DE3751099T3

DE3751099T3 - Gegen Viren resistente Pflanzen mit einem viralen Überzugsprotein.

Info

Publication number: DE3751099T3
Application number: DE3751099T
Authority: DE
Inventors: Nancy P. Jarvis; Sue Loesch-Fries; Donald J. Merlo
Original assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Current assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Priority date: 1986-04-02
Filing date: 1987-04-01
Publication date: 2001-08-02
Anticipated expiration: 2007-04-02
Also published as: ES2068811T3; GR3015892T3; EP0240331B2; EP0240331B1; ES2068811T5; AU616635B2; NZ219835A; JPS62285791A; EP0240331A3; EP0240331A2; AU7093487A; US5736627A; ATE119201T1; DE3751099D1; DE3751099T2

Description

GEBIET

Die vorliegende Erfindung betrifft die Gebiete des Genetic Engineering und des Pflanzenackerbaus und stellt insbesondere ein Mittel zum Herstellen einer Virus-resistenten Pflanze zur Verfügung, indem eine Pflanze so transformiert wird, daß sie ein Pflanzen-exprimierbares Fremdgen enthält, welches die Synthese eines viralen Hüllproteins lenkt. Es werden auch Pflanzen-transformierende, prokaryotische Plasmidvektoren, welche eine solche Pflanzen-exprimierbare RNA tragen, und Pflanzenzellen, die mit einem solchen Vektor transformiert sind, zur Verfügung gestellt.

HINTERGRUND

Überblick über Agrobacterium

Virulente Stämme des gram-negativen Gattung von Agrobacterium beherbergen große Plasmide, die als Ti-(Tumor- oder Transformation-induzierende)-Plasmide in A. tumefaciens und Ri-(Wurzelinduzierende)-Plasmide (pRi) in A, rhizogenes bekannt sind, welche oft durch das Opin klassifiziert werden, welches sie katabolisieren oder dessen Synthese sie verursachen. Ti- und Ri-Plasmide enthalten beide DNA-Sequenzen, die als T-DNA (übertragene DNA) bekannt sind, von welchen gefunden wurde, daß sie in Tumoren in das Genom der Host-Pflanze integriert sind. Einige T-DNA-Gene sind unter der Kontrolle von T-DNA-Promotoren, welche kanonischen, eukaryotischen Promotoren in der Struktur ähneln. Die Plasmide tragen auch Gene außerhalb des T-DNA-Bereiches. Ti- und Ri-Plasmide sind für viele Zwecke funktionell äquivalent.
Übersichten über durch Agrobacterium verursachte Krankheiten, Pflanzen-Transformation, Genetic Engeneering und Genexpression sind z. B. solche, die zu finden sind in: Merlo DJ (1982) Adv. Plant Pathol. 1: 139-178; Ream LW und Gordon MP (1982) Science 218: 854-859; Bevan MW und Chilton M-D (1982) Arm. Rev. Genet. 16: 357-384; Kahl G und Schell J (1982) Molecular Biolö~y of Plant Tumors; Barton KA und Chilton M-D (1983) Meth. Enzymol. 101: 527-539; Depicker A et al. (1983) in Genetic Engineering of Plants an Agricultural Perspective, Hrsg.: Kosuge T 44. S. 143- 176; Caplan A et al. (1983) Science 222: 815-821; Hall TC et al., Europäische Patentanmeldung 126,546; Binns AN (1984) Oxford Surveys Plant Mol. Cell Biol. 1: 130-160; Hall TC (1985) Oxford Surveys Plant Mol. Biol. 2: 329-338; Hooykaas PJJ und Schilperoort RA (1985) Trends Biochem. Sci. 10: 307-309; Thomas TL und Hall TC (1985) Bioassays 2: 149-153; Weissbach A und Weissbach H, Hrsg. (1986) Meth. Enzymol. 118 (siehe insbesondere Rogers SG et al., S. 627-640); Pühler A, hsg. (1983) Molecular Genetics ofthe Bacteria-Plant Interaction; und Schilperoort RA (1984) in Efficiency in Plant Breeding (Proc. 10. Congr. Eur. Assoc. Res. Plant Breeding), Hrsg.: Lange W et al., S. 251- 285.

Transformation von Pflanzen mittels Agrobacterium

Pflanzenzellen können durch Agrobacterium mit mehreren Verfahren, die im Stand der Technik gut bekannt sind, transformiert werden. Für einen Überblick über die jüngste Arbeit, siehe Syono K (1984) Oxford Surveys Plant Mol. Cell Biol. 1: 217-219.
Die Infektion von Pflanzengewebe mit Aarobacterium ist eine einfache Technik, die den Fachleuten des Standes der Technik gut bekannt ist. Typischerweise wird nach einer Verwundung eine Pflanze mit einer Suspension des Bakteriums inokuliert. Alternativ werden Gewebestücke, z. B. Blattscheiben, inokuliert (Horsch RB et al. (1985) Science 227: 1229-1231). Nach einer Induktion mit Agrobacterium des Wildtypus sind die Tumoren zu einem Phytohormon-unabhängigen Wachstum fähig. Es können traditionelle Inokulierungs- und Kultivierungstechniken zur Anwendung von disarmierten T- DNA-Vektoren verwendet werden, welche Vektoren zu einem Hormon-unabhängigen Wachstum nicht fähig sind (z. B. siehe Zambryski P et al. (1984) in Genetic Engineering, Principles and Methods, 6, Hrsg.: Hollaender A und Setlow J, S. 253-278).
Agrobacterium ist auch in der Lage, isolierte Zellen, in einer Kultur gewachsene Zellen, Callus- Zellen und isolierte Protoplasten zu infizieren (z. B. Fraley RT et al. (1984) Plant Mol. Biol. 3: 371-378; Fraley RT und Horsch RB (1983) in Genetic Engineering of Plants: an Aaricultural Perspective, Hrsg.: Kosuge T et al. S. 177-194; Muller A et al. (1983) Biochem. Biophys. Res. Comm. 123: 458462). Die Transformationsfrequenz von inokulierten Callusstücken kann durch Zugabe eines Opins oder von Opin-Vorstufen gesteigert werden (Cello LM und Olsen WL, 115.-Patent 4,459,355).
Der Host-Bereich der Kronengallpathogenese kann durch T-DNA-kodierende Funktionen, wie z. B. onc-Gene, beeinflußt werden (Hoekama A et al. (1984), J. Bacteriol. 158: 383-385; Hoekama A et al. (1984) EMBO J. 3: 3043-3047; Buchholz WC und Thomasshow MF (1984) 160: 327-332; Yanofsky M (1985) Mol. Gen. Genet. 201: 237-246). Vir-Gene beeinflussen auch den Hastbereich (Yanofsky, supra). Ausich RL, Europäische Patentanmeldung 108,580, berichtet über einen Transfer von T-DNA von A. tumefaciens zu Grünalgenzellen und die Expression darin von ocs- und Tn5-Kanamycin-Resistenzgenen. Hooykaas-von Slogteren GMS et al. (1984) Nature 311: 763-764 und Hernalsteens J-F et al. (1984) EMBO J. 3: 3039-3041 haben die Transformation von Monocot-Zellen durch Aurobacterium ohne die gewöhnliche Tumorgenese gezeigt.
T-DNA, disarmierte T-DNA und funktionelle Fremdgene von transformierten Pflanzen werden gewöhnlich durch Meiose anscheinend unverändert auf eine dominante, eng-verbundene, Mendelsche Art auf Nachkommen übertragen (z. B. siehe Horsch RB et al. (1984) Science 223: 496-498; Tepfer D (1984) Cell 37: 959-967; Deßlock M et al. (1984) EMBO J. 3: 1681-1689; Wöstemeyer A et al. (1984) Mol. Gen. Genet. 194: 500-507; Wallroth M et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 202: 6-15). Zwei unverbundene T-DNAs können eine einzelne Zelle transformieren, und sich, nach der Pflanzenregeneration, in die F1-Generation aufspalten (de Framond AJ et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 202: 125-131).

Ti-Plasmid-DNA

T-DNA ist oft in Host-DNA an mehreren Stellen im Kern integriert (d. h. inseriert). Flankierende Pflanzen-DNA kann entweder wiederholt oder eine Sequenz mit niedriger Kopierzahl sein. Integrierte T-DNA kann entweder in direkten oder in invertierten Tandemarrays gefunden werden und kann durch Spacer getrennt sein. T-DNA kann auch Chloroplasten transformieren (De Block M et al. (1985) EMBO J. 4: 1367-1372; siehe Übersicht von Flavell RB (1985) Bioassays 3: 177-178).
Die vollständige Sequenz der T-DNA eines Plasmids vom Octopin-Typus, gefunden in ATCC 15955, p1i15955, wurde berichtet (Barker RF et al. (1983) Plant Mol. Biol. 2: 335-350), und zwar daß sie den TL-Bereich von pTiAchS aufweist (Gielen J et al. (1984) EMBO J. 3: 835-846). Publizierte T- DNA-Gene enthalten keine Introne. Sequenzen, welche kanonischen, eukaryotischen Promotorelementen und Polyadenylierungsstellen ähneln, können erkannt werden.
Octopin-Ti-Plasmide tragen ein ocs-Gen, welches die Octopin-Synthase (Lysopin-Dehydrogenase) kodiert. Koncz C et al. (1983) EMBO J. 2: 1597-1603 sieht eine funktionelle Analyse von ocs vor. Dhaese P et al. (1983) EMBO J. 2: 419-426 berichteten die Verwendung verschiedenster Polyadenylierungsstellen durch "Transkript 7" (ORF3 von Barker R et al., supra und ocs. Die Anwesenheit des Enzyms Octopin-Synthase innerhalb eines Gewebes kann dieses Gewebe vor der toxischen Wirkung verschiedener Aminosäureanaloga, z. B. Aminoethylcystein, schützen (Dahl GA und Tempe J (1983) Iheor. Appl. Genet. 66: 233-239; Koziel MG et al. (1984) J. Mol. Appl. Genet. 2: 549-562). Nopalin-Ti-Plasmide kodieren das Nopalin-Synthase-Gen (nos (sequenziert von Depicker A et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1: 561-573). Shaw CH et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12: 7831-7846, stellt eine funktionelle Analyse von nos zur Verfügung. Gene, die zu Uns und tmr äquivalent sind, sind auf einem Plasmid vom Nopalin-Typus identifiziert worden (Willmitzer L et al. (1983) Cell 32: 1045- 1056).
Ti- und Ri-Plasmid-Gene außerhalb des T-DNA-Bereiches sind z. B. die vir-Gene, welche, wenn sie mutiert sind, ein avirulentes Ti-Plasmid ergeben. Die vir-Gene wirken in trans, wobei sie in der Lage sind, die Transformation von Pflanzenzellen mit T-DNA eines anderes Plasmid-Typus zu verursachen und physisch auf einem anderen Plasmid angeordnet sind. Solche Anordnungen sind als binäre Systeme bekannt, und die T-DNA-tragenden Plasmide sind als Micro-Ti-Plasmide allgemein bekannt. Geoffenbarte binäre Systeme und Micro-Ti-Plasmide sind z. B. die folgenden: Hoekama A et al. (1985) Plant Mol. Biol. 5: 85-89; Deblaere R et al. (1985) Nucl. Acids Res. 13: 47774788; von den Elzen P et al. (1985) Plant Mol. Biol. 5: 149-154; Anderson DM, U. S. -Patent 4,536,475; de Framond AJ et al. (1983) Biotechnol. 1: 262-269; Hoekama A et al. (1983) Nature 303: 179-180; Hille J et al. (1984) J. Bacteriol. 158: 754-756; Hoekama A et al. (1984) J. Bacteriol. 158: 383-385; An G et al. (1985) EMBO J. 4: 277- 284; Anderson DM, U. S. -Patent 4,536,475; Klee HJ et al. (1985) Biotechnol. 3: 637-642); de Framond AJ et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 202: 125-131; Dahl GA et al., Europäische Patentanmeldung 140,556; und Bevan M (1984) Nucl. Acids Res. 12: 8711-8721. T-DNA braucht nicht auf einem Plasmid sein, um eine Pflanzenzelle zu transformieren; chromosomisch angeordnete T-DNA ist funktionell (Hoekama A et al. (1984) EMBO J. 3: 2485-2490). T-DNA besitzt direkte Repeats mit etwa 25 Basenpaaren, die mit den linken und rechten Rändern, d. h. mit den T-DNA/Pflanzen-DNA-Verbindungen, assoziiert sind, welche entweder im Transfer von Agrobacterium oder in der Integration in das Host- Genom beteiligt sein können. Ti-Plasmid-determinierte Eigenschaften sind von Merlo, supra (siehe insbesondere Tabelle II) und von Ream und Gordon, supra, überblicksmäßig zusammengefaßt worden.

Fremd-Gen-Expression

Ein Gen, welches Bohnenphaseolin kodiert, wurde in Sonnenblumentumoren transferiert und exprimiert (Murai N et al. (1983) Science 222: 476-482). Das Phaseolin-Gen wurde mit einem hohen Pegel in sich entwickelnden Tabaksamen exprimiert (Sengupta-Gopalan C et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3320-3324). Ähnliche Ergebnisse sind mit einem homologen Gen, Sojabohnen-beta- Conglycinin (Beachy RN et al. (1985) EMBO J. 4: 3047-3053) beobachtet worden. Ein Gen für das Endospermprotein Zein aus dem Monocot. Zea mavs, wird in Sonnenblumencallus transkribiert (Matzke MA et al. (1984) EMBO J. 3: 1525-1531). Die Expression eines kleinen Erbsen-RuBP-Case Untereinheitgens ist in transformierten Petunia-Zellen Licht-reguliert; das kleine Erbsen-Untereinheitsprotein, welches hergestellt wird, wird in Chloroplasten richtig verarbeitet und innerhalb von Chloroplasten maskiert (Broglie R et al. (1984) Science 224: 838-843). Sequenzen, die an dieser Licht-Indizierbarkeit beteiligt sind, und solche, die für eine maximale Expression gebraucht werden, wurden identifiziert (Morelli G et al. (1985) Nature 315: 200-204; Nagy F. et al. (1985) EMBO J. 4: 3063-3069; Tiniko MP et al. (1985) Nature 318: 579-582). Die Expression eines Chlorophyll alb-Bindungsprotein- Gens vom Weizen ist Licht-reguliert und organspezifisch, und zwar in transformierten Tabakpflanzen (Lamppa G et al. (1985) Nature 316: 750-752). Ein Sojabohnen-Wärmeschock-Gen ist in Sonnenblumengewebe thermisch induzierbar (Schöffl F und Baumann G (1985) EMBO J. 4: 1119-1124). (Ein Wärmeschock-Promotor von Drosophila melanogaster ist in Tabakgewebe auf ähnliche Weise funktionell (Spena A et al. (1985) EMBO J. 4: 2739-2743).)

Chimere Gene mit T-DNA-Promotoren

Der nos-Promotor kann die Expression von Arzneimittel-Resistenz-Strukturgenen, die für eine Selektierung von transformierten Pflanzenzellen brauchbar sind, vorantreiben. Resistenz-Gene wurden für Kanamycin (Bevan MW et al. (1983) Nature 304: 184-187; Fraley RT et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 48034807; Herrera-Estrella L et al. (1983) EMBO J. 2: 987-995), Methotrexat (Herrera-Estrella et al., supra), Chloramphenicol (Herrera-Estrella L et al. (1983) Nature 303: 209- 213), Hygromycin B (von den Elzen PJM et al. (1985) Plant Mol. Biol. 5: 299-302) geschaffen. Helmer G et al. (1984) Biotechnol. 2: 520-527, haben ein Fusions-Gen geschaffen, welches den Promotor und das 5'-Ende des Struktur-Gens von nos, fusioniert mit Beta-Galactosidase-(lacZ)-Sequenzen, aufweist. Pflanzengewebe, welche mit diesem "screenbaren" Marker transformiert sind, können mit einer charakteristischen Farbe erkannt werden, wenn die Gewebe auf dem geeigneten chromogenen Substrat gezüchtet werden.
Fusionsprotein-Gene zwischen dem ocs-Strukturgen, welches ebenso Promotoren zur Verfügung stellte, und Strukturgenen für Resistenz gegenüber Hygromycin B und für Phaseolin wurden geschaffen und sind funktionell (Waldron C et al. (1985) Plant Mol. Biol. 5: 103-108; Murai N et al. (1983) Science 222: 476-482). Ein mit ocs vorangetriebenes Glyphosat-Gen wurde konstruiert (Comai L et al. (1985) Nature 317: 741-744).
Promotoren für Octopin-TL-Gene ORF24 und ORF25 konnten die Strukturgen-Expression auch vorantreiben (Velten J et al. (1984) EMBO J. 3: 2723-2730; Velten J und Schell J (1985) Nucl. Acids Res. 13: 6981-6998; Gelvin SB et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199: 240-248; Comai L etal. (1985) Nature 317: 741-744).

Chimere Gene mit Pflanzenpromotoren

Ein chimeres RuBP-Case-kleine Untereinheit/Kanamycin-Resistenzprotein wurde in den Chloroplast translociert (Van den Broeck G et al. (1985) Nature 313: 358-363). Der Promotor dieses Gens verleiht eine Licht-induzierbare Expression im Callus den Chloramphenicol- und Kanamycin-Resistenz- Genen (Herrera-Estrella L et al. (1984) Nature 310: 115-120; Facciotti D et al. (1985) Biotechnol. 3: 241-146). Ein Chalcon-Synthasepromotor trieb die Licht-induzierbare Expression eines Kanamycin- Resistenzgens auch voran (Kaulen H et al. (1986) EMBO J. 5: 1-8). Chlorophyll a/b-Bindungsprotein- Promotoren wurden verwendet, um die Expression von ocs und Kanamycin-Resistenz-Strukturgen voranzutreiben (Jones JDG et al. (1985) EMBO J. 4: 2411-2418; Simpson J et al. (1985) EMBO J. 4: 2723-2729).

Chimere Gene mit viralen Promotoren

Ein Kanamycin-Resistenzgen unter der Kontrolle eines Blumenkohl-Mosaikvirus-(CaMV)- Promotors wurde in Pflanzenzellen exprimiert, die mit T-DNA transformiert waren (Koziel MG et al. (1984) J. Mol. Appl. Genet. 2: 549-562). Ein Methotrexat-Resistenzgen hinter dem CaMV 35S-Promotor verlieh eine Methotrexat-Resistenz (Brisson N et al. (1984) Nature 310: 511-514). Das Hüllprotein des Tabak-Mosaikvirus wurde in transformiertem Tabakgewebe unter der Kontrolle eines CaMV-Promotors exprimiert (Bevan MW et al. (1985) EMBO J. 4: 1921-1926). Odell JT et al. (1985) Nature 313: 810-812 haben Sequenzen des CaMV 355-Promotors, die für eine Transkription gebraucht werden, kartiert.

Transformation von Pflanzen ohne Agrobacterium

Der direkte Transfer von DNA in Pflanzenzellen wurde kürzlich überblicksmäßig dargestellt (Jones MGK (1985) Nature 317: 579-580; Potrykus I et al. (1985) Plant Mol. Biol. Reptr. 3: 117-128; Howe C (1985) Trends Genet. 1: 38-39; Paszkowski J und Saul MW (1986) Meth. Enzymol. 118: 659- 668; Power JB et al. (1986) Meth. Enzymol. 118: 578-594). Sowohl Dicot- als auch Monocot-Zellen können unter Kontrolle von entweder einem nos oder einem CaMV-Promotor durch Kanamycin-selektierbare Marker direkt transformiert werden (Paszkowski J et al. (1984) EMBO J. 3: 2717-2722; Gardner RC et al. (1984) Plant Mol. Biol. Reporter 2: 3-8; Hain R et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199: 161- 168; Potrykus I et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199: 183-188; Lörz H et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199: 178-182; Shillito RD et al. (1985) Biotechnol. 3: 1099-1103; Meyer P. et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 210: 513-518). Bestimmte DNA-Moleküle können in eine Pflanzenzelle cotransformiert werden; es ist vorteilhaft, daß eine DNA im Gemisch einen selektierbaren Marker trägt (Peerbolte R et al. (1985) Plant Mol. Biol. 5: 235-246). Abkömmlinge von Pflanzen, die von solchen transformierten Zellen gezüchtet wurden, erben das transformierte Hybrid-Gen als ein einzelnes, dominates, Mendelsches Merkmal (Potrykus et al., Mol. Gen. Genet., supra).
CaMV hat sich als ein Pflanzen-Transformationsvektor brauchbar erwiesen (Brisson N et al. (1984) Nature 310: 511-514; Brisson N und Hohn T (1986) Meth. Enzymol. 118: 659-668). Bromgras- Mosaikvirus (BMV), ein RNA-Virus, kann auch in Pflanzen verwendet werden, um fremde Strukturgene zu exprimieren (French R et al. (1986) Science 231: 1294-1297).
Die Elektroporation hat sich zum Einbringen von chimeren Genen in Pflanzenzellen in einem transienten Expressionssystem (Fromm M et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5824-5828) und für eine stabile Transformation von Maiszellen (Fromm ME et al. (1986) Nature 319: 791-793) als nützlich erwiesen.
Zellen können DNA aufnehmen, die von Membranen umgeben ist. DNA, einschließlich ph- DNA, kann via Liposomen (z. B. Deshayes A et al. (1985) EMBO J. 4: 2731-2737) oder durch Fusion von Pflanzen und Bakterienzellen nach Entfernung ihrer jeweiligen Zellwände (z. B. Hain R et al. (1984) Plant Cell Rept. 3: 60-64) eingebracht werden. Pflanzen-Protoplasten können Agrobacterium-Zellen, denen die Zellwand genommen wurde, aufnehmen. T-DNA kann auf Gewebe, welches von fusionierten Protoplasten gezüchtet wurde, übertragen werden.
DNA kann in ein Pflanzengenom nach Microinjektion stabil integriert werden (Crossway A et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 202: 179-185).
Die Einbringung von DNA in Pflanzenzellen während einer Fertilisierung oder Bestäubung wurde für Korn und Baumwolle von Ohta Y (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 715-719, bzw. Zhou G-Y et al. (1983) Meth. Enzymol. 101: 433481 berichtet.

Überblick über AMV

Alfalfa-Mosaikvirus (AMV) ist einer einer Klasse von Pflanzenviren, welche ein dreiteiliges, einzelsträngiges, plussträngiges RNA-Genom aufweisen. Das Genom (ausschließlich der RNA-Subgenommoleküle) ist in drei RNA-Moleküle segmentiert. Diese Klasse schließt ein: die Alfalfa-Mosaikvirus-(AMV)-Gruppe, die Ilarviren, die Bromoviren, die Cucumoviren und die Hordeiviren (von Vloten- Doting L et al. (1981) Intervirol. 15: 198-203; Mattews REF (1982) Classiflcation and Nomenclature of Viruses. Die Genomsegmente sind in bazillenförmigen Teilchen unterschiedlicher Längen getrennt eingekapselt. Neben den drei genomischen RNA-Komponenten (RNA1, RNA2 und RNA3) wird eine vierte subgenomische RNA (RNA4) in Viruspräparationen gefunden. Ein Gemisch der drei Genom- RNAs ist zusammen mit einer kleinen Menge Hüllprotein oder seiner Messenger, RNA4, erforderlich, um eine Infektion zu initiieren (Bol JF et al. (1971) Virol. 46: 73-85).
Die vollständige Sequenz von AMV-RNA4 wurde geoffenbart (Brederode FT et al. (1980) Nucl. Acids Res. 8: 2213-2223). RNA4 besitzt eine Länge von 881 Nucleotiden. Der kodierende Bereich ist 660 Nucleotide (ohne das Initüenmgs- und Terminierungskodon), flankiert von einem 5'-untranslatierten Bereich aus 39 Nucleotiden und einem 3'-untranslatierten Bereich aus 182 Nucleotiden. Die Sequenz von RNA4 ist vorhanden im und angeordnet beim 3'-Ende von RNA3 (Gould AR und Symons RH (1978) Eur. J. Biochem. 91: 269-278).
Die vollständige Nucleotidsequenz von AMV-RNA3 wurde geoffenbart (Barker RF et al. (1983) Nucl. Acids Res. 11: 2881-2891). Ein 5'-nichtkodierender Bereich mit 240 Basen ist vor einem offenen Leserahmen (ORF) mit 903 Nucleotiden. Diesem ORF folgt ein intercistronischer Bereich mit 49 Basen und ein ORF mit 666 Nucleotiden, wobei dieser letztere ORF das AMV-Hüllprotein kodiert.
Dem Hüllprotein-Gen folgt eine 3-untranslatierte Sequenz mit 179 Basen. AMV-RNA4 ist identisch zu und wird bestimmt durch das 3'-Ende von RNA3, welches 36 Nucleotide des intercistronischen Bereiches aufweist, das Hüllprotein-Strukturgen und die 3'-untranslatierte Sequenz.
Die vollständige Nucleotidsequenz von AMV-RNA1 wurde geoffenbart (Gornelissen BJC et al. (1983) Nucl. Acids Res. 11: 1253-1265). RNA1 besitzt eine Länge von 3645 Nucleotiden und enthält einen ORF für ein Protein mit Mr 125.685, flankiert von einer 5'-untranslatierten Sequenz mit 99 Nucleotiden und einem 3'-untranslatierten Bereich mit 163 Nucleotiden.
Ein Vergleich der 3'-terminalen Sequenzen aller vier AMV-RNAs bringt eine außerordentliche Homologie zwischen den 3'-terminalen 140 bis 150 Nucleotiden zu Tage (Houwing CJ und Jaspars EMJ (1978) Biochem. 17: 2927-2933). Es sind etwa 20 Basensubstitutionen in den 145 3'-terminalen Nucleotiden der AMV-RNAs vorhanden, aber diese sind entweder in den Schleifen von über Basen gepaarten Strukturen angeordnet, oder wandeln A-U-Basenpaare zu G-C-Basenpaare in den Stielen der Haarnadeln der sekundären Struktur um (Koper-Zwarthoff EC et al. (1979) Nucl. Acids Res. 7: 1887- 1900).

Kreuzschutz

Kreuzschutz bezieht sich auf ein Phänomen, wobei eine Pflanze, welche mit einem Stamm eines Virus infiziert ist, auf eine Superinfektion mit einem Stamm eines verwandten Virus viel weniger empfindlich ist als eine nicht-infizierte Pflanze. Übersichten über Kreuzschutz, induzierten systemischen Schutz und über eine Wechselwirkung von Viren während der Infektion sind z. B. Fulton RW (1982) in Active Defense Mechanisms in Plants Hrsg.: Wood RKS, S. 231-245; Ross AF (1974) Acta Hort.
36: 247-260d; Dean RA und Kuc J (1985) Trends Biotechnol. 3: 125-129; und Sequeira L (1984) Trends Biotechnol. 2: 25-29. Kreuzschutz wurde für AMV gezeigt (Schmelzer K (1963) Phytopathol. Z. 46: 17- 52; "Schneeball-Mosaikvirus" ist ein Synonym für AMV).
Der Mechanismus des Kreuzschutzes kann mit einer Reihe von Hypothesen erklärt werden (siehe Ross, supra; Fulton, supra, und Sequeira, supra. Der Mechanismus braucht nicht für alle Viren gleich sein (z. B. siehe Fulton, supra, S. 240-241). Eine Hypothese besteht darin, daß das Vorhandensein eines Hüllproteins in einem Pflanzengewebe den Aufbau einer Infektion mit einem superinfizierenden Virus stört (de Zoeten GA und Fulton RW (1975) Phytopathol. 65: 221-222). Die Rolle des Hüllproteins im Kreuzschutz wurde jedoch nicht geklärt. Ein Beweis für diese Hypothese für den Kreuzschutz zwischen Stämmen des Tabak-Mosaikvirus (TMV) wurde präsentiert (Sherwoood JL und Fulton RW (1982) Virol. 119: 150-158). Ein anderer Beweis zeigt jedoch auf, daß das Hüllprotein beim TMV- Kreuzschutz nicht beteiligt ist (Sarkar S und Smitamana P (1981) Mol. Gen. Genet. 184: 158-159; Zaitlin M (1976) Phytopathol. 66: 382-383). Der Mechanismus für den Kreuzschutz von AMV-Stämmen und TMV-Stämmen braucht nicht der gleiche sein, da die Rolle des Hüllproteins bei der Infektion, die Virionstwkturen und die Natur der Wechselwirkungen Hüllprotein/Hüllprotein und der Wechselwirkungen Hüllprotein/Nucleinsäure für diese zwei Viren verschieden sind.
Pflanzenzellen, die mit einem Virus infiziert sind, enthalten natürlich Hüllproteinmoleküle, die in Virionen nicht eingebaut sind. Sequeira, supra, schlägt vor, daß, falls es sich erweist, daß das TMV- Hüllprotein beim Inhibieren eines Entmantelns von superinfizierenden Virionen beteiligt ist, es nützlich sein könnte, einen T-DNA-Vektor zu verwenden, um ein Pflanzen-exprimierbares Hüllprotein-Gen einzubringen. Bevan MW et al. (1985) EMBO J. 8: 1921-1926 verwendeten eine solche TMV-Hüllproteingen/Vektor-Kombination, um Tabakzellen zu transformieren. Obwohl niedrige Pegel an TMV-Hüllprotein in den transformierten Callusgeweben akkumuliert wurden, wurde ein Schutz vor einer Infektion durch TMV nicht berichtet. Informelle Berichte geben an, daß Tabakpflanzen, die mit einer ähnlichen Vektor/Gen-Kombination transformiert sind, einer TMV-Infektion gegenüber resistent sind (z. B. Bialy H und Klausher A (1986) Bioteclmol. 4: 96; Freeman K (Feb. 1986) Genet. Eng. News 6(2): 18).

Kurzfassung der Erfindung

Diese Erfindung betrifft das Auftreten viraler Infektionen in Pflanzen und die Bemühungen von Gärtnern und Landwirten, diese Infektionen in wirtschaftlich bedeutenden Pflanzenarten zu bekämpfen. Virusinfektionen treten in jeder bekannten Pflanzenart auf und verursachen beträchtliche Verringerungen in der Ernte und in der Qualität aller landwirtschaftlicher und gartenwirtschaftlicher Pflanzenarten. Die Pflanzenindustrie in keinem Land auf dieser Welt ist von einem solchen von Viren verursachten Schaden ausgenommen, und es ist keine konsistente Behandlung bekannt, solche viralen Infektionen zu behandeln oder solchen viralen Infektionen vorzubeugen. Es sind beispielsweise 90% der Cassava- Pflanzen in Kenia mit dem Cassava-Mosaikvirus infiziert, was zu einer geschätzten 75%igen Verringerung in der Ernte führt. Ein anderes Beispiel: in einer jüngsten viralen Epidemie in Ghana wurden mehr als einhundert Millionen Kakaobäume durch Infektion mit dem gequollenen Sprößlingsvirus verloren. Es könnten viele weitere Beispiele angegeben werden, die es offenkundig machen, daß virale Epidemien und Infektionen eine ungeheure ökonomische Bedeutung besitzen. Die Verringerung im Ertrag von Feldfrüchten ist auch für die ständig steigende menschliche Bevölkerung der Welt und für die chronische Unterernährung, die bereits existiert, relevant. Es ist daher klar, daß sowohl die Mittel zum Schaffen Virus-resistenter Pflanzengenotypen als auch der resultierenden Pflanzen selbst für eine Verbesserung der Fähigkeit dieser Welt, sich selbst zu ernähren, sehr nützlich sein würden.
Es wurde gezeigt, daß insbesondere das Alfalfa-Mosaikvirus ernste Abnahmen der Fruchternte verursacht. AMV infiziert Alfalfa und andere Jahresleguminosen. Dies ist ökonomisch wichtig; allein in den Vereinigten Staaten sind etwa 30 Millionen Acre mit Alfalfa bepflanzt. Alfalfa-Mosaikvirus verursacht auch ökonomisch bedeutende Krankheiten in Fruchtpflanzen, wie z. B. Pfeffer, Kartoffel, Sellerie, Erbsen und Bohnen. Alfalfa kann ein Qberwinterungs-Host sein, von welchem Blattläuse den Virus tragen. Die Krankheit wird auch von Alfalfa auf andere Arten von Fruchtpflanzen nach einem Aufbau eines Blattlausbefalls verbreitet. In vielen Fällen zeigen Pflanzen, die von AMV infiziert sind, keine Symptome und machen es schwierig, das Auftreten und die Verbreitung der Krankheit nachzuweisen. In anderen Fällen ist die Mosaik-Krankheit offenkundig, aber zu diesem Zeitpunkt hat sich der Virus praktisch sicher über einen großen Pflanzenbereich in einem Feld ausgebreitet.
Neben der Entfernung infizierter Pflanzen und der Verwendung von Insektiziden, die Blattläuse, welche den Virus übertragen, zu töten, gibt es keine praktischen Methoden, die zum Verhindern der Ausbreitung von AMV entwickelt wurden. Es ist daher klar, daß sowohl die Mittel zum Schaffen AMVresistenter Genotypen und der resultierenden Pflanzen für eine Steigerung der landwirtschaftlichen Produktivität einer Reihe von Pflanzen sehr nützlich sein würden.
Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Pflanzen zur Verfügung zu stellen, welche neue Virus-Resistenzgene aufweisen, und insbesondere Pflanzen zur Verfügung zu stellen, welche einer AMV-llnfektion gegenüber resistent sind. Für dieses Ziel werden Verfahren zum Schaffen von viralen Resistenzgenen, insbesondere von Hüllprotein-Genen, die eine virale Replikation inhibieren, zur Verfügung gestellt. Es werden auch Pflanzen, Pflanzenzellen, Pflanzengewebe und Pflanzensamen zur Verfügung gestellt, welche Hüllproteingene enthalten, welche für solche Pflanzenmaterialien, die einen viralen Resistenz-Phänötypus aufweisen, verantwortlich sind. Ferner werden auch DNA-Moleküle beschrieben, die zum Schaffen solcher virusresistenter Pflanzen brauchbar sind. Diese vorliegende Erfindung wird auch beispielhaft beschrieben, indem ein Hüllprotein-Gen, welches in ein translatierbares, das Alfalfa- Mosaikvirus-Hüllprotein kodierendes Transkript transkribiert ist, in Tabak eingebracht wird.
In der Natur enthalten Pflanzenzellen kein virales Hüllprotein, sofern sie nicht mit diesem Virus infiziert wurden. Infizierte Pflanzen enthalten vollständige virale Genome, und zwar zusätzlich zum Hüllprotein. Im allgemeinen wurden Pflanzenzellen nicht dazu gebracht, ohne eine virale Injektion ein Hüllprotein zu enthalten. Es wird angenommen, daß dies im Fall von AMV zutrifft, obwohl eine Ausnahme für diese Behauptung Pflanzen einschließen könnte, die transformiert sind, sodaß sie Pflanzenexprimierbare TMV-Hüllproteingene enthalten (siehe Kreuzschutz). Wie im Abschnitt Hintergrund über Kreuzschutz diskutiert, war es vor der vorliegenden Offenbarung ungewiß, ob ein Hüllprotein beim Verhindern einer Superinfektion von Pflanzen beteiligt war. Es war auch ungewiß, ob alle Beispiele eines Kreuzschutzes dem gleichen Mechanismus zuzuschreiben sind: Mit anderen Worten war es ungewiß, ob ein Schutz, der dem Vorhandensein eines Hüllproteins zuzuschreiben ist, einer Pflanze vor Infektion mit einem bestimmten Virus auf einen Schutz vor einer Infektion mit anderen, nichtverwandten Viren aufgrund des Vorhandenseins ihres Hüllproteins extrapoliert werden könnte.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die folgenden Definitionen werden gegeben, um Ungewißheiten ihrer gedachten Verwendung und ihres Umfangs in der Beschreibung und in den Ansprüchen zu beseitigen.
Promotor: Bezieht sich auf Sequenzen am 5'-Ende eines Strukturgens, welches an der Initiierung der Transkription beteiligt ist. Ein Pflanzen-exprimierbarer Promotor ist jeder Promotor, der die Transkription in mindestens einem Typus Pflanzenzelle in mindestens einem Entwicklungsstadium vorantreiben kann. Eukaryotische Promotorsequenzen werden üblicherweise an der Anwesenheit von DNA- Sequenzen erkannt, die der kanonischen Form 5'...TATAA...3' homolog sind, welche etwa 10-30 Basenpaare (Bp) 5' zur Stelle von DNA-Sequenzen, die das 5-Ende eines Transkripts kodieren (Kappenstelle), entfernt sind. Etwa 30 Bp 5' zu TATAA wird oft eine andere Promotorsequenz geflanden, welche an der Anwesenheit von DNA-Sequenzen erkannt wird, die der kanonischen Form 5'...CCAAT...3' homolog sind.
Transkript-Terminator: Bezieht sich auf jede Nukleinsäuresequenz, die in der Lage ist, die Position des 3'-Endes eines Transkripts zu bestimmen. Das DNA-Segment des Transkript-Terminators kann selbst ein Komposit von Segmenten sein, abgeleitet von einer Vielzahl von Quellen, und zwar natürlich vorkommend oder synthetisch, prokaryotisch oder eukaryotisch, und kann eine cDNA (mRNA: Messenger-RNA) sein, die von einer genomischen DNA oder von einer mRNA abgeleitet ist.
Transkript-Terminationsstellen sind z. B. Polyadenylierungsstellen und Stellen, welche das 3'-Ende von ribosomalen RNAs (rmAs), Transfer-RNAs (tRNAs) und nicht-polyadenylierten mRNAs bestimmen (z. B. Histon-mRNA; Krieg PA und Melton DA (1984) Nature 308: 203-206).
Eine Polyadenylierungsstelle ist eine Nukleinsäuresequenz, die mit einer Polyadenylierung eines Transkripts in Eukaryonten korreliert ist, d. h., nachdem transkriptionelle Terminations-"Schwänze" aus Polyadenylsäure dem 3'-Ende von niRNA-Vorstufen hinzugefügt worden sind. Polyadenylierungsstellen werden üblicherweise am Vorhandensein einer Homologie zur kanonischen Form 5'...AATAAA...3' erkannt, obwohl Variationen des Abstandes 5' zum 3'-Ende des Transkripts, teilweises "Durchlesen", und multiple kanonische Tandemsequenzen nicht unbekannt sind. Es scheint, daß DNA-Sequenzen zwischen 20 und 35 Bp stromabwärts des 3'-Endes von Transkripten notwendig sind (MeDevitt MA et al. (1984) Cell 37: 993-999). Es sollte erkannt werden, daß eine kanonische "Polyadenylierungsstelle" tatsächlich den Ort des 3'-Endes der mRNA und nicht die Polyadenylierung er se bestimmen kann (Proudfoot N (1984) Nature 307: 412-413; Birnstiel ML et al. (1985) Cell 41: 349-359).
Transkriptionskontrollierende Sequenzen: Bezieht sich auf eine Promotor/Transkript-Terminatorstellenkombination, die ein Strukturgen flankiert. Die Promotor- und Terminator-DNA-Sequenzen, welche ein bestimmtes fremdes Strukturgen flankieren, brauchen nicht von den gleichen Quellengenen (z. B. eine Paarbildung mit zwei verschiedenen T-DNA-Transkripts) oder der gleichen taxonomischen Quelle (z. B. eine Paarbildung von Sequenzen aus T-DNA mit Sequenzen aus Nicht-T-DNA-Quellen, wie z. B. Pflanzen, Tiere, Pilze, Hefen, eukaryotische Viren, Bakterien und synthetische Sequenzen) abgeleitet zu sein.
Hüllprotein-Gentranskript und Hüllprotein-mRNA: Das erstere bezieht sich hier auf das Transkript eines Pflanzen-exprimierbaren Hüllproteingens, während sich das letztere hier auf die das Hüllprotein kodierende mRNA, die in der Natur während einer viralen Infektion vorhanden ist, bezieht. Obgleich ein "translatierbares Transkript" im Stand der Technik als ein Synonym für "Messenger-RNA" anerkannt wird, werden diese zwei verchiedenen Ausdrücke hier verwendet, um zwischen der Messenger, die während einer viralen Infektion synthetisiert wird, und dem Produkt des Hüllproteingens der vorliegenden Erfindung zu unterscheiden.
Hüllprotein-Gen: Bezieht sich auf einen Promotor, eine DNA-Sequenz, die ein Hüllprotein kodiert (d. h. ein Hüllprotein-Strukturgen), und einen Transkript-Terminator, wobei der Promotor, das Strukturgen und der Terminator eine solche Position und Orientierung in bezug aufeinander haben, daß in einer Pflanzenzelle ein das Hüllprotein kodierendes Transkript unter der Kontrolle des Promotors und des Terminators synthetisiert werden kann. Ein Hüllprotein-Gen kann ein Komposit von Segmenten sein, die von einer Vielzahl von Quellen, natürlich vorkommend oder synthetisch, abgeleitet sind. Ein Hüllgen-Transkript kann Sequenzen enthalten, die gänzlich oder teilweise von einer prokaryotischen DNA, einer eukaryotischen DNA, einer episomalen DNA, einer plasmidischen DNA, einer plastidischen DNA, einer genomischen DNA, einer cDNA, einer viralen DNA, einer viralen cDNA, einer chemisch synthetisierten DNA oder dergleichen abgeleitet sind. Es ist ferner daran gedacht, daß ein Hüllprotein- Gen eine oder mehrere Modifikationen in entweder den Transkriptionskontrollsequenzen, den transkribierten Sequenzen oder der viralen cDNA enthalten kann, welche die biologische Aktivität oder die chemische Struktur des Hüllproteins, die Expressionsrate oder die Art und Weise der Expressionskontrolle beeinflussen können. Solche Modifikationen sind z. B., aber nicht beschränkt auf, Mutationen, Insertionen, Deletionen und Substitutionen von einem oder mehreren Nukleotiden, und Modifikationen, welche die Funktion des Hüllproteins oder des Hüllprotein-Transkripts nicht ändern, welche aber die intrazelluläre Lokalisierung, den Transport oder die Stabilität des Hüllproteins oder seines Tanskripts beeinflussen. DNA, die ein Hüllprotein-Gen kodiert, kann ein nicht-unterbrochenes Strukturgen sein oder kann ein oder mehrere Introne sein, gebunden durch die richtigen Plfanzen-funktionellen Spleißverbindungen, welche von einer synthetischen oder von einer natürlich vorkommenden Quelle erhalten werden können.
cDNA (komplementäre DNA): Obwohl dieser Ausdruck im Stand der Technik gut verstanden wird, besitzt er zwei Bedeutungen. (1) Eine cDNA kann eine einzelsträngige DNA sein, die zu einer RNA (z. B. eine virale mRNA) komplementär ist. (2) Eine cDNA kann auch ein doppelsträngiges DNA- Segment sein, von welchem ein Strang zu einer RNA komplementär ist, wobei der andere Strang eine Sequenz besitzt, die zu dieser RNA äquivalent ist (wobei T gegen U substituiert wird). Im allgemeinen wird eine doppelsträngige cDNA von einer einzelsträngigen cDNA abgeleitet. Wie hier definiert, ist eine doppelsträngige DNA, welche mRNA-Sequenzen kodiert, z. B. die DNA eines Strukturgens, im Begriff cDNA enthalten. In dieser Beschreibung ist die Bedeutung von cDNA durch den Kontext definiert und wird von den Fachleuten des Standes der Technik gut verstanden.
Plussträngig: Bezieht sich auf Viren mit Genomen mit Sequenzen, die äquivalent Genen von mRNA von Viren sind; d. h., RNA, die in Viruspartikeln gefunden wird, ist zu viraler mRNA nicht komplementär. Oft kann die virale RNA von plussträngigen Viren als eine mRNA dienen. AMV ist ein Beispiel eines plussträngigen Virus; jede der vier RNAs, die in AMV-Virionen gefunden werden, kann als eine mRNA dienen. "Minusstrang" oder Antisense-RNA bezieht sich auf das Komplement des Plus- Stranges.
Dreiteiliges RNA-Genom: Bezieht sich auf eine Organisation eines genetischen Materials eines Virus. "Genom" bezieht sich auf das gesamte genetische Material des Virus. "RNA-Genom" gibt an, daß das Genom in RNA-Form ist, anwesend in Virionen (Vinispartikeln). Dreiteilig gibt an, daß das Genom in drei getrennte RNA-Moleküle geteilt ist. Ein Beispiel eines Virus mit einem dreiteiligen RNA- Genom ist AMV. Das Genom von AMV wird von den AMV-RNAs 1, 2 und 3 getragen. Die Sequenz von RNA4 ist vollständig im RNA3 enthalten, und RNA4 wird nicht repliziert; daher wird RNA4 als eine subgenomische RNA bezeichnet und wird nicht als eine der genomischen RNAs gezählt.
Translationsinitiierungsstelle: Bezieht sich auf das Translationsstartkodon 5'AUG3' am 5'-Ende eines Strukturgens, das Nukleotid nach AUG und den 3 Nukleotiden vor dem AUG (siehe Kozak M (1983) Microbiol. Rev. 47: 1-45, und Kozak M (1984) Nucl. Acids Res. 12: 857-872).
5'-untranslatierte Sequenz: Bezieht sich auf den Teil einer mRNA oder Transkript zwischen seinem 5'-Ende oder "Kappenstelle" und dem Translationsstartkodon.
Pflanzen-exprimierbarer selektierbarer oder "screenbarer" Marker: Bezieht sich hier auf einen genetiseheri Marker, der in einer Pflanzenzelle funktionell ist. Ein selektierbarer Marker (z. B. ein Gen für Kanamycinresistenz) gestattet, daß Zellen, welche diesen Marker enthalten und exprimieren, unter Bedingungen wachsen, die für Zellen, die diesen Marker nicht exprimieren, ungünstig sind. Ein "screenbarer" Marker (z. B. beta-Galaktosidase-Gen) erleichtert eine Identifizierung von Zellen, welche diesen Marker exprimieren.
cDNA mit praktisch voller Länge: Bezieht sich auf eine cDNA, die zu einer gesamten mRNA komplementär ist, mit möglicher Ausnahme einer weniger (z. B. etwa fünf) Nukleotiden an jedem Ende dieser mRNA-Sequenz.
Transformieren: Bezieht sich auf das Geschehen, das dazu führt, daß eine Zelle ein Nukleinsäuremolekül oder eine Sequenz enthält, die ursprünglich kein Teil dieser Zelle war.
Pflanzenegewebe: Schließt differenzierte und undifferenzierte Gewebe von Pflanzen ein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Wurzeln, Sprößlinge, Pollen, Samen, Tumorgewebe, wie z. B. Kronengallen, und verschiedenste Formen von Aggregationen von Pflanzenzellen in einer Kultur, wie z. B. Embryos und Callusse. Das Pflanzengewebe kann inplanta oder in einem Organ, Gewebe oder in einer Zellkultur sein.
Pflanzenzelle: Wie hier verwendet, schließen Pflanzenzellen ein: in planta und Pflanzenzelle und Protoblasten in Kultur.
Die folgenden Ausdrücke sind im Stand der Technik gut bekannt und werden hier nicht spezifisch oder besonders definiert: Strukturgen, einzelsträngig, Genom, Alfalfa-Mosaikvirus-Gruppe (siehe Mattews REF (1982) Classification and Nomenclature of Viruses, S. 177), CaMV 19S-Promotor (siehe Hohn T et al. (1983) Plant Mol. Biol. 2: 335-350), ein T-DNA-Randrepeat, translatierbar, Transkription unter der Kontrolle eines Promotors, ligierend, abstammendes, und Strukturgen.
Die Produktion einer genetisch modifizierten Zelle, die ein Hüllprotein-Gen exprimiert, vereinigt die spezifischen Lehren der vorliegenden Offenbarung mit einer Reihe von Techniken und Ausgestaltungen, die im Stand der Technik bekannt sind. In den meisten Fällen existieren alternative Ausgestaltungen für jedes Stadium des Gesamtverfahrens. Die Wahl der Hilfsmittel hängt von Variablen ab, wie z. B. der Wahl des einzelnen Virus, gegen welche eine Resistenz erwünscht ist, dem Grundvektorsystem für die Einbringung und die stabile Aufrechterhaltung des Hüllprotein-Gens, der Pflanzenart, die modifiziert werden soll, und der erwünschten Vermehrungsstrategie, der einzelnen verwendeten transkriptionellen Kontrollsequenzen, und dergleichen, von welchen alle alternative Verfahrensschritte darstellen, welche die Fachleute auswählen und anwenden können, um ein erwünschtes Ergebnis zu erzielen. Wenn neue Mittel für eine stabile Insertion und Transkription von Fremd-DNA in Pflanzenzellen entwickelt werden, werden die Fachleute des Standes der Technik in der Lage sein, unter solchen alternativen Verfahrensschritten auszuwählen, um ein erwünschtes Ergebnis zu erzielen. Die fundamentalen Aspekte der Erfindung sind die Natur des Hüllprotein-Gens und seine Verwendung, um mit ihm Resistenz gegenüber viralen Infektionen von Pflanzen, die damit transformiert sind, zu verleihen. Andere Aspekte sind z. B. die Natur und die Struktur der Hüllprotein-Strukturgensequenz und ihre Mittel zur Inserierung und Expression in einem Pflanzengenom. Die übrigen Schritte der bevorzugten Ausführungsform zum Erhalten einer genetisch modifizierten Pflanze sind z. B. ein Inserieren des Hüllprotein-Gens in T-DNA, ein Transferieren der modifizierten T-DNA in eine Pflanzenzelle, worin die modifizierte T-DNA als Teil des Pflanzenzell-Genoms stabil integriert wird. Techniken für eine Kultivierung in vitro und schließlich eine Vermehrung bzw. Züchtung zu ganzen Pflanzen, wobei Schritte zum Selektieren oder Nachweisen transformierter Pflanzenzellen und Schritte zum Transferieren des eingebrachten Hüllprotein-Gens aus dem ursprünglich transformierten Stamm in kommerziell annehmbare Züchtungen und ein Überwachen der Expression in transformierten Pflanzen eingeschlossen sein können.
Ein Ausgangspunkt zur Konstruktion eines Hüllprotein-Gens ist das Erhalten von DNA-Klonen mit viralen Sequenzen. Falls das Virus ein DNA-Virus ist, sind die DNA-Klone unter Anwendung von Verfahren erhältlich, die im Stand der Technik von rekombinanter DNA gut bekannt sind. Falls der Virus ein RNA-Virus ist, muß ein cDNA-Klon von der erwünschten viralen Sequenz hergestellt werden. Im Stand der Technik der rekombinanten DNA sind eine Reihe von Methoden zum Herstellen von cDNA-Klonen bekannt; die Wahl der Methoden wird von Variablen abhängen, wie z. B. der Polyadenylierung, der RNA-Länge, dem Vorwissen über die RNA-Sequenz, früheren Präparationen innerhalb des einzelnen Labors für andere cDNA-Klinierungsexperimente und dergleichen.
Ein Hauptmerkmal der vorliegenden Erfindung in ihrer bevorzugten Ausführungsform ist die Konstruktion eines T-DNA-Derivates, welches ein inseriertes Gen aufweist, unter der Kontrolle von Pflanzen-exprimierbaren, die Transkription kontrollierenden Sequenzen, d. h., zwischen einem Promotor und einem Transkript-Terminator, wobei diese Ausdrücke oben definiert worden sind. Das Strukturgen, welches das Hüllprotein kodiert, muß in korrektor Position und Orientierung hinsichtlich des Promotors inseriert sein. Position bezieht sich auf welche Stelle des Promotors das Strukturen inseriert ist. Es ist bekannt, daß die Mehrheit der Promotoren eine Initiierung der Transkription und Translation nur in einer Richtung entlang der DNA kontrollieren. Der Bereich der DNA, der unter der Promotor-Kontrolle ist, soll, so sagt man, "stromabwärts" oder alternativ "hinter" oder "3' zum" Promotor liegen. Um daher vom Promotor kontrolliert zu werden, muß die korrekte Position einer Strukturgen-Insertion stromabwärts vom Promotor sein. Orientierung bezieht sich auf die Direktionalität des Strukturgens. Der Teil einer ein Hüllprotein kodierenden DNA, welche den Amino-Terminus eines viralen Hüllproteins kodiert, wird als das 5'-Ende des Strukturgens bezeichnet, während das Ende, welches Aminosäuren nahe des Carboxylendes des Proteins kodiert, als das 3'-Ende des Strukturgens bezeichnet wird. Die korrekte Orientierung der das Hüllprotein kodierenden DNA ist mit ihrem 5'-Ende proximal zum Promotor. Ähnlich zum Promotorbereich muß der Transkriptions-Terminator in korrektor Position und Orientierung relativ zum Hüllprotein-Stmkturgen angeordnet sein, und zwar proximal zum 3'-Ende des Strukturgens. Unterschiede in den Raten der Hüllprotein-Genexpression oder der entwicklungsmäßigen Kontrolle können beobachtet werden, indem Hüllprotein-Strukturgen-tragende Komponenten, Promotoren, Transkript-Terminatoren, flankierende DNA-Sequenzen oder Insertionsstellen im transformierten Genom der Pflanze variiert werden. Die Transkriptakkumulierung des Hüllprotein-Gens kann auch durch die Details der sekundären Struktur des Hüllprotein-Gentranskripts, insbesondere der StieL/Schleife-Strukturen, beeinflußt werden. Verschiedene Eigenschaften, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, auf solche Eigenschaften, wie z. B. Stabilität, intrazelluläre Lokalisierung, posttranskriptionelle Verarbeitung und andere funktionelle Eigenschaften des exprimierten Hüllprotein-Gens selbst können beobachtet werden, wenn die Komponenten des Gens variiert werden. Alle diese Variationen stellen zahlreiche Möglichkeiten dar, die funktionellen Eigenschaften des Phenotypus der viralen Resistenz in Abhängigkeit von den erwünschten physiologischen Eigenschaften innerhalb der Pflanzenzelle, dem Pflanzengewebe und der gesamten Pflanze zu manipulieren und zu kontrollieren.
Das fundamentale Prinzip der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß die Anwesenheit eines Hüllproteins in einer Pflanzenzelle in der Lage ist, zumindest einen gewissen Pegel an viraler Resistenz dieser Zelle zu übertragen. Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die Art oder auf den Mechanismus der Störung beschränkt. Das Hüllprotein-Gen braucht nicht die gesamte Länge des Strukturgens kodieren; jedes kodierte Hüllprotein-Strukturgenderivat, welches die virale Infektion stört, ist geeignet. Es ist wichtig, daß genügend Hüllprotein in einer Pflanzenzelle vorhanden ist, um den viralen Lebenszyklus stören zu können; falls zuwenig Hüllprotein vorhanden ist, wird die Infektion nicht inhibiert. Eine Maximierung der Translationsefflzienz wird helfen, die Akkumulierung des Hüllproteins zu steigern. Der Stand der Technik erkennt an, daß mehrere Faktoren die Translationseffizienz beeinflussen. Diese Faktoren sind z. B. Kodonverwendung, Distanz zwischen dem 5'-Ende eines translatierbaren Hüllprotein-Transkripts ("Kappenstelle") und dem AUG-Translationsstartkodons, die sekundäre Transkriptstruktur, der Mangel an AUG-Kodons zwischen der Kappenstelle und der Translationsinitiierungsstelle, die Sequenz der Translationsinitiierungsstelle und dergleichen. Im allgemeinen hat die Evolution die Kodonverwendung von Hüllprotein-Strukturgenen bereits größtenteils optimiert. Außerordentlich lange 5'-untranslatierte Sequenzen können die Translationseffizienz herabsetzen; allgemein kürzere "Leader"-Sequenzen sind wünschenswert. Es wird angenommen, daß außerordentliche doppelsträngige sekundäre Strukturen, z. B. StiellSchleife-Strukturen, die Translationseftizienz herabsetzen, obwohl gedacht wird, daß etwas sekundäre. Struktur für die RNA-Funktion oder -Stabilität gebraucht wird. Eine übereinstimmende Translationsinitüerungsstelle wrde abgeleitet:
(siehe Kozak M (1986) Cell 44: 283-292, und die darin zitierten Referenzen, insbesondere Kozak M (1983) Microbiol. Rev. 47: 1-45, und Kozak M (1984) Nucl. Acids Res. 12: 857-872), wobei AUG das Translationsstartkodon ist. Abweichungen von dieser Uberinstimmung könnten die Translationseffizienz herabsetzen. Es ist ebenso bekannt, daß das Vorhandensein eines AUG-Kodons zwischen der Kappenstelle und der Translationsstartstelle die Translationsefflzienz herabsetzt (z. B. siehe Rogers SG (1985) Plant Mol. Biol. Reptr. 3: 111-116).
Wie definiert, kann das Transkript eines Hülleprotein-Gens nicht-virale Sequenzen enthalten. Soggar in dem Fall, wo eine virale Sequenz mit voller Länge enthalten ist, kann ein Hüllprotein-Gentranskript nicht-virale Sequenzen enthalten. Gewöhnlich werden diese nicht-viralen Sequenzen am 5'- Ende und am 3'-Ende des Hüllprotein-Transkripts sein. Oft werden diese nicht-viralen Komponenten von Promotor- oder Transkript-Terminator-DNA-Segmenten abgeleitet sein. Ein Einschluß verschiedener nicht-viraler Sequenzen kann die RNA-Stabilität, die zelluläre Lokalisierung des Transkripts, die posttranskriptionelle Verarbeitung und dergleichen beeinträchtigen. Es ist im Stand der Technik bekannt, daß die RNA-Stabilität von terminalen Strukturen, wie z. B. dem 5'-Verkappen und der 3'-Polyadenylierung und vom Ausmaß der Innenstruktur, d. h., dem intramolekularen Paaren von Basen, beeinflußt wird. Ein Hüllprotein-Transkript kann innerhalb einer Zelle lokalisiert sein, z. B. ein Transkript mit einer translatierbaren Sequenz, welche ein Signalpeptid enthaltendes Polypeptid kodiert, wird dazu neigen, an ein rauhes endoplasmatisches Reticulum gebunden zu werden. Ein Intron kann in ein Hüllprotein-Gen aufgenommen werden, vorausgesetzt, daß, falls die Spleißstellen von zwei verschiedenen Genen abgeleitet sind, die Intron-Spleißstellen kompatibel sind.
Das Kombinieren von DNA-Segmenten, einschließlich viraler, nicht-viraler, Promotor- und Transkript-Terminatorsequenzen zur Bildung eines Hüllprotein-Gens wird durch Mittel erzielt, die von den Fachleuten des Standes der Technik der rekombinanten DNA-Technik bekannt sind und verstanden werden. Die Wahl des Promotors hängt von der erwünschten entwicklungsmäßigen Regulierung ab. Die Verwendung von entwicklungsmäßig regulierten Promotoren für die Genexpression in Pflanzen wird im Teil Hintergrund beschrieben. T-DNA- oder CaMV-Promotoren sind vorteilhaft, da sie konstitutiv sind. Der RuBP-Case-kleine Untereinheitspromotor kann für eine Expression im grünen Gewebe von mit Hüllprotein-Gen transformierten Pflanzen brauchbar sein. In den bevorzugten Ausführungsformen ist der Transkript-Terminator eine Polyadenylierungsstelle. Die Pflanzengenquelle der Polyadenylierungsstelle ist nicht kritisch, vorausgesetzt, daß die Polyadenylierungsstelle, der Promotor und das Hüllprotein-Strukturgen für eine Transkription und für das posttraskriptionelle Verarbeiten kompatibel sind. Den Fachleuten des Standes der Technik wird klar sein, daß die Hüllprotein-Genkombination zwischen jede Restriktionsstelle angeordnet werden kann, die zum Entfernen der Kombination aus dem Plasmid, auf welchem es getragen wird, zweckmäßig ist, und zur Insertion in den Pflanzentransformationsvektor der Wahl zweckmäßig ist. Zum Beispiel ist der Ort der Hüllprotein-Geninsertionsstelle innerhalb T-DNA nicht kritisch, solang die Transferfunktion von Sequenzen, die die T-DNA-Ränder unmittelbar umgeben, nicht auseinandergerissen werden, da es in Studien des Standes der Technik scheint, daß diese Bereiche für eine Insertion der modifizierten T-DNA in das Pflanzengenom unbedingt erforderlich ist. Die Kombination wird mittels Standardtechniken, die den Fachleuten des Standes der Technik gut bekannt sind, in den Pflanzentransformationsvektor inseriert. Die Orientierung des zusammengebauten Hüllprotein-Gens ist hinsichtlich der Richtung der Transkription und der Translation endogener Vektorgene gewöhnlich nicht kritisch; im allgemeinen ist jede der zwei möglichen Orientierungen funktionell.
Wie im Teil Hintergrund (Ti-Plasmid-DNA) überblicksmäßig dargestellt ist, kann T-DNA von micro-Ti-Plasmiden von einem Agrobacterium-Stamm auf eine Pflanzenzelle übertragen werden, vorausgesetzt, daß der Agrobacterium-Stamm bestimmte trans-wirkende Gene enthält, deren Funktion darin besteht, den Transfer von T-DNA zu einer Pflanzenzelle zu fördern. Micro-Ti-Plasmide sind insofern vorteilhaft, als sie klein sind und relativ leicht direkt zu manipulieren sind, wobei der Bedarf für eine Übertragung des Gens auf T-DNA von einem Shuttle-Vektor durch homologe Rekombination beseitig wird. Nachdem das erwünschte Hülleprotein-Gen inseriert worden ist, können sie auf einfache Weise direkt in eine Agrobacterium-Zelle eingebracht werden, welche trans-wirkende vir-Gene enthält, wobei die vir-Gene gewöhnlich ein "Helferplasmid" sind, welches den T-DNA-Transfer unterstützt. Die Einbringung in einen Agrobacterium-Stamm wird zweckmäßigerweise entweder durch Transformation des Agrobacterium-Stammes oder durch Konjugattransfer von einer bakteriellen Donorzelle erzielt, wobei die Techniken dafür den Fachleuten gut bekannt sind. Für die Zwecke der Einbringung neuer DNA-Sequenzen in ein Pflanzengenom sollten Ti-Plasmide, Ri-Plasmide, micro-Ti-Plasmide und T- DNA, integriert in Chromosomen, funktionell äquivalent angesehen werden.
T-DNA mit einem Hüllprotein-Gen kann auf Pflanzenzellen transferiert werden, und zwar mit jeder Technik, die im Stand der Technik bekannt ist. Dieser Transfer kann zum Beispiel am zweckmäßigsten mit einer Cokultivierung des Agrobacterium-Stammes mit Pflanzenzellen oder mit Pflanzengeweben erzielt werden. Durch Anwendung dieser Methoden wird ein gewisser Teil der Pflanzenzellen transformiert, das heißt, daß sie T-DNA besitzen, die darin transferiert und in das Pflanzenzellengenom inseriert ist. In jedem Fall müssen die transformierten Zellen selektiert oder "gescreent" werden, um sie von untransformierten Zellen zu unterscheiden. Die Selektion wird am einfachsten erreicht, indem ein selektierbarer Marker vorgesehen wird, der zusätzlich zum Hüllprotein-Gen in die T-DNA eingebaut ist. Beispiele von künstlichen Markern sind z. B. jene, die im Teil Hintergrund übersichtsmäßig dargestellt sind (siehe die Abschnitte über chimere Gene). Zusätzlich sieht die T-DNA endogene Marker vor, wie z. B. ein oder mehrere Gene, die eine abnormale Morphologie von Ri-induzierten Tumorwurzeln kontrollieren, und ein oder mehrere Gene, die die Resistenz gegenüber toxischen Verbindungen, wie z. B. Aminosäureanaloga, kontrollieren, wobei eine solche Resistenz durch ein Opin-synthetisierendes Enzym (z. B. ocs vorgesehen wird. "Screenmethoden", die den Fachleuten des Standes der Technik gut bekannt sind, sind z. B., aber nicht beschränkt auf, Prüfverfahren auf Opin-Produktion, spezifische Hybridisierung auf charakteristische Nukleinsäuresequenzen (z. B. Hüllprotein-Transkripte oder T-DNA) oder immunologische Prüfverfahren für spezifische Proteine (z. B. Hüllprotein). Zusätzlich kann ein Phenotypus eines exprimierten Hüllprotein-Gens (z. B. Resistenz gegenüber einem Zielvirus) verwendet werden, um transformiertes Gewebe zu identifizieren. Ein Prüfverfahren auf virale Reistenz kann von einer Reihe von Methoden, die im Stand der Technik der Pflanzenvirologie gut bekannt sind, vorgenommen werden, einschließlich des Nachweises einer verringerten Produktion einer Viruskomponente (z. B. eine virale RNA oder ein virales Protein), verminderte Infektiosität, überprüft durch Protoplasteninfektion oder durch Prüfverfahren auf lokale Läsion, verringerte Produktion von pyrogenem Virus und dergleichen.
Obwohl die bevorzugten Ausführungsformen eine Verwendung von micro-Ti-Plasmiden beinhalten, können andere Vektorsysteme auf Basis von T-DNA, die im Stand der Technik bekannt sind, ohne weiteres substituiert werden. Obwohl die bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung ein über Aarobacterium vermitteltes System auf T-DNA-Basis zur Aufhahme des Hüllprotein-Gens in das zu transformierende Genom der Pflanze beinhaltet, sind auch andere Mittel zum Übertragen und Aufhehmen des Hüllprotein-Gens innerhalb des Umfanges dieser Erfindung enthalten. Andere Mittel für eine stabile Aufnahme des Hüllprotein-Gens in ein Pflanzengenom sind z. B. zusätzlich, aber nicht limitiert auf, eine Verwendung von Vektoren auf Basis von viralen Genomen, Minichromosomen, Transposomen und homologen oder nicht-homologen Rekombination in Pflanzenchromosomen. Alternative Formen der Abgabe dieser Vektoren in eine Pflanzenzelle sind z. B. zusätzlich, aber nicht limitiert auf, eine Fusion mit Vektor-enthaltenden Liposomen oder bakteriellen Sphäroplasten, Mikroinjektion, Einkapselung in virales Hüllprotein, gefolgt von einem infektionsähnlichen Verfahren, und direkte Aufnahme von DNA, möglicherweise nach einer Induktion der Plasmalemmapermeabilität durch einen elektrischen Impuls, einen Laser oder ein chemisches Mittel. Mittel zur transienten Aufnahme und/oder Expression sind ebenso im Umfang dieser Erfindung enthalten. Systeme auf Basis von Agrobacterium-Zellen und T- DNAs können verwendet werden, um Angiosperme, einschließlich Zweikeimblättriger und Einkeimblättigrer, zu transformieren, und zwar durch Transfer von DNA von einem Bakterium in eine Pflanzenzelle; Systeme auf Basis alternativer Vektoren oder Mittel für eine Vektorabgabe können verwendet werden, um Gymnosperme und Angiosperme zu transformieren.
Die Regeneration von transformierten Zellen und Geweben wird mit Bezug auf bekannte Techniken erzielt. Ein Ziel des Regenerationsschritts besteht darin, eine ganze Pflanze zu erhalten, welche normal wächst und sich normal reproduziert, welche jedoch integrierte T-DNA beibehält. Regenerationstechniken variieren etwas gemäß den Prinzipien, die im Stand der Technik bekannt sind, und können vom Pflanzentransformationsvektor und den Arten der transformierten Pflanze abhängen. Die Regeneration von transformierten Tabakpflanzen, Petuniapflanzen und Pflanzen verwandter Arten ist im Stand der Technik gut bekannt. Da Mittel zur Regeneration anderer Pflanzenarten entwickelt werden, wird der Fachmann verstehen, und zwar ohne unzumutbares Experimentieren, wie diese neu entdeckten Mittel zur Regeneration von Pflanzen aus transformierten Pflanzenzellen und transformierten Pflanzengeweben zu adaptieren sind.
Der Genotypus des transformierten Pflanzengewebes wird oft für die Einfachheit gewählt, mit welcher seine Zellen gezüchtet und in einer in vitro-Kultur regeneriert werden können, und wegen der Empfindlichkeit auf das zu verwendende Selektionsmittel. Sollte eine Kultur von landwirtschaftlichem Interesse für diese Manipulationen ungeeignet sein, wird zuerst eine zugänglichere Varietät transformiert. Nach der Regeneration kann das neu eingebrachte Hüllprotein-Gen auf einfache Weise der erwünschten landwirtschaftlichen Züchtung durch Techniken übertragen werden, die den Fachleuten des Standes der Technik der Pflanzenzucht und der Pflanzengenetik gut bekannt sind. Sexuelles Kreuzen transformierter Pflanzen mit den landwirtschaftlichen Kulturen gibt Ersthybride. Diese Hybride können dann mit Pflanzen des gewünschten genetischen Hintergrunds rückgekreuzt werden. Nachkommen werden kontinuierlich "gescreent" und/oder selektiert, und zwar auf die fortdauernde Anwesenheit der integrierten Hüllprotein-Gen-DNA, T-DNA oder auf einen neuen Phenotypus, der von einer Expression des Hüllprotein-Gens oder anderen Genen stammt, die von der inserierten DNA getragen werden. Auf diese Weise können nach einer Anzahl von Rückkreuzungs- und Selektionsdurchgängen Pflanzen produziert werden, die einen Genotypus aufweisen, der im wesentlichen den landwirtschaftlich erwünschten Eltern mit der Hinzufügung inserierter DNA-Sequenzen identisch ist.
Eine Alternative zur Aufnahme eines Hüllprotein-Gens in ein Pflanzengenom zum Herstellen einer ein Hüllprotein-enthaltenden Pflanzenzelle besteht darin, eine Pflanze mit einer viralen Vektor- RNA zu infizieren, welche in dieser Pflanze gehalten werden kann, wobei die virale RNA Hüllproteinkodierende Sequenzen für ein Zielvirus hat (d. h., ein Virus, vor welchem ein Schutz gewünscht wird, welcher Virus vom Vektorvirus verschieden ist). Typischerweise werden doppelsträngige cDNA-Sequenzen des Vektorvirus und des Zielvirus manipuliert, wobei rekombinante DNA-Technologie angewendet wird. Nach einem Zusammenbau einer DNA-Sequenz, die jener der erwünschten Vektor- RNA/Zielhüllprotein-cDNA-Kombination entspricht, kann die Pflanzenvirusvektor-cDNA/HüllproteineDNA-Kombination hinter einem Promotor angeordnet werden, der eine in vitro-Transkription vorantreiben kann. Beschreibungen solcher Vektoren und Bedingungen für ihre Verwendung sind z. B. Melton DA (1984) Nucl. Acids Res. 12: 7035-7056, Krieg PA und Melton DA (1984) Nucl. Acids Res.
12: 7057-7070, Ahlquist P und Janda M (1984) Mol. Cell. Biol. 4: 2876-2882, und French R et al. (1986) Science 231: 1294-1297. Nachdem eine solche Virusvektor/Zielhüllproteinlin-vitro-Transkriptionsvektorkombination zusammengebaut ist, kann eine Virusvektor-RNA/Zielhüllprotein-Squenzkombination durch in vitro-Transkription hergestellt und mit anderen viralen RNA-Komponenten gemischt werden, die für eine Beibehaltung des viralen Vektors in einer Pflanzenzelle notwendig sind. Eine Infektion mit einer Vektor/Hüllprotein-Sequenzkombination einer Pflanzenzelle kann dann mit bekannten Verfahren bewirkt werden, und nach einer Inokulierung mit dem Zielvirus oder der Zielvirus-RNA kann die Inhibierung oder Infektion oder Produktion einer Viruskomponente mit Verfahren überprüft werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind. Unter Anwendung solcher Methoden können hohe Pegel an Hüllprotein-Transkript und Hüllprotein akkumuliert werden.
Auf ähnliche Weise können virale Pflanzen-DNA-Vektoren verwendet werden, um ein Hüllprotein-Gen in eine Pflanzenzelle einzubringen. Die Verwendbarkeit solcher Vektoren wurde von Brisson N et al. (1984) Nature 310: 511-514 gezeigt. Die Mittel zum Schaffen funktioneller Hüllprotein-Gene, wie sie mit der vorliegenden Erfindung gelehrt werden, können mit einer Verwendung von Vektoren auf Basis von Pflanzen-DNA-Viren von den Fachleuten des Standes der Technik kombiniert werden. Nach einer Infektion einer geeigneten Pflanzenwirtzelle kann die Inhibierung der Infektion mit dem Zielvirus überprüft werden, wie dies oben beschrieben ist.

BEISPIELE

Die folgenden Beispiele werden zum Zwecke der Veranschaulichung spezifischer Ausführungsformen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung angegeben, ohne den Umfang zu beschränken, welcher Umfang von den Ansprüchen definiert wird. Den Fachleuten des Standes der Technik werden zahlreiche Variationen klar sein.
Die Beispiele wenden viele Techniken an, die den Fachleuten des Standes der Technik der Molekularbiologie und der Manipulation von T-DNA und Agrobacterium gut bekannt sind und die ihnen zugänglich sind; solche Methoden werden in einer oder mehreren der zitierten Referenzen voll beschrieben, falls sie nicht hier im Detail beschrieben sind. Alle Referenzen, die in dieser Beschreibung zitiert sind, werden durch die Bezugnahme hierdurch aufgenommen. Enzyme werden von kommerziellen Quellen bezogen und werden gemäß den Empfehlungen der Verkäufer und anderen Variationen, die im Stand der Technik bekannt sind, verwendet. Reagenzien, Puffer und Kulturbedingungen sind ebenso den Fachleuten des Standes der Technik bekannt. Referenzarbeiten, welche solche Standardtechniken enthalten, sind z. B. die folgenden: Wu R, Hrsg. (1979) Meth. Enzymol. 68; Wu Ret al., Hrsg. (1983) Meth. Enzymol. 100 und 101; Grossman L und Moldave K, Hrsg. (1980) Meth. Enzymol. 65; Weissbach A und Weissbach H., Hrsg. (1986) Meth. Enzymol. 118 (siehe insbesondere Rogers SG et al., 5. 627-640); Miller JH (1972) Experiments in Molecular Genetics; Davis R et ah (1980) Advanced Bacterial Genetics; Schleif RF und Wensink PC (1982) Practical Methods in Molecular Biologv; Walker JM und Gaastra W, Hrsg. (1983) Techniques in Molecular Bioloay; und Maniatis T et al. (1982) Molecular Cloning. Zuätzlich machen Lathe RF et al. (1983) Genet. Engin. 4: 1-56 brauchbare Kommentare über DNA-Manipulationen,
Die textlichen Verwendung des Namens einer Restriktionsendonuklease bei der Isolierung, z. B. "BclI", bezieht sich auf die Verwendung dieses Enzyms bei einer enzymatischen Verdauung, außer in einem Diagramm, wo sie sich auf die Stelle einer Sequenz beziehen kann, die auf die Wirkung dieses Enzyms empfindlich ist, z. B. eine Restriktionsstelle. Im Text sind Restriktionsstellen durch die zusätzliche Verwendung der "Arbeitsstelle" angegeben, z. B. "BcII-Stelle". Die zusätzliche Verwendung des "Arbeitsfragmentes", z. B. "BglI-Fragment", gibt cin lineares doppelsträngiges DNA-Molekül an, welches Enden aufweist, die durch die Wirkung des benannten Enzyms erzeugt wurden (z. B. ein Restriktionsfragment). Ein Ausdruck, wie z. B. "BglI/SmaI-Fragment", gibt an, daß das Restriktionsftagment durch die Wirkung von zwei verschiedenen Enzymen, hier BclI und Smai, erzeugt wurde, wobei die zwei Enden von der Wirkung verschiedener Enzyme stammen.
Plasmide, und zwar nur Plasmide, werden mit vorangestelltem "p" bezeichnet, z. B. pTi15955 oder pH400, und Stammbenennungen in Klammer geben ein Plasmid an, welches darin beherbergt wird, - z. B. A. tumefaciens (pTi15955) oder E. coli K802 (pH400).

Beispiel 1: Herstellung von AMV-RNA4-cDNA

pSP65A4 (Loesch-Fries LS et al. (1985) Virol. 146: 177-187) trägt eine cDNA-Kopie von AMV-RNA4 in voller Länge in pSP65. pSP65 ist für eine in-vitro-Transkription unter der Kontrolle eines Bakteriophagen-SP6-Promotors gestaltet (Melton DA et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12: 7035- 7056; Krieg PA und Melton DA (1984) Nucl. Acids Res. 12: 7057-7070). pSP65A4 steuert die Synthese von AMV-Hüllprotein kodierenden Sequenzen. Wenn es mit SmI und EcoRI geschnitten wird, sind in-vitro-Run-off-Transkripts praktisch eine mRNA-Sequenz mit voller Hüllproteinlänge.
Beispiel 2: Herstellung von CaMV-Transkriptions-kontrollierenden Sequenzen pDOB512, welcher Transkriptions-kontrollierende Sequenzen des Kohlmosaikvirus (CaMV) trägt (erhalten von Dr. Ken Richards, Centre National de la Recherche Scientifique, Institute de Biologie Moleculaire et Cellulaire, 15, rue Descartes, F-67084 Straßburg, Frankreich), wurde wie folgt konstruiert: (Für einen Überblick über CaMV siehe Hohn T et al. (1982) Curr. Top. Microbiol. Immunol.
96: 193-236.) Ein HindIII-Fragment, welches den CaMV-19S-RNA-Promotorbereich (CaMV-Nukleotide 5376-5851) trägt, wurde in pBR322 inseriert und innerhalb eines Basenpaares der 19S-Transkript- Kappenstelle zurückgeschnitten. Ein HincII-Fragment, welches den CaMV-19S-Transkript-Terminator (CaMV-Nukleotide 7018-7794) trägt, an welches BamHI-Linker hinzugefügt worden waren, wurde dann hinter den 19S-Promotor inseriert; das erhaltene Plasmid wurde als pDOB412 bezeichnet. pDOB412-DNA wurde mit BglII und SaII verdaut, mit dem Klenow-Fragment von E. coli-DNA-Polymerase I gefüllt, und erneut ligiert, wodurch DNA deletiert wurde, welche BamHI- und HindIII-Stellen aufwies, und zwar zwischen der CaMV-Position 7644-BgIII-Stelle und der pBR322-Position 650-SalI- Stelle, und eine BglI-Stelle regeneriert wurde. Das erhaltene Plasmid wurde als pDOB512 bezeichnet. Die klebrigen Enden von mit HindIII linearisierter pDOB512-DNA wurden mit dem Klenow- Fragment (oder alternativ mit einer T4-DNA-Polymerase) gefüllt. Die pDOB512-DNA mit stumpfen Enden wurde gemischt mit und ligiert mit kommerziell erhältlichen VIII-Linkern. Das Ligierungsgemisch wurde dann in E. coli K802 transformiert, und ein Ampicillin-resistenter Transformant wurde isoliert, welcher ein Plasmid beherbergte, welches als pDOB513 bezeichnet wurde. pDOB513 besitzt CaMV-19S-Transkriptions-kontrollierende Sequenzen auf einem BglII-Fragment. Smai- und BamHII- Stellen werden zwischen den DNA-Segmenten mit dem Promotor und der Polyadenylierungsstelle sowohl in pDOB412, pDOB512 als auch pDOB513 gefunden, wodurch ein zweckmäßiger Ort für eine Insertion fremder DNA zur Verfügung gestellt wird, welche DNA ein Template Ihr ein Transkript sein soll.

Beispiel 3: Plazierung von AMV-cDNA hinter den CaMV-Promotor

pSP65A4-DNA wurde mit EcoRI und SmaI verdaut, und die AMV-cDNA mit 0,89 kflp wurde durch Eluierung von einem Agarosegel nach einer elektrophoretischen Trennung gereinigt. Das klebrige Ende von EcoRI wurde durch Inkubation mit dem Klenow-Fragment von E. coli-DNA-Polymerase I in ein stumpfes Ende umgewandelt. Nachdem mit SmaI linearisierte pDOB513-DNA mit der stumpfendigen cDNA gemischt und ligiert worden war, wurden die Ligierungsprodukte in MC 1061 transformiert. Ampicillin-resistente Transformanten wurden durch Koloniehybridisierung auf eine AMV- RNA4-Sonde "gescreent". Es wurde eine Kolonie identifiziert, welche ein Plasmid beherbergte, das als pDOBA4 bezeichnet wurde, mit einer AMV-cDNA, die zwischen die CaMV-19S-Transkriptions-kontrollierenden Sequenzen inseriert war, und zwar so orientiert, daß bei Transkription ein Hüllprotein-kodierendes Transkript synthetisiert würde; d. h., daß das EcoRI-Ende und eine innere BamHI-Stelle proximal zum Promotor und distal zum Transkript-Terminator sind. Eine CaMV-Transkkriptions-kontrollierende Sequenzen/AMV-Hüllprotein-Strukturgenkombination kann vom pDOBA4 auf einem Bglll- Fragment mit 1,92 kBp entfernt werden.

Beispiel 4: Konstruktion von pH400, ein micro-Ti-Plasmid

pH4-1 ist ein micro-Ti-Plasmid, welches von E. coli K802 (pH4-1) beherbergt wird, welches als NRRL B-18009 hinterlegt ist. pH4-1 ist von Sutton DW et al., U. S. -Patentanmeldung mit der Seriennummer 778,384, siehe auch Gray, L. E. et al., Plant Science (1986) 474%55 welche hierdurch durch Bezugnahme aufgenonvnen sind, geoffenbart, und von Merlo D et al. (1985) Abstracts, 1, Int.
Cong. Plant Mol. Biol., Hrsg.: Galau GA. pH4-1 enthält zwei T-DNA-Fragmente, ein HindIII-Fragment, welches die Positionen 602 und 2290 (definiert von Barker RF et al. (1983) Plant Mol. Biol. 2: 335-350) überspannt, welches des linken Rand von TL- und Promotorsequenzen, die mit ORFl assozuert sind, trägt, und ein SmaIBclI-Fragment, welches die Positionen 11207 und 14711 überspannt, welches ein 3'-deletiertes tml, ein intaktes ocs und den rechten Rand von TL besitzt. Zwischen der Position 3390-HindIII-Stelle und der Position 11207-SmaI-Stelle (wobei diese SmaI-Stelle in ein BglIII durch Stelleninsertion von BblII-Linker umgewandelt worden ist) dieser zwei Fragmente ist ein Pflanzen-exprimierbarer Selektrionsmarker. Dieser Marker besitzt einen CaMV-19S-Promotor, ein Tn5- Kanamycin-Resistenzstrukturgen, welches die Neomycinphosphotransferase II kodiert, und zwei Polyadenylierungsstellen, eine von CaMV und die andere von T-DNA-ORF26, von einem T-DNA-Fragment, welches Hinchl-Stellen an den Positionen 21727 und 22440 überspannt. Das Kanamycin-Resistenzgen ist parallel zu ocs und tml und antiparallel zum ORF 1-Promotor orientiert. Die Kombination T- DNA/Selektionsmarker wird in die Hindill-Stelle von pSUP 106 inseriert, einem Plasmid mit 11 kBp und einem weiten Hostbereich, das sich sowohl in E. coli als auch in Agrobacterium halten kann (Priefer UB et al. (1985) J. Bacteriol. 163: 324-330; E. coli CSH52 (pSUP106) ist als NRRL B-15486 hinterlegt). Die T-DNA ist innerhalb pSUP106 so orientiert, daß der rechte Rand von TL proximal zur pSUP 106-EcoRI-Stelle ist, welche innerhalb des pSUP 106-Chloramphenicol-Resistenzgens vorhanden ist.
pH4-1 besitzt zwei BglIIII-Stellen, welche beide den kan-Selektionsmarker flankieren. Eine der III-Stellen wurde entfernt, wodurch eine einzigartige BglII-Stelle, die zur Insertion fremder kodierender DNA brauchbar war, blieb, und zwar wie folgt: pH4-1-DNA wurde linearisiert, indem sie teilweise mit III verdaut wurde, und die lineare DNA mit voller Länge wurde elektrophoretisch isoliert. Die klebrigen Enden von MII wurden dann durch Inkubation mit dem Klenow-Fragment von E, coli- Polymerase I entfernt. Die erhaltene DNA mit stumpfen Enden wurde mit sich selbst ligiert und in E. coli transformiert. Plasmidische DNAs, die von Transformanten isoliert wurden, die gegenüber Chloramphenicol resistent waren, wurden durch Restriktionsanalyse "gescreent", und es wurde eine Kolonie identifiziert, welche ein Plasmid beherbergte, welches als ph400 bezeichnet wurde. pH400 war identisch mit pH4-1 außer für das Fehlen der BgglII-Stelle zwischen dem kan-Gen und dem ORF1-Promotor, wobei die einzigartige pH400-III-Stelle zwischen dem kan-Gen und dem oocs-Gen angeordnet ist.

Beispiel 5: Inserierung eines AMV4-Hüllprotein-Gens in yH400

pDOBA4-DNA wurde mit BglII verdaut und dann mit BglII-linearisierter, entphosphorylierter pH400-DNA gemischt und ligiert. Nach einer Transformation in MC 1061 und einer Selektion auf Resistenz gegenüber Chloramphenicol wurden plasmidische DNAs durch Restriktionsanalyse charakterisiert. Es wurde eine Kolonie identifiziert, welche ein Plasmid, bezeichnet als pH400A4, beherbergte, welches ein Hüllprotein-Gen aufwies, das in die pH400-BgIII-Stelle inseriert war. pH400A4 besitzt ein Hüllprotein-Gen mit AMV-RNA4-Sequenzen mit voller Länge, wobei das Gen parallel zu dem 3'-deletierten tml-Gen, ocs, und dem auf Kanamycin selektierbaren Marker orientiert ist.

Beispiel 6: Pflanzentransformation

pH400A4 wurde in A. tumefaciens LBA4404 transferiert (Ooms G et al. (1981) Gene 14: 33- 50), einem das vir-Gen beherbergenden, micro-Ti-mobilisierenden Stamm, und zwar durch die triparentale Abstimmungstechnik. (Ruvkun GB und Ausubel FM (1981) Nature 289: 85-88), welche im Stand der Technik gut bekannt ist, oder durch Abstimmen von einem mobilisierenden Stamm von E. coli z B SM10 (NRRL B-15481) oder 517-1 (NRRL B-15483) (Simon R et al. (1982) Biotechnol. 1: 784-791). Tabakblattgewebe wurde von 4 oder 5 Wochen alten XanthiNC-Pflanzen, die axial in Magenta-Boxen gezüchtet wurden, erhalten. Inokuliert wurde nach einer Modifikation der Methode von Horsch RB et al. (1985) Science 227: 1229-1231. Es wurden Inokula hergestellt, indem zwei Schlingenmengen A robacterium in 10 ml L-Nährmedium gegeben wurden. Nach einer Suspendierung durch kraftvolles Pipettieren mit einer Pasteur-Pipette konnten die Inokula sofort verwendet werden. Blätter wurden ausgeschnitten und die Mittelrippen wurden entfernt; die geschnittenen Oberflächen wurden mit L-Nährmedium benetzt, um die Blätter naß zu halten. Blattstücke wiesen eine Breite von etwa 2-4 mm und eine Länge von etwa 7-10 mm auf. Blattsegmente wurden 5-10 min. in das Inokulum getaucht, obgleich in einigen Experimenten die Blattstücke nur kurz in das Inokulum getaucht wurden oder mit dem Inokulum in einem Kolben infiltriert wurden. Darm wurden die Stücke auf sterilem Filtrierpapier trockengedrückt und mit der Oberseite nach unten auf Nährplatten gegeben, die von einer Xanthi-Suspensionskultur hergestellt wurden. Die Nährplatten hatten ein SMPi-Medium (SMPi: MX-, ergänzt mit 0,1 mg/l p- Chlorphenoxyessigsäure (pCPA) und 7,5 mg/16-(8,8-Dimethylallylamino)purin (2iP); MX: 1,65 g/l NH&sub4;NO&sub3;, 1,9 g/l KNO&sub3;, 440 mg/l CaCl&sub2;.2H&sub2;O, 370 mg/l MgSO&sub4;.7H&sub2;O, 170 mg/l KH&sub2;PO&sub4;, 0,83 mgfl K3, 6,2 mg/l H3B03, 22,3 mg/l MnSO&sub4;.4H&sub2;O, 8,6 mg/l ZnSO&sub4;.7H&sub2;O, 0,25 mg/l Na&sub2;MoO&sub4;.2H&sub2;O, 0,025 mg/l CuSO&sub4;.5H&sub2;O, 0,025 mg/l CoCl&sub2;.5H&sub2;O, 37,23 mg/l Na&sub2;.EDTA, 27,85 mg/l FeSO&sub4;.7H&sub2;O, 1 g/l Inositol, 50 mg/l Nikotinsäure, 50 mg/l Pyroxidin.HCl, 50 mg/l Thiamin.HCl, 30 g/l Sucrose, pH 5,8, verfestigt mit 8 g/l Agar). Blattstücke wurden von den Nährplatten nach 4-6 Tagen entfernt und auf SMPi-Medium gegeben, welches mit 500 mg/l Carbenicillin, 50 mg/l Cloxacillin und 100-300 mg/l Kanamycin (200 mg/l Optimum) ergänzt war. Die erhaltenen Sprößlinge wurden geschnitten und auf MX-Medium gegeben, welches mit 100-300 mg/l Kanamycin (200 mg/l Optimum) ergänzt war.

Beispiel 7: Expression in Pflanzen

Regenerierte Tabakpflanzen, die von Zellen stammten, die mit A. tumefaciens LBA4404 (pH400A4) transformiert waren, wurden selbstbestäubt. Die Anwesenheit eines Hüllproteins in den Transformanten wurde mittels eines Enzym-verbundenen Immunosorbent-Tests (ELISA) (Tabelle I) bestätigt, und die Anwesenheit eines Hüllprotein-Gentranskriptes wurde durch Northern-Blot-Analyse bestätigt. Die erhaltenen Samen wurden auf MX-, welches mit 100-300 mg/l Kanamycin (200 mg/l Optimum) ergänzt war, gekeimt, um Pflanzen zu selektieren, welche eine Hüllprotein-Gen-tragende T- DNA enthielten. Die Anwesenheit nachweisbarer Pegel an Hüllprotein war mit der Anwesenheit von Hüllprotein nicht absolut korreliert; dies wird von publizierten T-DNA-Transformationsstudien erwartet, welche ergeben haben, daß die relativen Pegel einer Expression inserierter Gene in Geweben, die von verschiedenen Transformationsereignissen stammen, variieren können. Untransformierte Kontroll-Tabakpflanzen und Hüllprotein-Gen-enthaltende Tabakpflanzen werden durch Inokulierung von mit Carborundum abgescheuerten Blättern mit AMV-Virionen angeregt. Bei Vergleich mit Kontrollpflanzen wird beobachtet, daß Pflanzen mit einem Hüllprotein-Gen auf eine AMV-Infektion resistent sind oder verringerte oder verspätete Symptome aufweisen, und zwar in Abhängigkeit vom Pegel des Hüllproteins in den Geweben einer bestimmten Pflanze.

Beispiel 8: In-vitro-Tests von Hüllprotein-Funktionen

Es ist bekannt, daß der Aufbau einer AMV-Infektion Hüllprotein-abhängig ist. Dieses Hüllprotein kann als Teil eines Inokulums geboten werden (entweder als freies Hüllprotein oder in der Form von Virionen) oder kann im Infektionsprozeß früh synthetisiert werden, falls RNA4 im Inokulum vorhanden ist. Falls die transformierten Protoplasten Hüllprotein enthalten, sollte der Aufbau einer Infektion nicht länger vom Vorhandensein im Inokulum eines Hüllproteins oder seiner Messenger-RNA abhängig sein. Tabak-Protoplasten wurden hergestellten und inokuliert, und zwar im wesentlichen wie von Samac DA et al. (1983) Virol. 131: 455-462 beschrieben. Eine Hauptmodifikation bestand darin, daß RNA in einem kleinen Volumen (z. B. 10 ul) zu den Protoplastenpellets zugegeben wurde, worauf dann in restlichem Überstand vor einer Zugabe von Polyethylenglycol (PEG) erneut suspendiert wurde. Inokulierungen von Hüllprotein-enthaltenden Protoplasten mit einer RNA-Präparation ohne AMV-RNA4 ergab sehr hohe Infektionspegel; ähnliche Inokulierungen von untransformierten Protoplasten ergaben im wesentlichen keine Infektion (Tabelle 2). Tatsächlich waren die Infektionspegel von transformierten Pxotoplasten mit Präparationen ohne Hüllprotein-mRNA sogar höher, als sie für eine Inokulierung von untransformierten Protoplasten mit RNA-Präparationen mit allen vier Komponenten beobachtet wurden. Dies zeigte, daß das Hüllprotein, welches in transformierten Protoplasten enthalten war, biologisch aktiv war. Tabakprotoplasten wurden in vitro mit AMV-Virionen infiziert, und zwar im wesentlichen wie oben für RNA beschrieben. In einem typischen Experiment, welches Tabakprotoplasten anwandte, die von transformierten oder Kontrolltabakpflanzen stammten, hatten die Kontrollprotoplasten signifikant niedrigere Infektionspegel als Protoplasten, welche Hüllprotein enthielten, überprüft mittel ELISA (Tabelle 3). Obgleich die Schutzpegel schwankten, wurden die Infektionspegel für Protoplasten, welche AMV-Hüllprotein enthielten, stets geringer als für untransformierte Kontrollen beobachtet. Dies zeigte, daß die Anwesenheit von AMV-Hüllprotein in einer Pflanzenzelle diese Zelle vor einer Infektion durch Alfalfa-Mosaikvirus schützen kann. TABELLE 1 EXPRESSION VON HÜLLPROTEIN IN TRANSFORMIERTEM TABAK TABELLE 2 BIOLOGISCHE AKTIVITÄT VON EXPRIMIERTEM HULLPROTEIN
* Inokulum für 105 Protoplasten bestand aus 0,6 ug AMV-RNA 1 + 2 + 3 allein oder in Kombination mit 1 ug AMV-RNA 4 oder 6 ug unfraktionierter AMV-RNA. RNA-Aufnahme geschah in Gegenwart von PEG-CaCl&sub2;. Die Infektion wurde mittels Immunfluoreszenz unter Verwendung von Antikörpern auf das Hüllprotein überprüft. TABELLE 3 POSITIVE WIRKUNGEN DES HÜLLPROTEINS IN TRANSFORMIERTEM TABAK
* Inokulum für 105 Protoplasten bestand aus 1-3 ug Alfalfa-Mosaikvirus. Die Virusaufliahme geschah in Gegenwart von PEG-CaCl&sub2;. Die Infektion wurde mittels Immunfluoreszenz unter Verwendung von Antikörpern auf das Hüllprotein überprüft. NB = Nicht bestimmt.

Claims

1. Virus-resistente(s) Pflanzenzelle, Pflanzengewebe, Pflanzensamen oder Pflanze, enthaltend ein rekombinantes DNA-Molekül, welches

einen binären Vektor, der einen Promotor und virales Hüllproteinstrukturgen eines Pflanzenvirus mit einem einzelsträngigen, plus-strängigen, dreiteiligen RNA-Genom umfaßt, wobei

(a) das rekombinante DNA-Molekül kein einzelnes oder mehrere vir-Gene enthält,

(b) der binäre Vektor zur Replikation in A. tumefaciens befähigt ist und

(c) der Promotor und das Strukturgen eine derartige Position und Orientierung zueinander aufweisen, daß eine für ein Hüllprotein kodierende RNA unter Kontrolle des Promotors transkribiert wird.

2. Virus-resistente(s) Pflanzenzelle, Pflanzengewebe, Pflanzensamen oder Pflanze, enthaltend ein rekombinantes DNA-Molekül, welches

einen Promotor, ein virales Hüllproteinstrukturen eines Pflanzenvirus mit einem einzelsträngigen, plus-strängigen, dreiteiligen RNA-Genom und ein ocs- Gen umfaßt, wobei

der Promotor, das Strukturgen und das ocs-Gen eine derartige Position und Orientierung zueinander aufweisen, daß eine für ein Hüllprotein kodierende RNA unter Kontrolle des Promotor transkribiert wird.

3. Virus-resistente(s) Pflanzenzelle, Pflanzengewebe, Pflanzensamen oder Pflanze, enthaltend ein rekombinantes DNA-Molekül, welches

einen Promotor, der aus der Gruppe, bestehend aus einem Oktopin-TL-Gen- Promotor, einem Chalconsynthase-Promotor, einem Chlorophyll-a/b- Bindungsprotein-Promotor und einem CaMV-19S-Promotor, ausgewählt ist und ein virales Hüllproteinstrukturgen eines Pflanzenvirus mit einem einzelsträngigen, plus-strängigen, dreiteiligen RNA-Genom umfaßt, wobei der Promotor und das Strukturgen eine derartige Position und Orientierung zueinander aufweisen, daß eine für ein Hüllprotein kodierende RNA unter Kontrolle des Promotors transkribiert wird.

4. Virus-resistente(s) Pflanzenzelle, Pflanzengewebe, Pflanzensamen oder Pflanze, enthaltend ein rekombinantes DNA-Molekül, welches

einen Promotor, ein virales Hüllproteinstrukturgen eines Pflanzenvirus mit einem einzelsträngigen, plus-strängigen, dreiteiligen RNA-Genom und einen CaMV-Transkriptterminator umfaßt, wobei

der Promotor, das Strukturgen und der CaMV-Transkriptterminator eine derartige Position und Orientierung zueinander aufweisen, daß eine für ein Hüllprotein kodierende RNA unter Kontrolle des Promotors transkribiert wird.

5. Virus-resistente(s) Pflanzenzelle, Pflanzengewebe, Pflanzensamen oder Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das DNA-Molekül weiter einen mit dem viralen Hüllproteinstrukturgen funktionsfähig verbundenen Transkriptterminator umfaßt.

6. Virus-resistente(s) Pflanzenzelle, Pflanzengewebe, Pflanzensamen oder Pflanze nach Anspruch 5, wobei die Transkriptterminatorstelle ein CaMV- Transkripterminator ist.

7. Virus-resistente(s) Pflanzenzelle, Pflanzengewebe, Pflanzensamen oder Pflanze nach einem der Ansprüche 1, 3 und 4, wobei das DNA-Molekül weiter ein ocs-Gen umfaßt.

8. Virus-resistente(s) Pflanzenzelle, Pflanzengewebe, Pflanzensamen oder Pflanze nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei das DNA-Molekül weiter eine T-DNA-Border-Wiederholungssequenz umfaßt.

9. Virus-resistente(s) Pflanzenzelle, Pflanzengewebe, Pflanzensamen oder Pflanze nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Hüllprotein von einem Virus der Alfalfa-Mosaik-Virusgruppe stammt.

10. Virus-resistente(s) Pflanzenzelle, Pflanzengewebe, Pflanzensamen oder Pflanze nach Anspruch 9, wobei das Virus ein AMV ist.

11. Virus-resistente(s) Pflanzenzelle, Pflanzengewebe, Pflanzensamen oder Pflanze nach Anspruch 10, wobei das Virus ein AMV vom Stamm 425 ist.

12. Virus-resistente(s) Pflanzenzelle, Pflanzengewebe, Pflanzensamen oder Pflanze nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Promotor ein CaMV-19S-Promotor ist.

13. Virus-resistente(s) Pflanzenzelle, Pflanzengewebe, Pflanzensamen oder Pflanze nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das DNA- Molekül weiter einen in Pflanzen expremierbaren, selektierbaren oder screeningfähigen Marker umfaßt.

14. Virus-resistente(s) Pflanzenzelle, Pflanzengewebe, Pflanzensamen oder Pflanze nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der selektierbare Marker für Neomycinphosphotransferase kodiert.

15. Verfahren zur Herstellung einer Virus-resistenten Pflanze, umfassend die Schritte:

(A) Transformieren einer transformierbaren, regenerierbaren Pflanzenzelle mit einem rekombinanten, in einem der Ansprüche 1 bis 14 definierten DNA-Molekül und

(B) Regenerieren der Pflanzenzelle zur Herstellung einer Virus-resistenten Pflanze und gegebenenfalls Vermehren der Pflanze.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das DNA-Molekül einen in Pflanzen expremierbaren Marker umfaßt und das Verfahren den Schritt des Züchtens der transformierten Pflanzenzelle in Gegenwart eines selektiven Mittels, gegenüber welchem der Marker Resistenz verleiht, umfaßt.

17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, umfassenden weiteren Schritt des geschlechtlichen Kreuzens der im Schritt (B) hergestellten Pflanze mit einer zweiten Pflanze, die einen gewünschten genetischen Hintergrund aufweist, zur Erzeugung eines Ausgangshybrids, und gegebenenfalls Rückkreuzen des Ausgangshyprids und seines Nachkommens mit Pflanzen, die den gewünschten genetischen Hintergrund aufweisen, zur Erzeugung Virusresistenter Pflanzen mit einem gewünschten Genotyp.