DE3688246T2

DE3688246T2 - Kunstpolypeptide zum nachweis mykobakterieller infektionen.

Info

Publication number: DE3688246T2
Application number: DE86905514T
Authority: DE
Inventors: A Houghten; Percy Minden; M Shinnick
Original assignee: Scripps Clinic and Research Foundation
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1985-08-12
Filing date: 1986-08-12
Publication date: 1993-10-21
Anticipated expiration: 2006-08-13
Also published as: AU6229386A; JPH07300497A; JP2573815B2; EP0233936A4; US4889800A; WO1987001118A1; ATE87935T1; DE3688246D1; US4689397A; JPS63500524A; EP0233936B1; EP0233936A1; CA1306582C; AU605108B2; JPH0762030B2

Description

Technisches Gebiet

Die Erfindung bezieht sich auf Immunogene, Antigene, Inocula, Antikörper, Verfahren und Systeme, die für den Nachweis, die Diagnose und Behandlung von Erkrankungen, die mycobakterielle Infektionen involvieren, nützlich sind.

Hintergrund der Erfindung

Mycobakterien sind schon vor langer Zeit als bakterielles Pathogen für den Menschen erkannt worden und rufen immer noch verheerende Krankheiten hervor, insbesondere in den Entwicklungsländern. World Health Organization, Bull. WHO, 61, 779 (1983). Tuberkulose wird durch eine Infektion der Atemwege mit Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) hervorgerufen und sucht derzeit weltweit ungefähr 30 Millionen Leute mit einer jährlichen Mortalität von ungefähr 3 Millionen heim.
Für immundiagnostische und immunprophylaktische Zwecke sind rohe bakterielle Antigenpräparationen verwendet worden. Der von Koch 1881 entwickelte Tuberkulintest war der erste bei Menschen verwendete immundiagnostische Test. Tuberkulin, ein M. tuberculosis-Filtrat von komplexer, jedoch schlecht definierter Zusammensetzung, wird derzeit als Antigen für einen Haut-Überempfindlichkeitstest vom verzögerten Typ (DCH) oder Hauttest verwendet, um einen früheren Kontakt mit dem Pathogen nachzuweisen. Seibert et al., Am. Rev. Tuberc. 69, 585 (1954). Unglücklicherweise ist die Verwendbarkeit von Tuberkulin sowohl durch mangelnde Spezifität als auch durch seine Unfähigkeit, zwischen aktiver Krankheit, früherer Sensibilisierung durch Kontakt mit M. tuberculosis oder Kreuzsensibilität mit anderen Mycobakterien zu unterscheiden, begrenzt.
Derzeit wird Bacillus Calmette-Guerin (BCG), ein avirulenter Mycobacterium bovis (M. bovis)-Stamm, als Lebendimpfstoff verwendet, um Menschen vor Tuberkulose zu schützen. Calmette, A., J. Am. Med. Assoc., 96, 58 (1931). Während BCG das Auftreten von Tuberkulose in Westeuropa wirksam verringert hat (Medical Research Council, Bull. WHO 46, 371 (1972)), ist es kürzlich in einem größeren Versuch in Indien als unwirksam befunden worden (World Health Organization, WHO Tech. Reh. Ser., 651 (1980)).
Ein grundlegendes Problem bei den rohen Antigenpräparationen, die jetzt zum Nachweis mycobakterieller Infektionen verwendet werden, ist, daß die Antigenpräparationen oft positiv mit mehreren verschiedenen mycobakteriellen Arten reagieren. Dies erschwert natürlich die Diagnose und das Aufstellen eines geeigneten Behandlungsplanes. Ein Reagens, das eine Immunantwort gegen eine bestimmte mycobakterielle Art spezifisch hervorruft, wäre für die Diagnose und Behandlung mycobakterieller Infektionen von Vorteil.
Die Vorteile der Verwendung eines definierten Polypeptidantigens in einer DCH-Reaktion sind zahlreich. Beispielsweise könnte das Polypeptid im Fall von mycobakteriellen Infektionen ein nützliches Reagens für den spezifischen Nachweis einer tuberkulösen mycobakteriellen Infektion sein und so die Kreuzreaktivitätsprobleme, die mit den derzeit verwendeten Hauttestantigenen verbunden sind, umgehen, da die Aminosäuresequenz des Polypeptides einem Teil eines Proteines entspricht, das in der tuberkulösen mycobakteriellen Art spezifisch exprimiert wird. Weiterhin kann das Polypeptid chemisch synthetisiert werden, um die Notwendigkeit der Zucht großer Kulturen eines pathogenen Organismus für die Produktion der Hauttestantigene zu beseitigen.
Das Polypeptid kann auch für den Nachweis oder die Prävention (Impfung) von mycobakteriellen Infektionen verwendet werden. Tatsächlich könnte ein das Polypeptid enthaltendes Inoculum Tuberkulin oder PPD (gereinigtes Proteinderivat) als Antigen der Wahl in DCH oder Hauttests für den Nachweis von Tuberkulose in Menschen ersetzen.
Obwohl das allgemeine Konzept der Herstellung synthetischer Antigene (Immunogene) und deren Verwendung zur Induktion von Antikörpern mit vorbestimmter Spezifität bereits beschrieben ist, bleibt ein großes Gebiet dieser Technologie, das sich nach wie vor einer Vorhersagbarkeit entzieht. Dafür gibt es mindestens zwei Gründe. Erstens induziert ein synthetisches Antigen (Immunogen) nicht notwendigerweise Antikörper, die mit dem intakten Protein in seiner nativen Umgebung immunreagieren. Zweitens gehen die natürlichen Antikörper eines Wirts gegen ein natürlich auftretendes Immunogen, beispielsweise gegen ein virales Protein, selten eine Immunreaktion mit einem Polypeptid ein, das einem kurzen linearen Anteil der Aminosäuresequenz des Immunogens entspricht. Von dem letztbeschriebenen Phänomen wird angenommen, daß es eine Folge der Tatsache ist, daß kurzen linearen Polypeptiden die erforderlichen Sekundär- und Tertiärkonformationsstrukturen fehlen.
In einem Übersichtsartikel von Benjamini, E., et al., Current Topics in Microbiology and Immunology 58, 85 (1972), werden viele der Arbeiten über die Bindung von Peptiden durch Antikörper, die gegen Proteine gemacht worden sind, zusammengefaßt. Die Rolle der Peptidstruktur bei der Antikörperbindung ist von Goodman, J. W., Immunochem. 6 139 (1969), betont worden.
Die meisten der Untersuchungen, die sich mit den Wirkungen von Veränderungen der Sequenz des Peptides auf die Antikörperbindung beschäftigen, sind als Hinweis darauf interpretiert worden, daß die Struktur der Antikörperbindungsstelle eine vorherrschende Rolle spielt. Die Wirkung von Sequenz- und Strukturveränderungen wird in diesen Studien vermischt und ist schwierig zu trennen. Einige dieser Untersuchungen können genau so gut durch strukturelle Veränderungen im Antigen, die die Bindung beeinflussen, erklärt werden.
Die Antikörperantwort involviert auf molekularer Ebene die Bindung eines Antigens definierter Sequenz (Primärstruktur) und definierter Konformation (Sekundär- und Tertiärstruktur). Immunantworten gegen Proteinantigene sind traditionell als gegen die Primär-, Sekundär- oder Tertiärstruktur des Proteins gerichtet interpretiert worden.
Dieses Klassifikationsschema kann Gültigkeit für Proteine haben, die eine gut definierte Gesamtstruktur bei physiologischen Temperaturen und in physiologischen Lösungen haben.
Seine Gültigkeit für Peptidantigene, die eine dynamischere Struktur haben, ist zweifelhaft.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft synthetische Polypeptide, die die Produktion von Antikörpern induzieren können, die mit einem Antigen von einem tuberkulösen Mycobakterium immunreagieren. Die Polypeptide enthalten ungefähr 13 bis ungefähr 40 Aminosäurereste und umfassen die Aminosäuresequenz, die, von links nach rechts und in Richtung vom Aminoterminus zum Carboxyterminus geschrieben, durch die Formel:
dargestellt wird. Die Polypeptide können Cystein (Cys)-Reste entweder am Aminoterminus oder am Carboxyterminus oder an beiden umfassen.
Die Polypeptide können, wenn sie an einen Träger gebunden sind und in einer wirksamen Menge in einen Säugetierwirt eingeführt werden, die Produktion von Antikörpern induzieren, die mit einem Antigen von einem tuberkulösen Mycobakterium immunreagieren. Die Erfindung bezieht sich auch auf pharmazeutisch verträgliche Salze und immunologisch verwandte Varianten des Polypeptides.
Die Polypeptide können außerdem zur Immunreaktion mit humanen Antikörpern, die durch ein natürliches Antigen von einem tuberkulösen Mycobakterium induziert werden, fähig sein.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin synthetische Multimere, die eine Vielzahl von verbundenen synthetischen, sich wiederholenden Polypeptideinheiten enthalten, wobei mindestens eine der sich wiederholenden Einheiten ein Polypeptid, wie oben beschrieben, ist. Die sich wiederholenden Polypeptideinheiten können auf Kopf-zu-Schwanz-Art durch Amidbindungen verbunden sein. Alternativ können die synthetischen Polypeptidmonomere durch andere als Amidbindungen verbunden werden, um ein polymeres Multimer zu bilden, ähnlich wie bei der Verwendung von intramolekularen Interpolypeptidcysteindisulfidbindungen.
In einer weiteren Ausführungsform wird eine wirksame Menge eines erfindungsgemäßen Polypeptides in einem physiologisch verträglichen Verdünnungsmittel verwendet, um ein Inoculum zu bilden, das Antikörper induzieren kann, die mit einem Antigen von einem tuberkulösen Mycobakterium immunreagieren können. Außer für die Verwendung für die Produktion von Antikörpern kann ein erfindungsgemäßes Inoculum als Impfstoff für Menschen verwendet werden, als ein Mittel, um eine aktive Immunität gegen mycobakterielle Infektionen zu induzieren.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Rezeptormolekül, das eine Antikörperbindungsstelle enthält, die zur Immunreaktion mit einem Antigen von einem tuberkulösen Mycobakterium fähig ist. Der Rezeptor wird gegen ein synthetisches Immunogen herangezogen, das ein oben allein oder als Konjugat beschriebenes synthetisches Polypeptid umfaßt.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein diagnostisches System für den Test auf die Gegenwart eines Antigenes von einem tuberkulösen Mycobakterium. Das System umfaßt Rezeptormoleküle, wie oben beschrieben, und ein anzeigendes Mittel zum Anzeigen der Immunreaktion der Bindungsstelle mit einem Antigen von einem tuberkulösen Mycobakterium.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein diagnostisches System zum Testen auf die Gegenwart von Antikörpermolekülen gegen ein Antigen von einem tuberkulösen Mycobakterium in einem Körperbestandteil. Ein solches System umfaßt synthetische Polypeptide, wie oben beschrieben, und ein anzeigendes Mittel, zum Anzeigen der Immunreaktion des Polypeptides mit Antikörpermolekülen gegen ein Antigen von einem tuberkulösen Mycobakterium. In einer bevorzugteren Ausführungsform enthält dieses System weiterhin einen festen Träger, der eine feste Matrix, an die das Polypeptid angeheftet ist, umfaßt. Ein Mittel zum Identifizieren des Isotyps der einer Immunreaktion unterworfenen Antikörpermoleküle kann in das System ebenfalls einbezogen werden.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein diagnostisches System zum Bestimmen der Gegenwart einer zellvermittelten Immunreaktionsfähigkeit gegen ein tuberkulöses mycobakterielles Antigen in einem Wirt, umfassend ein oben beschriebenes synthetisches Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz hat, die der Aminosäuresequenz eines tuberkulösen mycobakteriellen Antigens entspricht. Das Polypeptid kann nach intradermaler Verabreichung an einen Wirt in einer wirksamen Menge und in einem physiologisch verträglichen Verdünnungsmittel die Proliferation Thymus-abgeleiteter Zellen in dem Wirt induzieren. Die Proliferation wird durch Erytheme (Rötungen) und Verhärtungen an der Stelle der intradermalen Verabreichung angezeigt.
Weiter werden Verfahren zum Induzieren der Proliferation Thymus-abgeleiteter Zellen in einem Wirt offenbart, der zuvor mit einem tuberkulösen Mycobakterium immunisiert worden ist, und zum Bestimmen der Gegenwart eines tuberkulösen mycobakteriellen Antigens in einem Wirt. Die Verfahren umfassen die Schritte des Bereitstellens eines Polypeptides, wie es hier diskutiert wird, und der intradermalen Verabreichung einer wirksamen Menge des Polypeptides an den Wirt in einem physiologisch verträglichen Verdünnungsmittel; entsprechend dem letztgenannten Verfahren werden die Proliferation Thymus-abgeleiteter Zellen und die Gegenwart eines tuberkulösen mycobakteriellen Antigens in dem Wirt durch Erytheme und Verhärtungen an der Stelle der intradermalen Verabreichung angezeigt.
Die vorliegende Erfindung stellt verschiedenerlei Nutzen und Vorteile zur Verfügung. Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist es, daß die Verwendung eines synthetischen Polypeptids die Notwendigkeit der Gegenwart des korrespondierenden intakten Proteins umgeht. Das Polypeptid selbst kann einen Impfstoff bereitstellen, der zum Schutz des Wirtes vor der Krankheit ausreichend ist. Folglich sind Verunreinigungen, beispielsweise zellulärer Debris und Toxine, die mit der Produktion verwendbarer Mengen viraler Proteine aus Bakterien verbunden sind, im erfindungsgemäßen Produkt nicht vorhanden.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt die Sequenz von 20 Aminosäuren vom aminoterminalen Teil des BCG-a-Proteins von M. bovis, wie sie von Minden et al., Infect. Immun., 46, 516 (1984), bestimmt worden ist. Weiter werden synthetische Polypeptide, die die ersten 12 Aminosäurereste des BCG-a-Proteins umfassen, gezeigt. Im ersten Fall umfaßt das synthetische Polypeptid einen Cysteinrest am Carboxyterminus. Im zweiten Fall umfaßt das synthetische Polypeptid Cysteinreste sowohl am Aminoterminus als auch am Carboxyterminus.

Eingehende Beschreibung der Erfindung

I. Einleitung

Mit tuberkulösen Mycobakterien infizierte Menschen entwickeln Antikörper gegen mit den Mycobakterien assoziierte Antigene. Die traditionell verwendeten klinischen Verfahren für den Test auf tuberkulöse Mycobakterien und Antikörper gegen tuberkulöse Mycobakterien im Menschen sind mühselig. Außerdem sind die derzeitigen Verfahren für die Reinigung von Antigenen von tuberkulösen Mycobakterien aus der Zellkultur nicht leicht auf eine Massenproduktion umstellbar.
Die vorliegende Erfindung umfaßt die Verwendung der Technologie für synthetische Polypeptide, um einige der Probleme der derzeitigen Verfahren zu überwinden. Relativ kurze synthetische Polypeptide können antigene Determinanten auf einem natürlichen Protein immunologisch nachahmen und können daher zum Erzeugen von Antikörpern einer vorbestimmten Spezifität, die das natürliche Protein erkennen, verwendet werden.
Der Ausdruck "immunologisch nachahmen" wird hier verwendet, um zu bezeichnend daß ein erfindungsgemäßes immunogenes Polypeptid die Produktion von Antikörpern, die an das induzierende Polypeptid und auch an die entsprechende Sequenz in dem intakten Protein binden, induziert. Dieses Phänomen kann sowohl experimentell als auch klinisch ausgenutzt werden.
Experimentell können Antikörper gegen synthetische Polypeptide verwendet werden, um das DNA-Leseraster und daher die Aminosäuresequenz eines klinisch bedeutsamen Proteins, wie dem BCG-a-Protein von M. bovis, zu etablieren. Klinisch können Antikörper einer vorbestimmten Spezifität, die gegen ein synthetisches Polypeptid erzeugt werden, für diagnostische und therapeutische Zwecke verwendet werden.
Es wurden relativ kurze Polypeptide synthetisiert, deren Aminosäuresequenzen im wesentlichen denen eines tuberkulösen mycobakteriellen Antigenes entsprechen.
Die Erfindung umfaßt insbesondere synthetische Polypeptide mit einer Aminosäuresequenz, die im wesentlichen Teilen der Aminosäuresequenz des BCG-a-Proteins aus Mycobacterium bovis-Stamm BCG entsprechen. Dieses Protein wurde von Minden et al., Infect. Tmmun.. 46, 519 (1984) als ein Protein, das spezifisch von tuberkulösen Mycobakterien (M. bovis und M. tuberculosis) exprimiert wird, identifiziert. Wie in der oben genannten Publikation berichtet wird, bestimmten Minden et al. die Sequenz der aminoterminalen 20 Reste dieses Proteins. (Siehe die erste Aminosäuresequenz in Fig. 1).
Erfindungsgemäß wurde ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die den Resten 1 bis 12 des BCG-a-Proteins mit einem Cystein am Carboxyterminus entspricht, synthetisiert (siehe die zweite Aminosäuresequenz von Fig. 1) und es wurde gezeigt, daß sie bei Meerschweinchen, die mit einem Ultraschall-behandelten Extrakt von M. bovis-Stamm BCG immunisiert worden sind, eine verzögerte Haut-Überempfindlichkeitsreaktion hervorrief.
Außerdem wurde in, wie oben beschrieben, immunisierten Meerschweinchen eine ausgeprägtere verzögerte Haut-Überempfindlichkeitsreaktion durch ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die den Resten 1 bis 12 des BCG-a-Proteins entspricht, aber einen Cystein(Cys)-Rest sowohl am Aminoterminus als auch am Carboxyterminus umfaßt, hervorgerufen (siehe die dritte Aminosäuresequenz in Fig. 1).
Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß die Polypeptide in einem Hauttest zum Nachweis von spezifischen Infektionen mit dem tuberkulösen Mycobakterium in Menschen verwendet werden können. Die Polypeptide können außerdem verwendet werden, um die mit dem gegenwärtig verwendeten Haut-Überempfindlichkeitsantigenen vom verzögerten Typ verbundenen Kreuzreaktivitätsprobleme zu umgehen. Die erfindungsgemäßen Polypeptide können Tuberkulin oder PPD als Antigen der Wahl in DCH-Tests zum Nachweis von Tuberkulose in Menschen ersetzen.

A. Synthetische Polypeptide

1. Sequenzen

Die relativ kleinen synthetischen Polypeptide (13 bis 20 Aminosäurereste lang), die in dieser Untersuchung verwendet wurden, wurden unter Verwendung des Festphasenverfahrens von Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 (1963), synthetisiert.
Der Ausdruck "synthetisch", so wie er hier verwendet wird, bedeutet, daß das Polypeptidmolekül oder die sich wiederholende Polypeptideinheit mit chemischen Mitteln gebildet worden ist, d. h., eher chemisch synthetisiert als mit biologischen Mitteln, z. B. gentechnischen Verfahren, hergestellt ist. Die erfindungsgemäßen synthetischen Polypeptide sind daher frei von natürlich auftretenden Proteinen und deren Fragmenten.
Die chemisch synthetisierten Polypeptide unterscheiden sich auch von Abbauprodukten der natürlich auftretenden Proteine, wie sie durch die Wirkung von Bromcyan auf das Protein hergestellt werden. Die gut bekannte chemische Synthese mit Festphasenverfahren, in der blockierte Aminosäurereste nacheinander zugefügt werden, um das gewünschte Polypeptid zu erhalten, ist das bevorzugte Syntheseverfahren, und wird detaillierter unten beschrieben.
Alle hier genannten Aminosäurereste sind in der natürlichen oder L-Konfiguration. Im Einklang mit der Standardnomenklatur für Polypeptide werden die folgenden Abkürzungen für Aminosäurereste verwendet: SYMBOL AMINOSÄURE 1-Buchstabencode 3-Buchstabencode Tyr L-Tyrosin Gly L-Glycin Phe L-Phenylalanin Met L-Methionin Ala L-Alanin Ser L-Serin Ile L-Isoleucin Leu L-Leucin Thr L-Threonin Val L-Valin Pro L-Prolin Lys L-Lysin His L-Histidin Gln L-Glutamin Glu L-Glutaminsäure Glx L-Glutaminsäure oder L-Glutamin Trp L-Tryptophan Arg L-Arginin Asp L-Asparaginsäure Asn L-Asparagin Asx L-Asparaginsäure oder L-Asparagin Cys L-Cystein
Die vorliegende Erfindung umfaßt ein synthetisches Polypeptid, das ungefähr 13 bis ungefähr 40 Aminosäurereste umfaßt und eine Sequenz einschließt, die, von links nach rechts und in Richtung vom Aminoterminus zum Carboxylterminus geschrieben durch die Formel:
definiert wird.
Das Polypeptid kann, wenn es an einen Träger gebunden ist und in einer wirksamen Menge in einen Säugetierwirt eingeführt wird, die Produktion von Antikörpern induzieren, die mit einem Antigen von einem tuberkulösen Mycobakterium immunreagieren.
Die erfindungsgemäßen synthetischen Polypeptide werden hier oft einfach der Kürze wegen als "Polypeptide" oder als "synthetische Polypeptide" bezeichnet.
Der Ausdruck "immunologisch (oder antigenisch) verwandte Varianten" wird hier verwendet, um Polypeptide mit unterschiedlicher Aminosäure-Gesamtsequenz zu bezeichnen, die mindestens einen Teil einer antigenen Determinante teilen und daher immunologisch kreuzreaktiv sind.
Der Ausdruck "antigene Determinante", so wie er hier verwendet wird, bezeichnet den strukturellen Bestandteil eines Moleküls, der für die spezifische Wechselwirkung mit dem korrespondierenden Antikörper (Immunglobulin)-Molekül verantwortlich ist, das durch das gleiche oder ein verwandtes Antigen oder Immunogen hervorgerufen wird.
Der Ausdruck "immunogene Determinante", so wie er hier verwendet wird, bezeichnet den strukturellen Bestandteil eines Moleküls, der für die Induktion eines Antikörpers, der eine Antikörperbindungsstelle (Idiotyp) enthält, die an das Immunogen, wenn es als Antigen verwendet wird, bindet, in einem Wirt verantwortlich ist.
Der Ausdruck "Antigen", so wie er hier verwendet wird, bezeichnet eine Einheit, die von einem Antikörper gebunden wird.
Der Ausdruck "Immunogen", so wie er hier verwendet wird, beschreibt eine Einheit, die die Antikörperproduktion in einem Wirtstier induziert. In einigen Fällen sind das Antigen und das Immunogen die gleiche Einheit, während in anderen Fällen diese beiden Einheiten unterschiedlich sind.
Beispielsweise wurde, wie im Folgenden beschrieben wird, das Polypeptid zur Induktion der Produktion von Antikörpern in Meerschweinchen verwendet, und daher als Immunogen eingesetzt. Die so induzierten Antikörper binden an das Polypeptid, wenn es als ein Antigen verwendet wird. Das Polypeptid war daher sowohl ein Immunogen als auch ein Antigen. Antikörper gegen tuberkulöse Mycobakterien binden sowohl an das tuberkulöse mycobakterielle Antigen als Immunogen und Antigen als auch an das Polypeptid als Antigen.
Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind die hier beschriebenen synthetischen Polypeptide, die pharmazeutisch verträglichen Salze davon und immunologisch verwandte Varianten davon. Jedes dieser Polypeptide ist zur Induktion von Antikörpern fähig, die an Antigene von tuberkulösen Mycobakterien binden, wie oben beschrieben.
Es wird festgestellt, daß ein Gedankenstrich am Anfang oder Ende einer Aminosäuresequenz eine Bindung an einen Rest, beispielsweise H oder OH, am Amino- bzw. Carboxyterminus, oder eine weitere Sequenz von einer oder mehr Aminosäureresten bis zu einer Gesamtzahl von 40 Aminosäureresten in der Polypeptidkette bedeutet.
Der Ausdruck "pharmazeutisch verträgliche Salze", so, wie er hier verwendet wird, bezeichnet nicht-toxische Alkalimetall-, Erdalkalimetall- und Ammoniumsalze, die in der pharmazeutischen Industrie verwendet werden, einschließlich der Natrium-, Kalium-, Lithium-, Calcium-, Magnesium- und Ammoniumsalze und ähnlicher, die nach im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden. Der Ausdruck umfaßt außerdem nicht-toxische Säureadditionssalze, die im allgemeinen durch Umsetzen der erfindungsgemäßen Verbindungen mit einer geeigneten organischen oder anorganischen Säure hergestellt werden. Beispielhafte Salze umfassen das Hydrochlorid, Hydrobromid, Sulfat, Bisulfat, Acetat, Oxalat, Valerat, Oleat, Laurat, Vorat, Benzoat, Lactat, Phosphat, Tosylat, Citrat, Maleat, Fumarat, Succinat, Tatrat und ähnliche.

B. Multimere

Die vorliegende Erfindung umfaßt weiterhin ein synthetisches Multimer, das eine Vielzahl von verbundenen sich wiederholenden synthetischen Polypeptideinheiten enthält, wobei mindestens eine der sich wiederholenden Einheiten eines der hier beschriebenen Polypeptide ist.
Die erfindungsgemäßen Multimere können allein oder an einen Träger gebunden die Produktion von Antikörpern, die an ein Antigen von tuberkulösen Mycobakterien binden, induzieren, wenn sie in einer wirksamen Menge in einen Säugetierwirt eingeführt werden. Solche Multimere, die das besonders bevorzugte erfindungsgemäße Polypeptid enthalten, können außerdem auch an die menschlichen Antikörper binden, die durch ein Antigen von einem tuberkulösen Mycobakterium induziert worden sind.
Die erfindungsgemäßen Multimere sind daher, wie das Polypeptid, immunogen, und sind Antigene für Human-Antikörper gegen tuberkulöse Mycobakterien. Diese Multimere können daher verwendet werden, um die Produktion von Antikörpern gegen tuberkulöse Mycobakterien zu induzieren, die für im folgenden diskutierte diagnostische Verfahren und Systeme nützlich sind, und können außerdem als ein Antigen in entsprechenden diagnostischen Verfahren und Systemen verwendet werden.
Multimere, die weniger als ungefähr 35 Aminosäurereste in dem Gesamtmultimer enthalten, werden für die Verwendung als ein Immunogen typischerweise an einen Träger gebunden. Multimere, die mehr als insgesamt 35 Aminosäurereste enthalten, sind typischerweise ausreichend immunogen, um ohne einen Träger verwendet zu werden.
Polypeptidmultimere können durch Verbinden von synthetisierten Polypeptidmonomeren auf Kopf-an-Schwanz-Weise unter Verwendung des zuvor genannten Festphasenverfahrens hergestellt werden; d. h., es kann eine vollständige Polypeptidsequenz am Harz synthetisiert werden, gefolgt von einer oder mehreren der gleichen oder unterschiedlichen Polypeptidsequenzen, wobei die gesamte Multimereinheit anschließend vom Harz abgespalten wird und eingesetzt wird, wie es hier im Folgenden beschrieben wird. Solche Kopf-an-Schwanz-Polypeptidmultimere enthalten bevorzugt ungefähr 2 bis ungefähr 4 sich wiederholenden Polypeptideinheiten.
Wahlweise können die Multimere als ein Polymer synthetischer Polypeptide, die als Monomere verwendet werden, hergestellt werden. So, wie er hier verwendet wird, ist der Ausdruck "Polymer" in seinen verschiedenen grammatischen Formen als ein Typ eines Multimers definiert, das eine Vielzahl von synthetischen, statistisch sich wiederholenden Copolymereinheiten enthält, die miteinander anders als durch Peptidbindungen verbunden sind.
Ein beispielhaftes erfindungsgemäßes Polymer kann unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Polypeptides, das einen sowohl am Amino- als auch Carboxyterminus zugefügten Cysteinrest enthält (diCys-Polypeptid), hergestellt werden. Das diCys-Polypeptid kann aneinander durch intramolekulare Interpolypeptidcysteindisulfidbindungen gebunden werden, wobei ein Oxidationsverfahren zur Bildung eines immunogenen, antigenen Polymers verwendet wird. Das so hergestellte Polymer enthält eine Vielzahl der erfindungsgemäßen Polypeptide als sich wiederholende Einheiten. Diese sich wiederholenden Einheiten werden durch die oben diskutierten oxidierten Cysteine (Cystin)-Reste aneinander gebunden.
Die Gegenwart von ein oder zwei terminalen Cys-Resten in einem erfindungsgemäßen Polypeptid für die Zwecke der Bindung des Polypeptides an einen Träger oder zum Herstellen eines Polymers wird nicht als Veränderung der Aminosäuresequenz der sich wiederholenden Einheiten des erfindungsgemäßen Polypeptides verstanden.

C. Inocula

In einer weiteren Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Polypeptide in einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel verwendet, um ein Inoculum oder einen Impfstoff zu bilden, der, wenn er in einer wirksamen Menge verabreicht wird, zur Induktion von Antikörpern fähig ist, die mit einem Antigen von einem tuberkulösen Mycobakterium immunreagieren.
Das Wort "Inoculum" in seinen verschiedenen grammatischen Formen wird hier verwendet, um eine Zusammensetzung zu beschreiben, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid als aktiven Bestandteil enthält, der für die Herstellung von Antikörpern gegen tuberkulöse Mycobakterien verwendet wird. Wenn ein Polypeptid zur Induktion von Antikörpern verwendet wird, soll verstanden werden, daß das Polypeptid alleine verwendet werden kann, an einen Träger gebunden oder als ein Multimer; diese Alternativen werden jedoch zugunsten der Einfachheit des Ausdrucks im Folgenden nicht immer ausgedrückt.
Bei Polypeptiden, die weniger als ungefähr 35 Aminosäurereste enthalten, ist es bevorzugt, einen Träger zu verwenden, um die Produktion von Antikörpern zu induzieren. Ein an einen Träger gebundenes oder damit in Verbindung stehendes Polypeptid wird hier zur Veranschaulichung verwendet, wenn Antikörper hergestellt werden. Das Inoculum kann zur Produktion von Antikörpern für die Verwendung in diagnostischen Tests verwendet werden, die Antigene von tuberkulösen Mycobakterien nachweisen.
Der Ausdruck "Impfstoff", in seinen verschiedenen grammatischen Formen wird hier verwendet, um einen Typ von Inoculum zu beschreiben, der ein erfindungsgemäßes Polypeptid als aktiven Bestandteil enthält, der für die Induktion einer aktiven Immunität in einem Wirtssäugetier verwendet wird. Da eine aktive Immunität die Produktion von Antikörpern involviert, können ein Impfstoff und ein Inoculum identische Bestandteile enthalten, aber ihre Verwendungen sind unterschiedlich. In den meisten Fällen sind die Bestandteile eines Impfstoffes und eines Inoculums unterschiedlich, weil viele Adjuvanzien, die in Tieren nützlich sind, in Menschen nicht verwendet werden können.
Das erfindungsgemäße Inoculum oder der erfindungsgemäße Impfstoff enthält eine wirksame Menge eines erfindungsgemäßen Polypeptides, als Multimer, beispielsweise als Polymer von einzelnen Polypeptiden, die miteinander über oxidierte terminal am Polypeptid angeordnete Cysteinreste verbunden sind, oder als ein an einen Träger gebundenes Konjugat. Zugunsten der Einfachheit des Ausdrucks werden die verschiedenen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Polypeptide insgesamt mit dem Ausdruck "Polypeptid" und seinen verschiedenen grammatischen Formen bezeichnet.
Die wirksame Menge eines Polypeptides pro Dosierungseinheit hängt unter anderem von der Art des zu beimpfenden Tieres, dem Körpergewicht des Tieres und dem gewählten Impfplan ab, wie im Stand der Technik gut bekannt ist. Inocula und Impfstoffe enthalten typischerweise Polypeptidkonzentrationen von ungefähr 100 ug bis ungefähr 500 mg pro Inoculation (Dosis). Die angegebenen Polypeptidmengen beziehen sich auf das Gewicht des Polypeptides ohne das Gewicht eines Trägers, sofern ein Träger verwendet wird. Spezielle beispielhafte Inocula werden im Folgenden mit Gewicht des Trägers plus Polypeptid (Konjugat) angegeben.
Der Ausdruck "Dosierungseinheit" bezeichnet physikalisch diskrete Einheiten, die als Einfachdosen für Tiere geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge des aktiven Materials enthält, die so berechnet ist, daß sie den gewünschten therapeutischen Effekt in Verbindung mit dem erforderlichen Verdünnungsmittel, d. h., Träger oder Vehikel, erzeugt. Die Einzelheiten der neuen erfindungsgemäßen Dosierungseinheit werden durch (a) die einzigartigen Merkmale des aktiven Materials und den besonderen therapeutischen Effekt, der erreicht werden kann, und (b) die in der Technik inhärenten Beschränkungen des Vermischens solcher aktiven Materialien für therapeutische Verwendung in Tieren diktiert und sind direkt abhängig davon, wie im Detail in der Beschreibung offenbart ist, wobei dies Merkmale der vorliegenden Erfindung sind.
Inocula werden typischerweise aus getrockneten festen Polypeptidkonjugaten oder Polypeptidpolymeren durch Suspendieren des Polypeptidkonjugates oder Polypeptidpolymeres in einem physiologisch verträglichen (akzeptablen) Verdünnungsmittel, beispielsweise Wasser, Salzlösung oder Phosphatgepufferter Salzlösung, hergestellt.
Inocula können außerdem ein Adjuvans enthalten. Adjuvanzien, wie z. B. vollständiges Freund'sches Adjuvans (CFA), unvollständiges Freund'sches Adjuvans (IFA) und Alaun sind in der Technik gut bekannte Materialien und sind aus verschiedenen Quellen kommerziell erhältlich.

D. Rezeptoren

Antikörper und im wesentlichen ganze Antikörper, erzeugt gegen (induziert durch) die erfindungsgemäßen Polypeptide, sowie Antikörperbindungsstellen, die aus solchen Antikörpern hergestellt sind, stellen eine weitere Ausführungsform der Erfindung dar. Diese Moleküle werden insgesamt als Rezeptoren bezeichnet. Rezeptoren werden in Säugetierwirten, beispielsweise Mäusen, Meerschweinchen, Kaninchen, Pferden und ähnlichen, durch Immunisieren unter Verwendung der oben beschriebenen Inocula erzeugt.
Geeignete monoklonale Rezeptoren, typischerweise gesamte Antikörper, können auch unter Verwendung der von Niman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 80, 4949 (1983) beschriebenen Hybridomtechnologie hergestellt werden, wobei diese Beschreibung durch Verweis einbezogen wird. Kurzgesagt werden zur Bildung eines Hybridomes, von dem ein monoklonaler Rezeptor erzeugt wird, eine Myelom- oder eine andere sich selbst erhaltende Zellinie mit Lymphozyten verschmolzen, die aus der Milz eines mit einem erfindungsgemäßen Polypeptid hyperimmunisierten Säugetiers erhalten worden sind.
Es ist bevorzugt, daß die Myelomzellinie von der gleichen Art stammt, wie die Lymphozyten. Typischerweise ist eine Maus vom Stamm BALB/c das bevorzugte Säugetier. Geeignete Mausmyelome für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen die Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin-sensitiven (HAT)-Zellinien P3X63-Ag8.653 (ATCC CRL 1580), und Sp2/O-Ag14 (ATCC CRL 1581).
Die Splenozyten werden typischerweise mit den Myelomzellen unter Verwendung von Polyethylenglycol, beispielsweise PEG 1500 oder PEG 6000, verschmolzen. Verschmolzene Hybride werden aufgrund ihrer Empfindlichkeit gegen HAT ausgewählt. Hybridome, die die erfindungsgemäßen Rezeptormoleküle erzeugen, werden unter Verwendung des Enzym-gebundenen Immunadsorptionstests (ELISA), der in dem Abschnitt Material und Methoden im Folgenden beschrieben wird, identifiziert.
Monoklonale Rezeptoren können nicht nur aus Hybridomüberständen erhalten werden, sondern können ebenso in im allgemeinen konzentrierterer Form aus der Ascitesflüssigkeit von Säugetieren erhalten werden, in die das gewünschte Hybridom eingeführt worden ist. Die Produktion von monoklonalen Antikörpern unter Verwendung von Ascitesflüssigkeit ist gut bekannt und wird im Folgenden nicht weiter behandelt.
Ein erfindungsgemäßer Rezeptor bindet sowohl an das Polypeptid, gegen das er erzeugt ist, und bindet außerdem an die korrespondierende antigene Determinante aus tuberkulösem Mycobakterium, das das erfindungsgemäße Polypeptid immunologisch nachahmt. Daher kann das erfindungsgemäße Polypeptid sowohl ein Immunogen als auch ein Antigen sein.
Die Erfindungsgemäßen Rezeptoren können als oligoklonal beschrieben werden, im Vergleich zu den natürlich auftretenden polyklonalen Antikörpern, da sie gegen ein Immunogen erzeugt werden, das relativ wenige Epitope aufweist, im Vergleich zu den Epitopen eines intakten antigenen Moleküls aus tuberkulösen Mycobakterien. Folglich binden die erfindungsgemäßen Rezeptoren an Epitope des Polypeptides, während natürlich auftretende Antikörper, die gegen Antigene von tuberkulösen Mycobakterien erzeugt worden sind, an über das gesamte tuberkulöse Mycobakteriumantigenmolekül verteilte Epitope binden.

E. Diagnostische Testsysteme und Verfahren

Die Polypeptide, Antikörper und Antikörperbindungsstellen (Rezeptoren), die gegen die zuvor beschriebenen Polypeptide erzeugt werden, und die erfindungsgemäßen Verfahren können außerdem für diagnostische Tests, beispielsweise Immuntests, verwendet werden. Solche diagnostischen Verfahren umfassen beispielsweise Enzym-Immuntests, Enzymmultiplizierte Immuntestverfahren (enzyme multipled immunoassay technique - EMIT), Enzym-gebundene Immunadsorbtion (ELISA), Radioimmuntests (RIA), Fluoreszenzimmuntests, entweder Einzel- oder Doppelantikörperverfahren und andere Verfahren, in denen entweder der Rezeptor oder das Antigen mit einem nachweisbaren Marker oder anzeigenden Mittel markiert ist. Siehe allgemein Maggio, Enzyme Immunoassay CRC Press, Cleveland, Ohio (1981); und Goldman, M., Fluorescent Antibody Methods. Academic Press, New York, N.Y. (1980). Spezielle Beispiele solcher Testverfahren und Systeme, die für die Durchführung dieser Verfahren nützlich sind, sind im Folgenden beschrieben.

1. Tests auf tuberkulöse Mycobakterien

Ein Verfahren zum Testen auf die Gegenwart eines Antigenes von tuberkulösen Mycobakterien in einer Körperprobe wird hier ebenfalls ins Auge gefaßt. Gemäß einem allgemeinen Verfahren wird eine zu untersuchende Körperprobe bereitgestellt und mit Rezeptormolekülen gemischt, die eine Antikörperbindungsstelle enthalten, die gegen ein erfindungsgemäßes synthetisches Polypeptid erzeugt worden ist. Die Mischung wird für einen vorbestimmten Zeitraum aufbewahrt, der für die Rezeptormoleküle ausreichend ist, mit dem Antigen von dem tuberkulösen Mycobakterium, das in der Körperprobe vorhanden ist, eine Immunreaktion einzugehen. Das Ausmaß dieser Immunreaktion wird dann gemessen, um festzustellen, ob in der untersuchten Körperprobe ein tuberkulöses mycobakterielles Antigen vorhanden war oder nicht.
Ein anschauliches diagnostisches System in Kit-Form, das eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt, die zum Nachweis von tuberkulösem mycobakteriellen Antigen nützlich ist, das in einem Aliquot der Körperprobe vorhanden ist, enthält erfindungsgemäße Rezeptormoleküle, beispielsweise Antikörper, im wesentlichen ganze Antikörper oder Antikörperbindungsstellen, wie z. B. Fab- und F(ab')&sub2;-Teile, die gegen ein erfindungsgemäßes Polypeptid erzeugt worden sind, in einer Packung. Dieses System umfaßt außerdem ein anzeigendes Mittel zum Anzeigen der Gegenwart einer Immunreaktion zwischen dem Rezeptor und dem Antigen.
Typische anzeigende Mittel umfassen Radioisotope, z. B. ¹²&sup5;J und ¹³¹J, Enzyme, beispielsweise alkalische Phosphatase, Meerrettichperoxidase, β-D-Galactosidase und Glucoseoxidase, und Fluorochrom-Farbstoffe, beispielsweise Fluorescein und Rhodamin. Das anzeigende Mittel kann direkt an einen erfindungsgemäßen Rezeptor gebunden sein. Das anzeigende Mittel kann auch an ein getrenntes Molekül, beispielsweise einen zweiten Antikörper, an eine Antikörperbindungsstelle oder an Staphylococcus aureus (S. aureus)-Protein A gebunden sein, das mit dem erfindungsgemäßen Rezeptor reagiert (bzw. daran bindet). Ein spezifisches Beispiel eines solchen anzeigenden Mittels in Form eines separaten Moleküles ist ein ¹²&sup5;J-markiertes S. aureus-Protein A.
Das anzeigende Mittel erlaubt den Nachweis des Immunreaktionsproduktes und wird getrennt vom Rezeptor verpackt, wenn es nicht direkt an den erfindungsgemäßen Rezeptor gebunden ist. Das Rezeptormolekül immunreagiert mit dem tuberkulösen mycobakteriellen Antigen unter Bildung eines Immunreaktanten, wenn es mit einer Körperprobe, beispielsweise einem Aceton-fixierten Ausstrich peripherer Blutlymphozyten (PBL) gemischt wird, und das vorhandene anzeigende Mittel zeigt dann die Bildung eines Immunreaktionsproduktes an.
Eine Ausführungsform eines diagnostischen Verfahrens für tuberkulöse mycobakterielle Antigene ist ein Immunfluoreszenztest, der ein amplifizierendes Mittel umfaßt. In einem solchen Test wird ein PBL-Ausstrich auf einem ebenen Objektträger Aceton-fixiert. Ein Aliquot der Antikörper, die erfindungsgemäß z. B. in Kaninchen oder Meerschweinchen erzeugt worden sind, im allgemeinen ungefähr 100 ug bis ungefähr 500 ug, wird mit dem Objektträger unter Verwendung gut bekannter Verfahren in Kontakt gebracht.
Nach dem Abspülen jedweder erfindungsgemäßer Antikörper, die keine Immunreaktion eingegangen sind, werden typischerweise alle unspezifischen Bindungsstellen auf dem Objektträger mit einem Protein, beispielsweise Rinderserumalbumin (BSA) blokkiert, sofern es gewünscht ist. Ein zweites Reagens (amplifizierendes Reagens), beispielsweise Komplement oder anti- Immunglobulin-Antikörper, z. B. Meerschweinchenkomplement, kann dann auf dem Objektträger inkubiert werden.
Nach dieser zweiten Inkubation wird das nicht umgesetzte amplifizierende Reagens entfernt, z. B. durch Spülen, wobei nur zurückbleibt, was an die zuerst genannten Antikörper auf dem Objektträger gebunden ist. Ein drittes Reagens (anzeigendes Mittel), z. B., Antikörper, z. B. Ziege-anti- Meerschweinchen-Komplement, wird dann auf den Testobjektträger inkubiert. Das dritte Reagens wird markiert, indem es an einen fluorochromen Farbstoff, beispielsweise Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Rhodamin B-Isothiocyanat (RITC), Tetramethylrhodaminisothiocyanat (TRITC), 4,4'- Diisothiocyanstilben-2,2'-disulfonsäure (DIDS) und ähnliche, die in der Technik gut bekannt sind, gebunden wird.
Nach dieser dritten Inkubation wird alles nicht umgesetzte dritte Reagens weggespült, wobei alle FITC-markierten Ziegeanti-Meerschweinchenkomplement-Antikörper, die an das Komplement auf dem Testobjektträger binden, zurückbleiben. Die Gegenwart von FITC-markiertem dritten Reagens kann unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen werden und dadurch die Gegenwart einer mycobakteriellen Infektion anzeigen.
Ein bevorzugtes diagnostisches System, bevorzugt in Kit- Form, das für die Durchführung des oben beschriebenen Testverfahrens nützlich ist, umfaßt in getrennten Packungen (a) erfindungsgemäße Rezeptoren (Antikörper), die mit einem tuberkulösen mycobakteriellen Antigen immunreagieren, (b) ein zweites, amplifizierendes Reagens, beispielsweise Komplement, wie Meerschweinchenkomplement, anti-Immunglobulin-Antikörper oder S. aureus-Protein A, das mit dem Rezeptor reagiert, und (c) ein anzeigendes Mittel, das direkt an das amplifizierende Mittel gebunden sein kann oder ein Teil eines getrennten Moleküles, beispielsweise eines Antikörpers oder Antikörperteiles, der mit dem amplifizierenden Reagens reagiert, sein kann. Das anzeigende Mittel zeigt die Immunreaktion des Rezeptormoleküles mit dem tuberkulösen mycobakteriellen Antigen durch die Vermittlung des amplifizierenden Reagenzes indirekt an.
Rezeptormoleküle und getrennte anzeigende Mittel jedes hier beschriebenen diagnostischen Systems sowie das oben beschriebene amplifizierende Reagens können in Lösung, als Flüssigdispersion oder als im wesentlichen trockenes Pulver, z. B. in lyophilisierter Form, bereitgestellt werden. Wo das anzeigende Mittel ein vom amplifizierenden Reagens getrenntes Molekül ist, ist es bevorzugt, daß das anzeigende Mittel getrennt verpackt ist. Wo das anzeigende Mittel ein Enzym ist, kann das Substrat des Enzymes in einer getrennten Packung des Systemes ebenfalls bereitgestellt werden. Ein fester Träger, wie beispielsweise der zuvor beschriebene Mikroskopobjektträger, ein oder mehrere Puffer oder Aceton können ebenfalls als getrennt verpackte Elemente in diesem diagnostischen Testsystem enthalten sein.
Die hier im Zusammenhang mit den diagnostischen Systemen diskutierten Packungen werden für diagnostische Systeme gebräuchlicherweise verwendet. Solche Packungen umfassen Glas- und Kunststoff- (z. B., Polyethylen, Polypropylen und Polycarbonat) Flaschen, Röhrchen, Kunststoff- und Kunststofffolien laminierte Hüllen und ähnliches.
Die Verwendung ganzer intakter biologisch aktiver Antikörpers ist in vielen diagnostischen Systemen, wie z. B. dem oben beschriebenen Immunfluoreszenztest, nicht erforderlich. Anstelle dessen kann nur die immunologisch aktive, den Idiotyp enthaltende, Antigen-bindende und Erkennungsrezeptorstelle, d. h., die Antikörperbindungsstelle, des Antikörpermoleküles verwendet werden. Beispiele solcher Antikörperbindungsstellen sind in der Technik als Fab- und F(ab')&sub2;-Antikörperteile bekannt, die durch Proteolyse unter Verwendung von Papain bzw. Pepsin hergestellt werden, was dem Fachmann bekannt ist.

2. Test auf Antikörper gegen tuberkulöse Mycobakterien

Ein weiteres erfindungsgemäßes diagnostisches Verfahren ist ein ELISA, der Antikörper gegen tuberkulöse Mycobakterien in einer Körperprobe nachweist (z. B. anti-BGG-a-Antikörper). Hier wird ein erfindungsgemäßes Polypeptid als Antigen verwendet und bevorzugt an eine feste Matrix gebunden (daran adsorbiert) oder anderweitig mit einer festen Matrix verbunden, wie z. B. einem quervernetzten Dextran, das unter dem Warenzeichen SEPHADEX von Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, New Jersey) erhältlich ist, Agarose, Glaskugeln, Polyvinylchlorid, Polystyrol, quervernetztes Acrylamid, Nitrozellulose oder die Vertiefung einer Mikrotiterplatte, um einen festen Träger zu bilden.
Das Polypeptid wird mit der zu untersuchenden, bereitgestellten Körperprobe gemischt. Die Mischung wird für einen vorbestimmten Zeitraum aufbewahrt, der für die in der Körperprobe vorhandenen Antikörper gegen das tuberkulöse Mycobakterium ausreichend ist, mit dem Polypeptid eine Immunreaktion einzugehen. Die Gegenwart dieser Immunreaktion wird dann bestimmt, z. B. mit einem anzeigenden Mittel, um die Gegenwart von Antikörpern gegen tuberkulöse Mycobakterien in der untersuchten Körperprobe anzuzeigen.
Ein beispielhafter ELISA, der das oben genannte Verfahren verwendet, beruht auf einem festen Träger, der an eine feste Matrix adsorbiertes erfindungsgemäßes Polypeptid umfaßt, wobei die feste Matrix den Vertiefungen einer 12 oder 96 Vertiefungen umfassenden Mikrotiterplatte aus Polystyrol oder Polyvinylchlorid entspricht. Unspezifische Bindungsstellen auf den Wänden der Mikrotiterplattenvertiefungen werden anschließend typischerweise mit einem Protein, z. B. Rinderserumalbumin (BSA) blockiert. Nicht-gebundenes Polypeptid und BSA werden aus der Mikrotiterplattenvertiefung durch Spülen entfernt.
Ein Aliquot einer Körperprobe, z. B. menschliches Serum, Blut oder Plasma, wird mit dem oben beschriebenen Polypeptid-gebundenen festen Träger gemischt, um eine feste und flüssige Phasen enthaltende Mischung zu bilden. Die Fest/Flüssigphasenmischung wird für einen Zeitraum aufbewahrt, der für die Antikörper gegen tuberkulöse Mycobakterien in der Körperprobe ausreichend ist, mit dem Polypeptidantigen eine Immunreaktion einzugehen. Die festen und flüssigen Phasen werden anschließend im allgemeinen getrennt.
Eine Lösung eines zweiten markierten, ein anzeigendes Mittel enthaltenen Antikörpers, einer Antikörperbindungsstelle oder von S. aureus-Protein A, die mit dem erstgenannten Antikörper reagieren, wird dann mit der festen Phase gemischt, um eine weitere Fest/Flüssigphasenmischung zu bilden. Ein beispielhafter zweiter Antikörper ist ein Peroxidase-markierter Ziegen-Antikörper gegen Human-Ig, wenn der erstgenannte Antikörper aus einer menschlichen Körperprobe stammt. Weitere nützliche Enzymmarkierungen umfassen alkalische Phosphatase, β-D-Galactosidase und Glucoseoxidase. Die aus der festen Phase und der zweiten markierten Antikörperlösung gebildete Mischung wird für einen vorbestimmten Zeitraum (z. B., 30 min) aufbewahrt (inkubiert), der ausreichend ist, um einen Reaktanten zwischen dem erstgenannten Antikörper und dem anzeigenden Mittel, wie beispielsweise bei einer Immunreaktion zwischen den beiden Antikörpern, zu bilden. Die feste und flüssige Phase werden anschließend getrennt.
Der oben beschriebene zweite Antikörper kann außerdem nur für eine der Immunglobulinklassen (z. B. IgG, IgM, IgE, IgA oder IgD) spezifisch sein und damit eine Immunreaktion eingehen. Solche Antikörper können dazu befähigen, die Immunglobulinklasse des Antikörpers gegen tuberkulöse Mycobakterium in der Körperprobe zu identifizieren. Zusätzlich kann der zweite Antikörper oder die Antikörperbindungsstelle für nur eine der beiden Typen leichter Immunglobulinketten spezifisch sein und damit immunreagieren (z. B., oder λ). Diese Antikörper können zur Identifizierung des Isotyps des in der Körperprobe vorhandenen Immunglobulinmoleküles befähigen.
Anschließend wird eine Lösung, die ein Substrat für den Enzymmarker enthält, mit der festen Phase gemischt, z. B. Wasserstoffperoxid für Peroxidase und ein farbbildender Farbstoffvorläufer, z. B. o-Phenylendiamin, oder p-Nitrophenylphosphat für alkalische Phosphatase. Die optische Dichte bei einer vorgewählten Wellenlänge (z. B. 490 bzw. 405 Nanometer) kann bestimmt werden, wenn ein vorbestimmter Zeitraum verstrichen ist (z. B. 60 min) und mit der optischen Dichte einer Kontrolle verglichen werden, um festzustellen, ob Antikörper gegen tuberkulöse Mycobakterien in der Körperprobe vorhanden waren.
Eine weitere Ausführungsform dieser Erfindung umfaßt ein diagnostisches System in Kit-Form, das einen festen Träger enthält, der eine feste Matrix umfaßt, beispielsweise einen Mikrotiterstreifen aus Polystyrol mit 12 Vertiefungen, und ein erfindungsgemäßes Polypeptid, das unter Bildung einer festen Matrix an die feste Matrix absorbiert (gebunden) oder anderweitig fixiert ist. Dieses System umfaßt bevorzugt getrennt verpackte Antikörper gegen Human-Ig mit einem daran gebundenen anzeigenden Mittel, z. B. Peroxidase-markierten Ziegen-Antikörpern gegen Human-Ig, und kann außerdem ein Substrat für das gebundene anzeigende Mittel umfassen, beispielsweise Wasserstoffperoxid und einen farbbildenden Farbstoffvorläufer, z. B. o-Phenylendiamin, in weiteren, getrennten Packungen. Wasserstoffperoxid ist wegen seiner relativen Instabilität im Kit normalerweise nicht enthalten und wird normalerweise vom Endverbraucher bereitgestellt. Puffersalze, die in einem dieses System verwendenden Test nützlich sein könnten, können in einer oder mehreren getrennten Pakkungen in trockener oder flüssiger Form ebenfalls vorgesehen sein. Getrennte Packungen, die Human-Antikörper gegen tuberkulöse Mycobakterien enthalten, und Human-Antikörper, die frei von Antikörpern gegen tuberkulöse Mycobakterien sind (normale menschliche Antikörper) können als positive bzw. negative Kontrollen ebenfalls enthalten sein. Mit diesem diagnostischen System kann ein Test auf die Gegenwart von Antikörpern gegen tuberkulöse Mycobakterien in einer Körperprobe, z. B. einem Serum, unter Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens durchgeführt werden.

II. MATERIAL UND METHODEN

A. Synthese der Polypeptide

Die erfindungsgemäßen Polypeptide wurden mittels Festphasenverfahren chemisch synthetisiert, wie von Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc., 85, 2149 (1963) und Houghten et al., Int. J. Pept. Prot. Res., 16, 311 (1980) beschrieben. Das Festphasenverfahren zur Polypeptidsynthese wurde unter Verwendung eines Beckman Modells 990B Polypeptid Synthesizers durchgeführt; das Gerät ist von Beckman Instrument Co., Berkeley, CA, kommerziell erhältlich.
Für Polypeptide mit weniger als 35 Resten, die in Inocula verwendet wurden, wurde ein Cysteinrest an den Carboxyterminus oder sowohl an den Aminoterminus als auch den Carboxyterminus angefügt, um die Kopplung an einen Proteinträger zu unterstützen, wie unten beschrieben wird. Die Zusammensetzung aller Polypeptide wurde mittels Aminosäureanalyse bestätigt.
Bei der Herstellung erfindungsgemäßer synthetischer Polypeptide mit dem oben genannten Festphasenverfahren werden die Aminosäurereste an ein Harz (Festphase) über eine Esterbindung vom carboxyterminalen Rest gebunden. Wenn das Polypeptid an den Träger über einen Cys-Rest gebunden oder über terminale Cys-Reste polymerisiert werden soll, ist es angenehm, den Cys-Rest als carboxyterminalen Rest zu verwenden, der über einen Ester an das Harz gebunden ist.
Die α-Aminogruppe jeder zugefügten Aminosäure wird typischerweise durch eine tert.-Butoxycarbonyl (t-BOC)-Gruppe geschützt, bevor die Aminosäure der wachsenden Polypeptidkette zugefügt wird. Die t-BOC-Gruppe wird dann vor der Addition der nächsten Aminosäure zu der wachsenden Polypeptidkette entfernt.
Reaktive Aminosäureseitenketten wurden während der Synthese der Polypeptide ebenfalls geschützt. Für die verbleibenden Aminosäurereste wurden übliche Seitenkettenschutzgruppen verwendet, wie folgt: o-(p-Brombenzyloxycarbonyl) für Tyrosin; o-Benzyl für Threonin, Serin, Asparaginsäure und Glutaminsäure; S-Methoxybenzyl für Cystein, Dinitrophenyl für Histidin; 2-Chlorbenzoxycarbonyl für Lysin und Tosyl für Arginin.
Geschützte Aminosäuren wurden aus geeigneten Lösungsmitteln rekristallisiert, um bei der Dünnschichtchromatographie einzelne Flecken zu ergeben. Die Kopplungen wurden typischerweise durchgeführt, indem ein zehnfacher molarer Überschuß sowohl der geschützten Aminosäure als auch von Dicyclohexylcarbodiimid über die Anzahl der Milliäquivalente der anfänglichen N-terminalen Aminosäure verwendet wurde. Ein zweimolarer Überschuß beider Reagenzien kann ebenfalls verwendet werden. Für Asparagin wurde eine gleiche molare Menge N-Hydroxybenztriazol zur geschützten Aminosäure zugefügt und Dimethylformamid als Lösungsmittel verwendet. Alle Kopplungsreaktionen waren nach dem Picrinsäuretest von Gisin, Anal. Chem. Acta. 58, 248 (1972), mehr als 99% vollständig.
Nach der Herstellung eines gewünschten Polypeptides wurde ein Teil des resultierenden, geschützten Polypeptides (ungefähr 1 g) mit 2 ml Anisol behandelt, und in das Reaktionsgefäß wurde bei Trockeneistemperatur wasserfreie Flußsäure, ca. 20 ml, kondensiert. Die resultierende Mischung wurde bei ungefähr 4ºC ungefähr 1 Std. gerührt, um die Schutzgruppen abzuspalten und das Polypeptid vom Harz zu entfernen. Nach dem Verdampfen der Flußsäure bei einer Temperatur von 4ºC unter einem Stickstoffstrom wurde der Rückstand dreimal mit wasserfreiem Diethylether extrahiert, um das Anisol zu entfernen, und der Rückstand wurde im Vakuum getrocknet.
Das Vakuum-getrocknete Material wurde mit 5% wäßriger Essigsäure (3 mal mit 50 ml) extrahiert, um das freie Polypeptid vom Harz zu trennen. Die extrakthaltige Lösung wurde lyophilisiert, um ein monomeres nicht-oxidiertes Polypeptid bereitzustellen.
Das erzeugte synthetische Polypeptid kann als Reagens in einem Enzym-gebundenen Immunadsorbtionstest (ELISA) zum Nachweis von Antikörpern gegen tuberkulöse Mycobakterien verwendet werden. Das synthetische Polypeptid kann außerdem zur Erzeugung eines Inoculums verwendet werden, gewöhnlich, indem es an einen Träger unter Bildung eines Konjugates gebunden wird und dann eine wirksame Menge des Konjugates in einem physiologisch verträglichen Verdünnungsmittel dispergiert wird, wie im folgenden diskutiert wird.
Es soll außerdem bemerkt werden, daß ein erfindungsgemäßes synthetisches Multimer durch Festphasensynthese aus einer Vielzahl von erfindungsgemäßen Polypeptiden hergestellt werden kann, die miteinander Ende-an-Ende (Kopf-an-Schwanz) über eine Amidbindung zwischen dem carboxyterminalen Rest eines Polypeptides und dem aminoterminalen Rest eines zweiten Polypeptides verbunden sind. Solche synthetischen Multimere werden bevorzugt als einzelne lange Polypeptidmultimere synthetisiert, können jedoch ebenfalls als individuelle Polypeptide hergestellt werden, die im Anschluß an ihre individuellen Synthesen miteinander verbunden werden, wobei ein Carbodiimidreagens, wie z. B. 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3- ethyl-carbodiimidhydrochlorid in Wasser verwendet wird. Die Gesamtzahl von Aminosäureresten, die in einem als eine einzelne Polypeptidkette hergestellten Multimer enthalten sind, beträgt bevorzugt weniger als ungefähr 50, so daß bis zu ungefähr 8 erfindungsgemäße Polypeptide in eine einzelne Kopf-an-Schwanz-Multimerkette eingebaut werden können, die als ein einzelnes Polypeptid synthetisiert wird. Ein synthetisches Kopf-an-Schwanz-Multimer enthält stärker bevorzugt 2 bis ungefähr 4 Blöcke verbundener, synthetischer statistischer erfindungsgemäßer Copolymerpolypeptide, und eine Gesamtzahl von weniger als ungefähr 40 Aminosäureresten.

B. Herstellung von Polymeren

Die erfindungsgemäßen Polypeptide können miteinander verbunden werden, um ein antigenes und/oder immunogenes Polymer (synthetisches Multimer) zu bilden, das eine Vielzahl von sich wiederholenden Polypeptideinheiten umfaßt. Ein solches Polymer hat typischerweise den Vorteil einer erhöhten Immunogenizität und Antigenizität. Zusätzlich ist normalerweise kein Träger erforderlich, wenn ein polymeres Immunogen verwendet wird. Wo verschiedene Polypeptidmonomere verwendet werden, um das Polymer zu bilden, wird die Fähigkeit zur Immunreaktion mit Antikörpern gegen verschiedene antigene Determinanten tuberkulöser Mycobakterien erhalten. Ein weiterer Vorteil ist die Fähigkeit eines solchen Polymeres, bei seiner Verwendung als Inoculum Antikörper zu induzieren, die mit verschiedenen antigenen Determinanten eines Antigenes von tuberkulösen Mycobakterien immunreagieren.
Das erfindungsgemäße Polymer kann durch Synthese der Polypeptide, wie oben beschrieben, und einschließlich von Cysteinresten an sowohl den Aminotermini als auch den Carboxytermini hergestellt werden, um ein Polypeptid mit zwei endständigen Cys-Resten zu bilden. Nach der Synthese werden für eine typische Laborpräparation 10 mg des diCys-Polypeptides (das die Cysteinreste in nicht-oxidierter Form enthält) in 250 Milliliter (ml) 0,1 molaren (M) Ammoniumbicarbonatpuffers gelöst. Das gelöste Polypeptid mit zwei endständigen Cysteinresten wird dann an der Luft oxidiert, indem die resultierende Lösung sanft über einen Zeitraum von ungefähr 18 Std., oder bis kein mittels des Ellmann-Tests (siehe Ellman Arch. Biochem. Biophys.. 82, 70 (1959)) nachweisbares freies Mercaptan vorhanden ist, an der Luft gerührt wird.
Das so hergestellte Polymer (synthetisches Multimer) enthält eine Vielzahl der synthetischen sich wiederholenden Polypeptideinheiten als statistisches Copolymer, die durch oxidierende Cystein-(Cystin)Reste aneinander gebunden sind. Solche Polymere enthalten ihre sich wiederholenden Polypeptideinheiten normalerweise in einer Kopf-an-Schwanz-Weise sowie in einer Kopf-an-Kopf und Schwanz-an-Schwanz-Weise aneinander gebunden; d. h., die Aminotermini der beiden sich wiederholenden Polypeptideinheiten können über einen einzelnen Cystinrest aneinander gebunden sein, ebenso wie zwei Carboxytermini, da die Verbindungsgruppen an beiden Polypeptidtermini identisch sind.

C. Kopplung an Träger

Die synthetischen Polypeptide wurden an Keyhole-Limpet Hämocyanin (KLH) als Träger nach dem von Liu et al., Biochem., 80, 690 (1979) beschriebenen Verfahren gekoppelt. Kurz gesagt wurden 4 Milligramm (mg) des Trägers mit 0,51 mg m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester aktiviert und anschließend mit 5 mg des Polypeptides über ein amino- oder carboxyterminales Cystein umgesetzt, um ein Konjugat bereitzustellen, das ungefähr 10 bis ungefähr 35 Gew.-% Polypeptid enthält.
Eine oder mehrere zusätzliche Aminosäurereste können an die Amino- oder Carboxytermini der synthetischen Polypeptide gebunden werden, um die Bindung des Polypeptides an einen Träger zu unterstützen. Wie zuvor diskutiert, ist von Cysteinresten, die an die Amino- oder Carboxytermini der synthetischen Polypeptide angefügt werden, festgestellt worden, daß sie insbesondere zur Bildung von Polymeren über Disulfidbindungen nützlich sind. Es können jedoch auch andere in der Technik gut bekannte Verfahren zum Herstellen von Konjugaten verwendet werden. Beispielhafte zusätzliche Verbindungsverfahren umfassen die Verwendung von Michael-Additions-Reaktionsprodukten, Dialdehyden, beispielsweise Glutaraldehyd (Klipstein et al., J. Infect. Dis. 147, 318 (1983)), und ähnlichen, oder die Verwendung der Carbodiimid-Technologie, wie bei der Verwendung eines wasserlöslichen Carbodiimides zur Bildung von Amidbindungen an den Träger, wie zuvor für die Bindung einer Vielzahl von Polypeptiden aneinander zur Bildung eines synthetischen Multimers diskutiert worden ist.
In der Technik sind nützliche Träger gut bekannt, und sind im allgemeinen selber Proteine. Beispielhaft für solche Träger sind Keyhole-Hämocyanin (KLH), Edestin, Thyroglobulin, Albumine, beispielsweise Rinderserumalbumin (BSA) oder Humanserumalbumin (HSA), rote Blutzellen, beispielsweise Schaferythrocyten (SRBC), Tetanustoxoid, Choleratoxoid sowie Polyaminosäuren, beispielsweise Poly(D-Lysin: D-Glutaminsäure) und ähnliches.
Wie in der Technik ebenfalls gut bekannt ist, ist es oft vorteilhaft, ein synthetisches Polypeptid an seinen Träger mittels einer dazwischenliegenden Verbindungsgruppe zu binden. Wie oben angemerkt, ist Glutaraldehyd eine solche Verbindungsgruppe. Jedoch ist dann, wenn Cystein verwendet wird, die dazwischenliegende Verbindungsgruppe bevorzugt ein m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimid (MBS), wie es hier verwendet wurde.
MBS kann außerdem zuerst über eine Ester-Amidaustauschreaktion an den Träger angefügt werden, wie von Liu et al., s. o., offenbart. Der Addition kann die Addition einer blockierten Mercaptogruppe, beispielsweise Thiolessigsäure (CH&sub3;COSH), über die Maleimido-Doppelbindung folgen. Nach Spaltung der Acyl-Blockierungsgruppe wird eine Disulfidbindung zwischen der deblockierten Verbindungsgruppe Mercaptan und dem Mercaptan des zugesetzten Cysteinrestes des synthetischen Polypeptides gebildet.
Die Wahl des Trägers hängt eher von der letztendlichen Verwendung des Immunogenes ab, als von dem Determinanten-Teil des Immunogens, und beruht auf Kriterien, die nicht im einzelnen zur vorliegenden Erfindung gehören. Wenn ein Inoculum beispielsweise in Tieren verwendet werden soll, sollte ein Träger verwendet werden, der in dem speziellen Tier keine nachteilhafte Reaktion hervorruft.

D. ELISA

Bindungsstudien mit Antikörpern gegen das Polypeptid und Inhibitionsstudien können mit einem Enzym-gebundenen Immunadsorptionstest (ELISA) wie unten beschrieben durchgeführt werden.
Kurz gesagt werden Mikrotitervertiefungen (Costar, #3590, Cambridge, MA) mit den jeweiligen Polypeptiden als Antigen durch Zufügen von 100 Mikrolitern (ul) BBS (10 millimolar (mM) Natriumborat (pH 8,3), 150 mM NaCl), die das Polypeptid in einer Konzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter (ug/ml) enthalten, beschichtet. Der Kontakt zwischen den Vertiefungen und der Antigen-haltigen Lösung wird für eine vorbestimmte Zeit, typischerweise 15 min, und bei 20ºC aufrechterhalten, um eine Antigen-beschichtete Festphase zu bilden. Die Fest- und Flüssigphasen werden getrennt und die Vertiefungen dreimal mit BBS gewaschen.
Unspezifische Bindungsstellen werden durch Zumischen von 200 ul 1%igem Rinderserumalbumin (BSA) zu jeder Vertiefung zur Bildung einer weiteren Fest-Flüssigphasenmischung und 30 minütiges Aufbewahren der Fest-Flüssigphasenmischung bei 20ºC blockiert. Die Phasen werden getrennt und überschüssiges, ungebundenes BSA durch dreimaliges Waschen mit BBS entfernt.
Kaninchen- (oder Meerschweinchen-) und Humanseren (Körperprobenaliquots) werden durch Zufügen von 100 ul eines 1 : 20 in BBS verdünnten Serums pro Vertiefung getestet, um eine Fest/Flüssigphasenzusammensetzung zu bilden. Der Kontakt zwischen den verdünnten Seren und der Antigen-beschichteten Festphase wird für einen vorbestimmten Zeitraum, beispielsweise 1 Std., bei 20ºC aufrechterhalten, damit sich ein Immunreaktant bildet. Die festen und flüssigen Phasen werden getrennt und die feste Phase, d. h., Antigen-beschichtete, Immunreaktant-enthaltende Vertiefungen, werden dann dreimal mit BBS gewaschen.
Die mit einem adsorbierten Polypeptid immunreagierenden Antikörper in Humanserum können unter Verwendung eines anzeigenden Mittels nachgewiesen werden, das mit alkalischer Phosphatase konjugierte Ziegenantikörper gegen Human-Ig (Tago, Burlington, CA) umfaßt. Die Antikörper in Kaninchenseren, die mit einem adsorbierten Polypeptid immunreagieren, können unter Verwendung eines anzeigenden Mittels nachgewiesen werden, das mit alkalischer Phosphatase konjugierte Ziegenantikörper gegen Kaninchen-Ig (Kirkegard & Perry Laboratories, Inc. Gaithersburg, MD) enthält. In jedem Fall werden pro Vertiefung 100 ul des anzeigenden Antikörpers, 1 : 300 in BBS verdünnt, zugesetzt, um eine weitere Fest-Flüssigphasenzusammensetzung zu bilden. Diese Fest-Flüssigphasenzusammensetzung wird bei 20ºC für einen vorbestimmten Zeitraum, 1 Std., aufbewahrt, um eine Reaktionsprodukt zwischen den an die Festphase gebundenen Human-Antikörpern und dem anzeigenden Mittel zu bilden. Die Phasen werden getrennt, und die feste Phase wird dreimal mit BBS gewaschen.
Ein mit alkalischer Phosphatase konjugierter Antikörper, der an einen Polypeptid-spezifischen Antikörper gebunden ist, kann durch spektrophotometrische Messung der enzymatischen Hydrolyse von p-Nitrophenylphosphat zu p-Nitrophenol nachgewiesen werden. Kurz gesagt werden jeder Vertiefung 100 ul p-Nitrophenylphosphat (1 mg pro ml in 2 mM Magnesiumchlorid (pH 9,8), 50 mM Natriumcarbonat) zugesetzt. Die enzymatische Reaktion kann 1 Std. lang laufen, und die optische Dichte wird dann bei 405 nm in einem von den Flow Laboratories, Inglewood, CA erhältlichen TITERTEK-Spektrophotometer bestimmt.

E. Immunisierungen

Die erfindungsgemäßen Rezeptormoleküle umfassen ganze Antikörper, die in Säugetieren erzeugt wurden, indem diese mit Inocula, die ein Polypeptid und/oder ein Multimer, wie oben beschrieben, einschließen, immunisiert werden. Sowohl Polypeptide als auch Multimere können in einem Inoculum allein oder an ein Trägerprotein konjugiert, beispielsweise Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH), enthalten sein. Die Polypeptide werden jedoch bevorzugt als Konjugate verwendet und die Multimere werden bevorzugt alleine verwendet.
Kaninchen können mit Inocula immunisiert werden, die 1,0 mg des Konjugats in vollständigem Freund'schen Adjuvans (CFA) enthalten, und einen Monat später mit 1,0 mg des Konjugates in unvollständigem Freund'schen Adjuvans (IFA) aufgefrischt (geboostert) werden. Jede Immunisierung bestand aus einer subkutanen Injektion in die hintere Hüfte. Den Kaninchen wurde ein und zwei Monate nach der Auffrischungsimpfung Blut entnommen.
Aus den Blutproben wurden durch gut bekannte Verfahren Seren gewonnen, die immunologisch aktive Antikörper enthalten. Diese Antikörper immunreagierten mit einem oder mehreren der erfindungsgemäßen Polypeptide und einer tuberkulösen mycobakteriellen Antigendeterminante. Sie können daher in einem System zur Bestimmung der Gegenwart von mycobakteriellen Infektionen verwendet werden.
Einzelne Inocula werden mit CFA oder IFA wie folgt hergestellt: Eine Menge des Konjugates, die ausreichend ist, die gewünschte Menge des Polypeptids pro Inoculation (z. B., 1 mg) bereitzustellen, wird in PBS (ungefähr 0,5 ml) bei pH 7,2 gelöst. Gleiche Volumina CFA oder IFA werden dann mit den Konjugatlösungen gemischt, um ein Inoculum bereitzustellen, das Konjugat, Wasser und Adjuvans enthält, wobei das Wasser-zu-Öl-Verhältnis 1 : 1 betrug. Die Mischung wird anschließend homogenisiert, um die Inocula bereitzustellen. Das Volumen eines so hergestellten Inoculums ist typischerweise größer als 1 ml, und etwas von dem Konjugat, PBS und Adjuvans kann während der Emulgierung verlorengehen. Im wesentlichen alles von der Emulsion, das gewonnen werden kann, wird in eine Spritze gefüllt und wird dann, wie zuvor diskutiert, in das Kaninchen eingeführt. Die Menge des in die Kaninchen eingeführten Inoculums sollte mindestens ungefähr 90% des vor dem Emulgationsschritt Vorhandenen betragen.
Die oben beschriebene Inocula-Stammlösungen veranschaulichen die erfindungsgemäßen Inocula. Wie hier gezeigt wird, können sie verwendet werden, um Rezeptormoleküle zu erzeugen, die mit tuberkulösen mycobakteriellen Antigenen immunreagieren.

F. Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ (Hautreaktionstest)

Die zuvor beschriebenen diagnostischen Systeme und Tests beruhen auf in vitro-Tests. Obwohl bestimmte Schritte der Tests in vivo durchgeführt werden können, wird die tatsächliche Immunantwort in Gewebekultur gemessen. Die vorliegende Erfindung kann jedoch ebenfalls für diagnostische Systeme verwendet werden, die eine in vivo-Messung der T-Zell-Antworten einbeziehen. Ein Beispiel eines solchen Systemes ist die Haut-Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ (DCH) (delayed-type cutaneous hypersensitivity reaction), die allgemein als ein Hautreaktionstest bekannter ist.
Eine DCH-Reaktion kann nur in einem Individuum auftreten, das zuvor mit einem gegebenen Antigen sensibilisiert worden bzw. ihm ausgesetzt worden ist. Der erste Kontakt (die erste Behandlung) eines Individuums mit dem Antigen führt zu keiner sichtbaren Veränderung, aber der Immunstatus des Individuums wird verändert, so daß eine Überempfindlichkeit gegen einen neuerlichen Kontakt mit dem Antigen resultiert. Es entwickelt sich daher nach einer intradermalen oder subkutanen Injektion des Antigenes (bevorzugt in einer gepufferten Salzlösung) an der Injektionsstelle eine charakteristische Hautläsion - eine Läsion, die sich nicht nach einem ersten Kontakt mit dem Antigen entwickeln würde. Weil die Antwort auf das zweite (herausfordernde) Antigeninoculum normalerweise um 24 bis 48 Std. verzögert auftritt, wird die Reaktion als Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ bezeichnet.
In Menschen findet der Kontakt mit einem sensibilisierenden Antigen bei Kontakt mit dem für die Erkrankung verantwortlichen Mikroorganismus statt (Beispiele sind Tuberkulin aus Mycobacterium tuberculosis, Typhoidin aus Salmonella typhi und Abortin aus Brucella abortus), und die Sensibilisierung tritt als Folge einer chronischen Infektion auf. In Tieren kann eine Sensibilisierung durch Inoculation eines in Wasser, Salz oder einem Adjuvans emulgierten Antigenes erreicht werden.
Sowohl in Menschen als auch in Tieren wird die Überempfindlichkeit in vivo durch Injektion des in einem physiologisch verträglichen Verdünnungsmittel, z. B. Salzlösung, gelösten Antigenes in die Haut (entweder intradermal oder subkutan) getestet. DCH ist gewöhnlich ein empfindlicherer diagnostischer Test als die Bestimmung oder Messung der Menge des gegen das Antigen erzeugten Antikörpers. Beispielsweise sind nur sehr kleine Mengen eines Proteins (einige 100 Mikrogramm) für eine DCH-Sensibilisierung einer Maus notwendig, während eine sehr viel größere Dosis für die Induktion der Antikörperproduktion erforderlich ist.
Da die erfindungsgemäßen Polypeptide die Proliferation von T-Zellen in Meerschweinchen nach einer Immunisierung (Sensibilisierung) mit einem erfindungsgemäßen Polypeptid stimulieren, wurde ein Hautreaktionstest entwickelt, der eines oder mehrere der erfindungsgemäßen synthetischen Polypeptide als Kontakt(Behandlungs)antigen verwendete.
Eine Haut-Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ wurde insbesondere dann beobachtet, wenn ein erfindungsgemäßes synthetisches Polypeptid intradermal an Mycobacterium bovis-BCG-sensibilisierte und Mycobacterium tuberculosis Stamm H37Rv-sensibilisierte Meerschweinchen verabreicht wurde.
Die hier beschriebenen Bakterien sind aus der Kultursammlung der Scripps Clinic and Research Foundation erhalten und wurden wachsen gelassen, wie in Minden et al., Science, 176, 57 (1972) und Minden et al., Infect. Immun., 6, 574 (1972) beschrieben; diese Publikationen werden hier durch Verweis einbezogen.
Insbesondere Meerschweinchen, die 6 Wochen früher mit Hitzeabgetöteten BCG-haltigen oder H37Rv-haltigen Ultraschallbehandelten Zellen immunisiert worden waren, zeigten eine Haut-Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ (DCH) nach intradermaler Infektion mit ungefähr 250 ug eines synthetischen Polypeptides. Das Polypeptid wurde normalerweise in ungefähr 100 ul Phosphat-gepufferter Salzlösung (pH 7,0), enthaltend 0,005% TWEEN 20, verabreicht.
Gemäß herkömmlicher Praxis wird eine DCH-Reaktion 24 oder 48 Std. nach der Injektion eines Antigenes gesucht. Das entzündliche Infiltrat (das in erster Linie aus mononukleären Zellen besteht), das 24 bis 48 Std. nach der intradermalen Injektion des Antigenes auftritt, und die begleitenden Ödeme führen zu einer Verhärtung der Haut. Eine gleichzeitig bestehende Fläche mit Erythemen kann sich ebenfalls entwikkeln. Der Durchmesser dieser Verhärtung ist auch ein Index für die Haut-Überempfindlichkeit, und einer Verhärtung mit einem Durchmesser von ungefähr 5 mm oder mehr ist das allgemein anerkannte Kriterium für eine positive DCH-Reaktion.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide riefen eine erythematöse Fläche und eine Verhärtung von mindestens ungefähr 10 mm Durchmesser an der Injektionsstelle hervor. Nicht-immunisierte Tiere zeigten keine DCH-Reaktion nach intradermaler Injektion eines Polypeptides. Mit Zellextrakten aus nichttuberkulösen Mycobakterien immunisierte Tiere zeigten geringfügige DCH-Reaktionen (Erytheme und Verhärtungen von weniger als ungefähr 5 mm) gegen ein Polypeptid.
Das Polypeptid, das die ausgeprägtesten DCH-Reaktionen hervorrief, wurde über Cysteinreste sowohl an seinem Amino- Terminus als auch an seinem Carboxy-Terminus polymerisiert. Siehe das di-Cys-Polypeptid, das in Zeile 3 von Fig. 1 gezeigt ist. Die Ergebnisse der DCH-Tests, die bei Verwendung dieses Polypeptids erhalten wurden, sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle I Mit Ultraschall-behandelten Lysaten¹ der folgenden Stämme immunisierte Tiere DCH²-Reaktion auf 250 ug Polypeptid³ DCH-Reaktion auf PPD&sup5; M. bovis Stamm BCG M. tuberculosis Stamm H37Rv M. fortuitum M. kansasii M. intracellulare Polypeptid (diCys-Enden) (siehe Anmerkung 3) nicht-immunisierte Tiere
¹ Hergestellt und immunisiert, wie von Minden et al., Infect. Immun., 46, 519 (1984) beschrieben; diese Publikation wird durch Verweis einbezogen.
² Haut-Überempfindlichkeit vom verzögerten Typ.
³ 250 ug eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz
- CysAlaLysValAsnIleLysProLeuGlnAspLysIleCys (das in Zeile 3 von Fig. 1 gezeigte Polypeptid) wurden in ungefähr 100 ul Phosphat-gepufferter Salzlösung (pH 7,0), die ungefähr 0,005% TWEEN 20 (ICI Americas, Inc., Wilmington, D.) enthielten, gelöst.
&sup4; Die erste Zahl in jeder Reihe stellt die Anzahl positiver DCH-Reaktionen dar, und die zweite Zahl stellt die Gesamtzahl von Versuchen dar.
&sup5; PPD (Purified Protein Derivative-gereinigtes Proteinderivat) von Connaught Laboratories LTD., Willowdale, Canada, wurde in Mengen von 100 ul, die ungefähr 250 Tuberkulineinheiten entsprechen, verabreicht.
Zu Tabelle I ist zu bemerken, daß mit Ultraschall-behandelten Zell-Lysaten von M. bovis Stamm BCG oder M. tuberculosis H37Rv immunisierte Meerschweinchen eine starke DCH-Reaktion auf die Polypeptide und PPD (gereinigtes Proteinderivat) entwickelten.
Mit einem nicht-tuberkulösen Mycobakterium immunisierte Tiere (M. fortuitum, M. kansasii und M. intracellulare) entwikkelten eine schwache Reaktion oder reagierten gar nicht (siehe Tabelle I für Einzelheiten) auf die Polypeptide, entwickelten aber eine starke DCH-Reaktion gegen PPD.
Tiere, die mit dem Polypeptid mit diCys-Enden immunisiert worden waren, entwickelten eine DCH-Reaktion auf das Polypeptid, aber nicht auf PPD.
Nicht-immunisierte normale Tiere entwickelten keine DCH- Reaktion auf die Polypeptide oder PPD.
Die Immunogenizität der erfindungsgemäßen Polypeptide wurde auch unter Verwendung von Polypeptiden zur Erzeugung von Antikörpern untersucht. Die Spezifitäten und Bindungsmerkmale der resultierenden Antikörper wurden in einem Enzym-gebundenen Immunadsorptionstest (ELISA), wie hier beschrieben, bestimmt.
Eine starke anti-Polypeptidantwort wurde hervorgerufen, wenn das Polypeptid (gezeigt in Zeile 2 der Fig. 1) an einen Proteinträger (Keyhole-Limpet-Hämocyanin) gekoppelt und zusammen mit unvollständigem Freund'schen Adjuvans in Kaninchen injiziert wurde. Der Titer der resultierenden Antiseren gegen das Polypeptid wurde durch Immobilisieren von 1 ug des Polypeptids in jeder Vertiefung einer Polystyrol-Mikrotiterplatte und anschließendes Umsetzen des gebundenen Polypeptides mit Verdünnungsreihen der Antiseren gemessen. Der Antikörpertiter wird als der Kehrwert der Verdünnung des Antikörpers ausgedrückt, der 50% der maximalen Bindung im ELISA erzeugt. Die Antiseren hatten anti-Polypeptidtiter von 1250 bis 2500.
Die Reaktivität der durch Polypeptid hervorgerufenen Antikörper mit Extrakten verschiedener mycobakterieller Arten wurde in einem ELISA gemessen, in dem "S-Antigen"-Zubereitungen in den Vertiefungen der Polystyrol-Mikrotiterplatten immobilisiert wurden ("S-Antigene" sind die nach Zentrifugation bei 100000·g in den Überstandsfraktionen vorhandenen Antigene bakterieller Suspensionen, die durch Beschallen zerbrochen worden sind. Beschrieben von Minden et al., Infect. Immun., 46, 519 (1984); diese Publikation wird durch Verweis miteinbezogen).
Im Fall eines Polypeptides mit einer Aminosäuresequenz, die den Resten 1 bis 12 des BCG-a-Proteines mit einem Cystein an dem Carboxy-Terminus entspricht, reagierten die anti-Polypeptid-Antikörper sehr stark mit dem Polypeptid (Titer = 1250), gereinigtem BCG-a-Protein (1250) und löslichen Ultraschallextrakten vom Mycobacterium bovis Stamm BCG (675) und Mycobacterium tuberculosis Stamm H37Rv (675). Eine nur geringfügige Bindung an die beschallten Extrakte vom Mycobacterium fortuitum (50), Mycobacterium kansasii (25) und Mycobacterium intracellulare (25) wurde beobachtet. Diese Art der geringfügigen Bindung wurde ebenfalls mit dem prä-Immun- Kaninchenserum gesehen, was darauf hinweist, daß die Kaninchenantikörper unspezifisch an diesen mycobakteriellen Extrakte haften könnten. Es gab keine Bindung (Titer geringer als 10) an die "S-Antigene" von E. coli, Listeria monocytogenes, Salmonella epidermis, Salmonella typhimurium oder Pseudomonas sp. Diese Daten weisen darauf hin, daß das Polypeptid ein immunogenes Epitop enthält, das überwiegend in den tuberkulösen mycobakteriellen Arten exprimiert wird.
Die Antigenizität der Polypeptide wurde auf zwei Arten bestimmt. Zuerst wurden die Polypeptide zur Messung der Reaktivität mit humoralen Antikörpern in Vertiefungen von Mikrotiterplatten immobilisiert und mit verschiedenen Antikörperzubereitungen umgesetzt. Im Fall eines Polypeptides mit einer Aminosäuresequenz, die den Resten 1 bis 12 des BCG-a- Proteines mit einem Cystein am Carboxy-Terminus entspricht, gab es eine signifikante Bindung an das Polypeptid durch Antikörper, die gegen das Polypeptid (Titer = 1250), BCG- a-Protein (625) und einen Ultraschall-Gesamtextrakt von M. bovis BCG (625) gerichtet waren. Es gab eine nur geringfügige Bindung der Antikörper, die durch Extrakte von M. kansasii (25) und M. fortuitum (5) hervorgerufen wurden. Es gab keine nachweisbare Bindung an Antiseren, die durch Extrakte von E. coli, L. monocytogenes, S. epidermis, S. typhimurium oder Pseudomonas sp. hervorgerufen wurden. Diese Daten weisen wieder darauf hin, daß dieses Epitop hauptsächlich von den tuberkulösen Arten exprimiert wird und nur wenig, wenn überhaupt, von den beiden untersuchten atypischen Stämmen (M. kansasii und M. fortuitum).
Die Ergebnisse der DCH-Reaktionen zeigen, daß die erfindungsgemäßen synthetischen Polypeptide für ein diagnostisches in vivo-System für die Gegenwart einer zellvermittelten Immunantwort gegen tuberkulöse mycobakterielle Antigene nützlich sein können.
Nachdem die Sicherheit und Wirksamkeit der oben genannten Polypeptide in Tieruntersuchungen gezeigt worden sind, können die Polypeptide als Kontakt(Behandlungs)antigene in Human-Hautreaktionstests für Empfänger von tuberkulösen mycobakteriellen Impfstoffen verwendet werden. Die Polypeptide werden wie zuvor beschrieben hergestellt, gereinigt über Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)-Verfahren, sterilisiert und auf Pyrogen getestet.
Da die proliferativen T-Zell-Antworten von humanen Rezipienten eines Impfstoffes mit tuberkulösen Mycobakterien hinsichtlich der Polypeptidspezifität sehr unterschiedlich sein können, werden Impfstoffempfänger und als nicht geimpfte Kontrollen dienende Individuen mit einer Reihe von Polypeptiden behandelt. Die Kinetik und die optimale Antigendosis können in der Impfstoff-Rezipienten Gruppe unter Verwendung der Tieruntersuchungen als Richtlinie bestimmt werden.
Chronisch infizierte Individuen können unter Verwendung synthetischer Polypeptide als Antigene für einen Hautreaktionstest ebenfalls auf eine spezifische T-Zell-Sensibilisierung für tuberkulöse Mycobakterien untersucht werden.
In jedem Fall wird das Behandlungsantigen durch intradermale Injektion des besonderen Polypeptides in einer physiologisch verträglichen Lösung (ungefähr 1 ml) in die volare Oberfläche des Unterarms injiziert. Die Verwendung einer Nadel mit 25 oder 27 Gauge stellt normalerweise eine intradermale anstelle einer subkutanen Verabreichung des Antigenes sicher. Die subkutane Injektion kann zu einer Verdünnung des Antigens im Gewebe führen und einen falsch-negativen Test erzeugen. Die Injektionsstellen werden dann 4, 24 und 48 Std. nach der Behandlung auf Erytheme (Hautrötungen) und Verhärtungen (Schwellungen) untersucht.
Die vorstehende Beschreibung soll die vorliegende Erfindung veranschaulichen, aber nicht beschränken. Unzählige Variationen und Modifikationen können durchgeführt werden, ohne vom Geist und Umfang der neuen erfindungsgemäßen Konzepte abzuweichen. Es soll verstanden werden, daß eine Beschränkung hinsichtlich der spezifischen Polypeptide, Antikörper, deren Zusammensetzung und Verwendungen, die hier gezeigt werden, weder beabsichtigt ist noch auferlegt werden sollte.

Claims

1. Synthetisches Polypeptid, das ungefähr 13 bis ungefähr 40 Aminosäurereste enthält und eine Sequenz von 12 Aminosäureresten einschließt, die, von links nach rechts und in der Richtung vom Amino-Terminus zum Carboxy-Terminus geschrieben, durch die Formel:

dargestellt wird, wobei das Polypeptid zur Induktion der Produktion von Antikörpern, die mit einem Antigen eines tuberkulösen Mycobakteriums immunreagieren, fähig ist, wenn es an einen Träger gebunden und in einer wirksamen Menge in einen Säugetierwirt eingeführt wird.

2. Synthetisches Polypeptid-Inoculum, das zum Induzieren von Antikörpern geeignet ist, die mit einem Antigen eines tuberkulösen Mycobakteriums immunreagieren, das ein synthetisches Polypeptid umfaßt, das ungefähr 13 bis ungefähr 40 Aminosäurereste enthält, die in einer wirksamen Menge in einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel gelöst oder dispergiert sind, wobei das Polypeptid eine Sequenz von 12 Aminosäureresten einschließt, die, von links nach rechts in Richtung vom Amino-Terminus zum Carboxy-Terminus geschrieben, durch die Formel:

dargestellt wird, wobei das Inoculum, wenn es in einer wirksamen Menge in einen Säugetierwirt eingeführt wird, zur Induktion der Produktion von Antikörpern, die mit einem Antigen eines tuberkulösen Mycobakteriums immunreagieren, fähig ist.

3. Synthetisches Polypeptid-Inoculum nach Anspruch 2, wobei das Polypeptid an einen Träger gebunden ist.

4. Synthetisches Polypeptid-Inoculum nach Anspruch 2 in Form einer Dosierungseinheit, in der das Polypeptid in einer Menge von ungefähr 100 Mikrogramm bis ungefähr 500 Milligramm pro Dosis vorhanden ist.

5. Rezeptormolekül, enthaltend eine gegen ein synthetisches Immunogen gebildete Antikörperbindungsstelle, wobei das synthetische Immunogen ein synthetisches Polypeptid umfaßt, das ungefähr 13 bis ungefähr 40 Aminosäurereste enthält und eine Sequenz von 12 Aminosäureresten einschließt, die, von links nach rechts in Richtung vom Amino-Terminus zum Carboxy-Terminus geschrieben, durch die Formel:

dargestellt wird, wobei der Rezeptor mit einem Antigen eines tuberkulösen Mycobakteriums immunreagiert.

6. Diagnostisches System in Kitform zum Testen auf die Gegenwart eines tuberkulösen Mycobakteriums, umfassend:

a) Rezeptormoleküle, die gegen ein synthetisches Polypeptid gebildet werden, das ungefähr 13 bis ungefähr 40 Aminosäurereste enthält und eine Sequenz von 12 Aminosäuren einschließt, die, von links nach rechts und in Richtung vom Amino-Terminus zum Carboxy-Terminus geschrieben, durch die Formel

dargestellt wird;

b) ein anzeigendes Mittel zum Kennzeichnen der Immunreaktion des Rezeptors mit einem Antigen eines tuberkulösen Mycobakteriums.

7. Diagnostisches System nach Anspruch 6, wobei die Rezeptormoleküle ganze Antikörper sind.

8. Diagnostisches System nach Anspruch 6, wobei die Rezeptormoleküle in Lösung oder in flüssiger Form in einer von dem anzeigenden Mittel getrennten Packung bereitgestellt werden.

9. Diagnostisches System nach Anspruch 6, wobei die Rezeptormoleküle in lyophilisierter Form in einer getrennten Packung zur Verfügung gestellt werden.

10. Diagnostisches System nach Anspruch 6, wobei die Rezeptormoleküle mit einem anzeigenden Mittel markiert sind.

11. Diagnostisches System nach Anspruch 6, wobei das anzeigende Mittel ein markierter Antikörper ist, der mit einem amplifizierenden Mittel immunreagiert.

12. Diagnostisches System nach Anspruch 11, wobei der markierte Antikörper mit einem fluorochromen Farbstoff markiert ist.

13. Diagnostisches System nach Anspruch 11, wobei der markierte Antikörper mit einem Fluoreszenz-Isothiocyanat markiert ist.

14. Diagnostisches System nach Anspruch 11, wobei der markierte Antikörper mit einem Enzym markiert ist.

15. Verfahren zum Testen auf Antikörper gegen tuberkulöse Mycobakterien in einer Körperprobe, umfassend die Schritte:

a) Bereitstellen einer Körperprobe, die untersucht werden soll;

b) Mischen der Körperprobe mit einem synthetischen Polypeptid, das ungefähr 13 bis ungefähr 40 Aminosäurereste enthält und eine Sequenz von 12 Aminosäureresten einschließt, die, von links nach rechts und in Richtung vom Amino-Terminus zum Carboxy-Terminus geschrieben, durch die Formel

dargestellt wird;

c) Aufbewahren der Mischung über eine vorbestimmte Zeit, die für die Antikörper gegen tuberkulöse Mycobakterien, die in der Probe vorhanden sind, ausreichend ist, mit dem Polypeptid eine Immunreaktion einzugehen; und

d) Bestimmen des Vorhandenseins der Immunreaktion.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Körperprobe aus der aus Blut, Serum und Plasma bestehenden Gruppe ausgewählt wird.

17. Verfahren nach Anspruch 15, das den weiteren Schritt einschließt, das Polypeptid vor dem Mischen an einem festen Träger zu fixieren.

18. Diagnostisches System in Kitform zum Testen auf die Gegenwart von Antikörpern gegen ein Antigen eines tuberkulösen Mycobakteriums in einem Körperbestandteil, umfassend in getrennten Packungen:

a) ein synthetisches Polypeptid, das ungefähr 13 bis ungefähr 40 Aminosäurereste enthält und eine Sequenz von 12

Aminosäureresten einschließt, die, von links nach rechts in der Richtung vom Amino-Terminus zum Carboxy-Terminus geschrieben, durch die Formel

dargestellt wird; und

b) ein anzeigendes Mittel zum Kennzeichnen der Immunreaktion des Polypeptides mit Antikörpern gegen das Antigen des tuberkulösen Mycobakteriums.

19. Diagnostisches System nach Anspruch 18, das weiter eine feste Matrix umfaßt, die zur Bindung des Polypeptides fähig ist.

20. Diagnostisches System nach Anspruch 19, wobei das synthetische Polypeptid an einer festen Matrix fixiert ist, um einen festen Träger zu bilden.

21. Diagnostisches System nach Anspruch 19, wobei die feste Matrix aus der aus Polystyrol, Polyvinylchlorid und Nitrozellulose bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

22. Diagnostisches System nach Anspruch 19, wobei die feste Matrix ein Mikrotiterstreifen ist, der eine Vielzahl von Vertiefungen enthält.

23. Diagnostisches System nach Anspruch 18, wobei das anzeigende Mittel ein markierter Antikörper ist, der zur Immunreaktion mit humanen Antikörpern gegen ein tuberkulöses Mycobakterium fähig ist.

24. Diagnostisches System nach Anspruch 23, wobei der markierte Antikörper mit einem Enzym markiert ist, das aus der alkalische Phosphatase, Meerrettichperoxidase, β-D-Galactosidase und Glucoseoxidase bestehenden Enzymgruppe ausgewählt ist.

25. Verfahren zum Testen auf die Gegenwart eines Antigens eines tuberkulösen Mycobakteriums in einer Körperprobe, umfassend die Schritte:

a) Bereitstellen einer Körperprobe, die untersucht werden soll;

b) Mischen von Rezeptormolekülen, die eine gegen ein synthetisches Polypeptid mit ungefähr 13 bis ungefähr 40

Aminosäuren, das eine Sequenz von 12 Aminosäuren einschließt, die, von links nach rechts und in Richtung vom Amino-Terminus zum Carboxy-Terminus geschrieben, durch die Formel

dargestellt wird, gerichtet sind, wobei das Polypeptid, wenn es an einen Träger gebunden ist und in einer wirksamen Menge in einen Säugetierwirt eingeführt wird, zur Induktion der Produktion von Antikörpern fähig ist, die mit einem Antigen eines tuberkulösen Mycobakteriums, das in der Körperprobe vorhanden ist, eine Immunreaktion eingehen; und

c) Messen der Menge der Immunreaktion.

26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Körperprobe aus der aus Lymphozyten und Tumorgewebe bestehenden Gruppe ausgewählt wird.

27. Immunreaktionsprodukt, umfassend einen humanen Antikörper gegen tuberkulöses Mycobakterium, der immunologisch an ein synthetisches Polypeptid gebunden ist, das ungefähr 13 bis ungefähr 40 Aminosäurereste enthält und eine Sequenz von 12 Aminosäureresten einschließt, die, von links nach rechts und in Richtung vom Amino-Terminus zum Carboxy-Terminus geschrieben, durch die Formel

dargestellt wird.

28. Synthetisches Polypeptid, das ungefähr 13 bis ungefähr 40 Aminosäurereste enthält und eine Sequenz von 12 Aminosäureresten einschließt, die, von links nach rechts und in Richtung vom Amino-Terminus zum Carboxy-Terminus geschrieben, durch die Formel

dargestellt wird, wobei das Polypeptid, wenn es an einen Träger gebunden und in einer wirksamen Menge in einen Säugetierwirt eingeführt wird, zur Induktion der Produktion von Antikörpern, die mit einem Antigen eines tuberkulösen Mycobakteriums immunreagieren, fähig ist, und wobei das Polypeptid zur Immunreaktion mit humanen Antikörpern gegen tuberkulöses Mycobakterium fähig ist.

29. Synthetisches Multimer, enthaltend eine Vielzahl verbundener wiederholter Einheiten des synthetischen Polypeptids, wobei die wiederholten Einheiten mindestens ein synthetisches Polypeptid umfassen, das ungefähr 14 bis ungefähr 40 Aminosäurereste enthält und eine Aminosäuresequenz einschließt, die, von links nach rechts und in Richtung vom Amino-Terminus zum Carboxy-Terminus geschrieben, durch die Formel

dargestellt wird, wobei die wiederholten Polypeptideinheiten zur Induktion der Produktion von Antikörpern, die mit einem Antigen eines tuberkulösen Mycobakteriums immunreagieren, fähig sind, wenn sie an einen Träger gebunden und in einer wirksamen Menge in einen Säugetierwirt eingeführt werden.

30. Multimer nach Anspruch 29, wobei die wiederholten Polypeptideinheiten über eine Amid- oder Disulfidbindung aneinander gebunden sind.

31. Synthetisches Inoculum, das zur Induktion von Antikörpern geeignet ist, die mit einem Antigen eines tuberkulösen Mycobakteriums immunreagieren, das ein synthetisches Multimer umfaßt, das eine Vielzahl von verbundenen wiederholten synthetischen Polypeptideinheiten enthält, wobei die wiederholten Einheiten mindestens ein synthetisches Polypeptid umfassen, das ungefähr 14 bis ungefähr 40 Aminosäurereste enthält, die in einer effektiven Menge eines pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittels gelöst oder dispergiert sind, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz einschließt, die, von links nach rechts in Richtung vom Amino-Terminus zum Caboxy-Terminus geschrieben, durch die Formel

32. Synthetisches Inoculum nach Anspruch 31, wobei das Multimer an einen Träger gebunden ist.

33. Synthetisches Inoculum nach Anspruch 31 in Form einer Dosierungseinheit, wobei das Multimer in einer Menge von ungefähr 10 Mikrogramm bis ungefähr 500 Milligramm pro Dosis vorhanden ist.

34. Diagnostisches System zum Bestimmen der Gegenwart eines tuberkulösen mycobakteriellen Antigens in einem Wirt, umfassend mindestens ein synthetisches Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die, von links nach rechts und in Richtung vom Amino-Terminus zum Carboxy-Terminus genommen, aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus:

wobei das synthetische Polypeptid, wenn es in einem physiologisch verträglichen Verdünnungsmittel einem Wirt intradermal verabreicht wird, zur Induktion der Proliferation Thymus-abgeleiteter Zellen in dem Wirt fähig ist, wobei die Proliferation durch Erytheme und Verhärtungen an der Stelle der intradermalen Verabreichung angezeigt wird.

35. Diagnostisches System nach Anspruch 34, wobei das physiologisch verträgliche Verdünnungsmittel ein Mitglied der aus Wasser, Salzlösung und einem Adjuvanz bestehenden Gruppe ist.

36. Diagnostisches System nach Anspruch 34, wobei das synthetische Polypeptid an einen Träger gebunden ist.

37. Diagnostisches System nach Anspruch 36, wobei der Träger aus der aus Keyhole Limpet Hämocyanin, Keyhole Limpet Hämocyanin in unvollständigem Freund'schen Adjuvanz, Alaun, Keyhole Limpet Hämocyanin-Alaun absorbiert, Keyhole Limpet Hämocyanin-Alaun absorbiert-Pertussis, Edestin, Thyroglobulin, Tetanustoxoid, Tetanustoxoid in unvollständigem Freund'schen Adjuvanz, Choleratoxoid und Choleratoxoid in unvollständigem Freund'schen Adjuvanz, bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

38. Synthetisches Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die, von links nach rechts und in Richtung vom Amino-Terminus zum Carboxy-Terminus genommen, aus der aus

bestehenden Gruppe ausgewählt ist, zur Verwendung zum Induzieren der Proliferation Thymus-abgeleiteter Zellen in einem Wirt, der zuvor gegen ein tuberkulöses mycobakterielles Antigen immunisiert worden ist.

39. Synthetisches Polypeptid nach Anspruch 38, wobei das synthetische Polypeptid zur Bildung eines Konjugates an einen Träger gebunden ist.

40. Synthetisches Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die, von links nach rechts und in Richtung vom Amino-Terminus zum Carboxy-Terminus genommen, aus der aus

bestehenden Gruppe ausgewählt ist, zur Verwendung zum Bestimmen der Gegenwart eines tuberkulösen mycobakteriellen Antigens in einem Wirt.