DE3416112A1

DE3416112A1 - Verwendung von sterolinen und spiroketalinen als lipoxygenaseregulatoren

Info

Publication number: DE3416112A1
Application number: DE19843416112
Authority: DE
Inventors: Karl Heinrich Prof. Dr. Durban Pegel; Hans Dr. 3440 Eschwege Walker
Original assignee: Roecar Holdings NV; Roecar Holdings Netherlands Antilles NV
Current assignee: Roecar Holdings NV; Roecar Holdings Netherlands Antilles NV
Priority date: 1984-04-30
Filing date: 1984-04-30
Publication date: 1985-10-31
Also published as: DE3587160T2; DE3587160D1; EP0162330B1; EP0162330A1; ATE86492T1; DE3416112C2

Description

*- " ^: 34161

Verwendung von Sterolinen und Spiroketalinen als Lipoxygenaseregulatoren

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Sterolinen und/oder Spiroketalinen als Lipoxygenaseregulatoren und -hemmer.

Erst seit kurzem hat sich herausgestellt, daß Arachidonsäure eine Schlüsselsubstanz des Stoffwechsels darstellt. Zwar war bereits seit längerem bekannt, daß sich von der Arachidonsäure durch Einwirkung der Cyclooxygenase über Ring- und Endoperoxydbildung die verschiedenen Prostaglandine, Thromboxane und Prostacycline ableiten, die eine vielfältige Wirkung im Stoffwechsel aufweisen. Erst in jüngster Zeit hat sich herausgestellt, daß die Arachidonsäure auch die Muttersubstanz für die sogenannten Leukotriene darstellt. Man wußte zwar schon seit Jahren, daß neben dem klassischen Allergiefaktor Histamin bei vielen Erkrankungen scheinbar auch eine weitere langsam reagierende, eine Anaphylaxe verursachende Substanz im Spiele sein mußte, doch erst in den letzten Jahren gelang es, die chemische Struktur dieser Substanzen aufzuklären. Die zusammenfassend als Leukotriene bezeichneten Verbindungen sind Abkömmlinge der 5-Hydroxy-7,9,11,1^-eicosatetraensäure, die über eine Thioetherbrücke mit Glutathion verbunden sind oder in Stellung 11 ein Wassermolekül anlagern. Bei allen natürlich vorkommenden Leukotrienen handelt es sich um Verbindungen mit 3 konjugierten Doppelbindungen und insgesamt 4 Doppelbindungen im gesamten Molekül. Die Biosynthese geht von der Arachidonsäure aus, die unter der Einwirkung von z.B. 5-Lipoxygenase in 5~Hydroperoxy-6,8,11,Ik₁ -eicosatetraensäure umgewandelt wird, wobei sich diese Persäure in

der nächsten Stufe in das Peroxyd umwandelt (abgekürzt als LTAi bezeichnet), die dann durch Anlagerung von Wasser in LTB. und durch Anlagerung von Glutathion in LTC.

übergeht. Durch Verlust der Glutaminsäure entsteht LTD. und durch weiteren Verlust der Aminosäure Glycin LTE^. Der entscheidende Unterschied im Vergleich zur Synthese der Prostaglandine besteht darin, daß das Substrat Arachidonsäure nicht mit Hilfe der Cyclooxygenase, sondern mit der der Lipoxygenase umgesetzt

Die Bedeutung und der Wirkungsmechanismus der Leukotriene im Körper sind zurzeit noch nicht restlos erforscht, bekannt aber ist, daß diese Verbindungen bei der Auslösung allergischer Reaktionen eine Rolle spielen. Man weiß, daß Histamin und Leukotriene in den sogenannten Mastzellen enthalten sind und daß bei allergischen Reaktionen Immunglobuline vom Typ E (abgekürzt I gE) sich an die äußere Zellmembrane der Mastzellen heften und deren Permeabilität erhöhen, so daß Histamin und Leukotriene ins Blut gelangen können. Man nimmt daher heute an, daß nicht nur Histamin, sondern auch die Leukotriene bei allergischen Reaktionen des Soforttyps eine bedeutende Rolle spielen. Zu den Erkrankungen dieser Art gehören beispielsweise Asthma und, bei überschießender Reaktion, der sogenannte anaphylaktische Schock.

Bislang ungeklärt ist allerdings, in welcher Art von Zusammenspiel die Leukotriene bei sogenannten Autoimmunkrankheiten auftreten wie beispielsweise bei rheumatoiden Arthritiden, Lupus erythematodes, bestimmten Anaemien Leuko-, Thrombo- oder Panzytopenien, bestimmten Hepatitiden, Myastenia gravis und anderen Erkrankungen.

Fest steht jedenfalls, daß bei diesen Erkrankungsformen der Gehalt an Leukotrienen im Blut oder in der Zellflüssigkeit erhöht ist. Ungeklärt ist bislang auch das Zusammenwirken zwischen Leukotrienen und dem Auftreten von Psoriasis, es wurde aber festgestellt, daß im Exudat von Psoriasisherden eine erhöhte Konzentration dieser Verbindungen nachweisbar ist.

Ein spezifischer Regulator oder Hemmer der entarteten Leukotriensynthese bzw. der Aktivität der Lipoxygenase war bisher nicht bekannt. Als unspezifischer Hemmer werden bei diesen Erkrankungen Cortikosteroide eingesetzt, da diese die Freisetzung * -τ----" der Arachidonsäure in jeder Beziehung unterbinden.

Völlig überraschend wurde nunmehr festgestellt, daß Steroline und Spiroketaline gut wirksame Regulatoren der Lipoxygenase sind. Die Erfindung betrifft daher die Verwendung dieser Verbindungen als Lipoxygenasenormalisatoren einer entgleisten Leukotrienbiosynthese, insbesondere bei der Behandlung von Autoimminkrankheiten und-Psoriasis.

Als Steroline werden die Glykoside von Phytosterolen einschließlich Cholesterol und tetracyclischer Triterpene wie beispielsweise Lanosterol und Cycloartenol bezeichnet. Steroline oder Phytosterole kommen in der Natur in kleinen Mengen sowohl in allen Pflanzen wie auch häufig in Mikroorganismen vor. Synthetisch können Steroline nach der bekannten Könlgs-Knoll-Synthese unter Verwendung der entsprechenden Aglycone und eines am C-I bromierten Zuckeracetates unter Verwendung von Silberoxyd oder

-carbonat oder Quecksilber- und Cadmiumverbindungen hergestellt werden. Die Steroline entsprechen der folgenden allgemeinen Formel

12 3
in der R , R und R Wasserstoffatome oder Methylgruppen und R ein Wasserstoffatom oder eine Methyl-, Ethyl, Methylen- oder Ethylidengruppierung und Z den Zuckerrest, gegebenenfalls verestert, bedeuten. An verschiedenen Stellen des Grundgerüstes und auch in der Seitenkette können darüber hinaus Doppelbindungen vorhanden sein; besonders in Stellung 5» wenn C-5 nicht ein 5J*-H trägt.

Steroline kommen in der Natur meist als Monoglykoside vor, es sind allerdings auch bereits einige filigoglykoside beschrieben worden. Der am häufigsten vorliegende Zucker ist D-Glukose, darüber hinaus sind in den natürlich

vorkommenden Verbindungen aber auch Mannose, Galactose, Arabinose und Xylose festgestellt worden. Teilweise liegen die Steroline im natürlichen und pflanzlichen Material auch in Form ihrer Ester, meist mit einbasischen Monocarbonsäuren₍ hauptsächlich als Palmitat_fvor.

Als Spiroketaline werden die von Steroidsaponinen abkömmlichen Mono- bis Tri-glykoside bezeichnet, die im Steroidgerüst des Aglycons eine an den C-l6 und C-I7 angeschlossene Spiroketalgruppierung aufweisen. Die Aglycone können entweder zu den 5-En-Steroidsapogeninen oder zu den 5J*-Steroidsapogeninen oder zu den 5<k-Steroidspogeninen gerechnet werden. Typische 5-En-Verbindungen sind beispielsweise Diosgenin, Yamogenin und Botogenin, während zu den 5dL-Verbindungen beispielsweise Tigogenin, Hecogenin oder Sisalagenin zählen. Bei dem natürlichen Saponin-Material liegen die Aglycone als Glykoside vor und enthalten meist 3 oder mehr Monosaccarideinheiten gekuppelt und diese werden hydrolytisch mittels Enzymen oder der Magensäure zu Spiroketalinen abgebaut. Synthetisch können Spiroketaline ebenfalls nach der Königs-Knorr-Synthese hergestellt werden.

Die Spiroketalsteroidglykoside entsprechen der nachfolgenden allgemeinen Formel

in der in 5-Stellung eine Doppelbindung oder ein Ai-Wasserstoffatom vorhanden sein können und in der Z einen Zuckerrest, gegebenenfalls verestert, bedeuten.

Die Verbindungen können in an sich bekannter Weise zu pharmazeutischen Spezialitäten verarbeitet werden wie beispielsweise zu Pulvern, Pillen und Tabletten, Kapseln, Dragees, Emulsionen, Lösungen, Injektionsbzw. Infusionslösungen, Salben oder Cremes. Es ist allerdings zu beachten, daß die Steroline und in geringerem Maße die Spiroketaline nur eine sehr geringe Wasserlöslichkeit aufweisen. Die Verbindungen müssen daher in einer für die Resorption geeigneten Teilchengröße gegeben werden. Dies kann in an sich bekannter Weise durch Adsorption, Absorption oder Mahlvorgänge mit oder ohne Zusatzstoffe erfolgen, vorausgesetzt, daß die Teilchengröße unter etwa 0,1 mm und vorzugsweise unter 0,06 - 0,05 mm liegt.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Verbindungen zeichnen sich durch eine minimale Toxizität und große therapeutische Breite aus, obgleich sie zur effektiven Behandlung nur in sehr geringen Dosen eingesetzt zu werden brauchen. Die Tagesdosen betragen etwa 0,01 - 10 mg, im allgemeinen reichen als prophylaktische oder als Erhaltungsdosis etwa 0,^5 - 0,1 mg täglich. Die Verbindungen können nicht nur im Humanbereich, sondern auch zur Behandlung tierischer Krankheiten, die auf einer entarteten

Leukotrien-Biosynthese beruhen, verwendet werden.

Die Erfindung wird im folgenden anhand der Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1:

Herstellung von Diosgenin-3-ß-D-glukosid.

4l, 4 g Diosgenin und 55 »2 g Silberkarbonat wurden in siedendes Toluol eingebracht, und die Mischung wurde unter Rühren so lange destilliert, bis das Destillat wasserfrei überging. Dann wurde in die gerührte siedende Mischung eine Lösung aus 82,2 g Bromacetylglukose in loo ml Toluol eingetropft. Die Mischung wird kontinuierlich weiter destilliert, um das sich bei der Reaktion bildende Wasser zu entfernen. Während dieser Zeit wird das Reaktionsgefäß vor Licht geschützt. Falls notwendig, wird das Volumen der Reaktionsraischung durch Zugabe von trockenem Toluol konstant gehalten. Nach der Zugabe, der Acetobromglukoselösung wird so lange weiter destilliert, bis das Destillat wasserfrei übergeht. Die Reaktionsmischung wird dann abgekühlt und filtriert. Der Rückstand wird mit frischem heißen Toluol ausgewaschen. Die vereinigten Filtrate und Waschflüssigkeiten werden unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird aus Aethanol oder Hexan umkristallisiert. Die Ausbeute an Diosgenin-3-ß-D-glukosid-tetraacetat betrug 25,5 S oder 34,3%

lg Natrium wurde in loo ml absolutem Aethanols gelöst. Von dieser Lösung wurden 15 ml unter Rühren schnell zu einer Lösung von Io g Diosgenin-glukosid-tetraacetat in 600 ml Aethanol bei 45 C zugegeben. Die Mischung wird eine Stunde gerührt, bevor 2 1 Wasser zugesetzt werden und die Mischung dann wiederum eine Stunde gerührt wird. Das ausgefallene Diosgenin -ß-D-glukosid wird abfiltriert und mit Wasser neutral gewaschen, bevor es im Vakuum 12 Stunden getrocknet wird. Die Ausbeute betrug 7 g oder

In entsprechender Weise können auch alle übrigen erwähnten Spiroketalsteroidglykoside hergestellt werden.

Beispiel 2:

Herstellung von Sitosterol-ß-D-glukosid.

Eine Mischung aus kl,k g Sitosterol und 55,2 g Silberkarbonat in Toluol wird unter Rühren so lange destilliert, bis das Destillat wasserfrei übergeht. Dann wird in die gerührte siedende Mischung tropfenweise eine Lösung von 82,2 g Acetobromglukose in loo ml Toluol eingetropft. Das Toluol wird kontinuierlich weiter destilliert, so daß das gesamte bei der Umsetzung gebildete Wasser azeotrop entfernt wird. Das Reaktionsgefäß wird in dieser Zeit vor Licht geschützt. Falls notwendig, wird das Volumen der Reaktionsmischung durch Zugabe von trockenem Toluol konstant gehalten. Nach der Zugabe der Bromacetoglukoselosung wird so lange weiter am Sieden gehalten, bis das Destillat

AO

wasserfrei ist. Anschließend wird die Reaktionsmischung abfiltriert und der Rückstand mit frischem heißen Toluol ausgewaschen. Die vereinigten Filtrate und Waschflüssigkeiten werden dann unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird aus Aethanol bzw. Hexan umkristallisiert. Die Ausbeute an Sitosterol-glukosid-tetraacetat beträgt 22,^ g entsprechend Jo %.

Eine Lösung von 1 g Natrium in loo ml Aethanol wird unter Rühren schnell zu einer Lösung von Io g Sitosterolglukosid-tetraacetat in 600 ml Aethanol bei einer Temperatur von k$ C zugesetzt. Die Mischung wird eine Stunde gerührt, bevor 2 1 Wasser zugesetzt werden und die Mischung eine weitere Stunde gerührt wird. Das niedergeschlagene Sitosterol-glukosid wird abfiltriert und mit Wasser neutral gewaschen,bevor es 12 Stunden im Vakuum getrocknet wird. Die Ausbeute beträgt 6,9 g entsprechend 95 %·

Durch Wahl geeigneter Ausgangsverbindungen können auch alle übrigen erwähnten Steroline nach dem oben angegebenen Verfahren hergestellt werden.

Beispiel 3:

Beeinflussung der Lipoxygenase.

Die Untersuchungen wurden nach dem von Schröer et al, Naomyn-Schmiedeberg's A,rch. Pharmak. 313, 69 pp (1980) beschriebenen Verfahren durchgeführt. Nach dieser

- Io -

A4

werden Versuchsanordnung ^^ in gewaschene menschliche Thrombozyten mit Thrombin (0,6 iU/ml) stimuliert. Die von den Thrombozyten auf die Stimulation hin freigesetzte Axachidonsäure wird durch die 1,2J-LIpoxygenase der Plättchen in 12-Hydroperoxyeikosatetraensäure (12-HPETE) umgewandelt. Bei einer Dosierung von Diosgeninglukosid 5 /*g/nil ergab sich eine 13%ige Hemmung, bei loy*g/ml eine solche von 31 % und bei 5° /*-g/^ml eine solche von 60 %.

Der stärkste bisher bekannte Lipoxygenasehemmer ist 5, 8, 11, ld-Eicosetetrainsäure (ETYA), die unter den angegebenen Versuchsbedingungen bei einer Konzentration von Io Rg/ml eine 97 %ige Hemmung ergibt,

Beispiel k:

in vitro Bestimmung der Inhibierungswirkung.

In-weiteren Untersuchungen wurde die Hemmung der z.B. 12- Lipoxygenase an menschlichen Thrombozyten - bzw. Leukozytenpreparationen nachgewiesen.

Die gewaschenen und resuspendierten Thrombozyten bzw. Leukozyten wurden einerseits mit einer gesättigten Lösung von ß-Sitosterol-ß-D-glukosid (12,5 mg/lo ml Äthanol), andererseits mit einer lofach übersättigten Lösung unter Zugabe von 0,25/*Cu Arachidonsäure 5 Minuten inkubiert.

NachAnsäuern des Probengemisches erfolgte die Extraktion

- 11 -

?*- 34161T2

Al

unter Verwendung von Athylacetat. Die Auftrennung der Reaktionsprodukte erfolgte mittels Radiodünnschichtchromatografie.

Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle X erhalten, wobei im Leukozytentest 1 die Anzahl der Leukozyten 2ooo, im Test 2 l6oo und im Throbozytentest die Zahl der Thrombozyten l4o 000 im 2. Test 2^o betrug.

Nach Inkubation mit der Testsubstanz läßt sich eine deutliche Hemmung der Lipoxygenaseprodukte bei den Thrombozyten nachweisen, wobei es bei der übersättigten Lösung zu einer fast völligen Hemmung der Synthese und einem Liegenbleiben nicht metabolisierter Arachidonsäure kommt. Auch bei den Leukozyten findet sich ein dosisabhängiger Hemmeffekt der Lipoxygenase, wobei die Veränderungen hauptsächlich durch 12-HETE und 12-HPETE bedingt sind, während sich für HHT nur geringere Änderungen zeigen.

Beispiel 51

in vivo Untersuchungen.

In vivo Untersuchungen mit ß-Sitosterol-ß-D-Glukosid wurden nach dem Verfahren von Anderson et al (Br.J. pharmakol. (I983) 78, 67-7^) an der durch antigene . induzierten und über Leukotriene als Mediator verlaufenden Bronchokonstruktionen bei sensibilisierten Meerschweinchen durchgeführt wird. 25 - 3° Tage nach

- 12 -

J* -

Al

der Sensibilisierung wurde bei den anästhesierten Tieren nach operativer Vorbereitung der Atmungsdruck nach Gabe des Ovalbumins und einminütiger vorheriger Gabe der Testsubstanz in Dosen von 1 mg/kg bzw. Io mg/kg iv gemessen. Als Lösungsmittel wurde DMSO 50 % in Wasse verwendet. Ausserdem wurde als Vergleich Phenidone eingesetzt.

Die signifikanten Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle enthalten:

Dosis (mg/kg i.v.)	5o?S DMSO	mittlere Änderung des Atmungsdruckes nach Ovalbumingabe nach Min.	2	3	4	5	ή	Io
	BSSG 1	1	55,6 ^9,7	75,3 +6,5	76,8 +5,5	83,1 +4,2	72,8 + 6,1	65,4 + 8,0
BSSG 10	7,9 i2,7	26,8 + 8,2	3o,o üo,6	38,o ±9,4	39,5 ±9,3	32,9 i7,2	36,0 + 7,2
Phenidone 10	5,8 ±4,5	3l,o £9,8	fclo',5	5o,3	52,9 + 7,7	47,4 +5,8	37,6 ±4,5
1,8 + 2,8	22,8 +7,o	43,3 i8,2	5o,o £9,9	42,5 18,9	4o,4 ±8,2	34,3 16,7
ti',o

AH :

Tabelle I

12 HETE 12 HPETE

1. LEUKOZYTEN normal ₅₀₂

30' ) gesättigt - 35 9

120· ) - ₁₃[,

30' ) _Ufli

120' ) ^öbersätt!9t

2. LEUKOZYTEN normal 48,0

30' ) -,.. ,. 37,0

'gesattigt

r 120« ) 2,7

"" 30' )

12O¹ )

³⁰' 1 übersättigt ²²'⁷

1. THROMBOZYTEN normal ³⁹'⁸

^{301 J} gesättigt

120' ) ³'⁸

2. THROMBOZYTEN normal ₃₅

. ^{301 J} gesättigt

Claims

Ansprüche

1.) Verwendung von Sterolinen oder Spiroketalxnen als Lipoxygenaseregulatoren.

2. ) Verwendung nach Anspruch 1 zur Behandlung von Allergien insbesondere Asthma.

3.) Verwendung nach Anspruch 1 zur Behandlung von Psoriasis.