DE3329387A1

DE3329387A1 - Method and reagent for the determination of cholesterol

Info

Publication number: DE3329387A1
Application number: DE19833329387
Authority: DE
Inventors: Günther Dipl.-Chem. Dr.rer.nat. Gurka; Ursula 6270 Idstein Schurr
Original assignee: Flemming GmbH
Current assignee: Flemming GmbH
Priority date: 1983-08-13
Filing date: 1983-08-13
Publication date: 1985-02-21
Also published as: DE3329387C2

Abstract

The method for the kinetic quantitative determination of cholesterol in free or bound form, which is not confined to a cholesterol oxidase of specific origin or to a specific inhibitor, with the aid of cholesterol oxidase, of a cholesterol oxidase inhibitor and, where appropriate, additionally of a cholesterol esterase by measurement of the oxygen consumption, of the amount of hydrogen peroxide formed, or of the amount of cholestenone formed, is characterised in that the cholesterol oxidase inhibitor used is phenol or a phenol derivative, with the exception of 3,4-dichlorophenol in combination with a cholesterol oxidase from a microorganism of the genus Streptomyces.

Description

Verfahren und Reagenz zur Bestimmung Method and reagent for determination

von Cholesterin Die quantitative Bestimmung von Cholesterin in freier oder gebundener Form mit Hilfe von Cholesterinoxidase und gegebenenfalls Cholesterinesterase ist seit vielen Jahren bekannt. of cholesterol The quantitative determination of cholesterol in the free or bound form with the aid of cholesterol oxidase and optionally cholesterol esterase has been known for many years.

Die Bestimmung von freiem Cholesterin mit Cholesterinoxidase unter Bildung von Cholestenon und Wasserstoffperoxid ist beispielsweise in der DE-PS 2 224 132 und der DE-OS 2 265 122 beschrieben. Die Bestimmung erfolgt dabei entweder durch Ermittlung des Sauerstoffverbrauches, durch Ermittlung der gebildeten Cholestenonmenge oder durch Ermittlung der gebildeten Wasserstoffperoxidmenge. Der Sauerstoffverbrauch kann beispielsweise mit einer Clark-Elektrode, die Cholestenonmenge photometrisch bei X = 240 nm und die Wasserstoffperoxidmenge durch gekoppelte Indikatorreaktion mit Peroxidase und Trindersystem oder Katalase und Kageyama-Reaktion bzw. ALDH-Reaktion bestimmt werden.The determination of free cholesterol with cholesterol oxidase taking Formation of cholestenone and hydrogen peroxide is for example in DE-PS 2 224 132 and DE-OS 2 265 122 described. The determination takes place either by determining the oxygen consumption, by determining the amount of cholestenone formed or by determining the amount of hydrogen peroxide formed. The oxygen consumption For example, with a Clark electrode, the amount of cholestenone can be measured photometrically at X = 240 nm and the amount of hydrogen peroxide by coupled indicator reaction with peroxidase and Trinder system or catalase and Kageyama reaction or ALDH reaction to be determined.

Gebundenes Cholesterin wird, wie beispielsweise in der DE-OS 2 506 712 beschrieben ist, mit Hilfe von Cholesterinesterase freigesetzt, wonach das freigesetzte Cholesterin wie oben beschrieben bestimmt wird.Bound cholesterol is, for example, in DE-OS 2,506 712 is described, released with the help of cholesterol esterase, after which the released Cholesterol is determined as described above.

Alle diese bekannten Bestimmungsmethoden waren Endpunktmethoden, die den Sauerstoffverbrauch bzw. die gebildete Cholestenon- oder Wasserstoffperoxidmenge nach im wesentlichen vollständigem Ablauf der Reaktion messen. Solche Endpunktbestimmungen erfordern relativ lange Zeit, da der Ablauf der Reaktion abgewartet werden muß. Dies ist besonders ungünstig bei Verwendung moderner Analysenautomaten, die für einen hohen Probendurchsatz konzipiert sind und nur kurze Inkubationszeiten gestatten. Heute übliche Analysenautomaten sind daher nur mit hoher Analysenfrequenz voll ausgelastet.All of these known determination methods were endpoint methods that the oxygen consumption or the amount of cholestenone or hydrogen peroxide formed measure after the reaction is essentially complete. Such endpoint determinations require a relatively long time, since the reaction has to be awaited. This is particularly unfavorable when using modern automatic analyzers for are designed for a high sample throughput and allow only short incubation times. Automatic analyzers that are customary today are therefore only fully utilized with a high analysis frequency.

Dieses Problem ist bekannt, weswegen man sich in neuerer Zeit um kinetische Bestimmungsmethoden bemüht, die nicht den vollen Reaktionsablauf abwarten müssen, sondern für eine bestimmte Zeitdifferenz den Unterschied im Sauerstoffverbrauch, in der gebildeten Cholestenonmenge oder der gebildeten Wasserstoffperoxidmenge bestimmen und daher viel kürzere Analysenzeiten benötigen als die Endpunktbestimmungen.This problem is well known, which is why we have recently been interested in kinetic Determination methods tried that not the full reaction process have to wait, but for a certain time difference the difference in oxygen consumption, in the amount of cholestenone formed or the amount of hydrogen peroxide formed and therefore require much shorter analysis times than the endpoint determinations.

Grundsätzlich sind kinetische Verfahren zur Bestimmung von Enzymsubstraten aus der DE-PS 2 440 011 und der DE-AS 2 558 536 bekannt. In diesen Druckschriften ist aber keine kinetische Bestimmungsmethode für Cholesterin beschrieben.Basically, kinetic methods are used to determine enzyme substrates from DE-PS 2 440 011 and DE-AS 2 558 536 known. In these publications but no kinetic determination method for cholesterol is described.

Auch ist es beispielsweise aus dem Aufsatz "Die Bestimmung von Substanzkonzentrationen auf kinetischer Basis" in "GIT-Labor-Medizin", Heft 2/1981, Seiten 89 bis 94 bekannt, daß bei der kinetischen Bestimmung einer Substratkonzentration die Michaelis-Menten-Gleichung anzuwenden ist, gemäß der die Reaktionsgeschwindigkeit bei Reaktionen erster Ordnung oder pseudoerster Ordnung näherungsweise der Substratkonzentration proportional ist, wenn die Michaelis-Konstante K m sehr viel größer als die Substratkonzentration im Test ist.It is also, for example, from the article "The determination of substance concentrations on a kinetic basis "in" GIT-Labor-Medizin ", issue 2/1981, pages 89 to 94 known, that in the kinetic determination of a substrate concentration the Michaelis-Menten equation is to be used, according to which the reaction rate for reactions of the first order or pseudo first order approximately proportional to the substrate concentration is when the Michaelis constant K m is very much greater than the substrate concentration is under test.

Weiterhin ist es bekannt, bei Verwendung von Enzymen, deren Michaelis-Konstante nicht viel größer als die höchste zu bestimmende Substratkonzentration ist, kompetitive Enzyminhibitoren zu verwenden, mit Hilfe derer zu niedrige K -Werte m der beteiligten Enzyme künstlich erhöht werden.It is also known, when using enzymes, whose Michaelis constant is not much greater than the highest substrate concentration to be determined, competitive To use enzyme inhibitors, with the help of which too low K values m the involved Enzymes are artificially increased.

Schließlich ist es aus der DE-OS 3 046 241 bekannt, daß die bisher zum Stand der Technik gehörenden Cholesterinoxidasen einen niedrigen K -Wert besitzen und daß mit einer Ausnahme m die Verwendung von Enzyminhibitoren bei Cholesterinoxidasen sich als erfolglos erwiesen. Der einzige beschriebene Ausnahmefall ist die Verwendung von 3,4-Dichlorphenol als Enzyminhibitor für eine Cholesterinoxidase, die aus einem Mikroorganismus der Gattung Streptomyces gewonnen wurde. Die deutsche Offenlegungsschrift betont ausdrücklich, daß weder die Kombination von 3,4-Dichlorphenol mit anderen Cholesterinoxidasen noch die Verwendung anderer Isomerer des Dichlorphenols eine ausreichende Erhöhung der Michaelis-Kon- stante ergaben, um die Cholesterinbestimmung kinetisch durchführen zu können.Finally, it is known from DE-OS 3 046 241 that the hitherto prior art cholesterol oxidases have a low K value and that, with one exception, the use of enzyme inhibitors in cholesterol oxidases proved unsuccessful. The only exception described is use of 3,4-dichlorophenol as an enzyme inhibitor for a cholesterol oxidase, which consists of a Microorganism of the genus Streptomyces was obtained. The German Offenlegungsschrift expressly emphasizes that neither the combination of 3,4-dichlorophenol with others Cholesterol oxidases nor the use of other isomers of dichlorophenol sufficient increase in Michaelis con stante revealed to the To be able to carry out the kinetic determination of cholesterol.

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand somit darin, eine kinetische Methode zur quantitativen Bestimmung von Cholesterin mit Hilfe von Cholesterinoxidase zu bekommen, die nicht auf eine Cholesterinoxidase spezieller Provenienz und nicht auf einen speziellen Inhibitor beschränkt ist. Insbesondere bestand eine speziellere Aufgabenstellung der Erfindung darin, einen Enzyminhibitor verwenden zu können, der gleichzeitig auch als Komponente des farberzeugenden Systems für die quantitative Bestimmung beispielsweise des Wasserstoffperoxids eingesetzt werden kann.The object on which the invention is based was thus to provide a kinetic method for the quantitative determination of cholesterol with the help of cholesterol oxidase to get that is not due to a specific provenance of cholesterol oxidase and not is limited to a specific inhibitor. In particular, there was a more specific one The object of the invention is to be able to use an enzyme inhibitor, at the same time as a component of the color-producing system for the quantitative Determination, for example, of the hydrogen peroxide can be used.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß entgegen der Aussage in der DE-OS 3 046 241 Phenol und Phenol derivate generell für alle Cholesterinoxidasen als Enzyminhibitoren verwendet werden können und daß dies keineswegs auf eine Kombination von 3,4-Dichlorphenol mit einer Cholesterinoxidase aus einem Mikroorganismus der Gattung Streptomyces beschränkt ist.Surprisingly, it has now been found that, contrary to the statement in DE-OS 3 046 241 phenol and phenol derivatives in general for all cholesterol oxidases can be used as enzyme inhibitors and that this is by no means due to a combination of 3,4-dichlorophenol with a cholesterol oxidase from a microorganism of the Genus Streptomyces is restricted.

Es wurde durch Darstellung in Lineweaver-Burk-Diagramme gefunden, daß es sich bei der erfindungsgemäßen Verwendung von Phenol oder Phenolderivaten als Enzyminhibitor um einen nichtkompetitiven Hemmtyp handelt, wobei die Wechselwirkung zwischen den Cholesterinoxidasen und den Inhibitoren nicht im einzelnen geklärt ist. Es ist im Hinblick auf den Stand der Technik überraschend, daß nichtkompetitive Inhibitoren geeignet sind.It was found by representation in Lineweaver-Burk diagrams, that it is in the inventive use of phenol or phenol derivatives as an enzyme inhibitor is a non-competitive type of inhibitor, the interaction between the cholesterol oxidases and the inhibitors has not been clarified in detail is. It is surprising in view of the prior art that non-competitive Inhibitors are suitable.

Da man nach dieser neuen Erkenntnis nicht mehr an eine spezielle Cholesterinoxidase und einen speziellen Enzyminhibitor gebunden ist, läßt sich die kinetische Bestimmung von Cholesterin viel flexibler gestalten und den Erfordernissen anpassen, und man kann einen Enzyminhibitor wählen, der auch in dem farberzeugenden System, wie einem Trinder-System einsetzbar ist.Since, according to this new knowledge, you no longer need a special cholesterol oxidase and a special enzyme inhibitor is bound, the kinetic determination can be make cholesterol much more flexible and adapt to requirements, and you can choose an enzyme inhibitor that is also in the color-producing system, such as a Trinder system can be used.

Bevorzugte Phenolderivate, die erfindungsgemäß als Cholesterinoxidaseinhibitoren verwendet werden können, sind solche, die zusätzlich zu der phenolischen Hydroxylgruppe einfach bis dreifach kernsubstituiert sind, wobei die Substituenten Halogenatome, besonders Chloratome, Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Alkoxygruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Carboxygruppen, Sulfonylgruppen, Sulfonsäuregruppen, Aminogruppen oder mit C 1-4 -Alkylgruppen substituierte Aminogruppen sein können.Preferred phenol derivatives according to the invention as cholesterol oxidase inhibitors Can be used are those in addition to the phenolic hydroxyl group are mono- to triple-substituted in the nucleus, the substituents being halogen atoms, especially chlorine atoms, alkyl groups with 1 to 4 carbon atoms, alkoxy groups with 1 to 4 carbon atoms, carboxy groups, sulfonyl groups, sulfonic acid groups, May be amino groups or amino groups substituted by C 1-4 alkyl groups.

Bevorzugt verwendete Cholesterinoxidaseinhibitoren, die gleichzeitig auch als Komponente des farbgebenden Systems bei der Bestimmung von Wasserstoffperoxid verwendet werden können, sind Phenol, 4-Chlorphenol, 2,4-Dichlorphenol und 3,5-Dichlor-2-hydroxybenzolsulfonsäure.Preferably used cholesterol oxidase inhibitors at the same time also as a component of the coloring system in the determination of hydrogen peroxide Can be used are phenol, 4-chlorophenol, 2,4-dichlorophenol and 3,5-dichloro-2-hydroxybenzenesulfonic acid.

Das Phenol oder Phenolderivat wird in den Testlösungen zweckmäßig in einer Menge von mindestels 1 g/l bis zur Löslichkeitsgrenze in dem betreffenden Testreagenz, vorzugsweise in einer Menge von mindestens 2 g/l bis zur Löslichkeitsgrenze benutzt, wobei die stärker bevorzugten Bereiche von dem jeweiligen Phenolderivat abhängen. In jedem Fall ist das Phenol oder Phenolderivat in einer die erforderliche Inhibitorwirkung hervorrufenden Menge zu verwenden, die erheblich über derjenigen liegt, in der Phenolderivate in dem Chromophorsystem normalerweise eingesetzt werden.The phenol or phenol derivative is useful in the test solutions in an amount of at least 1 g / l up to the solubility limit in the relevant Test reagent, preferably in an amount of at least 2 g / l up to the solubility limit used, the more preferred ranges being from the particular phenol derivative depend. In either case, the phenol or phenol derivative in one is required The amount producing an inhibitory effect is to be used which is considerably higher than that in which phenol derivatives are normally used in the chromophore system.

Als Cholesterinoxidasen kommen alle bislang bekannten in Betracht, wie solche aus Stämmen von Nocardia, wie Nocardia erythropolis, oder aus Stämmen von Streptomyces, aus Mycobacterium rubrum oder jenen Bakterienstämmen, die in der DE-OS 3 151 616 aufgeführt sind. Andere brauchbare Cholesterinoxidasen stammen aus Stämmen von Brevibacterium oder Pseudomonas.All hitherto known cholesterol oxidases come into consideration, such as those from strains of Nocardia, such as Nocardia erythropolis, or from strains from Streptomyces, from Mycobacterium rubrum or those bacterial strains which are present in the DE-OS 3 151 616 are listed. Other useful cholesterol oxidases are derived from Strains of Brevibacterium or Pseudomonas.

Als Cholesterinesterasen können ebenfalls beliebige bekannte Cholesterinesterasen verwendet werden, wie solche aus Mikroorganismen oder Pankreas. Beispiele hierfür sind solche aus Stämmen von Candida, Rhizopus, Aspergillus, Actinomyces oder Streptomyces, wie solche, die in der DE-OS 2 506 712 beschrieben sind.Any known cholesterol esterases can also be used as cholesterol esterases such as those from microorganisms or pancreas. Examples of this are those out Strains of Candida, Rhizopus, Aspergillus, Actinomyces or Streptomyces, such as those described in DE-OS 2,506,712.

Die Erfindung betrifft auch Reagenzien zur Durchführung des eingangs geschilderten Verfahrens. Diese Reagenzien enthalten Cholesterinoxidase und ein System zur Bestimmung von H 202 oder Cholestenon sowie gegebenenfalls Cholesterinesterase und erfindungsgemäß Phenol oder ein Phenolderivat als Cholesterinoxidaseinhibitor. Im allgemeinen enthält das Reagenz auch eine Puffersubstanz, wobei alle Puffer in Betracht kommen, die im Aktivitätsbereich der beteiligten Enzyme zu puffern vermögen, vorzugsweise im pH-Bereich von 6 bis 8, besonders bevorzugt etwa 6,5. Als besonders geeignet erwiesen sich Phosphatpuffer, Hepespuffer und Trispuffer.The invention also relates to reagents for performing the above described procedure. These reagents contain cholesterol oxidase and a System for the determination of H 202 or cholestenone and possibly cholesterol esterase and according to the invention, phenol or a phenol derivative as a cholesterol oxidase inhibitor. In general, the reagent also contains a buffer substance, all buffers in Those capable of buffering in the activity range of the enzymes involved come into consideration, preferably in the pH range from 6 to 8, particularly preferably about 6.5. As special Phosphate buffers, Hepes buffers and Tris buffers have proven to be suitable.

Besonders geeignete Reagenzzusammensetzungen sind folgende: 0,2 bis 5 x 103 U/1 Cholesterinoxidase (beispielsweise aus Nocardia oder Streptomyces), 0,2 bis 10 x 103 U/1 Cholesterinesterase (aus Mikroorganismen oder Pankreas), 0,1 bis 30 x 103 U/1 Peroxidase, eine inhibierende Menge, vorzugsweise 1 bis 50, besonders 2 bis 25 g/l Phenol oder Phenolderivat, 1 bis 20 g/l nichtionisches Detergens, 1 bis 50 mMol/l Natriumcholat und 20 bis 200 mMol/l Phosphatpuffer pH 6,5.Particularly suitable reagent compositions are as follows: 0.2 to 5 x 103 U / 1 cholesterol oxidase (for example from Nocardia or Streptomyces), 0.2 to 10 x 103 U / 1 cholesterol esterase (from microorganisms or pancreas), 0.1 to 30 x 10 3 U / 1 peroxidase, an inhibiting amount, preferably 1 to 50, especially 2 to 25 g / l phenol or phenol derivative, 1 to 20 g / l nonionic detergent, 1 up to 50 mmol / l sodium cholate and 20 to 200 mmol / l phosphate buffer pH 6.5.

Wenn das Reagenz 4-Chlorphenol enthält, so ist dieses zweckmäßig in einer Menge von 2,5 bis 12 g/l enthalten. Im Falle von Phenol ist dieses zweckmäßig in einer Menge von 10 bis 15 g/l enthalten. Im Falle von 2,4-Dichlorphenol ist dieses zweckmäßig in einer Menge von 2 bis 5 g/l enthalten.If the reagent contains 4-chlorophenol, this is useful in contain an amount of 2.5 to 12 g / l. In the case of phenol, this is useful contained in an amount of 10 to 15 g / l. In the case of 2,4-dichlorophenol, this is expediently contained in an amount of 2 to 5 g / l.

Daneben kann das erfindungsgemäße Reagenz noch übliche Zusatzstoffe für enzymatische Reagenzien, wie Stabilisierungsmittel, z.B. Mannit, Bactericide, wie Azid, oder anorganische Salze enthalten.In addition, the reagent according to the invention can also contain customary additives for enzymatic reagents such as stabilizers, e.g. mannitol, Contain bactericides, such as azide, or inorganic salts.

Das Wesen der vorliegenden Erfindung ist unabhängig von dem speziellen Chromophor, so daß alle H202- bzw. Cholestenon-Bestimmungssysteme in Verbindung mit der Erfindung verwendet werden können.The essence of the present invention is independent of the particular Chromophore, so that all H202 or cholestenone determination systems are connected can be used with the invention.

Beispiel 1 Es wurde folgendes Reagenz verwendet: 1000 U/1 Cholesterinoxidase aus Streptomyces 1000 U/1 Peroxidase 0,3 mMol/l 4-Aminophenazon 2 g/l 2,4-Dichlorphenol 10 g/l Hydroxypolyethoxydodecan 1 g/l Natriumcholat 30 mMol/l Phosphatpuffer, pH 6,5 Handelsübliche Cholesterinstandards mit Gehalten von 100 bis 400 mg/dl wurden am Photometer bei 250 C und 546 nm im Minutenabstand gemessen. Das Probevolumen lag bei 10 ijl, das Reagenzvolumen bei 1000 p1.Example 1 The following reagent was used: 1000 U / 1 cholesterol oxidase from Streptomyces 1000 U / 1 peroxidase 0.3 mmol / l 4-aminophenazone 2 g / l 2,4-dichlorophenol 10 g / l hydroxypolyethoxydodecane 1 g / l sodium cholate 30 mmol / l phosphate buffer, pH 6.5 Commercially available cholesterol standards with levels of 100 to 400 mg / dl were used Measured on the photometer at 250 C and 546 nm every minute. The sample volume was 10 μl, the reagent volume was 1000 μl.

Es ergaben sich folgende E's zwischen der zweiten und dritten Minute.The following E's resulted between the second and third minute.

100 mg/dl 0,029 200 mg/dl 0,058 400 mg/dl 0,117 Linearität ist somit bis mindestens 400 mg/dl gegeben. 100 mg / dl 0.029 200 mg / dl 0.058 400 mg / dl 0.117 linearity is therefore given up to at least 400 mg / dl.

Beispiel 2 Es wurde folgendes Reagenz verwendet: 400 U/1 Cholesterinoxidase aus Nocardia erythropolis 10 000 U/1 Peroxidase 0,3 mMol/l 4-Aminophenazon 10 g/l Phenol 15 g/l Hydroxypolyethoxydodecan 15 g/l Natriumcholat 30 mMol/l Phosphatpuffer, pH 6,5 Handelsübliche Cholesterinstandards mit Gehalten von 100 bis 400 mg/dl wurden am Photometer bei 250 C und 546 nm im Minutenabstand gemessen. Die Probevolumen lagen bei 10 p1, das Reagenzvolumen bei 1000 p1.Example 2 The following reagent was used: 400 U / 1 cholesterol oxidase from Nocardia erythropolis 10,000 U / 1 peroxidase 0.3 mmol / l 4-aminophenazone 10 g / l phenol 15 g / l hydroxypolyethoxydodecane 15 g / l sodium cholate 30 mmol / l phosphate buffer, pH 6.5 Commercially available cholesterol standards with levels 100 to 400 mg / dl were measured on the photometer at 250 C and 546 nm every minute measured. The sample volume was 10 p1, the reagent volume 1000 p1.

Es ergaben sich folgende hE's zwischen der dritten und vierten Minute: 100 mg/dl 0,010 200 mg/dl 0,020 400 mg/dl 0,039 Linearität ist somit bis mindestens 400 mg/dl gegeben.The following hE's resulted between the third and fourth minute: 100 mg / dl 0.010 200 mg / dl 0.020 400 mg / dl 0.039 linearity is thus up to at least 400 mg / dl given.

Beispiel 3 Es wurde folgendes Reagenz verwendet: 400 U/1 Cholesterinoxidase aus Nocardia erythropolis 10 000 U/1 Peroxidase 0,3 mMol/l 4-Aminophenazon 8 g/l 4-Chlorphenol 15 g/l Hydroxypolyethoxydodecan 25 g/l Natriumcholat 30 mMol/l Phosphatpuffer, pH 6,5 Handelsübliche Cholesterinstandards mit Gehalten von 100 bis 400 mg/dl wurden am Photometer bei 250 C und 546 nm im Minutenabstand gemessen. Das Probevolumen hatte 10 Ctl, das Reagenzvolumen 1000 p1 Es ergaben sich folgende AE' s zwischen der erten und vierten Minute: 50 mg/dl 0,014 100 mg/dl 0,031 200 mg/dl 0,057 400 mg/dl 0,119 800 mg/dl 0,238 Die Linearität ist bis mindestens 800 mg/dl gegeben.Example 3 The following reagent was used: 400 U / 1 cholesterol oxidase from Nocardia erythropolis 10,000 U / 1 peroxidase 0.3 mmol / l 4-aminophenazone 8 g / l 4-chlorophenol 15 g / l hydroxypolyethoxydodecane 25 g / l sodium cholate 30 mmol / l phosphate buffer, pH 6.5 Commercially available cholesterol standards with levels of 100 to 400 mg / dl were used Measured on the photometer at 250 C and 546 nm every minute. The sample volume had 10 Ctl, the reagent volume 1000 p1 The following were found AE 's between the first and fourth minutes: 50 mg / dl 0.014 100 mg / dl 0.031 200 mg / dl 0.057 400 mg / dl 0.119 800 mg / dl 0.238 The linearity is up to at least 800 mg / dl given.

Beispiel 4 Es wurde folgendes Reagenz verwendet: 1000 U/1 Cholesterinoxidase aus Streptomyces 100 U/dl Cholesterinesterase aus Mikroorganismen 200 U/1 Cholesterinesterase aus Pankreas 10 000 U/1 Peroxidase 0,3 mMol/l 4-Aminophenazon 2,5 g/l 4-Chlorphenol 10 g/l Hydroxypolyethoxydodecan 1 g/l Natriumcholat 30 mMol/l Phosphatpuffer, pH 6,5 Auf einem handelsüblichen Analyseautomaten (ACP 5040 der Firma Eppendorf Gerätebau Hamburg) wurde die kinetische Cholesterinbestimmung im Serum mit der folgenden Einstellung durchgeführt: Methode Kinetik Temperatur 259 C Takt 12 sec.Example 4 The following reagent was used: 1000 U / 1 cholesterol oxidase from Streptomyces 100 U / dl cholesterol esterase from microorganisms 200 U / 1 cholesterol esterase from pancreas 10,000 U / 1 peroxidase 0.3 mmol / l 4-aminophenazone 2.5 g / l 4-chlorophenol 10 g / l hydroxypolyethoxydodecane 1 g / l sodium cholate 30 mmol / l phosphate buffer, pH 6.5 On a commercially available automatic analyzer (ACP 5040 from Eppendorf Gerätebau Hamburg) the kinetic cholesterol determination in serum was carried out with the following setting carried out: method kinetics temperature 259 C cycle 12 sec.

Wellenlänge Hg 546 nm Abgleich E 0,0 Faktor/Standard 200 Rotordrehung 1 Auswertenummer 0 Spülposition 18 Startposition 0 Volumenposition 1 500 p1 Volumenposition 2 10 ijl Volumenposition 5 0 pl Die Präzision in der Serie, die erzielt wurde, zeigen folgende zwei Beispiele: 1. Probe 2. Probe n = 11 n = 12 x = 81,6 x = 90,8 s = 0,924 x = 3,24 VK = 1,13 % VK = 3,57 Hierin bedeutet n die Anzahl der gemessenen Werte, x den Mittelwert der gemessenen Werte, s die Standardabweichung und VK den Variationskoeffizienten.Wavelength Hg 546 nm Adjustment E 0.0 factor / standard 200 rotor rotation 1 evaluation number 0 Rinsing position 18 Start position 0 Volume position 1 500 p1 volume position 2 10 ijl volume position 5 0 pl The precision in series, The two examples that were achieved are shown by the following: 1. Sample 2. Sample n = 11 n = 12 x = 81.6 x = 90.8 s = 0.924 x = 3.24 VK = 1.13% VK = 3.57 where n means the number of measured values, x the mean of the measured values, s the standard deviation and VK is the coefficient of variation.

Eine Messung von Kontrollserum erbrachte folgende Ergebnisse: Gemessener Wert Sollwert (x aus n = 3) 93,7 97 168,7 159 94,3 99 113,3 114 162,0 148 418,3 409 Es ist ersichtlich, daß die gemessenen Werte mit den Sollwerten innerhalb der Meßgenauigkeit gut übereinstimmten.A measurement of control serum produced the following results: Measured Setpoint value (x from n = 3) 93.7 97 168.7 159 94.3 99 113.3 114 162.0 148 418.3 409 It can be seen that the measured values match the setpoints within the Accuracy matched well.

Beispiel 5 Es wurde folgendes Reagenz verwendet: 1000 U/1 Cholesterinoxidase aus Streptomyces 100 U/1 Cholesterinesterase aus Mikroorganismen 400 U/1 Cholesterinesterase aus Pankreas 10 000 U/1 Peroxidase 0,3 mMol/1 4-Aminophenazon 2,5 g/l 4-Chlorphenol 10 g/l Hydroxypolyethoxydodecan 1 g/l Natriumcholat 30 mMol/l Phosphatpuffer, pH 6,5 Auf einem handelsüblichen Analysenautomaten (Gemsaec der Firma Electro Nucleonics) wurde die kinetische Cholesterinbestimmung im Serum mit folgender Einstellung durchgeführt: Rotoloader Sample - Schalter B Blank - Schalter Reagent Probevolumen 10 ul (10 %)* Spülvolumen 50 ul (25 %)* in Bucht C Reagenz I Volumen 500 ul (50 %)* in Bucht C Reagenz II Volumen *) für Pumpen von 50 ul, 200 ul und 1 ml Analyzer Reaktionstemperatur 250 C Wellenlänge 500 nm Vorfilter 430 - 560 nm Control Reaktionsart kinetisch Art des Laufes Auto Initial Reading (IR) 120 Reading Internal (RI) 20 Number of Readings (NR) Computer IR = 120 AD = 4 RI - 20 CD = 1 NR = 4 HI = 220 SC = 200 LO = 140 KT = 0 SA = 1,2 TF = 145 RM = 2,0 TC = 1 XX = 0 Es wurde menschliches Serum mit Cholesteringehalten mit bis zu 700 mg/dl untersucht. Hierbei ergab sich ein linearer Verlauf bis mindestens 500 mg/dl Cholesterin.Example 5 The following reagent was used: 1000 U / 1 cholesterol oxidase from Streptomyces 100 U / 1 cholesterol esterase from microorganisms 400 U / 1 cholesterol esterase from pancreas 10,000 U / 1 peroxidase 0.3 mmol / 1 4-aminophenazone 2.5 g / l 4-chlorophenol 10 g / l hydroxypolyethoxydodecane 1 g / l sodium cholate 30 mmol / l phosphate buffer, pH 6.5 On a commercially available automatic analyzer (Gemsaec from Electro Nucleonics) the kinetic cholesterol determination in the serum was carried out with the following setting: Rotoloader Sample - Switch B Blank - Switch Reagent Sample volume 10 μl (10%) * Rinse volume 50 ul (25%) * in bay C Reagent I volume 500 ul (50%) * in bay C Reagent II volume *) for pumps of 50 μl, 200 μl and 1 ml analyzer reaction temperature 250 C wavelength 500 nm pre-filter 430 - 560 nm Control response type kinetic type of run Auto Initial Reading (IR) 120 Reading Internal (RI) 20 Number of Readings (NR) Computer IR = 120 AD = 4 RI - 20 CD = 1 NR = 4 HI = 220 SC = 200 LO = 140 KT = 0 SA = 1.2 TF = 145 RM = 2.0 TC = 1 XX = 0 It became human Serum with cholesterol levels of up to 700 mg / dl was examined. This resulted a linear course up to at least 500 mg / dl cholesterol.

Claims

Method and reagent for the determination of cholesterol Patent claims 1. Method for the kinetic quantitative determination of cholesterol in the free or bound form with the aid of cholesterol oxidase, a cholesterol oxidase inhibitor as well as, if necessary, a cholesterol esterase by measuring the oxygen consumption, the amount of hydrogen peroxide formed or the amount of cholestenone formed, thereby characterized in that the cholesterol oxidase inhibitor used is phenol or a phenol derivative, excluding 3,4-dichlorophenol in combination with a cholesterol oxidase from one Microorganism belonging to the genus Streptomyces was used.

2. The method according to claim 1, characterized in that one is phenol or a phenol derivative is used which except the phenolic hydroxyl group 1 to 3 substituents from the group of halogen atoms, in particular chlorine atoms, Alkyl groups with 1 to 4 carbon atoms, alkoxy groups with 1 to 4 carbon atoms, Carboxy groups, sulfonyl groups, sulfonic acid groups, amino groups or through C1 Has 4-alkyl groups substituted amino groups.

3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that one as a cholesterol oxidase inhibitor phenol, 2,4-dichlorophenol, 4-chlorophenol or 3, 5-dichloro-2-hydroxybenzenesulfonic acid is used.

4. The method according to claim 1 to 3, characterized in that one the phenol or phenol derivative in an amount of at least 1 g / l up to its Solubility limit used in the reagent.

5. reagent for performing the method according to claim 1 to 5, characterized in that it contains 0.2 to 5 x 10 3 U / 1 cholesterol oxidase, 0.2 to 10 x 103 U / 1 cholesterol esterase, 0.1 to 10 x 10 U / 1 peroxidase, at least 1 g / l Phenol or phenol derivative, 1 to 20 g / l nonionic detergent, 1 to 50 mmol / l Contains sodium cholate and 20 to 200 mmol / l phosphate buffer pH 6 to 8.

7. Reagent according to claim 6, characterized in that it is 2.5 to Contains 12 g / l 4-chlorophenol.

8. Reagent according to claim 6, characterized in that it is 10 to 15 g / l phenol contains 9. reagent according to claim 6, characterized in that it Contains 2 to 5 g / 12,4-dichlorophenol.