DE3427495A1

DE3427495A1 - Verfahren zur herstellung von l-aminosaeuren aus (alpha)-ketosaeuren

Info

Publication number: DE3427495A1
Application number: DE19843427495
Authority: DE
Inventors: Murray Campbell Ellicott City Fusee, Md.
Original assignee: WR Grace and Co
Current assignee: WR Grace and Co
Priority date: 1983-08-05
Filing date: 1984-07-26
Publication date: 1985-02-14
Also published as: GB8419142D0; JPS6043390A; SE8403933D0; AU3040784A; SE8403933L; GB2147579A; FR2550801A1; IT8421921A0; IT8421921A1; NL8401049A; IT1176404B

Description

Die Erfindung betrifft allgemein die biologische Herstellung von L-Aminosäuren. Es wurde insbesondere gefunden, daß eine L-Aminosäure aus der korrespondierenden a-Ketosäure als Ausgangsverbindung hergestellt werden kann, indem man die a-Ketosäure einer in der aktiven, logarithmischen Wachstumsphase befindlichen Kultur von geeigneten Mikroorganismen in einem Nährmedium zuführt.

Zahlreiche Mikroorganismen sind fähig, a-Ketosäuren biologisch in L-Aminosäuren umzuwandeln.

Es ist bekannt, daß a-Ketosäuren enzymatisch in ihre korrespondierenden L-Aminosäuren umgewandelt werden können. Beispielsweise beschreibt die US-PS 2 749 279 ein Verfahren, bei dem a-Ketoglutarsäure und Ammoniak mit einem biologischen Enzym-Coenzym-Katalysator behandelt werden. Geeignete biologische Katalysatoren können aus tierischem Gewebe, aus schnell wachsenden Pflanzen oder aus Bakterien als Autolysate oder Zellkulturextrakte gewonnen werden. Die US-PS 4 304 858 beschreibt ebenfalls die Umwandlung von wasserlöslichen a-Ketocarbonsäuren in die korrespondierenden Aminosäuren in Gegenwart einer substratspezifischen Dehydrogenase, Ammoniumionen und Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD+/NADH). Die Umwandlung von α-Ketosäuren in Aminosäuren unter Verwendung von Suspensionen ruhender Zellen wurde von Yamada et al., "The Production of Amino Acids", Seiten 440-446 (1972) beschrieben.

Es wunde erfindungsgemäß festgestellt, daß die biologische Umwandlung einer α-Ketosäure in die korrespondierende L-Aminosäure wirkungsvoller durch eine aktiv wachsende Mikroorganismenkultur vermittelt werden kann. Mikroorganismen, die fähig sind, ot-Ketosäuren in L-Aminosäuren zu überführen, werden in einem Nährmedium angezogen. Die a-Ketosäure wird als Ausgangsverbindung für die gewünschte L-Aminosäure der in der aktiven, logarithmischen Wachstumsphase befindlichen Kultur zugeführt. Die Transaminierungsreaktion wird durch ein von den Mikroorganismen der wachsenden Kultur gebildetes gekoppeltes enzymatisches System im wesentlichen bis zum Abschluß getrieben, was eine kontinuierliche Rückführung des Aminogruppendonators (L-Glutamat) und des Coenzyms (NADH oder NADPH) zuläßt. Die L-Aminosäure kann aus dem Kulturmedium gewonnen werden.

Es ist in erster Linie Aufgabe der Erfindung, ein äußerst wirksames Verfahren zur biologischen Transaminierung von cx-Ketosäuren in ihre korrespondierenden L-Aminosäuren zu schaffen.

Ferner kann das erfindungsgemäße Verfahren mit zahlreichen Mikroorganismen durchgeführt werden und zur Herstellung zahlreicher L-Aminosäuren dienen.

Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zu schaffen, bei dem ein einzelner Mikroorganismenstamm ausreichende Mengen sämtlicher für die Umwandlung einer bestimmten a-Ketosäure in die L-Aminosäure erforderlichen Enzyme bildet.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, für eine weitgehende Umwandlung der α-Ketosäure in die L-Aminosäure innerhalb einer kurzen Reaktionszeit zu sorgen.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zu schaffen, mit Hilfe dessen eine hohe Ausbeute an L-Aminosäuren bei einer geringen Konzentration des Aminogruppendonators erhalten wird.
5

Bakterienwachstum kann allgemein in drei aufeinanderfolgende Phasen eingeteilt werden. Die lag-Phase ist ein Zeitraum, innerhalb dessen die Mikroorganismenzahl in der Kultur wenig oder gar nicht ansteigt. In der logarithmischen oder exponentiellen Wachstumsphase steigt die Zellzahl exponentiell in Abhängigkeit von der Zeit. In der stationären Phase findet wenig oder kein Zellwachstum oder Zellteilung statt.

Es wurde gefunden, daß die mikrobiologische Transaminierung einer a-Ketosäure in die L-Aminosäure mit gesteigerter Wirksamkeit durchgeführt werden kann, wenn man die a-Ketosäure zu einer geeigneten Mikroorganismenkultur in der logarithmischen Wachstumsphase gibt. Die chargenweise gespeiste Fermentierung gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren liefert hohe Ausbeuten bei hohen Umwandlungsraten. Das Verfahren macht von einem in den wachsenden Mikroorganismen vorhandenen gekoppelten Enzymsystem Gebrauch, um die Reaktion vollständig ablaufen zu lassen. Das L-Aminosäureprodukt kann aus dem Kulturmedium gewonnen werden.

Bei der biologischen Umwandlung der α-Ketosäure in die L-Aminosäure handelt es sich um eine enzymatische Transaminierungsreaktion. Die biologische Umwandlung wird durch ein gekoppeltes Enzym-Coenzymsystem vermittelt, das eine Transaminase, eine Glutamatdehydrogenase, das Coenzym NADP+/NADPH (oder NAD+/NADH) und eine Dehydrogenase umfaßt. Alternativ kann letztere Komponente dos Enzymsystems eine Hydrogenase für die Rückführung des NADP+ (oder NAD+) in NADPH (oder NADH) sein.

3*27495

Das gekoppelte Reaktionssystem kann wie folgt dargestellt werden:

(NADPH)

oder

(NADH)

(tiyäroA

\genase/

oder —

/De- \

I hydro-J \genase/

(3)

(NADP^) oder (NAD+)

a-Ketoglutarat

matdehydro
genase

L-A min osäure

Vaminase/

L-Glutamat

ot-Keto-■ säure

(2)

(D

Die gewünschte Transaminierungsreaktion (Stufe 1), a-Ketosäure zu L-Aminosäure, ist normalerweise reversibel und würde nur bis zur Einstellung des Gleichgewichts fortschreiten, wodurch die Umwandlungseffizienz in die Aminosäure begrenzt würde. Durch Kopplung der Transaminierungsreaktion an andere enzymatische Reaktionen kann man die Transaminierung theoretisch vollständig ablaufen lassen, es können jedoch chemische Abbaureaktionen stattfinden, die die tatsächliche Ausbeute senken.

Die oben als Stufe 2) bezeichnete gekoppelte enzymatische Reaktion führt eines der Transaminierungsprodukte, das a-Ketoglutarat, zurück in L-Glutamat. Dieser Schritt, eine reduktive Aminierung, wird durch die GIutamatdehydrogenase vermittelt und macht die Gegenwart

'von Ammoniumionen erforderlich. Das für die Transaminierung der a-Ketosäure in die L-Aminosäure zur Verfügung stehende L-Glutamat wird durch diesen Rückführungsschritt kontinuierlich ersetzt.
5

In Stufe 2) wird von einem der Coenzyme NADPH oder NADH Gebrauch gemacht, die zu NADP+ oder NAD+ umgewandelt werden. In einer dritten enzymatischen Reaktion, Stufe 3), wird dieses NADP+ (NAD+) entweder durch eine Dehydrogenasereaktion oder eine Hydrogenasereaktion wieder in NADPH (NADH) umgewandelt. Demgemäß wird auch das in Stufe 2) erforderliche NADPH (NADH) kontinuierlich aufgefüllt. Das in Stufe 2) erforderliche NH.+ wird durch das Nährmedium bereitgestellt.

Das enzymatische Reaktionssystem selbst ist bekannt. Bei den bekannten Anwendungen dieses Systems ist jedoch der Zusatz von drei verschiedenen Mikroorganismen, vgl. US-PS 3 183 170, oder der Zusatz von Mikroorganismen, Aminogruppendonatoren und Cofaktoren, vgl, Yamada et al., "The Microbial Production of Amino Acids, Seiten 440-446 (1976) erforderlich, um die Reaktionskomponenten der vorstehend dargestellten drei Stufen bereitzustellen. Ferner werden in diesen bekannten Verfahren

25 Suspensionen ruhender Zellen verwendet.

Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein einzelner Mikroorganismenstamm verwendet, der das gesamte gekoppelte enzymatische Reaktionssystem liefert. Eine KuI-tür geeigneter Mikroorganismen in der logarithmischen Wachstumsphase, mit Ammoniumionen in dem Kulturmedium versorgt, vermittelt alle drei Stufen bei der biologischen Umwandlung der a-Ketosäuren in ihre jeweiligen L-Aminosäuren. In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird in Stufe 3) des gekoppelten Enzymsystems von einer

Dehydrogenasereaktion Gebrauch gemacht, um NADP+ (NAD+) in NADPH (NADH) zu überführen.

Das gekoppelte enzymatische Reaktionssystem ist in aktiv wachsenden Mikroorganismen vorhanden. Dieses natürlich auftretende System kann nun für eine effiziente Umwandlung von a-Ketosäuren in L-Aminosäuren verwendet werden. Bei Einsatz geeigneter Mikroorganismen mit dem richtigen Substrat wird die Umwandlung mit hohen Ausbeuten durch die Mikroorganismen selbst durchgeführt.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren sind sehr unterschiedliche Mikroorganismentypen verwendbar. Beispielsweise sind als Glutaminsäurebildner bekannte Bakterienstamme mit Erfolg verwendet worden. Diese schließen ^.!!„i^.äi.i.f.iliüül—i.lliP.S.^ilii.äii⁸- (ATCC Nr. 31723), Br_e_y_i_b_ac_-

t_e_ir_^u_m ^ac^oJ^rjTie^t^m (ATCC Nr. 13655), §.£.e_v_i_b_ac_t_e_r_i_ijm

ammon^ag_e_n_e_s (ATCC Nr. 13746), Brevibacterium glutamigenes (ATCC Nr. 13747, Br.ey^baci^r^ujTi f l_av_u[m (ATCC Nr.

13826) und Co£y_ne_bacte_£^u_m il^ncu^e^ (ATCC Nr. 13868)

ein. Die ATCC Nummern geben die Hinterlegungsnummern an, unter denen jede der oben genannten Kulturen bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 30852 hinterlegt worden ist.

Es wird davon ausgegangen, daß andere Glutaminsäurebildner in dem erfindungsgemäßen Verfahren ebenfalls geeignet sind .

Es wurde ferner gefunden, daß E__. c_oJjL HB101 , der norma-

lerweise nicht als Glutaminsäurebildner angesehen wird, in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden kann und dabei Ausbeuten gewonnen werden, die denen mit

vorstehend genannten Mikroorganismen entsprechen. E__. c_o-

l_i_ ist insofern kein Glutaminsäurebildner, als er Glutaminsäure nicht in das Medium ausscheidet. Sämtliche

Mikroorganismen bilden jedoch kleine intrazelluläre Mengen der Substanz. Das erfindungsgemäß interessierende Enzymsystem erfordert nur katalytische Mengen von Glutaminsäure um die Reaktion in Gang zu bringen, und E__. c_o_-

l_i_ scheint ausreichende Mengen von Glutaminsäure zu bilden, um die Stufe 2) des gekoppelten Systems ablaufen zu lassen.

Es zeigt sich, daß eine große Vielzahl von Mikroorganismen in dem erfindungsgemäßen biologischen Umwandlungsverfahren verwendbar ist. Es ist primär erforderlich, daß die Mikroorganismen fähig sind, eine cx-Ketosäure zu resorbieren und in die korrespondierende L-Aminosäure umzuwandeln. Um die biologische Umwandlung mit größter Wirksamkeit durchzuführen, sollten die Mikroorganismen in der Lage sein, die in den Stufen 1) bis 3) beteiligten Enzyme des gekoppelten Enzymsystems in ausreichenden Mengen zu bilden, um die Transaminierungsreaktion über den Gleichgewichtspunkt hinaus im wesentlichen bis zum Abschluß zu katalysieren. Schließlich sollten die Mikroorganismen vorzugsweise fähig sein, die L-Aminosäure in das Kulturmedium abzugeben, um eine bequeme und ökonomische Gewinnung möglich zu machen.

Die Auswahl der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten a-Ketosäure hängt von dem gewünschten L-Aminosäureprodukt ab. Beispielsweise wird Phenylbrenztraubensäure zu L-Phenylalanin, a-Ketoisocapronsäure zu L-Leucin, a-Ketoisovaleriansäure zu L-Valin, Brenztraubensäure zu L-Alanin, Oxalessigsäure zu L-Asparginsäure, ß-Hydroxy-a-ketobuttersäure zu L-Threonin, p-Oxyphenylbrenztraubensäure zu L-Thyrosin, Indolbrenztraubensaure zu L-Tryptophan und a-Keto-ß-methylvaleriansäure zu L-Isoleucin umgewandelt. Es ist offensichtlich, daß die herkömmlichen Ausgangsverbindungen für L-Aminosäuren in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die a-Ketosäure der Kultur als wäßrige Lösung zugesetzt, da diese Form das Pumpen der Ausgangsverbindung in die Kulturbrühe erleichtert. Falls gewünscht kann die a-Ketosäure jedoch auch in anderen physikalischen Formen, wie als Feststoff oder Aufschlämmung vorliegen.

Es wurde gezeigt, daß die Reinheit der a-Ketosäure als Ausgangsverbindung die L-Aminosäureausbeute recht dramatisch beeinflußt, zumindest im Fall der Umwandlung von Phenylpyruvat zu Phenylalanin (vgl. Beispiel 5). Neben der Tatsache, daß in der gereinigten Ausgangsverbindung höhere Mengen von a-Ketosäuren zur Verfügung stehen, wird angenommen, daß die Mikroorganismen gegenüber der gereinigten α-Ketosäure eine geringere Sensitivität entfalten .

Die Konzentration der wäßrigen a-Ketosäurelösung kann, wenn dies die Form ist, in der sie der Kultur zugeführt wird, erheblich variieren. Wird beispielsweise das erfindungsgemäße Verfahren bei einer kontinuierlichen Fermentation verwendet, so wird die Lösung verdünnter sein als für eine Batch-Fermentation. Die obere Konzentrationsgrenze hängt von der Löslichkeit der a-Ketosäure in dem gewünschten Lösungsmittel ab. Es wird davon ausgegangen, daß Spiegel von etwa 1,0 bis 200 g/l geeignet sind, wobei die Konzentration von der jeweiligen α-Ketosäure sowie von den zuvor genannten Faktoren abhängig ist. Es ist am bequemsten, die α-Ketosäure in Wasser zu lösen, aber auch andere Lösungsmittel, die mit der Fermentation verträglich sind, beispielsweise zusätzliches Wachstumsmedium, können falls gewünscht verwendet werden.

Das Wachstumsmedium sollte so gewählt werden, daß optimale Wachstumsbedingungen für die verwendeten Mikroorganismen geschaffen werden. Änderung und Anpassung der Medien liegt im Rahmen den Fähigkeiten des Fachmanns und müssen erfindungsgemäß nicht im einzelnen diskutiert werden.

Zusätzlich zu den Nährstoff-Grunderfordernissen sollte das Medium jedoch eine Quelle für NH.+ enthalten. Die Ammoniumionen werden von den Mikroorganismen sowohl zur Steigerung der Zellmasse als auch für die Stufe 2) des gekoppelten enzymatischen Reaktionssystems verwendet. Demgemäß sollte der Ammoniumionenspiegel in dem Kulturmedium im Hinblick auf die gewünschte Aminosäurenproduktion und Zellmasse gesteuert werden. Die Einstellung des (NH.+)-Spiegels ist dem Fachmann ebenfalls geläufig. Beispielsweise können die Ionen bequem durch Zusatz von Ammoniumsulfat in einer Konzentration von etwa 10 bis etwa 50 g/l zu dem Nährmedium geliefert werden.

Alternativ können Harnstoff, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat usw. als (NH.+)-Donatoren verwendet werden.

Das erfindungsgemäße biologische Umwandlungsverfahren erfordert eine Kultur von aktiv wachsenden Mikroorganismen. Diese Kultur kann hergestellt werden, indem man steriles Nähr- oder Wachstumsmedium mit einer Impfkultur des gewünschten Stammes aniropft. Die zum Animpfen des Nährmediums verwendete Impfkultur läßt man vorzugsweise etwa 6 bis 40 Stunden vor der Verwendung als Inokulum wachsen. Der Zeitraum, während dessen man die Impfkultur vor dem Animpfen anzieht, variiert abhängig von dem verwendeten Bakterienstamm. Es ist wünschenswert, daß die Impfkultur eine gesunde, wachsende ZeIlmasse enthält, die ausreicht, um eine gute Basis für

die Bildung und das Wachstum der Kultur für die Fermentation zu bilden.

Die Größe des Fermenters hängt von der speziellen Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ab. Dem Fachmann ist es geläufig, die Mengen des Mediums und der Impfkultur den Erfordernissen eines spezifischen Reaktors oder der gewünschten Ausbeute anzupassen. Man läßt die Kultur in dem Fermenter wachsen, bis sie sich an die Reaktorumgebung gewöhnt hat und sich zu einer Zellmasse entwickelt hat, die ausreicht, um der Zugabe der a-Ketosäure standzuhalten. Dieses ist besonders wichtig, wenn eine unreine Ausgangsverbindung verwendet wird. Die optische Dichte kann als geeignetes Maß für das Zellwachsturn dienen. Eine optische Dichte ("O. D.", 640 nm) von etwa 10 deutet im allgemeinen daraufhin, daß die Kultur für die Zugabe der a-Ketosäure bereit ist. Dies entspricht einer Wachstumszeit von etwa 6 bis 40 Stunden, abhängig von dem Organismus und den Wachstumsbedingungen. Dies kann jedoch etwas variieren und sollte nicht als strenges Erfordernis angesehen werden sondern eher der Erfahrung und dem Ermessen des Ausführenden überlassen bleiben.

Die Kultur wird bei einer Temperatur angezogen, die mit maximalem Wachstum des verwendeten Bakterienstammes vereinbar ist. Der allgemeine Bereich reicht von Raumtemperatur bis hinauf zu etwa 37 C. Für

und ^.IlS.y.i^.äS.i^E.iH.¹⁷¹ beträgt die bevorzugte Temperatur etwa 3O⁰C, für E_1-CoIi etwa 37⁰C. Der pH-Wert der Kultur sollte etwa 7 bis 8 betragen. Falls dies für den gewählten Bakterienstamm notwendig ist, kann belüftet werden .

In diesem Stadium wird der Reaktor mit der gewünschten a-Ketosäure beschickt. Wie zuvor angegeben liegt die a-Ketosäure vorzugsweise als wäßrige Lösung vor. Die Konzentration der a-Ketosäure in dieser wäßrigen Lösung kann von etwa 1 bis etwa 20 Gew.% betragen. Der pH-Wert der Lösung kann zwischen etwa 7 und etwa 14 liegen. Der pH-Wert kann mit Eisessig oder anderen biologisch verträglichen Säuren (wie Schwefelsäure oder Zitronensäure) oder mit Kohlendioxidgas auf niedrigere Werte eingestellt werden. Die Lösung kann durch Dampf (beispielsweise 15 Minuten bei 121⁰C), Milliporenfiltration (beispielsweise 0,22 μηη Porengröße) oder andere geeignete Mittel sterilisiert werden.

Falls erforderlich kann für kontinuierliches Kulturwachstum eine sterile Glukoselösung zusammen mit oder etwa gleichzeitig mit der a-Ketosäure in den Fermente^ eingespeist werden. Überschüssige, am Ende der Fermentierung in der Kulturbrühe verbleibende Glukose kann jedoch die Gewinnung des Aminosäureproduktes stören. In solchem Falle sollte die Menge der der Kultur zugeführten Glukose auf die Menge berechnet werden, die von der Zellmasse während der Fermentation verbraucht wird.

Die α-Ketosäure (und Glukose falls gewünscht) wird vorzugsweise aseptisch gemacht, um eine Kontaminierung des Reaktors zu vermeiden. Die a-Ketosäure-Konzentration in der Kulturbrühe des Reaktors liegt im Bereich von etwa 20 bis etwa 50 g/l für einen portionsweise beschickten Batch-Reaktor. Bei kontinuierlicher Fermentation kann die Konzentration niedriger sein. Es ist jedoch wünschenswert, die a-Ketosäure-Konzentration so hoch als möglich einzustellen, ohne den Metabolismus zu stören, um den Verbrauch durch die Mikroorganismen während der

35 logarithmischen Wachstumsphase zu maximieren.

Man läßt die Kultur anschließend für eine zusätzliche Zeit, vorzugsweise etwa 20 bis etwa 72 Stunden wachsen. Diese Zeit, während derer die a-Ketosäure biologisch in die L-Aminosäure umgewandelt wird, ist vorzugsweise so kurz als möglich, läßt jedoch maximale Ausbeuten zu. Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren können die maximal erwarteten Ausbeuten eine Höhe von 100 % innerhalb eines so kurzen Zeitraumes wie 23 Stunden erreichen, wie anhand der Herstellung von L-Phenylalanin gemäß Beispiel 6 gezeigt wurde. Im Anschluß an die Wachstumsphase kann das L-Aminosäureprodukt aus dem Kulturbrühe nach herkömmlichen Verfahren gewonnen werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird nachfolgend anhand von Beispielen erläutert.
*j

B_e_is_p_ie_i 1_

Es wurden die folgenden Impfkulturmedien hergestellt

_{1 1}

Impf kulturmedium Bestandteile Wachstumsmedium

Glukose² 100,00 g

Maisquellflüssigkeit

(corn steep liquor) 2,50 g

NZ Amin B 2,50 g

1,00 g ^K2^HP04 ¹'°° 9

MgSO₄ · 7H₂O 0,25 g

30,00	g
2,50	g
2,50	g
1,00	g
0,25	g
10,00	g
1,00	3 cm
1,00	cm

)_oS0„ 50,00 g

""■ 3 3

Biotinstammlösung 1,00 cm

4
Thiamin-HCl-Stammlösung ₃

Stammlösung 1,00 cm

20,90 g MOPS-Puffer⁵ 20,9Og

1 - je Liter entionisiertes Wasser

2 - eine 70 %-ige Lösung (Gew./Vol.) Glukosestammlösung

3 - 100 mg d-Biotin je Liter entionisiertem Wasser
4-1,Og Thiamin-HCl je Liter entionisiertem Wasser

5 - MOPS = Morpholinopropansulfonsäure

Außer den Glukose wurden alle Bestandteile vereinigt und bei 121 C 15 Minuten lang dampf stenilisiert. Die Glukoselösung wunde nach dem gleichen Verfahnen getnennt sterilisiert und anschließend steril zu dem 3
übrigen Medium gegeben. Es wunden Kolben (250 cm ) mit Impfkultunmedium verwendet, um jeweils zwei Impfkulturen fün 6 Glutaminsäune bildende Bakterienstämme anzuziehen. Die Stämme und die optischen Dichten für jeden der Stämme nach Anzucht der Impfkulturen für einen Zeitraum von 8 Stunden sind nachfolgend angegeben:

S;tamm optische Dichte (640 nm)

Brevibacterium 3,9 +_ 0,1

thiogenitalis (ATCC 31723)

Brevibacterium 11,2 + 0,8

¹⁵ lactofenmentum (ATCC 13655)

Bnevibactenium 6,0 +_ 0,4

ammoniagenes (ATCC 13746)

Bnevibactenium 9,2 +0,2

glutamigenes (ATCC 13747)

Brevibacterium 13,3 +0,3

²⁰ flavum (ATCC 13826)

Conynebactenium 12,3 + 0,7

hencules (ATCC 13868)

Das stenilisiente Wachstumsmedium wunde in Teilmengen

3 3

von jeweils 50 cm in gekenbte 250 cm Schüttelkolben gegeben. Jeden Kolben wunde mit einen einzelnen Impfkultun auf den Basis von 1 Vol./Vol.% beimpft. Man ließ sowohl die Bnevibactenium- als auch die Conynebacterium-Kulturen in den Schüttelkolben bei einer Schüttelrate von 300 UpM 17 Stunden lang bei 30⁰C wachsen.

Es wunde eine wäßnige Lösung von Natriumpheny!brenztraubensäure (Na-PPA) verwendet. Die Lösung war ein ungereinigtes Natniumhydnoxid-Hydnolysat von 5-Benzylidenhydantoin. Die Herstellung des Hydnolysats von 5-Ben-

zylidenhydantoin (Hamsphire Chemical Co.) wurde nach folgendem Verfahren durchgeführt: 2233 g entionisiertes Wasser und 223,3 g NaOH wurden in einem 3 1 Becher aus rostfreiem Stahl vereinigt und bis zum Sieden erhitzt. Unter fortgesetztem Sieden wurden langsam 350 g 5-Benzylidenhydantoin zugegeben. Der Siedevorgang wurde bei 101 bis 103°C 2 Stunden lang fortgeführt. Während der Reaktion wurde die Lösung mit einem elektrischen Mixer gemischt. Nach Abschluß des Siedens wurde die Mischung langsam in einem Eiswasserbad gekühlt. Das Endvolumen dieses Hydrolysats betrug 1810 ml und wies eine Na· PPA'HpO-Konzentration von 162 g/l, einen pH-Wert von 13,51 und klare Bernsteinfarbe auf. Eine 1 M Lösung des Natriumphenylpyruvats (Hydrolysat) enthielt 1,2 M NaOH, 0,5 M Natriumcarbonat und 0,5 M Harnstoff. Der pH-Wert der Lösung wurde mit 2 N Essigsäure auf 8 eingestellt und die Lösung wurde anschließend durch einen Milliporenfilter (0,22 [im Porengröße) sterilisiert.

Es wurde eine gesonderte Glukoselösung (70 Gew./Vol.% in entionisiertem Wasser) hergestellt und bei 121⁰C 15 Minuten lang sterilisiert. Die Glukoselösung wurde mit einem Volumenverhältnis von 3 : 7 -steril zu der sterilen Na-PPA-Lösung gegeben. In jeden Schüttelkolben wurde ein solches Volumen der zusammengesetzten Lösung gegeben, daß eine Natriumphenylpyruvat-Konzentration von 10 g/l in der Kulturbrühe erhalten wurde.

Man ließ jede der Kulturen in den Schüttelkolben weitere 23 Stunden wachsen, so daß eine Gesamtwachstumszeit von 40 Stunden erreicht wurde. Gleichzeitig wurden Mediumproben entnommen und unter Verwendung eines Hochdruckflüssigkeitschromatographen (HPLC) auf L-Phenylalanin untersucht. Durch Milliporen (0,22 μηι Porengröße) filtrierte Mediumproben wurden vor der Injektion in den HPLC nach dem Dansylchloridverfahren behandelt.

Ferner wurde für jede Mediumprobe das Zelltrockenge-

3
wicht bestimmt. Eine 10 cm -Probe des Mediums aus jedem Kolben wurde bei 10 000 UpM 30 Minuten lang zentrifugiert. Die feuchte Zellpaste wurde in einem Ofen bei 80 C 24 Stunden lang getrocknet und nachfolgend für 15 Minuten in einen Vakuum-Exsikkator gebracht. Die Trockenzellprobe wurde anschließend gewogen.

Für jeden Schüttelkolben wurde die durchschnittliche L-Phenylalaninproduktion in 23 Stunden je g Zelltrockenmasse berechnet. Die für jeden'Mikroorganismenstamm in jeweils zwei Schüttelkolben erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 wiedergegeben.

Mikroorganismen

ATCC	Nr.	31723
ATCC	Nr.	13655
ATCC	Nr.	13746
ATCC	Nr.	13747
ATCC	Nr.	13826
ATCC	Nr.	13868

Zelltrockengewicht (g/l)

39 + 0,8

22.4 + 3,2 34,7 + 0,6

46.5 + 12,6 51 ,6 + 5,1 42,5 + 1,5

Tabelle 1 mM (g/l) L-Phenylalanin

40,9 +1,0 (6,8 +0,2)

25,7 + 4,5 (4,3 +0,8)

28,2 + 0,3 (4,65 + 0,05)

29,4 + 1,5 (4,9 + 0,3)

41,2 + 7,9 (6,8 + 1,3)

38,4 + 2,1 (6,4 + 0,4)

1 = M L-Phenylalaninbildung/Stunde/g Zelltrockengewicht

%-Umwandlung	durchschnitt	,6	Rate	,9
(Mol/Mol)	liche	,6	+ 1	,7
67 +1,5	45	,3	+ 1	,2
42,3 + 7,5	49		+ O	,6
46,2 + 0,5	. 35	,4	+ 9	,2
48,2 +2,5	30	,3	+ 3	,8
67,6 + 12,9	34	+ O
63,1 + 3,5	39

Es wunde das folgende Kulturmedium (Luria-Brühe) hergestellt:

Bestandteile

2 Bacto-Trypton

2 Bacto-Hefeextrakt

10 NaCl

MOPS-Puffer³

Meng_e	g
10,0	g
5 ,0	g
5,0	g
20,9

1 - je Liter entionisiertes Wasser,
2 - erhältlich von Difco,

3 - MOPS = Morpholinopropansulfonsäure.

Die Bestandteile wurden vereinigt und bei 121 C 15 Minuten lang dampfsterilisiert. Das steriliserte Medium

3
wurde in Teilmengen von jeweils 50 cm in gekerbte

3
250 cm Schüttelkolben gegeben. Jeder Schüttelkolben wurde mit einer Kultur von §.s^2.!l^e-^r.i2.!li5u-^c.°ii *~"^ 1^1 ^au^ der Basis von 1 Vol./Vol.% beimpft.

Man zog die Kulturen in den Kolben 8 Stunden lang bei 37 C und einer Schüttelfrequenz von 300 UpM als Impfkulturen an. Am Ende dieses Zeitraumes betrug die optische Dichte für die als Doppelwert angesetzten Schüttelkolben bei 640 nm 6,27 + 0,03. Diese Impfkultur wurde an-

~ 3

schließend zum Beimpfen frischer 250 crn Schüttelkolben verwendet und 17 Stunden lang angezogen, bevor die Kolben mit der a-Ketosäure beschickt wurden.

Es wurde eine sterile wäßrige Natriumphenylbrenztraubensäure-Glukose-Lösung gemäß Beispiel 1 hergestellt. Diese Lösung wurde am Ende der 17 stündigen Wachstumsphase (optische Dichte = 10,3 + 1,3) gemäß Beispiel 1 den Testkulturen in den Schüttelkolben zugeführt, um eine Natriumphenylbrenztraubensäure-Endkonzentration von 10 g/l in der Brühe zu erhalten. Nach einer zusätzlichen Wachstumszeit von 23 Stunden wurden Proben entnommen und Zelltrockengewichte und L-Phenylalaninkonzen- -)0 trationen gemäß Beispiel 1 bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 wiedergegeben.

Tabelle 2

Zelltnockengewicht %-Umwandlung durchschnittig/l) mM (g/l) L-Pheny!alanin (Mol/Mol) liehe Rate

19,4+0,3 31,8+5,8(5,3+1,0) 52,2+9,5 71,3+13,8

ω. . > - μΜ L-Phenylalaninbildung/Stunde/g Zelltrockengewicht '.,' '

Es wurde das folgende Impfkultunmedium hergestellt:

Hysoy 3,0 g

!..-•Isoleucin 1 ,0 g

MgSO₄ · 7H₂O 0,4 g

(NH₄)₂S0₄ 10,0 g

KH PO 3,0 g

2

Spurenelemente 1,0 cm

CaCO,, 15,Og

3

Biotin-Stammlösung 1,0 cm

4

-\ 5 Thiamin-HCl-Stammlösung 1,0 cm

entionisiertes Wasser 700,0 cm

1 - erhältlich von Sheffield Co.

2 - die Stammlösung der Spurenelemente bestand aus:

ZnSO₄ · 7H₂O 8,8 g

FeSO₄ · 7H₂O 10,0 g

CuSO₄ · 5H₂O 0,06 g

Na₂B₄O₇ ■ 10H₂O 0,088 g

Na₂Mo₂O₄ · 2H₂O 0,053 g

MnSO₄ · H₂O 7,5 g

CoCl₂ · 6H₂O 0,12 g

CaCl₅ 0,055 g

3 3Q entionisiertes Wasser 900,00 cm

Die Stammlösung der Spurenelemente wurde mit konzentrierter HpSO auf pH 2 eingestellt und entionisier-

3 tes Wasser bis zu einem Endvolumen von 1000 cm

zugegeben.

3 - 100 g D-Biotin je Liter entionisiertem Wasser

4-1,Og Thiamin-HCl je Liter entionisiertem Wasser.

Das oben beschriebene Medium wurde mit 5 N NaOH auf pH 7,5 eingestellt und entionisiertes Wasser bis zu

einem Endvolumen von 900 cm zugegeben. Das Medium wurde bei 121 15 Minuten lang dampfsterilisiert. Eine Glukosestammlösung (50 g/100 cm entionisiertes Wasser) wurde gesondert bei 121°C 15 Minuten lang dampfsterilisiert. Nach dem Abkühlen wurde die sterile Glukoselösung steril zu dem sterilen Medium gegeben, bis ein

3
Mediumendvolumen von 1000 cm erreicht war. Der pH wur-

10 de mit 5 N Eisessig auf 7 eingestellt.

3
Teilmengen von jeweils 50 cm des Impfkulturmediums wur-

3
den in zwei gekerbte 250 cm Schüttelkolben gegeben.

Die Kolben wurden mit §£e y_^b ac^e^i^m i.!li^o-§L^e-!li£.™i^s_

ATCC Nr. 31723 beimpft und 8 Stunden lang bei 30°C unter Schütteln (300 UpM Schüttelfrequenz) angezogen, um Impfkulturen zu bilden. Am Ende der 8-stündigen Wachstumszeit betrug die optische Dichte (640 nm) etwa 10,0.

Wachstumsmedium wurde auf die gleiche Weise wie Impfmedium hergestellt, mit dem Unterschied, daß 50 g (NaH_A)„S0. verwendet wurden. Teilmengen von jeweils

50 cm des Wachstumsmediums . wurden in zwei gekerbte

3
250 cm Schüttelkolben gegeben. Anschließend wurden die

Kolben jeweils mit einer 2,5 cm Probe einer der Impfkulturen beimpft. Nach dem Beimpfen wurden die Schüttelkolben-Kulturen 33 Stunde
teln (300 UpM) angezogen.

kolben-Kulturen 33 Stunden lang bei 30°C unter Schüt-

Eine sterile Glukoselösung (70 Gew./Vol.% in entionisiertem Wasser) wurde gemäß Beispiel 1 hergestellt. Es wurde eine wäßrige ungereinigte 17,5 Gew./Gew.%-ige Lösung von Natrium-a-ketoisocapronsäure (Dichte =

3
1,125 g/cm , pH = 13,5) verwendet. Die Lösung war ein Natriumhydroxidhydrolysat von Isobutylidenhydantoin,

hergestellt nach dem Verfahren gemäß Beispiel 1 unter Verwendung einer ausreichenden Menge des Isobutylidenhydantoins, um vor dem Sieden eine 15 %-ige Lösung in Wasser und NaOH zu bilden. Eine 1 M Lösung der Natrium-α-ketoisocapronsäure (Hydrolysat) enthielt etwa 1,2 M NaOH, 0,5 M Natriumcarbonat und 0,5 M Harnstoff. Die Natrium-a-ketoisocapronsäurelösung wurde mit konzentriertem Eisessig auf pH 7 eingestellt und bei 121⁰C 15 Minuten lang dampfsterilisiert. Gleiche Volumina der sterilen Glukoselösung und der sterilen Natrium-a-ketoisocapronsäurelösung wurden steril vermischt und der ph-Wert erneut mit Eisessig auf 7 eingestellt.

Es wurden solche Volumina der vereinigten Lösung zu den Schüttelkolben-Kulturen gegeben, daß die in Tabelle 3 angegebenen a-Ketoisocapronsäure-Endkonzentrationen in der Brühe erhalten wurden. Man ließ die Kulturen für weitere 62 Stunden wachsen. Im Anschluß an diese Wachstumszeit wurden Proben entnommen, durch Milliporen filtriert (0,22 \xm Porengröße), um die Zellen zu beseitigen, und unter Verwendung von Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) gemäß Beispiel 1 hinsichtlich des L-Leucingehaltes analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 wiedergegeben.

Natrium-a-Keto- molare

1 2 2

■isocapronsäure L-Leucin gebildet Ausbeute

O.O312M (4,10 g/l) 0,025M (3,28 g/l) 80,0 %

0,0354M (4,61 g/l) 0,037M (4,85 g/l)⁴ 105,0 %^A

0.0624M (8,12 g/l) 0,058M (7,61 g/l) 93,7 %

1 - zugegeben nach 33-stündigem Wachstum

2 - nach einer weiteren Wachstumszeit von 62 Stunden

3 - molare Ausbeute g L-Leucin

= . x 100

g Na-a-Ketoisocapronsäure

4 - der analytische Fehler bei HPLC-Bestimmungen beträgt etwa

+ 10 %; es liegt demgemäß nahe, daß diese Zahl durch einen
analytischen Fehler nach oben zustande kommt.

Das Impfkulturmedium und das Wachstumsmedium gemäß Beispiel 3 wurden verwendet, um B£exib_a£t££^u_m_th^o_g_e_n_i_- talis ATCC Nr. 31723 für die biologische Umwandlung von a-Ketoisovaleriansäure zu L-Valin anzuziehen. Impfkulturen und Schüttelkolben-Testkulturen wurden unter Verwendung dieses Stammes nach dem Verfahren gemäß Beispiel 3 hergestellt. Es wurde eine wäßrige ungereinigte 4,53 gew.%-Lösung von Natrium-a-ketoisovaleriansäure verwendet. Die Lösung war ein gemäß Beispiel 1 hergestelltes Natriumhydroxid-Hydrolysat von Isopropylidenhydantoin,

3Q bei der eine ausreichende Menge des Isopropylidenhydan-

toins verwendet wurde, um vor dem Sieden eine etwa 6 %-ige Lösung in Wasser und NaOH zu bilden. Eine 1 M Lösung der Natrium-a-ketoisovaleriansäure enthielt etwa 1 ,2 M NaOH, 0,5 M Natriumcarbonat und 0,5 M Harnstoff.

Der pH-Wert der Lösung betrug 13,8 und wurde mit Eises-

sig auf 7,0 eingestellt. Die Lösung wurde bei 121⁰C 15 Minuten lang dampfsterilisiert.

Es wunde eine gesonderte Glukoselösung (70 Gew./Vol.% in ent ionisiertem Wasser) hergestellt und bei 121 C 15 Minuten lang dampfsterilisiert. 70 Teile der sterilen u-Ketoisovaleriansäurelösung wurden steril zu 30 Teilen der sterilen Glukoselösung gegeben. Es wurden in verschiedenen Stadien des Wachstums solche Volumina dieser Mischung zu den Schüttelkolben-Testkulturen gegeben, daß die Endkonzentrationen der Natrium-a-ketoisovaleriansäure in der Brühe entweder 10 oder 15 g/l betrugen, wie in Tabelle 4 wiedergegeben. Die Gesamtwachstumszeit betrug 40 Stunden für jede Schüttelkolben-Testkultur. An diesem Punkt wurden Proben entnommen, durch Milliporen filtriert (0,22 μιη Porengröße) und unter Verwendung von HPLC gemäß Beispiel 1 hinsichtlich des L-Valingehaltes analysiert.

in einer Kontrolluntersuchung wurden die gleichen Mikroorganismen und Verfahren verwendet, Natrium-a-ketoisovaleriansäure jedoch bei der Fermentation weggelassen. Die Kontrollen produzierten durchschnittlich 0,0205 M (2,4 g/l) L-Valin aus Glukose. Dieser Betrag wurde bei den in Tabelle 4 angegebenen Untersuchungsergebnissen nicht berücksichtigt.

Tabelle 4

N at r ium-a-Keto-

Zeitpunkt

isovaleriansäure der Zugabe L-'Valin gebildet

molare Ausbeute⁴¹

O,0725M (10 g/l)

16 Stunden 0,0846 + ,008M

(9,90 + 0,90 g/l)

99 %

O,O725M (10 g/l)

24 Stunden 0,0910 + ,003M

(10,65 + 0,35 g/D'

106

0,1087M (15 g/l)

16 Stunden 0,1004 + 005M

(11,75 + 0,55 g/l)

1 - nach 40 Stunden Gesamtwachstumszeit
2- molare Ausbeute g L-Valin

78 %

χ 100

g Natrium-a-ketoisovaleriansäure

3 - der analytische Fehler bei HPLC-Bestimmungen beträgt etwa + 10,0; es ist demgemäß naheliegend daß diese Zahl durch einen analytischen Fehler nach oben zustande gekommen ist.

25

30

In diesem Beispiel wurde die biologische Umwandlungseffizienz von Bll^i^ac^e£^umtl2iogeini_Ltali_:s ATCC 31723 verglichen, wenn ein Kaliumhydroxid-5-benzylidenhydantoin-Hydrolysat (Kaliumphenylbrenztraubensäure) oder eine 98 %-ige reine Natriumphenylbrenztraubensäure als Substrat angeboten wurde. Die a-Ketosäurelösungen wurden wie folgt hergestellt:

Kaliumphenylbrenztraubensäure: Es wurde ein ungereinigtes Kaliumhydroxid-Hydrolysat von 5-Benzylidenhydantoin (erhalten von Hampshire Chemical) gemäß Beispiel 1 aus

3M KOH je Mol 5-Benzylidenhydantoin hergestellt. Der pH-Wert des Hydrolysats wunde von dem Eingeben in die Schüttelkolben mit C0_-Gas auf 8,0 eingestellt.

Natriumphenylbrenztraubensaure: Festes Natriumphenylpyruvatmonohydrat (98 %), erhalten von Aldrich Chemical Company, wurde in 0,6 M wäßrigem KOH bis zu einer Konzentration von 98 g/l gelöst (als Natriumphenylpyruvatmonohydrat (Na* ΡΡΑ·Η_?Ο)) . Der pH-Wert wurde vor dem Eingeben in die Schüttelkolben mit CO -Gas auf 8,0 eingeste11t.

Die verwendete Impf- und Wachstumsmedien wurden gemäß Beispiel 1 hergestellt, mit dem Unterschied, daß der MOPS-Puffer durch 20 g/l CaCO ersetzt wurde und die Glukose sowie andere Bestandteile des Mediums zusammen 10 Minuten, lang bei 110 C autoklaviert wurden (anstelle der gesonderten Dampfsterilisation). Die Impf kulturen wurden gemäß Beispiel 1 unter Verwendung des Stammes §.£.^e-^v_i^.2:2.i.^e.£.i^u.^m._i.!li^o.ä^e-Ilii.SS:i.i2. ^AT(^C 31723 hergestellt.

Die Impfkulturen wurden verwendet, um die Schüttelkolben gemäß Beispiel 1 zu beimpfen. Nach einer anfänglichen 17-stündigen Wachstumsperiode wurden einzelne Schüttelkolben mit den Phenylbrenztraubensäurelösungen in solchen Mengen beschickt, daß die Phenylpyruvat-Endkonzentrationen in den Kulturmedien 76,22 mM (12,51 g/l als Pheny!brenztraubensäure) betrug. Man ließ die Kulturen in den Schüttelkolben wachsen und die molaren Ausbeuten wurden nach 23 Stunden (40 Stunden Gesamtwachstumszeit) und nach 28 Stunden (45 Stunden Gesamtwachstumszeit) bestimmt. Die HPLC-Bestimmungen wurden gemäß Beispiel 1 durchgeführt. Die in Tabelle 5 wiedergegebenen Ergebnisse zeigen, daß die Fähigkeit von

Liüü! ÜliP.S.f.n.ii.^i.ii ATCC 31723 zur biologischen Umwand-

lung von Phenylpyi-uvat zu L-Phenylalanin in dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht voll ausgenutzt wind, wenn eine unreine Ausgangsverbindung benutzt wird.

Tabelle 5

Phenyl-^

pyruvat L-Phenylalaninbildung (rnM)

2 2

23 Stunden molare „ 28 Stunden molare

Ausbeute Ausbeute

Kaliumphe-

nylpyruvat 35,96+0,85 47,2+1,1 49,52+12,7 65 +16,7

Natriumphe-

nylpyruvat 67,80+0 89,0+0 69,19+1,2 90,8+1,6

1 - Doppelwerte der Schuttelkolbenuntertsuchungen

2 - Zeit seit Zugabe von Phenylpyruvat

3 - molare Ausbeute mM L-Phenylalanin

χ 100

mM Phenylpyruvat

Beispiel 6

In diesem Beispiel wurde Natriumphenylbrenztraubensäure (Na*PPA) verwendet, die durch Fällen aus einem Natriumhydroxid-Hydrolysat von 5-Benzylidenhydantoin gereinigt worden war. Das Hydrolysat war gemäß Beispiel 1 herge-

30 stellt worden.

Anschließend wurde eine Essigsäurefällung an dem Hydrolysat durchgeführt. 1500 ml des Hydrolysats wurden in einen 2000 cm Glasbecher in einem Eiswasserbad überführt. Eisessig (Konzentration 99,7 %, 17,4 M) wurde

langsam unter Rühren zugegeben, um den pH-Wert auf 9 zu senken. Man ließ die Temperatur nicht über 30 C ansteigen. Bei etwa pH 12,95 begann ein Niederschlag auszufallen, nach 15 Minuten war ein pH-Wert von 9 erreicht.
5

Man ließ die Mischung 1 Stunde lang bei 23 C abgedeckt und unter einem Abzug stehen. Die Aufschlämmung wurde ohne Waschen durch Whatman-Papier Nr. 4 filtriert. Der feuchte Niederschlag wurde 18 Stunden lang in einem Vakuumofen bei 50 C gehalten. Der trockene Niederschlag wurde durch ein Sieb mit einer lichten Maschenweite von 0,420 mm gegeben. Das Endprodukt war Na-PPA-H„0 mit 79 %-iger Reinheit, wobei die weiteren Bestandteile Acetat, Na+, kleine Mengen von CO ~ und organischen

15 Stickstoff einschlossen.

Die Impf- und Wachstumskulturmedien wurden gemäß Beispiel 5 hergestellt.

31723 wurde in dem Impfmedium gemäß Beispiel 5 angezo-

3 gen. Die Impfkultur wurde zum Beimpfen von 250 cm

Schüttelkolben benutzt.

Nach einer anfänglichen Wachstumszeit von 18 Stunden wurde das gefällte Na-PPA-H₂O gelöst in 0,3 M KOH (100

g/l als Na-PPA-H 0) in die Schüttelkolben gegeben, so daß die in Tabelle 6 wiedergegebenen Endkonzentrationen in der Brühe erhalten wurden. Man ließ die Kulturen für weitere 23 Stunden wachsen. HPLC-Bestimmungen von L-Phenylalanin wurden gemäß Beispiel 1 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 wiedergegeben. Bei den Ergebnissen handelt es sich um Nährungswerte, da der durch Verdampfen entstandene Flüssigkeitsverlust aus den Schüttelkolben nicht gemessen wurde.

Tabelle 6

Versuchsnummer

Na»PPA»H₀O

1,73 + 0,12 3,06 +0 3,3 +0,08 5,71 +0 5,75 + 0,36 6,80 + 0,05 8,16 + 0,44 9,13 +0,36 9,45 +0 9,49 +0 12,91 + 0,04

!--Phenylalanin^

1,8	+ 0,09
3,69	+ 0,02
3,57	+ 0,19
6,32	+ 0,19
6,18	+ 0,11
6,05	+ 0,05
7,4	+ 0
6,99	+ 0,14
8,35	+ 0,15
7,82	+ 0,12
10,05	+ 0,95

Wachstum nach 23 Stunden (O.D. 640 nm)	molare . Ausbeute
34 + 4
41+2	100
40 + 2	100
24 + 1	100
27 + 1	100
23 + 0	100
43 + 2	88
43 + 0	90
27 + 0	76
36 + 7	88
24+1	82
37 + 5	78

- Doppelwerte der Schüttelkolbenversuche

2 - kolorimetrisch bestimmte PPA-Konzentration in dem Medium (g/l)

- L-Phenylalaninkonzentration (g/l) gebildet in 23 Stunden.

- Molare Ausbeute M L-Phenylalanin

M Phenylpyruvat

χ 100.

Claims

UEXKÜLL & STOLBERG

PATENTANWÄLTE

BESELERSTRASSE 4 D 2000 HAMBURG 52

EUROPEAN PATENT ATTORNEYS

DR. J. D FRHR von UEXKÜLL DR ULRICH GRAF STOLBERG DIPL ING. JÜRGEN SUCHANTKE DIPL-ING. ARNULF HUBER DR. ALLARD von KAMEKE

W.R. Grace & Co.

1114 Avenue of the Americas New York, N.Y. 10036

V.St.A.

(Prio.: 5. August 1983

US 520 632 0665/UGS/VOE/wo)

Juli 19 84

Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren aus

a-Ketosäuren

Patentansprüche

Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) Mikroorganismen auswählt, die fähig sind, eine a-Ketosäure in die korrespondierende L-Aminosäure umzuwandeln,

b) die Mikroorganismen in einem Nährmedium anzieht,

c) den Mikroorganismen während der logarithmischen Wachstumsphase die gewünschte a-Ketosäure zuführt und

d) die α-Ketosäure durch die wachsenden Mikroorganismen in die korrespondierende L-Aminosäure umwandeln läßt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen verwendet, die im wesentlichen einen einzelnen Bakterienstamm enthalten.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismen Glutaminsäure ausscheidende Bakterien oder !s^h^r^ch^^c^olä verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Glutaminsäure bildenden und ausschei-

-\ 5 denden Bakterien aus den Gattungen

und Corvnebacterium auswählt.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die L-Aminosäure aus dem Kulturmedium ge-

20 winnt.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Wachstumsphase gemäß Stufe b) etwa 6 bis etwa 40 Stunden und die Wachstumsphase gemäß Stu-

25 fe d) etwa 20 bis etwa 72 Stunden beträgt.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe c) ein Kulturmedium verwendet, das die α-Ketosäure in Mengen von etwa 0,5 bis

30 etwa 5,0 Gew./Vol.% enthält.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die α-Ketosäure als wäßrige Lösung verwendet .
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der wäßrigen Lösung etwa 1,0 bis etwa 20 Gew./Vol.% beträgt.
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als a-Ketosäure Phenylbrenztraubensäure, α-Ketoisocapronsäure, a-Ketoisovaleriansäure, Brenztraubensäure, Oxalessigsäure, ß-Hydroxy-a-ketobuttersäure, p-Oxyphenylbrenztraubensäure, Indol-Ί0 brenztraubensäure oder a-Keto-ß-methylvaleriansäure einsetzt.
11. Verfahren zur biologischen Transaminierung von a-Ketosäuren in ihre korrespondierenden L-Aminosäu-

-j 5 ren unter Verwendung des gekoppelten Enzymsystems einer in der logarithmischen Wachstumsphase befindlichen Bakterienkultur, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) eine in der logarithmischen Wachstumsphase befindliche Mikroorganismenkultur, die fähig ist,

a-Ketosäuren in ihre korrespondierenden L-Aminosäuren umzuwandeln, in Gegenwart eines Nährme— diums mit der gewünschten a-Ketosäure kontaktiert und

b) die Transaminierung der α-Ketosäure in die

L-Aminosäure durch das gekoppelte Enzymsystem der wachsenden Kultur katalysieren läßt.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man das L-Aminosäureprodukt der Transami-

nierungsreaktion aus dem Medium gewinnt.
13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismen Glutaminsäure bil-

₃₅ dende und ausscheidende Bakterien oder coli verwendet.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man die Glutaminsäure bildenden Bakterien

aus den Gattungen B.H^v.i^ä.S.i.f-lliy.OI ^unc' 2.2.£.y_ⁿ.§.kä£i^e-~ £iu.m. auswählt.
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15. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als a-Ketosäure Phenylbrenztraubensäure, α-Ketoisocapronsäure, α-Ketoisovaleriansäure, Brenztraubensäure, Oxalessigsäure, ß-Hydroxy-a-ketobuttersäure, p-Oxyphenylbrenztraubensäure, Indolbrenztraubensäure oder a-Keto-ß-methylvaleriansäure verwendet.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man die a-Ketosäure als wäßrige Lösung verwendet.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der wäßrigen Lösung etwa 1 bis etwa 20 % beträgt.
18. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultur in der logarithmischen Wachstumsphase etwa 20 bis etwa 72 Stunden lang mit der α-Ketosäure kontaktiert.