DE3789905T2

DE3789905T2 - Verfahren zum Nachweis von elektrophoretisch getrennten Oligonukleotiden.

Info

Publication number: DE3789905T2
Application number: DE3789905T
Authority: DE
Inventors: Charles R Connell; Steven Fung; Cheryl Heiner; Steven M Menchen; Sam Lee Woo
Original assignee: Applied Biosystems Inc
Current assignee: Applied Biosystems Inc
Priority date: 1986-02-07
Filing date: 1987-02-04
Publication date: 1995-01-19
Anticipated expiration: 2007-02-05
Also published as: JPS62249049A; EP0233053A3; EP0233053A2; US4855225A; EP0233053B1; DE3789905D1; JP2678597B2

Description

Die Erfindung bezieht sich allgemein auf molekulare Separations- und Trennverfahren und insbesondere auf Verfahren zum Identifizieren von Oligonukleotiden, die durch Gel- Elektrophorese separiert worden sind.
Viele Verfahren in der Molekularbiologie erfordern, daß heterogene Mischungen von DNA oder RNA elektrophoretisch in homogene Komponenten entsprechend der Masse, der Ladung, der Konformation, des Isoelektrischen Punktes oder dergl. separiert werden. Die homogenen Komponenten werden dann durch Densitometrie oder über radioaktives, fluoreszierendes oder chromogenes Markieren detektiert. Jedes derartige Verfahren zur Identifikation hat seine eigenen Vor- und Nachteile, beispielsweise wird auf Gould and Metthews, Separation Methods for Nucleic Acids and Oligonucleotides (North-Holland Publishing Company, Amsterdam, 1976) Seiten 337-344 verwiesen. Beispielsweise basierten bis in die jüngste Zeit DNA- Sequenzierverfahren ausschließlich auf radioaktiven Markierungen zur Unterscheidung von durch Elektrophorese separierten Oligonukleotiden. Radioaktive Marken sind in höchstem Maße sensibel und können leicht in die interessierenden Moleküle eingebracht werden. Jedoch bestehen verschiedene inhärente Nachteile gegenüber ihrer Anwendung: In der Autoradiographie ist die Auflösung durch die omnidirektionale Natur der Spuren der Zersetzungspartikel, die Dicke und den Abstand der autoradiographischen Emulsion und die kumulierende Natur des in der Emulsion aufgezeichneten Signals begrenzt. Radioaktive Markierungen stellen auch im Labor ein Gesundheitsrisiko dar, was dazu führt, daß die Marken einer speziellen Behandlung und einer entsprechenden Entsorgung bedürfen. Schließlich erfordern radioaktive Markierungen lange Belichtungs- und Zählzeiten für eine hinreichende Signal-Störung-Auflösung. Dieser letztgenannte Nachteil ist insbesondere dann akut, wenn Markierungen im Zusammenhang mit automatischen Verfahren eingesetzt werden, beispielsweise einem automatischen DNA-Sequenzierverfahren, bei welchem Bänder unterschiedlicher Arten von markierten Nukleotiden rasch identifiziert werden müssen, wenn sie eine einzige Elektrophoresespur durchlaufen. Darüber hinaus sind nicht einmal nukleotidspezifische radioaktive Marken für die Identifizierungspraxis vorhanden, und selbst wenn dies der Fall wäre, sind gegenwärtige Detektionsverfahren, wie z. B. die Autoradiographie oder der Scintillationszähler zu zeitaufwendig. Als Folge hiervon sind Fluoreszenzmarkierungen für die Verwendung bei DNA-Sequenzierverfahren gesucht.
Fluoreszierende Marken können sofort nach der Anwendung festgestellt werden; sie können in konventioneller Weise gehandhabt werden und sie ermöglichen die genaue Lokalisierung und Quantifizierung der markierten Moleküle.
Verschiedene Faktoren engen die Auswahl von fluoreszierenden Marken für eine oligomere Serie ein, die der Separation durch Gel-Elektrophorese ausgesetzt worden ist, beispielsweise einer oligomeren Serie von Nukleotiden, deren Elemente lediglich in einer Basiszahl differieren. Als erstes dürfen die Marken die elektrophoretische Mobilität nicht nachteilig beeinflussen, so daß außergewöhnliche Bandaufweitungen eintreten. Auch können die relativen Effekte der Marken auf die elektrophoretische Mobilität derart sein, daß eine oder mehrere Bandpositionen vertauscht werden oder überlappen, so daß der Zusammenhang zwischen der Bandreihenfolge und der natürlichen Ordnung der oligomeren Serie zerstört wird. Unglücklicherweise gibt es keinen zuverlässigen Weg, um mit Gewißheit das elektrophoretische Verhalten eines Oligomers mit einer willkürlich gewählten Markierung vorherzusagen, beispielsweise eine organischen Farbe. Zu Verfahren zur elektrophoretischen Separation gelangt man für gewöhnlich auf empirischem Wege, jedoch sind zwei Hauptfaktoren, die die elektrophoretische Mobilität festlegen, die Ladung und das Molekulargewicht. Andere bedeutsame Faktoren umfassen die Konformation der Oligomere und die Gel-Polymerdichte, vergl. Gould and Matthews, Separation Methods for Nucleic Acids and Oligonucleotides (North-Holland Publishing Company, Amsterdam, 1976), Seite 313)
Zweitens, dort, wo verschiedene unterschiedliche Marken erforderlich sind, kann eine Auswahl der Farben keine signifikante Überlappung der Emissionsbänder haben. Jedoch ist es, unter der Annahme, daß die Emissionsband-Halbbreite für organische fluoreszierende Farben üblicherweise um 40-80 nm und daß die Breite des sichtbaren Spektrums lediglich um 350-400 nm liegt, außergewöhnlich schwierig, eine zweckmäßige Auswahl der fluoreszierenden Farben ohne signifikante Überlappungen zu finden, und zwar immer dann, wenn drei oder mehr unterschiedliche Fluoreszenzmarken erforderlich sind. Wenn verschiedene Fluoreszenzfarben verwenden werden, wird darüber hinaus die Anregung schwierig, weil die Absorptionsbanden der Farben oft weit voneinander entfernt sind. Die wirksamste Erregung tritt dann ein, wenn jede Farbe mit derjenigen Wellenlänge belichtet wird, die dem Maximum ihrer Absorptionsbande entspricht. Wenn verschieden Farben zusammen verwendet werden, ist man oft gezwungen, einen Ausgleich zwischen der Empfindlichkeit des Detektionssystems und den erhöhten Kosten zu treffen, die durch separate Erregungsquellen für jede Farbe entstehen. Schließlich müssen die Fluoreszenzmarken kompatibel mit der verwendeten chemikalischen Umwelt sein, die eingesetzt wird, um Moleküle zu erzeugen oder zu handhaben, welche markiert worden sind. Bei der enzymatischen Sequenzierung von DNA beispielsweise können die Fluoreszenzfarben, die verwendet werden um sog. Primer zu markieren, nicht mit der DNA-Polymerase-Aktivität interferieren.
Die japanische Patentanmeldung Nr. 59 96454 beschreibt das Markieren einer Nukleinsäureprobe durch zwei bis vier unterschiedliche Arten von Fluoreszenzfarben, um eine Diskrimination zwischen den vier Arten der Reaktionsprodukte zu erlauben.
Schmidt et al in "Synthesis of Oligonucleotides Containing an Aliphatic Amino Group at the 5' Terminus: Synthesis of Fluorscent DNA Primers for use in DNA Sequence Analysis", Nucleic Acids Research, Vol. 13, Seiten 2399-2412 (1985), beschreiben einen Satz von vier Fluoreszenzfarben zur Verwendung in der enzymatischen DNA-Sequenzanalyse zur Markierung von Oliginukleotiden, die durch Elektrophorese separiert worden sind. Jede Farbe aus dem Satz wird verwendet, um ein Elektrophorese-Gel-Band der Oligonukleotide zu identifizieren, die das gleich 3' -Endnukleotid haben.
Gemäß dem Verfahren der Erfindung werden vier Sätze von Fluoreszenzfarben verwendet, um Oligonukleotide immer dann zu detektieren, wenn Mischungen von bis zu vier Klassen von Oligonukleotiden elektrophoretisch auf einem Gel separariert werden. Mitglieder von jedem der folgenden Sätze von Farben haben sich in bezug auf Mitglieder jedes anderen Satzes unter den Gel-Elektrophoresebedingungen, die nachfolgend beschrieben werden, spektralmäßig als auflösbar erwiesen.
Satz I besteht aus Fluoresceinderivaten, die durch die Formel I definiert sind:
in welcher A eine Verbindungsfunktionalität an der 5. oder 6. Kohlenstoffposition ist, die verwendet werden kann, um die Fluoresceinmoietät der Farbe mit einer komplementären Funktionalität an einem Oligonukleotid zu verbinden, und B eine saure anionische Gruppe, vorzugsweise die Carboxyl- oder Sulfongruppe und am meisten bevorzugt Carboxyl.
Die folgende Tabelle zeigt zur Erläuterung Verbindungsfunktionalitäten, die durch A dargestellt sind, ihre komplementären Funktionalitäten und die resultierenden Verbindungsgruppen, die zur Verwendung im Zusammenhang mit der Erfindung zweckmäßig sind.
Verbindungsfunktionalität Komplementäre Funktionalität Verbindungsgruppe
Die Verbindungsfunktionalität ist vorzugsweise Isothiocyanat, Sulfonylchlorid, 4,6-Dichlortriazinylamin oder Succinimidylcabrobyxlat, und zwar immer dann, wenn die komplementäre Funktionalität die Amingruppe ist. Vorzugsweise ist die Verbindungsfunktionalität Maleimid oder Jodoacetamid, immer wenn die komplementäre Funktionalität die Sulfhydrylgruppe ist.
Satz II besteht aus Derivaten von Dichlordimethoxyfluorescein, definiert durch die Formel II:
wobei A und B wie oben beschrieben definiert worden sind. Satz III besteht aus Tetramethylrhodamin, welches mit einer Verbindungsfunktionalität an der 5. oder 6. Kohlenstoffposition derivatisiert ist, und zwar definiert durch die Formel III:
wobei A und B wie oben beschrieben definiert worden sind. Satz IV besteht aus Rhodamin-X-Derivaten, die durch die Formel IV definiert worden sind:
wobei A' eine Verbindungsfunktionalität ist, die durch A (wie oben definiert) oder eine saure anionische Gruppe repräsentiert ist, die durch B (wie oben definiert) dargestellt worden ist, und B' eine saure anionische Gruppe ist, und zwar immer wenn A' eine Verbindungsfunktionalität ist, und B' ist eine Verbindungsfunktionalität, immer wenn A' eine saure anionische Gruppe darstellt. Noch mehr wird bevorzugt, daß A' eine Sulfonsäure oder eine Verbindungsfunktionalität ist, so wie sie durch A repräsentiert ist, und B' ist eine Carboxyl- oder Sulfongruppe, und zwar immer wenn A' eine Verbindungsfunktionalität ist, und B' ist eine Verbindungsfunktionalität immer dann, wenn A' Sulfonsäure ist. Gemäß der Erfindung werden vor der Trennung, Elemente innerhalb jeder Klasse der Oligonukleotide mit einer Farbmarke markiert, die aus dem gleichen Satz ausgewählt worden ist, um markierte Oligoinukleotid-Konjugate zu bilden, beispielsweise derart, daß die Mitglieder von unterschiedlichen Klassen mit Farben aus unterschiedlichen Sätzen markiert worden sind. Dies bedeutet, daß jede Klasse einem unterschiedlichen Satz I, II, III oder IV entspricht, so wie er oben definiert worden ist (wobei auch hierin auf den ersten bis vierten Satz jeweils Bezug genommen wird). Nach dem Markieren werden die Mitglieder aller Klassen kombiniert, um eine Mischung zu bilden. Die Mischung wird dann der Gel-Elektrophorese ausgesetzt, um die Oligenucleotide hinsichtlich der Masse, der Ladung, der Konformation und/oder anderer Eigenschaften zu trennen, welche die Grundlage für ein- oder zweidimensionale elektrophoretische Separationen bilden. Oligomere Reihen in bezug auf derartige Eigenschaften innerhalb der und zwischen den Klassen werden durch relative Positionen von entsprechend separierten, beispielsweise Bändern, der Oligonukleotide auf dem Gel bestimmt. Schließlich werden die an den entsprechend separierten Oligonukleotiden befestigten Farben fluoreszierend gemacht und die Identität ihrer Klasse wird durch das Fluoreszenz- oder Absorptionsspektrum der anhängenden Farbmarke bestimmt.
Klassen von Oligonukleotiden können in einer Vielzahl von Zusammenhängen auftreten. Beispielsweise können sie als Produkte von Restriktionsenzymauflösungen auftreten. Vorzugsweise werden die Klassen, die gemäß der Erfindung identifiziert worden sind, in Ausdrücken von Endnukleotiden von Nukleinsäuren definiert, so daß eine Korrespondenz zwischen den vier möglichen Endbasen und den vier Sätzen der spektralauflösbaren Farbmarken besteht. Stärker bevorzugt treten die Klassen im Zusammenhang mit dem chemischen oder enzymatischen Sequenzieren von Nukleinsäuren auf, und am meisten bevorzugt treten die Klassen im Zusammenhang mit dem enzymatischen Sequenzierung von DNA auf. Notwendige Bedingung für eine Klasse, damit sie gemäß der Erfindung identifizierbar ist, sind (1), daß die Oligonukleotide der Klasse durch Gel-Elektrophorese separierbar sind, (2), daß sie dafür geeignet sind, daß sie durch Farbmarken gemäß der Erfindung markiert werden können, und (3), daß die Klassen gegenseitig exklusiv sind, insofern, als ein Oligonukleotid lediglich ein Mitglied einer einzigen Klasse sein kann.
So wie der Begriff hier verwendet ist, bedeutet "spektral auflösbar", daß die Fluoreszenzemissionsbande der Farbmarkierungen innerhalb eines Satzes ausreichend unterschiedlich zueinander sind, d. h. daß im wesentlichen keine Überlappung mit denjenigen Markierungen irgendeines anderen Satzes auftritt , so daß die Klassen der Oligonukleotide, an welche die Farbmarkierungen angebracht werden, durch Standardphotodetektionssysteme unterschieden werden können.
Oligonukleotide, so wie sie hier verwendet werden, bedeuten eine einzel- oder doppelsträngige Kette DNA oder RNA in der Größenordnung von ungefähr 10-1000 Basen in der Länge (falls es um einen Einzelstrang geht) oder in der Größenordnung von 10- 1000 Basispaaren der Länge, falls ein Doppelstrang vorliegt.
Der Vorteil dieser Sätze von Marken beruht auf der Eigenart ihrer spektralen Eigenschaften in der Gel-Umgebung. Insbesondere bewirken die Gel-Umgebungen, die für elektrophoretische Separationen zweckmäßig sind, eine Verschiebung von ungefähr 10- 15 nm in Richtung auf die rote Farbe in den Absorptions- und Emissionsbändern der Farben der Sätze I und II. Das Verschieben der Absorptionsbande erhöht den Wirkungsgrad bemerkenswert, mit welchem die Marken mit 514 nm-Licht erregt werden können, eine Hauptemissionslinie des Argonionenlasers, der wirksamsten Erregungsquelle. Die Emissionsbanden der Marken aus dem Satz I werden auch von der 514-nm-Emissionslinie weg verschoben, wodurch der Anteil an gestreutem Licht verringert wird, welches mit dem Fluoreszenzsignal von diesen Marken immer dann aufgenommen wird, wenn Marken mit 514 nm-Licht belichtet werden.
Das Verfahren gemäß der Erfindung findet direkte Anwendung auf chemische und enzymatische DNA-Sequenzierverfahren, um durch Gel-Elektrophorese separierte Oligonukleotide fluoreszenzmäßig zu markieren.
Die Erfindung umfaßt Verfahren zum Detektieren von bis zu vier vordefinierten Klassen von Oligonukleotiden, die hinsichtlich der Masse, der Ladung, der Konformation oder einer anderen Eigenschaft auf dem gleichen Gel elektrophoretisch separiert worden sind. Das Verfahren gemäß der Erfindung wird durch Markieren von Oligonukleotiden jeder Klasse mit Marken durchgeführt, die aus einem bestimmten Satz von vier Sätzen von Marken ausgewählt wurden, die oben definiert worden sind. Ein derartiges Markieren stellt sicher, daß jede Klasse eine unterschiedliche und spektralmäßig auflösbare Fluoreszenzmarke hat.
Satz I besteht aus mono-derivatisiertem Fluorescein mit einer Verbindungsfunktionalität entweder an dem 5. oder 6. Kohlenstoffatom (so wie diese durch das Color-Index- Numerierungssystem festgelegt ist). Erläuterungsbeispiele für die Mitglieder des Satzes I umfassen: Fluorescein-5- isothiocyanat, Fluorescein-6 isothiocyanat, (Auf die Formen -5- und -6- wird gemeinsam als FITC Bezug genommen), Fluorescein-5-succinimidylcarboxylat, Fluorescein-6- succinimidylcarboxylat, Fluorescein-5-iodoacetamid, Fluorescein- 6-iodoacetamid, Fluorescein-5-maleimid und Fluorescein-6- maleimid. Diese Beispiele für Mitglieder des Satzes I sind im Handel erhältlich, beispielsweise von der Firma Molecular Probes, Inc, (Junction City, OR), oder sie können unter Einsatz von Standardverfahren synthetisiert werden.
Satz II umfaßt 2', 7'-Dimethoxy-4', 5'-dichlorofluorescein, monoderivatisiert mit einer Verbindungsfunktionalität an dem 5. oder 6. Kohlenstoffatom (Die Kohlenstoffatome sind in Übereinstimmung mit dem Color Index-Numerierugssystem identifiziert worden). Satz II-Elemente können durch Standardmodifikationen von 2, 7-Dimethoxy 4', 5 '-dichlor-9-(2', 4'-dicarboxyphenyl)-6-hydroxy-3H-xanthen-3-1 und 2,7-Dimethoxy- 4,5-diochlor-9(2',5'-dicarboxyphenyl)-6-hydroxy-3H-xanthen-3-1 erhalten werden (IUPAC-Notierung), wie dies in dem U.S. Patent 4,318,846 beschrieben ist. Die 4'- und 5'-Carboxy-Gruppen dieser Zusammensetzungen können mit N-Hydroxysuccinimid unter Verwendung von Dicylohexylcarbodiimid kondensiert werden, um eine amino-selektive Verbindungsfunktionalität zu bilden, so wie dies durch die Beispiele 6 und 8 des oben genannten Patentes erläutert worden ist (Spalten 28-29). Kasai et al, Anal. Chem., Band 47, Seiten 34-37 (1975), beschreiben das Basisverfahren für derartige Kondensationen. Satz II-Marken, die aus derartigen Reaktionen resultieren, sind 2,7-Dimethoxy 4', 5'- dichlorfluorescein-5-succinimidylcarboxylat (die -5- und -6- Formen werden mit dem Sammelbegriff DDFCS bezeichnet).
Satz III umfaßt Tetramethylrhodamin, welches mit einer Verbindungsfunktionalität an den 5. und 6. Kohlenstoffpostionen monoderivatisiert ist. Erläuterungsbeispiele der Mitglieder des Satzes III umfassen Tetramethylrhodamin-5-isothiocyanat Tetramethylrohodamin-6 isothiocyanat, (die -5- und -6- Formen werden insgesamt als TMRITC bezeichnet), Tetramethylrhodamin-5-iodoacetamid, Tetramethylrhodamin -6-iodoacetamid, Tetramethylrhodamin-5-succinimidylcarboxylat, Tetramethylrhodamin-6-succinimidyl-carboxalat, Tetramethylrhodamin-5-maleimid und Tetramethyl-rhodamin-6- maleimid. Diese als Beispiel genannten Marken sind im Handel erhältlich, beispielsweise von der Firma Molecular Probes, Inc., oder können unter Verwendung von Standardverfahren synthetisiert werden.
Satz IV umfaßt Rhodamin-X-Derivate, welche ein disubstituiertes Phenyl an dem Sauerstoffheterozyklus des Moleküls haben, wobei einer der Substituenten eine Verbindungsfunktionalität ist, die an dem 4. oder 5. Kohlenstoffatom des Phenyls befestigt ist (IUPAC-Numerierung) und die andere eine saure anionische Gruppe ist, die an dem 2'-Kohlenstoffatom befestigt ist. Erläuterungsbeispiele für Mitglieder des Satzes IV umfassen Texas Red (Handelsname der Firma Molecular Probes, Inc.), Rhodamin X-5-isothiocyanat, Rhodamin X-6-isothiocyanat, Rhodamin X-5-iodoacetamid, Rhodamin X-6-iodoacetamid, Rhodamin x-5- succinimidylcarboxylat, Rhodamin X-6-succinimidylcarboxilat, Rhodamin X-5-maleimid und Rhodamin X-6-maleimid. Die meisten dieser als Beispiel genannten Marken sind im Handel erhältlich, beispielsweise von der Firma Molecular Probes, Inc., oder können unter Verwendung von Standardverfahren synthetisiert werden. Beispielsweise kann Texas Red nach dem Verfahren synthetisiert werden, welches in Titus et al., "Texas Red, a Hydrophilic, Red-Emitting Fluorophore for Use with Fluorescein in Dual Parameter Flow Microfluorometric and Fluorescence Microscopic Studies," J. Immunological. Methods, Band 50, Seiten 193-204 (1982) beschrieben ist.
5- und 6- Carboxyderivate von Rhodamin X können unter Verwendung von Standardverfahren synthetisiert werden, beispielsweise wie diese im U.S. Patent 3,932, 415 beschrieben worden sind und auf welches hier Bezug genommen wird. Die 5- und 6- Carboxylgruppen können dann in Verbindungsfunktionalitäten durch Standardverfahren umgewandelt werden. Beispielsweise wird Rhodamin X-succinimidylcarboxylat durch Verfahren hergestellt, die in Muller et al, Experimental Cell Research, Band 100, Seiten 213-217 (1976) beschrieben worden sind. Entsprechend wird diese Literaturstelle durch das Zitat hier miteinbezogen.
Die Marken werden an Oligonukleotiden befestigt, wobei Standardverfahren eingesetzt werden, beispielsweise aus einem Überblick von Haugland, "Covalent Fluorescent-Probes", in Excited States of Biopolymers, Steiner, Hrsg. (Plenum Press, New York, 1983), Seiten 29-58, wobei diese Seiten hier durch Bezugnahme miteinbezogen werden. Es sind in jüngster Zeit verschiedene Verfahren entwickelt worden, um reaktive Funktionalitäten an Oligonukleotiden anzubringen, um es möglich zu machen, kovalente markierte Oligonukleotidkonjugate durch Kondensieren der reaktiven Funktionalität an dem Oligonukleotid mit einer Verbindungsfunktionalität der Marke zu bilden. Beispielsweise beschreiben Smith et al, wie oben zitiert, ein Verfahren zur Anbringung einer Aminogruppe an das 5'-Ende eines Oligonukleotids. Conolly und Rider, "Chemical Synthesis /of Oligonucleotides Containing a Free Sulphydryl Group and Subsequent Attachment of Thiol Specific Probes," Nucleic Acids Research, Band 13, Seiten 4485-4502 (1985) beschreiben ein Verfahren zum Anbringen von Sulfhydrylgruppen.
Vorzugsweise ist die reaktive oder komplementäre Funktionalität an den Oligonukleotiden eine Amingruppe. Bevorzugterweise wird das reaktive Amin mit Hilfe von demjenigen Befestigungsreagenzien befestigt, die in der ebenfalls anhängigen US-Anmeldung Ser. No. 769,179 erwähnt worden sind, die am 26. August 1985 angemeldet und als US-A- 4,757,141 am 12. Juli 1988 veröffentlicht worden ist und den Titel hat: "Aminoderivatized Phosphite and Phosphate Linking Agents, Phosphoramidite Precursors, and Useful Conjugates Thereof". Am meisten bevorzugt wird das reaktive Amin, welches durch Reagieren von 2-Methoxy-3-trifluoracetyl-1,3,2-oxazaphosphacylopentan mit den Oligonukleotiden befestigt wird. Standard- Elektrophoretik-Verfahren werden zum Separieren der markierten Nukleinsäuren eingesetzt, beispielsweise nach Gould and Matthews, wie vorgenannt; Rickwood and Hames, Hrsg., Gel Electrophoresis of Nucleic Acids: A Practical Approach, (IRL Press Limited, London, 1981); oder Osterman, Methods of Protein and Nucleic Acid Research, Band 1, (Springer-Verlag, Berlin, 1984). Vorzugsweise sind die separierten Nukleinsäuren Oligonukleotide.
Der am meisten bevorzugte Typ des Gels ist Polyacrylamid mit einer Konzentration (Gewicht zu Volumen) von zwischen ungefähr 2-20%. Eine Polyacrylamingelkonzentration zwischen ungefähr 4-8% wird stärker bevorzugt. Vorzugsweise weist das Gel ein den Strang separierendes oder denaturierendes Reagenz auf. In Einzelheiten beschriebene Verfahren zum Aufbau derartiger Gele werden durch Maniatis et al., "Fractionation of Low Molecular Weight DNA and RNA in Polyacrylamid Gels Containing 98% Formamide or 7 M Urea," in Methods in Enzymology, Band 65, Seiten 299-305 (1980); Maniatis et al., "Chain Length Determiniation of Small Double- and Single-Stranded DNA Molecules by Polyacrylamide Gel Electrophoresis," Biochemistry, Band 14, Seiten 3787-3794, (1975); und Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982), Seiten 179-185 gebracht. Die optimale Gel-Konzentration, der pH-Wert, die Temperatur, die Konzentration des denaturienden Reagenz und dergl., die für eine spezielle Separation eingesetzt werden, hängen von vielen Faktoren ab, unter Einschluß des Größenbereichs der zu separierenden Nukleinsäuren, ihrer Basenzusammensetzung, ob sie einzelsträngig oder doppelsträngig sind, und der Natur der Klassen, für welche Informationen durch Elektrophorese erhalten werden sollen. Demzufolge kann der Einsatz der Erfindung ein vorgeschaltetes Standardtestverfahren erforderlich machen, um die Bedingungen für spezielle Separationen zu optimieren. Beispielsweise sind gemäß der Erfindung Oligonukleotide mit Größen im Bereich zwischen ungefähr 20-300 Basen in dem nachfolgenden Gel separiert und detektiert worden: 5% Polyacrylamid, hergeleitet aus 25 Teilen zu einem Teil Acrylamid bis bis-Acrylamid, welches in einer Tris-Borat EDTA Pufferlösung bei einem pH-Wert von 8,4 (gemessen bei 250 C) mit 48% (Gew./Volumen) von Urea bzw. Harnstoff gebildet worden ist. Das Gel wurde bei 50ºC eingesetzt.
Die markierten Oligonukleotidkonjugate auf dem Gel werden durch Standardeinrichtungen, beispielsweise eine Quecksilberdampflampe mit hoher Intensität, durch Laser oder dergl. belichtet. Vorzugsweise werden die markierten Oligonukleotide auf dem Gel Laserlicht ausgesetzt, welches durch einen Argon- Ionen-Laser erzeugt worden ist, welcher insbesondere die 488- und 514-nm-Emissionslinien eines Argon-Ionen-Lasers hat. Verschiedene Argon-Ionen-Laser sind im Handel erhältlich, welche gleichzeitig auf diesen Frequenzlinien arbeiten, beispielsweise durch die Firma Cyonics, Ltd. (Sunnyvale, CA) mit dem Modell 2001.

I. Synthese eines bevorzugten Verbindungsreagenz: 2-Methoxy-3- trifluoracetyl-1,3,2-oxazaphosphacyclopentan

Chlor-N,N-diisopropylaminomethoxyphosphin (5,0 ml von der Firma Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI erhältlich) wurde tropfenweise bei 0ºC in eine gerührte Lösung von N-(2- hydroxyethyl)-2,2,2-trifluoracetamid (3,9 g) und Diisopropylethylamin (5,0 ml) in Dichloromethan (ungefähr 40 ml) unter Argon gegeben. (N-(2-hydroxethyl)-2,2,2-trifluoracetamid wurde nach dem folgenden Verfahren synthetisiert, welches von Lazarus und Benkovic in J. Am. Chem. Soc., Band 101,, Seiten 4300-4312 (1979) angegeben worden ist: Ethyltrifluoracetat (56,8 g, 0,4 mol) in 50 ml von Chloroform wurde tropfenweise in eine gerührte Lösung von 24,4 g (0,4 mol) von Ethanolamin in 50 ml Chloroform gegeben. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur 5 Stunden lang gerührt, unter Drehung verdampft, um das Lösungsmittel zu entfernen, und bei 115ºC (4,3 Torr) destilliert, um 58,5 g Öl zu ergeben, welches beim Abkratzen kristallisierte) . Nach dem Rühren bei Raumtemperatur über eine Zeitdauer von 5 Stunden wurde die Reaktionsmischung zweimal mit 0.2 M Kaliumkarbonatlösung und einmal mit Lauge gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4; und unter verringertem Druck konzentriert, um N-(2-(N',N'-diisopropylamino-methoxyphosphinyloxyethyl)-2,2,2- trifluoracetamid als eine farblose Flüssigkeit ( 7,77 g) zu ergeben.
¹H-MNR (CD&sub2;Cl&sub2;) : 3.6 (6H,m), 3.4 (3H, d, J=12), 1.2 (12H, d, J= 6.5)
³¹P-MNR (CD&sub2;Cl&sub2;), ¹H entkoppelt) : 149 (s)
N-(2-(N',N''-diisopropylaminoethoxyphosphinyloxy)-ethyl)-2,2,2- trifluoracetamid (7,7 g) wurde destilliert (58-59ºC bei 0,8 Torr), um mengenmäßig 2-methoxy-3-trifluoracetyl-1,3,2- oxazaphosphacyclopentan als eine farblose Flüssigkeit zu ergeben.
IR (Film) : 1705, 1420, 1230, 1200, 1160, 1020, 965 cm&supmin;¹
¹H-MNR (CD&sub2;Cl&sub2;) : 4,45 (2H, m), 3.65 (2H,m), 3.60 (3H, d, J=12)
³¹O-NMR (CD&sub2;Cl&sub2;, ¹H entkoppelt) : 132 (s), 125 (q, J=61)
MS: m/e 218 (M&spplus;), 197, 148, 136, 123, 120, 109, 92, 79, 70(100), 69, 62.

II. Reaktion von 2-methoxy-3-trifluoracetyl-1,3,2-oxazaphosphacyclopentan mit dem 5' Ende eines Oligonukleotids, um ein 5'-(geschütztes)-Aminooligonukleotid zu bilden

Das Anbringen von 2-methoxy-3-trifluoracetyl-1,3,2- Oxyazaphosphacyclopentan an dem 5'-Hydroxyl-Ende eines Oligonukleotids wurde mit einem auf Applied Biosystems 380A DNA Synthesizer (Applied Biosystems, Foster City, CA) oder einem vergleichbaren Instrument durchgeführt. Caruthers et al. U.S. Patent 4,458,066; Caruthers et al., U.S. Patent 4,415,732; und Caruthers et al, "New Methods for Synthesizing Deoxyoligonucleotides," in Genetic Engineering Band 4, Seiten 1-17 (Plenum Press, New York, 1982) bieten detaillierte Beschreibungen der Chemie, die durch den Applied Biosystems 380A DNA Synthesizer eingesetzt wird. 2-methoxy-3-trifluoracetyl- 1,3,2-oxazaphosphacyclopentan wurde als eine 0,2 M Acetonitril- Lösung in Verbindung mit 0,5 Mitrazol/Acetonitril-Lösung verwendet, um ein aktiviertes Reagenz in dem Synthese-Kreislauf zu bilden. Der normale Sythetisierzyklus wurde lediglich während der Zugabe des aktivierten Reagenz in der folgenden Art und Weise modifiziert. Das aktivierte Reagenz wurde zweimal mit einstündiger Wartezeit nach jeder Zugabe zugegeben. Die Kopplungsergebnisse lagen bei 95%. Die normale Deprotektion mit Thiophenol/Triethylamin und dann mit Amoniumhydroxid ergab ein 5'-Aminoethylphosphat-Oligonukleotid. Entsprechende Ergebnisse wurden erhalten, wenn das aktivierte Reagenz eine Acetonitril- Lösung aufwies, die 0,2 M 2-methoxy-3-trifluoracetyl-1,3,2- oxazaphosphacyclopentan und 0,1 M 4-dimethyl-aminopyridin enthielt. In diesem Fall wurde das modifizierte Aktivatorreagenz lediglich einmal hinzugefügt und ihm wurde die Möglichkeit gegeben, ungefähr 2 bis 3 Minuten zu wirken.

III. Anbringen der Marken an den aminoderivatisierten Oligonukleotiden

Die Trifluoracetyl-Schutzgruppe wurde von dem Verbindungsreagenz durch Behandlung mit konzentriertem Amoniumhydroxid entfernt, so daß 5'-Aminoethylphosphat-Oligonukleotide entstanden. Das Anbringen der Marken an den freiliegenden Aminogruppen wurde durch Standardverfahren durchgeführt, beispielsweise durch solche, die in den nachfolgenden Beispielen beschrieben worden sind.

A. FITC

Eine DMF-Lösung von FITC (25 ul mit einer Konzentration von 10 mg/ml, beispielsweise von der Firma Molecular Probes, Inc, Junction City, OR erhältlich), wurde einer Lösung aus 5'- Aminoethylphosphat Oligonukleotid (ein 18-mer) (0,2 mikromolar) in Wasser (0,2 ml) und einer 1 M NaHCO&sub3;/Na&sub2;HCO&sub3;-Pufferlösung, pH=9,0 (0,025 ml) zugegeben. Die resultierende Lösung wurde in Dunkelheit über sechs Stunden oder mehr aufbewahrt. Um die unkonjugierte Marke zu entfernen, durchlief die Reaktion eine äquilibrierte 10 ml Sephadex G-25 (medium) (ein Markennamenprodukt der Firma Pharmacia Fine Chemicals)-Säule mit Wasser. Das Band des gefärbten Materials, das in dem ausgefilterten Volumen ausfiel, wurde aufgefangen. Das Roh-5'- fluorescein-aminoethylphospat-Oligonukleotid wurde durch Polyacrylamidgelelektrophorese oder durch HPLC (beispielsweise Perkin-Elmer Series 4 oder vergleichbare Einrichtungen) auf einer Vydac C18-Säule (Nr. 218TP54) oder einer ähnlichen Einrichtung mit einem linearen Gradienten von 10-20% Acetonitril/0,1 M Triethylammoniumacetat, pH 7,0 gereinigt

B. TMRITC

Eine DMF-Lösung von TMRITC (0,01 ml mit einer Konzentration von 20 mg/ml, beispielsweise von der Firma Research Organics, Inc., Cleveland, OH, oder der Firma Molecular Probes Inc., Junction City, OR erhältlich) wurde einer Lösung von 5'- aminoethlyphosphat-Oligonukleotid (ein 18-mer) (0,004 Micromol) in Wasser (88 ul) und 1 M NaHCO&sub3;/Na&sub2;CO&sub3; Pufferlösung zugegeben, deren pH-Wert 9,0 (2 ul) betrug. Die sich ergebende Lösung wurde in Dunkelheit über sechs Stunden oder mehr aufbewahrt. Die Reaktion wurde durch eine äquilibrierte 10 ml Sephadex G-25 (medium) Säule mit 0,1 M Triethylammoniumacetat, pH=7,0 hindurchgeleitet. Das Band des gefärbten Materials in dem ausgefilterten Volumen wurde wie bei FITC gereinigt.

C. Texas Red.

Das Verfahren, um Texas Red an deb 5'-Aminoethylphosphat- Oligonukleotid zu befestigen, kann durchgeführt werden, indem dem gleichen Verfahren wie für TMRITC gefolgt wird.

D. DDFCS

DDFCS (0,3 mg) wurde einer Lösung von 5'-Aminoethylphosphat- Oligonukleotid (ein 18-mer) (0,006 Mikromol in 10 ul Wasser) und 1 M NaHCO&sub3;/Na&sub2;CO&sub3; Pufferlösung hinzugeführt, deren pH-Wert =9,0 (10 ml) war. Die resultierende Lösung wurde in Dunkelheit über fünf Stunden aufbewahrt und so wie FITC behandelt.

IV. Verwendung von markierten Aminoethylphosphat- Oligonukleotid-Konjugaten als Primer in der enzymatischen DNA Sequenzanalyse

Die DNA-Sequenzanalyse ist in höchstem Maße nützlich, und zwar sowohl in wissenschaftlicher als auch in kommerzieller Hinsicht. Die beiden primären Verfahren zur Sequenzierung von DNA- Fragmenten sind chemische Verfahren, so beispielsweise Maxam und Gilbert, Proc. Nat. Acad. Sci., Band 74, Seite 560 (1970), und enzymatische Replikationsverfahren, so beispielsweise Smith, Methods in Enzymology, Band 65; Grossman and Moldave, Hrsg., Seiten 560-580 (Academic Press, New York, 1980) und Sanger et al., Proc. Natl . . Acad.Sci., Band 74, Seiten 5363-5367 (1977). Das Verfahren gemäß der Erfindung kann im Zusammenhang mit beiden Verfahren eingesetzt werden, um Fluoreszenzmarken für radioaktive Marken einzusetzen. In diesem Beispiel ist gezeigt, wie die vorliegende Erfindung bei der enzymatischen DNA-Sequenz- Analyse von Sanger et al., "Cloning in Single-Stranded Bacteriophage as and Aid to Rapid DNA Sequencing", J. Mol. Biol., Band 143, Seiten 161-178 (1980) und Schreiber and Cortese, "A Fast Simple Method for Sequencing DNA Cloned in the Single-Stranded Bacteriophage M13", J. Mol. Biol., Band 129, Seiten 169-172 (1979) eingesetzt wird. Das durch diese beiden Veröffentlichungen beschriebene DNA-Sequenzierverfahren wird nachfolgend als "Sanger-Verfahren" bezeichnet. Bevor das Sanger- Verfahren beschrieben wird, ist es sinnvoll, die folgenden Begriffe zu definieren.
DNA-Polymerase ist ein großes Multifunktionsenzym, welches die Synthese von einzelsträngiger DNA katalysiert. Die spezielle Art der DNA-Polymerase, die in dem Sanger-Verfahren verwendet wird, ist das sog. Klenow-Fragment der Escherichia coli DNA Polymerase I. Dieses Fragment besitzt die synthetische Funktion des Enzyms. Für die Synthese der DNA-Polymerase ist ein Templat, ein Primer und eine Quelle von Deoxyribonukleotiden erforderlich.
Ein Templat ist ein einzelsträngiges Stück DNA, welches die Sequenz von Nukleotiden in dem einzelsträngigen Stück der DNA festlegt, welches durch die DNA-Polymerase synthetisiert worden ist. Während der Synthese bewegt sich die DNA-Polymerase an dem Templat entlang und für jede Nukleotidbase des Templats bringt die DNA-Polymerase das komplementäre Nukleotid an die wachsende Kette der einzelsträngigen DNA an. Eine komplementäre Nukleotidbase ist eine Base, die mit einer gegebenen Base in Erfüllung mit der Basenpaar-Regel für die Bildung doppelsträngiger DNA zugeordnet ist. Die Basenpaar-Regel erfordert, daß Adenosin des einen Strangs immer mit Thymidin des anderen Stranges gepaart ist und daß Cytidin des einen Stranges immer mit Guanosin des anderen Stranges ein Paar bildet. Demzufolge fügt die DNA-Polymerase, immer wenn sie auf Adenosin an dem Templat stößt, ein Thymidin an die synthetisierte Kette an und wenn sie auf Cytidin stößt, fügt sie ein Guanosin hinzu. Nachdem die DNA-Polymerase sich weiterbewegt hat, liegen die neu synthetisierte Kette und der komplementäre Teil des Templats in doppelsträngiger Form vor.
Ein Primer ist ein Teilstück einer einzelsträngigen DNA. Der Primer sorgt für eine Start stelle für die DNA-Polymerase, an der sie damit beginnt, Nukleotide in dem Syntheseverfahren hinzuzufügen. Der Primer muß an dem Stück der einzelsträngigen DNA befestigt werden, das das Templat enthält, so daß ein Abschnitt der doppelsträngigen DNA als Startpunkt für die DNA- Polymerase zur Verfügung steht.
Dideoxyribonukleotide sind identisch zu Deoxyribonukleotiden, allerdings mit der Ausnahme, daß ihnen beide 2'- und 3'- Hydroxylgruppen an dem Ribose-Teil fehlen, anstatt nur die 2'- Hydroxylgruppe wie bei den Deoxyribonukleotiden. Dideoxyribonukleotide werden manchmal als Analoge zu Deoxyribonukleotiden bezeichnet, da die DNA-Polymerase die Dideoxy-Derivative anstelle der entsprechenden Deoxyribonukleotide in dem DNA-Synthesevorgang akzeptiert. Wenn eine solche Substitution stattfindet hält die Synthese an, weil die DNA-Polymerase keine 3' Hydroxylgruppe hat, an welcher das nachfolgende Nukleotid befestigt werden kann.
Beim Sanger-Verfahren wird ein DNA-Strang, der sequenziert werden soll, als ein Templat für die Escherichia coli DNA- Polymerase I verwendet. Ein Primer wird an einem Stück der einzelsträngigen DNA befestigt, welches das Templat enthält, und sodann wird es enzymatisch auf eine Länge von im Mittel 200 bis 300 oder mehr Nukleotiden bei Vorhandensein von radioaktiv markierten Deoxyribonukleosid-Triphosphaten verlängert, beispielsweise ³²P-markiertes Adenosin-Triphosphat, und des Dideoxyribonukleosid-Triphosphat-Analogons einer der vier Nukleotide. Das heißt, vier separate Reaktionen werden ausgeführt, welche jeweils ein unterschiedliches Dideoxy- Analogon aufweisen. Weil das DNA-Kettenwachstum das Hinzufügen von Deoxyribonukleotiden an das 3'-Hydroxylende erfordert, beendigt das Einführen eines Dideoxyribonukleotids das Kettenwachstum. Das Einfügen des Dideoxy-Analogs anstelle des normalen Nukleotids tritt zufällig auf, so daß jede der vier Reaktionen eine heterogene Population von markierten Strängen erzeugt, die mit dem gleichen Nukleotid enden, welche elektrophoretisch hinsichtlich der Kettenlänge separiert werden können. Das heißt, daß vier Klassen von Oligonukleotiden eingerichtet werden, die auf dem Typ des Endstückes der vorhandenen Dideoxyribonukleoside basieren. Eine einzelsträngige DNA-Phage M 13 wird verwendet, um Kopien des zu sequenzierenden DNA-Fragments zu klonen. Wenn eine ausreichende Menge von M 13 geklont worden ist, wird die M 13 DNA gereinigt und in vier Aliquots separiert. In jedem Aliquot findet die Synthese oder die Kettenwachstumsreaktion bei Vorhandensein der entsprechenden Dideoxyribonukleotide statt.
Gemäß der Erfindung werden, anstatt die Oligonukleotide durch den Einsatz von radioaktiven Nukleotiden während der Kettenwachstumsphase zu markieren, Primer synthetisiert und sodann markiert, indem eine Verbindungsfunktionalität angebracht wird und mit einer Marke reagiert. Vorzugsweise wird eine Amin- Verbindungsfunktionalität angebracht, indem die Primer mit 2- methoxy-3-trifluoracetyl-1,3-2-oxazaphosphacyclopentan
reagieren, um 5'-(geschützte) Aminoethylphosphat-Oligonukleotide zu bilden. Die Schutzgruppen werden entfernt und eine Marke gemäß der Erfindung wird an das ungeschützte 5'-Aminoende angefügt, um markierte Primerkonjugate zu bilden. Die markierten Primerkonjugate werden dann gemäß dem Sanger-Verfahren eingesetzt, jedoch mit dem Unterschied, daß Oligonukleotide aus den vier Aliquots miteinander gemischt und auf die gleiche Elektrophoresespur geladen werden. Die relative Größe der Oligonukleotide und die Natur ihrer Dideoxyribonukleotide wird als Band von homogenen Olignukleotidbahnen längs der Elektrophoresespur ermittelt und durch ein Fluorimeter oder ein Spektrophotometer nach Belichtung detektiert. Gemäß der Erfindung werden die Bänder vorzugsweise sowohl mit 514-nm- als auch 488-nm-Laserlicht belichtet, und zwar entweder nacheinander oder gleichzeitig.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis von bis zu vier Klassen von durch Elektrophorese separierten Oligonukleotiden, wobei das Verfahren die Stufen aufweist:

Markieren jedes einzelnen Oligonukleotids innerhalb jeder Klasse der Oligonukleotide mit einer oder mehreren Marken, die aus dem gleichen Satz eines ersten Satzes von Marken, einem zweiten Satz von Marken, einem dritten Satz von Marken oder einem vierten Satz von Marken ausgewählt worden sind, um markierte Oligonukleotidkonjugate aus jeder Klasse zu bilden, so daß Oligonukleotide unterschiedlicher Klassen mit Marken aus unterschiedlichen Sätzen markiert worden sind, wobei der erste Satz der Marken durch die Formel I definiert ist:

in welcher A eine Verbindungsfunktionalität zur Verbindung der Marke mit einer komplementären Funktionalität eines Oligonukleotids ist und B eine saure anionische Gruppe ist;

der zweite Satz von Marken durch die Formel II definiert ist:

wobei A und B wie oben definiert sind; der dritte Satz von Marken durch die Formel III definiert ist:

wobei A und B so wie oben definiert sind, und der vierte Satz von Marken durch die Formel IV definiert ist:

wobei A' und B' jeweils eine Verbindungsfunktionalität für die Verbindung der Marken mit einer komplementären Funktionalität eines Oligonukleotids oder eine sauren anionischen Gruppe ist, so daß B' eine Verbindungsfunktionalität ist, immer wenn A' eine saure anionische Gruppe ist und B' einer sauren anionische Gruppe ist, immer wenn A' eine Verbindungsfunktionalität darstellt;

Bildung einer Mischung der markierten Oligonuklotidkonjugate aus mehr als einer Klasse;

elektrophoretisches Trennen der markierten Oligonukleotidkonjugate auf einem Gel;

Belichten der Marken von in entsprechender Weise separierten markierten Oligonukleotidkonjugaten und

Identifizierung der Klasse von in entsprechender Weise separierten markierten Oligonukleotodkonjugaten durch das Fluoreszenz- oder das Absorptionsspektrum der Marken der markierten Oligonukleotidkonjugate.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Oligonukleotide unterschiedliche End- Dideoxyribonukleotide haben, wobei das Verfahren die folgenden Stufen aufweist:

Verbinden einer Marke der Formel I mit den 5'-Enden der Oligonukleotide einer vorbestimmten Sequenz, um eine erste Mehrzahl von markierten Primern zu bilden;

Verbinden einer Marke der Formel II mit den 5'-Enden der Oligonukleotide der vorbestimmten Sequenz, um eine zweite Mehrzahl von markierten Primern zu bilden;

Verbinden einer Marke der Formel III mit den 5'-Enden der Oligonukleotide der vorbestimmten Sequenz, um eine dritte Mehrzahl markierter Primer zu bilden;

Verbinden einer Marke der Formel IV mit den 5'-Enden der Oligonukleotide der vorbestimmten Sequenz, um eine vierte Mehrzahl markierter Primer zu bilden;

separates Erzeugen markierter Oligonukleotide in Übereinstimmung mit einem enzymatischen DNA-Sequenziervorgang unter Verwendung der ersten, zweiten, dritten und vierten Mehrzahlen der markierten Primer, so daß eine Eins-zu-Eins- Entsprechung zwischen den Mehrzahlen der markierten Primern und der Art der Dideoxyribonukleotide festgelegt wird, die an dem 3'-Ende der markierten Oligonukleotide befestigt ist;

Bilden einer Mischung der markierten Oligonukleotide;

elektrophoretisches Trennen der markierten Oligonukleotide auf einem Gel entsprechend der Größe;

Belichten der in entsprechender Weise größenmäßig getrennten markierten Oligonukleotide; und

Identifizieren der Art der Dideoxyribonukleotide, die an dem 3'-Ende von in entsprechender Weise separierten markierten Oligonukleotiden befestigt sind, indem das entsprechende Fluoreszenz- oder Absorptionsspektrum der in entsprechender Weise separierten markierten Oligonukleotide mit den befestigten Dideoxyribonukleotiden in Beziehung gesetzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Stufe des Markierens oder Verbindens das Anbringen einer komplementären Funktionalität an jedem Oligonukleotid von jeder der vier Klassen der Oligonukleotide oder an den 5'-Enden der Oligonukleotide der vorbestimmten Sequenz umfaßt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die saure anionische Gruppe der Substituenten A', B und B' Carboxylsäure oder Sulfonsäure ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 oder 4, wobei die Verbindungsfunktionalitäten, die durch A repräsentiert sind, amino-selektiv und die komplementären Funktionalitäten Amine sind.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der erste Satz der Marken aus Fluorescein-5-isothiocyanat, Fluorescein-6- isothiocyanat, Fluorescein-5-succinimidylcarboxylat und Fluorescein-6-succinimidylcarboxylat, besteht; der zweite Satz der Marken 2', 7'-Dimethoxy-4', 5'-dichlorfluorescein- 5-succinimidylcarboxylat und 2' 7'-Dimethoxy-4', 5'-dichlorfluorescein-6-succinimidylcarboxylat besteht; der dritte Satz der Marken aus Tetramethylrhodamin-5-isothiocyanat, Tetramethylrhodamin-6-isothiocyanat Tetramethylrhodamin-5- succinimidylcarboxylat und Tetramethylrhodamin- 6- succimidylcarboxylat besteht; und der vierte Satz der Marken aus Texas-Rot, Rhodamin X-5-isothyiocyanat, Rhodamin X-6- Isothiocyanat, Rhodamin X-5-succinimidylcarboxylat und Rhodamin X-6-Succinimidylcarboxylat besteht.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, wobei die Stufe des Anbringens der komplementären Funktionalität das Reagieren einer 2-Methoxy-3-trifluoracetyl-1,3,2-oxazaphosphacycloalkan mit Oligonukleotiden umfaßt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Gel ein Polyacrylamid-Gel mit einer Konzentration von 2 bis 25% ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Stufe des Belichtens die Belichtung der Marken mit 514 nm Licht umfaßt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Stufe des Belichtens die Belichtung der Marken mit 488 nm Licht umfaßt.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Stufe das Identifizieren von in entsprechender Weise separierten markierten Oligonukleotidekonjugaten oder markierten Oligonukleotiden durch das Fluoreszenzspektrum der Marken der markierten Oligonukleotidekonjugate oder markierter Primer der markierten Oligonukleotide umfaßt.