lösung von Benzen:Methanol (70:30) zugegeben wurde, und die Lösung wurde wie im Beispiel 8 lyophilisiert. Das getrocknete Lipid wurde mit 2,0 ml PBS gemischt, und das Gemisch durch starkes Rühren dispergiert. Die Amphotericin B-Lösung (0,2 ml) wurde zu dem Lipid gegeben, und das Gemisch wurde über Nacht gerührt. Die erhaltenen DMPC:DMPG-MLV's (200 ul) wurden auf einen Saccharose-Dichtegradienten geschichtet und für 24 Stunden bei 22ºC bei 230 000 x g zentrifugiert. Die Ergebnisse sind aus Fig. 11 zu entnehmen; das gesamte Amphotericin B wurde mit dem lipid assoziiert in einer breiten Verteilung, wobei das obere Ende des Gradienten das meiste Lipid enthielt, und der Hauptpeak von Amphotericin B am Ende des Gradienten lag. Alternativ dazu wurden die erhaltenen DMPC:DMPG-MLV's lyophilisiert und mit destilliertem Wasser (2,0 ml) rehydratisiert.
Das obige Beispiel wurde wiederholt unter Verwendung von 7, 9, 16,7, 17, 20, 25, 33, 50 und 60 Molprozent Amphotericn B. Mit dem Molprozentgehalt an Arzneimittel bei und oberhalb 16,7 wurden die meisten HDLC gebildet. Die Dichtezentrifugationsgradienten derartiger Präparationen mit hohem Arzneimittel:Lipid- Verhältnis sind ähnlich denen, die in Fig. 5 wiedergegeben sind, wo das gesamte Arzneimittel und Lipid co-assoziiert in einem Einzelpeak ist.

Beispiel 10

Proben von 25 Molprozent Amphotericin B-DMPC:DMPG wurden für die Röntgenbeugung, DSC, Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie und ³¹P-NMR-Untersuchungen wie folgt hergestellt: ein 7:3 Molverhältnis von DMPC:DMPG (44 mg Gesamtlipid) und 20 mg Amphotericin B (25 Molprozent Amphotericin B) wurde in Chloroform:Methanol (70:30 v/v) suspendiert und unter vermindertem Druck bei 55ºC zu einem dünnen Film auf den Kolbenseiten eingedampft. Der Film wurde mit 8,0 ml 20 mM Hepes, 250 mM NaCl, pH 7,2, bei 22ºC durch starkes Mischen mit Glaskügelchen hydratisiert. Die Präparation wurde bei 10 000 x g für 10 Minuten zentrifugiert, das Überstehende abdekantiert und das Pellet resuspendiert in 1,0 ml des Hepes/NaCl- Puffers. Die Präparation wurde anschließend in einem Bad-Beschallungsgerät für 20 Minuten bei 25ºC und 50 bis 60 Hz beschallt.
Das obige Verfahren wurde wiederholt unter Verwendung von 0, 5 und 50 Molprozent Amphotericin B.

Beispiel 11

Um das eingekapselte Volumen an Amphotericin B-enthaltenden Liposomen und HDLC zu bestimmen wurde nach folgenden Verfahren gearbeitet:
DMPC (100 mg) und 42 mg DMPG, beide in Chloroform, wurden mit 10 mg Amphotericin B (25 Mol-%) in Methanol (0,1 mg/ml Amphotericin B) in einem Kolben vereinigt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck bei 37ºC entfernt. PBS (3,7 ml), zu dem 0,3 ml einer verdünnten ³H-Inulin-Lösung in destilliertem Wasser gegeben worden war, wurde zu dem trockenen Lipidfilm unter Rühren hinzugegeben. Ein Aliquotes (10,2 ml) dieser lösung wurde in einen Scintillationscocktail gegeben und auf Radioaktivität in einem beta-Scintillationszähler gezählt. Ein zweites Aliquotes wurde auf Phosphat nach dem Verfahren von Bartlett, J. Biol. Chem., 1959, 234:466-468 untersucht. Die Lipid-Arzneimittel- Suspension wurde bei 10 000 x g für 10 Minuten zentrifugiert, das Überstehende wurde verworfen und das Pellet in PBS resuspendiert. Die Zentrifugierungs- und Pellet-Resuspensionsstufen wurden zwei weitere male durchgeführt; die letzte Resuspendierung wurde als Probe genommen (100 ul) und in einem beta-Scintillationszähler gezählt. Ein zweites Aliquotes der letzten Pellet-Resuspension wurde wie oben auf Phosphat untersucht. Die prozentuale Einkapselung von Inulin wurde berechnet durch Division der finalen radioaktiven Zählungen durch die Anfangszählungen und Multiplikation mit 100. Das eingekapselte Volumen (ul Inulin eingekapselt/uMol Lipid) wurde ebenso berechnet.
Das obige Verfahren wurde wiederholt unter Verwendung von 0, 5 und 50 Mol- % Amphotericin B.

Beispiel 12

Amphotericin B-Teilchen wurden hergestellt durch Trocknung von 15,5 mg DMPC und 6,5 mg DMPG (Molverhältnis 7:3) aus etwa 10 ml Chloroform an den Seiten eines 100 ml Rundkolbens. Amphotericin B (10 mg) wurde in 100 ml Methanol suspendiert, und 100,0 ml der Methanollösung wurden in den Kolben gegeben, und der Lipidfilm suspendiert, was zu 25 Mol-% Amphotericin B führte. Das Gemisch wurde anschließend unter Rotationsverdampfung bei 37ºC zu einem dünnen Film auf den Seiten des Kolben getrocknet. Der Film wurde dann mit 4,0 ml von 10 mM Hepes, 150 mM NaCl (pH 7,2) unter Verwendung von Glaskügelchen hydratisiert und für 30 Minuten beschallt, um zu einer endgültigen Suspension zu gelangen. Eine Probe dieser Suspension wurde dann auf 60ºC für 10 Minuten durch Tauchen in ein Wasserbad erhitzt. Die erhaltene Suspension wurde durch DSC, NMR und Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie chrakterisiert.
Das obige Verfahren wurde wiederholt ohne Erhitzung der Probe. Diese Probe wurde bei 22ºC gehalten und wurde ebenso durch die oben genannten Verfahren charakterisiert.

Beispiel 13

Die Materialien und Verfahren von Beispiel 12 wurden wiederholt unter Verwendung von 50 Mol-% und Mol-% Amphotericin B. Diese Systeme wurden durch DSC, ESR und Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie chrakterisiert.

Beispiel 14

Die DSC-Messungen wurden auf einem Micro Cal MC-1 Gerät von Micro Cal, Inc., Amherst, MA durchgeführt. Probenvolumina von 0,70 ml, die 5 bis 9 mg Suspension enthielten, wurden in die Probenzelle injiziert mit dem gleichen Voluman an Puffer, das in der Referenzzelle verwendet wurde. Die Proben wurden entweder auf 26ºC/Stunde oder etwa 37ºC/Stunde erwärmt. Doppeldurchläufe der gleichen Probe mit der gleichen Entstehungsgeschichte ergaben Anfangs- und Endtemperaturen, die auf 0,2ºC reproduzierbar waren. Im allgemeinen wurden die Proben, die Amphotericin B enthielten, auf 60ºC erhitzt (nicht höher) und anschließend auf 7 bis 4ºC für wenigsten 2 Stunden abgekühlt, um die Übereinstimmung der Probenentstehung zu sichern.

Beispiel 15

Die NMR-Spektren wurden bei 145,7 MHz auf einem Bruker NMR-Spektrometer AM 360 (wide bore) erhalten unter Einsatz von 8K Datenpunkten für die Meßwertaufnahme, eine sweep-Weite von 50 000 Hz und eine Pulsbreite von 20 uSek bei einem 45º Puls. Die Spektren wurden aus bis zu 10 000 FID's aufakkumuliert.

Beispiel 16

Ein 0,1 bis 0,3 ul Aliquotes der Proben wurde sandwichartig zwischen ein Paar Balzers-Trägerplatten (Nashua, NH) genommen und schnell von 23ºC in flüssiges Propan getaucht. Die Proben wurden gebrochen und in einer Doppelrepliziervorrichtung in einem Balzers-Gefrierbruchgerät bei einem Vakuum von 2 x 10&supmin;&sup6; mbar oder höher und bei -115ºC repliziert. Die Repliken wurden in 3 N Salpetersäure flotiert, gefolgt vom Waschen in einer abgestuften Reihe von Natriumhypochlorit-Lösungen. Diese wurden schließlich in destilliertem Wasser gereinigt und auf 300 Hex-Mesh-Kupfersieben (Polysciences, PA) aufgenommen. Die Replikationen wurden auf einem Elektronenmikroskop Philips 300 bei einer 3000- bis 22 000- fachen Vergrößerung untersucht.

Beispiel 17

Die Absorptionsspektren (wie in Fig.12 und 13) wurden durch Verdünnung von Amphotericin B in Hepes/NaCl-Puffer auf 25 uM Liter Amphotericin B gemacht. Eine Probe wurde in eine Probenküvette eines Beckman-Spektrofotometers gebracht und bei 300 bis 500 nm abgelesen. Die Probenküvette wurde gegen den reinen Puffer gemessen.

Beispiel 18

Proben für die ESR wurden mit einer Reihe positioneller Isomerer von sterischen Doxylsäuren markiert, bei denen die Doxyl-Anzeigegruppe an verschiedenen Positionen entlang der Fettsäurekette vorhanden war. Die Markierung erfolgte durch Einarbeiten der Probe durch Verwirbelung und Beschallung aus einer methanolischen Lösung, die zu einem dünnen Film auf den Seiten eines Teströhrchens getrocknet wurden. Alle Proben wurden bei einem Molprozent markiert.
Die ESR-Spektren wurden auf einem IBM-ESR-Spektrometer ER100D mit einer Stickstoffgasstrom-Temperaturregulierung aufgezeichnet. Eine außerhalb eingemessene Thermistorsonde (Omega Engineering, Inc., Stamford, CA) wurde verwendet, um die Temperatur der Probe zu verfolgen. Die ESR-Spektren wurden bei einer Mikrowellenleistung von 10 MW und einer Mikrowellenfrequenz von 9,11 Ghz mit einer Feldablenkung von 100 G und einer 100 kHz Feldmodulationsamplitude von 0,32 G aufgezeichnet. Die Ordnungsparameter wurden aus der maximalen Hyperfeinaufspaltung (A max) berechnet.

Beispiel 19

Amphotericin B (337,5 g) wurde zu 3375 ml DMSO gegeben, und das Amphotericin B (100 mg/ml) bis zur Auflösung (etwa 3 Stunden) unter Verwendung eines mechanischen Mischers vermischt. Das Gemisch wurde in einen Druckbehälter aus rostfreiem Stahl (5 l Kapazität) übertragen und durch ein 0,22 um Sartofluor- Filter und ein Polypropylen-Tiefenfilter (Pall Profile, Pall, Inc., Glen Cove, N.Y.) filtriert.
In einen 40 l Druckkessel wurden 50,8 kg Methylenchlorid mit 225,0 g DMPC und 99,0 g DMPG für 3,5 Stunden vermischt, um diese vollständig zu lösen. Die erhaltene Lipidlösung wurde durch einen 0,2 m² Sartofluor-Teflonfilter mit 0,22 um in einen Behandlungstank aus rostfreiem Stahl gegeben. Der 40 l Druckkessel wurde mit zusätzlichen 55,2 kg Methylenchlorid gewaschen, und dieses wurde in ähnlicher Weise in den Behandlungstank filtriert. Der Behandlungstank wurde auf eine Rotationsvermischung der Lipidlösung bei 195 U/Min eingestellt, und die Amphotericin B-DMSO-Lösung wurde anschließend in den Tank gegeben. Danach wurde Natriumchloridlösung (16,2 l, 0,9% US-Arzneibuch) zu dem Tank über ein 0,22 um Millipak 100-Polycarbonatfilter zugegeben.
Unter Verwendung eines auf 35ºC eingestellten und mit dem Behandlungstank in Reihe geschateten Wärmeaustauschers wurde ein erwärmter flüssiger Stickstoffstrom über den Tank geleitet und das Lösungsmittel über einen Zeitraum von 12 Stunden entfernt. Der erhaltene Lipid-Arzneimittel-Komplex wurde mit Natriumchlorid 0,9% US-Arzneibuch (7000 ml) verdünnt und in den Tank über ein Millipak 100 0,22 um Filter gegeben. Die resultierenden HDLC wurden unter Verwendung der Gifford Wood Kolloidmühle und einer Kreiskolbenpumpe homogenisiert. Die HDLC wurden durch den Kolloidmühlenkopf bei einer Spalteinstellung von 12,7 um (0,5 mil) mit einem Rückdruck von 68,96 kPa (10 psi) für 3,0 Stunden gefuuhrt, was zu Teilchen mit weniger als 20 um führte. Die Teilchengröße der HDLC wurde mittels des Malvern-Teilchenzählers analysiert.

Beispiel 20

Lipid (102,6 uMol gesamt, 70:30 Molverhältnis von DMPC:DMPG) gelöst in Chloroform, wurde in einen 500 ml Rundkolben pipettiert. Nystatin (500 mg) wurde gelöst in 1,0 l Methanol (0,5 mg/ml) durch Beschallung in einem Branson-Badbeschallungsgerät. Das gelöste Nystatin (5,0 ml) wurde zu dem in dem Rundkolben enthaltenen Lipid gegeben und vermischt; das Lösungsmittel wurde anschließend durch Rotationsverdampfung bei 45ºC für 15 Minuten entfernt, und die resultierenden Präparationen wurden in Salzlösung (5,0 ml) durch starkes Mischen durch Glaskügelchen rehydratisiert. Nach der lichtmikroskopischen Untersuchung waren Liposomen sichtbar. Der obige Ablauf wurde wiederholt unter Verwendung von 25, 50, 75 und 100 Mol-% Nystatin. Nach der Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie- Untersuchung waren die Präparation, die 25 Mol-% Nystatin enthielten, nichtliposomale HDLC.

Beispiel 21

Lipid (14,8 uMol/ml, Molverhältnis 7:3 von DMPC:DMPG) wurde in destilliertem Wasser hydratisiert und bei 4ºC inkubiert. Die erhaltenen MLV wurden durch zwei übereinander geschichtete Polycarbonatfilter zehnmal unter Einsatz des LUVET-Verfahrens extrudiert.
Amphotericin B wurde in destilliertem Wasser unter Verwendung eines Badbeschallers bei einer Konzentration von 10,8 uMol/ml dispergiert. Die Amphotericin B-Dispersion wurde zu der Lipidsuspension bis zu einer endgültigen Lipid- und Amphotericin B-Konzentration von 13,5 uMol/ml bzw. 0,98 uMol/ml zugegeben. Um das nicht eingeschlossene Amphotericin B zu entfernen, wurden 20 ml der Probe bei 15 000 x g für 30 Minuten in einem Ti60- oder SW 27-Rotor (Beckman) bei 22ºC in einer Ultrazentrifuge Beckman L8-60 zentrifugiert. Das überstehende freie Amphotericin B wurde ohne Zerstörung des Liposompellets entfernt. Die erhaltenen Liposomen wurden durch quasi-elastische Lichtstreuung als größer als 1,0 um im Durchmesser gemessen.
Die obige Verfahrensweise unter Anwendung von Inkubationsbedingungen von 23ºC wurde wiederholt bei Einsatz von 150 mM NaCl, 10 mM Na&sub2;PO&sub4;, pH 7,4, um die Lipide zu hydratisieren. Die erhaltenen Liposomen wurden durch quasi-elastische Lichtstreuung gemessen als größer als 1,0 um im Durchmesser. Die Geschwindigkeit der Amphotericin B-Aufnahme durch die Liposomen war dann am höchsten, wenn die Ionenstärke des Mediums gering war (destilliertes Wasser gegen 150 mM NaCl) (Fig. 17).
Fig. 16 zeigt die Aufnahme von Amphotericin B in DMPC:DMPG-Liposomen unter verschiedenen Inkubationstemperaturbedingungen. Die Geschwindigkeit der Aufnahme ist ähnlich bei 23ºC und 45ºC. Das Arzneimittel sammelt sich auch, wenn das Lipid sich in der Gel-Phase befindet, d.h. bei 15ºC.

Beispiel 22

Es wurde mit den Materialien und der Verfahrensweise von Beispiel 20 gearbeitet, wobei jedoch das in destilliertem Wasser suspendierte Lipid mit dem Amphotericin B bei 22ºC inkubiert wurde. Die resultierenden Liposome waren unilamellar und wurden bei etwa 0,1 bis 0,2 um im mittleren Durchmesser gemäß quasi-elastischer Lichtstreuung gemessen. Fig. 19 zeigt, daß die Geschwindigkeit der Amphotericin B-Aufnahme schneller in den ersten beiden Stunden mit diesen LUV ist als bei den MLV.

Claims

1. Zusammensetzung, die einen hydrophoben bioaktives Mittel-Lipid-Komplex umfaßt, worin das Lipid eine Fettsäure oder ein Phospholipid umfaßt, wobei die Konzentration des bioaktiven Mittels in dem Komplex wenigstens 6 Molprozent beträgt und der Komplex im wesentlichen frei von Liposomen ist.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das bioaktive Mittel ein antimykotisches Polyen-Antibiotikum ist.

3. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 2, worin das Lipid ein Phospholipid umfaßt.

4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, die ein Lipid und ein bioaktives Mittel umfaßt, worin die Molprozente des bioaktiven Mittels von 6 bis 50 Molprozent betragen.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 4, worin das bioaktive Mittel ein antimykotisches Polyen-Mittel ist und worin die Molprozente des antimykotischen Polyen-Mittels 6 bis 50 Molprozent betragen.

6. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das Phospholipid ein gesättigtes Phospholipid oder eine gesättigte Fettsäure umfaßt.

7. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin das Phospholipid Phosphatidylcholin und Phosphatidylglycerol umfaßt.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 7, worin das Phosphatidylcholin Dimyristoylphosphatidylcholin und das Phosphatidylglycerol Dimyristoylphosphatidylglycerol ist.

9. Zusammensetzung nach Anspruch 8, worin das Phosphatidylcholin und das Phosphatidylglycerol in einem Molverhältnis von 7:3 vorliegen.

10. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 9, worin die Molprozente des antimykotischen Polyen-Mittels zwischen 25 und 50 Molprozent liegen.

11. Zusammensetzung nach Anspruch 10, worin die Molprozente des antimykotischen Polyen-Mittels 33 Molprozent betragen.

12. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 11, worin das antimykotische Polyen-Mittel Amphotericin B ist.

13. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 11, worin das antimykotische Polyen-Mittel Nystatin ist.

14. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, worin die Größe des hydrophoben Komplexes bioaktives Mittel-Lipid zwischen 0,2 und 10 um liegt.

15. Pharmazeutische Zusammensetzung, die den hydrophoben Komplex bioaktives Mittel-Lipid nach einem der Ansprüche 1 bis 14 umfaßt und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel.

16. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 15, die für die parenterale Verabreichung angepaßt ist.

17. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 15 oder 16 zur Behandlung einer Infektionskrankheit in einem Säuger mit einer wirksamen Menge der pharmazeutischen Zusammensetzung, insbesondere für eine fungale Infektion und eine virale Infektion.

18. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, die einen hydrophoben Komplex bioaktives Mittel-Lipid nach einem der Ansprüche 1 bis 14 umfaßt, wobei das Verfahren aus den Stufen besteht:

(a) Lösen von wenigstens einem Lipid in einem organischen Lösungsmittel intermediärer Polarität;

(b) Lösen des Arzneimittels in einem biokompatiblen organischen Lösungsmittel; und

(c) Vermischen der Lösung (a) mit der Lösung von Stufe (b).

19. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, die einen hydrophoben Komplex bioaktives Mittel-Lipid nach einem der Ansprüche 1 bis 14 umfaßt, wobei das Verfahren aus den Stufen besteht:

(b) Lösen des Arzneimittels in einem organischen Lösungsmittel;

(c) Vermischen der Lösung der Stufe (a) mit der Lösung von Stufe (b); und

(d) Dehydratisieren des Gemisches, das aus Stufe (c) oben resultiert.

20. Verfahren zur Herstellung eines hydrophoben Komplexes bioaktives Mittel-Lipid nach einem der Ansprüche 1 bis 14 umfaßt, wobei das Verfahren aus den Stufen besteht:

(b) Lösen des Arzneimittels in einem biokompatiblen organischen Lösungsmittel;

(c) Vermischen des Produktes der Stufe (a) mit der von Stufe (b);

(d) Verdampfen des Lösungsmittels aus dem Gemisch von Stufe (c) oben unter vermindertem Druck zur Herstellung eines getrockneten Lipidfilmes; und

(e) Zugabe einer wäßrigen Lösung zu dem Film von Stufe (d).

21. Verfahren zur Herstellung eines hydrophoben Komplexes bioaktives Mittel-Lipid nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei das Verfahren die Stufen umfaßt:

(a) Lösen des Arzneimittels in einem biokompatiblen organsichen Lösungsmittel;

(b) Lösen wenigstens eines Lipids in einem organischen Lösungsmittel intermediärer Polarität und Vermischung dessen mit der Lösung von Stufe (a);

(c) Zugabe einer wäßrigen Lösung zu den vermischten Lösungen (a) und (b) oben und Verdampfung der Lösungsmittel unter Druck zur Bildung einer Paste; und

(d) Zugabe von wäßriger Lösung zu der Paste von Stufe (c) oben.

22. Verfahren zur Bestimmung der Toxizität eines hydrophoben Komplexes bioaktives Mittel-Lipid durch Ablesen des Absorptionsspektrums der hydrophoben Komplexpräparation bioaktives Mittel-Lipid und Messung der Peak-Intensität.

23. Verfahren zur Herstellung eines hydrophoben Komplexes bioaktives Mittel-Lipid, der ein Arzneimittel und ein Lipid in einem hohen Arzneimittel: Lipid-Molverhältnis umfaßt, wobei das Verfahren die Stufen umfaßt:

(a) Suspendieren eines Arzneimittels in einer wäßrigen Lösung;

(b) Suspendieren eines Lipids in einer wäßrigen Lösung;

(c) Vermischen der Produkte von Stufe (a) und (b); und

(d) Inkubieren des Produktes von Stufe (c) bei oder oberhalb der Übergangstemperatur des Lipids.

24. Verfahren nach Anspruch 23, worin das Arzneimittel in einer wäßrigen Lösung durch Ultraschall suspendiert wird.