DE3650019T2

DE3650019T2 - Expression von Virusproteinen mit immunologischer Aktivität.

Info

Publication number: DE3650019T2
Application number: DE3650019T
Authority: DE
Inventors: Wesley Cosand; Susan Mcardle; Bruce Mcfarland Travis; Susan Mitsue Watanabe
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1985-04-08
Filing date: 1986-04-07
Publication date: 1995-03-09
Anticipated expiration: 2006-04-08
Also published as: AU5572786A; DK157186A; JPS62239992A; ES553757A0; GR860914B; IE64785B1; AU571128B2; FI861485A0; ATE109830T1; EP0201716A2; EP0201716B1; DK167158B1; FI861485A; NO861355L; DE3650019D1; IE860893L; JP2679973B2; DK157186D0; NO301176B1; ES8706208A1

Description

Technisches Fachgebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft eine isolierte DNA-Sequenz, umfassend einen Teil der env-Region des LAV-Genoms gemäß Anspruch 1, ein rekombinantes Plasmid, das zur Replikation in bakteriellen Wirtszellen fähig ist, ein Verfahren zum Herstellen eines Proteins, das mit Antikörpern gegen LAV immunologisch reaktionsfähig ist, eine pharmazeutische Zusammensetzung und ein Protein, das einen Teil des LAV-Hüllproteins umfaßt.

Technischer Hintergrund

Das erworbene Immunschwächesyndrom (AIDS) ist eine Übertragbare Schwäche der zellulären Immunität, die durch opportunistische Infektionen und gewisse seltene Malignitäten charakterisiert ist. Die vorherrschenden Risikogruppen für AIDS umfassen homosexuell aktive Männer, Drogensüchtige, die intravenös Drogen nehmen, Empfänger von Transfusionen und Blutprodukten und die heterosexuellen Partner und Kinder von Individuen mit hohem Risiko, was auf die Beteiligung eines infektiösen Agens hindeutet, welches durch Intimkontakt oder Blutprodukte übertragen wird.
Kürzliche Anzeichen deuten darauf hin, daß das infektiöse Agens, welches für die Krankheitsverbreitung verantwortlich ist, ein neues lymphotrophisches Retrovirus ist, das als Lymphadenopathie-assoziiertes Virus (LAV) bekannt ist (Barr -Sinoussi et al., Science 220 : 868 (1983)). Ähnliche Viren sind von anderen Wissenschaftsgruppen (Popovic et al., Science 224 : 497 (1984); Levy et al., Science 225 : 840 (1984)) beschrieben und als humanes T-Zell-Lymphotrophisches Virus vom Typ III (HTLV-III), AIDS-assoziiertes Retrovirus (ARV) oder Immunschwäche-assoziiertes Virus (IDAV) bezeichnet worden. Noch jüngere Daten deuten darauf hin, daß LAV, HTLV-III, ARV und IDAV mehrere wichtige Merkmale gemeinsam haben, einschließlich einer wesentlichen Nukleotidhomologie (Wain-Hobson et al., Cell 40 : 9 (1985); Muesing et al., Nature 313 : 450 (1985 ); Sanchez-Pescador et al., Science 227 : 484 (1985)), und als Isolate desselben Virus angesehen werden sollten, obwohl es wahrscheinlich ist, daß Stamm-zu-Stamm-Variationen unter den viralen Isolaten vorkommen werden. Zusätzlich zu der Tatsache, daß die Isolate eine wesentliche Nukleotidhomologie aufweisen, sind diese ähnlich hinsichtlich der Morphologie, Zytopathologie, der Bedingungen für optimale Reverse Transkriptaseaktivität und wenigstens einigen antigenen Eigenschaften (Levy, s. o.; Schupbach et al., Science 224 : 503 (1984)).
Das Virus, welches das erworbene Immunschwächesyndrom (AIDS) verursacht, ist das Objekt intensiver Forschung geworden. Als deren Ergebnis offenbart WO 86/02383 eine DNA-Sequenz, welche einen Teil der env-Region umfaßt. Wain-Hobson et al., Cell 40 : 9 (1985), vorstehend erwähnt, offenbaren die vollständige Nukleotidsequenz eines molekularen LAV-Klons, bezeichnet als lambda J19. Crowl et al., Cell 41 : 979 (1985) offenbaren die Nukleotidsequenz des envelope-Gens eines proviralen Genoms von HTLV-III, einschließlich einige Restriktionsstellen. Chang et al., Science 228, 93 (1985) offenbaren die Expression von Proteinen, die von env stammen, in E. coli.
Wie vorstehend bemerkt ist bekannt, daß das Virus durch Blutprodukte (Blut, Blutserum, Blutplasma und Fraktionen davon) übertragbar ist, woraus sich ergibt, daß es wichtig ist, Blutprodukte zu testen, um zu bestimmen, ob der Donor dem Virus ausgesetzt gewesen ist. Dies kann auf irgendeine Weise, einschließlich Enzymimmunoassay (ELISA) für die Bestimmung von Antikörpern gegen LAV und verwandten Viren, bewerkstelligt werden. Individuen, deren Blut Antikörper gegen LAV enthält, werden als "seropositiv" bezeichnet. Blut von seropositiven Spendern kann nach dem Nachweis von der Blutversorgung ausgeschlossen werden, wodurch die Ausbreitung der Krankheit verhindert werden kann.
Die Immunantwort von Individuen, die LAV ausgesetzt sind, ist unterschiedlich. Antikörper gegen irgendein virales Protein, einschließlich p13, p18, p25, p36, gp43, p55, gp110 etc. können produziert werden (Schupbach et al., New Engl. J. Med. 312 : 265 (1985)). Nicht alle Individuen werden Antikörper gegen dieselben Proteine oder gegen dasselbe Epitop auf einem gegebenen Protein herstellen.
Der Nachweis seropositiver Individuen, wie er gegenwärtig praktiziert wird, birgt mehrere inhärente Probleme in sich. Das vordringlichste unter diesen Problemen ist die Notwendigkeit, Antigen von vollständigen Viren für die immunologischen Assays zu isolieren. Für diese Isolierung ist die Manipulation großer Volumina an lebenden, potentiell infektiösen Viren notwendig, was als solches ein wesentliches Sicherheitsrisiko darstellt. Zusätzlich gibt es Bedenken hinsichtlich des Ertrags, der Reinheit und Reproduzierbarkeit des Virus von einer Präparation zur nächsten. Dies kann eine unannehmbare Zahl an falsch positiven und/oder negativen ergeben. Folglich gibt es in diesem Bereich einen Bedarf an alternativen Verfahren zum Herstellen viraler Antigene, die in Blutuntersuchungsassays verwendbar sind und darüber hinaus weitere, damit in Beziehung stehende Vorteile besitzen.
Zusätzlich ist bisher keine wirksame Behandlungsweise für die Krankheit gefunden worden. Nachdem die Ausbreitung von AIDS außergewöhnliche, wenn nicht epidemische Ausmaße zu erreichen begann und da das Ausmaß, mit welchem das Virus übertragen werden kann, noch fraglich ist, besteht auch ein Bedarf auf diesem Gebiet für eine pharmazeutische Zusammensetzung, um die allgemeine Bevölkerung zu immunisieren. Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen Bedarf und stellt darüber hinaus weitere, damit in Beziehung stehende Vorteile bereit.

Offenbarung der Erfindung

Kurz bemerkt, offenbart die vorliegende Erfindung DNA-Sequenzen, welche einen Teil des envelope(env)-Bereichs des LAV-Genoms umfassen, wobei der Teil für ein Protein kodiert, das mit Antikörpern gegen LAV immunologisch reaktionsfähig ist. Ein rekombinantes Plasmid, das zur Replikation in bakteriellen Wirtszellen fähig ist, wird ebenso offenbart. Das Plasmid umfaßt prokaryotische Transkriptions- und Translationssignale für eine Expression, worauf im Leseraster die vorstehend beschriebene DNA-Sequenz folgt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Signale ausgewählt aus einem Operon, wie dem trp-Operon, welches induzierbar und/oder supprimierbar ist. Bakterielle Zellen, wie E. coli, die mit dem vorstehend beschriebenen rekombinanten Plasmid transformiert worden sind, werden ebenso offenbart.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung offenbart ein Verfahren zum Herstellen von Proteinen, die mit Antikörpern oder mit gegen LAV gerichteten T-Zellen immunologisch reaktionsfähig sind. Das Verfahren umfaßt das Einbringen des rekombinanten Plasmids, das zur Replikation in bakteriellen Wirtszellen fähig ist, in eine bakterielle Wirtszelle. Das Plasmid umfaßt prokaryotische Transkriptions- und Translationssignale für eine Expression, worauf im Leseraster eine DNA-Sequenz, welche einen Teil der env-Region des LAV-Genoms umfaßt, folgt, wobei der Teil für ein Protein kodiert, das mit Antikörpern gegen LAV reaktionsfähig ist. Nach dem Einbringen des Plasmids wird der bakterielle Wirt in einem geeigneten Medium kultiviert. Die Expression des Proteins wird danach induziert und das Proteinprodukt der Sequenz von dem bakteriellen Wirt isoliert. Das Proteinprodukt kann nach der Isolierung beispielsweise durch Gel-Permeationschromatographie gereinigt werden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung offenbart ein Protein für die Verwendung zum Bestimmen der Gegenwart von Antikörpern gegen LAV in einer biologischen Flüssigkeit. Die biologische Flüssigkeit wird mit einem Protein inkubiert, das durch bakterielle Zellen, die mit einem rekombinanten Plasmid, wie vorstehend beschrieben, transformiert worden sind, hergestellt wurde, wodurch eine Reaktionsmischung gebildet wird, und nachfolgend wird die Reaktionsmischung analysiert, um die Gegenwart der Antikörper zu bestimmen. Es ist bevorzugt, daß der Schritt des Analysierens der Reaktionsmischung das Inkontaktbringen der Reaktionsmischung mit einem markierten, spezifischen Bindungspartner für den Antikörper umfaßt. Alternativ wird die Gegenwart von Antikörpern gegen LAV durch Durchführen einer Kompetition zwischen einer Probe, von der vermutet wird, daß sie den Antikörper enthält, und einem markierten monoklonalen Antikörper auf die Bindung an ein immobilisiertes rekombinantes Protein bestimmt.
Die Reaktionsmischung wird nachfolgend analysiert, um die Menge des markierten Antikörpers, der an die Festphase gebunden ist, zu bestimmen.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung offenbart ein Protein für die Verwendung in einem Assay zum Bestimmen der Gegenwart von LAV-Antigen in einer biologischen Flüssigkeit, wobei der Assay das Inkubieren der biologischen Flüssigkeit mit einem markierten Protein, das durch bakterielle Zellen, die mit einem rekombinanten Plasmid, wie vorstehend beschrieben, transformiert worden sind, hergestellt wurde, und entweder aufeinanderfolgend oder gleichzeitig einem Antikörper gegen das Protein umfaßt, so daß eine spezifische Bindung stattfindet. Nachfolgend kann die während der Inkubation gebildete Reaktionsmischung analysiert werden, um die Menge der mit dem Antikörper assoziierten Markierung zu bestimmen.
Ein Protein zur Verwendung für das Herstellen von Antikörpern gegen LAV, umfassend das Immunisieren eines Tiers mit einem Protein, das durch bakterielle Zellen, die mit einem rekombinanten Plasmid, wie vorstehend beschrieben, transformiert worden sind, hergestellt wurde, wird ebenso offenbart.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung offenbart ein Protein für die Verwendung in einem Assay zum Bestimmen der Gegenwart von Antikörpern gegen LAV in einer biologischen Flüssigkeit, wobei der Assay das Konjugieren von Latexperlen an ein Protein, das durch bakterielle Zellen, die durch ein rekombinantes Plasmid, wie vorstehend beschrieben, transformiert worden sind, hergestellt wurde, umfaßt. Nachfolgend wird die biologische Flüssigkeit mit dem Perlen/Protein-Konjugat inkubiert, wodurch sich eine Reaktionsmischung bildet. Die Reaktionsmischung wird danach analysiert, um die Gegenwart der Antikörper zu bestimmen.
Die erfindungsgemäß hergestellten Proteine bilden, wenn diese mit einem geeigneten Träger oder Verdünnungsmittel verwendet werden, eine immunologisch wirksame Impfzusammensetzung. Durch Verabreichen einer immunologisch wirksamen Menge eines Proteins, das durch eine DNA-Sequenz, umfassend einen Teil der env-Region des LAV-Genoms, kodiert wird, und das an einen physiologisch annehmbaren Träger angeheftet ist an ein Individuum, kann eine Infektion, die durch das für AIDS verantwortliche Virus verursacht wird, verhindert werden.
Weitere Aspekte der Erfindung werden offensichtlich nach Bezugnahme auf die folgende genaue Beschreibung und auf die anliegenden Zeichnungen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Fig. 1 stellt die Konstruktion von mpSW16 und mpSW19 ausgehend von λ-J19 dar.
Die Fig. 2 stellt die trp E-Expressionsvektoren pJH 11, pJH 12 und pJH 14 dar, einschließlich die Polylinker-Sequenzen.
Die Fig. 3 stellt den Ursprung der LAV-Inserts in pENV-1, pENV-2, pENV-3, pENV-4 und pENV-5 dar.
Die Fig. 4 stellt die Konstruktion von pENV-5 und pENV-1 ausgehend von pJH 12 und mpSW19 dar.
Die Fig. 5 stellt die Konstruktion von pENV-2 ausgehend von pJH 14 und mpSW19 und die Konstruktion von pENV-3 ausgehend von pJH 11 und mpSW19 dar.
Die Fig. 6 stellt die Konstruktion von pENV-4 ausgehend von pJH 12 und mpSW16 dar.
Die Fig. 7 stellt die Aminosäuresequenz von ENV-3 dar.
Die Fig. 8 stellt die Nukleotidsequenz der env-Region und deren Proteinprodukt dar.

Beste Art und Weise zum Ausführen der Erfindung

Vor weiteren Ausführungen zu der Erfindung kann es hilfreich für deren Verständnis sein, die Definitionen gewisser Ausdrücke, die nachstehend hierin verwendet werden, darzulegen.

Lymphadenopathie-assoziiertes Virus (LAV):

Ein humanes T-lymphotrophisches Retrovirus. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird ein Virus als dasselbe wie oder äquivalent zu LAV angesehen, wenn es im wesentlichen die folgenden Kriterien erfüllt:
(a) Das Virus ist trophisch für T-Lymphozyten, insbesondere T-Helferzellen (CD4&spplus; gemäß der in Bernard et al., Herausgeber, Leucocyte Typing, New York: Springer Verlag (1984)) definierten internationalen Nomenklatur);
(b) das Virus ist zytopathisch für infizierte CD4&spplus;-Zellen (anstatt transformierend, wie dies HTLV-I und II sind);
(c) das Virus kodiert für eine RNA-abhängige DNA-Polymerase (Reverse Transkriptase), die Mg²&spplus;-abhängig (optimale Konzentration 5 mM, optimaler pH 7,8, nicht hemmbar durch Actinomycin D) ist und oligo (dT)&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; als einen Primer für die Reverse Transkription von dessen 3' LTR verwenden kann;
(d) das Virus bildet in einem Saccharosegradienten bei einer Dichte von ungefähr 1,16 eine Bande;
(e) das Virus kann mit [³H]-Uridin markiert werden;
(f) das Virus ist aufgrund von immunologischen und Nukleotidsequenzkriterien unterschiedlich von Mitgliedern der HTLV-I/II-Virusfamilie (aufgrund dieses Kriteriums wird HTLV-III nicht als Mitglied der HTLV-I/II-Familie angesehen);
(g) das Virus ist mit den von den gag- und env-Regionen des LAV kodierten Proteinen im wesentlichen immunologisch kreuzreaktionsfähig; und
(h) das Virus besitzt eine wesentliche Nukleotidhomologie (78-100%) und Aminosäuresequenzhomologie (90-100%) mit LAV.

Immunologisch reaktionsfähig:

Ein Antigen und ein Antikörper werden als "immunologisch reaktionsfähig" bezeichnet, wenn sie fähig dazu sind, spezifisch aneinander zu binden, typischerweise mit einer Affinität von mindestens 10&sup6;M&supmin;¹, besser noch mit einer Affinität von mindestens 10&sup8;M&supmin;¹.

Transformiert oder Transformation:

Das Verfahren zum stabilen und vererbbaren Verändern des Genotyps einer Empfängerzelle oder eines Mikroorganismus durch das Einbringen von gereinigter DNA.
Lymphadenopathie-assoziiertes Virus (LAV) kann von Patienten mit AIDS oder dem Lymphadenopathie-Syndrom isoliert werden. An den Lymphknoten solcher Patienten wird typischerweise eine Biopsie durchgeführt, und das entnommene Material in ein Kulturmedium eingebracht, das soweit wie notwendig ergänzt worden ist, damit es das Wachstum unterstützt. Ein Mitogen, wie Interleukin-2(IL-2) oder Phytohämagglutinin (PHA) kann zugefügt werden; Antiserum gegen humanes Interferon kann ebenso zugefügt werden. Die Reverse Transkriptase-Aktivität erscheint typischerweise ungefähr am Tag 15 der Kultur, was die Gegenwart des Virus anzeigt. Das Virus kann unter Verwendung eines nicht-ionischen Detergens aus dem Kulturüberstand konzentriert werden, worauf eine Bandenbildung in einem Saccharosegradienten folgt. Diese und weitere Reinigungsverfahren sind im Stand der Technik gut bekannt und z. B. in Montelaro et al., J. Virology 42 : 1029 (1982) beschrieben.
LAV kann auf verschiedene Arten vermehrt werden. Es kann in T-Lymphozyten, die von der Nabelschnur oder peripherem Blut oder Knochenmark abstammen, kultiviert werden. Alternativ kann es in immortalisierten T-Zellen oder B-Zellen vermehrt werden; siehe z. B. Popovic et al., Science 224 : 497 (1984) und Montagnier et al., Science 225 : 63 (1984). Das Viruswachstum wird gewöhnlich durch das Vorhandensein Reverser Transkriptase-Aktivität angezeigt.
Ein genomischer LAV-Klon kann durch irgendein im Stand der Technik gut bekanntes Verfahren hergestellt werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf diejenigen, die von Hahn et al., Nature 312 : 166 (1984); Alizon et al., Nature 312 : 757 (1984); Luciw et al., Nature 313 : 760 (1984); und Muesing et al., Nature 313 : 450 (1985) beschrieben sind.
Kurz zusammengefaßt wird in einem dieser Verfahren (Alizon et al.) DNA aus LAV-infizierten T-Zellen eines gesunden Spenders isoliert, mit einer Restriktionsendonuklease wie Hind III partiell geschnitten und der entstandene Verdau elektrophoretisch fraktioniert. Fragmente, die hinsichtlich der Größe der Größe des gesamten LAV-Genoms (ungefähr 9,2 Kb) entsprechen, werden aus dem Gel eluiert, präzipitiert, resuspendiert und in die Arme eines geeigneten, geschnittenen Vektors ligiert. Die Ligierungsmischung wird in Bakteriophagenpartikel eingepackt. Bakterien werden mit den Bakteriophagen transfiziert, und die Klone unter Verwendung einer geeigneten Probe (wie einer ausgehend von LAV-RNA hergestellten cDNA) in situ auf LAV-Inserts hin durchsucht. Ausgehend von einem solchen Klon kann die gewünschte LAV-Region in einem bakteriellen Plasmidvektor, wie pUC 18, subkloniert werden. Weiteres Subklonieren kann wünschenswert sein, um nicht-gewollte Sequenzen zu entfernen und zusätzliche Restriktionsstellen (in der Form eines Polylinkers) an beiden Enden zum Zweck einer Vereinfachung des Klonierens in einen Expressionsvektor einzufügen.
Die LAV-Sequenzen können danach in einen induzierbaren Expressionsvektor subkloniert werden. Verschiedene Expressionsvektoren sind im Stand der Technik bekannt und umfassen λgt 11:Tn5 (Hall et al., Nature 311 : 379 (1984); trp E (Paul et al., Euro. J. Cell Biol. 31 : 171 (1983); pINIII (Masui et al., Biotechnology, Jan. 1984, S. 81).
Die sich ergebenden Proteine können partiell gereinigt und für verschiedene Zwecke, einschließlich als Immunogene und Antigene in Immunoassays, verwendet werden. Für die Verwendung als Immunogene können die Proteine in ein Tier, wie Maus, Kaninchen, Ziege etc. entweder in gepufferter Lösung oder in einem Adjuvans injiziert werden. Alternativ können die Proteine durch Polyacrylamidgelelektrophorese gereinigt und die Banden, die von Interesse sind, aus dem Gel ausgeschnitten, trituriert und in einem Puffer für die Injektion in ein Wirtstier resuspendiert werden. Polyklonale oder monoklonale Antikörper können hergestellt werden. Für die Verwendung als Antigene in Immunoassays können die Proteine in markierter oder unmarkierter Form verwendet werden. In den Fällen, in denen sie markiert werden, können die Markierungen Radioisotope, Fluorophore, Enzyme, lumineszierende Agenzien oder Partikel umfassen. Diese und weitere Markierungen sind im Stand der Technik gut bekannt und werden z. B. in den folgenden US-Patenten beschrieben: 3 766 162; 3 791 932; 3 817 837; 3 996 345 und 4 233 402.
Die Assays, die die erfindungsgemäßen rekombinanten Proteine verwenden, können heterogen (d. h. einen Trennungsschritt benötigend) oder homogen sein. Wenn der Assay heterogen ist, können verschiedene Trennungsmittel verwendet werden, einschließlich Zentrifugation, Filtration, Chromatographie oder Magnetismus.
Ein bevorzugter Assay zum Prüfen von Blutprodukten oder anderen physiologischen Flüssigkeiten auf das Vorhandensein von Antikörpern ist ein ELISA-Assay. Typischerweise wird ein Antigen (in diesem Fall ein rekombinantes Protein oder eine Kombination rekombinanter Proteine) an die Oberfläche einer Mikrotiterplatte adsorbiert. Restliche Protein-bindende Stellen auf der Oberfläche werden danach mit einem geeigneten Agens, wie Rinderserumalbumin (BSA), Hitze-inaktiviertes normales Ziegenserum (NGS) oder BLOTTO (eine gepufferte Lösung aus fettfreier Trockenmilch, die auch ein Konservierungsmittel, Salze und ein Antischaummittel enthält) blockiert. Die Vertiefungen der Mikrotiterplatte werden danach mit einer Probe, in der ein spezifischer Antikörper vermutet wird, inkubiert. Die Probe kann pur verwendet werden oder sie kann - wie es öfter geschieht - verdünnt werden, gewöhnlich in einer gepufferten Lösung, die eine geringe Menge (0,1-5,0 Gew.-%) Protein, wie BSA, NGS oder BLOTTO, enthält. Nachdem die Mikrotiterplatte für eine ausreichende Zeitdauer, um eine spezifische Bindung zu ermöglichen, inkubiert worden ist, werden die Vertiefungen ausgewaschen, um nicht-gebundenes Protein zu entfernen und danach mit einem markierten Anti-Humanimmunglobulin-Antikörper (α HuIg) inkubiert. Die Markierung kann aus verschiedenen Enzymen ausgewählt werden, umfassend Meerrettichperoxidase (HRP), β-Galactosidase, alkalische Phosphatase und Glucoseoxidase. Nachdem man genügend Zeit abgewartet hat, damit eine spezifische Bindung auftritt, werden die Vertiefungen nochmals gewaschen, um nicht-gebundenes Konjugat zu entfernen, und das Substrat für das Enzym wird zugefügt. Man läßt die Entwicklung der Farbe zu, und die optische Dichte des Inhalts in den Vertiefungen wird visuell oder mit einem Instrument bestimmt.
Aus Bequemlichkeitsgründen können die Reagenzien für die ELISA-Assays in der Form von Kits zur Verfügung gestellt werden. Diese Kits können Mikrotiterplatten an die durch rekombinante Techniken hergestellte virale Proteine voradsorbiert worden sind, verschiedene Verdünnungsmittel und Puffer, markierte Konjugate für den Nachweis spezifisch gebundener Antikörper und weitere Signal-erzeugende Reagenzien, wie Enzymsubstrate, Co-Faktoren und Chromogene, umfassen.
Aufgrund der Tatsache, daß eine signifikante Anzahl an AIDS-Patienten stark immunsupprimiert sind und fortschreitend die Fähigkeit verloren haben, Antikörper mit hohen Titern herzustellen, verwendet die vorliegende Erfindung Teile der envelope (env)-Region des LAV-Genoms, welches für ein Protein kodiert, das mit Antikörpern gegen LAV immunologisch reaktionsfähig ist. Die Gegenwart der Antikörper gegen das Hüllglykoprotein des LAV ist ein besserer Indikator für LAV-Infektionen als dies die Gegenwart von Antikörpern gegen andere virale Proteine ist, weil man glaubt, daß die Antikörpertiter gegen das Hüllglykoprotein während den späteren Krankheitsstadien fortbestehen, während Antikörper gegen andere Proteine, wie das core-Protein bis zu geringeren als nachweisbaren Mengen abfallen können.
Eine weitere Anwendung der erfindungsgemäßen rekombinanten Proteine ist die Verwendung als humane Impfstoffe. Die rekombinanten Proteine können extensiv gereinigt und in geeigneter Weise formuliert werden, gewöhnlich in Konzentrationen von 1 ug bis 20 mg pro kg des Wirts. Physiologisch annehmbare Träger, wie steriles Wasser, Salzlösung, gepufferte Kochsalzlösung etc. können verwendet werden.
Adjuvantien, wie Aluminiumhydroxid können ebenso verwendet werden. Der Impfstoff kann durch intravenöse, subkutane, intramuskuläre oder peritoneale Injektion verabreicht werden. Eine Injektion kann ausreichend sein, jedoch sind öfters mehrere Injektionen in wöchentlichen bis monatlichen Intervallen bevorzugt.
Alternativ können Vakzinevirus-Rekombinante konstruiert werden, die Bereiche des LAV-Genoms exprimieren. Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Konstrukte in ein Plasmid, wie pMM34 (Mackett et al., Science 227 : 433, 1985) eingebaut und Vakzinevirus-Hybride, die die sich ergebenden chimären Plasmide enthalten, durch homologe Rekombination gebildet werden. Es ist gezeigt worden, daß eine Immunisierung mit solchen Impfstoffen aus rekombinanten Viren wirksam hinsichtlich des Auslösens schützender Immunität in Tieren gegenüber Hepatitis B-Virus und vesikulärem Stomatitis-Virus ist (Smith et al., Nature 311 : 578, 1984).
Die Verwendung eines Impfstoffs aus rekombinantem Protein in dieser Weise hebt den Bedarf auf, Impfstoffe aus inaktivierten Präparationen oder avirulenten Stämmen pathogener Mikroorganismen zu erzeugen.
Die genetische Organisation des LAV, 5'LTR-gag-pol-Q-env-F-3'-LTR, ist einheitlich unter Retroviren. In allen weiteren bekannten, replikationskompetenten Retroviren überlappen die pol- und env-Gene; in LAV sind sie getrennt durch ein offenes Leseraster Q (Wain-Hobson et al., Cell 40 : 9 (1985)).
Das env-offene Leseraster besitzt eine mögliche Initiationsstelle (Methionin-Codon) am achten Triplet und kodiert daher vermutlich für ein Protein vom Molekulargewicht 97 kd. Dies ist vereinbar mit dem augenscheinlichen Molekulargewicht (110 kd) des LAV-Glykoproteins auf denaturierenden Polyacrylamidgelen. Es gibt in dem env-Gen 32 potentielle N-Glykosylierungsstellen (Asn-x-Ser/Thr). Es existieren ebenfalls drei hydrophobe Bereiche, die für retrovirale Hüllproteine charakteristisch sind und einem Signalpeptid (kodiert durch die Nukleotide 5815-5850), einem zweiten Bereich (7315-7350) und einem Transmembransegment (7831-7896) entsprechen. Der zweiten Region geht ein Arg/Lys-reicher Bereich voran, der vermutlich eine proteolytische Prozessierungsstelle darstellt (Wain-Hobson, s. o.).
Wie vorstehend bemerkt erscheinen Antikörper gegen das LAV-Glykoprotein (das env-Genprodukt) früh im Verlauf der Virusinfektion und bleiben in den späteren Krankheitsstadien ebenfalls bestehen (Kitchen et al., Nature 312 : 367 (1984). Antikörper gegen das Glykoprotein sind daher ein besonders guter Indikator für eine frühere LAV-Exposition; daher sind das Glykoprotein oder Teile davon besonders geeignet in Blutüberprüfungsassays.
Ein besonders bevorzugter Teil der env-Region des LAV-Genoms ist ENV-3. Wie in Fig. 3 gezeigt, umfaßt ENV-3 die Nukleotidsequenz von bp 7178 bis bp 7698. Unter Bezugnahme auf Fig. 7 sind innerhalb der Region die folgenden Sub-Regionen eingeschlossen (unterstrichen in Fig. 7): (1) ein hydrophobes Peptid, das durch bp 7315 bis 7350 kodiert ist; (2) ein Dodecapeptid, das putative proteolytische Prozessierungsstellen für die Spaltung des Vorläufer-Hüllproteins in gp 65 und gp 43 enthält; (3) eine hoch konservierte Region um zwei Cysteinreste; (4) eine konservierte Sequenz am 3'(Carboxyl)-Terminus; und (5) eine konservierte Sequenz am 5'(Amino)-Terminus.
Daten, die unter Verwendung synthetischer Peptide, die den verschiedenen Sub-Regionen von ENV-3 entsprechen, erhalten wurden, deuten darauf hin, daß die wichtigsten Regionen diejenigen sind, die die Cysteinreste umfassen oder in deren näherer Umgebung liegen und diejenigen, die die proteolytische Prozessierungsregion umfassen oder in deren näherer Umgebung liegen. Die Synthese und das Testen mancher dieser Peptide sind beschrieben in WO 86/06414, veröffentlicht am 6. November 1986, wobei der Text hierin durch Bezugnahme eingeführt wird.
Zusätzlich ist ENV-3 nahezu vollständig frei von potentiellen Glykosylierungsstellen; daher kann begründet erwartet werden, daß die Antigenität des rekombinanten Proteins diejenige des nativen Proteins nachahmt. Die vollständige Sequenz des env-Gens und dessen Proteinprodukts ist in Fig. 8 gezeigt, in der die potentiellen Glykosylierungsstellen unterstrichen sind. Unter Bezugnahme auf Fig. 8 kann gesehen werden, daß ein großer Bereich von ENV-3 frei von solchen Stellen ist und daß im Vergleich zu dem Rest des Gens ENV-3 als Ganzes auffallend unterglykosyliert ist.
In dem folgenden Beispiel wurde ein als λJ19 bezeichneter genomischer LAV-Klon in dem bakteriellen Plasmidvektor pUC 18 subkloniert. Der sich ergebende als pBT-1 (zugewiesen der ATCC-Hinterlegungsnummer 53069) bezeichnete Subklon wurde weiter subkloniert, woraus sich pRS-3 ergab, welcher vorherrschend Sequenzen der env-, F- und LTR-Regionen enthielt. Die env- und Teile der F-Sequenzen wurden weiter in M13mp18 subkloniert, und danach wurden Regionen der env-Sequenz in den induzierbaren trp E-Expressionsvektor überführt. Die env-DNA wurde im Leseraster stromabwärts des trp E-Gens eingebaut, wodurch sich die Expression eines trp E-env-Fusionsproteins ergab, wenn E. coli mit diesem Konstrukt transformiert wurde. Die sich ergebenden Proteine wurden partiell gereinigt und durch ihre Reaktionsfähigkeit im ELISA mit Seren von bekannten seropositiven und bekannten seronegativen Individuen charakterisiert. Fünf geeignete als pENV-1 bis pENV-5 bezeichnete Konstrukte wurden identifiziert.
Das folgende Beispiel wird als Darstellung und nicht als Beschränkung angeführt.

BEISPIEL

A. Konstruktion der trp-env-Expressionsvektoren

Irgendein bakterielles Expressionssystem kann verwendet werden, um die fremden Proteine zu exprimieren. Das trp E-System wurde für die Expression der LAV env-Sequenzen ausgewählt, weil es einen starken induzierbaren Promotor enthält, dessen Expression jedoch auch unterdrückt werden kann, so daß sich ein fremdes (und potentiell toxisches) Protein nicht innerhalb der Bakterien für lange Zeiträume anhäuft.
Da es keine schnelle und geeignete Weise gibt, um Bakterien zu überprüfen oder zu selektieren, die mit einem Vektor transformiert sind, der ein fremdes Insert (im Gegensatz zu Bakterien, die nur mit dem Vektor allein transformiert sind), enthält, ist es praktisch, die gewünschte Region eines großen DNA-Stückes (wie λPhagen-DNA) in einen Vektor subzuklonieren, welcher ein Selektionssystem für Inserts enthält, bevor dieses in den trp E-Expressionsvektor überführt wird. Dies erleichtert das Durchsuchen der transformierten Bakterien auf diejenigen hin, welche das gewünschte Insert enthalten.
Die Strategie der Erfinder war es deshalb, den größten Teil der env-Region des LAV-Genoms zuerst in zwei Schritten in einen Transfervektor, M13mp18 (Fig. 1), subzuklonieren. Danach wurden verschiedene Fragmente dieses Subklons in jeden der drei trp-Expressionsvektoren (pJH 11, pJH 12, pJH 14) ligiert, die sich nur im Leseraster der Restriktionsstellen in der Polylinker-Region unterscheiden (siehe Fig. 2). Einige der sich ergebenden Subklone (z. B. pENV-5, pENV-4) wurden als solche verwendet, andere jedoch benötigten weitere Modifikationen (pENV-1, pENV-2, pENV-3), damit diese das gewünschte Produkt herstellen.

1. Subklonieren des LAV-Genoms

a. Präparation der Phagen-DNA

Das gesamte LAV-Genom wurde vom Pasteur Institut in der Form von X-Phagenpartikel erhalten, welche ein 9,2 Kb genomisches DNA-Insert in der Hind III-Stelle des Phagen λL47.1 enthalten. Dieser Klon wird als λJ19 bezeichnet und ist beschrieben in Wain-Hobson et al., Cell 40 : 9 (1985). λJ19-Phagenpartikel wurden in den Stamm Q359 des E. coli K-12 transfiziert (der Genotyp von Q359 ist hsdRk&supmin;, hsdMk&spplus;, supF, φ80, P2), gemäß dem Verfahren von Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, S. 64. Ein einzelner Plaque wurde abgenommen und der Phage durch die Plattenlysat-Methode (Maniatis, s. o. auf S. 65) amplifiziert. Nach einer neunstündigen Inkubation bei 37ºC wurden die Platten (100 mm Durchmesser), die konfluente Plaques enthielten, mit 5 ml 100 mM NaCl/20 mM MgSO&sub4;/50 mM Tris, pH 7,5 überschichtet. Nach Inkubation für 12 Stunden bei 4ºC wurde die Flüssigkeit gesammelt und zweimal mit einem gleichen Volumen an Chloroform extrahiert.
Zu 10 ml der sich ergebenden wäßrigen Phase, die die Phagenpartikel enthält, wurden 2 ml 0,25 M EDTA/2,5% SDS/0,5 M Tris, pH 9 zugefügt, und die Suspension wurde für 15 Minuten bei 70ºC inkubiert, um den Phagen zu zerstören. 2,5 ml 8 M Kaliumacetat wurde zugefügt, und die Lösung wurde für 15 Minuten auf Eis inkubiert, danach für 10 Minuten bei 12000 xg bei 4ºC zentrifugiert, um Protein zu pelletieren. Der Überstand wurde in ein 50 ml Polypropylen-Zentrifugenröhrchen überführt und mit einem gleichen Volumen an Phenol (pH 8, equilibriert mit 1 M Tris, pH 8) bei 20ºC extrahiert. Die wäßrige Phase wurde danach mit einem gleichen Volumen an Chloroform: Isoamylalkohol (24 : 1) bei 20ºC extrahiert. Zu der wäßrigen Phase wurden danach 2,5 Volumen an 95%-igem Ethanol zugefügt, um die DNA zu präzipitieren. Nach der Zentrifugation wurde das DNA-Pellet getrocknet und in 10 mM Tris HCl, pH 7,4/1 mM EDTA resuspendiert.

b. Subklonieren der env-Region

Ungefähr 12 ug λJI9 DNA, hergestellt wie vorstehend in A.1.a, wurde mit dem Restriktionsenzym Sst I (Bethesda Research Labs, Bethesda, MD), das nur in den LTR-Regionen von diesem LAV-Isolat schneidet, vollständig verdaut. Die Verdaumischung wurde bei 1 V/cm durch 0,9%-ige Agarose in 0,089 M Tris-Borat/0,089 M Borsäure/l mM EDTA elektrophoretisch aufgetrennt. Die Position des 9,1 Kb-Fragments wurde im Verhältnis zu Molekulargewichtsstandards nach Färben mit Ethidiumbromid bestimmt. Diese Bande wurde auf NA45-Papier (Schleicher und Schuell, Keene, NH) elektroeluiert. Die DNA wurde gemäß den vom Hersteller bereitgestellten Anweisungen von dem Papier gewonnen.
Das 9,1 Kb Sst I-Fragment wurde in den Sst I-geschnittenen Vektor pUC 18 zu einem Verhältnis von 10 Insertmolekülen: 1 Vektormolekül ligiert. Der E. coli-Stamm HB101 wurde mit der Ligierungsmischung durch das CaCl&sub2;-Verfahren von Maniatis et al. (s. o.) transformiert und auf LB plus Ampicillin (200 ug/ml)-Agarplatten ausplattiert.
Einzelne Kolonien wurden abgenommen und in 3 ml LB plus Ampicillin-Medium verdünnt und unter konstantem Schütteln über Nacht bei 37ºC wachsengelassen. Plasmid-DNA wurde durch die alkalische Lyse-Methode (Maniatis et al., s. o., S. 368) präpariert. Eine Kolonie wurde selektiert, die das 9,1 Kb Sst I-Insert in einer solchen Orientierung enthielt, daß die Eco RI-Stelle im Polylinker am nahesten am 5'-Ende des LAV-Genoms lag, wie durch Restriktionsanalyse der Plasmid-DNA bestimmt wurde. Dieser Subklon wurde als pBT-1 (ATCC-Hinterlegungsnummer 53069) bezeichnet (Fig. 1).
Das Plasmid pBT-1 wurde danach mit Eco RI geschnitten, und der Vektor, welcher noch das 3'-Ende des LAV-Genoms enthielt, wurde religiert. Dies diente dazu, die 5' Eco RI-Fragmente von dem Plasmid zu entfernen. HB101-Zellen wurden mit der Ligierungsmischung transformiert, und eine Kolonie, die das Insert pRS-3 enthielt, wurde durch Restriktionsanalyse der gereinigten Plasmid-DNA identifiziert.
Die Sequenz zwischen den Kpn I-Stellen bei bp 5889 und bp 8572 [Numerierung gemäß Wain-Hobson et al., Cell 40 : 9 (1985)], die das meiste der env-Region enthält, wurde danach vom pRS-3- in den M13mp18-Vektor überführt. Dies wurde gemacht, um externe (nicht-env) Sequenzen weiter zu entfernen und auch um die env-Sequenzen in einen Vektor einzubringen, der β-Galactosidase anstatt Ampicillin als selektierbaren/überprüfbaren Marker benutzt. Dies war vorteilhaft, weil der trp E-Expressionsvektor Ampicillinresistenz als dessen selektierbaren Marker verwendet; die Überführung eines Inserts von einem Vektor (pUC 18), der für den Ampicillinresistenzfaktor kodiert, zu einem anderen (trp-Expressionsvektoren pJH 11, 12, 14) würde das Durchsuchen auf das gewünschte Insert plus Vektor schwieriger machen. M13-Phagen wurden unter Verwendung des chromogenen Substrats 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-galactosid (Sigma Chemical Co.) durchmustert, um auf eine Inaktivierung der β-Galactosidase aufgrund des Einbaus der env-Sequenz zu testen. Solche Phagen, die Inserts enthielten, wurden auf die Orientierung des Inserts im Verhältnis zu den Restriktionsstellen in der Polylinkerregion getestet. DNA wurde aus den Rekombinanten (mpSW16, mpSW19) mit beiden Orientierungen isoliert (Fig. 1).

2. Einbau der env-Sequenz in trp-Vektoren

Die Expressionsvektoren enthielten den E. coli trp-Operon- Promotor, -Operator und das trp E-Gen, eingebaut in pBR322 (Fig. 2). Das trp E-Gen war an dessen am äußersten 5'-Ende gelegenen Bgl II-Stelle durch den Einbau einer Polylinker-Sequenz verkürzt (Konopka et al., J. Virol. 51: 223 (1984)). Die verschiedenen trp-Vektoren (pJH 11, pJH 12 und pJH 14) unterschieden sich hinsichtlich des Leserasters der Restriktionsstellen innerhalb der Polylinker-Region. Der Einbau eines offenen Leserasters in einen geeigneten Vektor ergibt die Produktion eines Fusionsproteins mit trp E-Sequenzen am Amino-terminalen Ende (Spindler et al., J. Virol 49 : 132 (1984)).
Die Erfinder selektierten fünf überlappende Regionen des LAV-env für eine Expression (Fig. 3). Die Wahl wurde durch die Begrenzung auf eine bestimmte Insertgröße in diesen Vektoren (Konopka et al., J. Virol 51 : 223 (1984)) und durch die Lage hydrophober Sequenzen, die für eine Expression schädlich sein können, vorgeschrieben.
pENV-5 (ATCCC-Hinterlegungsnummer 53074) wurde durch Ligieren der env-Region von der Bam HI-Stelle in der Polylinker-Region des mpSW19 bis zur env-Hind III-Stelle (bp #7698) in den mit Bam HI und Hind III (New England Biolabs) geschnittenen pJH 12 konstruiert (Fig. 4). Die Legierungen wurden in CaCl&sub2;-geschockte E. coli HB101-Zellen transformiert, und die Bakterien in der Gegenwart von Ampicillin (Sigma) zu 100 ug/ml und Tryptophan (Sigma) zu 20 ug/ml ausplattiert. Das Tryptophan wurde zugefügt, um die Expression des fremden Proteins zu unterdrücken, dessen Anhäufung für die Bakterien schädlich sein könnte. Ampicillin-resistente Kolonien wurden durch Minilysate auf das Vorhandensein rekombinanter Plasmide, die das env-Fragment enthalten, durchsucht.
pENV-1 (ATCC-Hinterlegungsnummer 53070) wurde durch Entfernen der Sequenzen zwischen den beiden Bgl II-Stellen (bp 6598 und bp 7178) von pENV-5 hergeleitet (Fig. 4). Diese Deletion verminderte die Größe des offenen Leserasters durch Einführen eines Stopp-Codons kurz nach der Bgl II-Stelle.
pENV-2 (ATCC-Hinterlegungsnummer 53071) wurde durch Einbau des Fragments zwischen zwei Bgl II-Stellen (bp 6598 und bp 7178) in Bam HI-geschnittenen pJH 14 konstruiert (Fig. 5) (Bgl II- und Bam HI-Überhänge sind kompatibel). E. coli HB101-Zeilen wurden mit den Legierungsreaktionen transformiert und die Ampicillin-resistenten Kolonien durch Restriktionsanalyse auf die Gegenwart und Orientierung des env-Inserts in pJH 14 durchsucht.
pENV-3 (ATCC-Hinterlegungsnummer 53072) benötigte eine Legierung der env-Region zwischen der Bam HI-Stelle des mpSW19 (im Polylinker) und der Hind III-Stelle (bp 7698) in einen Bam HI- und Hind III-geschnittenen pJH 11 (Fig. 5). E. coli HB101-Zellen wurden mit der Legierungsreaktion transformiert, und die Ampicillin-resistenten Kolonien wurden durch Minilysate durchsucht. DNA wurde aus einer geeigneten Kolonie isoliert, mit Bam HI und Bgl II (New England Biolabs) geschnitten und religiert. Diese DNA wurde verwendet, um E. coli HB101 zu transformieren. Die sich ergebenden Ampicillin-resistenten Bakterien wurden durch Restriktionsanalyse auf rekombinante Plasmide durchsucht, die das Bam HI- bis Bgl II-Fragment deletiert hatten (Fig. 5). Die Deletion des Fragments brachte die env-Sequenzen zwischen der Bgl II-Stelle (bp 7178) und der Hind III-Stelle (bp 7698) in das korrekte Leseraster.
pENV-4 (ATCC-Hinterlegungsnummer 53073) wurde durch Ligieren des Hind III-Fragments von mpSW16 in pJH 12 konstruiert, der mit Hind III und alkalischer Phosphatase aus Kalbsdarm (Boehringer Mannheim) behandelt worden war (Fig. 6). Rekombinante Plasmide wurden durch Transformieren von E. coli HB101 mit der Ligierungsmischung und nachfolgendem Durchsuchen durch Restriktionsanalyse der Minilysate identifiziert.

B. Proteinexpression

1. Transformation von E. coli mit den trp-env-Konstrukten

Jedes der rekombinanten trp-env-Expressionsplasmide wurde von E. coli HB101 in E. coli C600 überführt, weil der letztere ein potentiell besserer Wirt für eine Proteinproduktion ist. Die Überführung umfaßte die Transformation von CaCl&sub2;-geschockten C600-Zellen mit überspiraliger DNA aus Minilysaten von HB101. Die Bakterien wurden in Gegenwart von Ampicillin und Tryptophan, wie beschrieben, ausplattiert (Konopka et al., J. Virol. 51 : 223 (1984)). Antibiotikaresistente Kolonien wurden durch Minilysate durchsucht, um die Gegenwart des geeigneten Plasmids zu bestätigen.

2. Expression von trp-env-Proteinen

Die Kultivierung und Induktion von E. coli C600-Zellen, die durch die trp-Expressionsvektoren transformiert waren, wurden wie beschrieben durchgeführt (Spindler et al., J. Virol 49 : 132 (1984); Konopka et al., J. Virol. 51 : 223 (1984)). Kurz beschrieben, wurde Minimalmedium, das Tryptophan (20 ug/ml) und Ampicillin (100 ug/ml) enthielt, mit transformierten Bakterien aus Glycerin-Stammkulturen angeimpft. Die Kulturen wurden unter Belüftung über Nacht bei 37ºC wachsengelassen. Die "über Nacht"-Kulturen wurden danach zu 1 : 100 in frisches Minimalmedium, das Ampicillin (100 ug/ml), jedoch kein Tryptophan enthielt, überimpft. Diese Kulturen wurden unter Belüftung für 2-3 Stunden (bis zur frühen log-Phase) bei 37ºC wachsengelassen. Der Induktor, 3-β-Indol-acrylsäure (Sigma) wurde zu einer Endkonzentration von 20 ug/ml aus frisch hergestellten Stammlösungen zu 20 mg/ml in 95%-igem Ethanol zugefügt.
Die induzierten Kulturen wurden unter Belüftung für 4 bis 5 Stunden bei 37ºC wachsengelassen und danach pelletiert und wahlweise eingefroren. Die Proteinausbeuten aus pENV-1, pENV-2 und pENV-3 lagen typischerweise zwischen 10-30 mg/l, während die Ausbeuten von pENV-4 und pENV-5 typischerweise geringer als 1 mg/l waren.

C. Isolierung und Reinigung der trp-env-Proteine

Fusionsproteine wurden wie beschrieben aus Zellpellets partiell gereinigt (Konopka et al., J. Virol. 51 : 223 (1984)). Kurz zusammengefaßt wurden Bakterien in 100 ml 50 mM Tris, pH 7,5/0,5 mM EDTA/150 mM NaCl (TNE) pro Liter induzierte Kultur resuspendiert. Lysozym (Sigma) wurde zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml zugefügt. Nach 15 Minuten bei 0ºC wurde NP40 zu der Mischung zu einer Endkonzentration von 0,2% für 10 Minuten bei 0ºC zugefügt. 1-2 mg DNase (Sigma) wurde danach mit 150 ml DNase-Puffer (150 mM NaCl/12 mM MgCl&sub2;) zugefügt. Die Reaktionsmischungen wurden für 1 Stunde bei 0ºC unter häufigem Rühren inkubiert. Unlösliches Protein wurde danach durch Zentrifugation für 15 Minuten bei 8000 xg bei 0ºC pelletiert. Die Pellets wurden zweimal in TNE gewaschen und danach auf das Vorhandensein unlöslicher Proteine durch denaturierende Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert. Die Proteine wurden durch Färben mit Coomassie Brilliant Blau R sichtbar gemacht.
Das das unlösliche Material enthaltende Pellet von 1 Liter Bakterien wurde in 6 ml 6 M Guanidiniumchlorid/ 0,1 M Tris HCl, pH 7,8 solubilisiert. Zu dieser Lösung wurden ungefähr 60 mg festes Dithiothreitol (DTT) zugefügt, und die Reduktion wurde für 30 Minuten bei 37ºC fortschreiten gelassen.
Das solubilisierte, reduzierte Protein wurde Gel-Permeationschromatographie an einer 9,4 mm · 25 cm GF-250-Zorbax-Säule (Du Pont, Wilmington, DE) ausgesetzt. Ein 100 ul Aliquot der Proteinlösung wurde auf die Säule injiziert und mit 6 M Guanidiniumchlorid bei einer Fließrate von 0,5 ml/min eluiert. Die optische Dichte bei 280 nm wurde aufgezeichnet, und Fraktionen wurden in 30-Sekunden-Intervallen gesammelt. Die Fraktionsnummer 32, d. h. die Fraktion, die zwischen 7,75 und 8,00 ml eluierte, wurde für die nachfolgenden Assays verwendet. Bemerke: Das Einbringen von DTT wird die Bildung unlöslicher Metallsulfide ergeben, wenn minderwertige Qualitäten des Guanidiniumchlorids verwendet werden.
Die trp-env-Fusionsproteine sind auch wie folgt gereinigt worden:
Die Fusionsproteine wurden aus Zellpellets als ein unlösliches Pellet (vorstehend beschrieben) partiell gereinigt. Das das unlösliche Material enthaltende Pellet aus 4 Litern Bakterien wurde in 4 ml 6 M Guanidiniumchlorid/0,1 M Tris HCl, pH 7,8, solubilisiert. Zu dieser Lösung wurden ungefähr 100 mg festes Dithiothreitol (DTT) zugefügt, und die Reduktion wurde für eine Stunde bei 37ºC fortschreiten gelassen.
Das solubilisierte, reduzierte Protein wurde Gel-Permeationschromatographie an einer 2,6 · 87 cm Fractogel TSK HW-50(S)-Säule ausgesetzt (MCB Manufacturing Chemists, Gibbstown, NJ). Die 4 ml reduziertes Protein wurden auf die Säule gepumpt und mit 2 · 10&supmin;&sup4; M DTT/2 ·10&supmin;³ Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)/6 M Guanidiniumchlorid (American Research Products Co., South Euclid, OH) eluiert. Die Säule wurde zu 0,5 ml/min laufengelassen, die optische Dichte bei 280 nm wurde aufgezeichnet, und Fraktionen wurden in 10 Minuten-Intervallen gesammelt. Die Fraktionen 34 und 35, die beiden Fraktionen aus dem Zentrum des UV-absorbierenden Peaks, wurden in den nachfolgenden Assays verwendet.

D. Immunologische Reaktionsfähigkeit der trp-env-Proteine

1. Analyse durch Western-Blots

Aliquots von den unlöslichen Proteinpräparationen, die durch pENV-1, pENV-2, pENV-3, pENV-4 und pENV-5 exprimiert worden waren, wurden in 2% Natriumdodecylsulphat/100 mM Tris, pH 6,8/20% Glyerin/1,5 M β-Mercaptoethanol solubilisiert und auf denaturierenden Polyacrylamidgelen elektrophoretisch aufgetrennt. Die Proteine wurden auf Nitrocellulose (BA85, Schleicher und Schuell, Keene, NH) elektrotransferiert und die Filter mit 5%-igem Rinderserumalbumin (Sigma) geblockt. Die Filter wurden danach mit E. coli-adsorbierten, humanen Seren, die von AIDS-Patienten gesammelt worden waren, getestet. Die Filter wurden mit HRP-konjugiertem Ziege αHuIg entwickelt. Der Pool war mit allen fünf trp-env-Fusionsproteinen, jedoch nicht mit dem trp E-Protein allein reaktionsfähig.

2. Analyse durch ELISA

Unlösliche Proteinpräparationen von pENV-1, pENV-2, pENV-3, pENV-5 und trp E wurden in 3 M Guanidiniumchlorid solubilisiert. Unlösliches Material wurde durch Zentrifugation für 5 Minuten bei 15000 xg entfernt. Die Konzentrationen löslichen Proteins wurden durch das Verfahren von Bradford (Analytical Biochemistry) 72 : 248 (1976)) bestimmt. Die Proteine wurden in 0,05 M Carbonat/Bicarbonat-Puffer (pH 9,6) zu einer Endkonzentration von 1-2 ug/ml verdünnt. Fünfzig ul-Aliquots wurden in jeweils eine Vertiefung einer Mikrotiterplatte eingefüllt und über Nacht bei 4ºC inkubiert. Die Platten wurden danach mit BLOTTO (5% [Gew./Vol.] fettfreie Trockenmilch/0,01% Thimerosol/ 0,01% Antischaummittel A in 0,01 M Natriumphosphat, pH 7,2/ 0,15 M Natriumchlorid) für eine Stunde bei 37ºC geblockt. Vereinigte, seropositive Seren, Seren von männlichen Homosexuellen oder LAS-Patienten und Seren von gesunden Heterosexuellen wurden 1 : 100 mit einer 1 : 1-Mischung aus BLOTTO und PBS (0,01 M Natriumphosphat, pH 7,3/0,15 M NaCl) verdünnt, und 50 ul verdünntes Serum wurden pro Vertiefung für eine Stunde bei 37ºC zugefügt. Die Seren wurden entfernt, und die Platten wurden dreimal in Waschpuffer (0,15 M NaCl/0,05% [Gew./Vol.] Tween 20) gewaschen, bevor 100 ul des Ziege-anti-humanIgG/Meerrettichperoxidase-Konjugats (verdünnt 1 : 10000 in 50 mM Na-Citrat/0,05% Tween 20/1% Hitze-inaktiviertes normales Ziegenserum; erhalten von Antibodies, Inc., Davis, CA) für eine Stunde bei 37ºC zugefügt wurde. Das Konjugat wurde entfernt und die Platten dreimal mit 0,15 M NaCl/0,05% (Gew./Vol.) Tween 20 gewaschen. Der ELISA-Assay wurde durch Zufügen von 100 ul/Vertiefung Substratlösung (10 mg o-Phenylendiamin in 50 ml 0,05 M Natriumcitrat, pH 7,0) für 30 Minuten bei Raumtemperatur entwickelt. Die Reaktionen wurden mit 100 ul/Vertiefung 3N H&sub2;SO&sub4; gestoppt und die optische Dichte bei 490 nm durch ein automatisiertes ELISA-Lesegerät bestimmt. Es wurde gefunden, daß alle durch pENV-1, pENV-2, pENV-3 und pENV-5 hergestellten Proteine reaktionsfähig mit bekanntermaßen seropositiven Seren waren.
Das weitere Testen des von pENV-1, pENV-3 und pENV-5 kodierten Proteins wurde unter Verwendung von Material aus den vorstehend beschriebenen Guanidiniumchlorid-solubilisierten Pellets (das von pENV-1 kodierte Protein wurde wie vorstehend beschrieben durch Gel-Permeationschromatographie weiter gereinigt) gegen eine Serie von 31 humanen Serumproben durchgeführt. Die Serie umfaßte 8 Seren von gesunden Heterosexuellen (als negativ definiert in einem Gesamtvirus-ELISA), 2 SerumPools von AIDS-Patienten und 21 Seren von als LAS (Lympadenopathie-Syndrom) diagnostizierte Individuen. Seren von LAS-Individuen wurden als seropositiv in einem Gesamtvirus-ELISA bestätigt. 12 wurden weiterhin durch Western-Blot-Analyse bestätigt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen, daß Seren von AIDS- oder LAS-Patienten reaktionsfähiger mit von pENV-1, pENV-3 und pENV-5 kodiertem Protein waren als Seren von normalen Individuen. Diese Darstellung zeigt, daß die trp-env-Fusionsproteine verwendet werden können, um auf die Gegenwart von Seren, die mit dem AIDS-verursachenden Virus, LAV, reaktionsfähig sind, zu testen. TABELLE 1 Vergleich von pENV1, pENV3 und pENV5 mit einem Gesamtviruslysat in einem ELISA-Assay für den Nachweis von Antikörpern gegen LAV ELISA Serum Nr. Diagnose Gesamtes Viruslysat¹ pENV bestätigt als seropositiv² Positiv Kontroll-Pool LAS³ und/oder homosexuel ja n.d.&sup4; ELISA Serum Nr. Diagnose Gesamtes Viruslysat¹ pENV bestätigt als seropositiv² LAS und/oder homosexuell ja nicht seropositiv n.d. unbekannt gesund heterosexuell
¹Viruslysat wurde durch Präzipitieren des Überstands infizierter Zellkulturen mit 10% Polyethylenglykol (PEG 6000), danach zweimaligem Bandenbilden zum Gleichgewicht in einem 20-60% Saccharosegradient hergestellt. Die virale Bande bei einer Dichte von 1,16 wurde entfernt, und virale Partikel durch Ultrazentrifugation weiter konzentriert, danach in RIPA-Puffer (beschrieben in Fußnote 2), enthaltend 0,5% Natriumdodecylsulfat lysiert, danach auf Vertiefungen von Mikrotitertestplatten geschichtet.
²Radiomarkierte LAV-Antigene wurden in RIPA-Puffer (Gilead et al., Nature 264 : 263 (1976)) zerstört und danach mit humanem Serum reagieren gelassen. Die sich ergebenden Immunkomplexe wurden durch Binden an ein Staphylococcus aureus-Adsorbens (Kessler, J. Immunology 115 : 1617 (1975) getrennt, worauf mehrere Waschschritte folgten. Die immunpräzipitierten Antigene wurden durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (Laemmli, Nature 227 : 680, (1970)) analysiert, worauf Fluorographie folgte. Das Vorhandensein von entweder einer p25- oder gp43-Bande wurde als notwendig und ausreichend angesehen, um eine Probe als seropositiv zu bestätigen.
³LAS= Lymphadenopathie-Syndrom
&sup4;n.d.= nicht getestet.

3. Fluoreszenz-Objektträger-Test zum Nachweis von Serumantikörper gegen LAV

Wie vorstehend beschrieben hergestelltes lösliches Protein wird an Latex-Perlen konjugiert, und die Protein/Perlen- Präparation auf Mikroskopobjektträger Ethanol-fixiert. Ein Aliquot eines Patientenserums wird mit dem Protein/Perlen auf einem Objektträger inkubiert. Die Objektträger werden gewaschen, und FITC-markiertes anti-Humanimmunglobulin in Evans-Blau-Gegenfärbemittel wird zugefügt. Die Objektträger werden gewaschen und Fixierungsmedium und Deckgläschen jeweils aufgebracht.
Alternativ wird die Protein/Perlen-Präparation für die Inkubation mit Patientenserum in Teströhrchen eingebracht. Die Röhrchen werden zentrifugiert und gewaschen, und FITC- markiertes anti-Humanimmunglobulin in Evans-Blau- Gegenfärbemittel wird zugefügt. Die Röhrchen werden zentrifugiert und der Überstand abgezogen. Ein Aliquot der Perlen wird auf einen Mikroskopobjektträger aufgetragen und Ethanol-fixiert, und die Deckgläschen werden befestigt.
Alle Objektträger werden durch Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Wenn das Testserum Antikörper-positiv ist, erscheinen die Perlen als fluoreszenzgrüne Kugeln; wenn das Testserum Antikörper-negativ ist, erscheinen die Perlen als rote Kugeln.
Aus dem Vorstehenden wird man erkennen können, daß, obwohl spezifische, erfindungsgemäße Ausführungsformen hierin zum Zweck der Darstellung beschrieben worden sind, verschiedene Modifikationen durchgeführt werden können, ohne daß vom Umfang der Erfindung abgewichen wird. Dementsprechend ist die Erfindung außer durch die angehängten Ansprüche nicht zu beschränken.

Claims

1. Eine isolierte DNA-Sequenz, umfassend einen Teil der env-Region des LAV-Genoms, wobei der Teil für ein Protein kodiert, das immunologisch reaktionsfähig ist mit Antikörpern gegen LAV, und worin die Sequenz ausgewählt wird aus dem Insert env-1 von Plasmid pENV-1, ATCC Nr. 53070, dem Insert env-2 von Plasmid pENV-2, ATCC Nr. 53071, dem Insert env-3 von Plasmid pENV-3, ATCC Nr. 53072, dem Insert env-4 von Plasmid pENV-4, ATCC Nr. 53073, dem Insert env-5 von Plasmid pENV-5, ATCC Nr. 53074 oder einer DNA-Sequenz, die für ein Protein kodiert, wobei das Protein zu mindestens 90% homolog zu dem Protein, kodiert von einem der Inserts env-1 bis env-5, ist, und worin die DNA-Sequenz zu mindestens 90% homolog zu der Sequenz ist, die env-1 bis env-5 kodiert.

2. Ein rekombinantes Plasmid, das zur Replikation in bakteriellen Wirtszellen fähig ist, wobei das Plasmid procaryontische Transkriptions- und Translationssignale zur Expression enthält, gefolgt von der DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 im Leserastar.

3. Das rekombinante Plasmid nach Anspruch 2, worin die Signale von dem trp-Operon stammen.

4. Eine Bakterienzelle transformiert mit einem rekombinanten Plasmid nach einem der vorherigen Ansprüche 2 oder 3.

5. Die transformierte Zelle nach Anspruch 4, worin die Bakterienzelle E. coli darstellt.

6. Ein Verfahren zum Herstellen eines Proteins, das mit Antikörpern gegen LAV immunologisch reaktionsfähig ist, umfassend:

- Einführen des rekombinanten Plasmids gemäß Anspruch 2 oder 3 in eine bakterielle Wirtszelle;

- Kultivieren des bakteriellen Wirts in einem geeigneten Medium; und

- Isolieren des Proteins.

7. Das Verfahren nach Anspruch 6, das nach der Isolierung des Proteins das Reinigen des Proteins durch Gelausschlußchromatographie umfaßt.

8. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein Protein, hergestellt gemäß einem der Ansprüche 6 oder 7, und einen physiologisch verträglichen Träger und/oder ein Verdünnungsmittel.

9. Die pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8, die ein Adjuvanz umfaßt.

10. Eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung bei der Stimulierung des Immunsystems eines Individuums gegen eine Infektion, die durch das Virus, das für das Syndrom der erworbenen Immunschwäche verantwortlich ist, verursacht ist, enthaltend ein Protein hergestellt nach einem der Ansprüche 6 oder 7.

11. Eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung bei der Stimulierung des Immunsystems eines Individuums gegen eine Infektion, die durch das Virus, das für das Syndrom der erworbenen Immunschwäche verantwortlich ist, verursacht ist, enthaltend ein Protein kodiert durch die DNA-Sequenz nach Anspruch 1.

12. Ein Protein, das einen Teil des LAV-Hüllproteins umfaßt, umfassend die Aminosäuresequenz von Fig. 7 von Isoleucin, Nr. 1 bis Threonin, Nr. 173, wobei das Protein mit Antikörpern gegen LAV immunologisch reaktionsfähig ist.

13. Ein nach einem der Ansprüche 6 oder 7 hergestelltes Protein zur Verwendung in einem Assay zur Bestimmung der Anwesenheit von Antikörpern gegen LAV in einer biologischen Flüssigkeit.

14. Ein nach einem der Ansprüche 6 oder 7 hergestelltes Protein zur Verwendung in einem Assay zur Bestimmung der Anwesenheit von LAV-Antigen in einer biologischen Flüssigkeit.

15. Ein nach einem der Ansprüche 6 oder 7 hergestelltes Protein zur Verwendung bei der Herstellung von Antikörpern gegen LAV.

16. Ein nach einem der Ansprüche 6 oder 7 hergestelltes Protein zur Verwendung als Arzneimittel.

17. Ein Protein, wie durch die DNA-Sequenz nach Anspruch 1 kodiert, zur Verwendung bei der Stimulierung des Immunsystems eines Individuums gegen eine Infektion, die durch das Virus, das für das Syndrom der erworbenen Immunschwäche verantwortlich ist, verursacht ist.