DE3219620C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Ermittlung des Verhältnisses von lebenden und toten Zellen in Hefesuspensionen.

Das Verfahren gemäß der Erfindung kann zur mikrobiologischen Kontrolle bei der Herstellung von Eiweiß-Vitamin-Konzentraten, Enzymen, Antibioti­ ka und anderen Produkten angewandt werden, die durch Kultivie­ rung entsprechender Mikroorganismen hergestellt werden.

Es sind bereits verschiedene Meßverfahren zur Ermittlung des Gehalts an toten Zellen in Zellsuspensionen bekannt, so z. B. ein Verfahren zur Bestimmung des Prozentsatzes der toten Zellen durch Anfärbung mit Methylenblau und Ermittlung der Anzahl der gefärbten Zellen in bezug auf die Gesamtzahl der ausgewerteten Zellen (vgl. z. B. die Monographie von I. L. Rabotnov: Allgemeine Mikro­ biologie, 1966).

Bekannt ist auch ein Verfahren zur Anfärbung toter Zellen mit Löffler-Blau und mit anderen Farbstoffen. Ein Nachteil die­ ser Verfahren besteht in der Instabilität der anzuwendenden Farbstoffe, da deren Färbevermögen vom Zustand der Farbstoffe, ihrer Lagerzeit, dem Lagerverfahren usw. abhängig ist.

Es ist ferner ein Verfahren zur Ermittlung des Gehalts an toten Zellen bekannt, das darin besteht, daß einer Hefesuspen­ sionsprobe, die einem Fermentationsapparat entnommen wird, ein Farbstoff (Methylenblau) zugesetzt und daraus ein Präparat her­ gestellt wird, indem ein Probetropfen mit dem Farbstoff auf einen Objektträger gebracht und mit einem Deckglas so bedeckt wird, daß eine Monoschicht der Hefezellen erhalten wird. Die toten Zellen haben eine dunkelblaue, die lebenden aber eine schwach graue bzw. graublaue Färbung je nach der Schwächung der Zellen. Das Präparat wird im Durchlicht in einem Mikroskop analysiert. Der Prozentsatz der toten Zellen wird visuell durch Zählung der Anzahl der toten Zellen pro hundert durchgesehene Hefezellen bestimmt.

Ein Nachteil dieses Verfahrens besteht im großen Ar­ beitsaufwand (die Bestimmung dauert 40 bis 60 min), in der geringen statistischen Signifikanz, da durch Erhöhung der Zellenzahl auf über Hundert der Arbeitsaufwand der Messungen wesentlich vergrößert wird, in der Subjektivität bei der Einschätzung des Anfärbungsgrads sowie in der Instabilität des Farbstoffs in Abhängigkeit von seiner Lagerzeit, was die Zahl der angefärbten Zellen stark beeinflußt. Das führt dazu, daß der Variationskoeffizient, d. h., das Verhältnis des quadratischen Mittelwerts zum Mittelwert des Gehalts an toten Zellen, die nach dem bekannten Verfahren bestimmt wurden (je 20 bis 30 Zellen im Gesichtsfeld einer Probe), 0,4 bis 0,5 beträgt, was eine zu grobe Abschätzung darstellt.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein genaueres Verfahren zur Ermittlung des Verhältnisses von lebenden und toten Zellen in Hefesuspensionen anzugeben, das zugleich wesentlich schneller als bisherige Verfahren durchführbar ist.

Die Aufgabe wird anspruchsgemäß gelöst.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Ermittlung desVerhält­ nisses von lebenden zu toten Zellen in Hefesuspensionen durch mikroskopische Auswertung eines Dünnschichtpräparats (Mono­ schichtpräparats) der Hefesuspension und Erfassung der leben­ den und toten Zellen im Präparat zur Ermittlung ihres Verhältnisses ist gekennzeichnet durch

• a) Abtastung und Photometrierung des Präparats in einem Raster­ mikroskop
  unter Erzeugung einer Digitalmatrix des Präparatbilds, wobei die Konturlinien der Zellen aufgrund der Helligkeitsänderung zwischen Untergrund und Zellbildern diskriminiert werden,
• b) Erzeugung eines Histogramms der Helligkeitsamplituden der Zellbilder,
• c) Berechnung der Dispersion und der Asymmetrie der Zellen anhand des Histogramms und
• d) Identifizierung der untersuchten Zellen als lebend oder tot durch Vergleich ihrer Dispersion und Asymmetrie im Histogramm mit vorgegebenen Schwellenwerten dieser Größen für die betreffende Hefesuspension.

Dieses Verfahren läßt sich leicht automatisieren; dadurch wird die Durchführungszeit erheblich verkürzt, wobei gleichzeitig die Meßgenauigkeit im Vergleich zu den bekannten Verfahren, die manuell durchgeführt werden, erhöht ist.

Es ist zweckmäßig, den Schwellenwert der Dispersion und der Asymmetrie des Histogramms der Zellen getrennt für die leben­ den und für die toten Zellen zu bestimmen, wobei jeweils die entsprechenden Zellen im Dünnschichtpräparat abgetastet und photometriert werden, und eine Digitalmatrix der Zellbilder erzeugt wird, in der die Konturlinien der Zellen diskriminiert werden, und danach ein Histo­ gramm der Helligkeitsamplituden der entsprechen­ den Zellbilder erzeugt wird, anhand dessen die Schwellenwerte der Dispersion und der Asymmetrie berechnet werden.

Nachstehend wird die Erfindung anhand eines Ausführungs­ beispiels unter Bezug auf die Zeichnung näher erläutert; es zeigt

Fig. 1 eine Digitalmatrix einiger Zellbilder, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wurde;

Fig. 2 Histogramme der Helligkeitsamplituden der Zellbilder von lebenden Zellen, die nach dem erfindungs­ gemäßen Verfahren erhalten wurden, und

Fig. 3 Histogramme der Helligkeitsamplituden der Zellbilder von toten Zellen, die nach dem erfin­ dungsgemäßen Verfahren erhalten wurden.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird wie folgt durchgeführt.

Nach einem beliebigen bekannten Verfahren wird zunächst ein Dünnschichtpräparat (Monoschicht) der zu untersuchenden Hefe­ suspension hergestellt. Dieses Präparat wird am Tisch eines Rastermikroskops befestigt, mit dem das zu untersuchende Dünnschichtpräparat abgetastet wird.

Unter Verwendung eines Photomultipliers erhält man die Helligkeitsamplituden des Präparatbilds, aus denen eine Digitalmatrix (Fig. 1) erzeugt wird.

In dieser Digitalmatrix ist der Untergrund mit "0" bezeich­ net, während die Zahlenwerte, die von Null verschieden sind, der Größe der Helligkeitsamplituden der Zellbilder der Hefesuspension entsprechen, mit denen die Konturlinien der Zellen festgelegt werden. In Fig. 1 sind insgesamt drei Zellen zu unterscheiden.

Dann werden nach einem bekannten Algorithmus, z. B. durch Analyse der Konturlinien selbst bzw. nach dem Sehnen- bzw. Sekantenverfahren, in der Digitalmatrix des Präparatbilds die Konturlinien der einzel­ nen Zellen nach dem Helligkeitsunterschied zwischen dem Untergrund und dem betreffenden Zellbild diskriminiert. Diese Konturlinien umfassen die Helligkeitsamplituden, anhand deren die Histogramme der Zellen (Fig. 2 und 3) erzeugt werden.

Anhand des erhaltenen Histogramms bestimmt man ihre Disper­ sion σ und ihre Asymmetrie S (vgl. E. S. Wenzel, Wahrscheinlichkeitstheorie, Moskau 1969, Seiten 92-103). In Fig. 2 sind Histo­ gramme von lebenden Hefezellen und in Fig. 3 Histogramme von toten Hefezellen dargestellt, für die verschiedene Werte der Asymmetrie (S) (0,1; 0,15; 0,2; 0,34; 0,35; 0,3 und -0,1; -0,31; -0,3; -0,33; -0,35) berechnet sind.

Die Untersuchungen zeigen, daß die Asymmetrie S für leben­ de Zellen positiv und für tote Zellen negativ ist. Außerdem ist, wie aus Experimenten hervorgeht, die Dispersion σ für lebende Zellen stets größer als für tote Zellen.

Die erhaltenen Werte der Dispersion σ und der Asymmetrie S für die zu untersuchende Hefesuspension werden mit vorgegebenen Schwellenwerten dieser Parameter verglichen; anhand der Vergleichs­ ergebnisse werden die Zellen als lebende oder tote identifiziert.

Die Schwellenwerte der Dispersion und der Asymmetrie können in beliebiger Weise bestimmt werden, jedoch ist es günstiger, diese Werte durch das oben erläuterte Verfahren zu bestimmen, indem im Rastermikroskop getrennt nur tote Zellen und unabhängig davon nur lebende Zellen der gleichen Hefesuspension abgetastet werden. Dazu ist es notwendig, nach einem beliebigen bekannten Verfahren ein entsprechendes Monoschichtpräparat herzustellen.

Nach der Diskriminierung der Konturlinien der Zellen in der Digitalmatrix wird ein Histogramm der Helligkeitsamplituden für die toten und für die lebenden Zellen erzeugt, anhand dessen die Dispersion und die Asymmetrie sowohl für die toten als auch für die lebenden Zellen berechnet werden.

Anhand einer repräsentativen Anzahl von Zellen berech­ net man den Mittelwert und das Vertrauensintervall der oben­ genannten Parameter, dessen oberer Wert für die Schwellen­ werte bei der Identifizierung der toten Zellen verwendet wird.

Das nachstehende Beispiel erläutert das erfindungsgemäße Verfahren.

Beispiel

Einem Fermenter wurde eine Probe einer Hefesuspension ent­ nommen, aus der ein Monoschichtpräparat hergestellt wurde.

Das Präparat wurde am Tisch eines Rastermikroskops be­ festigt; das Präparat wurde dann zeilenweise mit einem Raster­ maß von 0,5 µm mit einer Sonde von 1 µm abgetastet.

Mit einem Photomultiplier wurden in jedem Abtastpunkt die Helligkeitsamplituden (der Durchlässigkeit) des Präparatbilds der Hefesuspension im Anoptralkontrast ermittelt und als Digitalmatrix des Präparatbildes festgehalten. In der Digitalmatrix wurden die Konturlinien der Zellen diskriminiert; anhand der Werte der Helligkeitsamplituden der Bildbereiche innerhalb der ermittelten Konturlinien wurden Histogramme sämtli­ cher Zellen des Präparats erzeugt, für die die Werte der Dispersion σ und der Asymmetrie S bestimmt wurden.

Es wurde angenommen, daß für eine tote Zelle S 0 sind (vgl. Fig. 3) σ 12). Im Ergebnis einer Analyse von 100 Zellen wurden fünf Zellen als tote identifiziert, was ein Verhältnis von le­ benden und toten Zellen von 100 : 5 für die zu untersuchende Hefesuspension ergibt.

Der Meßfehler des Gehalts an toten Zellen beträgt 5 bis 10% mit einem Variationskoeffizienten von 0,1 bis 0,2 (gegenüber 0,4 bis 0,5 bei bekannten Verfahren).

Da kein Farbstoff bei der Herstellung des Monoschicht­ präparats verwendet wird, und die Bestimmung der Zugehörig­ keit einer Hefezelle zu toten oder lebenden Zelle an einer größeren Zahl zu untersuchender Zellen durchgeführt wird, ist die erfindungsgemäß erzielte Bestimmungsgenauigkeit gegen­ über herkömmlichen Verfahrensweisen erheblich höher. Das Ver­ fahren läßt sich ferner leicht automatisieren, was die Durch­ führungszeit verkürzt. Hierdurch wird es möglich, die zu messen­ den Parameter zur Schnellkontrolle des Zustands von Hefekulturen sowie zur Steuerung entsprechender Prozesse durch automa­ tisierte Steuersysteme zu verwenden, was im Endergebnis eine Er­ höhung der Leistung von Fermentern und der Qualität der herzu­ stellenden Biomasse ermöglicht.

Claims (2)

1. Verfahren zur Ermittlung des Verhältnisses von lebenden zu toten Zellen in Hefesuspensionen durch mikroskopische Auswertung eines Dünn­ schichtpräparats der Hefesuspension und Erfassung der lebenden und toten Zellen im Präparat zur Ermittlung ihres Verhältnisses, gekennzeichnet durch

• a) Abtastung und Photometrierung des Präparats in einem Rastermikroskop
  unter Erzeugung einer Digitalmatrix des Präparat­ bilds, wobei die Konturlinien der Zellen aufgrund der Helligkeitsänderung zwischen Untergrund und Zellbildern diskriminiert werden,
• b) Erzeugung eines Histogramms der Helligkeitsampli­ tuden der Zellbilder,
• c) Berechnung der Dispersion und der Asymmetrie der Zellen anhand des Histogramms und
• d) Identifizierung der untersuchten Zellen als lebend oder tot durch Vergleich ihrer Dispersion und Asym­ metrie im Histogramm mit vorgegebenen Schwellenwer­ ten dieser Größen für die betreffende Hefesuspen­ sion.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Schwellenwerte der Dispersion (σ ) und der Asymmetrie (S) des Histogramms für lebende und für tote Zellen getrennt bestimmt werden, wobei jeweils die ent­ sprechenden Zellen im Dünnschichtpräparat abgetastet und photometriert werden, und eine Digitalmatrix der Zellbilder erzeugt wird, in der die Konturlinien der Zellen diskriminiert werden, und danach ein Histogramm der Helligkeitsamplituden der entsprechenden Zellbilder erzeugt wird, anhand dessen die Schwellenwerte der Dispersion (σ ) und der Asymmetrie (S) berechnet werden.