DE3731953A1 - Neue saccharide, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Saccharide, Verfahren zu ihrer Herstellung, sie enthaltende pharmazeutische Zubereitungen und ihre Verwendung als Pharmazeutika.

Die Erfindung betrifft insbesondere neue Saccharide der Formel

worin R₁ und R₂ gleich oder verschieden sind und jeweils für eine gegebenenfalls substituierte Acylgruppe stehen, in freier Form oder in Form ihrer Säureadditionssalze, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihrer Verwendung

Erfindungsgemäß gelangt man zu den Verbindungen der Formel I, indem man Verbindungen der Formel

worin R und R′ für Schutzgruppen stehen und R₁′ die gleiche Bedeutung wie R₁ besitzt, wobei jedoch gegebenenfalls vorhandene OH-Gruppen geschützt sind, acyliert und anschließend die vorhandenen Schutzgruppen abspaltet.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann beispielsweise ausgeführt werden, indem man eine Verbindung der Formel II in einem unter den Reaktionsbedingungen inerten Lösungsmittel, z. B. in einem Halogenkohlenwasserstoff, wie Methylenchlorid, gemeinsam mit dem Acylierungsmittel, gegebenenfalls unter Zusatz von Dicyclohexylcarbodiimid und 4-Dimethylaminopyridin, löst und bei tiefer Temperatur, z. B. bei etwa 4°C, reagieren läßt. Aus dem Reaktionsgemisch kann das Reaktionsprodukt nach an sich bekannten Methoden isoliert und gegebenenfalls gereinigt werden. Anschließend werden die vorhandenen Schutzgruppen in bekannter Weise abgespalten.

Als Schutzgruppen können die in der Saccharidchemie allgemein üblichen Schutzgruppen verwendet werden, beispielsweise die Triphenylmethylgruppe. Auch als Schutzgruppe des Phosphatrestes können bekannte Schutzgruppen eingesetzt werden, z. B. die Benzylgruppe.

R₁ und R₂ sind gleich oder verschieden und bedeuten eine Acylgruppe mit beispielsweise 4 bis 20, vorzugsweise 12 bis 16 und insbesondere 14 Kohlenstoffatomen, die in der 3-Position durch OH, Acetoxy oder eine Acyloxygruppe, wie sie oben definiert ist, substituiert sein kann, wobei das C-3-Atom R- oder S-konfiguriert ist. In den Verbindungen der Formel I können daher R₁ und R₂ in achiraler Form, in R-, S- oder racemischer Form vorliegen. Bei den in der Erfindung beschriebenen Reaktionen bleibt die Konfiguration während des Reaktionsablaufs unverändert, d. h., ausgehend von R-, bzw. S- oder racemischen Ausgangsprodukten erhält man die entsprechenden R-, bzw. S- oder racemischen Endverbindungen.

Die Verbindungen der Formel I werden bevorzugt als Säureadditionssalze gewonnen, wobei als Gegenion zur Erhöhung der Wasserlöslichkeit bevorzugt hydrophile basische Verbindungen, beispielsweise Tris(hydroxymethyl) aminomethan oder L-Lysin, verwendet werden.

Die als Ausgangsprodukte benötigten Verbindungen der Formel II können erhalten werden, indem man in einer Verbindung der Formel

worin R₁′ und R′ obige Bedeutung besitzen, die ungeschützte OH-Gruppe in Position 1 zu einem geschützten Phosphatester umsetzt. Dieses Verfahren kann beispielsweise ausgeführt werden, indem man eine Verbindung der Formel III in einem unter den Reaktionsbedingungen inerten Lösungsmittel, z. B. in einem cyclischen Ether, wie Tetrahydrofuran, löst und bei tiefer Temperatur, beispielsweise bei -50°C, mit Butyllithium in einem aliphatischen Kohlenwasserstoff, z. B. in Hexan, versetzt und dann Dibenzylphosphorchloridat zugibt. Aus dem Reaktionsgemisch kann das Produkt nach an sich bekannten Methoden isoliert und gegebenenfalls gereinigt werden. Die freien OH-Gruppen des Phosphatrestes sind geschützt, z. B. durch Benzyl.

Die weiteren Ausgangsprodukte sind bekannt oder nach bekannten Methoden bzw. analog zu bekannten Methoden oder analog wie in den Beispielen beschrieben herstellbar.

Die Verbindungen der Formel I zeigen eine Beeinflussung der unspezifischen antimikrobiellen Resistenz. Diese Wirkung kann beispielsweise mit folenden Testmethoden gezeigt werden:

1.Bestimmung der endotoxischen Aktivität mittels Limulus-Amoebozytenlysat- Test

Endotoxin katalysiert die Aktivierung eines Proenzyms im Limulus-Amoebozytenlysat. Gemessen wird die Abspaltung von p-Nitroanilin aus einem farblosen Substrat. Das Ausmaß dieser Abspaltung wird photometrisch erfaßt, wobei die Korrelation zwischen Absorption und Endotoxinkonzentration (bzw. -Aktivität bei Analoga) im Bereich von 0,01-0,1 ng/ml Endotoxin linear ist (Vergleich mit den Absorptionswerten eines Standard- Endotoxins). Von jeder Probe (gelöst in pyrogenfreiem Aqua bidestillata sterilis) wird eine Verdünnungsreihe 1 : 10 hergestellt. Bei jeder Bestimmungsreihe wird zusätzlich eine Leerprobe mitgeführt. 100 µl Probe bzw. Standard oder Leerwert werden mit 100 µl Limulus-Amoebozytenlysat versetzt. Die Reaktion wird nach 10 Minuten Inkubation bei 37°C mit 200 µl Substrat versetzt. Nach weiteren 3 Minuten Inkubation wird die Reaktion mit 200 µl 50% Essigsäure gestoppt. Nach Aufschütteln der Probe wird in einem Spektralphotometer bei 405 nm die Absorption gegen einen Leerwert gemessen. Die Ermittlung des Endotoxingehaltes (der Endotoxinaktivität) der Probe als Endotoxin-Units (E. U.) erfolgt durch Berechnung einer linearen Regression mit den Werten des Standardendotoxins.

2. Endotoxinschock-Induktion in der Maus

Der Test erfaßt die Erzeugung eines Endotoxinschocks bzw. eines klinisch ähnlichen Zustandes mit letalem Ausgang durch LPS-ähnliche Substanzen in Galactosamin-(GalN)-sensibilisierten Mäusen. Männliche C57-bl.-Mäuse (6 Tiere pro Kollektiv) erhalten simultan i.p. 8 mg GalN, gelöst in 0,5 ml PBS, und 0,1 µg LPS aus Salmonella abortus equi (Sigma), gelöst in 0,2 ml physiologischer Kochsalzlösung. Diese Behandlung führt zum Tod aller Tiere innerhalb von 6-12 Stunden (C. Galanos, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76 [1979] 5939-5943). Anstelle des LPS im Standardverfahren werden Prüfsubstanzen in verschiedenen Dosierungen simultan mit GalN bzw. auch vor oder nach der GalN-Behandlung einmal parenteral oder oral verabreicht. Die Beurteilung des Ergebnisses erfolgt anhand eines Vergleiches der geringsten Dosis, die zum Tod aller Tiere einer Gruppe führt, oder durch Berechnung einer LD₅₀ mittels der Spearman-Kärber-Methode.

3. Mikrobielle Septikämie in der neutropenischen Maus

Dieses Modell gestattet die Prüfung einer substanzbedingten Abwehrsteigerung in mikrobiell infizierten, neutropenischen Mäusen. Zur Erzeugung einer Neutropenie erhalten je 20 weibliche B₆D₂F₁-Mäuse 1×200 mg/kg Körpergewicht Cyclophosphamid in 0,2 ml Aqua dest. gelöst. s.c. am Tag 0 verabreicht. Am Tag 3 wird die Prüfsubstanz, soweit möglich, in physiologischer NaCl-Lösung, ansonsten jedoch auch in anderer Weise gelöst (0,3 ml) parenteral (vorrangig i.p.) oder auch peroral verabreicht. Die Infektion erfolgt am Tag 4 durch i.v. Verabreichung des jeweiligen Inoculums in einem Volumen von 0,2 ml (Keimzahl pro Maus z. B. Pseudomonas aeruginosa Δ12 : 1×10⁵, E.coli Δ120 : 2×10⁶, Staph. aureus Δ113 : 1×10⁶, Candida albicans Δ124 : 1×10⁴). Die Versuchstiere werden bis zum 10. Tag nach der Infektion beobachtet und täglich die auftretenden Todesfälle registriert. Im Vergleich zur Infektionkontrolle bzw. zu Standards werden folgende Parameter ausgewertet.

a) Durchschnittliche Überlebensdauer
b) Überlebensrate

Die Verbindungen der Formel I zeigten sowohl in den experimentellen Infektionen durch gramnegative Keime (z. B. Pseudomonas und E.coli) wie auch bei Infektionen durch grampositive Keime (z. B. Staph. aureus) bzw. Hefen (z. B. Candida albicans) nach parenteraler Verabreichung hinsichtlich Überlebensdauer und Überlebensrate deutliche Verbesserungen, verglichen mit der unbehandelten Infektionskontrolle.

4. Aktivierung von humanen Blutneutrophilen Oxydationsmetabolismus

Neutrophile (mindestens 95% Reinheit) werden mit der Prüfsubstanz in drei verschiedenen Konzentrationen für 1 bis 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Freisetzung von Superoxidanionen durch die Zellen als Index für die Aktivierung wird dann als Superoxid Dismutase-inhibierbare Reduktion von Cytochrom C gemessen. 1×10⁶ Neutrophile, mit Testsubstanz vorbehandelt oder nicht, werden dem Cytochrom C (80 µMol) zugesetzt, das Formylmethionylleucylphenylalanin (10^-6 M) enthält. Die Kontrollen enthalten zusätzlich 50 µg Superoxiddismutase. Nach 15 Minuten Inkubation bei 37°C wird die Reaktion durch Einbringen der Teströhrchen in ein Eisbad beendet. Sie werden dann schnell bei 400×g für 5 Minuten zentrifugiert, um die Zellen abzutrennen. Die Reduktion von Cytochrom C, die proportional der Menge an freigesetztem Superoxidanion ist, wird photometrisch bei 550 nm gemessen. Die Hemmwirkung der Prüfsubstanzen bei der PMN-Aktivierung durch LPS wird wie beschrieben gemessen mit der Maßgabe, daß nach der Vorinkubation der Leukocyten die Zellen weiterhin mit einer stimulierenden Konzentration von LPS inkubiert werden.

5. Carbon Clearence Test

Das Prinzip des Tests beruht darauf, daß Partikel in einer Größenordnung von 200-250 A (z. B. Kohlepartikel) aus dem Organismus nur durch Phagozytose durch Makrophagen eliminiert werden können. Bei intravenöser Verabreichung von Kohlepartikeln werden diese duch Phagozytose der Makrophagen in Leber (Kupffer'sche Sternzellen) und Milz aus dem Blutstrom eliminiert. Die Prüfung der RES-Aktivierung einer Substanz erfolgt durch einmalige oder wiederholte Verabreichung als wäßrige Lösung oder als Suspension. Die für die Behandlung vorgesehene Substanzmenge wird entweder in 4täglichen Einzeldosen oder einmal 24 Stunden vor Testbeginn i.p. oder s.c. appliziert. Tuschesuspension mit einem 10%igen Gehalt an Gasruß wird mit einer 1%igen Gelatine-NaCl-Lösung auf einen Gehalt von 16 mg Kohle/ml verdünnt. Jede Maus erhält 0,2 ml/20 g KG intravenös verabreicht. 3, 6, 9, 12 und 15 Minuten nach der intravenösen Verabreichung werden durch Punktion des Orbital plexus 25 µl Blut entnommen. Das Blut wird in 2 ml dest. Wasser hämolysiert. Die Kohlekonzentration wird photometrisch bestimmt. Anschließend werden die Tiere getötet und Leber und Milzgewichte bestimmt.

6. Herpesinfektion der Maus

Das Modell der intrakutanen Herpesinfektion gestattet die Prüfung einer substanzbedingten Abwehrsteigerung bei mit Herpesviren infizierten Mäusen. Der Krankheitsverlauf ist prolongiert und ermöglicht die Beobachtung des sequentiellen Auftretens mehrerer Parameter. Es treten herpetische Läsionen an der Infektionsstelle auf, diese ulcerieren, das nächstgelegene Bein wird gelähmt und die Paralyse schreitet fort bis zum Tode. Immunkompetente haarlose Mäuse werden am Tag 0 durch intrakutane Verabreichung des jeweiligen Inoculums in einem Volumen von 0,025 ml (z. B. 1×10⁶ Plaque-bildende Einheiten Herpes simplex Typ 1/Maus) intrakutan infiziert. Die Prüfsubstanz wird in Lösung, beispielsweise in physiologischer NaCl, (0,1 ml) i.p. verabreicht.

Das Modell der systemischen Herpesinfektion gestattet die Prüfung einer substanzbedingten Abwehrsteigerung bei mit Herpesvieren infizierten Mäusen. Immunkompetente NMRI-Mäuse werden am Tag 0 durch i.p. Verabreichung des jeweiligen Inoculums in einem Volumen von 0,1 ml (z. B. 1,3×10⁵ Plaque-bildende Einheiten Herpes simplex Typ 1/Maus) infiziert. Die Prüfsubstanz wird in Lösung, beispielsweise in physiologischer NaCl, subkutan verabreicht.

Die Versuchstiere werden bis zum 20. Tag nach der Infektion beobachtet und täglich die auftretenden Läsionen, Paralysen und Todesfälle registriert. Im Vergleich zur Infektionskontrolle bzw. zum Standard werden folgende Parameter ausgewertet:

a) Zahl der Mäuse mit Läsionen (kumulativ)
b) Zahl der Mäuse mit Paralysen (kumulativ)
c) Durchschnittliche Überlebensdauer
d) Überlebensrate.

Die Verbindungen der Formel I zeigten bei einmaliger Gabe zwischen Tag 0 bzw. -1 und +6 in der experientellen HSV-1-Infektion nach i.p. bzw. subkutaner Verabreichung hinsichtlich Krankheitsverlauf, Überlebensdauer und Überlebensrate deutliche Verbesserungen, verglichen mit der unbehandelten Infektionskontrolle.

7. Induktion von CSF (Kolonie stimulierender Faktor

CSFs sind Mediatoren, die im Organismus infolge von Infektionen oder Toxineinwirkungen produziert werden. Ihre biologischen Funktionen sind vielseitig, der Nachweis wird über die Stimulation der Proliferation des haemopoietischen Systems, insbesondere der Knochenmarkszellen, geführt. B₆D₂F₁ Mäusen werden die Prüfsubstanzen ein- oder mehrmals bis zu einer Dosierung von 50 mg/kg parenteral oder oral verabreicht. In variablen Zeitabständen danach wird von den Versuchstieren Serum gewonnen. Der Gehalt des Serums an CSF-Aktivität wird in einem Zellkulturassay anhand der Proliferationsraten von Knochenmarkszellen aus B₆D₂F₁ Mäusen gemessen [D. Metcalf, The hemopoietic colony stimulation factors, 1984, Elsevier; T. Mosmann, J. Immunol. Methods 65, 55-63 [1983]; L.M. Green et al., J. Immunol. Methods 70, 257-268 [1984]). Verbindungen der Formel I induzieren in unterschiedlich starkem Ausmaß CSFs in Mäusen, wobei auch zeitkinetische Unterschiede der CSF-Aktivitäten beobachtet werden, die bei therapeutischem Einsatz vorteilhaft sein können.

8. Induktion von Interleukin-1 (IL-1)

Der Nachweis, ob Substanzen Zellen zur IL-1-Produktion stimulieren können, wird primär in Zellkultureassays geführt. Zunächst werden adhärente Makrophagen von Mäusen gewonnen, sowohl residente als auch mit Thioglycolat "elicited macrophages". Diese werden in RPMI-Medium bei verschiedenen zu prüfenden Substanzkonzentrationen 48 Stunden inkubiert und die Zellüberstände gewonnen. Diese Überstände werden in Thymozytenkulturen von C₃H/HeJ Mäusen auf IL-1-Aktivität geprüft. Enthalten die Überstände von Makrophagen produziertes IL-1, werden die Thymozyten während einer Inkubation von 72 Stunden zur Proliferation angeregt, die durch Einbau von 3H-Thymidin im Szintillationszähler gemessen wird (J. Gery et. al., J. Exp. Med. 136, 128-142 [1972]); J. Oppenheim et. al., Cellular Immunol. 50, 71-81 [1980]). Substanzen der Formel I besitzen in unterschiedlichem Maße (konzentrationsbezogen 0,1-50 µg/ml) die Fähigkeit, IL-1-Produktion in Makrophagen zu induzieren.

9. Induktion einer LPS-(Endotoxin)-Toleranz (Letalitätstoleranz)

Durch ein- bis dreimalige tägliche parenterale Verabreichung von LPS an Mäuse kann eine sogenannte Toleranz erzeugt werden, die die Tiere gegen die nach Galactosamin-Gabe letalen Effekte des LPS schützt (s. auch Endotoxinschock-Induktion in der Maus).

Mit den Verbindungen der Formel I konnte bereits nach einmaliger i. p. Verabreichung von je 0,25 mg/Maus eine derartige Toleranz ausgelöst werden. Vorbehandelte (tolerante) Mäuse wurden zu verschiedenen Zeiten nach letzter Behandlung (1 Tag bis 3 Wochen) einem LPS-Challenge in einer Dosis von 0,01 µg LPS+8 mg Galactosamin/Maus i. p. unterworfen. Es überlebten insbesondere nach dreimaliger Verabreichung ein höherer Prozentsatz der Tiere diese LPS-Belastung im Vergleich zu der unvorbehandelten Challenge-Kontrolle.

Weiters besitzen die Verbindungen der Formel I auch antiinflammatorische Wirkung, insbesondere bei nichtspezifischen Entzündungen, bei immunologisch induzierten Entzündungen, bei hypersensitiv induzierten Entzündungen und bei allergischen Reaktionen. Diese Wirkung konnte durch verschiedene Testmethoden nachgewiesen werden, beispielsweise durch Untersuchungen der Beeinflussung der Prostaglandinsynthese in vitro und in vivo. in vitro wurde die Hemmung der LPS- und Zymosan-induzierten PGE₂- und PGF_{1 α} -Freisetzung untersucht. Thioglycolat-stimulierte Peritoneal- MΦ aus der NMRI-Maus wurden 24 Stunden mit LPS bzw. Versuchssubstanz inkubiert. Nach Wechsel des Mediums und dreifachem Waschen der Zellen wurden sie 2 Stunden mit LPS bzw. 1 Stunde mit Zymosan stimuliert. In diesen Überständen wurden PGE₂ und PGF_{1 α} nachgewiesen. Dabei zeigte sich eine Inhibierung sowohl der durch LPS als auch der durch Zymosan stimulierten PGE₂-Produktion der Zellen. In vivo wurde die Hemmung der LPS-induzierten PGE₂-Freisetzung von Maus-MΦ nach Vorbehandlung mit Prüfsubstanzen getestet. Jeweils 3 NMRI-Mäuse wurden am Tag 1, 2 und 3 mit LPS bzw. Prüfsubstanz i. p. behandelt. Am Tag 4 erhielten diese Tiere und eine Kontrollgruppe 1,5 ml Thioglycolat i. p., am Tag 7 wurden Peritoneal- MΦ gewonnen und mit LPS stimuliert. Es wurde eine deutliche Reduktion der PGE₂-Freisetzung im Vergleich zur Kontrolle gefunden.

In einem weiteren Test wird die Beeinflussung der "procoagulant activity" (PCA) untersucht. Nach Stimulation mit LPS synthetisieren humane Endothelzellen PCA, gemessen als Verkürzung der Gerinnungszeit von Plasma. Ebenso verkürzen MΦ nach LPS-Behandlung sowie Peritonealleukozyten (gewonnen von Kaninchen) nach Auslösen der generellen Shwartzman- Reaktion die Gerinnungszeit von recalzifiziertem Plasma. Zur Untersuchung der Beeinflussung der durch LPS generierten PCA in vitro wurden Thioglycolat-stimulierte Peritoneal-MΦ von B₆D₂F₁-Mäusen in einem Versuchsdesign a über Nacht mit LPS allein bzw. mit LPS und Prüfsubstanz in DMEM Medium ohne fötales Kälberserum (FCS) behandelt. Im Versuchsdesign b wurden ebensolche Maus-MΦ 24 Stunden lang mit LPS bzw. Prüfsubstanz behandelt und nach Mediumwechsel über Nacht mit LPS stimuliert. Die Gerinnungszeit von recalzifiziertem humanen Kontrollplasma nach Zugabe der mehrfach eingefrorenen und ultrabeschallten MΦ-Suspension wurde mittels Häkchenmethode gemessen. Zugabe von Prüfsubstanz reduziert die durch LPS ausgelöste PCA unter jene des Kontrollwertes (Verlängerung der Gerinnungszeit). Ebenso führt Vorbehandlung mit Prüfsubstanz zu einer Reduzierung der PCA.

In vivo konnte die Beeinflussung der LPS-induzierten PCA von Maus- Peritonealleukozyten nach Vorbehandlung der Tiere mit Prüfsubstanz folgendermaßen gezeigt werden: B₆D₂F₁-Mäuse wurden am Tag 1, 2 und 3 mit LPS bzw. Prüfsubstanz, intraperitoneal verabreicht, behandelt. Zusätzlich erhielten alle Tiere am Tag 3 1,5 ml Thioglycolat i. p. Am Tag 6 wurden Peritoneal-MΦ gewonnen, die Probe jedes Tieres auf 1×10⁶/ml Zellen eingestellt und 24 Stunden lang mit LPS in DMEM Medium ohne FCS stimuliert. Die PCA dieser Zellen wurde, wie oben beschrieben, bestimmt. Vorbehandlung mit LPS bzw. mit Prüfsubstanz erbringt eine deutlich verringerte PCA. Ein ähnlicher Befund konnte bei Vorversuchen mit Kaninchen erhoben werden. Auch die PCA von peritonealen Kaninchenleukozyten nach Auslösen der generellen Shwartzman-Reaktion konnte durch Vorbehandlung mit LPS bzw. mit Prüfsubstanz verringert werden.

Bei der Inhibierung der lokalen Shartzman-Reaktion wurden je 3 Chinchil 1a Kaninchen am Tag 1, 2 und 3 mit LPS bzw. Prüfsubstanz, jeweils i. v. bzw. i. p., vorbehandelt. Am Tag 6 erfolgte die intradermale Verabreichung von je 40, 20 10, 5, 2,5 und 1,25 µg LPS pro Hautstelle. Am Tag 7 wurde die Reaktion mit 2 µg LPS/kg i. v. ausgelöst. Die Bewertung der Reaktion erfolgte semiquantitativ durch Beurteilung der Hautnekrosen. Es zeigte sich eine fast vollständige Unterdrückung der Shwartzman-Reaktion durch LPS-Vorbehandlung bzw. durch Vorbehandlung mit Prüfsubstanz.

Weiters besitzen die Verbindungen der Formel I auch Wirkung gegen Tumore, wie in den folgenden Modellversuchen nachgewiesen werden konnte:

1. Untersuchung der Induktion von Tumor-Necrosis Faktor (TNF)

Zur Stimulierung von Mäuse-Knochenmarksmakrophagen werden Knochenmarkszellen von BDF₁ Mäusen (ca. 10-13 Tage alt, mit CSF induziert) auf 1×10⁶ Zellen/ml in Medium [RPMI 1640 + 1% Pen/Strep (5000 U/ml) + 1% Glutamin] verdünnt und in flachen Mikrotiterplatten mit den Substanzlösungen im Konzentrationsbereich 100 µg bis 0,1 µg/ml Endkonzentration (1 : 10 Verdünnungsstufen) 4 Stufen bei 37°C/5% CO₂ inkubiert. Nach Filtration durch 0,45 µm Filter werden die Überstände bis zur Durchführung des TNF-Tests bei -70°C eingefroren.

In Mikrotiterplatten werden L 929 Zellen zu 3×10⁴ Zellen/Näpfchen/ 100 µl über Nacht vorkultiviert (37°C/5% CO₂), mit 100 µl der jeweiligen Probe versetzt und in Serie in 1 : 2 Stufen weiterverdünnt. Nach Zugabe von 100 µl Actinomycin D (8 µg/ml Medium) in jedes Näpfchen wird weitere 18 Stunden bei 37°C/5% CO₂ inkubiert. Nach Entfernen der Überstände wird der verbliebene Zellrasen mit Giemsa-Lösung gefärbt und die Absorption bei 620 nm am Titertek Multiskan Autoreader (Flow) gemessen. Eine Einheit TNF ist definiert als jene Aktivität, welche eine 50%ige Lyse der L 929 Targetzellen hervorruft.

2. B16F1 Melanom Test

B16F1 Melanom Zellen werden 5 Tage in vitro gezüchtet. Einen Tag vor dem Versuch werden die Zellen durch Aufbrechen der Monolayer in einzelne Zellen, unter Verwendung von EDTA Trypsin, und Rückführung der Gesamtmenge in die gleiche Flasche mit neuem Medium synchronisiert. Die Zellen werden gezählt und auf 10⁶/ml Medium eingestellt. 0,1 ml Zellsuspension (10⁵ Zellen) werden intravenös in die Schwanzvene injiziert. 21 Tage danach werden die Mäuse getötet und die Anzahl der Tumore in der Lunge bestimmt. Für diesen Test werden B₆D₂F₁ Mäuse eingesetzt. Die Prüfsubstanz wird gelöst und an den Tagen -6, -4 und -1 intraperitoneal injiziert. Es hat sich gezeigt, daß die erfindungsgemäßen Substanzen der Formel I immunoprophylaktische Wirkung besitzen, die Anzahl der B16F1 Melanommetastasen in der Lunge wurde verringert. Zur Überprüfung der therapeutischen Aktivität wurden die Mäuse am 3., 6., 8., 10., 13. und 15. Tag nach der Tumorzelleninokulation behandelt. Auch hier zeigte sich eine deutliche Reduktion der Metastasenbildung.

Die Verbindungen der Formel I können daher als Modulatoren der unspezifischen antimikrobiellen Resistenz eingesetzt werden, zur systemischen Steigerung der Immunantwort und zur Steigerung der unspezifischen Immunität. Verbindungen der Formel I sind somit indiziert, z. B. für die Behandlung oder supportive Behandlung (d. h. zusammen mit anderen spezifischen oder supportiven Therapieformen) von Zuständen bei herabgesetzter Immunantwort, insbesondere bei herabgesetzter humoraler Immunantwort und/oder herabgesetzter Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ und zur Behandlung von Zuständen, bei welchen in sonstiger Weise eine Modulation der Immunantwort wünschenswert ist. Im speziellen sind Verbindungen der Formel I indiziert zur Behandlung oder supportiven Behandlung von Krankheitszuständen aufgrund idiopathischer Immunndefizienzen oder Immundefizienzen von der Art, wie sie bei geriatrischen Patienten auftreten, oder bei Patienten mit schweren Verbrennungen oder generalisierten Infektionen. Die Verbindungen der Formel I sind gleichfalls indiziert für die Behandlung oder supportive Behandlung viraler Erkrankungen (wie disseminierten Herpes, progressive Pockenerkrankungen und disseminierte Varizellenerkrankungen) sowie auch von Morbus Hodgkin und anderen malignen Tumoren. Außerdem eignen sich die Verbindungen der Formel I für die Prophylaxe des Endotoxinschocks, z. B. bei Unfällen, Verbrennungen und chirurgischen Eingriffen, sowie als antiinflammatorische Mittel.

Für die genannten Anwendungen ist die indizierte parenterale Dosis zwischen ca. 0,1 mg und ca. 70 mg, einmal verabreicht zur Erzielung eines Adjuvanseffektes, z. B. bei supportiver Behandlung, oder täglich, wobei im letzeren Fall die Dosis auf 2 bis 4 Verabreichungen pro Tag aufgeteilt oder in Retardform gegeben wird. Indizierte Dosiseinheiten für die Verabreichung enthalten daher zwischen ca. 0,025 und ca. 35 mg Substanz der Formel I, wenn tägliche Verabreichung, oder bei zu 70 mg Substanz der Formel I, wenn eine einzelne, adjuvante Behandlung gewünscht wird.

Aufgrund ihrer immunmodulierenden Aktivität eignen sich Verbindungen der Formel I auch als Adjuvantien für Vakzine. Für diese Verwendungsart ist eine indizierte Dosis zwischen 0,5 und 100 mg, vorzugsweise ca. 70 mg, verabreicht am Tage der Impfung mit einer möglichen Wiederholung bei gleicher Dosis 2 bis 4 Wochen später.

Pharmazeutische Bereitungen, enthaltend die Verbindungen der Formel I, können gemäß galenischen Standardverfahren, z. B. durch Vermischen mit konventionellen, pharmazeutisch unbedenklichen Verdünnungsmitteln oder Trägersubstanzen hergestellt werden. Solche Bereitungen können beispielsweise in Form von injizierbaren Lösungen hergestellt werden und bilden ebenfalls einen Teil der Erfindung.

Die Erfindung betrifft daher auch eine Methode zur Bekämpfung von Erkrankungen und Infektionen, wie sie oben beschreiben sind, durch Verabreichung einer wirksamen Menge einer Verbindung der Formel I oder eines chemotherapeutisch verträglichen Salzes davon an den Kranken, sowie die Verbindungen der Formel I zur Verwendung als chemotherapeutische Mittel, insbesondere als Immunmodulatoren, als antivirale Mittel und als antiinflammatorische Mittel.

Im nachfolgenden Beispiel, das die Erfindung näher erläutert, ihren Umfang jedoch in keiner Weise einschränken soll, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.

Beispiel 2-Desoxy-2-[3-(R)-hydroxytetradecanamido]-3,4-di-O-[3-(R)-hydroxytet-radecanoyl]- α-D-glucopyranose-1-phosphat a) 2-[3-(R)-Benzyloxytetradecanamido]-3,4-di-O-[3-(R)-benzyloxytetradec-anoyl]- 2-desoxy-6-triphenylmethoxy-α-D-glucopyranose-1-dibenzylphosphat

Zu einer auf 0° gekühlten Lösung von 1,1 g 2-[3-(R)-Benzyloxytetradecanamido]- 2-desoxy-6-triphenylmethoxy-α-D-glucopyranose-1-dibenzylphosphat, 1 g Benzyloxytetradecansäure und 40 mg 4-Dimethylaminopyridin in 20 ml trockenem Dichlormethan werden 6,9 mg Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben. Nach 30 Minuten wird das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur erwärmt, nach 4 Stunden wird filtriert und eingedampft. Der Rückstand wird chromatographiert (Toluol/Essigester = 4/1).
Rf = 0,75 (Toluol/Essigester = 4/1).

b) 2-Desoxy-2-[3-(R)-hydroxytetradecanamido]-3,4-di-O-[3-(R)-hydroxytet-radecanoyl]- α-D-glucopyranose-1-phosphat

500 mg 2-[3-(R)-Benzyloxytetradecanamido]-3,4-di-O-[3-(R)-benzyloxytetradec-anoyl]- 2-desoxy-6-triphenylmethoxy-α-D-glucopyranose-1-dibenzylphosphat werden in 150 ml Tetrahydrofuran/Wasser (4/1) gelöst und mit 500 mg Palladium auf Aktivkohle 12 Stunden bei Normaldruck hydriert. Danach wird filtriert und nochmals mit 500 mg Palladium auf Aktivkohle hydriert, dieser Vorgang wird noch zweimal wiederholt (48 Stunden Reaktionszeit). Der Katalysator wird abfiltriert, das Tetrahydrofuran abgedampft, die wäßrige Suspension mit 10 ml Wasser verdünnt und lyophylisiert.
Rf = 0,4 (Chloroform/Methanol/Wasser/Essigsäure=80/25/5/5).
[α] = +22° (c=0,1 in Chloroform/Methanol = 3/1).

Das als Ausgangsprodukt benötigte 2-[3-(R)-Benzyloxytetradecanamido]-2- desoxy-6-triphenylmethoxy-α-D-glucopyranose-1-dibenzylphosphat kann folgendermaßen erhalten werden:

Zu einer auf -60° gekühlten Lösung von 2 g 2-[3-(R)-Benzyloxytetradecanamido]- 2-desoxy-6-triphenylmethoxy-α-D-glucopyranose in 270 ml absolutem Tetrahydrofuran werden 2,55 ml einer 1,6molaren Lösung von Butyllithium in Hexan zugetropft. Nach 5 Minuten wird bei dieser Temperatur eine Lösung von 1,21 g Dibenzylphosphorochloridat in 4 ml Benzol zugetropft. Es wird noch 20 Minuten bei -60° gerührt, mit Essigsäure auf pH 7 eingestellt und bis zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird sofort chromatographiert (Toluol/Essigester = 1/1).
Rf = 0,47 (Toluol/Essigester = 1/1).

Claims (2)

1. Neue Saccharide der Formel worin R₁ und R₂ gleich oder verschieden sind und jeweils für eine gegebenenfalls substituierte Acylgruppe stehen, in freier Form oder in Form ihrer Säureadditionssalze.

2. Verfahren zur Herstellung neuer Saccharide der Formel worin R₁ und R₂ gleich oder verschieden sind und jeweils für eine gegebenenfalls substituierte Acylgruppe stehen, in freier Form oder in Form ihrer Säureadditionssalze, dadurch gekennzeichnet, daß man Verbindungen der Formel worin R und R′ für Schutzgruppen stehen und R₁′ die gleiche Bedeutung wie R₁ besitzt, wobei jedoch gegebenenfalls vorhandene OH-Gruppen geschützt sind, acyliert und anschließend die vorhandenen Schutzgruppen abspaltet.