DE3786321T2

DE3786321T2 - Expression von Protein-C.

Info

Publication number: DE3786321T2
Application number: DE87309528T
Authority: DE
Inventors: Kathleen L Berkner; Donald C Foster; Mark J Murray
Original assignee: Zymogenetics Inc
Current assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 1986-10-29
Filing date: 1987-10-28
Publication date: 1993-09-30
Anticipated expiration: 2007-10-29
Also published as: JP2561677B2; NO874495D0; ATE90966T1; DK567087A; NO173741C; DE3786321D1; EP0266190A2; DK567087D0; US4959318A; KR880005270A; NO874495L; JPH08252094A; EP0266190B1; JPS6485084A; CA1340263C; KR970002166B1; EP0266190A3; JP2922461B2; DK175183B1; NO173741B

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft im allgemeinen Plasmaproteine und DNA-Sequenzen, die sie kodieren, und genauer die Expression von Proteinen mit im wesentlichen derselben Struktur und/oder Aktivität wie das menschliche Protein C oder das menschliche aktivierte Protein C.

Stand der Technik

Protein C ist ein Zymogen oder Präkursor einer Serinprotease, der eine wichtige Rolle bei der Steuerung der Blutgerinnung und der Erzeugung von fibrinolytischer Aktivität in vivo spielt. Es wird in der Leber als ein einzelkettiges Polypeptid synthetisiert, das einer erheblichen Verarbeitung unterzogen wird, um ein zweikettiges Molekül zu erzeugen, welches schwere (Mr = 40.000) und leichte (Mr = 21.000) Ketten aufweist, die durch eine Disulfidbindung zusammengehalten werden. Das im Kreislauf geführte zweikettige Zwischenprodukt wird in die biologisch aktive Form des Moleküls umgewandelt, das als "aktiviertes Protein C" (APC) bekannt ist, durch das Thrombin-vermittelte Abspalten eines 12-Rest-Peptides von dem Aminoende der schweren Kette. Die Abspaltreaktion wird in vivo durch Thrombomodulin erhöht, einen endothelialen Zellcofaktor (Esmon und Owen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2249-2252, 1981).
Protein C ist ein Vitamin K-abhängiges Glycoprotein, das ungefähr neun Reste der Gamma-Carboxyglutaminsäure (Gla) und ein Äquivalent der Beta-Hydroxyasparaginsäure enthält, die durch Post-Translations-Modifikationen von Glutaminsäure- bzw. Asparaginsäureresten gebildet werden. Die Post-Translations-Bildung spezifischer Gamma-Carboxyglutaminsäurereste in Protein C erfordert Vitamin K. Diese unüblichen Aminosäurereste binden sich an Calciumionen und werden für verantwortlich für die Wechselwirkung des Proteins mit Phospholipiden gehalten, welche für die biologische Aktivität von Protein C erforderlich ist.
Im Gegensatz zu der gerinnungsfördernden Wirkung anderer Vitamin K - abhängiger Plasmaproteine, so wie Faktor VII, Faktor IX und Faktor X, wirkt Protein C als ein Regulator des Gerinnungsprozesses durch die Inaktivierung von Faktor Va und VIIIa durch begrenzte Proteolyse. Die Inaktivierung der Faktoren Va und VIIIa durch Protein C ist abhängig von der Anwesenheit saurer Phospholipide und Calciumionen. Von Protein S wurde berichtet, daß es diese Aktivität durch Beschleunigung der APC- katalysierten Proteolyse des Faktors Va steuert (Walker, J. Biol. Chem. 255: 5521-5524, 1980).
Protein C war auch bei der Wirkung von gewebeartigem Plasminogen-Aktivator beteiligt (Kisiel und Fujikawa, Behring Inst. Mitt. 73: 29-42, 1983). Die Infusion von Rinder-APC in Hunde führt zu einer erhöhten Plasminogen-Aktivator-Aktivität (Comp und Esmon, J. Clin. Invest. 68: 1221-1228, 1981). Jüngste Studien (Sakata et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1121- 1125, 1985) haben gezeigt, daß der Zusatz von APC zu kultivierten endothelialen Zellen zu einem schnellen, dosisabhängigen Zuwachs der fibrinolytischen Aktivität in dem konditionierten Medium führt, was die Zuwächse in der Aktivität sowohl der Urokinase-ähnlichen und gewebeartigen Plasminogen-Aktivatoren durch die Zellen wiedergibt. Die APC- Behandlung führt auch zu einer dosisabhängigen Abnahme in der Antiaktivator-Aktivität.
Mangel an Protein C ist mit wiederkehrenden thrombotischen Leiden verbunden (Broekmans et al., New Eng. J. Med. 309: 340-344, 1983; und Seligsohn u. a., New Eng. J. Med. 310: 559-562, 1984) und kann von genetischen Fehlordnungen oder von einem Trauma herrühren, so wie einer Leberkrankheit oder Operation. Dieser Zustand wird im allgemeinen mit oralen Antigerinnungsmitteln behandelt. Vorteilhafte Wirkungen sind auch durch die Infusion von Protein C-enthaltenem normalen Plasma erhalten worden (siehe Gardiner und Griffin in Prog. in Hematology, herausgegeben von Brown, Grune & Stratton, NY, 13: 265-278). Zusätzlich haben einige Forscher entdeckt, daß die antigerinnende Aktivität von Protein C nützlich bei der Behandlung thrombotischer Störungen ist, so wie venöser Thrombose (Smith u. a., PCT-Veröffentlichung Nr. WO 85 /00521). Es wird geschätzt, daß in einigen Teilen der Welt ungefähr 1 von 16.000 Personen Mangel an Protein C zeigt. Weiterhin ist ein totaler Mangel an Protein C für Neugeborene letal.
Schließlich wurde gezeigt, daß exogenes Protein C den gerinnungsstörenden und letalen Wirkungen von gramnegativer Sepsis vorbeugt (Taylor u. a., J. Clin. Invest. 79: 918-9265, 1987). Daten, die aus Studien mit Pavianen erhalten worden sind, legen nahe, daß Protein C eine natürliche Rolle beim Schutz gegen Sepsis spielt.
Obwohl natürliches Protein C aus Gerinnungsfaktorkonzentraten (Marlar u. a., Blood 59: 1067-1072) oder aus Plasma (Kisiel, ebd.), gereinigt werden kann, ist es ein komplexer und teurer Prozeß, teilweise aufgrund der beschränkten Verfügbarkeit des Startmaterials und der geringen Konzentration von Protein C im Plasma. Weiterhin trägt der therapeutische Nutzen von Produkten, die aus menschlichem Blut abgeleitet sind, das Risiko der Krankheitsübertragung durch, beispielsweise, den Hepatitisvirus, den Zytomegalovirus oder das verursachende Agenz des erworbenen Immunmangelsyndroms (AIDS). Im Hinblick auf die klinische Anwendbarkeit von Protein C bei der Behandlung thrombotischer Störungen ist die Herstellung nutzbarer Mengen an Protein C und aktiviertem Protein C eindeutig unbezahlbar.

Offenbarung der Erfindung

Kurz gesagt offenbart die vorliegende Erfindung DNA-Sequenzen, die für Proteine mit im wesentlichen derselben Struktur und/oder biologischen Aktivität wie menschliches Protein C oder menschliches aktiviertes Protein C kodieren. Nach einem Aspekt der vorliegenden Erfindung kodiert die DNA-Sequenz weiterhin für die Aminosäuresequenz (R&sub1;)n-R&sub2;-R&sub3;-R&sub4;, wobei R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; Lys oder Arg sind und n = 0, 1, 2 oder 3, an der Schnittstelle der leichten und schweren Kette. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Aminosäuresequenz an der Schnittstelle Arg-Arg-Lys-Arg. Nach einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt das Protein die Substitution des Restes 158 (Asp) durch einen nicht sauren Aminosäurerest so wie Ala, Ser, Thr oder Gly. In einem verwandten Aspekt umfaßt das Protein die Substitution des Restes 154 (His) durch einen basischen Aminosäurerest so wie Lys oder Arg. Nach einem weiteren Aspekt umfaßt das Protein die Substitution des Lys-Arg bei den Resten 156-157 des nativen Proteins C durch Lys-Lys oder Arg-Arg.
Zusätzlich offenbart die vorliegende Erfindung Expressionsvektoren, die zur Integration in Säugtier-Wirtszellen-DNA fähig sind, einschließlich eines Promotors, der stromabwärts von einer DNA-Sequenz gefolgt ist, die ein Protein mit im wesentlichen derselben Struktur und/oder Aktivität wie menschliches Protein C oder menschliches aktiviertes Protein C wie oben ausgeführt kodiert, wobei die Transkription der Nucleotidsequenz durch den Promotor geleitet wird. Die Nucleotidsequenz wird stromabwärts von einem Polyadenylierungssignal gefolgt. In einer Ausführungsform umfaßt der Expressionsvektor eine wählbare Markierung, die zwischen der Nukleotidsequenz und dem Polyadenylierungssignal gelegen ist, wobei die Transkription der wählbaren Markierung durch den Promotor geleitet wird. Der Expressionsvektor kann auch einen Satz von RNA-Spleißstellen umfassen.
Ein verwandter Aspekt der vorliegenden Erfindung offenbart Säugetierzellen, die transfiziert sind, um ein Protein zu exprimieren, welches, nach Aktivierung, im wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie menschliches aktiviertes Protein C hat. Die Säugetierzellen sind mit einem Expressionsvektor transfiziert, der zur Integration in Säugetier- Wirtszellen-DNA fähig ist, wobei der Expressionsvektor einen Promotor umfaßt, der stromabwärts von einer DNA-Sequenz wie oben beschrieben gefolgt wird. In einer Ausführungsform wird auch eine wählbare Markierung in die Zellen eingeführt, und stabil transfizierte Zellen werden ausgewählt. Säugetierzellen, die transfiziert sind, um ein Protein zu exprimieren, das im wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie menschliches aktiviertes Protein C hat, werden auch offenbart. Bevorzugte Wirtszellen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind COS-, BHK- und 293-Zellen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung offenbart ein Verfahren zum Herstellen eines Proteins, welches, nach Aktivierung, im wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie menschliches aktiviertes Protein C hat. Das Verfahren umfaßt (a) das Einführen eines Expressionsvektors, der eine DNA-Sequenz wie oben beschrieben aufweist, in eine Säugetier-Wirtszelle, welcher ein Protein mit im wesentlichen derselben Struktur und/oder Aktivität wie menschliches Protein C kodiert; (b) das Züchten besagter Säugetier-Wirtszelle in einem geeigneten Medium; und (c) das Isolierens des Proteinprodukts, das von besagter DNA-Sequenz kodiert und von besagter Säugetier- Wirtszelle erzeugt worden ist. Das nach diesem Verfahren produzierte Proteinprodukt wird auch offenbart. Ein Verfahren zum Produzieren eines Proteins, das im wesentlichen dieselbe Struktur und/oder biologische Aktivität wie menschliches aktiviertes Protein C hat, wird auch offenbart.
Die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Proteine können als aktive therapeutische Substanzen verwendet werden, einschließlich der Verwendung bei der Steuerung der Blutgerinnung. Weiterhin können diese Proteine mit einem physiologisch akzeptablen Träger und/oder Lösemittel kombiniert werden, um geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen zu bilden.
Andere Aspekte der Erfindung werden bei Bezug auf die detaillierte Beschreibung und die beigefügten Zeichnungen deutlich.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Figur 1 ist eine partielle Restriktionskarte der Protein C- cDNA in pHCλ6L. Der kodierende Bereich wird durch einen offenen Kasten angezeigt.
Figur 2 stellt die Nukleotidsequenz der vollständigen Protein C-cDNA und die abgeleitete Aminosäuresequenz von Protein C dar. Pfeile geben die Schnittstellen für das Entfernen des verbindenden Dipeptids und des Aktivierungspeptides an.
Figur 3 stellt eine Restriktionsenzymkarte der genomischen DNA dar, die für menschliches Protein C kodiert. Zahlen unterhalb der Linie geben die Länge in Kilobasen (kb) an.
Figur 4 stellt die komplette genomische Sequenz, einschließlich Exonen und Intronen, des menschlichen Protein C-Gens dar. Pfeilspitzen geben Intron-Exon-Spleißverbindungen an. Die Polyadenylierungs- oder Verarbeitungssequenzen von A-T-T- A-A-A und A-A-T-A-A-A an dem 3'-Ende sind in Kästen eingeschlossen. , potentielle Anhaftstellen für Kohlehydrate; ,offensichtliche Schnittstellen zum Verarbeiten des verbindenden Dipeptides; , Schnittstelle in der schweren Kette, wenn das Protein C in aktiviertes Protein C umgewandelt wird; , Stellen der Polyadenylierung.
Figur 5 stellt ein schematisches zweidimensionales Modell für die Struktur des menschlichen Protein C dar.
Figur 6 stellt das Subklonen der 5'- und 3'-Abschnittes eines partiellen cDNA-Klones von Protein C dar.
Figur 7 stellt das Entfernen von Intron A aus dem genomischen Klon dar, was zu der Fusion der Exonen I und II führt.
Figur 8 stellt die Fusion von Exonen I und II an den 5'- nächsten Abschnitt der cDNA-Einfügung der Figur 1 dar.
Figur 9 stellt den Aufbau eines Plasmides dar, das die komplette Kodierungssequenz für Protein C aufweist.
Figur 10 stellt den Expressionsvektor pD7C dar. Verwendete Symbole sind ori, die Adenovirus 5 0-1 Karten-Einheitssequenz; E, der SV40-Enhancer; Ad2MLP, der Adenovirus-2- Hauptspätpromotor; L1-3, der Adenovirus-2-dreigeteilte Leader; 5'ss, 5'-Spleißstelle; 3'ss, 3'-Spleißstelle; pA, das SV40-frühe Polyadenylierungssignal; und Δ , der ausgelassene Bereich der pBR322-"Gift"-Sequenzen.
Figur 11 stellt den Expressionsvektor pD5(PC-DHFRr) dar. DHFRr bezeichnet die Methotrexat-resistente mutante Dihydrofolat-Reduktase-Gensequenz; pA bezeichnet das SV40-späte Polyadenylierungssignal. Andere verwendete Symbole sind wie für Figur 10 beschrieben.
Figur 12 stellt den Expressionsvektor pDX/PC dar. Verwendete Symbole sind wie für Figur 11 beschrieben.
Figur 13 stellt die Ergebnisse einer Prüfung für aktiviertes Protein C auf Medienproben von transfizierten 293-Zellen dar.
Figur 14 stellt die Expressionsvektoren pDX/PC962 und PC229/962 dar.
Figur 15 stellt die Antigerinnungsaktivität von Protein C dar, das gemäß gewisser Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung präpariert worden ist.

Beste Art, die Erfindung auszuführen

Bevor die Erfindung dargelegt wird, mag es für deren Verständnis hilfreich sein, Definitionen bestimmter Ausdrücke zu erläutern, die hiernach benutzt werden sollen.

Biologische Aktivität:

Eine Funktion oder eine Menge von Funktionen, die von einem Molekül in einem biologischen Kontext (d. h. in einem Organismus oder einer in vitro- Umgebung) ausgeführt wird. Biologische Aktivitäten von Proteinen können in katalytische und Effektor-Aktivitäten unterteilt werden. Katalytische Aktivitäten der Vitamin K- abhängigen Plasmaproteine schließen im allgemeinen die spezifische proteolytische Spaltung anderer Plasmaproteine ein, was zu einer Aktivierung oder Deaktivierung des Substrates führt. Effektor-Aktivitäten schließen spezifische Bindung des biologisch aktiven Moleküls an Calcium, Phospholipide oder andere kleine Moleküle, an Makromoleküle, so wie Proteine, oder an Zellen ein. Effektor-Aktivität erhöht oftmals oder ist wesentlich für katalytische Aktivität unter physiologischen Bedingungen.
Für das Protein C ist die biologische Aktivität gekennzeichnet durch seine Antigerinnungs- und fibrinolytischen Eigenschaften. Protein C, wenn es aktiviert wird, inaktiviert Faktor Va und Faktor VIIIa in der Anwesenheit von Phospholipid und Calcium. Protein S scheint bei der Steuerung dieser Funktion beteiligt zu sein (Walker, ebd.). Aktiviertes Protein C verbessert auch die Fibrinolyse, ein Effekt, von dem geglaubt wird, daß er von dem Absenken von Werten für Plasminogen-Aktivator-Inhibitoren vermittelt wird (van Hinsbergh u. a., Blood 65: 444-451, 1985). Wie vollständiger unten beschrieben ist der Abschnitt des Proteins C, der von Exonen VII und VIII des Protein C-Gens kodiert wird, hauptsächlich für seine katalytischen Aktivitäten verantwortlich.

Prä-Pro-Peptid:

Eine Aminosäuresequenz, die an dem Aminoende einiger Proteine auftritt und im allgemeinen von dem Protein während der Translokation abgespalten wird. Prä-Pro-Peptide weisen Sequenzen auf, die das Protein in den Sekretionspfad der Zelle (Signalsequenzen) führen und sind durch die Anwesenheit eines Kernes hydrophober Aminosäuren gekennzeichnet. Sie können auch Verarbeitungssignale aufweisen. Wie hierin verwendet kann der Ausdruck "Prä-Pro-Peptid" auch einen Abschnitt eines natürlicherweise auftretenden Prä-Pro- Peptides bedeuten.

Expressionseinheit:

Ein DNA-Aufbau, welcher eine Haupt- Nukleotidsequenz aufweist, die ein Protein von Interesse kodiert, zusammen mit anderen Nukleotidsequenzen, die die Transkription der Haupt-Nukleotidsequenz leiten und steuern. Eine Expressionseinheit besteht aus wenigstens der Haupt- Nukleotidsequenz und einer Promotorsequenz, die stromaufwärts der Haupt-Nukleotidsequenz angeordnet ist und operabel mit ihr verbunden ist, und einem Polyadenylierungssignal, das stromabwärts angeordnet ist. Zusätzliche genetische Elemente können auch eingeschlossen sein, um die Leistungsfähigkeit der Expression zu verbessern. Diese Elemente umfassen Enhancer-Sequenzen, Leader und mRNA-Spleißstellen.

Expressionsvektor:

Ein DNA-Molekül, das unter anderem eine DNA-Sequenz enthält, die ein Protein von Interesse kodiert, zusammen mit einem Promotor und anderen Sequenzen, die die Expression des Proteins erleichtern. Expressionsvektoren enthalten weiterhin genetische Information, die für ihre Replikation in einer Wirtszelle sorgt, entweder durch autonome Replikation oder durch Integration in das Wirtsgenom. Beispiele von Expressionsvektoren, die gemeinhin für rekombinante DNA verwendet werden, sind Plasmide und bestimmte Viren, obwohl sie Elemente beider enthalten können. Sie können auch eine auswählbare Markierung einschließen.
Wie oben angemerkt, wird Protein C in der Leber produziert und erfordert Vitamin K für seine Biosynthese. Vitamin K ist notwendig für die Bildung spezifischer Gamma-Carboxyglutaminsäure-Reste in dem Aminoendebereich der leichten Kette. Diese Aminosäurereste werden durch eine post-translationale Modifikation gebildet und sind für die calciumvermittelte Verbindung an Phospholipid erforderlich. Zusätzlich enthält Protein C einen Beta-Hydroxy- Asparaginsäurerest, der auch in einer post-translationalen Modifikation gebildet wird. Jedoch ist die Rolle dieses Aminosäurerestes nicht bekannt.
Bei Zugrundelegen der Tatsache, daß die Aktivität von Protein C abhängig von post-translationalen Modifikationen ist, die die Gamma-Carboxylierung spezifischer Glutaminsäurereste und das Schneiden in die zwei Zwei-Ketten- Form einschließen, und auch von der Hydroxylierung eines spezifischen Asparaginsäurerestes abhängig sein kann, ist es unwahrscheinlich, daß ein aktives Produkt durch das Klonen und die Expression von Protein C in einem Mikroorganismus produziert werden könnte.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines Proteins zur Verfügung, welches gammacarboxyliert ist und, nach der Aktivierung, die biologische Aktivität von menschlichem aktiviertem Protein C hat, durch die Verwendung von Säugetierzellen, die transfiziert sind, um das Protein stabil zu exprimieren.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zum Erzeugen eines Proteins zur Verfügung, das gamma-carboxyliert ist und die biologische Aktivität von menschlichem aktiviertem Protein C hat, ohne die Notwendigkeit der Aktivierung.
Die leichten und schweren Ketten von Rinderprotein C sind sequenziert worden (Fernlund und Stenflo, J. Biol. Chem. 257: 12170-12179, 1982; und Stenflo und Fernlund, J. Biol. Chem. 257: 12180-12190, 1982). Isolation und Charakterisierung von menschlichem Protein C sind von Kisiel, J. Clin. Invest. 64: 761-769, 1979, beschrieben worden. Die Antigerinnungsaktivitäten sowohl der menschlichen als auch der Rinderenzyme wurden als hoch artspezifisch gefunden. Es wird vermutet, daß die Artenspezifität durch das Protein S vermittelt wird (Walker, Thromb. Res. 22: 321-327, 1981). Jedoch zeigen die menschlichen und Rinderproteine beträchtliche gesamtstrukturelle Homologie zueinander und zu anderen Vitamin K- abhängigen Plasmaproteinen, einschließlich Prothrombin, Faktor VII, Faktor IX und Faktor X. Ähnlichkeiten schließen die Anwesenheit von Gla-Resten in der leichten Kette und die aktive Stelle Serin in der schweren Kette ein, ebenso wie andere Aminosäuresequenz-Homologien in dem Aminoendeereich der leichten Kette.
In der vorliegenden Erfindung wurde eine λgt11 cDNA-Bibliothek aus mRNA der menschlichen Leber hergestellt. Diese Bibliothek wurde dann mit ¹²&sup5;J-markiertem Antikörper auf menschliches Protein C abgebildet. Antikörper-reaktive Klone wurden weiterhin für die Synthese eines Fusionsproteins von ß-Galactosidase an Protein C in dem λgt11-Vektor analysiert.
Einer der Klone gab ein starkes Signal mit der Antikörpersonde, und es wurde gefunden, daß er eine Einfügung von ungefähr 1400 bp enthielt. Die DNA-Sequenzanalyse der DNA- Einfügung zeigte eine vorhergesagte Aminosäuresequenz, die einen hohen Grad der Homologie zu Hauptabschnitten des Rinderproteins C zeigt, wie von Fernlund und Stenflo bestimmt (J. Biol. Chem. 257: 12170-12179; J. Biol. Chem. 257: 12180- 12190).
Die DNA-Einfügung enthielt den Hauptanteil des Kodierungsbereiches für Protein C, beginnend mit Aminosäure 64 der leichten Kette, einschließlich des Kodierungsbereiches für die gesamte schwere Kette und weiter bis zu dem Endcodon. Weiterhin, anschließend an das Haltecodon der schweren Kette, gab es 294 Basenpaare der 3'-nichtkodierenden Sequenz und einen Poly (A)-Schwanz von 9 Basenpaaren. Das Verarbeitungs- oder Polyadenylierungssignale A-A-T-A-A-A war 13 Basenpaare stromaufwärts dieses Poly (A)-Schwanzes in dieser cDNA- Einfügung anwesend. Diese Sequenz war eine von zwei potentiellen Polyadenylierungsstellen.
Die cDNA-Sequenz kodiert auch das Dipeptid Lys-Arg an der Stelle 156-157 (die Numerierung der Aminosäuren ist in Figur 2 gezeigt), die die leichte Kette von der schweren Kette trennt und wird während des Verarbeitens durch proteolytisches Schneiden entfernt, die in der Absonderung des Zweikettenmoleküles resultiert. Nach Aktivierung des Zweikettenmoleküles durch Thrombin wird die schwere Kette des menschlichen Proteins C zwischen Arginin 169 und Leucin 170 geschnitten, was das Aktivierungspeptid freigibt (Figur 2).
Durch ein ähnliches Verfahren wurde eine zweite cDNA, der die Kodierungssequenz für das Prä-Pro-Peptid und die ersten 23 Aminosäuren des Proteins C fehlten, isoliert. Durch Verwenden dieser cDNA als eine Hybridisierungssonde wurde der Rest der Kodierungssequenz aus einer menschlichen genomischen DNA- Bibliothek in λ Charon 4A erhalten (Foster u. a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4673-4677, 1985). Drei unterschiedliche λ Charon 4A-Phagen wurden isoliert, die überlappende Einfügungen für das Protein C-Gen enthielten.
Die Positionen von Exonen auf den drei Phagen-Klonen wurden durch Southern Blot-Hybridisierung von Verdauungsprodukten dieser Klone mit Sonden, die aus der oben beschriebenen 1400 bp cDNA hergestellt wurden, bestimmt. Die genomischen DNA- Einfügungen in diesen Klonen wurden durch Einzel- und Doppel- Restriktionsenzym-Verdauung abgebildet, gefolgt von Agarose- Gelelektrophorese Southern-Blot-Bildung und Hybridisierung mit radiomarkierten 5'- und 3'-Sonden, die von der cDNA für menschliches Protein C abgeleitet worden sind, wie in Figur 3 gezeigt.
DNA-Sequenzierungsstudien wurden unter Verwendung des Dideoxy-Kettenende-Verfahrens durchgeführt. Wie in Figur 4 gezeigt, überspannt die Nukleotidsequenz für das Gen für menschliches Protein C ungefähr 11 kb der DNA. Diese Studien zeigten weiterhin ein potentielles Prä-Pro-Peptid von 42 Aminosäuren. Die Prä-Pro-Sequenz wird durch eine Signalpeptidase gescnitten, die dem Gly-Rest an der Position -25 folgt. Das Verarbeiten in das reife Protein zieht zusätzliches proteolytisches Schneiden nach dem Rest- 1 nach sich, um das Amino-Endstück-Propeptid zu entfernen und um an den Resten 155 und 157 das Lys-Arg-Dipeptid zu entfernen, das die leichte und schwere Kette verbindet. Dieses letztendliche Verarbeiten ergibt eine leichte Kette aus 155 Aminosäuren und eine schwere Kette aus 262 Aminosäuren.
Das Protein C-Gen ist aus acht Exonen zusammengesetzt, die in der Größe von 25 bis 885 Nukleotiden liegen, und sieben Intronen, die in der Größe von 92 bis 2668 Nukleotiden liegen. Exon I und ein Bereich von Exon II kodieren für das Prä-Pro-Peptid aus 42 Aminosäuren. Der verbleibende Abschnitt von Exon II, Exon III, Exon IV, Exon V und ein Abschnitt von Exon VI kodieren für die leichte Kette von Protein C. Der verbleibende Abschnitt von Exon VI, Exon VII und Exon VIII kodieren für die schwere Kette von Protein C. Die Aminosäure- und DNA-Sequenzen für eine cDNA, die für menschliches Protein C kodiert, sind in Figur 2 gezeigt.
Die Intronen in dem Gen für Protein C sind hauptsächlich zwischen unterschiedlichen funktionalen Bereichen angeordnet. Exon II überspannt die hochgradig erhaltene Region des Prä- Pro-Peptides und den Gamma-Carboxyglutaminsäure (Gla)- Bereich. Exon III umfaßt eine Ausdehnung von acht Aminosäuren, die die Gla- und Wachstumsfaktor-Bereiche verbinden. Exonen IV und V stellen jedes einen potentiellen Wachstumsfaktorbereich dar, während Exon VI einen Verbindungsbereich überdeckt, der das Aktivierungspeptid einschließt. Exonen VII und VIII überdecken den katalytischen Bereich, der typisch für alle Serinproteasen ist.
Die Aminosaüresequenz und die vorgeschlagene Struktur für menschliches Prä-Pro-Protein C sind in Figur 5 gezeigt. Protein C ist ohne das Lys-Arg-Dipeptid gezeigt, das die leichte und schwere Kette verbindet. Die Anordnung der sieben Intronen (A bis G) ist durch durchgehende Striche angegeben. Aminosäuren, die an den bekannten proteolytischen Schnittstellen liegen, sind eingekreist. bezeichnet potentielle Kohlehydrat-Bindungsstellen. Die erste Aminosäure in der leichten Kette, im Aktivierungspeptid und in der schweren Kette beginnt mit Nummer 1. Diese Numerierung unterscheidet sich von der, die in den Figuren 2 und 4 gezeigt ist.
Kohlehydrat-Anlagerungsstellen sind beim Rest 97 in der leichten Kette und bei den Resten 79, 144 und 160 in der schweren Kette, gemäß dem Numerierungsschema der Figur 5, gelegen. Der Kohlehydratanteil ist kovalent an Asn gebunden. Bei der Mehrzahl der Beispiele kann die Umgebung der Anbindungsstelle für die Kohlehydrate durch Asn-X-Ser oder Asn-X- Thr dargestellt werden, wobei X = irgendeine Aminosäure.
Wie oben angemerkt, spielt Protein C eine steuernde Rolle bei dem Gerinnungsprozeß. Der katalytische Bereich, kodiert durch die Exonen VII und VIII, besitzt Serinproteaseaktivität, die spezifisch bestimmte Plasmaproteine schneidet (d.h. Faktoren Va und VIIIa), was zu ihrer Deaktivierung führt. Als ein Ergebnis dieser selektiven Proteolyse zeigt Protein C antigerinnende und fibrinolytische Aktivitäten.
Aufgrund der Anwesenheit zwischenliegender Sequenzen in dem genomischen Klon reicht das bloße Verbinden der genomischen und cDNA-Sequenzen, um eine komplette Kodierungssequenz zur Verfügung zu stellen, nicht aus, um eine akzeptable Expressionseinheit zu konstruieren. Es ist daher notwendig, diese zwischenliegenden Sequenzen zu entfernen, aus Gründen, die vollständiger weiter unten beschrieben sind, wenn ein genomischer Klon verwendet wird, um die Expressionseinheit zu konstruieren.
Der 5'-kodierende Bereich kann auch durch alternative Verfahren erhalten werden und schaltet somit die Notwendigkeit aus, zwischenliegende Sequenzen zu entfernen. Der 5'- kodierende Bereich kann erhalten werden, indem man Sonden verwendet, die von der existierenden cDNA oder von genomischen Klonen abgeleitet worden sind, um zusätzliche Bibliotheken zu sondieren. Durch dieses Verfahren wurde eine cDNA voller Länge isoliert. Weiterhin sind die Aminoende-Abschnitte der Vitamin K-abhängigen Plasmaproteine für ihre jeweiligen Calciumbindungsaktivitäten verantwortlich. Es wurde gefunden, daß, als ein Ergebnis dieser funktionalen Homologie, die Bereiche der Calciumbindung dieser Moleküle ausgetauscht werden können und dann noch die Aktivität behalten, die für den katalytischen Bereich des sich ergebenden Moleküls spezifisch ist. Beispielsweise, wie in der US- Patentanmeldung Nr. 724,311, angemeldet am 17. April 1985 und veröffentlicht als EP-A-0 200 421, beschrieben ist, kann der Aminoende-Abschnitt (calciumbindender Bereich) des Faktors IX an den Faktor VII bei Aminosäure 38 angebunden werden, um ein Protein mit der Aktivität des Faktors VII herzustellen. Faktor VII, Faktor IX, Faktor X, Prothrombin und Protein S teilen diese Homologie in der Aminoende-Sequenz mit Protein C. Folglich könnte eine geklonte Sequenz, die den 5'-kodierenden Bereich des Genes für irgendeines dieser Proteine enthält, durch die entsprechende Sequenz des Protein C-Gens substituiert werden. Zusätzlich können geeignete Kodierungssequenzen basierend auf den bekannten Aminosäuresequenzen verschiedener der Vitamin K-abhängigen Plasmaproteine oder der Sequenz des hierin offenbarten Proteins C synthetisiert werden. Techniken zum Herstellen synthetischer Nukleotidsequenzen sind im Stand der Technik wohlbekannt. Beispielsweise kann eine Gruppe überlappender Oligonukleotide synthetisiert und zu Paaren ausgeglüht werden, um doppelsträngige Fragmente mit überlappenden kohäsiven Endstücken zu liefern. Diese Fragmente werden dann gebunden, wie es irgendein Restriktionsfragment würde. Das sich ergebende synthetische Fragment wird dann an die cDNA an einer passenden Restriktionsstelle angebunden. Die Verbindungssequenz kann durch Oligonukleotid-gesteuerte Mutagenese wie notwendig modifiziert werden.
Wenn Klone, die die gesamte Kodierungssequenz repräsentieren, erhalten worden sind, können die geeigneten Bereiche wie notwendig verbunden werden, um die gewünschte Kodierungssequenz zu erzeugen. Fragmente, die aus einer oder mehreren Bibliotheken erhalten worden sind, werden mit geeigneten Restriktionsendodnukleasen geschnitten und enzymatisch in der richtigen Ausrichtung zusammengebunden. Abhängig von den Fragmenten und den speziellen gewählten Restriktionsendonukleasen kann es notwendig sein, unerwünschte DNA-Sequenzen durch einen "Schleifen-Ausnehmungs"-Prozeß der Löschmutagenese oder durch eine Kombination von Restriktionsendonukleasespaltung und Mutagenese zu entfernen. Die so erhaltene Sequenz sollte bevorzugt in der Form eines kontinuierlichen offen zu lesenden Rasters sein d. h., daß ihr die zwischenliegenden Sequenzen (Introne) fehlen, die im allgemeinen im höheren eukaryotischen Genen gefunden werden. Die Anwesenheit von Intronen in geklonten Genen kann zu anomalem Spleißen von Boten-RNA und/oder reduzierter Leistungsfähigkeit der Genexpression oder Instabilität bei Verstärkung führen, wenn die Gensequenz in eine Säugetier- Wirtszelle eingeführt wird. Es ist bevorzugt, daß diese Kodierungssequenz weiterhin ein Prä-Pro-Peptid kodiert, um die richtige Verarbeitung und Absonderung des Proteins C zu erleichtern, das gemäß der vorliegenden Erfindung produziert wird. Das Prä-Pro-Peptid kann das des Proteins C oder eines anderen abgesonderten Proteins sein, so wie Faktor IX, Faktor VII oder Prothrombin.
Unter gewissen Umständen kann es wünschenswert sein, aktiviertes Protein C direkt herzustellen, so daß nicht die Notwendigkeit verbleibt, das Proteinprodukt entweder in vitro oder in vivo zu aktivieren. Die Schnittstellen, die bei der Reifung und Aktivierung von Protein C beteiligt sind, sind bekannt (Foster und Davie, ebd.). Eine APC-kodierende Sequenz kann aufgebaut werden, indem man durch Oligonukleotidgesteuerte Löschmutagenese den Bereich entfernt, der das Aktivationspeptid kodiert. Das sich ergebende Protein wird dann durch Entfernen des Lys-Arg-Dipeptides während der normalen proteolytischen Verarbeitung in dem Absonderungsweg der Wirtszelle aktiviert werden. Es wurde gefunden, daß Proteine, denen das Aktivationspeptid fehlt, trotzdem von den Wirtszellen richtig verarbeitet werden, was zu einer Absonderung des aktivierten Proteins C führt.
Um das proteolytische Verarbeiten zu verbessern, das beim Peifen des rekombinanten Proteins C in die zweikettige Form beteiligt ist, kann es wünschenswert sein, die Aminosäuresequenz um die Verarbeitungsstelle zu modifizieren. Es ist gefunden worden, daß eine solche Modifikation die richtige Verarbeitung des rekombinanten Proteins C in transfizierten Zellen vereinfacht.
Effiziente Spaltung kann die spezifische Aktivität des Proteins erhöhen, wobei als gegeben genommen wird, daß es nicht bekannt ist, daß das einzelkettige Protein C im Blutstrom aktiviert wird. Wie zuvor angemerkt, umfaßt dieser Reifungsprozeß das Entfernen des Dipeptides Lys-Arg (Aminosäuren 156-157) (Foster und Davie, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 4766-4770, 1984). Modifikationen an der Aminosäuresequenz in der Umgebung dieser Verarbeitungsstelle umfassen die Substitution und/oder Einfügung von Aminosäuren. Eine solche Gruppe von Modifikationen ist die Änderung der Aminosäuresequenz, um die Sequenz (R&sub1;)n-R&sub2;-R&sub3;-R&sub4; einzuschließen, wobei R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; Lys oder Arg ist und n = 0, 1, 2 oder 3, anstelle des nativen Lys-Arg-Dipeptides. Eine besonders bevorzugte Modifikation dieser Gruppe ist die Sequenz Arg-Arg-Lys-Arg. Es wurde gefunden, daß diese Sequenz die Verarbeitung von rekombinantem Protein C um etwa das Fünffache in transfizierten BHK-Zellen verbessert. Eine zweite Gruppe von Modifikationen umfaßt die Substitution des Aminosäurerestes 154 (His) des nativen Proteins C durch einen Aminosäurerest (d. h. Lys oder Arg), um eine Verarbeitungsstellensequenz der allgemeinen Formel R&sub1;-X-R&sub2;-R&sub3; zu ergeben, wobei R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; Lys oder Arg sind, und X ist eine Aminosäure verschieden von Lys oder Arg, bevorzugt Leu. Eine dritte Gruppe von Modifikationen umfaßt die Substitution des Asp-Restes an der Stelle 158 durch einen nicht sauren Aminosäurerest. Die Verwendung einer kleinen neutralen Aminosäure, so wie Ala, Ser, Thr oder Gly ist bevorzugt. Eine vierte Gruppe von Modifikationen umfaßt die Substitution von Lys-Lys oder Arg-Arg für das Lys-Arg des Proteins C. Kombinationen dieser Gruppen von Modifikationen können auch gemacht werden. Beispielsweise kann die Aminosäure 158 in einem Protein C-Molekül ersetzt werden, das eine Verarbeitungsstelle mit der Sequenz (R&sub1;)n-R&sub2;-R&sub3;-R&sub4; enthält. Diese Modifikationen können bei der Produktion von Wildtyp-Protein C oder aktiviertem Protein C verwendet werden.
Die Kodierungssequenz für Protein C oder aktiviertes Protein C wird dann in einen geeigneten Expressionsvektor eingefügt, der wiederum verwendet wird, um eine Säugetierzellinie zu transfizieren. Expressionsvektoren zur Verwendung beim Ausführen der vorliegenden Erfindung werden einen Promotor umfassen, der in der Lage ist, die Transkription eines fremden Genes, das in eine Säugetierzelle eingeführt wird, zu steuern. Virale Promotoren sind wegen ihrer Leistungsfähigkeit beim Steuern der Transkription bevorzugt. Ein besonders bevorzugter Promotor ist der Hauptspätpromotor des Adenovirus 2. Derartige Expressionsvektoren werden auch bevorzugt eine Anzahl von RNA- Spleißstellen enthalten, die stromabwärts des Promotors und stromaufwärts der Einfügungsstelle für die Protein C-Sequenz oder innerhalb der Protein C-Sequenz selbst angeordnet sind. Bevorzugte RNA-Spleißstellen können von Adenovirus- und/oder Immunoglobulin-Genen erhalten werden. Auch enthalten in den Expressionsvektoren ist ein Polyadenylierungssignal, das stromabwärts der Einfügungsstelle angeordnet ist. Virale Polyadenylierungssignale sind besonders bevorzugt, so wie das frühe oder späte Polyadenylierungssignal von SV40 oder das Polyadenylierungssignal aus dem Adenovirus-5-EIb-Bereich. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfaßt der Expressionsvektor auch eine nicht kodierende virale Leader-Sequenz, so wie den Adenovirus 2- dreiteiligen Leader, angeordnet zwischen dem Promotor und den RNA-Spleißstellen. Bevorzugte Vektoren können auch Enhancer-Sequenzen umfassen, so wie den SV40-Enhancer und Sequenzen, die Adenovirus VA-RNAs kodieren.
Geklonte Gensequenzen können dann in kultivierte Säugetierzellen durch, beispielsweise, Calciumphosphat-vermittelte Transfektion eingeführt werden (Wigler u. a., Cell 14: 725, 1978; Corsaro und Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981; Graham und Van der Eb, Virology 52: 456, 1973). Ein Niederschlag wird aus der DNA und Calciumphosphat gebildet, und dieser Niederschlag wird den Zellen aufgegeben. Einige der Zellen nehmen die DNA auf und halten sie einige Tage lang innerhalb der Zeile. Ein geringer Bruchteil dieser Zellen (typischerweise 10&supmin;&sup4;) integriert die DNA in das Genom. Um diese integrierten Bestandteile zu identifizieren, wird im allgemeinen ein Gen, das einen wählbaren Phänotyp (eine wählbare Markierung) überträgt, in die Zellen zusammen mit dem interessierenden Gen eingeführt. Bevorzugte wählbare Markierungen umfassen Gene, die Drogenresistenz übertragen, so wie Neomycin, Hygromycin und Methotrexat. Wählbare Markierungen können in die Zellen auf einem separaten Plasmid zur selben Zeit wie in das interessierende Gen eingeführt werden, oder sie können auf demselben Plasmid eingeführt werden. Wenn sie auf demselben Plasmid sind, können die wählbare Markierung und das interessierende Gen unter Steuerung unterschiedlicher Promotoren oder desselben Promotors sein. In einer Ausführungsform wird die auswählbare Markierung auf dasselbe Plasmid gelegt, wobei die das Protein C kodierende Sequenz so ist, daß beide Sequenzen durch denselben Promotor gesteuert werden, eine Anordnung, die als eine dicistronische Nachricht bekannt ist. Aufbauten dieses Typs sind im Stand der Technik bekannt (z. B. europäische Patentveröffentlichung 117,058). Es kann auch vorteilhaft sein, zusätzliche DNA, bekannt als "Träger-DNA" der Mischung hinzuzufügen, die in die Zellen eingeführt wird. Nachdem die Zellen die DNA aufgenommen haben, dürfen sie über eine Zeitdauer, typischerweise ein bis zwei Tage, wachsen, um das interessierende Gen zu exprimieren. Drogenselektion wird dann angewendet, um für die Züchtung der Zellen auszuselektieren, die die wählbare Markierung in einer stabilen Weise exprimieren. Klone solche Zellen können für die Expression des Proteins C überprüft werden.
Bevorzugte Säugetierzellinien zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen die COS-, BHK- und 293-Zellinien. Zusätzlich können eine Anzahl anderer Zellinien in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, einschließlich Rat Hep I (ATCC CRL 1600), Rat Hep II (ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), menschliche Lunge (ATCC 75.1), menschliches Hepatom (ATCC HTB-52), Hep G2(ATCC HTB 8065), Mäuseleber (ATCC CC 29.1) und DUKX-Zellen (Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220, 1980).
Die 293-Zellinie (ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59-72, 1977) ist besonders bevorzugt, aufgrund ihrer Fähigkeit, das Protein C effizient in die Zweikettenform zu verarbeiten. Diese Zellinie wird mit menschlicher Adenovirus 5-DNA transformiert und hat das Ad5-ElA-Gen in seinem Genom integriert. Bevorzugte Expressionsvektoren zur Verwendung mit 293-Zellen werden einen Adenovirus-Promotor umfassen. Neomycin-Resistenz ist eine bevorzugte wählbare Markierung zur Verwendung bei 293-Zellen. Eine bevorzugte BHK-Zellinie ist die tk&supmin;-BHK-Zellinie BHK570 (Waechter und Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 1106-1110, 1982).
Die Anzahl der Kopien der integrierten Gensequenz kann durch Verstärkung erhöht werden, indem man bestimmte auswählbare Markierungen verwendet (z. B. Dihydrofolat-Reduktase, die die Resistenz auf Methotrexat überträgt). Die auswählbare Markierung wird in die Zellen zusammen mit dem interessierenden Gen eingeführt, und Drogenselektion wird angewandt. Die Drogenkonzentration wird dann schrittweise erhöht, mit Auswahl resistenter Zellen bei jedem Schritt. Indem man gemäß erhöhter Kopienanzahl geklonter Sequenzen selektiert, können die Expressionswerte kodierter Proteine wesentlich erhöht werden.
Protein C, das gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wird, wird bevorzugt gereinigt, wie durch Affinitätschromatographie auf einer Anti-Protein C-Antikörpersäule. Zusätzliche Reinigung des Säulen-Eluates kann durch herkömmliche chemische Reinigungsmittel erreicht werden, so wie hochleistungsfähige Flüssigkeitschromatographie (HPLC).
Protein C, das gemäß der vorliegenden Erfindung produziert worden ist, kann durch Entfernen des Aktivationspeptides von dem Aminoende der schweren Kette aktiviert werden. Die Aktivierung kann erreicht werden, indem man Protein C in der Anwesenheit von α-Thrombin (Marlar u. a., Blood 59: 1067- 1072, 1982), Trypsin (Marlar u. a., ebd.), Russells Viperngift-Faktor X-Aktivator (Kisiel, ebd.) oder dem kommerziell erhältlichen Aktivator Protac C, von tierischem Gift abgeleitet, (American Diagnostica) inkubiert.
Um die Beispiele zusammenzufassen, die folgen, Beispiel 1 beschreibt das Klonen von DNA-Sequenzen, die menschliches Protein C kodieren. Beispiel 2 beschreibt den Aufbau einer Kodierungssequenz voller Länge für Protein C aus den Sequenzen, die in Beispiel 1 isoliert worden sind. Beispiel 3 beschreibt die Konstruktion von Expressionsvektoren für die Protein C-DNA. Beispiel 4 beschreibt die Herstellung von Protein C, wobei transfizierte Säugetierzellen verwendet werden. Beispiel 5 beschreibt eine cDNA voller Länge, die Protein C kodiert, und ihre Expression in transfizierten Säugetierzellen. Beispiel 6 beschreibt die Produktion von aktiviertem Protein C in BHK- und 293-Zellen. Beispiel 7 beschreibt die Produktion von Protein C aus einem Präkursor mit modifizierter Schnittstelle. Beispiel 8 beschreibt die Verwendung des Faktor VII-Prä-Pro-Peptides oder des Prothrombin-Prä-Pro-Peptides, um die Absonderung von Protein C aus transfizierten Zellen zu steuern.

BEISPIELE

Restriktionsendonukleasen und andere DNA-Modifikationsenzyme (z.B. T4-Polynukleotid-Kinase, Kälberalkalinphosphatase, Klenow-DNA-Polymerase, T4-Polynukleotidligase) wurden von den Bethesda Research Laboratories (BRL) und New England Biolabs erhalten und wurden verwendet wie vom Hersteller angegeben, wenn nichts anderes angemerkt ist.
Oligonukleotide können auf einem Applied Biosystems Model 380 A-DNA-Synthetisierapparat synthetisiert und durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf denaturierenden Gelen gereinigt werden. E. coli- Zellen können wie von Maniatis u. a. beschrieben transformiert werden (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). M13 und pUC klonende Vektoren und Wirtsstränge wurden von BRL erhalten.

Beispiel 1

Klonen von DNA-Sequenzen, die menschliches Protein C kodieren

Eine cDNA, die für einen Abschnitt von menschlichem Protein C kodiert, wurde wie von Foster und Davie (ebd.) beschrieben präpariert. Kurz gesagt wurde eine .gt11-cDNA-Bibliothek aus mRNA aus menschlicher Leber durch herkömmliche Verfahren hergestellt. Klone wurden ausgesucht, indem ¹²&sup5;J-markierte affinitätsgereinigte Antikörper auf menschliches Protein C verwendet wurden, und Phagen wurden aus positiven Klonen durch das Plattenlysatverfahren (Maniatis u. a., ebd.) präpariert, gefolgt von Banding auf einem Cäsiumchloridgradienten. Die cDNA-Einfügungen wurden entfernt, indem man Eco RI verwendet, und in Plasmid pUC9 subklont (Vieira und Messing, Gene 19: 259-268, 1982). Restriktionsfragmente wurden in die Phagenvektoren M13mp10 und M13mp11 subgeklont (Messing, Meth. in Enzymology 101: 20-77, 1983) und durch das Dideoxyverfahren (Sanger u. a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467, 1977) sequenziert. Ein Klon wurde ausgesucht, der DNA entsprechend der bekannten Teilsequenz von menschlichem Protein C enthielt (Kisiel, ebd.) und Protein C kodierte, beginnend bei der Aminosäure 64 der leichten Kette und durch die schwere Kette hindurch und in den 3'-nicht kodierenden Bereich. Dieser Klon wurde mit λHC1375 bezeichnet. Ein zweiter cDNA-Klon, der für Protein C von der Aminosäure 24 an kodierte, wurde identifiziert. Die Einfügung von diesem Klon wurde in pUC9 subgeklont und das Plasmid mit pHC.6L bezeichnet (Figur 1). Dieser Klon kodiert einen Hauptabschnitt von Protein C, einschließlich dem Kodierungsbereich für die schwere Kette, dem Endcodon und dem 3'-nicht kodierenden Bereich.
Die cDNA-Einfügung aus λHC1375 wurde nick-translatiert, indem α-³²P dNTP's verwendet wurden, und benutzt, um eine menschliche genomische Bibliothek im Phagen λ Charon 4A zu sondieren (Maniatis u. a., Cell 15: 687-702, 1978), indem die Platten-Hybridierungsprozedur von Benton und Davis (Science 196: 181-182, 1977) wie von Woo modifiziert (Meth. in Enzymology 68: 381-395, 1979) verwendet wurde. Positive Klone wurden isoliert und plattengereinigt (Foster u. a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4673-4677, 1985, hierin durch Bezugnahme eingefügt). Phagen-DNA, präpariert aus positiven Klonen (Silhavy u. a., in Experiments with Gene Fusion, Cold Spring Harbor Laboratory, 1984) wurde mit Eco RI oder Bgl II ligeriert und die genomischen Einfügungen gereinigt und in pUC9 subgeklont. Restriktionsfragmente der Einfügung wurden in M13-Vektoren subgeklont und sequenziert, um ihre Identität zu bestätigen und die DNA-Sequenz des gesamten Genes festzulegen.
Die cDNA-Einfügung von pHC.6L wurde nick-translatiert und verwendet, um die Phage λ Charon 4A-Bibliothek zu sondieren. Ein genomischer Klon wurde identifiziert, der auf Sonden hybridisierte, die aus den 5'- und 3'-Enden der cDNA hergestellt waren. Dieser Phagenklon wurde mit Eco RI digeriert, und ein 4,4 kb-Fragment, entsprechend dem 5'-Ende des Protein C-Gens, wurde in pUC9 subgeklont. Das sich ergebende rekombinante Plasmid wurde pHCR4.4 bezeichnet. Die vollständige DNA Sequenzanalyse zeigte, daß die Einfügung in pHCR 4.4 zwei Exonen mit 70 und 167 Basenpaaren aufwies, getrennt durch ein Intron mit 1263 bp. Das erste Exon kodiert die Aminosäuren -42 bis -19; das zweite kodiert die Aminosäuren -19 bis 37. Sequenzanalyse bestätigte die DNA-Sequenz des gesamten Protein C-Gens.
Wie oben angemerkt ist es dann notwendig, das Intron zu entfernen, um einen genomischen Klon zum Aufbau einer akzeptable Kodierungssequenz zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung zu verwenden.

Beispiel 2

Aufbau einer Kodierungssequenz voller Länge für Protein C

Eine Kodierungssequenz voller Länge für Protein C, einschließlich des Prä-Pro-Peptides, wird aufgebaut, indem man die geeigneten Fragmente der cDNA- und genomischen Klone verbindet. Dies wird erreicht, indem man das Intron aus dem genomischen Klon (pHCR4.4) entfernt und die verschmolzenen Exone zu der cDNA (aus pHCλ6L) an passenden Restriktionsstellen verbindet. Die gewünschte genomische:cDNA-Verbindung wird dann erzeugt, indem man durch Schleifenbildung unerwünschte Sequenzen durch Oligonukleotid-gesteuerte Löschmutagenese entfernt.
Das Plasmid pHCλ6L enthält das Protein C teilweise cDNA- geklont an der Eco RI-Stelle von pUC9 (Figur 1). Die cDNA- Einfügung ist in zwei Fragmenten subgeklont, um es für die Verbindung mit dem 5'-nächsten kodierenden Bereich von dem genomischen Klon zu präparieren. Plasmid pHCλ6L wird mit Eco RI und Sal I digeriert, und die Reaktionsmischung wird mit Phenol und CHCl3 extrahiert, dann mit Ethanol ausgefällt. die sich ergebenden DNA-Fragmente werden in Ligationspuffer resuspendiert und T&sub4;-DNA-Ligase wird hinzugefügt. Die Ligationsmischung wird bei 15ºC 14 Stunden lang bebrütet. Ein Teil der Ligationsmischung wird verwendet, um E. coli JM83 zu transformieren, und die Zellen werden auf LB-Agar, der X-gal enthält, gelegt. Weiße Kolonien werden ausgewählt, und Plasmid-DNA wird präpariert. Die DNA wird durch Restriktionsenzymverdauung analysiert, um Klone zu identifizieren, die den 3'-Abschnitt der cDNA (ca. 1450 bp Einfügung) und den 5'- Abschnitt der cDNA (ca. 65 bp Einfügung) enthalten. Diese Klone werden mit p9C3' bzw. p9C5' bezeichnet (Figur 6).
Der 5'-kodierende Bereich, der von der cDNA fehlt, ist in Exonen I und II des genomischen Klons pHCR4.4 enthalten. Dieses Plasmid enthält eine Einfügung von ungefähr 4400 Basenpaaren und endet an seinem 3'-Ende an einer Eco RI- Stelle, die im Intron B gelegen ist.
Um die kodierenden Sequenzen aus dem pHCR4.4 zu entfernen, wird das Plasmid mit PstI und Eco RI digeriert, und die resultierenden Fragmente werden durch Elektrophorese in einem Agarosegel getrennt. Das ca. 2540 bp-Fragment, das die Exonen I und II enthält, wird aus dem Gel isoliert und mit CTAB extrahiert (Langridge u. a., Analyt. Biochem 103: 264, 1980). Dieses Fragment, mit 5'P-R bezeichnet, wird in pUC9 subgeklont, um das Plasmid p5'P-R zu produzieren (Figur 7).
Das Intron in p5'P-R (bezeichnet als Intron A) wird in einem Zweischrittprozeß entfernt (Figur 7). Das Plasmid wird mit Apa I digeriert, das an einer eindeutigen Stelle in dem Intron schneidet, und 3'-Enden, die überhängen, hinterläßt. Das linearisierte Plasmid wird dann mit Bal 31-Exonuklease oder T&sub4;-Polymerase behandelt, um ungefähr 400 bp von jedem Ende zu entfernen, und die sich ergebenden Fragmentenden werden mit S1-Nuklease stumpf gemacht. Das linearisierte Plasmid wird mit Ligase wieder in Kreisform gebracht und verwendet, um E. coli JM83 zu transformieren. Plasmid-DNA wird extrahiert und auf die Anwesenheit der Restriktionsstellen Sma I und Sst I im Intron A analysiert, und ein Plasmid mit einem Sma I-Sst I-Fragment, reduziert auf 300 bis 400 bp, wird ausgewählt und mit p5'PΔaR bezeichnet.
Der Rest des Introns A wird durch Oligonukleotid-gesteuerte Löschmutagenese entfernt, im wesentlichen wie von Zoller und Smith für das Zwei-Starter-Verfahren beschrieben (Manual for Advanced Techniques in Molecular Cloning Course, Cold Spring Harbor Laboratory, 1983). p5'PΔaR wird mit Pst I und Eco RI digeriert, und das Protein C-Fragment wird in Pst I + Eco RI- digeriertes M13mp9 subgeklont. Plus-Strang Phage-DNA wird als Matrize präpariert und an das Oligonukleotid mut-1 angeschweißt (Tabelle 1). Dieses mutagene Oligonukleotid umfaßt Sequenzen, die komplementär zu den zu verbindenden Sequenzen von Exon I und II sind. Der universelle sequenzierende Starter M13 wird bei 3' an mut-1 an derselben Matrix angeheftet. Die Starter werden gestreckt, indem DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) und Nukleosidtriphosphate in Anwesenheit von T&sub4;-DNA-Ligase verwendet werden. Die sich ergebenden DNA-Doppelkreise werden in E. coli JM103 transformiert und die sich ergebenden Platten unter strengen Hybridisierungsbedingungen überprüft, wobei das ³²P-markierte mutagene Oligonukleotid als Sonde verwendet wird. DNA aus positiven Platten wird isoliert und sequenziert, indem Oligonukleotid-Starter-I (Tabelle 1) verwendet wird, der am Exon II startet, was die Bestimmung der DNA-Sequenz über die Auslöschverbindung hin erlaubt. Ein Molekül mit der richtigen inneren Rasterverbindung der Exonen I und II wird ausgewählt. Das Pst I-Eco RI-Fragment wird aus der M13-Replikatform durch Verdauung mit Restriktionsendonuklease und Agarose-Gelelektrophorese isoliert und wird in pUC9 subgeklont, um Plasmid p5'I-II zu produzieren (Figur 7).
Es wird Bezug auf Figur 8 genommen, um den 5'-kodierenden Bereich mit der cDNA zu verbinden, wird das ca. 1277 bp lange PstI-Eco RI-Fragment des p5'I-II aus einem Pst I + Eco RI- Verdauungsprodukt des Plasmides isoliert und durch Agarose- Gelelektrophorese gereinigt. Das 65 bp lange 5'-nächste cDNA- Fragment wird aus einem Sal I + Eco RI-Verdauungsprodukt von p9C5' isoliert und durch Elektrophorese auf einem Acrylamidgel gereinigt. Die beiden Fragmente werden an ihren Eco RI- Enden gebunden, und das sich ergebende ca. 1330 bp lange Pst I-Sal I-Fragment wird in Pst I + Sal I-digeriertes M13mp9 subgeklont (Figur 8). Plus-Strang-Phage-DNA wird als Matrize für Oligonukleotid-gesteuerte Löschmutagenese präpariert. Das Oligonukleotid mut-2 (Tabelle 1) wird an die Matrize angeheftet, und Oligonukleotid mut-3 (Tabelle 1) wird stromaufwärts als zweiter Starter angeheftet. Die Starter werden wie oben beschrieben ausgestreckt. Oligonukleotid mut-2 steuert die Verschmelzung von Exon II-Sequenzen, die Aminosäuren 23-26 kodieren, an die cDNA bei Codon 27. Der zweite Starter (mut- 3) führt eine Eco RI-Stelle 35 bp stromaufwärts dem Startpunkt der Translation ein. Der sich ergebende Phage wird auf Abwesenheit von Nco I- und Xho I-Stellen und auf Anwesenheit der untersuchten Eco RI-Stelle untersucht. Phagen-DNA die das gewünschte Restriktionsmuster zeigt, wird sequenziert, wobei Starter-2 (Tabelle 1) verwendet wird, um die Anwesenheit der korrekten Verbindung zwischen dem Exon II und der cDNA zu verifizieren. Phagen-DNA mit der korrekten Sequenz wird ausgewählt, und das Pst I-Sal I- Fragment mit dem 5'-kodierenden Bereich wird von der Replikatform des M13-rekombinanten Phagen isoliert. Das Fragment wird durch Agarose-Gelelektrophorese gereinigt und in Pst I + Sal I-digeriertes pUC9 eingefügt, um das Plasmid pC5'-Ende zu produzieren.
Mit Bezugnahme auf Figur 9 wird das Plasmid pC5'-Ende mit Eco RI und Sal I digeriert, und das 5'-Protein C-Fragment wird durch Agarose-Gelelektrophorese und Extraktion mit CTAB gereinigt. Der Rest der cDNA wird als ein Sal I-Eco RI- Fragment von p9C3' isoliert. Die beiden Fragmente werden in einer dreiteiligen Bindung an Eco RI-digeriertes pUC9 gebunden. Die Bindungsmischung wird verwendet, um E. coli JM83 zu transformieren, die Zellen werden auf LB + X-gal gelegt, und Plasmid-DNA wird aus weißen Kolonien isoliert. Das sich ergebende Plasmid wird als pMMC bezeichnet. Es enthält die vollständige Kodierungssequenz für menschliches Protein C auf einem ca. 1500 bp langen Eco RI-Fragment. TABELLE I Oligonukleotid Sequenz mut Starter

Beispiel 3

Aufbau von Expressionsvektoren für Protein C

Die Protein C-kodierende Einfügung wird als ein Eco RI- Fragment aus pMMC entfernt und in einen geeigneten Säugetierzellen-Expressionsvektor eingefügt. Ein Beispiel für einen Vektor ist pD7, der den SV40-Enhancer und den Adenovirus 2- Hauptspätpromotor und dreigeteilten Leader aufweist.
Plasmid pD7 wird aus Plasmid pDHFRIII erzeugt (Berkner und Sharp, Nuc. Acids. Res. 13: 841-857, 1985). Die Pst I-Stelle unmittelbar stromaufwärts der DHFR-Sequenz in pDHFRIII wurde in eine Bcl I-Stelle durch Digerieren von 10 ug Plasmid mit 5 Einheiten Pst I 10 Minuten lang bei 37ºC in 100 ul Puffer A (10 mM Tris mit pH-Wert 8, 10 mM MgCl&sub2;, 6 mM NaCl, 7 mM β- MSH) umgewandelt. Die DNA wurde Phenol-extrahiert, mit EtOH ausgefällt und in 4 ul Puffer B (50 mM Tris mit pH-Wert 8, 7 mM MgCl2, 7 mM β-MSH), der 10 mM dCTP und 16 Einheiten T&sub4;-DNA Polymerase enthielt, resuspendiert und bei 12ºC 60 Minuten lang bebrütet. Im Anschluß an das Ausfällen mit EtOH wurde die DNA 12 Stunden lang bei 12ºC an 2,5 ug Kinase-Bcl I-Verbinder in 14 ul Puffer C (10 mM Tris mit pH-Wert 8, 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM DTT, 1,4 mM ATP), der 400 Einheiten T&sub4;-Polynukleotidligase enthielt, gebunden. Nach der Phenolextraktion und dem Niederschlag mit EtOH wurde die DNA in 120 ul Puffer D (75 mM KCl, 6 mM Tris mit pH-Wert 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM DTT) resuspendiert, mit 80 Einheiten Bcl I 60 Minuten lang bei 50ºC digeriert, dann mit Agarose der Elektrophorese unterworfen. Form III-Plasmid-DNA (10 ug) wurden von dem Gel isoliert und in 10 ul Puffer C, welcher 50 Einheiten T&sub4;-Polynukleotidligase enthielt, 2 Stunden lang bei 12ºC gebunden und verwendet, um E. coli HB101 zu transformieren. Positive Kolonien wurden durch schnelle DNA-Präparationsanalyse identifiziert und Plasmid-DNA (bezeichnet als pDHFR'), die aus positiven Kolonien hergestellt wurde, wurde in dAM&supmin;-E. coli transformiert.
Plasmid pD2' wurde dann erzeugt, indem pDHFR' (15 ug) und pSV40 (mit Bam HI-digerierter SV40-DNA, die an die Bam HI- Stelle von pML-1 geklont worden ist) (25 ug) in 100 ul Puffer D mit 25 Einheiten Bcl I 60 Minuten lang bei 50ºC geschnitten wird, gefolgt von dem Zusatz von 50 Einheiten Bam HI und zusätzlicher Bebrütung für eine Dauer von 60 Minuten bei 37ºC. Die DNA-Fragmente wurden durch Agarose-Gelelektrophorese wiedergewonnen, und das 4,9 kb pDHFR'-Fragment und das 0,2 kb SV40-Fragment wurden isoliert. Diese Fragmente (200 ng pDHFR-DNA und 100 ng SV40-DNA) wurden in 10 ul Puffer C, der 100 Einheiten T&sub4;-Polynukleotidligase enthielt, 4 Stunden lang bei 12ºC bebrütet, und der sich ergebende Aufbau (pD2') wurde verwendet, um E. coli-RRI zu transformieren.
Das Plasmid pD2' wurde modifiziert, indem die "Gift"-Sequenzen in dem pBR322-Bereich gelöscht wurden (Lusky und Botchan, Nature 293: 79-81, 1981). Die Plasmide pD2' (6,6 ug) und pML- 1 (Lusky und Botchan, ebd.) (4 ug) wurden in 50 ul Puffer A mit 10 Einheiten sowohl von Eco RI und Nru I 2 Stunden lang bei 37ºC bebrütet, gefolgt von Agarose-Gelelektrophorese. Das 1,7 kb lange pD2'-Fragment und das 1,8 kb lange pML-1- Fragment wurden isoliert und aneinander (jeweils 50 ng) in 20 ul Puffer C, der 100 Einheiten T&sub4;-Polynukleotidligase enthielt, 2 Stunden lang bei 12ºC gebunden, gefolgt von der Transformation in E. coli HB101. Kolonien, die den gewünschten Aufbau (bezeichnet mit pD2) enthielten, wurden durch schnelle Präparationsanalyse identifiziert. Zehn ug pD2 wurden dann mit jeweils 20 Einheiten Eco RI und Bgl II in 50 ul Puffer A 2 Stunden lang bei 37ºC digeriert. Die DNA wurde der Elektrophorese mit Agarose ausgesetzt, und das gewünschte 2,8 kb lange Fragment (Fragment C), das die pBR322-, 3'- Spleißstelle- und Poly A-Sequenzen enthielt, wurde isoliert.
Um die restlichen Fragmente zu erzeugen, die beim Aufbau von pD3 verwendet wurden, wurde pDHFRIII modifiziert, um die Sac II (Sst II)-Stelle entweder in eine Hind III- oder Kpn I- Stelle umzuwanden. Zehn ug pDHFRIII wurden mit 20 Einheiten Sst II 2 Stunden lang bei 37ºC digeriert, gefolgt von Phenolextraktion und Ausfällen mit Ethanol. Resuspendierte DNA wurde in 100 ul Puffer B, der 10 mM dCTP und 16 Einheiten T&sub4;- DNA-Polymerase enthielt, 60 Minuten lang bei 12ºC bebrütet, Phenol-extrahiert, dialysiert und mit Ethanol ausgefällt. DNA (5 ug) wurde mit 50 ng Kinase-Hind III- oder Kpn I-Verbindern in 20 ul Puffer C, der 400 Einheiten T&sub4;-DNA-Ligase enthielt, 10 Stunden lang bei 12ºC gebunden, Phenol-extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Nach der Resuspension in 50 ul Puffer A wurden die sich ergebenden Plasmide mit 50 Einheiten Hind III oder Kpn I, wie zweckmäßig, digeriert und mit Agarose der Elektrophorese unterworfen. Gelisolierte DNA (250 ng) wurde in 30 ul Puffer C, der 400 Einheiten T&sub4;-DNA-Ligase enthielt, 4 Stunden lang bei 12ºC gebunden und verwendet, um E. coli RRI zu transformieren. Die sich ergebenden Plasmide wurden mit pDHFRIII (Hind III) und pDHFRIII (Kpn I) bezeichnet. Ein 700 bp langes Kpn I-Bgl II-Fragment (Fragment A) wurde dann aus pDHFRIII (Kpn I) durch Verdauung mit Bgl II und Kpn I gefolgt von Agarose-Gelelektrophorese gereinigt.
Die SV40-Enhancer-Sequenz wurde wie folgt in pDHFRIII (Hind III) eingefügt: 50 ug SV40-DNA wurde in 120 ul Puffer A mit 50 Einheiten Hind III 2 Stunden lang bei 37ºC bebrütet, und das Hind III-C-SV40-Fragment (5089-968 bp) wurde gelgereinigt. Plasmid pDHFRIII (Hind III) (10 ug) wurde mit 250 ng Kälberdarm-Phosphatase 1 Stunde lang bei 37ºC behandelt, Phenol-extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Das linearisierte Plasmid (50 ng) wurde mit 250 ng Hind III-C-SV40 in 16 ul Puffer C 3 Stunden lang bei 12ºC gebunden, wobei 200 Einheiten T&sub4;-Polynukleotidligase verwendet wurden, und in E. coli HB101 transformiert. Ein 700 Basenpaare langes Eco RI- Kpn I-Fragment (Fragment B) wurde dann von diesem Plasmid isoliert.
Für den letztendlichen Aufbau von pD3 wurden die Fragmente A und B (jeweils 50 ng) mit 10 ng Fragment C mit 200 Einheiten T&sub4;-Polynukleotidligase 4 Stunden lang bei 12ºC gebunden, gefolgt von der Transfektion von E. coli RRI. Positive Kolonien wurden durch schnelle Präparationsanalyse erfaßt, und eine Präparation von pD3 in großem Maßstabe wurde gemacht.
Plasmid pD3 wird modifiziert, damit es die Einfügung der Protein C-Sequenz akzeptiert, indem die Bcl I-Einfügestelle in eine Eco RI-Stelle umgewandelt wird. Es ist zuerst notwendig, die Eco RI-Stelle, die in pD3 an der am weitesten links liegenden Endstelle der Adenovirus 5 0-1-Karte für Einheitssequenzen vorliegt, zu entfernen, indem man sie mittels konventioneller verbindender Prozeduren in eine Bam HI-Stelle umwandelt. Kurz gesagt wird das Plasmid mit Eco RI
TEXT FEHLT DHFR-Fragment isoliert. Dieses wird in einen M13-Phagenvektor subgeklont und mit einem Mutagen behandelt, wie bei Simonsen und Levinson beschrieben (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2495-2499, 1983). Die Mutagenese führt zu einer einzigen Basenpaaränderung in der DHFR-Sequenz. Das geänderte Fragment wird dann wieder in pDHFRIII eingefügt, um das Plasmid pDHFRrIII zu produzieren.
Der 5'-nicht kodierende Bereich der DHFR-Sequenz wird dann entfernt. Das Plasmid pDHFRrIII wird mit Fnu 4HI geschnitten, das das Plasmid an ungefähr 20 Stellen aufschneidet, dann mit T&sub4;-DNA-Polymerase und allen vier Desoxynukleotid-Triphosphaten behandelt, um abgestumpfte Endstücke zu erzeugen. Bam HI- Verbinder werden an die Enden gebunden und die Mischung mit Bam HI und Nco I digeriert. Ein 0,6 kb langes Bam HI-Nco I- Fragment, das die DHFRr-cDNA aufweist, wird isoliert. Das Plasmid pDHFRIII wird mit Nco I und Bam HI digeriert, und das 0,2 kb lange Fragment, das das SV40-Polyadenylierungssignal aufweist, wird isoliert. Das Polyadenylierungssignal, in der frühen Ausrichtung, wird dann an das DHFRr-Fragment gebunden. Nach der Verdauung mit Bam HI wird dann das sich ergebende Bam HI-Fragment in die Bam HI-Stelle von pD5 eingefügt, und die Verbindungsmischung wird verwendet, um E. coli HB101 zu transformieren. Die Plasmid-DNA wird präpariert und durch Restriktionsendonuklease-Verdauung ausgewählt. Ein Plasmid mit der DHFRr-Einfügung in der korrekten Ausrichtung für die Transkription vom Ad2-Spätpromotor wird mit pD5 (DHFRr) bezeichnet.
Um Protein C unter Verwendung von Plasmid pD5 (DHFRr) zu exprimieren, wird pMMC mit Eco RI digeriert, und das 1,5 kb lange Protein C-Fragment wird isoliert. Die Eco RI-Endstücke werden durch Anbindung in Bcl I-Endstücke gebunden. Plasmid pD5 (DHFRr) wird teilweise mit Bam HI digeriert, um es an dem 5'-Ende der DHFRr-Sequenz zu schneiden, und wird an das Protein C-Fragment gebunden. Die Plasmid-DNA wird in bezug auf die richtige Ausrichtung und Einfügung des Protein C- Fragmentes ausgewählt. Der sich ergebende Vektor, als pD5 (PC-DHFRr) bezeichnet, ist in Figur 11 dargestellt.

Beispiel 4

Expression von Protein C in transfizierten Säugetierzellen

Babyhamsternieren-(BHK)-Zellen (American Type Culture Collection Annahmenummer CCL10) werden mit pD7C durch gemeinsames Ausfällen mit Calciumphosphat transfiziert (Wigler u. a., Cell 14: 725, 1978; Corsaro und Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981; und Graham und Van der Eb, Virology 52: 456, 1973). Die Zellen werden bei 37º, 5 % CO2 in Dulbeccos Medium (plus 10 % wärmeinaktiviertem fetalem Kalbserum und versetzt mit L-Glutamin und Penicillinstreptomycin) in 60 mm Gewebekultur-Petrischalen auf eine Konfluenz von 20 % gezüchtet. Ein Gesamtwert von 10 ug DNA wird verwendet, um eine 60 mm-Schale zu transfizieren: 3,75 ug pD7C, 1,25 ug pKO-neo (Southern und Berg, J. Mol. Appl. Genet 1: 327-341, 1982) und 5 ug Lachssperma-DNA. Die DNAs werden in 0,3 M NaOAc, 75 % Ethanol, ausgefällt, mit 70 % Ethanol gespült und in 20 ul 10 mM Tris-HCl mit pH-Wert 8, 1 mM EDTA, wieder gelöst. Die DNA wird mit 440 ul H&sub2;O und 500 ul aus 280 mM NaCl, 1,5 mM NaHPO&sub4;, 12 mM Dextrose, 50 mM HEPES mit pH- Wert 7,12 kombiniert. Sechzig ul 250 mM CaCl&sub2; werden tropfenweise zu der obigen Mischung hinzugefügt, und die Lösung kann dann bei Zimmertemperatur 30 Minuten lang stehen. Die Lösung wird dann zu den Zellen hinzugefügt und die Zellen für 4 Stunden wieder auf 37ºC gebracht. Das Medium wird entfernt, und 5 ml 20 %iger DMSO in Dulbeccos mit Serum werden 2 Minuten lang bei Zimmertemperatur hinzugefügt. Die Schale wird dann schnell mit zweimaligem Austauschen des Mediums gewaschen und in frischem Medium über Nacht bebrütet. Vierundzwanzig Stunden nach dem Zusetzen der DNA wird das Medium entfernt und Auswahlmedium (10 mg/ml G418, 498 u/mg, Gibco, in Dulbeccos mit Serum) hinzugefügt. Nach ungefähr 10 bis 13 Tagen werden individuelle Klone, die Zellen darstellen, die das pKO-neo-Gen eingebaut haben und somit gegen G418 resistent sind, auf 96-Dellen-Platten übertragen und zur Proteinprobe in Dulbeccos plus 10 % fetalem Kalbserum gezüchtet.
Um auf Protein C zu überprüfen, wird das Medium von den Zellen und zellularem Abfall durch Zentrifugieren getrennt und auf Protein C-Polypeptid und biologische Aktivität geprüft. Die Zellen werden von den Platten mit Trypsin entfernt, mit frischem Medium gewaschen, zentrifugiert und bei -20ºC gefroren. Für die Probe werden die Zellkügelchen in PBS aufgetaut, in Kugelform gebracht und in PBS, das 0,25 % Triton X-100 enthält, resuspendiert. Proben werden verdünnt und auf Polypeptid und Aktivität geprüft.
Die enzymgekoppelte Immunoprobe (ELISA) für das Protein C wird wie folgt durchgeführt: affinitätsgereinigter polyklonaler Antikörper zu menschlichem Protein C (100 ul mit 1 ug/ml in 0,1 M Na&sub2;CO&sub3;, pH-Wert 9,6) wird in jede Delle von Mikrotiterplatten mit 96 Dellen gefüllt, und die Platten werden über Nacht bei 4ºC bebrütet. Die Dellen werden dann dreimal mit PBS (5 mM Phosphatpuffer, pH-Wert 7,5, 0,15 M NaCl), das 0,05 % Tween-20 enthält gewaschen und dann mit 100 ul 1 %igem Rinderserum-Albumin, 0,05 % Tween-20 in PBS über Nacht bei 4ºC bebrütet. Die Platten werden dann mehrere Male mit PBS gespült, luftgetrocknet und bei 4ºC aufbewahrt. Um Proben zu prüfen, werden 100 ul jeder Probe eine Stunde lang bei 37ºC in den überzogenen Dellen bebrütet, und die Dellen werden mit 0,05 % Tween-20 in PBS gespült. Die Platten werden dann eine Stunde lang bei 37ºC mit einem Biotinkonjugierten polyklonalen Antikörper auf Protein C vom Schaf (30 ng/ml) in PBS bebrütet, das 1 % Rinderserum-Albumin und 0,05 % Tween-20 enthält. Die Dellen werden mit PBS gespült und wieder für eine Stunde bei 37ºC mit Avidin-konjugiertem auf Alkalinphosphatase in PBS bebrütet, das 1 % Rinderserum- Albumin und 0,05 % Tween-20 enthält. Die Dellen werden dann mit PBS gespült, und die Alkalinphosphatase-Aktivität wird durch den Zusatz von 100 ul Phosphatasesubstrat (Sigma 104; 600 ug/ml) in 10 % Diethanolamin, pH-Wert 9,8, das 0,3 mM MgCl&sub2; enthält, gemessen. Die dekadische Extinktion bei 405 nm wird auf einem Mikrotiterplattenleser abgelesen.
Die biologische Aktivität von Protein C wird durch seine Fähigkeit zum Verlängern der Kaolin-Cephalin-Gerinnungszeit von Plasma geprüft, anschließend an seine Aktivierung wie im Beispiel 5C beschrieben.

Beispiel 5

Expression einer cDNA voller Länge, die Protein C kodiert

A. Isolation der cDNA.

Ein genomisches Fragment, das ein Exon entsprechend den Aminosäuren -42 bis -19 des Prä-Pro-Peptides (Exon 1 in Figur 4) des Proteins C enthielt, wurde isoliert, nick-translatiert und als eine Sonde zum Überprüfen einer cDNA-Bibliothek benutzt, die durch die Technik von Gubler und Hoffman (Gene 25: 263-269, 1983) aufgebaut worden ist, wobei mRNA aus HEPG2-Zellen verwendet wurde. Diese Zellinie wurde von menschlichen Leberzellen abgeleitet, und es war zuvor gezeigt worden, daß sie Protein C synthetisiert (Fair und Bahnak, Blood 64: 194-204, 1984). Zehn positive Klone, die cDNA aufweisen, welches in die Eco RI-Stelle des Phagen λgt11 eingefügt ist, wurden isoliert und mit einer Oligonukleotidsonde entsprechend dem 5'-nicht kodierenden Bereich des Protein C-Genes untersucht. Ein Klon war auch mit dieser Sonde positiv, und seine gesamte Nukleotidsequenz wurde bestimmt. Die cDNA enthielt 70 bp von 5'-unübersetzter Sequenz, die gesamte kodierende Sequenz für menschliches Prä- Pro-Protein C und den gesamten 3'-nicht kodierenden Bereich, der der zweiten Polyadenylierungsstelle (Figur 2) entspricht.

B. Aufbau des Expressionsvektors.

Die Expression von Protein C-cDNA wurde in dem Vektor pDX erreicht. Dieser Vektor wurde von pD3 (beschrieben in Beispiel 3 oben) und pD3' abgeleitet, einem Vektor identisch mit pD3, außer daß das SV40-Polyadenylierungssignal (d. h. das SV40-Bam HI [2533 bp] bis Bcl I [2770 bp]-Fragment) in der späten Orientierung ist. Somit enthält pD3' eine Bam HI-Stelle als die Stelle der Geneinfügung.
Um pDX zu erzeugen, wurde die Eco RI-Stelle in pD3' in eine BclI-Stelle durch Eco RI-Spaltung, Bebrütung mit S1-Nuklease und nachfolgender Bindung mit Bcl I-Verbindern überführt. Die DNA wurde aus einer positiv identifizierten Kolonie präpariert, und das 1,9 kb lange Xho I-Pst I-Fragment, das die geänderte Restriktionsstelle enthielt, wurde durch Agarose- Gelelektrophorese präpariert. In einer zweiten Modifikation wurde Bcl I-geschnittenes pD3 mit Kinase-Eco RI-Bcl I- Adaptoren (aufgebaut aus den Oligonukleotiden ZC525, 5'GGAATTCT3'; und ZC526, 5'GATCAGAATTCC3') gebunden, um eine Eco RI-Stelle als die Position zum Einfügen eines Genes in den Expressionsvektor zu erzeugen. Positive Kolonien wurden durch Restriktionsendonukleaseanalyse identifiziert, und die DNA daraus wurde verwendet, um ein 2,3 kb langes Xho I-Pst I- Fragment zu isolieren, das die modifizierte Restriktionsstelle enthielt. Die beiden oben beschriebenen DNA-Fragmente wurden zusammen mit T&sub4;-DNA-Ligase bebrütet, in E. coli HB101 transformiert, und positive Kolonien wurden durch Restriktionsanalyse identifiziert. Eine Präparierung solcher DNA, pDX genannt, wurde dann gemacht. Dieses Plasmid enthält eine eindeutige Eco RI-Stelle zum Einfügen fremder Gene.
Die Protein C-cDNA wurde dann in pDX als ein Eco RI-Fragment eingefügt. Rekombinante Plasmide wurden durch Restriktionsanalyse überprüft, um diejenigen zu identifizieren, die die Protein C-Einführung in der korrekten Ausrichtung in bezug auf die Promotorelemente haben, und Plasmid-DNA (bezeichnet als pDX/PC) wurde aus einem richtigen Klon (Figur 12) präpariert. Da die cDNA-Einfügung in pDX/PC ein ATG-Codon in dem 5'-nicht kodierenden Bereich (siehe Figur 2) enthält, wurde Löschmutagenese auf der cDNA vor den Transfektions- und Expressionsexperimenten durchgeführt. Das Auslöschen der drei Basenpaare wurde nach Standardprozeduren der Oligonukleotid-gesteuerten Mutagenese durchgeführt. Der auf pDX basierende Vektor, der die modifizierte cDNA enthielt, wurde als p594 bezeichnet.

C. cDNA-Expression.

Plasmid p594 wurde durch Calciumphosphatausfällung in COS-1 (ATCC CRL1650)-, BHK- und 293-Zellen transfiziert. Vier Stunden später wurden frische Kulturmedien (versetzt mit 5 ug/ml Vitamin K) hinzugefügt. Zu geeigneten Zeiten (üblicherweise 48 oder 72 Stunden) wurden die Kulturmedien abgeerntet, und die Zellen wurden gesammelt und gelöst.
Das Protein C, das in das Kulturmedium abgesondert wurde, wurde durch ELISA geprüft, wobei derselbe affinitätsgereinigte polyklonale Antikörper verwendet wurde, der bei der anfänglichen Identifizierung der cDNA-Klone benutzt wurde. Ergebnisse der Prüfungen der COS-1- und 293-Zellen (Tabelle 2) eigten, daß Protein C aus den transfizierten Zellen abgesondert wurde. Es wurde gefunden, daß 293-Zellen konsistent höhere Wert an Protein C als die COS-Zellen gaben.
Um das Ausmaß der Gamma-Carboxylierung des rekombinanten Proteins zu prüfen, wurden Proben der Kulturmedien der Ausfällung mit Bariumcitrat unterworfen, ein Prozeß, der selektiv nur gamma-carboxylierte Proteine aus dem Plasma ausfällt (Bajaj u. a., J. Biol. Chem. 256: 253-259, 1981) Über 70 % des Protein C-antigenen Materials konnte mit Bariumcitrat ausgefällt werden.
Das rekombinante Protein C wurde auf Antigerinnungsaktivität geprüft, indem seine Fähigkeit zum Verlängern der Gerinnung gemessen wurde. Dialysierte Medienproben wurden mit Protac C (American Diagnostica) behandelt, um das Protein C zu aktivieren. Die Proben wurden dann zu einer in vitro- Gerinnungsprobe gegeben (Sugo u.a., J. Biol. Chem. 260: 10453, 1985). Kurz gesagt wurden 50 ul jeweils von normal gesammeltem menschlichem Plasma, Kaninchenhirn-Kephalin (10 mg/ml in TBS [50 mM Tris mit pH-Wert 7,5, 150 mM NaCl]) und Kaolinsuspension (5 mg/ml in TBS) in einem mit Silicon überzogenen Glasrohr gemischt. Nach Vorbrütung bei 37ºC für 2 Minuten wurden 100 ul in TBS gelöstem aktivierten Protein hinzugefügt, und die Bebrütung bei 37ºC wurde für weitere 2 Minuten fortgeführt. Das Gerinnen wurde dann durch den Zusatz von 50 ul 25 mM CaCl&sub2; eingeleitet, und die Gerinnungszeit wurde aufgezeichnet. Es wurde gezeigt, daß die Aktivität des rekombinanten Materials im wesentlichen dieselbe wie die des natürlich auftretenden Proteins C ist.
Protein C, das durch transfizierte BHK- und 293-Zellen produziert wurde, wurde weiterhin durch Western blotting analysiert. Medienproben wurden auf denaturierten Gelen der Elektrophorese unterworfen, und Flecken wurden präpariert und mit radiomarkiertem Antikörper auf Protein C sondiert. Die Ergebnisse zeigten, daß ungefähr 20 % des Proteins C aus BHK- Zellen in der zweikettigen Form war, während etwa 90 % dessen aus 293-Zellen in die zweikettige Form verarbeitet worden war. TABELLE 2 TRANSITORISCHE EXPRESSION UND ABSONDERUNG VON PROTEIN C IN COS-1- UND 293-ZELLEN Zellen Plasmid ng/ml Protein C im Medium keines

Beispiel 6

Expression von aktiviertem Protein C

Die cDNA-Sequenz für Protein C wurde durch stellenspezifische Mutagenese geändert, um den Abschnitt auszulöschen, der das Aktivierungspeptid kodiert. Die geänderte Sequenz wurde dann in BHK- und 293-Zellen transfiziert, und stabil transfizierte Stellen wurden ausgewählt. Aktives Protein C wurde in Kulturmedienproben aus beiden Zellinien entdeckt.
Um die Kodierungssequenz für das Aktivierungspeptid zu löschen, wurde Plasmid p594 mit Sst I digeriert und das 880 pb lange Fragment wurde gereinigt und in die Sst I- Stelle von M13mp10 eingefügt. Die 12 Aktivierungspeptid- Codone wurden durch Oligonukleotid-gesteuerte Löschmutagenese (Zoller und Smith, DNA 3: 479-488, 1984) entfernt, indem das mutagene Oligonukleotid 5'CTGAAACGACTCATTGAT3' verwendet wurde. DNA in replikativer Form wurde aus mutanten Phagenklonen präpariert und mit Sst I digeriert. Das Protein C- Fragment ( 840 bp) wurde isoliert und in Sst I-digeriertes p594 eingefügt. Die sich ergebenden Plasmide wurden auf richtige Orientierung des Sst I-Fragmentes durch Restriktionsabbildung unter Verwendung von Bgl II untersucht. Ein richtiges Plasmid wurde ausgewählt und mit pPC829 bezeichnet. Das Plasmid pPC829 wurde sequenziert, um die Anwesenheit der gewünschten Kodierungssequenz zu verifizieren.
Plasmid pPC829 wurde in BHC-Zellen (mit Plasmid pSVDHFR (Lee u. a., Nature 294: 228-232, 1981)) und 293-Zellen (mit pKO- neo (Southern und Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1: 327-341, 1982)) durch gemeinsame Ausfällung mit Calciumphosphat (Graham und van der Eb, Virology 52: 456-467, 1973) cotransfiziert. Nach 48 Stunden wurden die Kulturmedien geerntet und auf Protein C mittels ELISA geprüft. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Zur selben Zeit wurden die Kulturen 1:5 aufgeteilt in Medien, die 500 ug/ml G418 (293-Zellen) oder 250 mM Methotrexat (BHK-Zellen) enthalten. Nach 10 Tagen in Anwesenheit von Auswahlmedien wurden stabil transfizierte Kolonien auf Protein C-Filter mittels Immunofilter-Proben geprüft (McCracken und Brown, BioTechniques, 82-87, März/April 1984). Die Platten wurden mit PBS oder serumfreiem Medium (Dulbeccos plus Penicillin-Streptomycin, 5 ug/ml Vitamin K) gespült. Teflon -Gitter wurde dann über die Zellen gelegt. Nitrocellulosefilter wurden mit PBS oder serumfreiem Medium, wie geeignet, befeuchtet und über das Gitter gelegt. Nach einer vierstündigen Bebrütung bei 37ºC wurden die Filter entfernt und 30 Minuten lang bei Zimmertemperatur in Puffer A (50 mM Tris mit pH-Wert 7,4, 5 mM EDTA, 0,05 % NP-40, 150 mM NaCl, 0,25 % Gelatine) gelegt. Die Filter wurden eine Stunde lang bei Zimmertemperatur bebrütet, mit Schütteln, in Biotin-markiertem polyklonalem Antikörper auf Protein C vom Schaf, 1 ug/ml in Puffer A. Die Filter wurden dann in Puffer A gewaschen und eine Stunde lang bei Zimmertemperatur bebrütet, mit Schütteln, in Avidin-konjugierter Meerrettich-Peroxidase (Boehringer-Mannheim, 1:1000 in Puffer A. Die Filter wurden in Puffer B gewaschen, dann in H&sub2;O und in Farbreagenz (60 mg HRP Farbentwicklungsreagenz [Bio-Rad], 20 ml Methanol, 100 ul H&sub2;O&sub2; in 100 ml 50 mM Tris mit pH-Wert 7,4, 150 mM NaCl) bebrütet. Die Reaktion wurde beendet, indem man die Filter in H&sub2;O überführte.
Positive Kolonien wurden aufgenommen und in selektiven Medien (die 500 ug/ml G418 oder 250 mM Methotrexat, wie geeignet) 10 Tage lang gezüchtet. Die Kulturmedien wurden durch chromogene Prüfung auf APC-Aktivität geprüft. Medienproben wurden in Mikrotiter-Dellen gefüllt, die 100 ul 0,2 mM Spektrozym PCa (American Diagnostica #336) in 50 mM Tris mit pH-Wert 7,5, 150 mM NaCl enthalten. Platten wurden bei 37ºC bebrütet und die A405 in verschiedenen Zeitintervallen gemessen. Repräsentative Ergebnisse aus einer transfizierten 293-Zellinie (bezeichnet mit 829-20) sind in Figur 13 gezeigt. Medien positiver Kolonien der Linie 829-20 zeigten konsistent höhere Aktivität mit dem chromogenen Substrat für APC als Kontrollmedien, die mit nicht-transfizierten 293-Zellen für dieselbe Zeitdauer (10 Tage) bebrütet worden waren. TABELLE 3 TRANSITORISCHE EXPRESSION VON AKTIVIERTEM PROTEIN C (ELISA) Zellinie Protein C ng/ml in den Medien

Beispiel 7

Modifikation der Protein C-Verarbeitungsstelle

A. Stellenspezifische Mutagenese.

Um die Verarbeitung des einzelkettigen Proteins C in die zweikettige Form zu verbessern, wurden zwei zusätzliche Argininreste in das Protein eingeführt, was zu einer Schnittstelle führte, die aus vier basischen Aminosäuren bestand. Der sich ergebende mutante Präkursor des Proteins C wurde mit PC962 bezeichnet. Er enthält die Sequenz Ser-His-Leu-Arg-Arg-Lys-Arg-Asp an der Schnittstelle. Die Verarbeitung an der Arg-Asp-Bindung führt zu einem zweikettigen Protein C-Molekül.
Das mutante Molekül wurde erzeugt, indem man die geklonte cDNA durch stellenspezifische Mutagenese änderte (im wesentlichen wie bei Zoller und Smith, DNA 3: 479-488, 1984 für das Zwei-Starter-Verfahren beschrieben), indem das mutagene Oligonukleotid ZC962 (5'-AGTCACCTGAGAAGAAAACGAGACA3') verwendet wurde. Das Plasmid p594 wurde mit Sst I digeriert, und das ungefähr 87 bp lange Fragment wurde in M13mp11 geklont und einzelsträngige Matrix-DNA wurde isoliert. Im Anschluß an die Mutagenese wurde ein richtiger Klon durch Sequenzieren identifiziert. DNA in replikativer Form wurde isoliert, mit Sst I digeriert, und das Protein C-Fragment wurde in den Sst I-Schnitt p594 eingefügt. Klone, die das Sst I-Fragment in der gewünschten Ausrichtung eingefügt haben, wurden durch Restriktionsenzymabbildung identifiziert. Der sich ergebende Expressionsvektor wurde als pDX/PC962 (Figur 14) bezeichnet.

B. Expression und Kennzeichnung von Protein C.

Plasmid pDX/PC962 wurde in tk&supmin;-BHK-Zellen zusammen mit pSV2-DHFR transfiziert (Subramani u. a., Mol. Cell Biol. 1: 854-864m 1981) durch das Calciumphosphatverfahren (im wesentlichen wie bei Graham und van der Eb, ebd. beschrieben). Die transfizierten Zellen wurden in Dulbeccos modifizierten Eagle's Medium (MEM) gezüchtet, das 10 % fetales Kalbserum, 1X PSN antibiotische Mischung (Gibco 600-5640), 2,0 mM L-Glutamin und Vitamin K (5 ug/ml) enthielt. Die Zellen wurden in 250 nM Methotrexat (MTX) 14 Tage lang selektiert, und die sich ergebenden Kolonien wurden durch die Immunofilterprobe (Beispiel 6) ausgewählt. Sechs der am meisten intensiv reagierenden Kolonien wurden durch Zylinderklonen aufgenommen und einzeln in 10 cm-Platten gezüchtet. Als die Kulturen nahezu zusammenflossen, wurden die Protein C-Produktionswerte durch ELISA gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 angegeben. TABELLE 4 Klon Zellenanzahl (x 10-7) ELISA ng/ml pg/Zelle/Tag
Der Klon BHK/962-1 wurde in einer Kulturgröße größeren Maßstabes gezüchtet, und einige hundert Mikrogramm Protein C wurden durch Affinitätschromatographie in einer Säule gereinigt, die durch Koppeln von 7 mg polyklonalem Antikörper gegen menschliches Protein C vom Schaf an 2 Gramm CNBr- aktivierte Sepharose 4B (Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ) präpariert wurde. Das Zellkulturmedium wurde in die Säule gegeben, die Säule wurde mit 100 ml TBS gewaschen und das Protein C wurde mit TBS, das 3 M KSCN enthielt, oder mit Puffer mit einem pH-Wert von 11,5 herausgelöst. Western Blot-Analyse zeigte, daß das mutante Protein C zu ungefähr 95 % in der zweikettigen Form war, verglichen mit etwa 20 % zweikettigem Protein C, das aus BHK-Zellen erhalten wurde, das mit den ursprünglichen Sequenzen transfiziert worden war.
Milligrammengen Protein C wurden entweder aus stabilen BHK- Zellklonen, die das PC962-mutante Protein exprimieren, oder stabilen 293-Zellklonen, die das Wildtyp-Protein C exprimieren (p594-transfizierte Zellen) gereinigt, indem eine monoklonale Antikörpersäule verwendet wurde, die spezifisch für die calciuminduzierte Gestaltung von Protein C ist. Zellkulturmedien wurden in die Säule in Anwesenheit von 5 mM CaCl&sub2; gegeben, die Säule wurde mit TBS, das 5 mM CaCl&sub2; enthielt, gewaschen, und das Protein C wurde mit TBS, das 10 mM EDTA enthielt, herausgelöst. Die Verwendung dieses Reinigungsverfahrens erlaubte die Reinigung von vollständig aktivem Protein C, ohne es denaturierenden Bedingungen auszusetzen. Das gereinigte Protein C wurde durch SDS/PAGE, gefolgt von Silberfärbung analysiert, und es wurde gezeigt, daß es > 95 % rein ist.
Das BHK-erzeugte PC962-Protein wurde auf seine Fähigkeit geprüft, in eine Form aktiviert zu werden, welche sowohl amidolytische als auch antigerinnende Aktivitäten zeigt.
Affinitätsgereinigte Proteinproben wurden erschöpfend gegen TBS dialysiert, dann durch Bebrütung mit 0,1 Volumen von 1 Einheit/ml Protac C (American Diagnostica) bei 37ºC für eine Stunde aktiviert. Amidolytische Aktivität wurde gemessen, indem Teile der Aktivierungsmischung zu 100 ul 1 mM Protein C-Substrat (Spektrozyme PCa, American Diagnostica) in eine Mikrotiteröffnung gefüllt wurden und die Änderung in A405 über die Zeit unter Verwendung eines Mikrotiterplattenlesers gemessen wurde. Die antigerinnende Aktivität des aktivierten Proteins C wurde geprüft wie bei Sugo u. a. (ebd.) beschrieben. Es wurde gezeigt, daß das affinitätsgereinigte PC962- Protein voll aktiv sowohl in den amidolytischen und den antigerinnenden Proben war. Es wurde gezeigt, daß das Herauslösen aus der Antikörpersäule mit einem Puffer mit einem pH-Wert von 11,5 ein Protein mit höherer Aktivität liefert als das, das bei Verwendung von 3 M KSCN-Auslösung erhalten wurde.
Klonale Zellinien aus der pDX/PC962-Transfektion in BHK- Zellen wurden auch durch einen Prozeß begrenzter Verdünnung isoliert. Eine Platte MTX-selektierter Kolonien (ungefähr 300 Kolonien) wurde trypsiniert, gezählt und in Mikrotiterdellen mit einem Durchschnitt von 0,5 Zellen/Delle wieder auf die Platte gegeben. Diese wurden in selektiven Medien gezüchtet, die 250 nM MTX enthielten. Ungefähr 50 % der Dellen enthielten Kolonien. Dellen, die identifizierbare Kolonien (1-2 mm Durchmesser) enthielten, wurden mittels ELISA auf Protein C-Werte in dem Medium geprüft. Für diese Probe wurde frisches Medium in alle Dellen gefüllt, es konnte 75 Minuten lang brüten, wurde dann entfernt und geprüft. 5 Kolonien, die 75-Minuten-Akkumulationen von mehr als 50 ng/ml, entsprechend mehr als 1000 ng/ml/Tag) ergaben, wurden in 10 cm-Platten für eine Kultur auf größerem Maßstab aufgespalten. Die Protein C-Produktionswerte für diese Klone reichten von 1,1 bis 2,8 pg/Zelle/Tag.
Ein zweites Plasmid, bezeichnet mit PC229/962, wurde aufgebaut, indem die PC962-cDNA in das Plasmid Zem229 eingefügt wurde. Zem229 ist ein pUC18-basierender Expressionsvektor, der eine eindeutige Bam HI-Stelle zum Einfügen fremder DNA zwischen dem Mäuse-Metallothionein-I-Promotor und dem SV40- Transkriptionsterminator enthält. Zem229 enthält auch eine Expressionseinheit des SV40-Früh-Promotor, Mäuse-Dihydrofolat-Reduktasegens und des SV40-Terminators. Ein Eco RI- Fragment, das die PC962-cDNA von pDX/PC962 enthielt, wurde mit Eco RI-Bam HI-synthetischen Oligonukleotidadaptoren an Zem229 gebunden, das mit Bam HI geschnitten und mit Phospatase behandelt worden ist. Der sich ergebende Vektor ist PC962/229, dargestellt in Figur 14.
Das Plasmid PC962/229 wurde in BHK-Zellen durch das Calciumphosphatverfahren transfiziert. Die Zellen wurden in Dulbeccos MEM, das 10 % fetales Kalbserum und 5 ug/ml Vitamin K enthielt, kultiviert. Der 48-stündige transitorische Expressionslevel aus dieser Transfektion war ungefähr 25 ng/ml. Nach 2 Tagen wurden die transfizierten Zellen in selektive Medien aufgeteilt, die 250 nM MTX enthielten und für weitere 14 Tage kultiviert. Drei Platten aus dieser Transfektion, die jeweils ungefähr 200 Kolonien enthielten, wurden durch die Immunofilterprüfung geprüft, und die 24 am intensivsten reagierenden Kolonien wurden durch Zylinderklonen aufgenommen. Diese wurden einzeln auf 10 cm-Platten gezüchtet, und ihre Protein C-Produktionswerte wurden gemessen. Kolonien, die zwischen 1,1 und 2,3 pg/Zellen/Tag produzierten, wurden für die Herstellung stabiler Protein C-produzierender Zellinien verwendet.
Der Expressionsvektor pDX/PC962 und das Plasmid pKO-neo wurden zusammen durch das Calciumphosphatverfahren in 293- Zellen transfiziert. Transfizierte Zellen wurden nach 48 Stunden in Medien aufgeteilt, die 500 ug/ml G418 enthielten. Nach 10 Tagen in selektiven Medien wurden Immunofilterproben durchgeführt und 2 Klone wurden durch Zylinderklonen aufgenommen. Es wurde gefunden, daß die Produktion von Protein C im Bereich von 1 bis 2 pg/Zellen/Tag lag. Die Kulturen wurden aufskaliert, und Protein C wurde durch Immunoaffinitätschromatographie gereinigt. Mehr als 95 % des Proteins C wurde in der zweikettigen Form gefunden.
Die Struktur des 962-mutanten Proteins, das aus BHK- und 293- Zellen präpariert worden war, wurde mit der des Wildtyp- Proteins C aus 293-Zellen und aus Plasma verglichen. Die Analyse durch SDS/PAGE gefolgt von Silberfärben zeigte, daß alle die rekombinanten Proteine schwere und leichte Ketten enthielten, die zusammen mit denen des Plasmaproteins wanderten. Das in 293-Zellen synthetisierte Wildtyp-Protein C enthielt eine beträchtliche Menge (ungefähr 20 %) einzelkettigen unverarbeiteten Proteins mit Mr = 66.000, wohingegen das mutante Protein, das in einem der Zelltypen produziert wurde, im wesentlichen vollständig in zwei Ketten verarbeitet war. Die N-Endstück-Sequenzanalyse zeigte, daß sowohl die leichte als auch die schwere Kette des rekombinanten Wildtyp- und des BHK/PC962-mutanten Proteins gut verarbeitet waren. Das Ausmaß der Gamma-Carboxylierung des rekombinanten Proteins wurde durch zwei unterschiedliche ELISA-Systeme gemessen. Das erste System erkennt sowohl gamma-carboxylierte und nicht-carboxylierte Formen des Proteins, während das zweite spezifische Antikörper benutzt, die nur Protein C erkennen, das eine gla-induzierte Gestaltungsänderung in der Anwesenheit von Calcium durchlaufen hat. Die Analyse zeigte, daß ungefähr 60 % des rekombinanten Proteins C, das in BHK- Zellen produziert worden ist, und 90 % bis 95 % desjenigen, das in 293-Zellen produziert worden ist, ausreichend gammacarboxyliert war, um durch die spezifischen Antikörper erkannt werden zu können.
Die drei rekombinanten Proteine wurden auch auf amidolytische und antigerinnende Aktivität analysiert, und die Ergebnisse wurden mit der Aktivität von Plasmaprotein C verglichen. Sowohl das PC962 aus BHK-Zellen und das Wildtyp-Protein C aus 293-Zellen zeigten volle amidolytische Aktivität. Bei der Antigerinnungsprobe hatte Protein C aus BHK-Zellen im wesentlichen die gleiche spezifische Aktivität wie Plasmaprotein C, während sowohl Wildtyp- als auch PC962-mutante Proteine aus 293-Zellen konsistent ungefähr 40 % größere spezifische Aktivität zeigten.

C. Modifikation der Verarbeitungsstelle des aktivierten Proteins C.

Eine DNA-Sequenz, die einen aktivierten Protein C-Präkursor mit der Verarbeitungsstellensequenz Arg-Arg-Lys- Arg kodiert, wurde durch Mutagenese der Wildtyp-Protein C- Sequenz aufgebaut. Die sich ergebende Sequenz war analog zu der in dem pPC829, es fehlte jedoch der Abschnitt, der das Aktivierungspeptid kodiert.
Die Protein C-Sequenz, die in dem Plasmid p594 vorliegt, wurde in einer einzigen Mutagenese geändert, um die Codone für das Aktivierungspeptid zu löschen und die Arg-Arg-Codone an den Verarbeitungsstellen einzufügen. Die Mutagenese wurde auf dem 870 bp langen Sst I-Fragment von p594 im wesentlichen wie im Beispiel 7A beschrieben durchgeführt, wobei ein Oligonukleotid verwendet wurde, das die Sequenz 5' CGC AGT CAC CTG AGA AGA AAA CGA CTC ATT GAT GGG 3' hatte.
Die mit einem Mutagen behandelte Sequenz wurde verwendet, um den Expressionsvektor pDX/PC1058 aufzubauen, und der Vektor wurde in BHK-Zellen wie in Beispiel 7B beschrieben cotransfiziert. Das Protein wurde auf einer Säule mit polyklonalen Antikörpern gereinigt, die mit Puffer mit einem pH- Wert von 11,5 auslöst.
Die Aktivität des 1058-Proteins wurde mit der des aktivierten Plasmaproteins C und des aktivierten PC962 verglichen. Plasmaprotein C und PC962 (5 g/ml) wurden durch zweistündige Behandlung mit 1/10 Volumen Protac C (American Diagnostica) aktiviert. Die antigerinnende Aktivität wurde geprüft, indem 50 l menschliches Plasma mit 50 l aktiviertem Protein C kombiniert und die Mischungen bei 38C 150 Sekunden lang bebrütet wurden. Zu dieser Mischung wurden 50 l aktiviertes Cephaloplastin (American Scientific Products, McGaw Park, IL) hinzugefügt, und die Mischung wurde bei 37ºC 300 Sekunden lang bebrütet. Einhundert ul 20 mM CaCl&sub2; wurden hinzugefügt, und die Gerinnungszeit wurde aufgezeichnet. Die Daten sind in Figur 15 dargestellt.

Beispiel 8

Verwendung der Faktor VII- und Prothrombin-Prä-Pro-Peptide zum Absondern von Protein C

Das Faktor VII-Prä-Pro-Peptid wurde gegen das Protein C-Prä- Pro-Peptid substituiert, in dem Bemühen, höhere Ausbeuten richtig verarbeiteten Proteins C zu erhalten. Diese Hybridaufbauten werden dann in geeignete Expressionsvektoren eingefügt und in Säugetierzellinien transfiziert.
Eine cDNA, die Faktor VII kodiert, ist beschrieben worden (Hagen u. a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 2412-2416, 1986). Der Klon λHVII565 weist die Kodierungssequenz für ein 38 Aminosäuren langes Prä-Pro-Peptid auf. Diese Kodierungssequenz wurde als ein Eco RI-Hha I-Fragment von 140 bp isoliert.
Die Protein C-Sequenz wurde aus p594 durch partielles Schneiden mit Sst I und vollständiger Verdauung mit Eco RI isoliert. Ein 1540 bp langes Fragment, das sich von der Sst I-Stelle bei Codon +7 zu der Eco RI-Stelle 3' zu der cDNA erstreckt, wurde isoliert.
Die Faktor VII- und Protein C-Sequenzen wurden dann mittels eines Oligonukleotid-Verbinders verbunden, der die kodierende Sequenz für die Aminosäuren -3 bis -1 des Faktor VII-Prä-Pro- Peptides und der Aminosäuren 1-8 des Proteins C vervollständigt. Der Verbinder wurde aus den zwei Oligonukleotiden mit den Sequenzen 5'CCGGCGCGCCAACTCCTTCCTGGAGGAGCT3' und 5'CCTCCAGGAAGGAGTTGGCGCGCCGGCG3' aufgebaut. Die beiden Oligonukleotide wurden aneinandergeheftet und, in einer vierteiligen Verbindung, mit der Faktor VII-Prä-Pro-Sequenz, Protein C-cDNA und pUC9 verbunden, die mit Eco RI geschnitten und mit bakterieller Alkalinphosphatase behandelt worden sind. Die gebundene DNA wurde verwendet, um E. coli (JM101) zu transformieren. Plasmid-DNA wurde präpariert und auf die Anwesenheit eines 1710 bp langes Eco RI-Fragmentes untersucht. Ein korrekter Klon wurde mit p7/C-10 bezeichnet.
Die Faktor VII/Protein C-Fusion wurde in 293-Zellen exprimiert. Die Eco RI-Einfügung aus Plasmid p7/C-10 wurde an das Eco RI-digerierte pDX gebunden. Der sich ergebende Expressionsvektor wurde verwendet, um 293-Zellen wie zuvor beschrieben zu co-transfizieren. 48-stündige Expressionswerte wurden durch ELISA geprüft und mit denen von 293-Zellen verglichen, die mit Wildtyp-Protein C-Expressionsaufbau transfiziert waren und mit untransfizierten Zellen. Resultate sind in Tabelle 5 angegeben. TABELLE 5 Protein Faktor VII/Protein C Wildtyp-Protein C Kontrolle
Die Prothrombin-Leadersequenz wurde aus den in Tabelle 6 aufgelisteten Sequenzen aufgebaut und an die reife Protein C- kodierende Sequenz angeschmolzen. Die Oligonukleotide wurden mit Kinase behandelt, indem 50 ng jedes Oligonukleotides mit einer Einheit T&sub4;-Kinase in 20 ul Kinasepuffer, der 1 mM ATP enthält, kombiniert wurden. Die Reaktion konnte sich bei 37ºC 30 Minuten lang fortsetzen, dann wurde die Mischung auf 65ºC 10 Minuten lang erhitzt, um die Kinase zu inaktivieren. TABELLE 6
Der Prothrombin-Leader wurde dann zusammengesetzt. Fünfzig ng Eco RI, Sst I-geschnittenes M13mp19 wurde mit 2,5 ng jeweils der mit Kinase behandelten Oligonukleotide in 20 ul 1x Ligasepuffer kombiniert, der 1 mM ATP und 4 Einheiten T&sub4;- Ligase enthielt. Die Mischung wurde 48 Stunden lang bei 15ºC bebrütet und in geeignete E. coli JM101-Zellen transformiert. Eine klare Platte wurde ausgewählt und Phagen-DNA wurde präpariert. DNA-Sequenzierung bestätigte, daß die korrekte Sequenz aufgebaut worden war.
Der Prothrombin-Leader wurde dann mit der Protein C-Sequenz verbunden. RF-DNA wurde aus dem Phagen-Klon präpariert, der den synthetisierten Leader enthielt, und ein 150 bp langes ECo RI-Sst I-Fragment wurde isoliert. Plasmid p594 wurde vollständig mit Eco RI digeriert und teilweise mit Sst I digeriert, und das 1540 bp lange Protein C-Fragment wurde wiedergewonnen Diese Fragmente wurden mit Eco RI-geschnittenem pDX verbunden, und die Verbindungsmischung wurde verwendet, um geeignete E. coli-HB101-Zellen zu transformieren. Plasmid-DNA wurde von den transformierenden Kolonien isoliert und durch Restriktionsverdauung analysiert, um zu bestätigen, daß die Fragmente in der korrekten Ausrichtung zusammengesetzt worden sind.
Aus dem Vorangegangenen wird verständlich sein, daß, obwohl spezifische Ausführungsformen der Erfindung hierin zu Zwecken der Erläuterung beschrieben worden sind, verschiedene Modifikationen gemacht werden können, ohne daß man sich von Gedanken und Umfang der Erfindung entfernt. Dementsprechend soll die Erfindung nicht beschränkt sein außer durch die angefügten Ansprüche.
Die Merkmale, die in der vorangegangenen Beschreibung, in den folgenden Ansprüchen und/oder in den beigefügten Zeichnungen offenbart sind, können, sowohl einzeln als auch in jeglicher Kombination, für die Ausführung der Erfindung in ihren unterschiedlichen Formen wesentlich sein.

Claims

1. DNA-Sequenz, die für ein Protein kodiert, das im wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie menschliches Protein C oder menschliches aktiviertes Protein C besitzt, wobei besagte Sequenz außerdem für die Aminosäuresequenz (R1)n-R2-R3-R4 kodiert, in der R1, R2, R3 und R4 Lys oder Arg sind und n=0, 1, 2 oder 3, anstelle des nativen Lys-Arg- Dipeptids an der Schnittstelle zwischen der leichten und der schweren Kette.

2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, wobei besagte Aminosäuresequenz Arg-Arg-Lys-Arg ist, an der Schnittstelle zwischen der leichten und der schweren Kette.

3. DNA-Sequenz, die für ein Protein kodiert, das im wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie menschliches Protein C oder menschliches aktiviertes Protein C besitzt, wobei besagtes Protein außerdem den Ersatz von Rest 158 durch einen nicht-sauren Aminosäurerest einschließt, der ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Ala, Ser, Thr und Gly besteht.

4. DNA-Sequenz, die für ein Protein kodiert, das im wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie menschliches Protein C oder menschliches aktiviertes Protein C besitzt, wobei besagtes Protein außerdem den Ersatz von Rest 154 durch einen basischen Aminosäurerest einschließt, der ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Lys oder Arg besteht.

5. DNA-Sequenz, die für ein Protein kodiert, das im wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie menschliches Protein C oder menschliches aktiviertes Protein C besitzt, wobei besagtes Protein außerdem den Ersatz von Lys-Arg an den Resten 156-157 durch Lys-Lys oder Arg-Arg einschließt.

6. Expressionsvektor, der zur Integration in Säugetier- Wirtszell-DNA in der Lage ist, wobei besagter Expressionsvektor einen Promotor einschließt, stromabwärts gefolgt von einer DNA-Sequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei besagter DNA-Sequenz stromabwärts ein Polyadenylierungssignal folgt, wobei Transkription der DNA- Sequenz von dem Promotor bestimmt wird.

7. Säugetierzellen, transfiziert mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 6.

8. Zellen nach Anspruch 7, wobei besagte Zellen ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus COS-, BHK-, Ratten-Hep I-, Ratten-Hep II-, TCMK-, menschlichen Lungen-, menschlichen Hepatom-, Hep G2-, Mäuseleber-, DUKX- und 293-Zellen besteht.

9. Verfahren zur Herstellung eines Proteins, das, bei Aktivierung, im wesentlichen dieselbe Struktur und/oder biologische Aktivität wie menschliches aktiviertes Protein C besitzt, umfassend:

Einführen eines Expressionsvektors nach Anspruch 6 in eine Säugetier-Wirtszelle;

Züchten besagter Säugetierzelle in einem geeigneten Medium; und

Isolieren des Proteinproduktes, das von besagtem Expressionsvektor kodiert und von besagter Säugetier- Wirtszelle produziert wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei besagte Zelle ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus der COS-, BHK-, Ratten-Hep I-, Ratten-Hep II-, TCMK-, menschlichen Lungen-, menschlichen Hepatom-, Hep G2-, Mäuseleber-, DUKX- und 293- Zellen besteht.

11. Verfahren zur Herstellung eines Proteins, das, bei Aktivierung, im wesentlichen dieselbe Struktur und/oder biologische Aktivität wie menschliches aktiviertes Protein C besitzt, umfassend:

Einführen eines Expressionsvektors der zur Integration in BHK-Wirtszell-DNA in der Lage ist, in eine BHK-Wirtszelle wobei besagter Expressionsvektor einen Promotor einschließt, stromabwärts gefolgt von einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1, 4 oder 5, wobei besagter DNA-Sequenz stromabwärts ein Polyadenylierungssignal folgt, wobei Transkription der DNA-Sequenz durch den Promotor bestimmt wird;

Züchten besagter BHK-Wirtszelle in einem geeigneten Medium; und

Isolieren des Proteinprodukts, das von besagter DNA-Sequenz kodiert und von besagter BHK-Wirtszelle produziert wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, welches weiter umfaßt, daß, mit besagtem Expressionsvektor, ein selektierbarer Marker in die Wirtszelle eingeführt wird.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, welches weiter den Schritt umfaßt, daß das Proteinprodukt aktiviert wird, um ein Protein zu produzieren, das im wesentlichen dieselbe biologische Aktivität wie menschliches aktiviertes Protein C besitzt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Aktivierungsschritt das Schneiden des Proteinproduktes mit einer Protease umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Alpha-Thrombin, Trypsin und Venenum-Aktivatoren besteht.